專利名稱：△9延伸酶及其在制備多不飽和脂肪酸中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明涉及編碼Δ9脂肪酸延伸酶的多 核苷酸序列的鑒定以及這些延伸酶在制備長鏈多不飽和脂肪酸PUFA中的用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)今，人們正研究包括植物、藻類、真菌、原生藻菌(stramenopiIes)和酵母在內(nèi) 的多種不同宿主作為商業(yè)化PUFA生產(chǎn)的手段?；蚬こ桃呀?jīng)證明，一些宿主(即便是天然 受限于亞油酸(LA;18:2 ω-6)和α-亞麻酸(ALA; 18:3 ω-3)脂肪酸產(chǎn)生的那些宿主)的 天然能力可以被顯著改變，以導(dǎo)致高水平地產(chǎn)生多種長鏈ω-3/ω-6 PUFA。不論這是天然 能力的結(jié)果還是重組技術(shù)的結(jié)果，花生四烯酸(ARA;20:4 ω-6)、二十碳五烯酸(ΕΡΑ;20:5 ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA;22:6 ω-3)的產(chǎn)生可能均需要表達(dá)Δ9延伸酶。迄今為止鑒定的大多數(shù)Δ 9延伸酶既具有將LA轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸(EDA ；20:2 ω-6)的能力又具有將ALA轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸(ETrA;20:3 ω-3)的能力(其中在與Δ8 去飽和酶反應(yīng)之后，EDA和ETrA隨后分別被合成二高-γ-亞麻酸(DGLA;20:3 ω-6)和 二十碳四烯酸(ETA ；20:4 ω-3)；在與Δ 5去飽和酶反應(yīng)后，DGLA和ETA隨后分別被合成 ARA和EPA ；并且，DHA合成需要后續(xù)表達(dá)額外的C2(1/22延伸酶和Δ 4去飽和酶)。盡管需要用于產(chǎn)生ARA、EPA和DHA的新方法，但僅少量的Δ9延伸酶得以鑒 定。來自綠光等鞭金藻(Isochrysis galbana)的Δ9延伸酶是公開可獲得的(在基因庫 編號(GenBank Accession No) AAL37626 以及 PCT 公開 WO 02/077213、WO 2005/083093、 WO 2005/012316 和 W02004/057001 中有描述)。PCT 公開 WO 2007/061845 和 WO 2007/061742 (申請人的受讓人的共同未決的申請)公開了來自小眼蟲(Euglenagracilis) 和Euti^ptiella sp. CCMP389的Δ 9延伸酶，以及Δ 9延伸酶的基序。因此，需要鑒定和分離出另外的編碼Δ9延伸酶的基因，該基因?qū)⑦m用于在多種 宿主生物中異源表達(dá)以用于產(chǎn)生ω-3/ω-6脂肪酸。本申請人通過從Euglena anabaena中分離出編碼Δ 9脂肪酸延伸酶的基因而解 決了這里所說的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的新的遺傳構(gòu)建體，以及它們在藻 類、細(xì)菌、酵母、類眼蟲、原生藻菌和真菌中的使用，用于產(chǎn)生PUFA。因此，本發(fā)明提供包含分 離的多核苷酸的微生物宿主細(xì)胞，該多核苷酸包含(a)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法 在與SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該多肽具有至少80%的氨基酸同一性；(b)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法在 與SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 26中示出的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該核 苷酸序列具有至少80%的序列同一性；(c)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中該核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12或SEQ ID NO 26中示出的核苷酸序列雜交；或(d) (a)、(b)或(C)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中該互補(bǔ)序列與該核苷酸序列由 相同數(shù)目的核苷酸組成并且100 %互補(bǔ)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生二十碳二烯酸的方法，該方法包括a)提供微生物宿主細(xì)胞，該微生物宿主細(xì)胞包含(i)編碼Δ 9延伸酶多肽的重組核苷酸分子，基于Clustal V比對方法在與SEQ ID Ν0:13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該延伸酶多肽具有至少80% 的氨基酸同一性；和(ii)亞油酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細(xì)胞在使編碼Δ 9延伸酶多肽的核酸片段表達(dá)并使亞 油酸轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸的條件下生長；以及c)任選回收步驟(b)的二十碳二烯酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生二十碳三烯酸的方法，該方法包括a)提供微生物宿主細(xì)胞，該微生物宿主細(xì)胞包含(i)編碼Δ 9延伸酶多肽的重組核苷酸分子，基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO 13或SEQ ID NO 14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該延伸酶多肽具有至少80% 的氨基酸同一性；和(ii) α-亞麻酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細(xì)胞在使編碼Δ 9延伸酶多肽的核酸片段表達(dá)并使 α-亞麻酸轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸的條件下生長；以及c)任選回收步驟(b)的二十碳三烯酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供如SEQ ID NO :26中示出的編碼Δ 9延伸 酶的分離的核酸分子，在該序列中至少98個(gè)密碼子被密碼子最優(yōu)化以便在耶氏酵母屬 (Yarrowia)物種中表達(dá)。附圖簡述和序列表

圖1是代表性的ω-3和ω-6脂肪酸生物合成途徑，該途徑提供了肉豆蔻酸經(jīng)過 多種中間產(chǎn)物向DHA的轉(zhuǎn)化。圖2示出了如實(shí)施例中所述的Euglena anabaena細(xì)胞提取物的脂質(zhì)概況的色譜 圖。圖3 提供了下列質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜(A)pY115(SEQ ID NO 19) ； (B) pY159 (SEQ ID NO 23) ； (C)pY173(SEQ ID NO 24)和(D)pY174(SEQID NO :25)。圖 4Α 和 4Β 示出了 EaD9Elo(SEQ ID NO 11)禾口 EaD9ES (SEQ IDNO 26)的核苷酸序 列的比較。圖5提供了下列質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜(A)pEaD9ES(SEQ ID NO 28)；和(B)pZUFmEaD9eS(SEQ ID NO :29)。
根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描 述和所附的序列描述形成了本申請的一部分。下面的序列遵循37C. F. R. § 1. 821-1. 825 ( “對包含核苷酸序列和/或氨基酸序 列公開內(nèi)容的專利申請的要求-序列規(guī)則”("Requirementsfor Patent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25標(biāo)準(zhǔn)(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5. 2和 49. 5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的 208 節(jié)和附錄 C)。用于核 苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中示出的規(guī)則。SEQ ID NO :1_4、9_19和22-29為編碼基因或蛋白質(zhì)(或其部分)或質(zhì)粒的0RF， 如表1中所示。M 1核酸和蛋白質(zhì)SEQ ID號總匯 SEQ ID NO 5和6分別對應(yīng)寡核苷酸oEugELl_l和oEugELl_2，用于擴(kuò)增小眼蟲Δ 9延伸酶。SEQ ID Ν0:7和8分別對應(yīng)M13F通用引物和引物M13-28Rev，用于對Euglena anabaena DNA插入物進(jìn)行末端測序。SEQ ID NO :20和21分別對應(yīng)引物oYFBAl和oYFBAl-6，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pY115的 FBAINm啟動(dòng)子。發(fā)明詳述本文中公開了新的Euglena anabaena Δ 9延伸酶和編碼這種延伸酶的基因，其可 用于操縱產(chǎn)生健康的PUFA的生化途徑。PUFA或其衍生物可用作膳食替代品或補(bǔ)充劑，尤其是嬰兒代乳品(formula)，用 于接受靜脈內(nèi)營養(yǎng)法的患者或用來預(yù)防或治療營養(yǎng)不良。或者，可以將純化的PUFA(或其 衍生物)摻入食用油、脂肪或調(diào)配的人造黃油中，以便食用者在正常使用中將獲得所需量 的膳食補(bǔ)充。PUFA還可以摻入嬰兒代乳品、營養(yǎng)補(bǔ)充劑或其他食品中，并且可用作抗炎或降 膽固醇劑。任選地，該組合物可以用于藥用(人藥或獸藥)。^JL在本公開的上下文中使用了大量術(shù)語和縮寫。給出了如下定義。“可讀框”縮寫為0RF。“聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為PCR?！懊绹湫团囵B(yǎng)物保藏中心”縮寫為ATCC?！岸嗖伙柡椭舅帷笨s寫為PUFA?！叭；视汀笨s寫為TAG。如本文所用，術(shù)語“發(fā)明，，或“本發(fā)明”不旨在局限于本發(fā)明的任一具體實(shí)施方案， 而是在一般情況下適用于如權(quán)利要求和說明書中所描述的本發(fā)明的任何實(shí)施方案和所有 實(shí)施方案。本文所用的以及所附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包 括復(fù)數(shù)指代，除非上下文中清楚地指明其他涵義。因此，例如，“一株植物”的涵義包括多株 此類植物，“一個(gè)細(xì)胞”的涵義包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞及其本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的等同物，寸寸。術(shù)語“脂肪酸”指不同鏈長的長鏈脂族酸(鏈烷酸)，鏈長為約C12至C22 (盡管更 長和更短鏈長的酸均是已知的)。主要的鏈長介于C16和C22之間。另外的關(guān)于“飽和脂肪 酸”與“不飽和脂肪酸”、“單不飽和脂肪酸”與“多不飽和脂肪酸”(或“PUFA”)以及“ ω -6 脂肪酸”(ω-6或η-6)與“ω-3脂肪酸”(ω-3或η_3)之間的區(qū)別的詳細(xì)信息在美國專利 7，238，482中有提供。本文通過簡單的記號系統(tǒng)“Χ:Υ”來描述脂肪酸，其中X表示特定脂肪酸中碳(c) 原子的總數(shù)，而Y為雙鍵的數(shù)目。脂肪酸名稱后面的數(shù)字表示從脂肪酸羧基端計(jì)數(shù)的雙鍵 的位置，詞綴“C”表示雙鍵的順式構(gòu)型(例如，棕櫚酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1， 9c)、巖芹酸(18:1,6c), LA(18:2，9c，12c)、GLA (18 3，6c，9c，12c)和 ALA (18 3，9c，12c， 15c))。除非另外指明，否則18:1、18:2和18:3分別指油酸、LA和ALA脂肪酸。如果沒有另外明確地寫明，則認(rèn)為雙鍵為順式構(gòu)型。例如，18:2(9，12)中的雙鍵將被認(rèn)為是順式構(gòu)型。在本公開內(nèi)容中用于描述PUFA的命名在下面的表2中示出。在標(biāo)題為“簡化符 號”一欄中，ω-指代系統(tǒng)用于表明碳數(shù)目、雙鍵的數(shù)目和最接近ω碳的雙鍵位置，雙鍵位 置的計(jì)數(shù)從ω碳開始(為此ω碳的編號為1)。該表的其余部分匯總了 ω-3和ω-6脂 肪酸及其前體的俗名、將在整個(gè)說明書的其余部分中使用的縮寫以及每種化合物的化學(xué)名 稱。表2多不飽和脂肪酸和前體的侖名 術(shù)語“三酰基甘油”、“油”和“TAG”指由與甘油分子酯化的三個(gè)脂肪酰殘基組成的 中性脂質(zhì)(并且這些術(shù)語在整個(gè)本公開內(nèi)容中將可互換使用)。這些油可含有長鏈PUFA以 及較短的飽和的和不飽和的脂肪酸以及較長鏈的飽和脂肪酸。因此，“油的生物合成”一般 指細(xì)胞中TAG的合成?！翱傊|(zhì)和油級分中的PUFA百分比(％)”指PUFA相對于在那些級分中的總脂肪 酸的百分比。術(shù)語“總脂質(zhì)級分”或“脂質(zhì)級分”兩者均指含油生物內(nèi)所有脂質(zhì)(即中性和極性脂質(zhì))的總和，因此包括位于磷脂酰膽堿(PC)級分、磷脂酰乙醇胺(PE)級分和三酰基 甘油(TAG或油)級分中的那些脂質(zhì)。然而，術(shù)語“脂質(zhì)”和“油”將可在整個(gè)說明書中互換
使用。 代謝途徑或生物合成途徑在生物化學(xué)意義上可以認(rèn)為是發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)由酶催化 的一系列化學(xué)反應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞待使用的或待貯存的代謝產(chǎn)物的形成，或啟動(dòng)另一代謝途 徑(因而稱作流量產(chǎn)生步驟)。很多此類途徑均很精細(xì)，并涉及對起始物質(zhì)的逐步修飾以使 之形成具有期望的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。術(shù)語“PUFA生物合成途徑”指將油酸轉(zhuǎn)化成諸如LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、DRA、DTA 禾口 DPAn-6之類的ω -6脂肪酸和諸如ALA、STA、ETrA, ETA、EPA、DPA和DHA之類的ω -3月旨 肪酸的代謝過程。該過程在文獻(xiàn)中已有詳細(xì)的描述(如參見PCT公開WO 2006/052870)。 簡而言之，該過程涉及通過添加碳原子來延長碳鏈和通過加入雙鍵來使分子去飽和，這通 過存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的一系列特異性去飽和酶和延伸酶(即“PUFA生物合成途徑酶”)進(jìn) 行。更具體地講，“PUFA生物合成途徑酶”指如下與PUFA生物合成相關(guān)的任何酶(以及編 碼所述酶的基因)，包括Δ9延伸酶、C14716延伸酶、C16718延伸酶、C18720延伸酶、C20722延伸 酶、Δ 4去飽和酶、Δ 5去飽和酶、Δ 6去飽和酶、Δ 12去飽和酶、Δ 15去飽和酶、Δ 17去飽 和酶、Δ 9去飽和酶和/或Δ 8去飽和酶。術(shù)語“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑”指在合適條件下表達(dá)時(shí)編碼催化產(chǎn)生 ω-3和ω-6脂肪酸二者之一或兩者的酶的一組基因。通常，參與ω-3/ω-6脂肪酸生物合 成途徑的基因編碼PUFA生物合成途徑酶。圖1示出了代表性的途徑，提供了肉豆蔻酸經(jīng)過 多種中間產(chǎn)物向DHA的轉(zhuǎn)化，這展示了 ω-3和ω-6脂肪酸兩者是如何可以從共同來源而 產(chǎn)生。自然，該途徑分成兩部分，其中一部分將產(chǎn)生ω-3脂肪酸而另一部分產(chǎn)生ω-6脂肪 酸。如本文關(guān)于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的上下文中所用，術(shù)語“功能性的”指 該途徑中的一些(或全部)基因表達(dá)活性酶，從而導(dǎo)致體內(nèi)催化或底物轉(zhuǎn)化。應(yīng)當(dāng)理解， “ ω -3/ ω -6脂肪酸生物合成途徑”或“功能性ω -3/ ω -6脂肪酸生物合成途徑”并不意味 著所有的PUFA生物合成途徑酶基因均是必需的，因?yàn)樵S多脂肪酸產(chǎn)物將僅需要表達(dá)該途 徑中的一亞組基因。術(shù)語“ Δ 6去飽和酶/ Δ 6延伸酶途徑”將指最低程度包括至少一種Δ 6去飽和酶 和至少一種Cw2tl延伸酶(也稱為Δ 6延伸酶)的PUFA生物合成途徑，從而使得能分別從 LA和ALA開始，以GLA和/或ETA作為脂肪酸中間產(chǎn)物生物來合成DGLA和/或ΕΤΑ。通過 其他去飽和酶和延伸酶的表達(dá)，還可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。術(shù)語“ Δ 9延伸酶/ Δ 8去飽和酶途徑”將指最低程度包括至少一種Δ 9延伸酶和 至少一種Δ 8去飽和酶的PUFA生物合成途徑，從而使得能分別從LA和ALA開始，以ETA和 /或DGLA作為脂肪酸中間產(chǎn)物來生物合成DGLA和/或ΕΤΑ。通過其他去飽和酶和延伸酶 的表達(dá)，還可以合成ARA、EPA、DPA和DHA。術(shù)語“脂肪酸中間產(chǎn)物”指在脂肪酸代謝途徑中產(chǎn)生的任何脂肪酸，其可以通過其 他代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成本途徑的目的脂肪酸產(chǎn)物。例如，當(dāng)利用Δ9延伸酶/ Δ 8去飽和酶途徑產(chǎn)生EPA時(shí)，可以產(chǎn)生EDA、ETrA, DGLA, ETA和ARA并被認(rèn)為是“脂肪酸 中間產(chǎn)物”，因?yàn)檫@些脂肪酸可通過其他代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成ΕΡΑ。
