專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗her2-靶向治療中脂質(zhì)激酶和與所述脂質(zhì)激酶相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與的制作方法主幾HER2國(guó)革巴向〉臺(tái)行:中脂質(zhì)激酶和與所述脂質(zhì)激酶相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的參與本發(fā)明涉及一種用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法，以及應(yīng)用脂質(zhì)激酶活性的抑制劑以增加HER2-靶向治療的敏感性。曲妥珠單抗(赫賽汀@)是以人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)為靶標(biāo)的單克隆抗體，HER2是一種在所有侵犯性乳腺癌中過(guò)表達(dá)20-25%的受體酪氨酸激酶。在聯(lián)合化療的大約60%的患者中觀察到了顯著的初始應(yīng)答。然而，大多數(shù)應(yīng)答患者最后對(duì)基于曲妥珠單抗的治療產(chǎn)生耐藥(Slamon,等.NewEnglJMed344,783-792(2001);Vogel,等.JClinOncol20,719-726(2002);Cobleigh,等.JClinOncol17，2639-2648(1999))。受體酪氨酸激酶的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族由四種受體組成，ErbB1(HER1)、ErbB2(HER2/Neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。EGF-受體家族的成員包括包含在配體結(jié)合和受體二聚化的胞外區(qū)、單跨膜區(qū)和胞質(zhì)酪氨酸激酶區(qū)。配體結(jié)合會(huì)誘導(dǎo)受體的二聚化，導(dǎo)致胞內(nèi)區(qū)的自磷酸化，從而在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的受體上產(chǎn)生對(duì)接位點(diǎn)。這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子包括Grb-2，其可激活Ras和Ras-依賴(lài)型的絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)級(jí)聯(lián)，最后導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子(如促進(jìn)基因表達(dá)和有助于細(xì)胞增殖的c-fos、AP-l和Elk-l)的激活；PLC，其可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2—增加及PKC的激活；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),其可導(dǎo)致局部產(chǎn)生PIP3[磷脂酰肌醇(3,4，5)-三磷酸]，隨后向質(zhì)膜補(bǔ)充AKT，在質(zhì)膜被磷酸化和活化；以及JAK/STAT，其通過(guò)JAK/STAT途徑的激活，導(dǎo)致核基因表達(dá)激活。結(jié)合配體后，由于內(nèi)吞作用EGF受體迅速被內(nèi)化。這一過(guò)程被認(rèn)為是需要網(wǎng)格蛋白，且發(fā)生在包被網(wǎng)格蛋白的小窩中，從質(zhì)膜處夾斷形成小囊泡移動(dòng)到初級(jí)內(nèi)體中。從初級(jí)內(nèi)體中，受體被再循環(huán)到細(xì)胞表面，或穿過(guò)次級(jí)內(nèi)體移動(dòng)到溶酶體中用于蛋白降解。曲妥珠單抗發(fā)揮其抗腫瘤活性的這種機(jī)制尚未完全清楚。有研究表明曲妥珠單抗能誘導(dǎo)抗體依賴(lài)型細(xì)胞毒作用(ADCC);抑制HER2胞外區(qū)酶切；以及通過(guò)下調(diào)HER2信號(hào)或者通過(guò)增加磷酸酶與張力蛋白同源物，使染色體TEN(PTEN)膜定位和磷酸酶活性缺失，導(dǎo)致減弱PI3K7AKT途徑激活和抑制增殖，來(lái)抑制PI3K/AKT生存信號(hào)(Morris和Carey，Oncology20,1763-1771(2006))。細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗耐藥的機(jī)制目前尚不明確。可能的機(jī)制包括在所述細(xì)胞如HER1和HER3中接替HER2作用的HER2-相關(guān)受體的激活，或者諸如胰島素-樣生長(zhǎng)因子I受體的非-HER受體的激活；阻止結(jié)合曲妥珠單抗的HER2的突變；由細(xì)胞表面粘蛋白增加引起的結(jié)合曲妥珠單抗的阻滯；HER2的降解增加；細(xì)胞循環(huán)抑制劑p27KIP的下調(diào)；以及脂質(zhì)磷酸酶PTEN的失活(Sergina，等.Nature445,437-441(2007);Morris和Carrey,Oncology20:1763-1771(2006))。盡管上述任何一種機(jī)制都可能與曲妥珠單抗耐藥有關(guān)，但是它們不能解釋所有觀察到的HER2-耐藥的腫瘤。HER2過(guò)表達(dá)的半數(shù)乳腺癌患者最初對(duì)基于曲妥珠單抗的治療都是非易感的，而大多數(shù)患者在治療期間對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥。對(duì)耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)將會(huì)促進(jìn)合理的藥物聯(lián)用的發(fā)展以防止耐藥發(fā)生，并可以選擇易應(yīng)答(敏感)的患者。在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)PI3K的突變或與PI3K相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活與HER2耐藥的發(fā)生有關(guān)。因此本發(fā)明提供了一種用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括測(cè)定所述個(gè)體的所述癌癥細(xì)胞樣品中的PI3K核苷酸序列或其部分序列，將所述序列與對(duì)照樣品中PI3K的相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比，在對(duì)比的基礎(chǔ)上確5定所述風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞樣品涉及所述個(gè)體的相關(guān)樣品，包括癌細(xì)胞或癌細(xì)胞殘留，如核酸分子或氨基酸分子。相關(guān)細(xì)胞樣品包括含有來(lái)自癌細(xì)胞的核酸分子或蛋白質(zhì)的細(xì)胞或細(xì)胞殘留。PD-激酶包括能在肌醇環(huán)的3'位將磷脂酰肌醇磷酸化、產(chǎn)生磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PI3，4,5-P3)的酶族，PI3,4，5-P3被認(rèn)為是作為第二信使控制細(xì)胞活性和特性，包括增殖、生存、活動(dòng)力和形態(tài)學(xué)。磷脂酰肌醇衍生物可通過(guò)與包括底物同源(PH)結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)相互作用來(lái)用作對(duì)接位點(diǎn)，從而調(diào)節(jié)定位，也常常調(diào)節(jié)PH-蛋白(PH-comprisingproteins)的活性。I類(lèi)PI3-激酶族成員包括調(diào)節(jié)亞基p85與催化亞基pll0形成的異源二聚體。在一些原發(fā)性結(jié)腸和卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)編碼調(diào)節(jié)亞基p85a的基因的突變(Bader等.NatureReviewsCancer5:921-929(2005))。目前已知四種催化亞基，包括PIK3催化的a(PIK3CA)、PIK3CB、PIK3C2B和PIK3CG。其中，編碼PIK3CA的基因與癌癥有關(guān)。已經(jīng)在結(jié)腸、乳腺、肝、大腦、胃、肺和卵巢腫瘤樣品中鑒別出PIK3CA基因的體細(xì)胞突變(Karakas等.BritishJournalofCancer94:455-459(2006)),而基因的過(guò)表達(dá)與卵巢癌、宮頸癌、及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌有關(guān)(Pedrero等.Int.J.Cancer114:242-248(2005))。在螺旋區(qū)和催化激酶區(qū)都高頻率地識(shí)別出一些突變(Bader等.NatureReviewsCancer5:921-929(2005))。因此在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括確定PIK3CA的核苷酸序列，或其部分序列或衍生序列。所述其部分序列或衍生序列優(yōu)選包括編碼一或多個(gè)表4中列出的氨基酸殘基的核酸序列。