專利名稱：癌細胞的檢測方法及其在診斷和監(jiān)測疾病治療中的應(yīng)用的制作方法
癌細胞的檢測方法及其在診斷和監(jiān)測疾病治療中的應(yīng)用 發(fā)明領(lǐng)域和
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及癌癥的檢測方法，更具體地講，本發(fā)明涉及優(yōu)化癌癥藥物治療的方法。
在世界范圍內(nèi)，大多數(shù)發(fā)病率和死亡率是由癌癥引起，盡管目前醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷進 步。目前的治療策略主要集中在通過各種外科手術(shù)和非手術(shù)技術(shù)切除患者體內(nèi)的癌細胞或 使癌細胞死亡；但最廣泛使用的還是化學(xué)治療和Y輻射。這些方法具有許多顯著缺陷，尤 其是會破壞患者體內(nèi)的健康細胞/組織，而且目前生產(chǎn)的用于癌癥治療的化療藥物具有相 當(dāng)大的毒副作用。"分化治療(Differentiation therapy)"是一種替代方法，該方法可促進表型從 惡性恢復(fù)到正常。分化治療是根據(jù)以下概念癌細胞是被阻止在未成熟或未完全分化狀態(tài) 的正常細胞，缺乏控制其自身生長的能力，因而以異?？斓乃俾史敝?。分化治療的目的是迫 使癌細胞重新恢復(fù)成熟過程。盡管分化治療不能殺死癌細胞，但是可阻止其生長并可允許 使用更多常規(guī)治療(例如化療)，以消除剩余惡性細胞。 與旨在癌/腫瘤細胞死亡的常規(guī)治療策略相比，分化治療具有眾多優(yōu)勢。 一開始， 就不需要用化療藥或Y輻射來破壞患者體內(nèi)的健康細胞/組織，同時也就沒有其相關(guān)不良 副反應(yīng)。在許多情況下，通過Y輻射或化療殺死癌細胞能消除患者體內(nèi)大部分、但并非所 有癌細胞，因而導(dǎo)致疾病的緩解。用分化治療，推測通過誘導(dǎo)癌細胞中的某些細胞進入終末 分化途徑并最終衰老，這會以某種方式將信號發(fā)給其它癌細胞經(jīng)不同機制而跟隨其后。
各種標(biāo)記物已用于監(jiān)測接受分化治療的患者的方法。 一種這樣的標(biāo)記物就是堿 性磷酸酶，其中該酶的表達看來與細胞分化狀態(tài)有關(guān)[Patnaik A等，Clin. Can Research, 2002 Jul ;8(7) :2142-8 ;R印haeli A，Zhuk R，Nudelman A， 2000， Drug Develop. Res.第50 巻:379-391]。 對這類標(biāo)記物進行快速簡便而高靈敏度、高選擇性和高精度的檢測，為定制針對 特定患者的治療藥(即個性化醫(yī)療(personalizedmedicine))鋪平了道路。這在癌癥治療 上非常重要，目前已經(jīng)知道，僅根據(jù)腫瘤種類和解剖學(xué)位置是無法預(yù)測腫瘤治療反應(yīng)的。
時至今日，對于這類標(biāo)記物尚無檢測系統(tǒng)能滿足所有這些要求。
美國專利申請?zhí)?0060100488公開了采用交流電，通過直接監(jiān)測細胞的電反應(yīng)而 檢測癌細胞。W0 91/15595公開了對癌細胞電導(dǎo)率進行分析，用于監(jiān)測對治療和藥物篩選的 反應(yīng)性。具體地講，W091/15595公開了通過分析其電導(dǎo)率來監(jiān)測抑制癌細胞體積和數(shù)量增 加的特定藥物的有效性。因此，這兩篇專利申請都公開了癌細胞固有電學(xué)性質(zhì)可用作標(biāo)記 物，用于檢測和監(jiān)測癌細胞。 美國專利申請?zhí)?0040053425公開了對流體中分析物的電流測量分析，其中電極 中含有電流產(chǎn)生酶。美國專利申請?zhí)?0040053425并未公開對胞內(nèi)標(biāo)記物的電流測量檢 美國專利號5， 149， 629公開了對包括癌細胞標(biāo)記物在內(nèi)的標(biāo)記物的電流測量分 析，其中電極中含有能與標(biāo)記物結(jié)合的抗體。分析是通過底物競爭來進行的。美國專利號 5， 149， 629并未檢測癌細胞的內(nèi)源性電流特性。
因此，對分析物進行電流測量檢測已經(jīng)成為有效的檢測方法。然而，時至今日，電
流測量檢測尚未用于分析細胞酶活性。 發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供癌細胞的檢測方法，該方法包括(a)在酶催化細胞
與底物反應(yīng)的條件下，使細胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物；和(b)測定
電信號水平，其中電信號水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細胞的標(biāo)志。 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供診斷癌癥患者的方法，該方法包括(a)在酶催化細
胞與底物反應(yīng)的條件下，使患者樣品中的至少一個細胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生
電信號的產(chǎn)物；和(b)測定電信號水平，其中電信號水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌癥
的標(biāo)志。 根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供對癌癥治療進行個性化優(yōu)化的方法，該方法包括
(a)使患者樣品中的至少一個癌細胞與至少一種抗癌藥接觸；(b)在酶催化細胞與底物反
應(yīng)的條件下，使至少一個癌細胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物；和(c)測
定細胞所產(chǎn)生的電信號水平，其中該水平表示抗癌藥對患者癌癥的療效。 根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供監(jiān)測患者的抗癌治療的方法，該方法包括(a)給予
患者至少一種抗癌藥；(b)按照本發(fā)明方法的步驟(a)，檢測患者樣品中癌細胞的存在或水
平，其中所述存在或水平表示癌癥的狀態(tài)。 根據(jù)本發(fā)明的額外方面，提供檢測患者的抗癌治療的方法，該方法包括 (a)按照本發(fā)明方法，分析患者樣品中癌細胞的存在或水平；(b)根據(jù)患者樣品中