術(shù)語“脂肪酸副產(chǎn)物”指在脂肪酸代謝途徑中產(chǎn)生的既非該途徑的目的脂肪酸產(chǎn) 物又非該途徑的“脂肪酸中間產(chǎn)物”的任何脂肪酸。例如，當(dāng)利用Δ9延伸酶/Δ8去飽和 酶途徑中產(chǎn)生EPA時(shí)，sciadonic酸(SCI)和juniperonic酸(JUP)也可通過Δ 5去飽和 酶分別作用于EDA或ETrA而產(chǎn)生。它們被認(rèn)為是“脂肪酸副產(chǎn)物”，因?yàn)閮烧呔荒芡ㄟ^其 他代謝途徑酶的作用進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成ΕΡΑ。術(shù)語“去飽和酶”指可以在一種或多種脂肪酸中去飽和(即引入雙鍵)而產(chǎn)生所關(guān) 注的脂肪酸或前體的多肽。盡管在整個(gè)說明書中使用ω-指代系統(tǒng)來指代特定的脂肪酸， 但使用Δ-系統(tǒng)從底物的羧基端計(jì)數(shù)來表示去飽和酶的活性更方便。所關(guān)注的去飽和酶包 括(例如)(1)使脂肪酸在從該分子的羧基端計(jì)數(shù)的第8個(gè)和第9個(gè)碳原子之間去飽和并 且可以(例如)催化EDA轉(zhuǎn)化成DGLA和/或催化ETrA轉(zhuǎn)化成ETA的△8去飽和酶；(2) Δ 5去飽和酶，該去飽和酶催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA和/或催化ETA轉(zhuǎn)化成EPA ； (3) Δ 6去飽 和酶，該去飽和酶催化LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或催化ALA轉(zhuǎn)化成STA ； (4) Δ 4去飽和酶，該去飽 和酶催化DPA轉(zhuǎn)化成DHA和/或催化DTA轉(zhuǎn)化成DPAn_6 ； (5) Δ 12去飽和酶，該去飽和酶催 化油酸轉(zhuǎn)化成LA ； (6) Δ 15去飽和酶，該去飽和酶催化LA轉(zhuǎn)化成ALA和/或催化GLA轉(zhuǎn)化 成STA ； (7) Δ 17去飽和酶，該去飽和酶催化ARA轉(zhuǎn)化成EPA和/或催化DGLA轉(zhuǎn)化成ETA ； 以及(8) △ 9去飽和酶，該去飽和酶催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸(16:1)和/或催化硬脂酸 轉(zhuǎn)化成油酸(18:1)。在本領(lǐng)域中，基于Δ 15和Δ 17去飽和酶將ω-6脂肪酸轉(zhuǎn)化成它們 的ω -3對應(yīng)物的能力(如分別將LA轉(zhuǎn)化成ALA和將ARA轉(zhuǎn)化成EPA)，偶爾也將它們稱作 “ ω-3去飽和酶”、“ ω-3去飽和酶”和/或“ ω-3去飽和酶”。在一些實(shí)施方案中，最理想 的是，通過用脂肪酸去飽和酶的基因來轉(zhuǎn)化合適的宿主并測定它對該宿主脂肪酸概況的作 用，從而經(jīng)驗(yàn)性地測定特定脂肪酸去飽和酶的特異性。為了本文的目的，通常將催化第一縮合反應(yīng)(即丙二酰輔酶A和長鏈?；o酶A 轉(zhuǎn)化成β-酮脂酰輔酶Α)的酶稱為“延伸酶”。一般來講，延伸酶的底物選擇性有些廣泛， 但由鏈長度和不飽和程度兩者來區(qū)分。因此，延伸酶可具有不同的特異性。例如，(14/16延 伸酶將會利用C14底物(如肉豆蔻酸)，C16718延伸酶將會利用C16底物(如棕櫚酸)，C18720 延伸酶(也稱為Δ 6延伸酶，兩個(gè)術(shù)語可以互換使用)將會利用C18底物(如GLA、STA)， 而(2(1/22延伸酶將會利用C2tl底物(如ARA、EPA)。同樣，并且本文尤其關(guān)注的是，“Δ9延伸 酶”催化LA轉(zhuǎn)化成EDA和/或催化ALA轉(zhuǎn)化成ETrA。重要的是，須注意一些延伸酶具有廣 泛的特異性并因而單個(gè)酶可能能夠催化幾種延伸酶反應(yīng)。因此，例如，Δ9延伸酶還可以用 作C16/18延伸酶、C18720延伸酶和/或C2(1/22延伸酶，并且可以分別對諸如EPA和/或GLA之 類的Δ5和△ 6脂肪酸具有備選的但非優(yōu)選的特異性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，理想的是，通 過用脂肪酸延伸酶的基因來轉(zhuǎn)化合適的宿主并測定它對該宿主脂肪酸概況的作用，從而經(jīng) 驗(yàn)性地測定該脂肪酸延伸酶的特異性。延伸酶體系通常包括四種酶，這些酶負(fù)責(zé)脂肪酸碳 鏈延長而產(chǎn)生比該延伸酶體系所作用的脂肪酸底物長兩個(gè)碳原子的脂肪酸。更具體地講， 延長過程與脂肪酸合酶相關(guān)聯(lián)進(jìn)行，其中輔酶A是酰基載體(Lassner等人，Plant Cell, 8 281-292(1996))。在第一步驟(已發(fā)現(xiàn)該步驟既是底物特異性的又是限速的)中，丙二酰 輔酶A與長鏈?；o酶A縮合產(chǎn)生二氧化碳(CO2)和酮脂酰輔酶A (其中脂?；糠?已經(jīng)延長了兩個(gè)碳原子)。后續(xù)的反應(yīng)包括還原成羥酰輔酶Α、脫水成烯酰輔酶A以及 第二還原反應(yīng)以產(chǎn)生延長的?；o酶Α。由延伸酶體系催化的反應(yīng)的實(shí)例是將GLA轉(zhuǎn)化成DGLAjf STA轉(zhuǎn)化成ETA、將LA轉(zhuǎn)化成EDA、將ALA轉(zhuǎn)化成ETrAjf ARA轉(zhuǎn)化成DTA和將EPA 轉(zhuǎn)化成DPA。 為了本文目的，術(shù)語“EaD9Elol” 指從 Euglena anabaena 分離的、由 SEQ ID NO: 11編碼的Δ9延伸酶(SEQ ID N0:13)。術(shù)語“EaD9Elo2”指從Ε. anabaena分離的、由SEQ ID NO 12編碼的Δ 9延伸酶(SEQ IDNO 14) 同樣，術(shù)語“EaD9eS”指來源于Ε. anabaena 的經(jīng)密碼子最優(yōu)化以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)的合成的Δ9延伸酶(即SEQ ID N0:26和 27)。術(shù)語“轉(zhuǎn)化效率”和“底物轉(zhuǎn)化百分比”指特定酶(如延伸酶)能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)化成 產(chǎn)物的效率。轉(zhuǎn)化效率根據(jù)下面的公式測量([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])*100，其中‘產(chǎn)物’ 包括中間產(chǎn)物和該途徑中來源于它的所有產(chǎn)物。術(shù)語“含油的”指那些往往以脂質(zhì)形式貯存它們的能源的生物(Weete，F(xiàn)ungal Lipid Biochemistry，第二版，Plenum，1980)。在含油微生物內(nèi)，細(xì)胞油或TAG含量通常符 合S形曲線，其中脂質(zhì)濃度增加直至晚對數(shù)生長晚期或穩(wěn)定生長早期時(shí)它達(dá)到最高濃度， 隨后在穩(wěn)定生長晚期和死亡期期間逐漸下降(Yongrmanitchai和Ward，Appl. Environ. Microbiol. ,57 :419_25 (1991))。含油微生物積累油超過它們的干細(xì)胞重量的約25%的情 形并不鮮見。術(shù)語“含油酵母”指那些能夠產(chǎn)油并被歸類為酵母的微生物。含油酵母的實(shí)例包 括但不限于如下屬耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢 酵母屬和油脂酵母屬。術(shù)語“裸藻綱(Euglenophyceae) ”指發(fā)現(xiàn)生活在淡水環(huán)境、海洋環(huán)境、土壤環(huán)境和 寄生環(huán)境中的一群單細(xì)胞的無色或光合鞭毛蟲(“類眼蟲”)。該綱的特征為孤立的單細(xì) 胞，其中大多數(shù)是自由游動(dòng)的并且具有從稱為儲存器的前內(nèi)陷長出的兩條鞭毛(其中一條 可能不露出)。光合類眼蟲含有一個(gè)至多個(gè)葉綠體，葉綠體從微小的盤狀至延伸的板狀或 帶狀而不同。無色類眼蟲依賴于滲透營養(yǎng)或吞噬營養(yǎng)來進(jìn)行營養(yǎng)同化作用。已經(jīng)描述了約 1000種物種并將它們分為約40個(gè)屬和6個(gè)目。裸藻綱的實(shí)例包括但不限于如下屬裸藻 屬(Euglena)、Eutreptiella 禾口 Tetruetreptia0如本文所用，“核酸”意指多核苷酸，并包括單鏈或雙鏈的脫氧核糖核苷酸或核糖 核苷酸堿基聚合物。核酸也可以包括片段和經(jīng)修飾的核苷酸。因此，術(shù)語“多核苷酸”、“核 酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互換使用，并且指作為單鏈或雙鏈的RNA或DNA 聚合物，任選含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由 cDNA、基因組DNA、合成DNA或它們的混合物的一個(gè)或多個(gè)片段構(gòu)成。核苷酸(通常以它們 的5'-單磷酸形式存在)可以用如下它們的單字母名稱指代“A”表示腺苷酸或脫氧腺苷 酸(分別針對RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，“G”表示鳥苷酸或脫氧鳥苷酸， “U”表示尿苷酸，“T”表示脫氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K” 表示G或T，“H”表示A或C或T，“ I ”表示肌苷，“N”表示任何核苷酸。術(shù)語“保守結(jié)構(gòu)域”或“基序”指進(jìn)化上相關(guān)的蛋白質(zhì)的比對序列中在特定位置處 保守的一組氨基酸。雖然同源蛋白質(zhì)之間在其他位置的氨基酸可以發(fā)生變化，但在特定位 置高度保守的氨基酸表明對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性來說是必需的氨基酸。因?yàn)樗鼈?可通過它們在蛋白質(zhì)同系物家族的比對序列中的高度保守來鑒定，所以它們可用作識別標(biāo)簽或“簽名”來確定具有新的測定序列的蛋白質(zhì)是否屬于以前鑒定的蛋白質(zhì)家族。PCT公開 WO 2007/061845和WO 2007/061742描述了七種不同的與Δ 9延伸酶相關(guān)的基序。
術(shù)語“同源性”、“同源的”、“基本上類似的”和“基本上對應(yīng)的”在本文中可互換使 用。它們指這樣的核酸片段，即其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基改變并不會影響該核酸片段介 導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。這些術(shù)語也指本發(fā)明的核酸片段的修飾(例如缺失或 插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸)，相對于初始的未經(jīng)修飾的核酸片段，該修飾基本上不會改變所得 核酸片段的功能特性。因此，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的，本發(fā)明涵蓋的不僅僅是具體 的示例性序列。此外，技術(shù)人員認(rèn)識到，本發(fā)明所涵蓋的基本上類似的核苷酸序列也通過它們 (在中等嚴(yán)格條件如0.5Χ SSC，0. SDS，60°C下)與本文所示例的序列雜交的能力，或雜 交至本文所公開的核苷酸序列的任何部分以及雜交至與本文所公開的任何核苷酸序列功 能相當(dāng)?shù)男蛄械哪芰λ薅??？梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件以篩選中度相似的片段(例如來自遠(yuǎn)緣 生物的同源序列)，到篩選高度相似的片段(例如從近緣生物復(fù)制功能性酶的基因)。雜交 后的洗滌可確定嚴(yán)格性條件。術(shù)語“選擇性雜交”包括指在嚴(yán)格雜交條件下，核酸序列與特定核酸靶序列以比其 與非靶核酸序列的雜交更高的可檢測程度(例如至少兩倍于背景)雜交，并指基本排除了 非靶核酸。選擇性雜交的序列通常彼此具有約至少80%的序列同一性，或90%的序列同一 性，最多并包括100%的序列同一性(即完全互補(bǔ))。術(shù)語“嚴(yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”包括指探針將會選擇性雜交至其靶序列的條 件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，并將因不同的環(huán)境而異。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán) 格性，可鑒定與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測)?；蛘?，可調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件以允許序列 中的一些錯(cuò)配，以便檢測到更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針的長度少于約1000 個(gè)核苷酸，任選長度少于500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)格條件將是如下那些條件在pH7. 0至8. 3下鹽濃度低于約1. 5M鈉離子， 通常約0. 01至1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，并且對于短探針(例如10至50個(gè)核苷酸) 溫度為至少約30°C，而對于長的探針(例如多于50個(gè)核苷酸)溫度為至少約60°C。嚴(yán)格 條件也可以通過加入諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)。示例性的低嚴(yán)格條件包括在37°C 下于含30至35%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖液中雜交，以及在50 至55°C下用IX至2X SSC (20X SSC = 3. 0MNaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)洗滌。示例性的中等嚴(yán) 格條件包括在37°C下于40至45%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，以及在55至60°C下用 0. 5X至IX SSC洗滌。示例性的高嚴(yán)格條件包括在37°C下于50%甲酰胺、IM NaClU % SDS 中雜交，以及在60至65°C下用0. IX SSC洗滌。特異性通常取決于雜交后洗滌，最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度是關(guān)鍵因素。對 于 DNA-DNA 雜交體，Tm 可以用 Meinkoth 等人，Anal. Biochem.，138 :267_284 (1984)中的等 式估算:Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L ；其中 M 是單價(jià)陽 離子的體積摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是雜交溶 液中甲酰胺的百分比，而L是以堿基對表示的雜交體的長度。Tm是(在確定的離子強(qiáng)度和 PH下)50%的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。每出現(xiàn)的錯(cuò)配，Tm降低約 rc ；因此，可調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或洗滌條件以與具有期望同一性的序列雜交。例如，如果要尋求具有彡90同一性百分比(％)的序列，則可將、降低10°C。通常，在確定的離子強(qiáng) 度和PH下，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列及其互補(bǔ)序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5°C。然而， 極嚴(yán)格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低1、2、3或4°C的溫度下雜交和/或洗滌；中等嚴(yán) 格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低6、7、8、9或10°C的溫度下雜交和/或洗滌；而低嚴(yán) 格條件可采用在比熱解鏈溫度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的溫度下雜交和/或洗滌。 利用上述等式、雜交和洗滌組合物以及所需的Tm，一般技術(shù)人員將會理解，雜交和/或洗滌 溶液的嚴(yán)格性的變化已經(jīng)在本質(zhì)上得以描述。如果所需的錯(cuò)配程度導(dǎo)致Tm低于45°C (水 溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，則優(yōu)選增加SSC的濃度以便能使用更高的溫度。對核酸雜 交的詳盡指導(dǎo)可在以下文獻(xiàn)中找至1J :Tijssen，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization withNucleic Acid Probes,第 I 部分，第 2 章 “Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NewYork(1993)；以及 Current Protocols in Molecular Biology,第 2 章，Ausubel 等人編輯，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York(1995)。 雜交和/或洗滌條件可進(jìn)行至少10、30、60、90、120或240分鐘。