所述其部分序列或衍生序列進(jìn)一步優(yōu)選包括編碼蛋白C-末端(C-terminalhalf)的核酸序列，蛋白包括螺旋區(qū)和激酶區(qū)，大約從氨基酸殘基編號(hào)520開(kāi)始(見(jiàn)圖7)。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述其部分序列或衍生序列包括外顯子9或外顯子20中出現(xiàn)的核酸序列，分別編碼部分螺旋區(qū)和部分催化區(qū)。對(duì)照樣品中的PIK3CA序列是指PIK3CA的野生型核苷酸序列(見(jiàn)圖7)。作為野生型序列的模型，對(duì)照樣品的GenBank登錄號(hào)為NM一006218。然而，對(duì)照樣品也可以來(lái)自未受影響的個(gè)體，例如未受影響的近親屬。與對(duì)照樣品中的PIK3CA核苷酸序列相比，改變的PIK3CA核苷酸序列指的是導(dǎo)致編碼蛋白的氨基酸序列變更的任何改變的核苷酸序列。優(yōu)選所述改變導(dǎo)致了與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性增強(qiáng)。在人類(lèi)癌癥中已經(jīng)識(shí)別了PIK3CA的改變，這些改變能增強(qiáng)PIK3CA的活性，這些改變包括下列任一位點(diǎn)的氨基酸的改變38(精氨酸)、60(谷氨酰胺)、88(精氨酸)、104(脯氨酸)、106(甘氨酸)、108(精氨酸)、IIO(谷氨酸)、111(賴(lài)氨酸)、118(甘氨酸)、122(甘氨酸)、124(脯氨酸)、345(天冬酰胺)、350(天冬氨酸)、378(半胱氨酸)、405(絲氨酸)、418(谷氨酸)、420(半胱氨酸)、453(谷氨酸)、539(脯氨酸)、542(谷氨酸)、545(谷氨酸)、661(谷氨酰胺)、701(組氨酸)、733(賴(lài)氨酸)、901(半胱氨酸)、909(苯丙氨酸)、1008(絲氨酸)、1011(脯氨酸)、1021(酪氨酸)、1025(蘇氨酸)、1035(谷氨酸)、1043(甲硫氨酸)、1044(天冬酰胺)、1046(丙氨酸)、1047(組氨酸)、1049(甘氨酸)或1065(組氨酸)，其中有關(guān)PIK3CA氨基酸序列的編號(hào)見(jiàn)圖7中的描述(見(jiàn)表4)。因此，出現(xiàn)這些改變中的一個(gè)或多個(gè)，就表明關(guān)于HER2-靶向治療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增加。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在如圖7所述編碼PIK3CA的核酸的1624、1633、1634、3075、3127、3140或3147任一位點(diǎn)，或在編碼PIK3CA的基因核酸分子中相應(yīng)的位點(diǎn)，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相應(yīng)的位點(diǎn)，確定PIK3CA的核苷酸序列，其中編碼的氨基酸在位點(diǎn)542(谷氨酸)、545(谷氨酸)、1025(蘇氨酸)、1043(甲硫氨酸)、1047(組氨酸)或1049(甘氨酸)處，從所示氨基酸改變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸，表明對(duì)HER2-靶向治療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增加。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括在如圖7所述編碼PIK3CA的核酸的1624、1633、1634或3140任一位點(diǎn)，或在編碼PIK3CA的基因核酸分子中相應(yīng)的位點(diǎn)，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相應(yīng)的位點(diǎn)，確定PIK3CA的核苷酸序列，其中編碼的氨基酸在位點(diǎn)542(谷氨酸)、545(谷氨酸)和1047(組氨酸)處，從所示氨基酸改變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸，表明對(duì)HER2-靶向治療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增加?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法確定PIK3CA的核苷酸序列，包括但不限于編碼PIK3CA的基因區(qū)的序列分析，mRNA產(chǎn)物或mRNA產(chǎn)物衍生物如cDNA產(chǎn)物的序列分析，通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法，包括但不限于雙脫氧測(cè)序、基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，以及雜交測(cè)序，包括與寡核苷酸特異性序列雜交和與寡核苷酸芯片(oligonucleotidearray)雜交。還可以通過(guò)使用突變分析法確定PIK3CA的核苷酸序列，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性、DNA異源雙鏈體分析、變性梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)包括PIK3CA基因或其mRNA產(chǎn)物的相關(guān)核酸分子的直接序列分析，或在PIK3CA基因或其mRNA產(chǎn)物的全部或任何部分?jǐn)U增之后通過(guò)相關(guān)核酸的間接序列，進(jìn)行序列分析?？蛇x的直接或間接方法包括雜交保護(hù)分析、等位基因特異性擴(kuò)增、連接酶介導(dǎo)檢測(cè)、引物延伸和限定性片段長(zhǎng)度分析。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，PIK3CA中的突變的出現(xiàn)表明對(duì)HER2-耙向治療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增加，這種突變可以通過(guò)對(duì)編碼蛋白的分析來(lái)確定，例如，蛋白序列測(cè)定、二維凝膠電泳、多維蛋白鑒別技術(shù)、ELISA、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)、或者應(yīng)用與PIK3CA非突變的正常型或PIK3CA突變變異型有相互作用的抗體。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括測(cè)定所述個(gè)體的所述癌癥細(xì)胞樣品中與PI3K相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)，以及基于所述狀態(tài)確定所述風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的方法，將所述活性狀態(tài)與對(duì)照樣品中所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)進(jìn)行對(duì)比，在所述對(duì)比的基礎(chǔ)上確定所述風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)語(yǔ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指一種過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程細(xì)胞將細(xì)胞外的信號(hào)轉(zhuǎn)換成應(yīng)答，包括從一種物理的或化學(xué)的形式轉(zhuǎn)換成另一種形式的信號(hào)延遲。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通常由從細(xì)胞的一個(gè)區(qū)室，如細(xì)胞膜向另一個(gè)區(qū)室，如細(xì)胞核傳導(dǎo)的一系列信號(hào)組成。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以包含不同的信號(hào)，例如諸如細(xì)胞鈣濃度和環(huán)磷腺苷濃度的特異性第二信使，通過(guò)離子通道進(jìn)出細(xì)胞的特異性離子，如磷酸化或去磷酸化的蛋白修飾，蛋白定位，蛋白酶切，蛋白降解，通過(guò)例如結(jié)合輔因子諸如鳥(niǎo)苷三磷酸的蛋白激活，諸如脂質(zhì)酶切、脂質(zhì)磷酸化和脂質(zhì)去磷酸化的脂質(zhì)修飾，以及轉(zhuǎn)錄激活。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活結(jié)果根據(jù)例如細(xì)胞類(lèi)型、細(xì)胞既往史和在所述細(xì)胞中有活性的其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而有所不同。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖、細(xì)胞激活、細(xì)胞分化、細(xì)胞改型和細(xì)胞死亡，或其他效果。與PI3K相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)可以通過(guò)對(duì)所述活性的指標(biāo)進(jìn)行定量來(lái)確定。