癌細胞的存在或水平，給予患者治療有效量的抗癌藥。 根據(jù)下文所述的本發(fā)明優(yōu)選實施方案的其它特征，方法還包括在步驟(b)后重復(fù) 步驟(a)。 根據(jù)本發(fā)明又一額外方面，提供能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型的藥物的鑒定方法，該方法 包括(a)使至少一個癌細胞接觸藥物；(b)按照本發(fā)明方法的(a)和任選在(a)之前，測定 細胞的惡性表型，其中表型逆轉(zhuǎn)表明藥物能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型。 根據(jù)本發(fā)明再一額外方面，提供藥盒，該藥盒包含(i)電化學(xué)電解池 (electrochemical cell)的至少一種組分，該電化學(xué)電解池適合于容納至少一個生物細胞 并適合于進行電化學(xué)測定；和(ii)至少一種抗癌藥。 根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，藥盒還包含底物，該底物被所述生物細 胞的酶催化而進行酶促反應(yīng)以生成反應(yīng)產(chǎn)物，從而在所述電化學(xué)電解池的電極上發(fā)生氧還 反應(yīng)。 根據(jù)本發(fā)明的額外方面，提供一種專為按照本發(fā)明方法檢測癌細胞而設(shè)計的系 統(tǒng)。 根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，至少一個細胞包括多個細胞。 根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，測定是用高通量方式進行。 根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，所述方式選自自動取樣裝置、液體處理
裝置、分配器、電極陣列、機器人或其任何組合。 根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，接觸是在體外進行。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，接觸是在離體情況下進行。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，樣品包含不多于500個細胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，活檢樣品包含不少于10個細胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，酶是堿性磷酸酶。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，底物是對氨基苯磷酸(p-APP)。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，癌細胞是結(jié)腸癌細胞。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，測定是用電化學(xué)電解池來進行。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，測定是在多孔陣列中進行。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，多孔陣列的各孔包含電化學(xué)電解池。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再一些特征，多孔陣列的各孔是納升體積的孔 (nano-volume well)。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再 化學(xué)物、碳水化合物、脂質(zhì)及其組合。
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
根據(jù)所述優(yōu)選實施方案中的再
本發(fā)明通過提供癌細胞的電學(xué)檢測方法而成功克服了目前已知配置的缺陷。
除非另有說明，否則本文所用的所有科技術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員公知的含義。盡管在本發(fā)明實踐或試驗中可采用類似于或等同于本文所述的方法與材 料，但是合適方法與材料如下所述。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考 文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中。在有矛盾的情況下，以包括定義在內(nèi)的本專利說明書 為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實施例僅為說明性、而非限制性的。
附圖簡述 參考附圖，僅以舉例方式描述本發(fā)明。具體參考附圖而言，強調(diào)的是具體的顯示是 以舉例方式并僅用于說明性討論本發(fā)明優(yōu)選實施方案的目的，并且是為了提供據(jù)信是對本 發(fā)明原理和概念方面的最有用且最易理解的描述。就此而言，并未顯示超出對本發(fā)明基本 理解所需的更詳細的本發(fā)明結(jié)構(gòu)性細節(jié)，根據(jù)描述和附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是
本發(fā)明的幾種形式是怎樣在實踐中實施的。
在附圖中

圖1A-C是描述HT-29結(jié)腸癌細胞對BA、磷酸丁?；柞ザ阴ズ投∷嵝挛祯Ｑ?基甲酯的反應(yīng)的曲線圖。用電化學(xué)陣列芯片產(chǎn)生對堿性磷酸酶活性進行監(jiān)測的電流反應(yīng)曲 線。使HT-29結(jié)腸癌細胞接觸以下分化劑丁酸(2. 5慮)-圖1A，磷酸丁?；柞ザ阴ズ?丁酸新戊酰氧基甲酯(50 ii M)-分別為圖1B和圖1C。將HT-29細胞和底物PAPP放入芯片 上的100nL體積的電化學(xué)小室中。用電流測量技術(shù)在220mV測定電流。誤差估計(5次重 復(fù))為2nA RMS。 圖2A-C是顯示每份樣品中細胞數(shù)的照片。
些特征，藥物包括試驗組合物。
-些特征，試驗組合物選自多核苷酸、多肽、小分子
些特征，藥物包括試驗條件。 些特征，試驗條件是輻射條件。 些特征，細胞是完整的。 些特征，癌細胞是完整的。 些特征，細胞是哺乳動物細胞。 些特征，癌細胞是哺乳動物細胞。
圖2D-F顯示的是樣品酶活性與細胞數(shù)的曲線圖。誤差估計(5次重復(fù))為3nA RMS。 圖3是柱狀圖，描述HT-29結(jié)腸癌細胞數(shù)與所誘導(dǎo)的堿性磷酸酶活性之間的關(guān)系。 活性用電流/時間來表示。每個結(jié)果代表3次測量的平均值。用電流測量技術(shù)在220mV測 定電流。 圖4A-C顯示用磷酸丁酰基甲酯二乙酯對HT-29細胞進行8小時處理的效果圖。圖 4A是柱狀圖，描述堿性磷酸酶電流信號的斜率。圖4B-C顯示的是，對不同數(shù)量的處理(圖 4B)和未處理(圖4C)細胞而言，電流隨時間的變化圖。 圖5A-C顯示用磷酸丁?；柞ザ阴T-29細胞進行78小時處理的效果圖。 圖5A是柱狀圖，描述堿性磷酸酶電流信號的斜率。圖5B-C顯示的是，對不同數(shù)量的處理 (圖5B)和未處理(圖5C)細胞而言，電流隨時間的變化圖。 圖6A-C顯示用磷酸丁?；柞ザ阴T-29細胞進行96小時處理的效果圖。 圖6A是柱狀圖，描述堿性磷酸酶電流信號的斜率。圖6B-C顯示的是，對不同數(shù)量的處理 (圖6B)和未處理(圖6C)細胞而言，電流隨時間的變化圖。