上下文中核酸序列或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”指在特定比較窗口上 進(jìn)行比對以尋求最大對應(yīng)時(shí)，兩個(gè)序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基。因此，“序列同一性百分比”指通過在比較窗口上比較兩個(gè)最佳對齊的序列而測得 的值，其中與參考序列(其不包括添加或缺失)相比較，比較窗口中的多核苷酸或多肽序列 部分可包括添加或缺失(即缺口)以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳比對。該百分比通過如下計(jì)算 測定相同核酸堿基或氨基酸殘基在兩個(gè)序列中出現(xiàn)的位置的數(shù)目，以獲得匹配位置的數(shù) 目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的總位置數(shù)目并將所得結(jié)果乘以100而獲得序列同 一性百分比。序列同一性百分比的可用的實(shí)例包括但不限于50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%或95%，或50%至100%的任何整數(shù)百分比。這些同一性可以用本文 描述的任何程序測定。序列比對和百分比同一性或相似性的計(jì)算可以用設(shè)計(jì)用于檢測同源序列的多 種比較方法來確定，這些方法包括但不限于LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTAR Inc. ,Madison, WI)的MegAlign 程序。在本專利申請的上下文中應(yīng)當(dāng)理解，使用序列分析 軟件進(jìn)行分析時(shí)，除非另外指明，否則分析結(jié)果將基于所參考程序的“默認(rèn)值”。在此所用的 “默認(rèn)值”將指在首次初始化軟件時(shí)軟件最初加載的任何值或參數(shù)集。"Clustal V 比對方法”對應(yīng)于稱為 Clustal V(在 Higgins 和 Sharp，CABI0S，5 151-153(1989) ；Higgins, D. G.等人，Comput. Appl. Biosci.，8 189-191 (1992)中有所描 述)并且可以在LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(同上)的MegAlign 程序中找到的 比對方法。對于多重比對，默認(rèn)值對應(yīng)于缺口罰分(GAP PENALTY) = 10和缺口長度罰分 (GAPLENGTH PENALTY) = 10。用Clustal V方法進(jìn)行成對比對和蛋白質(zhì)序列的百分比同一 性計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE = 1、缺口罰分=3、窗口(WINDOW) = 5和DIAGONALS SAVED =5。對于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE = 2，缺口罰分=5，窗口= 4和DIAGONALS SAVED = 4。在用Clustal V程序進(jìn)行序列比對后，有可能通過觀察相同程序中的“序列距離”表來 獲得“百分比同一性”。"BLASTN比對方法”是由國家生物技術(shù)信息中心(National CenterforBiotechnology Information, NCBI)提供的用以采用默認(rèn)參數(shù)比較核苷酸序列的算法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員非常清楚，多種程度的序列同一性可用于從其他物種中鑒定多 肽，其中這類多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的可用的實(shí)例包括但不限 于 50 %、55 %、60 %、65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、90 % 或 95 %，或 50 % 至 100 % 的任何整 數(shù)百分比。實(shí)際上，50%至100%的任何整數(shù)氨基酸同一性可用于描述本發(fā)明，例如51%、 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%, 67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%或99%。而且，所關(guān)注的是這種分離的核苷酸片段的任何全長或部分互補(bǔ)的序 列?！懊艽a子簡并性”指允許核苷酸序列在不影響所編碼的多肽的氨基酸序列的情況下發(fā)生變化的遺傳密碼的性質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及編碼氨基酸序列的全部或基本部分的任 何核酸片段，該氨基酸序列編碼在SEQID N0:13和SEQ ID NO 14中示出的本發(fā)明的類眼蟲 多肽。技術(shù)人員非常了解具體宿主細(xì)胞在使用核苷酸密碼子以確定給定氨基酸時(shí)所表現(xiàn)出 的“密碼子偏倚性”。因此，當(dāng)合成基因用以改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)，希望對基因進(jìn)行設(shè) 計(jì)，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用頻率?！昂铣傻幕颉笨捎墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的寡核苷酸構(gòu)件裝 配而成。將這些構(gòu)件進(jìn)行連接并退火以形成基因節(jié)段，該基因節(jié)段隨后在酶促作用下裝配 而構(gòu)建成完整的基因。因此，基于最優(yōu)化核苷酸序列以反映宿主細(xì)胞的密碼子偏倚性，可以 定制基因用以最優(yōu)化基因表達(dá)。如果密碼子使用偏向于宿主偏好的那些密碼子，則技術(shù)人 員會理解成功的基因表達(dá)的可能性。優(yōu)選的密碼子的確定可基于對來源于宿主細(xì)胞的基因 (其中序列信息可獲得)的檢測。“基因”指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，并且該核酸片段可以指單獨(dú)的編碼區(qū)或可 以包括位于編碼序列之前的調(diào)控序列(5'非編碼區(qū))和之后的調(diào)控序列(3'非編碼區(qū))。 “天然基因”是指天然存在的具有其自己的調(diào)控序列的基因?！扒逗匣颉笔侵覆皇翘烊换?因的任何基因，包含在天然情況下不是一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可 包括源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的 方式排列的調(diào)控序列和編碼序列?！皟?nèi)源性基因”指位于生物的基因組內(nèi)它的天然位置的天 然基因。“外來基因”指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，它通過基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主 生物內(nèi)。外來基因可以包含插入到非天然生物內(nèi)的天然基因，或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是已 通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組內(nèi)的基因?！敖?jīng)密碼子最優(yōu)化的基因”是其密碼子使用頻率經(jīng)設(shè)計(jì) 用以模仿宿主細(xì)胞優(yōu)選的密碼子使用頻率的基因?！熬幋a序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“調(diào)控序列”指位于編碼序列上游 (5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，并且該核苷酸序列影響相 關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)控序列可包括但不限于啟動(dòng)子、翻譯前 導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)?！皢?dòng)子”指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般來講，編碼序 列位于啟動(dòng)子序列的3'端。啟動(dòng)子可整個(gè)源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的 啟動(dòng)子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可以在不同的組織或細(xì)胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者響應(yīng)不同的環(huán) 境條件而引導(dǎo)基因的表達(dá)。導(dǎo)致基因在幾乎所有發(fā)展階段中表達(dá)的啟動(dòng)子通常稱為“組成 型啟動(dòng)子”。還應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，由于在大多數(shù)情況下調(diào)控序列的確切邊界(特別是它的5’端) 尚未完全確定，因此一些改變形式的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。
啟動(dòng)子序列可以由鄰近的和更遠(yuǎn)處的上游元件組成，后一類元件常稱為增強(qiáng)子和 /或沉默子。因此，“增強(qiáng)子”是能刺激啟動(dòng)子活性的DNA序列，并且可以是啟動(dòng)子的固有的 元件或插入的異源元件，用以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平或階段特異性?！俺聊印笔悄芤种茊?dòng)子 活性的DNA序列，并且可以是啟動(dòng)子的固有的元件或插入的異源元件，用以抑制啟動(dòng)子的 水平或階段特異性?！胺g前導(dǎo)序列”指位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和編碼序列之間的多核苷酸序列。翻 譯前導(dǎo)序列存在于翻譯起始序列的經(jīng)完全加工后的mRNA上游。翻譯前導(dǎo)序列可影響mRNA 的初級轉(zhuǎn)錄過程、mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。已經(jīng)描述了翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例(Turner，R.和 Foster, G. D.，Mol.Biotechnol.，3 :225_236(1995))。術(shù)語“3 ‘非編碼序列”、“轉(zhuǎn)錄終止子”和“終止序列”指位于編碼序列下游的DNA 序列。這包括多腺苷酸化識別序列和編碼能影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號的其他 序列。多腺苷酸化信號通常表征為影響多腺苷酸片添加到mRNA前體的3'末端。3'區(qū)可 影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯。"RNA轉(zhuǎn)錄物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄所產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物 與DNA序列拷貝完全互補(bǔ)時(shí)，它指初級轉(zhuǎn)錄物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是來源于初級轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄 后加工的RNA序列時(shí)，它指成熟的RNA?！靶攀筊NA”或“mRNA”指無內(nèi)含子并且可以由細(xì)胞 翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！癱DNA”指與mRNA模板互補(bǔ)并用反轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的DNA。 cDNA可以是單鏈，或使用DNA聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈?！坝辛x”RNA指包含mRNA 并且能在細(xì)胞內(nèi)或體外翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳xRNA”指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA 的全部或部分互補(bǔ)并且可阻斷靶基因的表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利5，107，065)。反義 RNA可以與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或編碼 序列互補(bǔ)。“功能性RNA”指反義RNA、核酶RNA或其他不能翻譯但是對細(xì)胞過程有影響作用 的RNA。術(shù)語“互補(bǔ)的”和“反向互補(bǔ)的”對mRNA轉(zhuǎn)錄來說可互換使用，并且用以定義信使 反義RNA。術(shù)語“可操作地連接”指單個(gè)核酸片段上的核酸序列的關(guān)聯(lián)，使得其中一個(gè)核酸序 列的功能受到另一個(gè)核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即，該編 碼序列受到該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)時(shí)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列 可能以有義或反義的取向可操作地連接至調(diào)控序列。術(shù)語“重組體”指(例如)通過化學(xué)合成或通過用基因工程技術(shù)操縱分離的核酸 片段而實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)原本分離的序列片段的人工組合。如本文所用，術(shù)語“表達(dá)”指源于本發(fā)明的核酸片段的有義RNA(mRNA)或反義RNA 的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達(dá)也可指mRNA翻譯成蛋白質(zhì)(其為前體蛋白或成熟蛋白)。“成熟”蛋白指經(jīng)翻譯后加工的多肽(即已經(jīng)去除了存在于初始翻譯產(chǎn)物中的任何 前肽或肽原的多肽)?！扒绑w”蛋白質(zhì)指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物(即前肽和肽原仍然存在)。 前肽和肽原可以是(但不限于)細(xì)胞內(nèi)定位信號。
術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”指通常攜帶有不屬于細(xì)胞中心代謝的部分的基因的染色體 外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA片段的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復(fù)制 序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其 中多個(gè)核苷酸序列已連接或重組為一種獨(dú)特構(gòu)建體，該獨(dú)特構(gòu)建體能夠?qū)⒈磉_(dá)盒引入細(xì)胞 中。
術(shù)語“表達(dá)盒”指包含如下序列的DNA片段所選基因的編碼序列和所選基因產(chǎn)物 表達(dá)所需的位于編碼序列之前(5‘非編碼序列)和之后(3'非編碼序列)的調(diào)控序列。因 此，表達(dá)盒通常由如下序列構(gòu)成(1)啟動(dòng)子序列；(2)編碼序列(即0RF)；和(3)3'非翻 譯區(qū)(即終止子)，在真核生物中其通常含有多腺苷酸化位點(diǎn)。表達(dá)盒通常包含于載體中以 有利于克隆和轉(zhuǎn)化?？梢詫⒉煌磉_(dá)盒轉(zhuǎn)化進(jìn)包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的 不同生物體中，只要能針對每種宿主使用正確的調(diào)控序列。“重組DNA構(gòu)建體”(在本文中也可互換地稱為“表達(dá)構(gòu)建體”和“構(gòu)建體”)包含 核酸片段(如在天然條件下不會一起存在的調(diào)控序列和編碼序列)的人工組合。因此，重 組DNA構(gòu)建體可以包含源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來源但以不同于 天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。此類構(gòu)建體可獨(dú)自使用或與載體組合使用。 如果使用載體，則載體的選擇取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的將要用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方 法。例如可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員十分了解必須存在于載體上以成功地轉(zhuǎn)化、選擇和 繁殖含本發(fā)明任何分離的核酸片段的宿主細(xì)胞的遺傳元件。技術(shù)人員還將認(rèn)識到，不同的 獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同水平和模式的表達(dá)(Jones等人，EMBO J. ,4 =2411-2418 (1985)； DeAlmeida等人，Mol. Gen. Genetics 218 :78_86 (1989))，因此，必須篩選多次事件以獲得 顯示期望表達(dá)水平和模式的品系。這樣的篩選可以通過DNA的Southern印跡分析、mRNA表 達(dá)的Northern印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析或表型分析等完成。術(shù)語“導(dǎo)入”指將核酸(例如表達(dá)盒)或蛋白質(zhì)提供至細(xì)胞中。導(dǎo)入包括指將核 酸整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組內(nèi)，并且包括指將 核酸或蛋白暫時(shí)提供給細(xì)胞。導(dǎo)入包括指穩(wěn)定的或瞬時(shí)的轉(zhuǎn)化方法以及有性雜交。