所述可定量的指標(biāo)包括編碼PBK的基因的擴(kuò)增，PI3K的表達(dá)水平，PI3K的活性和至少一種下游指示基因的表達(dá)水平，其表達(dá)水平依賴(lài)與PI3K相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性。對(duì)照樣品用于進(jìn)行對(duì)比，以確定相對(duì)于所述對(duì)照樣品而言，與PIK3CA相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是否受到影響。所述對(duì)照樣品可以包括對(duì)照細(xì)胞樣品。更清楚的說(shuō)，如果患病個(gè)體患的是乳腺癌，那么對(duì)照細(xì)胞樣品包括乳腺細(xì)胞或其殘留。如果患病個(gè)體患的是前列腺癌，那么對(duì)照細(xì)胞樣品包括前列腺細(xì)胞或其殘留。所述對(duì)照樣品可以同來(lái)自所述個(gè)體的所述樣品一起分析。優(yōu)選地，來(lái)自對(duì)照樣品的相關(guān)數(shù)據(jù)保存在存儲(chǔ)設(shè)備中，與所述個(gè)體中與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性狀態(tài)進(jìn)行對(duì)比。存儲(chǔ)設(shè)備可以是保存數(shù)據(jù)的任何設(shè)備，包括但不限于實(shí)驗(yàn)室筆記本，有可讀存儲(chǔ)介質(zhì)的電腦，以及包括來(lái)自患者的相關(guān)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù)，所述患者是確定了與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性狀態(tài)并接受了HER2-乾向治療的患者。如果所述對(duì)照樣品從顯示無(wú)應(yīng)答或弱應(yīng)答的患者中獲得，或從對(duì)HER2-乾向治療耐藥的患者中獲得，且如果患病個(gè)體中所述途徑的活性狀態(tài)與對(duì)照樣品中所述途徑的活性狀態(tài)相似，那么患有癌癥的個(gè)體處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)。如果所述對(duì)照樣品從健康患者中獲得，或從對(duì)HER2-靶向治療顯示良好應(yīng)答的人中獲得，所述個(gè)體和所述對(duì)照樣品之間的途徑的活性狀態(tài)具有相似性，則表明關(guān)于HER2-靶向治療呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)低。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，風(fēng)險(xiǎn)也可以根據(jù)所述個(gè)體的所述途徑活性狀態(tài)與對(duì)照樣品相比的差異進(jìn)行分類(lèi)，這是很清楚的。為了確定與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性狀態(tài)是否與對(duì)照樣品中所述途徑的活性狀態(tài)相似，確定了閾值水平。如果所述對(duì)照樣品從健康患者中獲得，或從對(duì)HER2-靶向治療顯示良好應(yīng)答的人中獲得，那么分?jǐn)?shù)高于預(yù)定閾值的樣品就被分到關(guān)于HER2-靶向治療呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低具有低風(fēng)險(xiǎn)的類(lèi)別中，而分?jǐn)?shù)低于所述閾值的樣品就被分到具有高風(fēng)險(xiǎn)的類(lèi)別中。與PIK3CA相關(guān)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是指受PIK3CA激活或抑制的影響的一或多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制或激活可以導(dǎo)致基因產(chǎn)物活性的差異、基因產(chǎn)物定位的差異、基因產(chǎn)物表達(dá)水平的差異10和基因產(chǎn)物修飾的差異。與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性狀態(tài)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式確定，包括但不限于確定PIK3CA基因的擴(kuò)增狀態(tài)，確定來(lái)自PIK3CA基因或所述途徑中其他基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平，以及確定來(lái)自PIK3CA基因的基因產(chǎn)物的活性。在本發(fā)明的這一方面，優(yōu)選的細(xì)胞樣品表示采集樣品時(shí)被表達(dá)的所有基因的定量的拷貝。為了保存定量的拷貝，樣品可以通過(guò)技術(shù)人員已知的多種方式處理。優(yōu)選地，它們是在獲取細(xì)胞或組織時(shí)新鮮制備的，或從在-7(TC保存?zhèn)溆玫耐饪苹罱M織中制備?？蛇x地，組織或外科活組織保存在保證RNA品質(zhì)的保護(hù)條件下。這些保存條件優(yōu)選的示例是釆用例如福爾馬林，RNA酶抑制劑，如RNAsin(Pharmingen)、RNasecure(Ambion)或RNalater(Ambion)固定。在一個(gè)可選的實(shí)施方案中，細(xì)胞樣品可以通過(guò)針穿刺活檢制備，該程序是將細(xì)針插入組織中抽取細(xì)胞。針穿刺活檢經(jīng)處理并保存在保證RNA品質(zhì)的保護(hù)條件下。這些保存條件的示例是釆用例如福爾馬林，RNA酶抑制劑，諸如RNAsin(Pharmingen)、RNasecure(Ambion)或RNalater(Ambion)固定。確定與PIK3CA相關(guān)的途徑活性狀態(tài)的優(yōu)選方法包括確定編碼PIK3CA的基因的擴(kuò)增。PIK3CA的基因擴(kuò)增可以在幾種癌癥中檢出，包括胃癌(Byun等.2003.IntJCancer104:318-27)、卵巢癌(Campbell等.2004.CancerRes.64:7678-7681)和口腔鱗狀細(xì)胞癌(Kozaki等.2006.CancerSci.97:1351-8)，且PIK3CA的基因擴(kuò)增與PIK3CA轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加有關(guān)。PIK3CA基因的擴(kuò)增狀態(tài)包括熒光原位雜交，顯色原位雜交，Southern印跡，全基因組DNA微陣列芯片雜交，以及定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)定來(lái)自PIK3CA基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平，確定所述與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性狀態(tài)。擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄激活可以導(dǎo)致PIK3CA的過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致與PIK3CA相關(guān)的途徑活性增強(qiáng)。來(lái)自PIK3CA基因的蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方式確定，包括但不限于二維凝膠電泳、酶鏈免疫吸附測(cè)定(ELISA)和Western印跡。確定PIK3CA基因的核酸表達(dá)水平的方法對(duì)于技術(shù)人員是已知的，包括但不限于Northem印跡、定量PCR和微陣列分析。Northern印跡包括采用凝膠電泳分離核酸表達(dá)產(chǎn)物后，與和所述核酸表達(dá)產(chǎn)物具有特異性相互作用的標(biāo)記探針雜交，對(duì)來(lái)自PIK3CA基因的核酸表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量。對(duì)與所述核酸表達(dá)產(chǎn)物具有特異性相互作用的標(biāo)記探針的定量是一種確定表達(dá)水平的方法。通過(guò)比夢(mèng)兩個(gè)分離的樣品的表達(dá)水平，其表達(dá)水平已知沒(méi)有差異，比較它們的核酸表達(dá)產(chǎn)物的總量的差異，可以對(duì)確定的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。定量-PCR(qPCR)提供了定量來(lái)自PIK3CA基因的核酸產(chǎn)物的表達(dá)水平的可選方法。逆轉(zhuǎn)錄之后，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR(rtPCR)，進(jìn)行qPCR，反應(yīng)過(guò)程中監(jiān)測(cè)產(chǎn)物的量，或者通過(guò)終點(diǎn)測(cè)量，以此確定終產(chǎn)物的量。技術(shù)人員已知，可以通過(guò)使用核酸插入劑，如溴化乙錠或SYBR⑧綠色I(xiàn)染料(該染料能與所有生成的雙鏈產(chǎn)物相互作用導(dǎo)致擴(kuò)增過(guò)程中熒光增強(qiáng))，或者通過(guò)使用特異性地與生成的有關(guān)基因的雙鏈產(chǎn)物相互反應(yīng)的標(biāo)記探針進(jìn)行rtPCR。通過(guò)樹(shù)狀信號(hào)放大、雜交信號(hào)放大和分子信標(biāo)提供了可以應(yīng)用的可選的檢測(cè)方法。