優(yōu)選實施方案的描述 本發(fā)明涉及癌細胞的檢測方法。具體地講，本發(fā)明可用于診斷癌癥，監(jiān)測治療，確 定治療方案和開發(fā)針對疾病的新型治療模式。 參考附圖和所附說明，可以更好地理解本發(fā)明方法的原理和操作。
在詳細解釋本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應(yīng)當(dāng)知道，以下實施例中的描述或 舉例說明所給出的細節(jié)并不限制本發(fā)明的應(yīng)用?？梢杂闷渌鼘嵤┓桨富虿煌绞絹韺嵤┗?實現(xiàn)本發(fā)明。另外，應(yīng)當(dāng)知道，本文所用的措詞和術(shù)語都用于描述的目的，不應(yīng)視為限制性。
分化治療集中在通過迫使癌細胞重新恢復(fù)成熟過程而誘導(dǎo)癌細胞變?yōu)檎＜毎?各種標(biāo)記物已用于監(jiān)測接受分化治療的患者的手段。 一種這樣的標(biāo)記物就是堿性磷酸酶， 其中該酶的表達看來與細胞分化狀態(tài)有關(guān)。 一般而言，正常酶活性表明，作為特定藥物治療 結(jié)果，細胞適當(dāng)?shù)胤只?；而缺乏酶活性則表明，對于特定癌癥和/或特定患者而言是無效藥 物治療。 然而，對這類標(biāo)記物，尚無方法能快速簡便而高靈敏度、高選擇性和高精度地進行 檢測。 本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)出新的電化學(xué)方法，用于靈敏而高通量地檢測癌細胞對 分化治療的反應(yīng)。 在將本發(fā)明付諸實施的時候，本發(fā)明的發(fā)明人就已經(jīng)知道可以使用p-APP等電化 學(xué)底物來進行酶的電流測量法，以便確定分化劑的有效性。如圖l所示，用本發(fā)明方法評價 了 3種分化劑對人結(jié)腸癌細胞的有效性。使用含小型電化學(xué)電解池陣列的芯片，本發(fā)明的 發(fā)明人能夠以高靈敏度、高精度和快速方式來監(jiān)測這些分化治療劑對極少量細胞樣品(少 于 15個細胞)的有效性(圖2A-F和圖3)。 在5分鐘內(nèi)，可用分辨率為10毫微安培的電流反應(yīng)測定藥物效果。此外，這些結(jié)
果表明所誘導(dǎo)的電流信號與納升體積的小室內(nèi)癌細胞計數(shù)之間的數(shù)量關(guān)系。 在臨床相關(guān)樣品中采用納升體積的分析設(shè)備很令人感興趣，因為只需要很少量組
織進行診斷，而且還能進行高通量分析并比較不同藥物對同一腫瘤樣品的效果，同時還能保持均一的生物條件和環(huán)境條件。另外，這一新方法有助于針對個別患者來定制癌癥藥物 和治療，成為"個性化醫(yī)療"。 因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供癌細胞的檢測方法。方法包括在酶催化細胞與 底物反應(yīng)的條件下，使細胞與酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物，然后測定電信 號水平，其中電信號水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細胞的標(biāo)志。 本文所用的術(shù)語"檢測"是指檢測、診斷、檢查、發(fā)現(xiàn)、揭示、觀察或鑒定細胞的行動。 本文所用的術(shù)語"細胞"是指哺乳動物細胞，優(yōu)選人體細胞。根據(jù)本發(fā)明，可使用單 細胞以及多個細胞。優(yōu)選多個細胞包含不少于10個細胞，且不多于500個細胞。優(yōu)選地， 細胞是在單個懸浮液中，這樣可以對細胞進行計數(shù)，盡管也可檢測粘附細胞和聚集物。多個 細胞可來自任何生物樣品，例如細胞系、原代培養(yǎng)物和細胞樣品，例如活檢樣品(手術(shù)活檢 樣品，包括切除或截除的活檢物、細針吸出物等)、完整切除物或體液。提取活檢樣品的方法 是本領(lǐng)域眾所周知的。 無需任何預(yù)處理，就可以評價生物樣品中細胞的功能酶。因此，生物樣品中的細胞 優(yōu)選是完整的(即整個細胞)，并且優(yōu)選是活的，盡管可以理解，本發(fā)明也包括對細胞進行 預(yù)處理，例如產(chǎn)生細胞提取物或非完整細胞。"癌細胞"，本文亦稱"惡性細胞"，是指已從正常細胞分裂控制中釋放出來的細胞， 因而其特性是異常生長并趨向于以非受控方式增殖，在某些情況下還會轉(zhuǎn)移。因此，癌細胞 可以是贅生性細胞、惡性前細胞(pre-malignant cell)、轉(zhuǎn)移性細胞、腫瘤細胞、致癌細胞、 具有癌基因型的細胞、惡性表型的細胞、癌基因轉(zhuǎn)染細胞、病毒轉(zhuǎn)化細胞、表達癌基因的細 胞、表達癌癥標(biāo)記物的細胞或其組合。 可以用本發(fā)明方法檢測的癌細胞的非限制性實例是腺癌細胞、腎上腺腫瘤細 胞、成釉細胞瘤細胞、退行性細胞(an即lastic cell)、甲狀腺細胞的退行性癌、血管纖 維瘤細胞、血管瘤細胞、血管肉瘤細胞、胺前體攝取脫羧細胞瘤細胞(apudoma cell)、 嗜銀細胞瘤細胞(argentaffmoma cell)、卵巢男胚瘤細胞、腹水腫瘤細胞(ascites t咖orcell)、腹水瘤細胞(ascitic tumor cell)、星形母細胞瘤細胞、星形細胞瘤細胞、 共濟失調(diào)-毛細血管擴張細胞、前房粘液瘤細胞(atrial myxomacell)、基底細胞癌細 胞、良性腫瘤細胞、骨癌細胞、骨瘤細胞、腦干膠質(zhì)瘤細胞、腦瘤細胞、乳癌細胞、伯基特淋 巴瘤細胞(Burkitt' slymphoma cell)、癌性細胞(cancerous cell)、類癌細胞、癌細胞 (carcinomacell)、小腦星形細胞瘤細胞、宮頸癌細胞、櫻桃狀血管瘤細胞、膽管癌細胞、 膽管瘤細胞、軟骨母細胞瘤細胞、軟骨瘤細胞、軟骨肉瘤細胞、成絨毛膜細胞瘤細胞、絨毛 膜癌細胞、結(jié)腸癌細胞、常見急性成淋巴細胞性白血病細胞、顱因管瘤細胞、囊性癌細胞、 囊性纖維瘤細胞(cystofbroma cell)、囊瘤細胞、細胞瘤細胞、腺管原位癌細胞、腺管乳 頭瘤細胞(ductal papilloma cell)、無性細胞瘤細胞、腦瘤細胞、子宮內(nèi)膜癌細胞、內(nèi) 皮瘤細胞、室管膜瘤細胞、上皮瘤細胞、紅白血病細胞、尤因肉瘤細胞(Ewing' s sarcoma cell)、外結(jié)節(jié)淋巴瘤細胞(extranodal lymphoma cell)、貓科肉瘤細胞、纖維腺瘤細 胞(fibro adenomacell)、纖維肉瘤細胞(fibro sarcoma cell)、甲狀腺濾泡癌細胞、神 經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤細胞、胃泌素瘤細胞、多形性成膠質(zhì)細胞瘤細胞、膠質(zhì)瘤細胞、成性 腺細胞瘤細胞、成血管細胞瘤細胞(haemangioblastomacell)、成血管內(nèi)皮細胞瘤細胞(haemangioendothelioblastoma cell)、血管內(nèi)皮細胞瘤細胞(haemangioendothelioma cell)、血管夕卜皮細胞瘤細胞(haemangiopericytoma cell)、血f林巴管瘤細胞 (haematolymphangiomacell)、成血細胞瘤細胞(haemocytoblastoma