因此， 將核酸片段(如重組DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒)插入細(xì)胞內(nèi)的情況下的“導(dǎo)入”意指“轉(zhuǎn)染”或 “轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括指將核酸片段整合進(jìn)真核或原核細(xì)胞中，在該細(xì)胞中核酸片段 可以整合進(jìn)細(xì)胞的基因組(如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)內(nèi)、轉(zhuǎn)變成自主的復(fù)制子或 瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mRNA)。如本文所用，“轉(zhuǎn)基因”指其基因組內(nèi)含有異源多核苷酸的細(xì)胞。優(yōu)選的是，異源多 核苷酸被穩(wěn)定地整合進(jìn)基因組中，使得該多核苷酸能傳遞至連續(xù)的世代。異源多核苷酸可 以單獨(dú)地或作為表達(dá)盒的部分整合進(jìn)基因組中。本文所用的轉(zhuǎn)基因包括因異源核酸存在而 已經(jīng)改變了基因型的任何細(xì)胞或細(xì)胞系，包括初始進(jìn)行此類改變的那些轉(zhuǎn)基因以及通過初 始的轉(zhuǎn)基因與不同配型交配而產(chǎn)生的那些。在此使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不涵蓋通過諸如隨 機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變之類的自然發(fā)生事 件導(dǎo)致的基因組(染色體基因組或染色體外基因組)改變。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如下文獻(xiàn)中 有更全面的描述Sambrook, J. ，F(xiàn)ritsch, E. F.禾口 Maniatis， Τ. ，Molecular Cloning :A Laboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NY(1989)；Silhavy, Τ. J.、Bennan, Μ. L.禾口 Enquist, L. W. , Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NY(1984)； 以 及 Ausubel, F. Μ.等 人，CurrentProtocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. andffiley-Interscience出版，Hoboken, NJ(1987)。轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并 且在下文中有所描述“綜述脂肪酸和三?；视偷奈⑸锷锖铣伞蓖ǔ?，含油微生物的脂質(zhì)蓄積是響應(yīng)存在于生長培養(yǎng)基中的總的碳氮比而觸發(fā)。 該過程(導(dǎo)致含油微生物中游離棕櫚酸(16:0)的從頭合成)在美國專利7，238，482中有 詳細(xì)描述。棕櫚酸是長鏈飽和和不飽和脂肪酸衍生物的前體，這些脂肪酸衍生物通過延伸 酶和去飽和酶的作用形成(圖1)。TAG(脂肪酸的主要貯存單位)通過涉及如下反應(yīng)的一系列反應(yīng)形成(1) 一分子 的?；o酶A和甘油-3-磷酸通過?；D(zhuǎn)移酶酯化而生成溶血磷脂酸；(2)第二分子的酰 基輔酶A通過?；D(zhuǎn)移酶酯化而生成1，2-二?；视土姿?通常稱為磷脂酸)；(3)通過 磷脂酸磷酸酶除去磷酸而生成1，2-二?；视?DAG)；以及(4)在?；D(zhuǎn)移酶的作用下加 入第三個(gè)脂肪酸以形成TAG。廣譜的脂肪酸可被整合進(jìn)TAG中，包括飽和和不飽和脂肪酸以 及短鏈和長鏈脂肪酸。ω脂肪酸的牛物合成其中油酸轉(zhuǎn)化成ω-3/ω-6脂肪酸的代謝過程涉及通過添加碳原子使碳鏈延長 和通過加入雙鍵使分子去飽和。這需要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的一系列特殊去飽和酶和延伸 酶。然而，如圖1中看到的和如下所述的，通常存在多個(gè)用于產(chǎn)生特定ω-3/ω-6脂肪酸的 替代途徑。具體地講，所有途徑均需要最初通過Δ 12去飽和酶將油酸轉(zhuǎn)化成LA (第一種ω-6 脂肪酸)。然后，利用“ Δ 9延伸酶/ Δ 8去飽和酶途徑”并將LA用作底物來如下形成長鏈 ω -6脂肪酸(1)通過Δ 9延伸酶將LA轉(zhuǎn)化成ETA ； (2)通過Δ 8去飽和酶將ETA轉(zhuǎn)化成 DGLA ；和(3)通過Δ 5去飽和酶將DGLA轉(zhuǎn)化成ARA ； (4)通過C2(1/22延伸酶將ARA轉(zhuǎn)化成 DTA ；以及(5)通過Δ 4去飽和酶將DTA轉(zhuǎn)化成DPAn_6。作為另外一種選擇，“ Δ 9延伸酶/ Δ 8去飽和酶途徑”可以將ALA用作底物來如下產(chǎn)生長鏈ω-3脂肪酸(1)通過Δ 15去飽 和酶將LA轉(zhuǎn)化成ALA (第一種ω -3脂肪酸)；(2)通過Δ 9延伸酶將ALA轉(zhuǎn)化成DGLA ； (3) 通過Δ 8去飽和酶將DGLA轉(zhuǎn)化成ETA ； (4)通過Δ 5去飽和酶將ETA轉(zhuǎn)化成EPA ； (5)通過 C20722延伸酶將EPA轉(zhuǎn)化成DPA ；和(6)通過Δ 4去飽和酶將DPA轉(zhuǎn)化成DHA。任選地，ω -6 脂肪酸可轉(zhuǎn)化成ω-3脂肪酸；例如，ALA可通過Δ 15去飽和酶活性由LA生成；ETA和EPA 可通過Δ 17去飽和酶活性分別由DGLA和ARA生成。用于ω-3/ω-6脂肪酸生物合成的替代途徑利用Δ 6去飽和酶和C18/2(1延伸酶(即 “ Δ 6去飽和酶/ Δ 6延伸酶途徑”)。更具體地講，LA和ALA可通過Δ 6去飽和酶分別轉(zhuǎn)化 成GLA和ETA ；然后，C18720延伸酶將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA和/或?qū)TA轉(zhuǎn)化成ETA。隨后如上 所述形成下游PUFA。預(yù)期需要導(dǎo)入特定宿主生物中用以產(chǎn)生ω-3/ω-6脂肪酸的特定功能將取決于宿主細(xì)胞(及其天然的PFUA概況和/或去飽和酶/延伸酶概況)、底物的可利用性和所需 終產(chǎn)物。例如，在一些實(shí)施方案中優(yōu)選的是Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑的表達(dá)，而不是 Δ 6去飽和酶/ Δ 6延伸酶途徑的表達(dá)，因?yàn)橥ㄟ^前面的途徑產(chǎn)生的PUFA無GLA和/或ETA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定多種編碼ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每種酶 的候選基因?？捎玫娜ワ柡兔负脱由烀感蛄锌稍醋匀魏蝸碓?，例如，分離自天然來源(來自 細(xì)菌、藻類、真菌、植物、動(dòng)物等)、經(jīng)由半合成途徑產(chǎn)生或從頭合成。盡管導(dǎo)入宿主的去飽和 酶和延伸酶基因的具體來源不是關(guān)鍵的，但選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的 考慮事項(xiàng)包括⑴多肽的底物特異性；⑵多肽或其組分是否為限速酶；⑶去飽和酶或 延伸酶是否是合成所需PUFA所必需的；(4)多肽所需的輔因子；和/或(5)多肽在其產(chǎn)生 后是否被修飾(例如，通過激酶或異戊烯轉(zhuǎn)移酶修飾)。表達(dá)的多肽優(yōu)選具有與它在宿主細(xì) 胞中的位置的生化環(huán)境相容的參數(shù)(對于另外的詳細(xì)內(nèi)容，參見美國專利7，238，482)。
在另外的實(shí)施方案中，考慮每種特定的去飽和酶和/或延伸酶的轉(zhuǎn)化效率也將是 有用的。更具體地講，由于每種酶極少能以100%的效率將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，宿主細(xì)胞所產(chǎn) 生的未純化的油的最終脂質(zhì)概況通常將是由期望的ω-3/ω-6脂肪酸及多種上游PUFA中 間產(chǎn)物組成的多種PUFA的混合物。因此，當(dāng)使所需脂肪酸的生物合成最優(yōu)化時(shí)，每種酶的 轉(zhuǎn)換效率也是要考慮的變量。考慮到上述各個(gè)考慮事項(xiàng)，具有合適去飽和酶和延伸酶活性(如Δ6去飽和酶、 C18720延伸酶、Δ 5去飽和酶、Δ 17去飽和酶、Δ 15去飽和酶、Δ 9去飽和酶、Δ 12去飽和酶、 C14716延伸酶、C16718延伸酶、Δ 9延伸酶、Δ 8去飽和酶、Δ 4去飽和酶和C2(1/22延伸酶)的候 選基因可根據(jù)可公開獲得的文獻(xiàn)(如GenBank)、專利文獻(xiàn)和對具有產(chǎn)生PUFA的能力的生物 的實(shí)驗(yàn)分析來鑒定。這些基因?qū)⑦m用于導(dǎo)入到特定的宿主生物中，以使該生物能合成PUFA 或增強(qiáng)生物的PUFA合成。新的△ 9延伸酶的序列鑒定在本發(fā)明中，已經(jīng)從Euglena anabaena中分離出編碼Δ9延伸酶的核苷酸序列， 匯總于下面的表3中。 * 注意=SEQ ID NO 27 與 SEQ ID NO 13 的序列相同。因此，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含(a)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法 在與SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該多肽具有至少 80%的氨基酸同一性；(b)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法在 與SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 26中示出的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該核苷酸序列具有至少80%的序列同一性；或 (c) (a)、(b)或的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中該互補(bǔ)序列與該核苷酸序列由相同 數(shù)目的核苷酸組成并且100 %互補(bǔ)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，該多核苷酸包含編碼具有Δ9延伸 酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法在與SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 12 或SEQ ID NO :26中示出的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，該核苷酸序列具有至少90%的序列同一性。具有至少約80% -90同一性百分比(％ )的更優(yōu)選的氨基酸片段是特別合適的， 并且具有至少約90%-95同一性百分比(％)的那些序列是最優(yōu)選的。類似地，對應(yīng)本發(fā) 明ORF的編碼Δ9延伸酶的優(yōu)選核酸序列是編碼活性蛋白的那些序列并且其具有至少約 80% -90%的同一性；具有至少約90% -95同一性百分比(％ )的那些序列是最優(yōu)選的。在備選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的EaD9Elol和/或EaD9Elo2序列可以經(jīng)密碼子最 優(yōu)化以便在特定的宿主生物中表達(dá)。如本領(lǐng)域所熟知的，這可以成為進(jìn)一步優(yōu)化酶在候選 宿主中的表達(dá)的有用手段，因?yàn)槭褂盟拗鲀?yōu)選的密碼子可以顯著提高編碼該多肽的外源基 因的表達(dá)。通常，宿主優(yōu)選的密碼子可在所關(guān)注的具體宿主物種中通過檢查蛋白質(zhì)(優(yōu)選 那些最大量表達(dá)的蛋白質(zhì))中的密碼子使用以及確定哪些密碼子的使用頻率最高來測定。 然后，可利用宿主物種中優(yōu)選的密碼子整個(gè)或部分地合成具有(例如)延伸酶活性的所關(guān) 注的多肽的編碼序列。也可以合成DNA的全部(或部分)以去除將存在于轉(zhuǎn)錄的mRNA中 的二級結(jié)構(gòu)的任何去穩(wěn)定序列或區(qū)域。也可以合成DNA的全部(或部分)以將堿基組成改 變成期望宿主細(xì)胞中更優(yōu)選的堿基組成。在本文中的本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，EaD9Elol(SEQ ID N0:11)經(jīng)密碼子最優(yōu) 化以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)?；谙惹皩庵辖湍该艽a子使用概況的確定、對那 些優(yōu)選的密碼子的鑒定以及對‘ATG’起始密碼子周圍的共有序列的確定(參見美國專利 7，238，482和美國專利7，125，672)，這是可能的。所得的合成基因稱為EaD9ES (SEQ ID NO 26)。由經(jīng)密碼子最優(yōu)化的Δ 9延伸酶基因編碼的蛋白質(zhì)序列(即SEQ IDNO 27)與野生型 蛋白質(zhì)序列(即SEQ ID NO 13)相同。可以利用類似的技術(shù)來產(chǎn)生源自EaD9Elo2 (SEQ ID NO 12)的合成的Δ9延伸酶，以用于在解脂耶氏酵母中表達(dá)?；谝吧虴aD9Elol和/或EaD9Elo2序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠利用本 文中的教導(dǎo)內(nèi)容來產(chǎn)生多種適用于在候選宿主中最佳表達(dá)的其他經(jīng)密碼子最優(yōu)化的Δ9 延伸酶蛋白。因此，本發(fā)明涉及任何經(jīng)密碼子最優(yōu)化的Δ9延伸酶蛋白，該延伸酶蛋白來源 于野生型核苷酸序列EaD9Elol(SEQ ID NO 11)或EaD9Elo2 (SEQ ID N0:12)。這包括但不 限于SEQ ID NO :26中示出的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼經(jīng)密碼子最優(yōu)化以便在解脂耶 氏酵母中表達(dá)的合成的Δ9延伸酶蛋白(即EaD9eS)。在備選的實(shí)施方案中，期望修飾編 碼EaD9Elol和/或EaD9Elo2的密碼子的部分，以增強(qiáng)基因在宿主生物(包括但不限于植 物或植物部分、藻類、細(xì)菌、侯選的酵母、類眼蟲、原生藻菌或真菌)中的表達(dá)。同源物的鑒定和分離任何本發(fā)明的延伸酶序列(即EaD9Elol、EaD9Elo2或EaD9eS)或其部分均可用于 利用序列分析軟件來搜索相同或其他細(xì)菌、藻類、真菌、類眼蟲或植物物種中的Δ9延伸酶 同源物。通常，這種計(jì)算機(jī)軟件通過將同源程度賦予多種置換、缺失和其他修飾來匹配相似的序列。 作為另外一種選擇，也可將任何本發(fā)明的延伸酶序列或其部分用作雜交試劑用以 鑒定Δ9延伸酶同源物。核酸雜交試驗(yàn)的基本組成包括探針、懷疑含有所關(guān)注的基因或基 因片段的樣品及特定的雜交方法。本發(fā)明的探針通常是與待檢測核酸序列互補(bǔ)的單鏈核酸 序列。探針與待檢測的核酸序列是“可雜交的”。盡管探針的長度可在5個(gè)堿基到數(shù)萬個(gè)堿 基之間變化，但通常約15個(gè)堿基到約30個(gè)堿基的探針長度是合適的。只需要探針分子的 部分與待檢測的核酸序列互補(bǔ)。另外，探針和靶序列之間不需要完全互補(bǔ)。雜交確實(shí)可以 在并不完全互補(bǔ)的分子之間發(fā)生，結(jié)果是雜交區(qū)內(nèi)的一定比率的堿基未與正確的互補(bǔ)堿基 配對。雜交方法是非常確實(shí)的。通常探針和樣品必須在允許核酸雜交的條件下混合。這 涉及在正確濃度和溫度條件下在存在無機(jī)或有機(jī)鹽時(shí)使探針和樣品接觸。探針和樣品核酸 必須接觸足夠長的時(shí)間，使探針和樣品核酸之間的任何可能的雜交均可發(fā)生?；旌衔镏械?探針或標(biāo)記的濃度將決定雜交發(fā)生所需的時(shí)間。探針或靶標(biāo)的濃度越高，所需的雜交孵育 時(shí)間就越短。任選地，可以加入離液劑(如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸鈉、四氯乙酸鋰、高氯 酸鈉、四氯乙酸銣、碘化鉀和三氟乙酸銫)。如果需要，可以將甲酰胺加入到雜交混合物中， 通常為 30-50% (ν/ν)。可以采用多種雜交溶液。通常，這些雜交溶液包含約20%至60%體積，優(yōu)選30% 體積的極性有機(jī)溶劑。普通的雜交溶液采用約30-50% ν/ν甲酰胺、約0. 15至IM氯化鈉、 約0. 05至0. IM緩沖液(如檸檬酸鈉、Tris-HC1、PIPES或HEPES (pH范圍約6-9))、約0. 05 至0. 2%去污劑(如十二烷基硫酸鈉)或0. 5-20mM的EDTA、FICOLL (Pharmacia Inc.)(約 300-500千道爾頓)、聚乙烯吡咯烷酮(約250-500千道爾頓)和血清白蛋白。一般的雜交 溶液還將包含約0. 1至5mg/mL未經(jīng)標(biāo)記的載體核酸、片段化的核酸DNA(如小牛胸腺或鮭 精DNA或酵母RNA)，以及任選約0. 5%至2%重量/體積的甘氨酸。還可以包含其他添加 齊U，例如包括多種極性水溶性或可膨脹試劑(如聚乙二醇)、陰離子聚合物(如聚丙烯酸酯 或聚甲基丙烯酸酯)和陰離子糖類聚合物(如硫酸葡聚糖)在內(nèi)的體積排阻劑。核酸雜交可適用于多種測定形式。最合適的形式之一是夾心測定形式。夾心測定 尤其適用于在非變性條件下雜交。夾心型測定的主要成分是固體支持體。固體支持體具有 吸附或共價(jià)連接至其上的固定核酸探針，該探針未經(jīng)標(biāo)記并且與序列的一部分互補(bǔ)。在另外的實(shí)施方案中，本文描述的任何Δ9延伸酶核酸片段(或其經(jīng)鑒定的任何 同源物)均可用于從相同的或其他細(xì)菌、藻類、真菌、類眼蟲或植物物種中分離編碼同源蛋 白質(zhì)的基因。使用序列依賴性規(guī)程分離同源基因是本領(lǐng)域熟知的。序列依賴性規(guī)程的實(shí)例 包括但不限于(1)核酸雜交方法；(2) DNA和RNA擴(kuò)增方法，這可通過核酸擴(kuò)增技術(shù)的多種 用法來舉例說明[如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，Mullis等人，美國專利4，683，202 ；連接酶鏈反 應(yīng)(LCR)，Tabor, S.