技術(shù)人員已知的擴(kuò)增方法都可以應(yīng)用到qPCR中，包括但不限于PCR、滾環(huán)擴(kuò)增、基于核酸序列的擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增和線(xiàn)性RNA擴(kuò)增。微陣列分析包括固定在表面的所選生物分子的應(yīng)用。微陣列通常包括核酸分子、所述探針，它們能夠與核酸表達(dá)產(chǎn)物，如來(lái)自PIK3CA基因的核酸表達(dá)產(chǎn)物雜交。探針暴露在標(biāo)記的樣品核酸中，雜交后，測(cè)定探針補(bǔ)體樣品中的核酸表達(dá)產(chǎn)物的豐度。微陣列中的探針可以包括DNA序列、RNA序列或DNA與RNA的共聚序列。探針也可以包括DNA和/或RNA類(lèi)似物，如核苷酸類(lèi)似物或肽核酸分子(PNA)，或者其組合。探針序列可以包括基因組DNA片段。這些序列還可以是合成的核苷酸序列，諸如合成的寡核苷酸序列。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)包括確定PIK3CA激酶的活性。PIK3CA的過(guò)表達(dá)和突變可以導(dǎo)致PIK3CA的激酶活性增強(qiáng)，對(duì)HER-2乾向治療產(chǎn)生耐藥。用于確定PIK3CA激酶活性的適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，如那些基于將嫌脂酰肌醇(4，5)-二磷酸轉(zhuǎn)化成磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸的檢測(cè)方法是本領(lǐng)域已知的，還包括PI3激酶ELISA(EchelonBiosciencesInc)、TruLight磷酸肌醇3-激酶檢測(cè)法(Merck/Calbiochem)，及PI3-激酶HTRF⑧檢測(cè)法(Upstate/Millipore)。在依據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，確定與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)包括確定PIK3CA的核苷酸序列。PIK3CA的核苷酸序列與對(duì)照樣品中PIK3CA的核苷酸序列相比有所改變，其中優(yōu)選導(dǎo)致與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性增強(qiáng)的所述改變。優(yōu)選在如圖7所述編碼PIK3CA的核酸的1624、1633、1634或3140位點(diǎn)上的改變，或者在編碼PIK3CA的基因核酸分子相應(yīng)位點(diǎn)的改變，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相應(yīng)位點(diǎn)的改變，其中編碼的氨基酸在位點(diǎn)542(谷氨酸)、545(谷氨酸)和1047(組氨酸)處，從所示氨基酸到另一個(gè)氨基酸的改變，表明對(duì)HER2-靶向治療耐藥的風(fēng)險(xiǎn)增加。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，確定與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)包括確定至少一個(gè)PIK3CA指示基因的表達(dá)水平。PIK3CA指示基因是其表達(dá)水平由與PIK3CA相關(guān)的途徑控制的基因。PIK3CA指示基因可以通過(guò)對(duì)比基因的表達(dá)水平進(jìn)行鑒別，這13些基因在細(xì)胞中以與PIK3CA相關(guān)的途徑的不同活性來(lái)表達(dá)，如本申請(qǐng)中所述方法之一估計(jì)的一樣。依賴(lài)于與PIK3CA相關(guān)的途徑的激活，可以上調(diào)或下調(diào)所述指示基因的表達(dá)水平。例如可以通過(guò)釆用PIK3CA抑制劑與細(xì)胞接觸以抑制PIK3CA活性，或者通過(guò)PIK3CA的外源性表達(dá)或激活細(xì)胞中的PIK3CA突變型以激活PIK3CA活性，來(lái)獲得與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性差異。已知的PIK3CA抑制劑包括渥曼青霉素、LY294002、PX-866、ZSTK474,以及反義RNA分子的表達(dá)、siRNA分子或抗PIK3CA亞基之一的抗體。優(yōu)選地，通過(guò)將細(xì)胞中表達(dá)野生型PIK3CA的基因表達(dá)水平與細(xì)胞中表達(dá)改變PIK3CA的所述基因表達(dá)水平進(jìn)行比較，識(shí)別所述至少一種PIK3CA-抑制劑基因，其中所述改變PIK3CA包括導(dǎo)致激活所述蛋白的改變?？梢詰?yīng)用監(jiān)督分析來(lái)識(shí)別PIK3CA-抑制劑基因，其表達(dá)水平能指示與PIK3CA相關(guān)的途徑的活性。可以通過(guò)將對(duì)HER2-乾向治療有應(yīng)答的患者樣品與對(duì)HER2-靶向治療耐藥或獲得耐藥的患者樣品中的PIK3CA-抑制劑基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較，驗(yàn)證所述PIK3CA-抑制劑基因。為同時(shí)檢測(cè)多種核酸基因表達(dá)產(chǎn)物，可以采用qPCR法，如逆轉(zhuǎn)錄酶多重連接探針擴(kuò)增法(rtMLPA)，該法在單管測(cè)試中可以精確定量多達(dá)45個(gè)有關(guān)轉(zhuǎn)錄物(Eldering等，NucleicAcidsRes2003;31:e153)，如果技術(shù)人員已知的話(huà)，還可以應(yīng)用微陣列分析。另一方面，本發(fā)明用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法中，所述治療是指選自基因治療、化療、化合物-介導(dǎo)治療、siRNA-介導(dǎo)治療、蛋白治療和抗體-介導(dǎo)治療的治療。優(yōu)選地，所述HER2-靶向治療選自酪氨酸激酶抑制劑，諸如拉帕替尼二甲苯磺酸酯(Tykerb,GSK)、Tak165(武田制藥公司)、吉非替尼(Iressa⑧，英國(guó)阿斯利康公司)、埃羅替尼(OSI-774,特羅凱)、CP-724714(輝瑞)和CI1033(PD183805;輝瑞)；反義技術(shù)，核酶和下調(diào)HER2表達(dá)水平的siRNA;抗體，諸如曲妥珠單抗(Herceptin)、帕妥珠單抗(Omnitarg⑧)；以及疫苗，諸如重組體dHER2疫苗(GSK)和Neuvenge⑧(APC8024，Dendreon)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HER2-耙向治療包括抗體-介導(dǎo)的HER2-乾向治療。結(jié)合ErbB2(HER2/Neu)胞外區(qū)的抗體能阻斷HER2過(guò)表達(dá)的功能。目前，已知兩種抗體在HER2的胞外區(qū)能結(jié)合不同的表位。重組體人源HER2單克隆抗體帕妥珠單抗(Genentech,加利福尼亞州舊金山)空間上阻斷HER2與EGFR和HER3的二聚體，而結(jié)合曲妥珠單抗可以通過(guò)促進(jìn)受體細(xì)胞內(nèi)吞作用來(lái)阻斷HER2的激活(Nahta等.2006.NatClinPractOncol.3:269-280)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體介導(dǎo)的治療包括曲妥珠單抗。曲妥珠單抗(Herceptin)是第一個(gè)批準(zhǔn)用于治療HER2-陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的人源抗體。曲妥珠單抗與紫杉醇聯(lián)用，可以治療腫瘤過(guò)表達(dá)HER2蛋白的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。然而，曲妥珠單抗耐藥是一個(gè)普遍問(wèn)題，最終導(dǎo)致治療失敗。鑒別患者對(duì)曲妥珠單抗耐藥或可能耐藥對(duì)適當(dāng)治療這些患者非常重要。另一方面，本發(fā)明提供了PIK3CA抑制劑、或優(yōu)選地PIK3CA突變型抑制劑在制備治療HER2-耐藥癌癥患者的藥物中的應(yīng)用。PIK3CA或者與PIK3CA相關(guān)的途徑的激活，可導(dǎo)致對(duì)HER2-乾向治療耐藥。因此，抑制PIK3CA活性可以恢復(fù)關(guān)于HER2-靶向治療的敏感性。已知PIK3CA的抑制劑包括渥曼青霉素、LY294002、PX-866、ZSTK474、反義RNA分子、siRNA分子或抗PI3激酶亞基之一的抗體，諸如P85或P110亞基。已知表達(dá)HER2的、以及從HER2-靶向治療獲益或可能獲益的惡性細(xì)胞包括前列腺細(xì)胞、膀胱細(xì)胞、輸尿管細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、骨細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、胃食管細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰臟細(xì)胞、鱗狀肺細(xì)胞和肺腺癌細(xì)胞。