cell)、血細胞瘤細胞 (haemocytoma cell)、毛細胞白血病細胞、錯構(gòu)瘤細胞、肝癌細胞、肝細胞癌細胞、肝細胞瘤 細胞、組織瘤細胞、霍奇金病細胞(Hodgkin'sdisease cell)、腎上腺樣瘤細胞、浸潤性癌細 胞、浸潤性腺管細胞癌細胞、胰島素瘤細胞、幼年血管纖維瘤細胞(juvenile angioforoma cell)、卡波西肉瘤細胞、腎瘤細胞、大細胞淋巴瘤細胞、白血病細胞、慢性白血病細胞、急性 白血病細胞、脂肪瘤細胞、肝癌細胞、肝轉(zhuǎn)移細胞、呂克癌細胞(Lucke carcinoma cell)、淋 巴腺瘤細胞、淋巴管瘤細胞、淋巴細胞性白血病細胞、淋巴細胞性淋巴瘤細胞、淋巴細胞瘤 細胞(lymphoeytoma cell)、淋巴水腫細胞(lymphoedema cell)、淋巴瘤細胞、肺癌細胞、 惡性間皮瘤細胞、惡性畸胎瘤細胞、肥大細胞瘤細胞、成神經(jīng)管細胞瘤細胞、黑素瘤細胞、腦 膜瘤細胞、間皮瘤細胞、轉(zhuǎn)移性細胞(metastatic cell)、轉(zhuǎn)移細胞(metastasis cell)、 轉(zhuǎn)移擴散細胞(metastatic spread cell)、摩頓神經(jīng)瘤細胞(Morton' s neuroma cell)、 多發(fā)性骨髓瘤細胞、成髓細胞瘤細胞、髓性白血病細胞、骨髓脂肪瘤細胞、骨髓瘤細胞、成 肌細胞瘤細胞、粘液瘤細胞、鼻咽癌細胞、贅生性細胞(neoplastic cell)、腎胚細胞瘤細 胞、成神經(jīng)細胞瘤細胞、神經(jīng)纖維瘤細胞、神經(jīng)纖維瘤病細胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、神經(jīng)瘤細 胞、非霍奇金淋巴瘤細胞(Non-Hodgkin' s lymphoma cell)、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、視神 經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、骨軟骨瘤細胞、成骨肉瘤細胞、骨肉瘤細胞、卵巢癌細胞、乳頭細胞的佩吉 特病(Paget' s disease of the nipple cell)、潘禾斗其jf特月中瘤細胞(pancoast tumor cell)、胰腺癌細胞、暗色素細胞瘤細胞(phaeochromocytoma cell)、嗜鉻細胞瘤細胞 (pheoehromocytoma cell)、漿細胞瘤細胞、原發(fā)性腦瘤細胞、錯構(gòu)瘤細胞、催乳素瘤細胞、 腎細胞癌細胞、成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞、橫紋肌肉瘤細胞(rhabdomyosarcomacell)、橫紋肌肉 瘤細胞(rhabdosarcoma cell)、實體瘤細胞、肉瘤細胞、繼發(fā)性腫瘤細胞、精原細胞瘤細胞、 皮膚癌細胞、小細胞癌細胞、鱗狀細胞癌細胞、草莓狀血管瘤細胞、T細胞淋巴瘤細胞、畸胎 瘤細胞、睪丸癌細胞、胸腺瘤細胞、滋養(yǎng)層腫瘤細胞、致瘤細胞(tumorigeniccell)、腫瘤發(fā) 生細胞(tumor initiation cell)、月中瘤發(fā)展細胞(tumorprogression cell)、前庭神經(jīng)銷 瘤細胞、維爾姆斯瘤細胞(Wilm' s tumorcell)或它們的組合。
根據(jù)本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案，癌細胞是結(jié)腸癌細胞。 如上所述，本發(fā)明的方法是通過使酶的底物與細胞接觸、引起細胞反應(yīng)而進行的， 其中酶促反應(yīng)產(chǎn)物能夠產(chǎn)生電信號。 本文所用的術(shù)語"細胞反應(yīng)"是指底物與細胞所表達的內(nèi)源性酶之間發(fā)生的反應(yīng)， 而不是與外源性酶發(fā)生的反應(yīng)。 根據(jù)需要檢測的酶(在本文也稱為"標(biāo)記酶")來選擇底物。酶可位于細胞內(nèi)(即 胞內(nèi)酶)或細胞膜上(即膜結(jié)合酶)。根據(jù)另一實施方案，酶是分泌酶?？梢岳斫?，當(dāng)待檢 測的酶是胞內(nèi)酶時，優(yōu)選底物是膜滲透性的。此外，優(yōu)選選擇底物，使得在催化后，所生成的 產(chǎn)物也是膜滲透性的，使得它可從細胞中擴散出來并到達檢測電極。 根據(jù)一個實施方案，需要檢測的酶是堿性磷酸酶(或分泌型堿性磷酸酶(SEAP))， 而底物是17，4-氨基苯磷酸(p-APP)。堿性磷酸酶使p-APP轉(zhuǎn)化為電化學(xué)產(chǎn)物，即對氨基苯 酚(PAP)。
p-APP是一種普通的市售產(chǎn)品，可得自Sigma-Aldrich公司(www. sigmaaldrich. com) 、 Bio-world公司(www. Bio-world, com)禾口許多其他公司。 堿性磷酸酶存在于正常細胞中，但在癌細胞中減少(或甚至不存在)。因此，對細 胞的堿性磷酸酶活性水平進行分析，可用作評價特定藥物有效性的標(biāo)記，可用于治療癌癥 乃至用于診斷目的。 本文所用的術(shù)語"接觸"是指在底物可被酶催化的條件下，使底物接近細胞。因此， 例如應(yīng)在緩沖劑條件下，在允許催化底物并生成電化學(xué)電解池所檢測的足夠的產(chǎn)物的溫度 和時間下進行接觸。例如，當(dāng)p-APP用作底物時，優(yōu)選在室溫下接觸至少5分鐘_參見以下 實施例2和實施例3。 可在體外、離體或體內(nèi)進行接觸。可在容器中進行接觸，該容器也能檢測酶促反應(yīng) 產(chǎn)物(即在電化學(xué)電解池中)，這樣就可在線檢測電信號。下文將進一步介紹這樣的容器。 或者，可在分離的容器中進行接觸，從中進行檢測，使得能夠在特定時間點連續(xù)取樣并將所 取樣品放入電化學(xué)電解池內(nèi)。因此，可在試管、燒瓶、組織培養(yǎng)器、芯片、陣列、板、微量板、毛 細管等中進行接觸?？蓪⒓毎旁谡駝影迳希偌尤氲孜?，用于連續(xù)充分混合細胞內(nèi)容物。
如上所述，在化學(xué)電解池的電極上對能經(jīng)歷氧還反應(yīng)(即能進行電子轉(zhuǎn)移)而得 到電信號的產(chǎn)物(即電化學(xué)產(chǎn)物)進行電化學(xué)測量，通常是在電化學(xué)電解池中進行。
本文所用的術(shù)語"電信號"是指電子或電化學(xué)活性物。 本文所用的術(shù)語"電化學(xué)測量"是指通過使用溶液中的、尤其是電化學(xué)電解池中的 電極來進行的測量?？赏ㄟ^例如定時電流法、定時電位法、循環(huán)伏安法、定時庫侖法或方波 伏安法，來進行測量。在這樣的測量中可檢測的信號，與在這些電化學(xué)測量中來自對照的信 號是不同的。 對于在線測量，本發(fā)明的電化學(xué)電解池包括測量電極、返回電極(return electrode)、參考電極和容納電解池的小室。 工作電極具有各種不同類型，例如可由碳(包括玻璃碳、活性碳布電極、碳氈、鉑
化碳布、平紋碳布)制成，也可由金、鉑或銀制成。對電極也可由與工作電極相同的材料制