等人，Proc. Acad. Sci. U. S. Α. ,82 1074 (1985)；或鏈置換擴(kuò)增(SDA)， Walker 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，89 392 (1992)]；以及(3)文庫構(gòu)建和互補(bǔ)篩選 方法。例如，編碼與本文描述的Δ9延伸酶相似的蛋白質(zhì)或多肽的基因可以用本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的方法，通過將本發(fā)明的核酸片段的全部或部分用作DNA雜交探針來篩選來自 (例如)任何期望的酵母或真菌(其中那些產(chǎn)生EDA和/或ETrA的生物將是優(yōu)選的)的文庫而得以直接分離?；诒景l(fā)明核酸序列的特異性寡核苷酸探針可通過本領(lǐng)域已知的方法(Maniatis，同上)設(shè)計(jì)和合成。而且，整個(gè)序列可直接用于通過熟練技術(shù)人員已知的方法 (如隨機(jī)引物DNA標(biāo)記、切口平移或末端標(biāo)記技術(shù))合成DNA探針，或使用可獲得的體外轉(zhuǎn) 錄體系合成RNA探針。另外，可設(shè)計(jì)特異性引物并將其用于擴(kuò)增部分(或全長)的本發(fā)明 序列。所得的擴(kuò)增產(chǎn)物可在擴(kuò)增反應(yīng)過程中直接標(biāo)記或在擴(kuò)增反應(yīng)后標(biāo)記，并用作探針來 在合適的嚴(yán)格條件下分離全長的DNA片段。通常，在PCR類型的擴(kuò)增技術(shù)中，引物具有不同的序列而且彼此之間不互補(bǔ)。取 決于所需的檢測條件，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)引物序列以提供既有效又可靠的靶核酸的復(fù)制。PCR引 物設(shè)計(jì)方法是本領(lǐng)域常見且熟知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotide as specific hybridization probes inthe Diagnosis of Genetic Disorders", Human Genetic Diseases :A PracticalApproach, K. E. Davis 編輯，(1986)第 33-50 頁，IRL Herndon，VA ；以及 Rychlik，W. ,Methods in Molecular Biology, White, B. A.編輯，(1993) 第 15 卷，第 31-39 頁，PCR Protocols Current Methods and Applications. Humania Totowa, NJ)0通常，可以將本發(fā)明序列的兩個(gè)短片段在PCR規(guī)程中用于從DNA或RNA擴(kuò)增編碼 同源基因的更長的核酸片段。PCR也可以用克隆的核酸片段的文庫進(jìn)行，其中一個(gè)引物的序 列源自本發(fā)明的核酸片段，而另一個(gè)引物的序列利用編碼真核基因的mRNA前體3'端的多 腺苷酸尾的存在。備選地，第二個(gè)引物序列可以基于來源于克隆載體的序列。例如，技術(shù)人員可以按 照 RACE 規(guī)程(Frohman 等人，Proc. Acad. Sci. U. S. Α.，85 8998 (1988))，通過用 PCR 擴(kuò)增在 轉(zhuǎn)錄物內(nèi)單個(gè)位點(diǎn)與3'或5'端之間的區(qū)域的拷貝來產(chǎn)生cDNA。以3'和5'方向取向的 引物可用本發(fā)明的序列設(shè)計(jì)。使用可商業(yè)獲得的3' RACE或5' RACE體系(Gibco/BRL， Gaithersburg, MD)可以分離特異性的 3'或 5' cDNA 片段(Ohara 等人，Proc. Acad. Sci. U. S. Α.，86 5673 (1989) ；Loh 等人，Science, 243 217 (1989))。在其他實(shí)施方案中，任何本文所述的Δ9延伸酶核酸片段(或其經(jīng)鑒定的任何同 源物)均可用于產(chǎn)生新的和/或改良的脂肪酸延伸酶。如本領(lǐng)域所熟知的，體外誘變和選 擇、化學(xué)誘變、“基因改組(gene shuffling) ”法或其他手段可用于獲得天然存在的延伸酶 基因的突變(其中這種突變可以包括缺失、插入和點(diǎn)突變或它們的組合)。這將使得能分 別在體內(nèi)產(chǎn)生具有延伸酶活性的多肽，該多肽在宿主細(xì)胞內(nèi)具有更佳的物理參數(shù)和動(dòng)力參 數(shù)，例如更長的半衰期或更高的所需PUFA的產(chǎn)生速率?；蛘撸绻枰?，可以通過常規(guī)誘 變、所得突變多肽的表達(dá)及其活性的測定來確定所關(guān)注的多肽(即Δ9延伸酶)對酶活性 重要的區(qū)域。這些技術(shù)的綜述在美國專利7，238，482中有描述。源自EaD9El0l、EaD9El02 和EaD9eS的所有這類突變蛋白和編碼它們的核苷酸序列均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。備選地，改良的脂肪酸可以通過結(jié)構(gòu)域交換合成，在該方法中將來自本文所述的 任何△ 9延伸酶核酸片段的功能結(jié)構(gòu)域與備選的延伸酶基因的功能結(jié)構(gòu)域交換，從而產(chǎn)生 新的蛋白質(zhì)。如本文所用，“結(jié)構(gòu)域”或“功能結(jié)構(gòu)域”指能夠引起微生物中的生物學(xué)應(yīng)答的 核酸序列。用于產(chǎn)牛多種ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法預(yù)計(jì)引入編碼本文所述的Δ 9延伸酶(即EaD9Elol、EaD9Elo2、EaD9eS或其他突變酶、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的酶或它們的同源物)的嵌合基因，處于合適的啟動(dòng)子控制下，將會 分別導(dǎo)致EDA和/或ETrA在轉(zhuǎn)化的宿主生物中的產(chǎn)生增加。就這一點(diǎn)而論，本發(fā)明涵蓋了 用于直接產(chǎn)生PUFA的方法，該方法包括將脂肪酸底物(即LA和/或ALA)暴露給本文所 述的延伸酶(例如，EaD9EloUEaD9Elo2或EaD9eS)，使得底物被轉(zhuǎn)化成所需的脂肪酸產(chǎn)物 (即分別為EDA和/或ETrA)。更具體地講，本發(fā)明的目的是提供用于在微生物宿主細(xì)胞(如酵母、藻類、細(xì)菌、 類眼蟲、原生藻菌和真菌)中產(chǎn)生EDA的方法，其中微生物宿主細(xì)胞包含(a)編碼A 9延伸酶多肽的重組核苷酸分子，基于Clustal V比對方法在與具有 SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列的多肽進(jìn)行比較時(shí)，該延伸酶多肽具 有至少80%的氨基酸同一性；和(b)LA 源；其中使微生物宿主細(xì)胞在使編碼A 9延伸酶的核酸片段表達(dá)并使LA轉(zhuǎn)化成EDA 的條件下生長，并且其中可任選回收EDA。在本發(fā)明的備選實(shí)施方案中，A 9延伸酶可用于將ALA轉(zhuǎn)化成ETrA。因此，本發(fā)明 提供了用于產(chǎn)生ETrA的方法，其中微生物宿主細(xì)胞包含(a)編碼A 9延伸酶多肽的重組核苷酸分子，基于Clustal V比對方法在與具有 SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列的多肽進(jìn)行比較時(shí)，該延伸酶多肽具 有至少80%的氨基酸同一性；和(b) ALA 源；其中使微生物宿主細(xì)胞在使編碼A 9延伸酶的核酸片段表達(dá)并使ALA轉(zhuǎn)化成ETrA 的條件下生長，而且其中可任選回收ETrA。作為另外一種選擇，本文描述的每種△ 9延伸酶基因及其相應(yīng)的酶產(chǎn)物可間接用 于產(chǎn)生多種和《_3PUFA(參見圖1和美國專利7，238，482)。如果脂肪酸底物經(jīng)由中 間步驟或途徑中間產(chǎn)物間接轉(zhuǎn)化成所需的脂肪酸產(chǎn)物，則間接產(chǎn)生了《-3/ -6PUFA。因 此，預(yù)期可以將本文描述的A9延伸酶(即EaD9Elol、EaD9Elo2、EaD9eS或其他突變酶、經(jīng) 密碼子最優(yōu)化的酶或它們的同源物)與另外的編碼PUFA生物合成途徑的酶(如A6去飽 和酶、C18/2(1延伸酶、A 17去飽和酶、A 8去飽和酶、A 15去飽和酶、A 9去飽和酶、A 12去飽 和酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、A 9延伸酶、A 5去飽和酶、A 4去飽和酶、C20/22延伸酶) 的基因結(jié)合表達(dá)以導(dǎo)致更高水平地產(chǎn)生長鏈W-3/OJ-6脂肪酸(如ARA、EPA、DTA、DPAn-6、 DPA 禾口 / 或 DHA)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的A9延伸酶將與A8去飽和酶(例如，來自 小眼蟲的去飽和酶[Wallis 等人，Arch. Biochem. and Biophys.，365 (2) 307-316 (May 1999) ；PCT 公開 TO 2000/34439 ；美國專利 6, 825, 017 ；PCT 公開 W0 2004/057001 ； PCT公開W0 2006/012325 ；美國專利7，256，033 ；美國專利申請11/635258]；來自卡
^ (Acanthamoeba castellanii)的 it包禾口 _ [Sayanova ^ A, FEBS Lett., 580 1946-1952 (2006)]；來自鹽生巴夫藻(Pavlova salina)的去飽和酶[PCT 公 開W 2005/103253]；來自路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)的去飽和酶[PCT公開W0 2007/127381]；來自 Tetruetreptia pomquetensisCCMP1491 的去飽和酶[美國專利申請 11/876115]；來自Eutr印tiellasp. CCMP389的去飽和酶[美國專利申請11/876115]；來自Eutreptiellacf_gymnastica CCMP1594的去飽和酶[美國專利申請11/876115 ；以及來自 Euglena anabaena的去飽和酶[在共同未決的美國專利申請12/099799和12/099811中 有描述])最低程度地一起表達(dá)。然而，包含于具體表達(dá)盒中的具體基因?qū)⑷Q于宿主細(xì)胞 (及其PUFA概況和/或去飽和酶/延伸酶概況)、底物的可利用性和所需的終產(chǎn)物。在備選的實(shí)施方案中，基于本文所述的完整序列、那些完整序列的互補(bǔ)序列、那些 序列的基本部分、源于它們的經(jīng)密碼子最優(yōu)化的延伸酶以及與它們基本同源的那些序列， 破壞宿主生物的天然A9延伸酶可能是有用的?！鑫锉硖?、表汰念纖體本文描述的A 9延伸酶基因和基因產(chǎn)物(即EaD9Elol、EaD9Elo2、EaD9eS或其他 突變酶、經(jīng)密碼子最優(yōu)化的酶或其同源物)可以在異源微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)，特別是在 含油酵母(如解脂耶氏酵母)的細(xì)胞中表達(dá)。含有引導(dǎo)外來蛋白質(zhì)高水平表達(dá)的調(diào)控序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。這些表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體的任一種均可用于構(gòu)建用于產(chǎn)生本發(fā)明序 列的任何基因產(chǎn)物的嵌合基因。然后可以將這些嵌合基因通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入合適的微生物中以 提供所編碼的酶的高水平表達(dá)?？捎糜谵D(zhuǎn)化合適的微生物宿主細(xì)胞的載體(如構(gòu)建體、質(zhì)粒)和DNA表達(dá)盒是本 領(lǐng)域熟知的。存在于構(gòu)建體中的序列的具體選擇取決于所需的表達(dá)產(chǎn)物(同上)、宿主細(xì)胞 的性質(zhì)以及提出的相對于未轉(zhuǎn)化細(xì)胞分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞的手段。然而，通常載體含有至少一個(gè) 表達(dá)盒、選擇標(biāo)記和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的表達(dá)盒包含基因控制轉(zhuǎn)錄 的5'區(qū)(如啟動(dòng)子)、基因編碼序列和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3'區(qū)(如終止子)。最 優(yōu)選的是，這兩個(gè)控制區(qū)均來源于來自轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞的基因，但應(yīng)當(dāng)了解這種控 制區(qū)不必源自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因?？捎糜隍?qū)動(dòng)本發(fā)明的A 9延伸酶0RF在期望的微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制 區(qū)(也稱為起始控制區(qū)或啟動(dòng)子)有許多并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。事實(shí)上，能夠 引導(dǎo)這些基因在所選宿主細(xì)胞中表達(dá)的任何啟動(dòng)子(即天然的、合成的或嵌合的啟動(dòng)子) 均適用于本發(fā)明，但來自宿主物種的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)是尤其有用的。在微生物宿主細(xì)胞中的 表達(dá)可以誘導(dǎo)型或組成型的方式來實(shí)現(xiàn)。誘導(dǎo)型表達(dá)可通過誘導(dǎo)可操作地連接至所關(guān)注的 基因的可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性來完成，而組成型表達(dá)可通過利用可操作地連接至所關(guān)注的基 因的組成型啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞為酵母時(shí)，則提供在酵母細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄 和翻譯區(qū)，尤其是來自宿主物種的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)(例如，對于在解脂耶氏酵母中使用的優(yōu) 選的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)，參見專利公開US-2006-0115881-A1)?？梢允褂迷S多調(diào)控序列的任意 一種，這取決于是期望組成型轉(zhuǎn)錄還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄、啟動(dòng)子在表達(dá)所關(guān)注的0RF中的效率、 構(gòu)建的容易性等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)圍繞翻譯起始密碼子‘ATG’的核苷酸序列影響酵母細(xì)胞的表達(dá)。如果所 需多肽在酵母中表達(dá)差，則可以修飾外源基因的核苷酸序列以包括有效的酵母翻譯起始序 列來獲得最佳的基因表達(dá)。對酵母中的表達(dá)而言，這可以通過使無效表達(dá)基因框內(nèi)融合至 內(nèi)源酵母基因(優(yōu)選高度表達(dá)的基因)而使其定點(diǎn)誘變來完成。作為另外一種選擇，可以 測定宿主中的共有翻譯起始序列并將該序列引入異源基因中，以便它們在所關(guān)注宿主中最 優(yōu)化表達(dá)。