對(duì)于患有骨肉瘤、及肺癌、胰腺癌、唾液腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌和膀胱癌的患者，正在進(jìn)行包含HER2-乾向治療的臨床試驗(yàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥患者是乳腺癌患者。HER2-陽(yáng)性乳腺癌比其他類(lèi)型的乳腺癌更具有侵襲性，而且對(duì)激素治療應(yīng)答較少。使HER2-陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞對(duì)HER2-靶向治療產(chǎn)生敏感或重新敏感，將改善這類(lèi)癌癥的結(jié)局。圖1為識(shí)別PTEN作為曲妥珠單抗療效調(diào)節(jié)劑的shRNA條形碼篩選。圖2為細(xì)胞培養(yǎng)物中PTEN下調(diào)和激活對(duì)曲妥珠單抗耐藥的PI3K信號(hào)。圖3為曲妥珠單抗治療HER2-陽(yáng)性患者的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)。圖4為PTEN免疫組織化學(xué)的分析圖。圖5為PIK3CA序列分析圖。圖6為離體隊(duì)列研究曲妥珠單抗治療HER2-陽(yáng)性患者的Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)。圖7為GenBank登錄號(hào)NM—006218的野生型PIK3CA的核苷酸和蛋白序列。具體實(shí)施例方式實(shí)施例l方法細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人乳腺癌細(xì)胞株BT-474和SKBR-3購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC，馬納薩斯)，并在補(bǔ)充了8%熱滅活胎牛血清、青霉素和鏈霉素的Dulbecco，sModifiedEagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。對(duì)BT-474和SKBR-3進(jìn)行亞克隆，異位性表達(dá)鼠親嗜性受體。通過(guò)Phoenix包裝細(xì)胞轉(zhuǎn)染，得到親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液。釆用磷酸鈣沉淀技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將病毒上清液用0.45]im濾膜過(guò)濾，在8jig/ml聚凝胺(Sigma)中進(jìn)行感染。用2pg/ml嘌呤霉素在BT-474和SKBR-3細(xì)胞中進(jìn)行藥物篩選。從NKI/AVL醫(yī)院藥房獲得曲妥珠單抗，溶解于MQ中，將20mg/ml儲(chǔ)備液保存在-2(TC。shRNA條形碼篩選用前述代表完整NKiRNAi基因庫(kù)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染BT-474細(xì)胞(Berns等.2004.Nature428:431-437)。用喋呤霉素(2.0|ig/ml)篩選感染的細(xì)胞，以低密度放置在兩個(gè)種群中。一個(gè)種群未經(jīng)處理，而另一個(gè)種群在IOiLig/ml曲妥珠單抗中培養(yǎng)。在篩選期間，細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶作用并重新排列(replated)，以去除小細(xì)胞團(tuán)。4周后收集處理的和未處理的種群中的培養(yǎng)物。用DNAzol(LifeTechnologies)分離基因組DNA。通過(guò)PCR,釆用含有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子的引物pRS-T7-fw,5，GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3，和pRS隱8-rev，5，-TAAAGCGCATGCTCCAGACT-3;從基因組DNA擴(kuò)增shRNA插入片段。用純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行線(xiàn)性RNA擴(kuò)增，用青色素-3(Cy3)或青色素-5(Cy5)熒光組(Kreatech)標(biāo)記純化的RNA探針。來(lái)自未處理和曲妥珠單抗處理的細(xì)胞的RNA探針與前述寡核苷酸芯片結(jié)合并雜交(Bems等,2004.Nature428:431-437)。用Imagene5.6(BioDiscovery)對(duì)所得的熒光圖像進(jìn)行定量，減去局部背景，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，并轉(zhuǎn)化為21og對(duì)數(shù)。質(zhì)粒前文已經(jīng)描述了表達(dá)PIK3CA組成性激活突變型的逆轉(zhuǎn)錄病毒載17體(llOaCaaX)和PTEN敲除載體(Kortlever等.2006.NatureCellBiol.8:877-884)。以caPIK3CA為模板，通過(guò)PCR生成PIK3CA(wt)和PIK3CA(H1047R)cDNAs，并將其克隆到pMXiresGFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。釆用表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒的GFP或發(fā)夾結(jié)構(gòu)靶向GFP進(jìn)行對(duì)照感染?；颊邔?duì)于NKI/AVL隊(duì)列，基于免疫組織化學(xué)的HER2過(guò)表達(dá)(IHC3+)和/或顯色原位雜交(CISH)的HER2基因擴(kuò)增的患者都有資格入選。從荷蘭癌癥研究所/AntonivLeeuwenhoek醫(yī)院及周邊醫(yī)院收集了HER2-過(guò)表達(dá)原發(fā)性乳腺癌、隨后發(fā)展成轉(zhuǎn)移性乳腺癌的34例患者，這些患者接受了曲妥珠單抗單一治療(n=3)、曲妥珠單抗加紫杉烷(n=8)、曲妥珠單抗加長(zhǎng)春瑞濱(n=16)、曲妥珠單抗加長(zhǎng)春瑞濱和洛那法尼(lonafamib)(n=5)、曲妥珠單抗與紫杉醇和卡鉑(n=l)或者輔助曲妥珠單抗(n=l)治療。治療從2002年9月至2005年9月開(kāi)始。從全部34例患者中獲取無(wú)復(fù)發(fā)生存數(shù)據(jù)(定義為至疾病進(jìn)展時(shí)間)。26例腫瘤為高核級(jí)m,7例為中核級(jí)n,l例腫瘤為低核級(jí)。釆用IHC分析了ER狀態(tài)，14例腫瘤為陽(yáng)性，19例腫瘤為陰性，l例腫瘤沒(méi)有可能修復(fù)ER狀態(tài)。福爾馬林固定的石蠟包埋的存檔材料用于IHC、基因組DNA分離、PCR和序列分析。對(duì)于MDAnderson隊(duì)列，證實(shí)為HER2擴(kuò)增的(通過(guò)FISH和/或IHC3+陽(yáng)性)21例乳腺癌患者的原發(fā)性腫瘤材料，來(lái)源于由IRB-批準(zhǔn)的方案支持的M.D.Anderson癌癥中心的冷凍乳腺組織腫瘤庫(kù)。17例腫瘤為高核級(jí)(由修正的Black定為III級(jí))，12例腫瘤IHC的ER狀態(tài)為陽(yáng)性，9例腫瘤為陰性。所有患者均釆用了用于轉(zhuǎn)移性疾病的基于曲妥珠單抗方案的治療；曲妥珠單抗單一治療(11=3)、或曲妥珠單抗加紫杉烷(n-8)、或曲妥珠單抗加長(zhǎng)春瑞濱(n-6)、或曲妥珠單抗加其他化療(n=4)。在所有病例中，用于本分析的治療方案是施予每個(gè)轉(zhuǎn)移性疾病患者的第一個(gè)含有曲妥珠單抗的方案。從施予的第一個(gè)基于曲妥珠單抗方案開(kāi)始，計(jì)算了所有患者的至疾病進(jìn)展時(shí)間。診斷時(shí)的平均年齡為46.6歲，年齡范圍從25歲到74.1歲(NKI:47.828.9-74.1,MDAnderson:44.5,25-65)。平均至疾病進(jìn)展時(shí)間為11.8個(gè)月，時(shí)間范圍從0.7個(gè)月到44.7個(gè)月(NKI:11.3，0.7-37.5,MDAnderson:12.6，0.8-44.7)。隨訪期間出現(xiàn)了48次事件，對(duì)7例患者進(jìn)行了檢查(NKI:29和5，MDAnderson:19和2)。PIK3CA突變的患病率為25%(NKI:21%,MDAnderson:33%)。在25%患者中觀察到了低PTEN表達(dá)。DNA分離從10pm厚的石蠟包埋組織切片中分離基因組DNA。將切片在二甲苯中進(jìn)行兩次去石蠟處理、每次5min,在100°/0、96%和70%的乙醇中進(jìn)行再水化處理、每種溶劑30s，用蘇木精染色30s,用水沖洗并在lMNaSCN中在37"C下過(guò)夜孵育，以去除交聯(lián)。在室溫下，用PBS沖洗載玻片兩次，每次10min,然后完全氣干。用解剖刀從玻片上刮下胂瘤組織，在200mlQiagenATL緩沖液中(QIAampDNA提取試劑盒)獲得至少70%腫瘤細(xì)胞(蘇木精和曙紅染色的載玻片由有經(jīng)驗(yàn)的乳腺癌病理學(xué)家給出)，轉(zhuǎn)移到eppendorf管中，用27pl蛋白酶K(protK15mg/ml儲(chǔ)備液)以450rpm在55。C下孵育。在20h和28h時(shí)加入另外兩個(gè)等份的27jilprotK?？俻rotK孵育約44h后，按照制造商的方法進(jìn)行DNA分離(Qiagen，Cat51306)。