成。參考電極可以是例如飽和甘滎電極，可以是Ag/AgCl電極。此夕卜，電極可以是絲網(wǎng)印刷
電極，其可插入到含電解池的容器中，而無需取出樣品并轉(zhuǎn)移到單獨的電化學(xué)電解池中。 用于按照本發(fā)明方法測定產(chǎn)物的電極可以是可重復(fù)使用的電極或一次性電極。可
重復(fù)使用的電極可以是例如由玻璃碳制成的盤狀或棒狀電極，其可嵌入特氟隆中。 一次性
電極可以是例如呈碳紙、碳布、碳氈形式的電極或上述種類的絲網(wǎng)印刷電極。 根據(jù)一個實施方案，電化學(xué)電解池是三電極電解池。根據(jù)另一實施方案，電化學(xué)電
解池是兩電極電解池。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，可以陣列(即芯片)形式提供電化學(xué)電解池，
所述陣列包含多個這樣的電解池即多孔陣列，其中各孔的大小是納升體積。 用于測定由反應(yīng)產(chǎn)物產(chǎn)生的電信號的系統(tǒng)還可包括控制模塊，其可以是計算機、
恒電位儀和復(fù)用器模塊(multiplexer module)，復(fù)用器模塊在同時測量多個電化學(xué)電解池
的典型實施方案的情況下是需要的。 參考定時電流模式，將描述在電解池中進行的電化學(xué)測量。應(yīng)當(dāng)理解，對其加以必 要的修正，也可用于上述其它電化學(xué)測量模式。此外，參考使用多電極系統(tǒng)(包含多個電極 的系統(tǒng))，可進行描述，并且顯然也可用于含單個電解池的系統(tǒng)。
在電化學(xué)測量開始，一起操作所有電極，計算機通過并聯(lián)端口掃描所有電極，并通 過計算機記錄針對各電極施用電位時的背景響應(yīng)。在一段長時間中，可進行完整的電化學(xué) 測量程序，同時測量因產(chǎn)物濃度改變而產(chǎn)生的電流。在電極表面因天然變異性所導(dǎo)致的不 相同的情況下，可通過測量電活性物(尤其是與電化學(xué)電解池中的酶促反應(yīng)產(chǎn)物相同種 類)的氧化或還原并比較所有電極結(jié)果，來標(biāo)定系統(tǒng)。 在進行測定時，可將電極與恒電位儀相連接，并同時也通過復(fù)用器聚集到微機并 聯(lián)端口。 將各電極插入到含參考電極和反電極的電化學(xué)電解池中，這些電極也與恒電位儀 相連接。通過恒電位儀將特定電位施加在電極上(所有電極可以施加相同電位，或者每個 電極施加不同電位)并檢測各電極的電流。在計算機屏幕上可實時觀察電信號。
因為酶促反應(yīng)的電化學(xué)產(chǎn)物所產(chǎn)生的電信號反映出細胞中的酶水平，而且酶(其 存在、不存在或水平)是癌癥的標(biāo)記物，所以信號可用于確定細胞是否癌變(即惡性)。具 體地講，如果所產(chǎn)生的電信號水平與預(yù)定閾值不同，則表明細胞是癌細胞。通常，預(yù)定閾值 是通過對照細胞所產(chǎn)生的電信號來確定的。 對照細胞可以是正常分化細胞、非癌變細胞，優(yōu)選與懷疑癌變或未分化表型的被 測細胞同屬相同組織和樣本。與對照細胞相比，優(yōu)選差異至少為10%、20%、30%、40%、 50%、80%、100% (即2倍)、3倍、5倍或10倍。 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，癌細胞中的酶含量(和由此而來的電信號)低于非 癌細胞中的酶含量(和由此而來的電信號)。 根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，癌細胞中的酶含量(和由此而來的電信號)高于
非癌細胞中的酶含量(和由此而來的電信號)。 可以理解，本發(fā)明的方法可用于診斷癌癥患者。 本文所用的術(shù)語"診斷"是指對癌癥進行分類，確定癌癥的嚴(yán)重程度(分級或分 期)，監(jiān)測癌癥的發(fā)展，預(yù)測癌癥的結(jié)果和/或痊愈的希望。 受試者可以是經(jīng)過常規(guī)健康檢查的健康動物或人類受試者?；蛘?，受試者可以是 處于癌癥危險中的患者(例如具有遺傳傾向的受試者，具有病史和/或家族史的受試者， 已接觸致癌物、職業(yè)危害、環(huán)境危害的受試者，和/或表現(xiàn)出可疑癌癥臨床癥狀(例如便血 或黑便、不明原因的疼痛、出汗、不明原因的發(fā)熱、不明原因的體重減輕至厭食、腸習(xí)性改變 (便秘和/或腹瀉)、里急后重(感覺排便不完全，尤其是對于直腸癌而言)、貧血和/或全 身乏力)的受試者。 可以理解，本發(fā)明具有涉及以下的各種用途個性化優(yōu)化癌癥治療，監(jiān)測患者的抗 癌治療，測定患者的抗癌治療和鑒定能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型的藥物。 因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型的藥物的鑒定方法。方法 包括使至少一個癌細胞接觸藥物并測定抗癌藥的效果，即按照本發(fā)明的方法來監(jiān)測標(biāo)記酶 (例如堿性磷酸酶)的活性或表達。 本文所用的術(shù)語"逆轉(zhuǎn)惡性表型"是指至少部分地逆轉(zhuǎn)惡性細胞的增殖和/或侵 襲性。 本文所用的術(shù)語"藥物"是指包含生物制劑或化學(xué)制劑的試驗組合物。 經(jīng)本發(fā)明的方法測試為潛在抗癌藥的生物制劑的實例包括但不限于核酸(例如多核苷酸、核酶、siRNA和反義分子(包括但不限于RNA、 DNA、 RNA/DNA雜合體、肽核酸以及 具有改變的主鏈和/或基本結(jié)構(gòu)(bass structure)或其它化學(xué)修飾的多核苷酸類似物)； 蛋白質(zhì)、多肽(例如肽)、碳水化合物、脂質(zhì)和"小分子"候選藥物。"小分子"可以例如是天 然存在的化合物(例如衍生自植物提取物、微生物肉湯等的化合物)或合成的有機化合物 或有機金屬化合物，其分子量小于約10， 000道爾頓，優(yōu)選小于約5， 000道爾頓，最優(yōu)選小于 約1， 500道爾頓。 根據(jù)本發(fā)明該方面的優(yōu)選實施方案，藥物可以是分化劑，包括但不限于丁酸及其 衍生物。 經(jīng)本發(fā)明方法測試為潛在抗癌藥的條件的實例包括但不限于輻射暴露(例如Y 輻射、紫外輻射、X射線)。 根據(jù)本發(fā)明該方面的一個實施方案，也可在接觸藥物之前對"標(biāo)記酶"進行測定分 析，從而可在治療前后進行比較。 根據(jù)本發(fā)明該方面的另一實施方案，使藥物接觸癌細胞足夠長時間，以產(chǎn)生抗癌 效果。因此，例如如果是分析丁酸和/或其衍生物的話，優(yōu)選這些藥物接觸癌細胞的時間至 少為l天，更優(yōu)選為3天。 可以理解，可以使藥物在體外、離體或體內(nèi)接觸癌細胞。如果接觸是在體內(nèi)進行， 通常在接觸本發(fā)明底物之前，將細胞從患者體內(nèi)取出。 在理論上，盡管可用單個電化學(xué)電解池實施本發(fā)明，但是這樣的方法既無效果又 不合乎要求。優(yōu)選本發(fā)明的方法使用多個電化學(xué)電解池同時篩選不同藥物，用于高通量藥 物篩選。電解池可以是芯片的組成部分，所述芯片例如以下實施例1所述的硅芯片。