終止區(qū)可源于起始區(qū)從其獲得的基因的3'區(qū)或源于不同的基因。大量的終止區(qū) 是已知的并且(在用于與它們源自的屬和物種相同和不同的屬和物種兩者時(shí))在多種宿 主中發(fā)揮的功能令人滿意。終止區(qū)的選擇通常更多是為了方便而不是因?yàn)槿魏翁厥獾男?質(zhì)。終止控制區(qū)也可以源于優(yōu)選宿主的天然的多種基因。在備選的實(shí)施方案中，3'-區(qū)也 可以是合成的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可利用可用的信息來設(shè)計(jì)和合成用作轉(zhuǎn)錄終止子的 3'-區(qū)序列。任選地，終止位點(diǎn)可以是非必需的；然而，如果包括則是最優(yōu)選的。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所意識到的，僅僅將基因插入到克隆載體中不能保證它將被 成功地以所需要的水平表達(dá)。根據(jù)對高表達(dá)率的需要，通過操作許多控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白 質(zhì)穩(wěn)定性、氧限制和從微生物宿主細(xì)胞分泌方面的不同遺傳元件，已經(jīng)建立了許多專用的 表達(dá)載體。更具體地講，已經(jīng)被操作以控制基因表達(dá)的一些分子特征包括相關(guān)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng) 子和終止子序列的性質(zhì)；所克隆基因的拷貝數(shù)目(其中可以在單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體中克隆另外 的拷貝和/或?qū)⒘硗獾目截愅ㄟ^增加質(zhì)?？截悢?shù)或通過將克隆基因多次整合進(jìn)基因組中 來引入宿主細(xì)胞中)；基因是質(zhì)粒攜帶的還是整合進(jìn)了宿主細(xì)胞的基因組中；所合成的外 來蛋白質(zhì)的最終細(xì)胞定位；蛋白質(zhì)在宿主生物內(nèi)的翻譯和正確折疊的效率；所克隆基因的 mRNA和蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)的固有穩(wěn)定性；以及所克隆基因中的密碼子使用，使得其頻率 與宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率接近。這些類型的修飾的每一種均涵蓋在本發(fā)明中，作 為進(jìn)一步優(yōu)化本文所述的△ 9延伸酶的表達(dá)的手段。微牛物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化一旦已經(jīng)獲得適用于在合適的微生物宿主細(xì)胞中表達(dá)的DNA盒(例如包含啟動(dòng) 子、0RF和終止子的嵌合基因)，則將其置于能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體中，或 將其直接整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中。表達(dá)盒的整合可以在宿主基因組中隨機(jī)地發(fā)生或者 可以通過使用這樣的構(gòu)建體來靶向，即該構(gòu)建體含有足以靶向宿主基因座中的重組的與宿 主基因組同源的區(qū)。如果構(gòu)建體靶向內(nèi)源性基因座，則轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控區(qū)的全部或某些可 以由內(nèi)源性基因座提供。如果兩個(gè)或更多個(gè)基因從獨(dú)立的復(fù)制載體表達(dá)，則希望每個(gè)載體具有不同的選擇 手段并且應(yīng)當(dāng)缺乏與其他構(gòu)建體的同源性以便維持穩(wěn)定表達(dá)和防止元件在構(gòu)建體之間重 配(reassortment)?？捎脤?shí)驗(yàn)方法確定對調(diào)控區(qū)、選擇手段和所引入的構(gòu)建體的增殖方法 的正確選擇，以便所有導(dǎo)入的基因均以需要的水平表達(dá)從而提供所需產(chǎn)品的合成。包含所關(guān)注的基因的構(gòu)建體可以通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞中。這些 技術(shù)包括轉(zhuǎn)化(如醋酸鋰轉(zhuǎn)化[Methods in Enzymology，194 186-187 (1991)])、原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊(bolistic impact)、電穿孔、顯微注射或?qū)⑺P(guān)注的基因引入宿主細(xì)胞 中的任何其他方法。為方便起見，已通過任何方法操縱來吸收DNA序列(如表達(dá)盒)的宿主細(xì)胞在本 文中將稱為“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)化體”或“重組體”。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)化體”在本文中 可互換使用。轉(zhuǎn)化的宿主將具有至少一個(gè)拷貝的表達(dá)構(gòu)建體，而且可以具有兩個(gè)或更多個(gè) 拷貝，這取決于該表達(dá)盒是整合進(jìn)基因組內(nèi)還是存在于具有多拷貝數(shù)的染色體外元件上。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以通過多種選擇技術(shù)來鑒定，如美國專利7，238，482、美國專利 7，259，255 和 PCT 公開 W 2006/052870 中所述。轉(zhuǎn)化后，適用于本發(fā)明的A9延伸酶(以及任選在宿主細(xì)胞中共表達(dá)的其他PUFA酶)的底物可以由宿主自然產(chǎn)生或通過轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生，或者它們可以由外部來源提供。用于重組表汰的優(yōu)詵的微牛物宿主用于表達(dá)本發(fā)明基因和核酸片段的微生物宿主細(xì)胞可以包括在多種原料(包括 簡單或復(fù)雜的碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、油、甘油和醇，和/或碳?xì)浠衔?上于寬的溫 度和pH值范圍內(nèi)生長的宿主。基于申請人的受讓人的需要，本發(fā)明描述的基因已經(jīng)在含油 酵母(并且特別是解脂耶氏酵母)中表達(dá)；然而預(yù)期的是，由于轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)生物合 成結(jié)構(gòu)是高度保守的，因此任何細(xì)菌、酵母、藻類、類眼蟲、原生藻菌和/或真菌均將是用于 表達(dá)本發(fā)明的核酸片段的合適微生物宿主。然而，優(yōu)選的微生物宿主是含油生物，例如含油酵母。這些生物天然能夠合成并積 聚油，其中油可構(gòu)成超過約25%的細(xì)胞干重，更優(yōu)選超過約30%的細(xì)胞干重，而最優(yōu)選超 過約40%的細(xì)胞干重。通常鑒定為含油酵母的屬包括但不限于耶氏酵母屬、假絲酵母屬、 紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，示例性的 油合成酵母包括圓紅冬孢酵母、斯達(dá)氏油脂酵母、產(chǎn)油油脂酵母、拉可夫氏假絲酵母、鐵紅 假絲酵母、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、茁芽絲孢酵母、皮狀絲孢酵母、膠粘紅酵母、牧草 紅酵母和解脂耶氏酵母(以前歸類為解脂假絲酵母(Candida lipolytic^)。在備選的實(shí) 施方案中，可以通過基因工程進(jìn)行油的生物合成，使得微生物宿主細(xì)胞(如酵母)產(chǎn)生多于 25%細(xì)胞干重的油，從而被認(rèn)為是含油的。最優(yōu)選的是含油酵母解脂耶氏酵母；并且，在又一個(gè)實(shí)施方案中，最優(yōu)選的是命名 為 ATCC #20362、ATCC #8862、ATCC #18944、ATCC#76982 和 / 或 LGAM S(7) 1 的解脂耶氏酵 母菌株(Papanikolaou S.和 Aggelis G. , Bioresour. Technol.，82(1) :43_9 (2002))。歷史上，已經(jīng)使用多種解脂耶氏酵母菌株用于加工和生產(chǎn)異檸檬酸裂解酶；脂 肪酶；聚羥基鏈烷酸酯；梓檬酸；赤蘚醇；2-酮戊二酸；癸內(nèi)酉旨；十二內(nèi)酯；以及丙 酮酸?？捎糜谵D(zhuǎn)化含油酵母(即解脂耶氏酵母)的具體教導(dǎo)內(nèi)容包括美國專利4，880，741 和美國專利 5，071，764，以及 Chen, D. C.等人(Appl. Microbiol. Biotechnol.，48 (2) 232-235(1997))。可用于在解脂耶氏酵母中工程化生產(chǎn)ARA、EPA和DHA的具體教導(dǎo)內(nèi)容 分別在美國專利申請11/264784、美國專利申請11/265761和美國專利申請11/264737中 提供。在這種酵母中表達(dá)基因的優(yōu)選方法是將線性DNA整合到宿主的基因組中；而且，當(dāng) 期望基因高水平表達(dá)時(shí)，則整合到基因組中的多個(gè)位置是尤其有用的[如在Ura3基因座 (基因庫編號AJ306421)、Leu2基因座(基因庫編號AF260230)、Lys5基因座(基因庫編號 M34929)、Aco2基因座(基因庫編號AJ001300)、Pox3基因座(Pox3 基因庫編號XP_503244 ； 或Aco3 基因庫編號AJ001301)、A 12去飽和酶基因座(美國專利7，214，491)、Lipl基因 座(基因庫編號Z50020)、Lip2基因座(基因庫編號AJ012632)、SCP2基因座(基因庫編號 AJ431362)和/或PexlO基因座(基因庫編號CAG81606)]。用于解脂耶氏酵母的優(yōu)選選擇方法是對卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418抗性 以及在缺乏尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸或組氨酸的培養(yǎng)基上生長的能力。在備選的實(shí) 施方案中，5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-F0A”)可用于選擇酵母Ura—突 變體。該化合物對具有編碼乳清苷5' _單磷酸脫羧酶(0MP脫羧酶)的功能性URA3基 因的酵母細(xì)胞有毒性；因此，基于這種毒性，5-F0A特別可用于選擇和鑒定Ura_突變型酵 母菌株(Bartel, P. L.禾口 Fields, S. , Yeast 2-Hybrid System, Oxford University :NewYork, v. 7，第109-147頁，1997 ；對于5-F0A在耶氏酵母中的使用，還可參見PCT公開W0 2006/052870)。用于耶氏酵母的備選的優(yōu)選選擇方法依賴于用于解脂耶氏酵母的基于磺酰脲 (氯嘧磺??；E. I. duPont de Nemours & Co.，Inc.，Wilmington, DE)抗性的顯性非抗生 素標(biāo)記。更具體地講，該標(biāo)記基因是具有單個(gè)氨基酸改變(W497L)的天然乙酰羥酸合 酶(AHAS或乙酰乳酸合酶；E. C. 4. 1. 3. 18)，從而賦予了磺酰脲除草劑抗性(PCT公布TO 2006/052870)。AHAS是用于生物合成支鏈氨基酸(即纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)的途徑中 的第一常用酶，并且它是磺酰脲和咪唑啉酮除草劑的靶標(biāo)。其他優(yōu)選的微生物宿主包括含油的細(xì)菌、藻類、類眼蟲、原生藻菌和其他真菌；并 且，在這一廣泛的微生物宿主群組中，特別關(guān)注的是合成《-3/ -6脂肪酸的微生物(或 可以為該目的進(jìn)行基因工程改造的那些微生物[例如，諸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)之類的其他酵母])。因此，例如，用處于誘導(dǎo)型或調(diào)節(jié)型啟動(dòng)子控制下 的任何本發(fā)明的A9延伸酶基因轉(zhuǎn)化高山被孢霉(Mortierella alpina)(其在商業(yè) 上用于生產(chǎn)ARA)可以產(chǎn)生能夠合成增加量的EDA的轉(zhuǎn)化生物；EDA可以轉(zhuǎn)化成增加 量的DGLA，如果A 8去飽和酶基因被共表達(dá)的話。Mackenzie等人(Appl. Environ. Microbiol. ,66 =4655(2000))描述了轉(zhuǎn)化高山被孢霉的方法。類似地，用于轉(zhuǎn)化破囊 壺菌目(Thraustochytriales)微生物(例如破囊壺菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌 (Schizochytrium))的方法在 U. S. 7，001，772 中公開。不論選擇哪種宿主用于表達(dá)本文描述的A9延伸酶，均需要篩選多個(gè)轉(zhuǎn)化體 以獲得顯示期望表達(dá)水平和模式的菌株。這種篩選可以通過DNA印跡的Southern分 析(Southern, J. Mol. Biol.，98 :503(1975))、mRNA 表達(dá)的 Northern 分析(Kroczek， J. Chromatogr. Biomed. Appl.，618 (1-2) 133-145 (1993))、蛋白質(zhì)表達(dá)的 Western 和 / 或 Elisa分析、PUFA產(chǎn)物的表型分析或GC分析來完成?；谏鲜鼋虒?dǎo)內(nèi)容，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明描寫了分別產(chǎn)生EDA或ETrA的方 法，該方法包括(a)提供含油酵母(例如解脂耶氏酵母)，其包含(i)編碼A 9延伸酶多肽的第一重組核苷酸分子，該核苷酸分子可操作地連接至 至少一個(gè)調(diào)控序列；和(ii)分別由LA和/或ALA組成的延伸酶底物源；和(b)在存在合適的可發(fā)酵碳源的情況下使步驟(a)的酵母生長，其中編碼A9延伸 酶多肽的基因得以表達(dá)而且分別將LA轉(zhuǎn)化成EDA和/或?qū)LA轉(zhuǎn)化成ETrA ；以及，(c)任選地分別回收步驟(b)中的EDA和/或ETrA?？赡苄枰┙o底物。編碼A9延伸酶的基因的核苷酸序列可以選自SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12。 在備選的實(shí)施方案中，編碼A 9延伸酶多肽的基因的核苷酸序列在SEQ ID N0:26中示出 (其中相對于SEQ ID NO :11，至少98個(gè)密碼子已經(jīng)被最優(yōu)化以便在耶氏酵母屬中表達(dá))。由于含油酵母中天然產(chǎn)生的PUFA僅限于18:2脂肪酸(即LA)和通常較少的18:3 脂肪酸(即ALA)，因此除了本文所述的A 9延伸酶之外，還將對含油酵母進(jìn)行基因工程改造 以表達(dá)多種對長鏈PUFA生物合成所必需的酶(由此使得能產(chǎn)生例如ARA、EPA、DPA和DHA)。具體地講，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中涉及的含油酵母包含
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(a)包含分離的多核苷酸的第一重組DNA構(gòu)建體，該多核苷酸編碼A 9延伸酶多 肽，并被可操作地連接至至少一個(gè)調(diào)控序列；和(b)至少一個(gè)另外的重組DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含可操作地連接至至少一個(gè)調(diào) 控序列的分離的多核苷酸，其編碼的多肽選自如下酶A4去飽和酶、A5去飽和酶、A6去 飽和酶、A 9去飽和酶、A 12去飽和酶、A 15去飽和酶、A 17去飽和酶、A 8去飽和酶、C14/16 延伸酶、 ^16/18 延伸酶、 ^18/20 延伸酶和 ^20/22 延伸酶。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)另外的重組DNA構(gòu)建體編碼具有A 8去飽和 酶活性的多肽。微牛物中的(0-3和/或(0-6脂肪酸牛物合成的代i射工禾早有關(guān)本發(fā)明的A9延伸酶序列的知識將可用于操縱多種宿主細(xì)胞中的(0-3和/ 或脂肪酸的生物合成。操縱生化途徑的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的；而且，預(yù) 計(jì)很多操縱方法將可能使含油酵母并且尤其是解脂耶氏酵母中的和/或《-6脂肪酸 的生物合成達(dá)到最大程度。這種操縱可能需要直接在PUFA生物合成途徑中進(jìn)行代謝工程 改造，或者需要另外對為PUFA生物合成途徑提供碳的途徑進(jìn)行操縱?？捎糜谏险{(diào)期望的生 化途徑和下調(diào)不期望的生化途徑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，與(0 -3和/或(0 -6脂肪酸生物合成途徑競爭能量或碳的生化途徑或干擾 特定PUFA終產(chǎn)物產(chǎn)生的天然PUFA生物合成途徑中的酶可以通過基因破壞來去除或通過其 他手段(如反義mRNA)來下調(diào)。 在PUFA生物合成途徑中作為增加ARA、EPA或DHA的手段的操縱(及其相關(guān)技術(shù)) 的詳細(xì)討論分別在美國專利公開2006-0094092-A1、美國專利公開2006-0115881-A1和美 國專利公開2006-0110806-A1中給出，在TAG生物合成途徑和TAG降解途徑中的理想的操 縱(及其相關(guān)技術(shù))也在其中給出。在本發(fā)明的上下文中，通過上述策略中的任意一種來調(diào)節(jié)脂肪酸生物合成途徑的 表達(dá)均可能是有用的。例如，本發(fā)明提供了方法，通過該方法，將編碼A9延伸酶/A8去飽 和酶生物合成途徑中的關(guān)鍵酶的基因引入含油酵母中用以產(chǎn)生《-3和/或(0-6脂肪酸。 利用對宿主生物進(jìn)行代謝工程改造的多種手段，使本發(fā)明的A9延伸酶基因在天然條件下 不具有和/或(0-6脂肪酸生物合成途徑的含油酵母中表達(dá)并協(xié)調(diào)這些基因的表達(dá)， 以最大程度地產(chǎn)生優(yōu)選的PUFA產(chǎn)物將是特別有用的。用于PUFA生產(chǎn)的微生物發(fā)酵過程使轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞在使嵌合的去飽和酶和延伸酶基因的表達(dá)最優(yōu)化而且 產(chǎn)生的所需PUFA的產(chǎn)率最大且最經(jīng)濟(jì)的條件下生長。通常，可以被優(yōu)化的培養(yǎng)基條件包括 碳源的類型和量、氮源的類型和量、碳氮比、不同礦物離子的量、氧水平、生長溫度、PH、生物 量生產(chǎn)期的時(shí)長、油積聚期的時(shí)長以及細(xì)胞收獲的時(shí)間和方法。使所關(guān)注的微生物(例如 含油酵母，如解脂耶氏酵母)通常在復(fù)合培養(yǎng)基(例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖肉湯 培養(yǎng)基(YPD))或缺乏生長所必需的成分并由此強(qiáng)迫選擇所需表達(dá)盒的確定成分的極限培 養(yǎng)基(如 Yeast NitrogenBase(DIFCO Laboratories, Detroit, MI))中生長。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳源。美國專利7，238，482中教導(dǎo)了合適的 碳源。盡管預(yù)期本發(fā)明中利用的碳源可以涵蓋許多種含碳源，但優(yōu)選的碳源是糖類(如葡 萄糖)、甘油和/或脂肪酸。