采用標(biāo)準(zhǔn)的苯酚-氯仿方法對(duì)冷凍乳腺組織的基因組DNA進(jìn)行分離。PIK3CAPCR、序列和突變分析PCR的引物和序列如下外顯子9-正向5，-AGTAACAGACTAGCTAGAGACAAT-3;外顯子9-反向5'-GAGATCAGCCAAATTCAGTTATTTT-3;外顯子20-正向5，-CAGGAGATGTGTTACAAGGCTTAT-3;外顯子20-反向5'-TCAGTTCAATGCATGCTGTTTAAT-3'。在基因組DNA的10-100ng下進(jìn)行PCR反應(yīng)。94°C30秒的初始變性步驟后，94°C30秒變性擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，55。C下退火30秒，72。C下延展l分鐘；然后在72。C下進(jìn)行最后延展循環(huán)10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)QIAquick離心柱(Qiagen)純化，并釆用BigDyeTerminator循環(huán)測(cè)序試劑盒(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，AppliedBiosystems)和ABI3730自動(dòng)毛細(xì)管測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于正向和反向序列均有序列變異的所有PCR產(chǎn)物，重復(fù)反應(yīng)進(jìn)行證實(shí)。PIK3CASNP分析用基于SNP的途徑對(duì)普通PIK3CA突變進(jìn)行檢測(cè)。我們釆用Sequenom(SanDiego，CA)MALDITOFMassArray系統(tǒng)。首先擴(kuò)增已知潛在的PIK3CA突變熱點(diǎn)位點(diǎn)111、542、545和1047的DNA，運(yùn)行引物延展反應(yīng)來(lái)確定潛在的SNP堿基。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物和延展引物都由SequenomAssay設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)。該程序允許每孔多達(dá)30個(gè)不同SNPs的多重反應(yīng)。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，初始PCR反應(yīng)在384孔板中進(jìn)行，釆用EXO-SAP(也由Sequenom提供)清除PCR反應(yīng)。根據(jù)Sequenom的方法并釆用Sequenom'sIPLEXchemistry進(jìn)行引物延展反應(yīng)。然后采用Sequenom的清除樹(shù)脂對(duì)IPLEX反應(yīng)除鹽，并用SamsungNanodispenser劃線(xiàn)到Spectrochip矩陣芯片(matrixchips)中。然后在SequenomMassArray中運(yùn)行芯片。釆用SequenomTyper軟件解釋生成的質(zhì)譜并報(bào)告預(yù)期量的SNPs堿基。所有生成的質(zhì)譜均運(yùn)行兩次并且經(jīng)過(guò)目視檢查。反相蛋白裂解陣列(RPPA)通過(guò)勻漿，釆用裂解緩沖液(l%TritonX-100，50mmHEPES，pH7.4，150mMNaCl，1.5mMMgCl2,lmMEGTA,lOOmMNaF，10mM焦磷酸鈉，lmMNa3V04,10%甘油，lmMPMSF和lmg/ml抑肽酶)裂解21份大體解剖的新鮮冷凍轉(zhuǎn)移性HER2擴(kuò)增的人乳腺腫瘤。將蛋白裂解液(上清液)稀釋至lmg/ml，用1。/。SDS煮沸，再用Tecan液體處理機(jī)器人(Tecanliquidhandlingrobot)加入裂解緩沖液稀釋成205份兩倍系列稀釋液。機(jī)器人基因TAC陣列儀(roboticGeneTACarrayer)(GenomicSolutions,Inc.,AnnArbor,MI)建立了1152個(gè)斑點(diǎn)，在硝化纖維鍍膜玻璃載玻片(FASTSlides,Schleicher&SchuellBioscience,Inc.USA,Keene，NH)上有192個(gè)樣品陣列包含在每個(gè)HER2擴(kuò)增樣品的系列稀釋液中(Liang等.2007.NatureCellBiol9:218-224;Tibes等.2006.MolCaneTher5:2512-2521;Sheehan等.2005.MolCellProteom4:346-355)。用經(jīng)驗(yàn)證的PTEN(CellSignaling,Inc.)最初抗體對(duì)該陣列載玻片進(jìn)行了探針檢測(cè)(ThisarrayedslidewasprobedwithavalidatedprimaryantibodytoPTEN),采用DakoCytomation(Carpinteria，CA)催化系統(tǒng)(CSA)對(duì)信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增。將第二抗體(抗兔)用作信號(hào)擴(kuò)增的起始點(diǎn)。采用Microvigene軟件(VigeneTechInc.,NorthBillerica,MA)掃描、分析、定量染色的載玻片，從載玻片上的所有樣品中生成一系歹'」PTEN的稀釋-信號(hào)強(qiáng)度超曲線(xiàn)(supercurve)，然后將每個(gè)樣品與該超曲線(xiàn)擬合以生成表示每個(gè)樣品裂解液的相關(guān)PTEN信號(hào)強(qiáng)度的對(duì)數(shù)值。釆用每個(gè)樣品中50個(gè)其他探針蛋白的平均表達(dá)水平校正PTEN的表達(dá)的蛋白載量。通過(guò)21份樣品，就定量的PTEN表達(dá)而言，底部25。/。的腫瘤被分類(lèi)為具有低PTEN表達(dá)，其他75。/。的腫瘤被分類(lèi)為具有高PTEN表達(dá)。免疫組織化學(xué)將來(lái)自石蠟塊的3pm系列切片在二甲苯中進(jìn)行去石蠟處理，并在各級(jí)系列乙醇中進(jìn)行水化處理。用LabVision全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)(LabVisionCorporation,Fremont,CA,USA)對(duì)PTEN(DAKO,1:200)、HER2(克隆3B5，1:3000;vandeVijver等.1988.NewEnglJMed319:1239-1245)和ER(雌激素受體-a(ER;1D5+6F11,稀釋1:50，Neomarkers,LabVisionCorporation,Fremont,CA,USA))的最初抗體進(jìn)行染色。用抗原修復(fù)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)(枸櫞酸鹽pH6.0)。評(píng)分根據(jù)染色強(qiáng)度和分布，采用別處描述的免疫反應(yīng)積分(IRSXChui等.1996.BrJCancer73:1233-1236;Friedrichs等.1993.Cancer72:3641-3647)對(duì)PTEN表達(dá)水平進(jìn)行半定量評(píng)分。簡(jiǎn)而言之，IRS=SI(染色強(qiáng)度)xPP(陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù))。SI定義為0=陰性；1=弱；2=中;3=強(qiáng)。PP定義為:0=0%;1=0-25%;2=25-50%;3=50-75%;4=75-100%。已知將血管內(nèi)皮作為陽(yáng)性對(duì)照表達(dá)正常PTEN。根據(jù)IRS分?jǐn)?shù)，PTEN狀態(tài)分級(jí)如下低PTEN表達(dá)，IRS0-3;高PTEN表達(dá)，IRS4-12。就一種腫瘤而言，不可能修改PTEN分?jǐn)?shù)。當(dāng)沒(méi)有腫瘤細(xì)胞被染色時(shí)，ER染色解釋為陰性，當(dāng)多于10%的腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞核ER染色時(shí)，解釋為陽(yáng)性。當(dāng)無(wú)(分?jǐn)?shù)0)、少于10%(分?jǐn)?shù)l)或多于10%(分?jǐn)?shù)2)的腫瘤細(xì)胞顯示弱染色時(shí)，Her2neu染色被評(píng)分為陰性，當(dāng)多于10%的腫瘤細(xì)胞顯示強(qiáng)膜-染色時(shí)(分?jǐn)?shù)3)，Her2neu染色被評(píng)分為陽(yáng)性。當(dāng)腫瘤顯示HER2IHC的分?jǐn)?shù)為2+時(shí)，我們對(duì)HER2進(jìn)行顯色原位雜交(CISH)。通過(guò)CISH評(píng)價(jià)基因狀態(tài)，每個(gè)細(xì)胞核平均至少或多于6個(gè)拷貝的樣品被認(rèn)為是HER2擴(kuò)增。釆用所述(Hannemann等.2006.BrJCancer95:1334-1341)的Spot-LightCISHPolymer檢測(cè)試劑盒(Zymed,SanFrancisco,CA，USA)進(jìn)行CISH。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析我們釆用將年齡作為時(shí)間尺度的多因素Cox回歸，評(píng)價(jià)至疾病進(jìn)展時(shí)間與兩個(gè)候選的風(fēng)險(xiǎn)因子PIK3CA突變和PTEN表達(dá)之間的聯(lián)系。