因此，根據(jù)一個實施方案，采用高通量方式實施本發(fā)明的方法。因此，可使用例如 自動取樣裝置、液體處理裝置、分配器、電極陣列、機器人或其任何組合，來實施本發(fā)明的方 法。 目前已經(jīng)知道，僅根據(jù)腫瘤類型和解剖學(xué)位置是無法預(yù)測腫瘤治療反應(yīng)的?？梢?理解，可以修改能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型的藥物的鑒定方法，使得特定患者細胞可用于測定系
統(tǒng)，因而可定制針對特定患者的治療藥。此外，可以理解，用本發(fā)明的方法不僅可選擇具體 藥物，而且還可根據(jù)本發(fā)明的方法來鑒定最佳劑量和最佳治療方案。采用這樣的方式，可以 確定藥物的治療有效量。 可根據(jù)本發(fā)明方法所選擇的最佳治療條件來治療患者，并任選在合適的時間周期 之后進行復(fù)檢。采用這樣的方式，可以在治療進行期間連續(xù)監(jiān)測患者的反應(yīng)。
可以理解，在治療期間，對酶水平的分析和給藥步驟可重復(fù)多次。例如可以每周分 析堿性磷酸酶水平，然后給予藥物。如果堿性磷酸酶水平比對照高，就減少藥物劑量。如果 堿性磷酸酶水平比對照低，就增加藥物劑量。 可以理解，可在藥盒中提供本發(fā)明的電化學(xué)電解池以及至少一種抗癌藥(例如分
化劑，例如丁酸)，用于測定其對癌細胞的效果。如有必要，本發(fā)明的藥盒可以呈包裝形式， 其可含有本發(fā)明藥盒的一個或多個單位。包裝中可帶有藥盒的使用說明書和抗癌藥對具體
細胞數(shù)的估計劑量。包裝中也可帶有由政府機構(gòu)對實驗室添加物(laboratorysupplement) 的制造、使用或銷售所規(guī)定的、與該包裝容器有關(guān)的信息，這種信息表明政府機構(gòu)許可所述 組合物的形式。
根據(jù)一個實施方案，藥盒還可包含底物，所述底物被生物細胞(即癌細胞)的標(biāo)記 酶催化而進行酶促反應(yīng)以生成反應(yīng)產(chǎn)物，從而在電化學(xué)電解池的電極上發(fā)生氧還反應(yīng)。這 樣的底物在上文已有描述。 在本專利有效期間，預(yù)計將會開發(fā)出許多相關(guān)底物，并且底物這一術(shù)語的范圍包 括所有這類新技術(shù)成果(all such new technologies apriori)。 根據(jù)以下非限制性實施例，本發(fā)明的額外目的、優(yōu)勢和新特征將是本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員顯而易見的。另外，以上所述的和以下權(quán)利要求書部分要求保護的本發(fā)明各實施方 案和方面，在以下實施例中都可找到實驗支持。
實施例 下面給出了以下實施例的參考文獻，這些參考文獻連同以上描述一起，以非限制 性方式說明本發(fā)明。 通常，本文所用的命名法和本發(fā)明所用的實驗室方法包括分子技術(shù)、生物化學(xué)技 術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻中有充分解釋。參見例如"Molecular Cloning :A laboratory Maruml，，S咖brook等(1989) ;"Current Protocols in Molecular Biology，，第I-III巻，Ausubel， R. M.編著(1994) ;Ausubel等，"Current Protocols inMolecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1989) ;Perbal， "A Practical Guide to Molecular Cloning，，， John Wiley&Sons， New York(1988); Watson等，"Recombinant DNA，，, Scientific AmericanBooks， New York ;Birren等(編 著)"Genome Analysis :A LaboratoryMa皿al Series，，，第1-4巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NewYork(1998);美國專利號4,666,828 ;4,683,202 ;4,801,531 ; 5， 192， 659和5， 272， 057中記載的方法;"Cell Biology :A Laboratory Handbook",第 I-III巻，Cellis， J. E.編著(1994) ;"Culture of Animal Cells-A Ma麗l ofBasic Technique", Freshney， Wiley-Liss， N. Y. (1994)， 第3片反；"Cur:rentP:rotocols in Immunology"第I-III巻，Coligan J. E.編著(1994) ;Stites等(編著)，"Basic and Clinical Immunology"(第8版)，Appleton&Lange， Norwalk， CT(1994) ;Mishell禾口 Shiigi(編 著)，"Selected Methods inCellular Immunology", W. H. Freeman and Co. ， New York(1980);有用的免疫測定在專利和科學(xué)文獻中有廣泛深入描述，參見例 如美國專利號3， 791， 932 ;3， 839， 153 ;3， 850， 752 ;3， 850， 578 ;3， 853， 987 ;3， 867， 517 ; 3， 879， 262 ;3， 901， 654 ;3， 935， 074 ;3， 984， 533 ;3， 996， 345 ;4， 034， 074 ;4， 098， 876 ; 4， 879， 219 ;5， 011， 771和5， 281， 521 ;"01igonucleotideSynthesis"Gait， M. J.編著 (1984) ;"Nucleic Acid Hybridization" Hames， B. D.禾P Higgins S.J.編著(1985); "Transcription and Translation" Hames， B. D.禾口 Higgins S.J.編著(1984) ;"Animal Cell Culture" Freshney， R. I. 編著 (1986) ;"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986) ;"APractical Guide to Molecular Cloning"Perbal， B. ， (1984); 禾口 "Methods inEnzymology，， 第 1-317巻，Academic Press ;"PCR Protocols :A Guide ToMethods and Applications", Academic Press, San Diego， CA(1990) ;Marshak等， "Strategies for Protein Purification and Characterization-Al^boratory Course Ma皿al"CSHL Press (1996);所有這些文獻都通過引用全部結(jié)合到本文中。本文全文提供了其它的一般性參考文獻。其中的方法據(jù)信在本領(lǐng)域是眾所周知的并且為了讀者方便而提