氮可以由無機(jī)源(如(NH4)2S04)或有機(jī)源(如尿素或谷氨酸)提供。除了合適的碳 源和氮源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基還必須含有合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液、維生素和本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的適合含油宿主生長并促進(jìn)PUFA產(chǎn)生所必需的酶促途徑的其他組分。要特 別注意促進(jìn)脂質(zhì)和PUFA合成的幾種金屬離子(如Fe+2、Cu+2、Mn+2、C0+2、Zn+2、Mg+2) (Nakahara, T.等人，Ind.Appl. Single Cell Oils，D. J. Kyle 和 R. Colin (編輯).第 61-97 頁(1992))。本發(fā)明中優(yōu)選的生長培養(yǎng)基是普通的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，例如Yeast Nitrogen Base (DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。也可以使用其他確定成分的生長培養(yǎng)基或合成 的生長培養(yǎng)基，適于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞生長的培養(yǎng)基對微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員來 說將是已知的。適于發(fā)酵的PH范圍通常介于約pH4. 0至pH8. 0之間，其中優(yōu)選將pH5. 5至 PH7. 5作為初始生長條件的范圍。發(fā)酵可以在有氧或厭氧條件下進(jìn)行，其中優(yōu)選為微好氧條 件。通常，在含油酵母細(xì)胞中積聚高水平的PUFA需要一個(gè)包括兩個(gè)階段的過程，因?yàn)?代謝狀態(tài)必須在生長和脂肪的合成/貯存之間達(dá)到“平衡”。因此，最優(yōu)選的是，包括兩個(gè)階 段的發(fā)酵過程是在含油酵母(如解脂耶氏酵母)中產(chǎn)生PUFA所必需的。這種方法在美國 專利7，238，482中有所描述，其也描述了多種合適的發(fā)酵工藝設(shè)計(jì)(即分批式、補(bǔ)料分批式 和連續(xù)式)和生長過程中的注意事項(xiàng)。PUFA油的純化和處理PUFA可以游離脂肪酸或以酯化的形式(例如?；视汀⒘字?、硫脂或糖脂)存 在于宿主微生物中，并且可以通過本領(lǐng)域熟知的多種手段從宿主細(xì)胞提取。關(guān)于酵母脂 質(zhì)的提取技術(shù)、質(zhì)量分析和可接受標(biāo)準(zhǔn)的一篇綜述是Z. Jac0bs(Critical Reviews in Biotechnology, 12 (5/6) :463_491 (1992))的綜述。有關(guān)下游加工的簡述也可由A. Singh和 0. Ward (Adv. Appl. Microbiol. ,45 :271_312 (1997))提供。通常，用于純化PUFA的手段可包括用有機(jī)溶劑萃取(例如，美國專利6，797，303 和美國專利5，648，564)、超聲處理、超臨界流體萃取(如使用二氧化碳)、皂化和物理手段 (例如擠壓)，或它們的組合。另外的詳細(xì)信息可參考美國專利7，238，482的教導(dǎo)內(nèi)容。含PUFA的油在食品、保健食品、藥物和動(dòng)物飼料中的用途市場目前支持各種摻入了《-3和/或(0-6脂肪酸(尤其是例如ALA、GLA、ARA、 EPA、DPA和DHA)的食物和飼料產(chǎn)品。預(yù)期包含長鏈PUFA的微生物量、部分純化的包含PUFA 的微生物量、純化的包含PUFA的微生物油和/或純化的PUFA將在食物和飼料產(chǎn)品中起作 用以賦予該制劑的健康益處。更具體地講，本發(fā)明的含有《_3和/或《 _6脂肪酸的油將 適用于多種食物和飼料產(chǎn)品，包括但不限于食物模擬物、肉產(chǎn)品、谷類產(chǎn)品、烘焙食物、小 吃和乳制品(關(guān)于詳細(xì)內(nèi)容請參見專利公開US-2006-0094092)。此外，本發(fā)明的組合物可用于制劑中以在醫(yī)療食物(包括醫(yī)療營養(yǎng)品、膳食補(bǔ)充 劑、嬰兒代乳品以及藥物產(chǎn)品)中賦予健康益處。食物加工和食物配制領(lǐng)域的技術(shù)人員將 了解所述各種油的量和組成如何加入食物或飼料產(chǎn)品中。該量在本文中將稱為“有效”量 并將取決于食物或飼料產(chǎn)品、期望補(bǔ)充該產(chǎn)品的膳食或醫(yī)療食物或醫(yī)療營養(yǎng)品旨在糾正或 治療的醫(yī)學(xué)狀況。實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中得以進(jìn)一步說明，其中份數(shù)和百分比是以重量計(jì)并且 度數(shù)是攝氏度，除非另外說明。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實(shí)施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案， 但僅是以例證的方式給出的。根據(jù)上面的論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定本 發(fā)明的基本特征，并在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對本發(fā)明做出多種改變和 修飾，以使其適用于多種用途和條件。因此，除了本文所示和描述的那些之外，根據(jù)前文所 述，本發(fā)明的各種修改形式對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的。這些修改形式也旨 在涵蓋于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。一般方法實(shí)施例中使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的并且在如 下文獻(xiàn)中有所描述1.) Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, T. Molecular Cloning A Laboratory Manual ；Cold Spring HarborLaboratory :Cold Spring Harbor, NY(1989) (Maniatis) ；2. ) T. J. Silhavy, M. L. Bennan 禾口 L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions ；Cold SpringHarbor Laboratory :Cold Spring Harbor, NY(1984)；以及 3.) Ausubel, F. M.等人，Current Protocols in Molecular Biology,由 Greene Publishing Assoc. and ffiley-Interscience 出版(1987)。適用于微生物培養(yǎng)物的維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域熟知的。適用于 T ffl $ M M W ii ^ ^ Manual of Methods for GeneralBacteriology (Phillipp Gerhardt，R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 禾口 G. Briggs Phillips 編輯)，American Society for Microbiology Washington, D. C. (1994))； 或 Thomas D.Brock in Biotechnology :A Textbook of IndustrialMicrobiology， 第 2 片反，Sinauer Associates :Sunderland， MA(1989)的 描述中找到。用于微生物細(xì)胞的生長和維持的所有試劑、限制性內(nèi)切酶和材料均獲 自 Aldrich Chemicals(Milwaukee, WI)、DIFC0 Laboratories(Detroit, MI), GIBC0/ BRL(Gaithersburg，MD)或 Sigma ChemicalCompany (St. Louis，M0)，除非另外說明。通常于 37°C下在Luria Bertani (LB)平板上培養(yǎng)大腸桿菌(E. coli)菌株。一般的分子克隆根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，同上)來完成。DNA序列是在ABI 自動(dòng)測序儀上采用染料終止劑技術(shù)(美國專利5，366，860 ；EP272, 007)使用載體和插入 片段特異性引物的組合來產(chǎn)生的。序列編輯是在Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor,MI)中進(jìn)行的。所有序列在兩個(gè)方向上覆蓋至少兩次。基因序列的比較是使用 DNASTAR 軟件(DNAStar Inc.，Madison，WI)來完成?？s寫的含義如下“SeC”表示秒，“min”表示分鐘，“h”或“hr”表示小時(shí)，“d”表示 天，“ P L”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“ y M”表示微摩爾，“rnM”表示毫摩爾，“M” 表示摩爾，“mmol”表示毫摩爾，“ y mole”表示微摩爾，“g”表示克，“ u g”表示微克，“ng”表 示納克，“U”表示單位，“bp”表示堿基對并且“kB”表示千堿基。表達(dá)盒的命名表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)將通過簡單的記號系統(tǒng)“X: :Y: :Z”表示，其中X描述啟動(dòng)子片段，Y 描述基因片段而Z描述終止子片段，它們均彼此可操作地連接。解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)
ATCC登錄號為#20362、#76982和#90812的解脂耶氏酵母菌株可購自美國典型培 養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常是在根據(jù)下面所示的配方的數(shù)種 培養(yǎng)基中于28-30°C下培育。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，按需要通過將20g/L瓊脂添加到每種液體培養(yǎng) 基中來制備瓊脂平板。YPD瓊脂培養(yǎng)基(每升)10g酵母提取物[Difco]，20g細(xì)菌用蛋白胨[Difco]；以 及20g葡萄糖。極限培養(yǎng)基(MM)(每升):20g/L葡萄糖；1. 7g無氨基酸的酵母氮源基礎(chǔ)；無氨基 酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；1. 0g脯氨酸；并且pH為6. 1 (未調(diào)節(jié))。極限培養(yǎng)基+5-氟乳清酸(MM+5-F0A)(每升)20g葡萄糖、6. 7g酵母氮源基礎(chǔ)、75mg 尿嘧啶、75mg尿苷，并且基于對一系列從100mg/L至1000mg/L的濃度的F0A活性試驗(yàn)(因?yàn)?供應(yīng)商提供的每批料中會發(fā)生改變)，選用適量的F0A(Zymo Research Corp.，Orange, CA)。解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化是根據(jù)Chen，D. C.等人(Appl. Microbiol. Biotechnol.， 48(2) 232-235(1997))的方法實(shí)施，除非另外指明。簡而言之，將耶氏酵母劃線接種到Y(jié)PD 平板上，并在30°C下培育大約18小時(shí)。從平板上刮掉數(shù)個(gè)大環(huán)量的細(xì)胞并將其重懸浮于 lmL含有如下成分的轉(zhuǎn)化緩沖液中2. 25mL 50%的PEG，平均分子量為3350 ；0. 125mL 2M 的醋酸鋰，pH 6. 0 ；0. 125mL 2M的DTT ；以及(可任選)50 y g已剪切的鮭精DNA。然后，將 大約500ng線性化的DNA(優(yōu)選包含至少一種嵌合基因)(或lOOng環(huán)狀質(zhì)粒)在100 y L 重懸浮的細(xì)胞中孵育，并將其在39°C下保持1小時(shí)，每間隔15分鐘進(jìn)行渦旋混合。將細(xì)胞 鋪在選擇培養(yǎng)基平板上并在30°C下保持2至3天。解脂耶氏酵母的脂肪酸分析對于脂肪酸分析，將細(xì)胞通過離心收集并如Bligh, E. G. &Dyer, ff. J. (Can. J. Biochem. Physiol. ,37 :911_9171959))中所述提取脂質(zhì)。通過將脂質(zhì)提取物 與甲醇鈉進(jìn)行酯交換反應(yīng)而制備脂肪酸甲酯(Roughan，G.和Nishida I.，Arch Biochem Biophys. ,276(1) 38-46 (1990))并隨后將其用配有 30mx0. 25mm(內(nèi)徑) HP-INN0WAX(Hewlett-Packard)柱的 Hewlett-Packard 6890 氣相色譜儀(GC)進(jìn)行分析。 烘箱溫度以3. 5°C /分鐘從170°C (保持25分鐘)升到185°C。為了進(jìn)行直接的堿催化酯交換反應(yīng)，收獲耶氏酵母培養(yǎng)物(3mL)，在蒸餾水中洗滌 一次，并在Speed-Vac中在真空下干燥5-10分鐘。將甲醇鈉(100iU，l%)加入樣品中，然 后將樣品渦旋振蕩20分鐘。在加入3滴1M氯化鈉和400 u 1己烷后，渦旋樣品并離心。移 出上層并如上所述用GC進(jìn)行分析。實(shí)施例1來自 Eimlena anabaena UTEX 373 的 cDNA 文庫的合成本實(shí)施例描述了來自Euglena anabaenaUTEX 373的cDNA文庫的合成。該工作包 括制備RNA、合成cDNA和產(chǎn)生cDNA文庫。Eimlena anabaena UTEX 373 的培育和 RNA 制備Euglena anabaena UTEX 373 可獲自密西根州立大學(xué) RichardTriemer 博士的實(shí) 驗(yàn)室(East Lansing,MI)。移出約2ml培養(yǎng)物用于液體分析，將其以1，800xg離心5分鐘。 用水洗滌沉淀一次并再次離心。將所得沉淀真空干燥5分鐘，重懸浮于100 u L三甲基氫氧 化硫(TMSH)中，在室溫下?lián)u動(dòng)孵育15分鐘。孵育后，加入0.5mL己烷并將該小瓶在室溫下
32另外搖動(dòng)孵育15分鐘。使用配有Omegawax 320熔融石英毛細(xì)柱的Hewlett-Packard 6890 氣相色譜(Supelco Inc.，目錄號24152)對脂肪酸甲酯(從己烷層取5 y L注射上樣)進(jìn)行 分離和定量。用程序控制烘箱溫度在170°C保持1. 0分鐘，以5°C /分鐘上升到240°C，然后 另外保持1.0分鐘。載氣通過Whatman氫發(fā)生器供應(yīng)。將保留時(shí)間與那些市售的甲酯標(biāo)準(zhǔn) 樣品(Nu-Chek Prep, Inc.，目錄號U-99-A)的保留時(shí)間進(jìn)行比較，所得的色譜圖在圖2中示 出。脂肪酸概況中存在EDA、ETrA、EPA和DHA且不存在GLA和STA表明，Euglena anabaena 采用A 9延伸酶/ A 8去飽和酶途徑來用于長鏈(LC) PUFA的生物合成，并且將會是LC-PUFA 生物合成基因(例如但不限于A9延伸酶)的良好來源。將剩余的5mL活躍生長的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至125mL玻璃燒瓶中的25mLAF_6培養(yǎng)基 (ffatanabe & Hiroki, NIES-Collection List of Strains,第 5 版，National Institute for Environmental Studies, Tsukuba，第 127 頁(2004))中。采用 16 小時(shí)光照 8 小時(shí)黑 暗周期并進(jìn)行非常輕微的攪動(dòng)，使小眼蟲培養(yǎng)物在22°C下生長2周。2周后，將培養(yǎng)物(25mL)轉(zhuǎn)移至500mL玻璃瓶中的100mL AF_6培養(yǎng)基中，如上所 述使培養(yǎng)物生長1個(gè)月。在這之后，將兩份50mL的等份試樣轉(zhuǎn)移進(jìn)兩個(gè)分開的裝有250mL AF-6培養(yǎng)基的500mL玻璃瓶中，如上所述將培養(yǎng)物培育2個(gè)月(得到總共約600mL的培養(yǎng) 物)。接下來，以1，800xg離心10分鐘獲得培養(yǎng)物的沉淀顆粒，將其用水洗滌一次并再次 離心。使用RNA STAT-60 試劑(TEL-TEST，Inc.，F(xiàn)riendswood，TX)，按照制造商提供的規(guī) 程(使用5mL試劑，將RNA溶解于0. 5mL水中)從一份所得的沉淀中提取總RNA。這樣，從 沉淀中獲得340 u g的總RNA(680ug/mL)。將剩余的沉淀在液氮中冷凍并在_80°C下保存。 使用mRNA純化試劑盒(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)按照制造商提供的規(guī)程從 340 u g總RNA中來分離mRNA。這樣，獲得9. 0 ii g mRNA。Euglena anabaena cDNA 的吿l|備禾口 cDNA 文庫 euglc 的產(chǎn)牛.使用Cloneminer cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒(目錄號 18249-029，Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，按照制造商提供的規(guī)程(VersionB，25-0608)產(chǎn)生 cDNA 文庫。 使用非放射標(biāo)記方法，從5. 12 ii g mRNA (上文所述的mRNA)中用生物素-attB2-01igo (dT) 引物來合成cDNA。在合成第一鏈和第二鏈后，加入attBl銜接子進(jìn)行連接，并用柱色譜對 cDNA按照大小進(jìn)行分級。將來自級分的DNA濃縮，重組進(jìn)pD0NR 222中，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿 菌ElectroMAX DH10B T1 噬菌體抗性細(xì)胞(Invitrogen Corporation)中。將該 Euglena anabaena euglc。將cDNA文庫euglc鋪在LB+卡那霉素平板(約100，000個(gè)菌落)上，刮下菌落， 使用 QIApi^p Spin Miniprep Kit(Qiagen Inc.，Valencia, CA)按照制造商提供的規(guī)程 來分離DNA。這樣，獲得來自euglc的質(zhì)粒DNA子文庫。實(shí)施例2從Eimlena anabaena UTEX 373 分離全長的 A 9 延伸酶本實(shí)施例描述了鑒定編碼來自Euglena anabaena UTEX 373的A9延伸酶的 cDNA (SEQ ID N0:1和2)。這一工作包括產(chǎn)生源自小眼蟲A9延伸酶(EgD9e ;SEQ ID NO: 3)的探針以及讓該探針與cDNA文庫euglc雜交以鑒定來自Euglena anabaena UTEX 373 的A 9延伸酶同源物。小眼蟲A 9延伸酶(ESD9e)