隨訪的時(shí)間從診斷的年齡開(kāi)始，至進(jìn)展的年齡(死亡年齡或截尾年齡(theageatcensoring),以先到的年齡計(jì))結(jié)束。在兩個(gè)參加中心，測(cè)量的PTEN表達(dá)不同。對(duì)于連續(xù)表達(dá)值的低和高的分類(lèi)，我們選擇了常用NKI測(cè)量的截點(diǎn)(范圍為0-12，截點(diǎn)〈3vs〉3，其結(jié)果是25%的NKI患者分類(lèi)為低)，將MDAnderson患者中表達(dá)值的相應(yīng)百分比作為MDAnderson患者的截點(diǎn)(范圍為57.3-488.4，截點(diǎn)<105vs>105)。1例NKI患者的PTEN表達(dá)缺失。所有的分析均通過(guò)中心分層，并通過(guò)釆用年齡這個(gè)變量作為時(shí)間尺度，根據(jù)年齡進(jìn)行了調(diào)整。采用混雜法進(jìn)一步評(píng)價(jià)了級(jí)別和ER狀態(tài)。為通過(guò)兩個(gè)候選風(fēng)險(xiǎn)因子圖解說(shuō)明事件歷史，生成Kaplan-Meier曲線(xiàn)圖。進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)以評(píng)價(jià)組-特異性生存曲線(xiàn)的均勻性。我們釆用Fisher精確檢驗(yàn)評(píng)價(jià)了治療應(yīng)答(完全應(yīng)答(CR)或部分緩解(PR)/疾病穩(wěn)定(SD)>6個(gè)月vs進(jìn)展疾病(PD)或部分緩解(PR)/疾病穩(wěn)定(SD)<6個(gè)月)與PIK3CA突變和PTEN表達(dá)之間的關(guān)系。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。結(jié)果作為鑒別含有曲妥珠單抗耐藥的基因的無(wú)偏倚方案，我們?cè)贖ER2-過(guò)表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株BT-474中釆用了大規(guī)模RNA干擾基因篩選。我們?cè)谇拔囊呀?jīng)描述了針對(duì)一些8,000人基因、被RNA干擾抑制的24,000shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因庫(kù)的傳代，以及被稱(chēng)為siRNA條形碼篩選的快速篩選這些基因庫(kù)的技術(shù)(Brummelkamp等.2006.NatChemBiol2:202-206;Bernsetal.2004.Nature428:431-437)。簡(jiǎn)而言之，基于載體中"條形碼"標(biāo)識(shí)符(唯一的19-merDNA序列)的相對(duì)豐度，這項(xiàng)技術(shù)能鑒別在種群中富集的shRNAs，在攜帶24,000個(gè)不同條形碼序列的DNA微陣列中測(cè)量。BT-474細(xì)胞主要通過(guò)其增殖率的降低，而不是調(diào)亡或完全增殖抑制，對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生應(yīng)答(圖la)。為了鑒別被shRNA抑制導(dǎo)致對(duì)曲妥珠單抗耐藥的基因，用shRNA基因庫(kù)感染BT-474細(xì)胞，并用P票呤霉素篩選shRNA載體。篩選后，將細(xì)胞以低密度劃線(xiàn)到兩個(gè)種群中。一個(gè)種群未經(jīng)處理作為對(duì)照，而另一個(gè)種群暴露在IOpg/ml曲妥珠單抗中。4周后收集細(xì)胞，通過(guò)PCR擴(kuò)增恢復(fù)分離的基因組DNA和shRNA試劑盒，并與所述DNA微陣列雜交(Berns等.2004.Nature428:431-437;見(jiàn)圖lb)。我們結(jié)合5份獨(dú)立曲妥珠單抗條形碼篩選的數(shù)據(jù)，分析了恢復(fù)的shRNAs的相對(duì)豐度。圖lc中顯示了與未處理種群相比，經(jīng)曲妥珠單抗處理的種群中shRNA載體的相對(duì)豐度。我們選擇了通過(guò)曲妥珠單抗選擇富集的前5個(gè)shRNAs載體，其中針對(duì)PTEN腫瘤抑制劑基因的shRNA富集的最顯著(用箭頭標(biāo)記)。在第二輪篩選檢測(cè)中，只有針對(duì)PTEN的載體對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥。更重要的是，敲除PTEN表達(dá)(Kortlever等.2006.NatureCellBiol8:877-884)的第二個(gè)獨(dú)立的shRNA也對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生耐藥，有效地排除了導(dǎo)致耐藥表型的shRNA載體"脫乾"效應(yīng)的可能性(圖2a)。我們發(fā)現(xiàn)BT-474細(xì)胞中敲除PTEN降低了對(duì)曲妥珠單抗的敏感性，與早期發(fā)現(xiàn)一致，這證明了PTEN丟失與基于曲妥珠單抗治療的耐藥有關(guān)(Nagata等.2004.CancerCell6:117-127)。更重要的是，我們對(duì)8,000例受試基因的觀察發(fā)現(xiàn)，僅敲除PTEN就產(chǎn)生曲妥珠單抗耐藥，這表明PTEN途徑在曲妥珠單抗耐藥中起著決定性的作用。然而，因?yàn)閮H在乳腺癌的部分中觀察到PTEN的丟失，所以不可能單獨(dú)用PTEN的丟失解釋在臨床中觀察到的、頻繁的原發(fā)性和獲得性對(duì)曲妥珠單抗的非應(yīng)答。在一些25。/。原發(fā)性乳腺癌中鑒別編碼PI3K的pll0a催化亞基(PIK3CA)的基因激活突變(Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559)。這些突變的大多數(shù)都位于外顯子9和20的兩個(gè)熱點(diǎn)，有證據(jù)表明兩種最常見(jiàn)的突變(E545K和H1047R)能導(dǎo)致PI3K途徑信號(hào)增加(Isakoff等.2005.CancerRes65:10992-11000)。為了檢測(cè)PI3K途徑的激活是否能導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥，我們用PIK3CA結(jié)構(gòu)性地激活突變型caPIK3CA(pl10aCaaX)對(duì)BT-474細(xì)胞進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖2顯示該突變型的表達(dá)表現(xiàn)出(rendered)BT-474對(duì)曲妥珠單抗幾乎完全不敏感。而且，在SK-BR3細(xì)胞(圖2b)和BT-474細(xì)胞(未顯示數(shù)據(jù))中，PIK3CA(wt)的表達(dá)和乳腺癌-衍生的突變型PIK3CA(H1047R)也顯示對(duì)曲妥珠單抗產(chǎn)生了耐藥。顯然，通過(guò)PIK3CA(wt)的過(guò)表達(dá)，PI3K信號(hào)的少量增加就能足以抵消細(xì)胞培養(yǎng)物中曲妥珠單抗的生長(zhǎng)抑制效果。在曲妥珠單抗耐藥的發(fā)展中，這些發(fā)現(xiàn)與PDK途徑的主要作用一致。在乳腺癌中高頻率的激活PIK3CA突變(約25%;Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559)，連同我們的觀察結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)物中激活的PI3K信號(hào)能誘導(dǎo)強(qiáng)曲妥珠單抗耐藥，引導(dǎo)我們研究在臨床中癌癥相關(guān)的PIK3CA突變或改變的PTEN水平是否能夠預(yù)示曲妥珠單抗耐藥。對(duì)此，我們利用了來(lái)自在AntonivanLeeuwenhoek醫(yī)院(i^34)和MDAnderson癌癥中心(11=21)治療的兩組HER2過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的樣品。這55例患者接受了曲妥珠單抗單一治療(n=6),或曲妥珠單抗聯(lián)用化療方案(n=49)。本研究中評(píng)價(jià)了PTEN表達(dá)水平(釆用免疫組織化學(xué)分析或蛋白芯片)和PIK3CA突變狀態(tài)(通過(guò)定位測(cè)序或SNP堿基分析)，并建立了治療應(yīng)答與基于曲妥珠單抗治療的相互關(guān)系(見(jiàn)方法項(xiàng)、圖4和圖5)。我們?cè)?4%(54例中的13例；一個(gè)樣品未評(píng)分)的受檢腫瘤中觀察了減少的PTEN表達(dá)(表2)。在基于曲妥珠單抗治療開(kāi)始后，根據(jù)至疾病進(jìn)展時(shí)間的臨床隨訪數(shù)據(jù)生成了Kaplan-Mder生存曲線(xiàn)。圖3a表明PTEN低腫瘤的患者的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p=0.028)比無(wú)復(fù)發(fā)生存的弱。55個(gè)腫瘤樣品后續(xù)的PIK3CA序列分析在外顯子20(H1047R)中鑒別了10個(gè)突變，在外顯子9(E542K和E545K)中鑒別了4個(gè)，這與25。/。的PIK3CA突變頻率相符，與公開(kāi)的乳腺癌PIK3CA突變頻率一致(Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559;見(jiàn)表2)。