供。其中所含所有信息都通過引用結(jié)合到本文中。 實施例1 納米生物芯片的制備 利用標(biāo)準(zhǔn)微系統(tǒng)技術(shù)(micro-system-technology, MST)方法，設(shè)計并制造出了納 米生物芯片(nano-bio-chip)。其構(gòu)造包括小型電化學(xué)電解池陣列。將電解池放入納升體 積的小室(即電化學(xué)電解池)中。每個圓柱狀小室容納100nL體積。所有陣列都包括陽性 和陰性對照小室。 裝置分兩部分來制備a) —次性芯片其具有納升小室，其中放入了電解池 (cell)，和b)可重復(fù)使用芯片其與包括復(fù)用器、恒電位儀、溫度控制和袖珍型PC在內(nèi)的電 子電路相連接，用于傳感和數(shù)據(jù)分析。這套設(shè)置允許連續(xù)重復(fù)使用，用于多次測量。
芯片由硅制成，并含有8個小型電化學(xué)電解池陣列。每個電化學(xué)電解池由以下3 個圓形、周圍有絕緣氮化硅層的電極組成1)金工作電極，2)金反電極和3)Ag/AgCl參考 電極。電極是通過金濺射、顯微光刻技術(shù)(microlithography)和選擇性沉積Ag而制成，而 對于參考電極，還要使其在含氯溶液中陽極化。小室壁是由光聚合的聚酰亞胺構(gòu)成(SU-8) (圖1A-B)。硅芯片通過導(dǎo)線與塑料芯片連接，后者接入電子電路。 通過接入電子電路的手持式掌上恒電位儀進行信號傳導(dǎo)，用于電極信號的調(diào)制和 檢測(Palm Instruments BV-2004)。該電子儀器是由具有溫度控制的電化學(xué)電解池的8個 獨立重復(fù)電路組成。在各電化學(xué)電解池的工作電極與參考電極之間施加電位并測定輸出電 流。 實施例2-3
通用材料與方法 細胞系和培養(yǎng)物在37°〇/95%空氣/5%0)2中，將1^-29人結(jié)腸癌細胞在含胎牛 血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，然后進行丁酸處理。將不同濃度的丁酸加入到HT-29細胞 培養(yǎng)物中。所用濃度為0mM、0. 078mM、0. 156mM、0. 3125mM、0. 625mM、 1. 25mM、2. 5mM、5mM和 10mM。由此求出最佳丁酸濃度、LC50和活力。測定在PBS中進行，用完整細胞而沒有對癌 細胞進行額外處理(例如溶解細胞)。 丁酸(BA)及其衍生物將范圍在0. 08-10mM之內(nèi)的丁酸(BA) (Sigma， Israel)加 入到HT-29結(jié)腸癌細胞中并孵育72小時，用于優(yōu)化。固定濃度為2. 5mM的BA用于所有電 化學(xué)實驗。如文獻所述，合成BA衍生物即磷酸丁?；柞ザ阴ズ投∷嵝挛祯Ｑ趸柞?[R印haeliA， Zhuk R， Nudelman A，2000， Drug Develop. Res.第50巻379-391]。將磷酸 丁?；柞ザ阴ト苡赑BS中，丁酸新戊酰氧基甲酯溶于匿SO中，然后用培養(yǎng)基稀釋至最 終匿S0濃度為《0. 1%。再將固定濃度為50iiM的前體藥物加入到細胞中并在37t:/95% 空氣/5% C02的條件下孵育96小時。與分化劑一起孵育之后，通過錐蟲藍排出法(tripa blue exclusion)進行活細胞計數(shù)并檢測活力，求出LC50。在所有電化學(xué)測量之前，將細胞 離心并在PBS中稀釋。所有測量都在PBS中進行。通過測定堿性磷酸酶的酶活性，來測定 BA、 丁酸新戊酰氧基甲酯和磷酸丁酰基甲酯二乙酯的影響。
堿性磷酸酶活性測定 光學(xué)測定用光學(xué)底物對硝基苯磷酸(現(xiàn)成的PNPP試劑盒，Sigma)測定堿性磷酸酶活性。在420nm波長處測定所得酶促產(chǎn)物。 電化學(xué)測量用電化學(xué)底物p-APP進行酶的電流測量。在220mV下，酶促反應(yīng)產(chǎn)物 氨基苯酚(p-AP)在金工作電極上被氧化，測量所產(chǎn)生的電流。在8通道100nL體積的電化 學(xué)小室中加入經(jīng)BA或其衍生物處理過的HT-29癌細胞。將細胞放入電化學(xué)小室中，加入底 物至終濃度為lmg/ml，總體積為100nL。測量所產(chǎn)生的電流并在顯微鏡下對細胞進行計數(shù)。 分析細胞數(shù)與電流密度之間的關(guān)系。
實施例2 經(jīng)本發(fā)明生物芯片測定的藥物對結(jié)腸癌細胞的效果 為了進行個性化癌癥治療，檢測各種單一來源的藥物對人結(jié)腸癌細胞(HT-29)的 影響。 結(jié)果 使HT-29結(jié)腸癌細胞與不同分化治療劑接觸96小時，然后測定所誘導(dǎo)的堿性磷酸 酶活性。陣列上的各電化學(xué)小室中加入接觸過不同試劑的細胞，這些試劑是丁酸、磷酸丁酰 基甲酯二乙酯和丁酸新戊酰氧基甲酯。結(jié)果見圖1A-C。正常酶活性表明，作為特定藥物治 療結(jié)果，細胞適當(dāng)?shù)胤只?。如圖lA-C所示，在50iiM濃度時，BA和磷酸丁?；柞ザ阴フT 導(dǎo)堿性磷酸酶的酶活性，而丁酸新戊酰氧基甲酯卻未誘導(dǎo)出任何酶活性，對于HT-29癌細 胞，這可能涉及其潛力降低[M. Entin-Meer等，Molecular Cancer Ther即eutics，第4巻， 第1952-1961頁，2005 ;D. Engel等，Clinical Cancer Research,第11巻，第9052S-9052S 頁，2005]。另外，設(shè)置陽性和陰性對照在小室中加入經(jīng)藥物處理的細胞，未處理細胞作為 陰性對照，而純化的堿性磷酸酶作為陽性對照。重要的是，注意到磷酸丁?；柞ザ阴ヅc BA的分化效果類似，盡管前者濃度要低1. 5個數(shù)量級，即磷酸丁?；柞ザ阴ズ虰A的濃 度分別為50iiM和2. 5mM。
實施例3 用生物芯片對癌細胞進行定量測定
結(jié)果 測定所誘導(dǎo)的電流信號與納升體積小室內(nèi)癌細胞計數(shù)之間的顯著的數(shù)量關(guān)系。癌 細胞計數(shù)和相對酶活性見圖2A-F。用電化學(xué)陣列芯片，得到對堿性磷酸酶活性監(jiān)測的電流 反應(yīng)曲線。將HT-29結(jié)腸癌細胞暴露給丁酸(2. 5mM)。將HT-29細胞以及底物PAPP放入芯 片中100nL體積的電化學(xué)小室內(nèi)。用電流測量技術(shù)在220mV測量電流。上中下3條曲線分 別表示小室內(nèi)計數(shù)的約100個細胞、15個和0個細胞的電流反應(yīng)。多次測量表明小室內(nèi)細 胞計數(shù)與堿性磷酸酶活性之間具有高相關(guān)性。結(jié)果見圖3。定量測定酶促反應(yīng)的能力是因 為芯片的小型化設(shè)計，并結(jié)合電化學(xué)檢測方法上的優(yōu)勢。
實施例4 經(jīng)本發(fā)明生物芯片測定的磷酸丁?；柞ザ阴?