有趣的是，14個(gè)PIK3CA突變中的12個(gè)是在PTEN高腫瘤中鑒別的，這與PTEN丟失和PIK3CA突變很少出現(xiàn)在相同的乳腺癌腫瘤中的結(jié)果一致(Saal等.2005.CancerRes65:2554-2559)。顯然，消除PTEN表達(dá)或致癌的PIK3CA突變緩解了對(duì)其他靶目標(biāo)的選擇壓力。然后我們確定了通過(guò)致癌的PIK3CA突變激活PBK途徑是否可以預(yù)示基于曲妥珠單抗治療結(jié)局。圖3b中Kaplan-Mder生存曲線(xiàn)明確證實(shí)了在突變-陽(yáng)性腫瘤的患者中，邊界線(xiàn)顯著地(p=0.052)弱于無(wú)復(fù)發(fā)生存。然而，用28%(40例中的ll例)PTEN低腫瘤污染PIK3CA野生型腫瘤，與至疾病進(jìn)展時(shí)25間縮短有關(guān)(圖3a)。因?yàn)镻TEN丟失和PIK3CA突變都有助于PI3K途徑激活，所以我們將患者分類(lèi)為兩組，"激活的"PI3K途徑(PTEN低+PIK3CA突變型；n-25)或"未激活的"PI3K途徑(PTEN高+PIK3CAwt;n=29),并生成Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)圖。圖3c所示的曲線(xiàn)證明PTEN丟失或PIK3CA突變的患者基于曲妥珠單抗治療后無(wú)復(fù)發(fā)生存顯著地低于無(wú)PTEN丟失或PIK3CA突變的患者(p=0.002)。更重要的是，當(dāng)兩種事件(PTEN丟失或PIK3CA突變)都被考慮時(shí)，兩組之間無(wú)復(fù)發(fā)生存差異的顯著性更加明顯。兩個(gè)隊(duì)列的分析分別給出了非常相似的生存曲線(xiàn)(圖6)。根據(jù)將年齡作為時(shí)間尺度的多因素Cox回歸分析，通過(guò)中心分層和調(diào)節(jié)ER狀態(tài)的危害率表明PDK途徑狀態(tài)對(duì)于疾病進(jìn)展是獨(dú)立的顯著的風(fēng)險(xiǎn)因子(HR2.1，p=0.02;表l)。而且，較差的臨床應(yīng)答(定義為根本無(wú)應(yīng)答，或部分緩解以及少于6個(gè)月的疾病穩(wěn)定)與PI3K途徑的激活具有顯著相關(guān)性(Fisher精確檢驗(yàn)p=0.049),但與單獨(dú)的PTEN丟失或PIK3CA突變無(wú)顯著相關(guān)性(表3)。這些數(shù)據(jù)提示結(jié)合PTEN表達(dá)和PIK3CA熱點(diǎn)突變分析可以作為基于曲妥珠單抗治療應(yīng)答的重要預(yù)示因子。兩個(gè)中心之間PTEN和PIK3CA的效果沒(méi)有異質(zhì)性證據(jù)(p>0.47)。這些數(shù)據(jù)提供了PIK3CA突變有助于曲妥珠單抗的無(wú)應(yīng)答性(圖3b)的第一手證據(jù)，與單獨(dú)的PTEN(24%,圖3)相比，PTEN狀態(tài)與PIK3CA狀態(tài)的結(jié)合可高達(dá)兩倍鑒別患者組增加的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)(46%)。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，對(duì)于HER2擴(kuò)散的乳腺腫瘤中曲妥珠單抗應(yīng)答性的最佳預(yù)言，需要同時(shí)評(píng)價(jià)PIK3CA突變狀態(tài)和PTEN表達(dá)水平，以及反應(yīng)途徑激活狀態(tài)。此外，本研究突出了曲妥珠單抗應(yīng)答中PI3K信號(hào)的中心重要性，從而建議了用于治療曲妥珠單抗無(wú)應(yīng)答的乳腺癌或預(yù)防耐藥出現(xiàn)的聯(lián)用治療方案。表格表l多因素Cox回歸分析<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>PD:進(jìn)展性疾病，CR:完全緩解，PR:部分緩解，SD:疾病穩(wěn)定表4經(jīng)常被改變的PIK3CA的氨基酸殘基38(精氨酸)60(谷氨酰胺)88(精氨酸)542(谷氨酸)545(谷氨酸)661(谷氨酰胺)701(組氨酸)733(賴(lài)氨酸)901(半胱氨酸)909(苯丙氨酸)1008(絲氨酸)1011(脯氨酸)1021(酪氨酸)1025(蘇氨酸)1035(谷氨酸)1043(甲硫氨酸)1044(天冬酰胺)1046(丙氨酸)1047(組氨酸)1049(甘氨酸)1065(組氨酸)}}>}}}}}胺酸酸}>酸}>酸酸酸酸酸酸酸酸酰氨氨酸酸氨酸酸氨氨氨氨氨氨氨氨冬冬胱氨氨胱氨氨脯甘精谷賴(lài)甘甘脯天天半絲谷半谷膽460001824508580390001112245701253111111113334444權(quán)利要求1、一種用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括a.測(cè)定所述個(gè)體的所述癌癥細(xì)胞樣品中的PI3K核苷酸序列，或其部分序列；b.將所述序列與對(duì)照樣品中PI3K的相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比；和c.在對(duì)比的基礎(chǔ)上確定所述風(fēng)險(xiǎn)。2、一種用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括a.測(cè)定所述個(gè)體的所述癌癥細(xì)胞樣品中與PI3K相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)；b.基于所述狀態(tài)確定所述風(fēng)險(xiǎn)。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其中將所述活性狀態(tài)與對(duì)照樣品中所述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性狀態(tài)相對(duì)比，且在所述對(duì)比的基礎(chǔ)上確定所述風(fēng)險(xiǎn)。4、如權(quán)利要求2所述的方法，其中確定所述與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性包括確定編碼PIK3CA的基因的擴(kuò)增。5、如權(quán)利要求2所述的方法，其中確定所述與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性包括確定來(lái)自PIK3CA基因的基因產(chǎn)物的表達(dá)水平。6、如權(quán)利要求2所述的方法，其中確定所述與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性包括確定PIK3CA的激酶活性。7、如權(quán)利要求1或2所述的方法，其包括在如圖7所述編碼PIK3CA的核酸的1624、1633、1634或3140任一位點(diǎn)，或在編碼PIK3CA的基因核酸分子中相應(yīng)的位點(diǎn)，或在所示核苷酸序列的任何部分或衍生序列中相應(yīng)的位點(diǎn)，確定PIK3CA的核苷酸序列，其中編碼的氨基酸在位點(diǎn)542(谷氨酸)、545(谷氨酸)和1047(組氨酸)處，由所示氨基酸改變?yōu)榱硪粋€(gè)氨基酸，表明關(guān)于HER2-靶向治療呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)。8、如權(quán)利要求2所述的方法，其中確定與PIK3CA相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性包括確定PIK3CA-指示基因的表達(dá)水平。9、如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述HER2-靶向治療選自基因治療、化療、化合物-介導(dǎo)的治療、siRNA-介導(dǎo)的治療、蛋白治療和抗體-介導(dǎo)的治療。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述HER2-靶向治療包括抗體-介導(dǎo)的治療。11、如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述抗體-介導(dǎo)的治療包括曲妥珠單抗。12、PIK3CA抑制劑或PIK3CA突變型抑制劑在制備治療HER2-耐藥癌癥患者的藥物中的應(yīng)用。13、如權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述癌癥患者是乳腺癌患者。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種用于確定患有癌癥的個(gè)體對(duì)HER2-靶向治療是否處于呈現(xiàn)或獲得應(yīng)答降低的風(fēng)險(xiǎn)的方法。一方面，本發(fā)明利用由脂質(zhì)激酶調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活性來(lái)確定所述風(fēng)險(xiǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101688243SQ200880018423公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年4月14日優(yōu)先權(quán)日2007年4月13日發(fā)明者凱特琳·伯恩斯,雷內(nèi)·伯納德斯申請(qǐng)人:荷蘭癌癥研究所基金會(huì)