對結(jié)腸癌細胞的效果 為了進一步檢測生物芯片的靈敏度，將數(shù)量遞增的HT-29結(jié)腸癌細胞與磷酸丁酰 基甲酯二乙酯一起孵育不同時間。用本發(fā)明生物芯片測定內(nèi)源性堿性磷酸酶的含量。
結(jié)果 結(jié)果見圖4A-C、5A-C和6A-C。磷酸丁?；柞ザ阴Π┘毎男ЧS孵育時間的延長而增加。另外，可以觀察到，效果的大小與所檢測細胞數(shù)有關(guān)。
結(jié)論 已經(jīng)證明了靈敏而高通量檢測響應(yīng)分化治療的癌細胞的新方法。就人結(jié)腸癌細胞
而言，這些細胞用不同分化治療藥物處理，同時在線測量細胞對不同藥物的反應(yīng)。這樣的微
陣列技術(shù)提供了在線檢測多種藥物的能力并能針對個體來定制有效治療。 這樣的"芯片實驗室(Lab-on-a-chip)"系統(tǒng)提供了對極少量樣品(少于 15個
細胞)的靈敏的檢測能力，而且在插入芯片之前無需進行特別的細胞處理。 可以理解，為了清楚起見，在獨立的實施方案內(nèi)容中所描述的本發(fā)明的某些特征，
也可以組合方式在單個實施方案中提供。相比之下，為了簡明起見，在單個實施方案中所描
述本發(fā)明的不同特征也可分別或在任何合適的亞組合中提供。 盡管結(jié)合具體的實施方案已經(jīng)描述了本發(fā)明，但是很明顯，許多替代、修改和改動 對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，所有落入所附權(quán)利要求書的精神和寬范圍內(nèi)的這 樣的替代、修改和改動都涵蓋在內(nèi)。本說明書所提及的所有出版物、專利和專利申請都通過 引用全部結(jié)合到本文中，其程度與每篇出版物、專利和專利申請各自通過引用結(jié)合到本文 中一樣。另外，在本申請中任何參考文獻的引用或鑒定都不應(yīng)視為承認(rèn)這類參考文獻對本 發(fā)明是可用的現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
一種檢測癌細胞的方法，所述方法包括(a)在酶催化細胞與底物反應(yīng)的條件下，使所述細胞與所述酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物；和(b)測定所述電信號水平，其中所述電信號水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細胞的標(biāo)志。
2. —種診斷癌癥患者的方法，所述方法包括(a) 在酶催化細胞與底物反應(yīng)的條件下，使患者樣品中的至少一個所述細胞與所述酶 的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物；禾口(b) 測定所述電信號水平，其中所述電信號水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌癥的標(biāo)志o
3. —種對癌癥治療進行個性化優(yōu)化的方法，所述方法包括(a) 使患者樣品中的至少一個癌細胞與至少一種抗癌藥接觸；(b) 在酶催化細胞與底物反應(yīng)的條件下，使所述至少一個癌細胞與所述酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物；禾口(c) 測定所述細胞所產(chǎn)生的所述電信號水平，其中所述水平表示所述抗癌藥對所述患 者癌癥的療效。
4. 一種監(jiān)測患者的抗癌治療的方法，所述方法包括(a) 給予所述患者至少一種抗癌藥；(b) 按照權(quán)利要求1的方法的步驟(a)，檢測所述患者樣品中癌細胞的存在或水平，其 中所述存在或水平表示癌癥狀態(tài)。
5. —種檢測患者的抗癌治療的方法，所述方法包括(a) 按照權(quán)利要求1的方法，分析所述患者樣品中癌細胞的存在或水平；(b) 根據(jù)所述患者樣品中所述癌細胞的存在或水平，給予所述患者治療有效量的抗癌藥。
6. —種能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型的藥物的鑒定方法，所述方法包括(a) 使至少一個癌細胞接觸藥物；(b) 按照權(quán)利要求1的方法的(a)并任選在(a)之前，測定所述細胞的惡性表型，其中 表型逆轉(zhuǎn)是藥物能逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型的標(biāo)志。
7. 權(quán)利要求5的方法，所述方法還包括在步驟(b)后重復(fù)步驟(a)。
8. 權(quán)利要求2、3和6中任一項的方法，其中所述至少一個細胞包括多個細胞。
9. 權(quán)利要求1、2、3和6中任一項的方法，其中所述測定是用高通量方式進行。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述方式選自自動取樣裝置、液體處理裝置、分配器、電極 陣列、機器人或其任何組合。
11. 權(quán)利要求l的方法，其中所述接觸是在體外進行。
12. 權(quán)利要求l的方法，其中所述接觸是在離體情況下進行。
13. 權(quán)利要求2-5中任一項的方法，其中所述樣品包含不多于500個細胞。
14. 權(quán)利要求2-6中任一項的方法，其中所述活檢樣品包含不少于IO個細胞。
15. 權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述酶是堿性磷酸酶。
16. 權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述底物是對氨基苯磷酸。
17. 權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述癌細胞是結(jié)腸癌細胞。
18. 權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述測定是用電化學(xué)電解池來進行。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述測定是在多孔陣列中進行。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述多孔陣列的各孔包含電化學(xué)電解池。
21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述多孔陣列的各孔是納升體積的孔。
22. 權(quán)利要求3-6中任一項的方法，其中所述藥物包括試驗組合物。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述試驗組合物選自多核苷酸、多肽、小分子化學(xué)物、碳 水化合物、脂質(zhì)及其組合。
24. 權(quán)利要求3-6中任一項的方法，其中所述藥物包括試驗條件。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述試驗條件是輻射條件。
26. 權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述細胞是完整的。
27. 權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其中所述癌細胞是完整的。
28. 權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
29. 權(quán)利要求4-6中任一項的方法，其中所述癌細胞是哺乳動物細胞。
30. —種專為按照權(quán)利要求1的方法檢測癌細胞而設(shè)計的系統(tǒng)。
31. —種藥盒，所述藥盒包含(i) 電化學(xué)電解池，所述電化學(xué)電解池適合于容納至少一個生物細胞并適合于進行電 化學(xué)測定；禾口(ii) 至少一種抗癌藥。
32. 權(quán)利要求31的藥盒，所述藥盒還包含底物，所述底物被所述生物細胞的酶催化而 進行酶促反應(yīng)以生成反應(yīng)產(chǎn)物，從而在所述電化學(xué)電解池的電極上發(fā)生氧還反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了癌細胞的檢測方法。所述方法包括(a)在酶催化細胞與底物反應(yīng)的條件下，使所述細胞與所述酶的底物接觸，從而生成能產(chǎn)生電信號的產(chǎn)物；和(b)測定所述電信號水平，其中所述電信號水平與預(yù)定閾值之間的差異就是癌細胞的標(biāo)志。所述方法適合于診斷、監(jiān)測癌癥治療，鑒定能治療癌癥的藥物并可對癌癥治療進行個性化優(yōu)化。
文檔編號C12Q1/00GK101702920SQ200880018299
公開日2010年5月5日 申請日期2008年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月2日
發(fā)明者J·里什龐, R·波波夫特澤, S·弗尼克, T·紐費爾德, Y·沙錢-戴曼德 申請人:特拉維夫大學(xué)拉莫特有限公司