33
將來自裸藻屬cDNA文庫(eeglc)的克隆(稱為eeglc. pkOOl. n5f，含有小眼蟲A 9 延伸酶(EgD9e;SEQ ID NO :3 ；其在美國申請11/601，563中有描述))用作模板，使用寡核 苷酸引物 oEugELl-l(SEQ ID NO :5)和 oEugELl-2 (SEQ ID NO :6)，用 VentR DNA 聚合酶 (目錄號 M0254S，New England Biolabs Inc. , Beverly, MA)按照制造商的規(guī)程擴(kuò)增 EgD9e。 使用Zero Blunt PCR克隆試劑盒(Invitrogen Corporation)，按照制造商的規(guī)程將所得 DNA片段克隆進(jìn)pCR-Blunt 克隆載體中，以產(chǎn)生pKR906(SEQ ID NO: 15)。菌落轉(zhuǎn)移將Euglena anabaena cDNA文庫euglc的大約17，000個(gè)克隆鋪在三個(gè)大的正方 形(24cmX 24cm) Petri 平板(Corning, Corning, NY)上，每個(gè)平板裝有 LB+50 ii g/mL 卡那霉 素瓊脂培養(yǎng)基。使細(xì)胞在37°C下生長過夜，然后使平板冷卻至室溫。M Biodyne B 0. 45 y m 膜(目錄號 60207，Pall Corporation, Pensacola, FL)修 剪成大約22cmX22cm，并將該膜小心地鋪放在瓊脂上面以避免氣泡。在室溫下孵育2分鐘 后，將膜標(biāo)記取向，用鑷子將膜提起并將菌落面朝上放在用0. 5M氫氧化鈉和1. 5M氯化鈉浸 濕的濾紙上。變性4分鐘后，通過將膜置于用0. 5M Tris-HCL(pH7. 5)和1. 5M氯化鈉浸濕 的濾紙上4分鐘來中和氫氧化鈉。重復(fù)該步驟，將膜在2XSSC緩沖液(20XSSC是3M的氯化 鈉、0.3M的檸檬酸鈉；pH 7.0)中簡單沖洗并在濾紙上風(fēng)干。^將膜在200mL雜交溶液中于65°C下預(yù)雜交2小時(shí)。雜交溶液含有6X SSPE(20X SSPE 是 3M 的氯化鈉、0. 2M 的磷酸鈉、20mM 的 EDTA ；pH 7. 4)、5X Denhardt 試劑(100X Denhardt試劑是2% (w/v)Ficoll,2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮、2% (w/v)乙酰化的牛血清 白蛋白)、0. 5%十二烷基硫酸鈉(SDS)、100ii g/mL已剪切的鮭精DNA和5%硫酸葡聚糖。用來自pKR906 (SEQ ID NO 15)的經(jīng)瓊脂糖凝膠純化過的NcoI/NotlDNA片段(其 含有小眼蟲A9延伸酶基因)來制備DNA探針，使用RadPrime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Catalog No. 18428-011，Invitrogen, Carlsbad, CA)按照制造商的說明書用 P32 dCTP 標(biāo)記該 DNA 片 段。使用 NICK 柱(目錄號 17-0855-02，Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)，按照制 造商的說明書分離未整合的P32dCTP。將探針在100°C下變性5分鐘，置于冰上3分鐘，并將 其一半加入到雜交溶液中。將膜在65°C下與探針輕微搖動(dòng)地雜交過夜，然后在次日用含0. 5% SDS的2XSSC 洗滌兩次(每次5分鐘)，并用含0. 1 % SDS的0. 2XSSC洗滌兩次(每次15分鐘)。洗滌
hyperfilm(目RPN30K, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) ^h -80°CT# 露于該膜過夜。根據(jù)將平板與暴露的hyperfilm對齊，用巴斯德吸管的鈍頭將陽性菌落挑選 至lmL水中并進(jìn)行渦旋。制備數(shù)份稀釋液，并將其鋪在裝有LB培養(yǎng)基和50 u g/mL卡那 霉素的小圓形培養(yǎng)皿(82mm)上以在單個(gè)平板上獲得約100個(gè)分離得很好的菌落。如上 所述進(jìn)行轉(zhuǎn)移，不同的是使用NytranN膜圓片(membrane circles)(目錄號10416116， Schleicher&Schuell，Keene，NH)并且用剩余的經(jīng)放射標(biāo)記過的探針在100mL雜交溶液中 雜交。以這種方式，確認(rèn)了陽性克隆。使各陽性克隆在LB+50ii g/mL卡那霉素液體培養(yǎng)基中于37°C下生長，用QIApMp Spin Minipr印試劑盒(Qiagen Inc.)按照制造商的規(guī)程來純化質(zhì)粒。
使用載體引發(fā)的M13F通用引物(SEQ ID NO 7)、M13rev_28引物(SEQ ID NO 8)和 聚腺苷酸尾引發(fā)的WobbleT寡核苷酸，用ABIBigDye version 3Prism測序試劑盒對384-孔 平板中的DNA插入物進(jìn)行末端測序。對于測序反應(yīng)，使用100-200ng模板和6. 4pmol引物， 重復(fù)以下反應(yīng)條件25次96°C 10秒，50°C 5秒，60°C 4分鐘。在基于乙醇的純化后，將循 環(huán)測序反應(yīng)的產(chǎn)物在Perkin-Elmer ABI 3700自動(dòng)測序儀上分離并檢測。WobbleT引物是 21mer聚(T)A、聚(T)C和聚(T)G的克分子數(shù)相等的混合物，用于對cDNA克隆的3‘末端進(jìn) 行測序。使用 Sequencher (版本 4. 2, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI)對序 列進(jìn)行比對和比較，這樣，基于插入序列可以將克隆歸類為兩種不同組中的一種(稱為 EaD9Elol和EaD9Elo2)。選擇含有每一類序列的cDNA的代表性克隆用于進(jìn)一步的研究，每 種代表性質(zhì)粒(即PLF121-1和pLF121-2)的序列分別在SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10中 示出。用一串NNNN表示的序列表示未進(jìn)行測序的聚腺苷酸尾區(qū)域。EaD9Elol和EaD9Elo2 的編碼序列分別在SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12中示出。EaD9Elol和EaD9Elo2的相應(yīng) 氨基酸序列分別在SEQ ID N0:13和SEQ ID N0:14中示出。實(shí)施例3Euglena anabaena UTEX 373 的 A 9 延伸酶序列(EaD9Elol 和 EaD9Elo2)的一級 序列分析和與其他公開的A9延伸酶序列的比較使用 Clustal V 方法(Higgins, D. G.禾口 Sharp， P. M. ， Comput. Appl. Biosci. ，5 151-153(1989) ；Higgins 等人，Comput. Appl. Biosci.，8 189-191(1992))，用 LASERGENE 生物信息學(xué)計(jì)數(shù)軟件包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的MegAlign v6. 1程序比較 EaD9Elol(SEQ ID NO 13)和EaD9Elo2 (SEQ ID NO 14)的氨基酸序列，該程序采用用于成 對比對的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE = 1，缺口罰分=3，窗口 = 5,DIAGONALS SAVED = 5，缺口長度 罰分=10)。與EaD9Elol(SEQ ID NO 13)相比較，EaD9Elo2 (SEQ ID NO 14)具有 1 個(gè)氨基酸 置換(即，基于EaD9Elol的編號，254位的R被置換成Q)。EaD9Elol(SEQ ID NO :11)和 EaD9Elo2 (SEQ ID NO 12)的核苷酸序列在全長774bp的長度范圍內(nèi)有6個(gè)堿基對不同。通過BLASTP (基本的局部比對搜索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)； Altschul 等人，J. Mol. Biol. , 215 =403-410 (1993))搜索與 BLAST “nr” 數(shù)據(jù)庫(包括所 有非冗余GenBank CDS翻譯物、來源于3-維結(jié)構(gòu)Brookhaven Protein Data Bank的序 列、SWISS-PR0T蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫的最新的主要公開版本、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫)中所 包含的序列的相似性(采用默認(rèn)參數(shù)并關(guān)閉過濾器)來評估EaD9Elol(SEQ IDN0 13)和 EaD9Elo2 (SEQ ID NO 14)的氨基酸序列。為方便起見，由BLAST所計(jì)算的、觀察到cDNA序 列與所搜索數(shù)據(jù)庫中包含的序列僅偶然匹配的P-值(概率)在本文中報(bào)導(dǎo)為“pLog”值， 該值代表了所報(bào)導(dǎo)的P-值的負(fù)對數(shù)。因此，pLog值越大，cDNA序列和BLAST的“命中序列” 代表同源蛋白的可能性就越大。當(dāng)與“nr”數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較時(shí)，相對于綠光等鞭金藻長鏈多不飽和脂肪酸延伸酶 (IgD9e ；SEQ ID NO 16) (NCBI 編號(NCBI Accession No.) AAL37626 (GI 17226123)，基因 座 AAL37626，CDS AF390174 ;Qi 等人，F(xiàn)EBS Lett.，510 :159-165 (2002))，這兩種序列均 產(chǎn)生了 38. 70的pLog值(P值為2e-39)。BLAST打分和概率表明，本核酸片段編碼整個(gè)Euglenaanabaena A 9月旨肪酸延伸酶。使用BlastP、Clustal V 和 Jotun Hein 序列比較方法，將 EaD9Elol (SEQ ID NO: 13)和 EaD9Elo2 (SEQ ID NO 14)的氨基酸序列與 IgD9e (SEQ ID NO 16)和小眼蟲 A9 延 伸酶氨基酸序列(EgD9e ;SEQID N0:4;PCT公開TO 2007/061845)進(jìn)行比較。用每種方法 確定的與IgD9e和EgD9e的百分比同一性分別在表4和表5中示出。序列百分比同一性計(jì)算是通過BlastP和Clustal V方法來完成的，如上所述。用 Jotun Hein 方法(Hein, J. J.，Meth. Enz.，183 =626-645(1990))進(jìn)行的序列百分比同一性 計(jì)算是用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算軟件包(DNASTAR Inc.，Madison, WI)的MegAlign v6. 1程序來完成的，該程序采用用于成對比對的默認(rèn)參數(shù)(KTUPLE = 2)。EaD9Elol(SEQ ID NO 13)和Ead9elo2(SEQ ID NO: 14)與 IgD9e(SEQ ID NO 16)的序列比較 實(shí)施例4解脂耶氏酵母中Eimlena anabaena UTEX 373 A 9延伸酶的功能分析本實(shí)施例描述了EaD9Elol(SEQ ID NO 13)和 EaD9Elo2(SEQ IDN0 14)在解脂耶 氏酵母中的功能分析。該工作包括如下步驟(1)構(gòu)建Gateway -相容的耶氏酵母表達(dá)載 體 pY159 ； (2)將 EaD9Elol 和 EaD9Elo2 轉(zhuǎn)入 pY159 中以產(chǎn)生 pY173 和 pY174 ；以及(3)比較含pY173和pY174的轉(zhuǎn)化生物內(nèi)的脂質(zhì)概況。構(gòu)津Gateway -相容的耶氏酵母表汰載體dY159質(zhì)粒pY5-30 (其以前在美國專利7，259，255中有描述)是既可在大腸桿菌中復(fù) 制又可在解脂耶氏酵母中復(fù)制的穿梭質(zhì)粒。質(zhì)粒PY5-30包含如下組分耶氏酵母自主復(fù) 制序列(ARS18) ；ColEl質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)；用于在大腸桿菌中選擇的氨芐青霉素抗性基因 (AmpE)；用于在耶氏酵母中選擇的耶氏酵母LEU2基因；以及TEF:⑶S: 嵌合基因。質(zhì)粒 PDMW263 (SEQ ID NO 17)由pY5_30產(chǎn)生，這通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)將TEF 啟動(dòng)子替換為解脂耶氏酵母FBAINm啟動(dòng)子(美國專利7，202，356)而實(shí)現(xiàn)。簡而言之，該 啟動(dòng)子指經(jīng)修飾的啟動(dòng)子，其位于由fbal基因編碼的果糖二磷酸醛縮酶(E. C. 4. 1. 2. 13) 的‘ATG’翻譯起始密碼子前面的5’上游非翻譯區(qū)，并且該啟動(dòng)子加上具有內(nèi)含子的5’編 碼區(qū)部分是表達(dá)所必需的，其中FBAINm在ATG翻譯起始密碼子和FBAIN啟動(dòng)子的內(nèi)含子之 間具有52bp的缺失(從而只包含N端的22個(gè)氨基酸)，并且在內(nèi)含子后面具有新的翻譯共 有基序。表6匯總了 pDMW263(SEQ ID NO 17)的組分。戲質(zhì)粒 DDMW263 (SEQ ID NO 17)的組分 將來自pDMW263 (SEQ ID NO :17)的Ncol/Sall DNA片段(其含有解脂耶氏酵母 FBAINm啟動(dòng)子)克隆進(jìn)pDMW237(SEQ ID NO :18)的Ncol/Sall DNA片段中以產(chǎn)生pY115 (SEQ ID NO :19 ；圖3A)，該pDMW237此前在PCT公開W0 2006/012325中有描述(因此將該專利 的內(nèi)容以引用的方式并入)，含有來源于綠光等鞭金藻的經(jīng)密碼子最優(yōu)化以便在解脂耶氏 酵母中表達(dá)的合成的A9延伸酶基因(IgD9eS)。在圖3A中，經(jīng)修飾的FBAINm啟動(dòng)子標(biāo)記 為FBA1+內(nèi)含子，而該啟動(dòng)子在圖3B、3C和3D中標(biāo)記為YAR FBA1PR0+內(nèi)含子。
使用寡核苷酸引物oYFBAl (SEQ ID NO 20)和 oYFBAl-6 (SEQ IDNO :21)，采用 PCR 從質(zhì)粒pY115(SEQ ID NO 19)擴(kuò)增FBAINm啟動(dòng)子。引物oYFBAl(SEQ ID NO 20)被設(shè)計(jì)成 在啟動(dòng)子的5’端引入Bglll位點(diǎn)，而引物oYFBAl-6(SEQ ID NO 21)被設(shè)計(jì)成在啟動(dòng)子的 3’端引入NotI位點(diǎn)，同時(shí)移除Ncol位點(diǎn)，并因而移除了 ATG起始密碼子。將所得PCR片段 用Bglll和NotI消化，并克隆進(jìn)pY115的Bglll/NotI片段(其含有載體骨架)中以形成 pY158(SEQ ID NO 22)。將質(zhì)粒pY158(SEQ ID NO :22)用NotI消化，并補(bǔ)足所產(chǎn)生的DNA末端。在補(bǔ) 足而形成平端后，將該DNA片段用牛小腸堿性磷酸酶處理并用瓊脂糖凝膠電泳分離。從 瓊脂糖凝膠中切下6992bp的含有解脂耶氏酵母FBAINm啟動(dòng)子的片段并用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen Inc，Valencia，CA)按照制造商的規(guī)程進(jìn)行純化。使用 GatewayVector Conversion System(目錄號 11823-029, Invitrogen Corporation),按照 制造商的規(guī)程將純化過的6992bp片段與rfA盒連接，以形成解脂耶氏酵母Gateway 目的 載體(destination vector)pY159(SEQ ID NO 23 ；圖 3B)。構(gòu)津耶氏酵母表汰載體DY173和DY174使用Gateway LR Clonase II 酶混合物(目錄號 11791-020， InvitrogenCorporation)，按照制造商的規(guī)程將來自pLF121_l (SEQ ID NO 9 ；實(shí)施例2)和 pLF121-2(SEQ ID N0:10;實(shí)施例 2)的 cDNA 插入物轉(zhuǎn)進(jìn) pY159 (SEQ ID NO 23)中，以分別 形成 pY173 (SEQ ID NO :24 ；圖 3C)和 pY174 (SEQ ID NO :25 ；圖 3D)。EaD9Elol和EaD9Elo2在解脂耶氏酵母菌株Y2224中的功能分析以如下方式分 離菌株Y2224:將來自YPD瓊脂平板(1%酵母提取物、2%細(xì)菌用蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊 脂)的解脂耶氏酵母ATCC#20362細(xì)胞劃線接種至含250mg/L 5_F0A(Zymo Research)的MM 平板(尿嘧啶和尿苷各75mg/L，6. 7g/L具有硫酸銨且無氨基酸的YNB，以及20g/L葡萄糖) 上。將平板在28°C下孵育并將四個(gè)得到的菌落分別貼在含有200mg/mL 5-F0A的MM平板上 和無尿嘧啶和尿苷的MM平板上以確定尿嘧啶Ura3營養(yǎng)缺陷型。如在“一般方法”中所述，將菌株Y2224用pY173 (SEQ ID NO 24 ；圖3C)和 pY174(SEQ ID NO 25 ；圖 3D)轉(zhuǎn)化。使含有pY173和pY174的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化株的單菌落在不含尿嘧啶的3mL極 限培養(yǎng)基中于30°C生長16h，之后，將細(xì)胞以250rpm離心以形成沉淀。將細(xì)胞用水洗滌 一次，通過離心沉淀并風(fēng)干。在50°C下用500i!L 的甲醇鈉對該沉淀進(jìn)行酯交換反應(yīng) (Roughan，G.和 Nishida，I. ,Arch. Biochem. Biophys.，276(1) :38_46 (1990)) 30 分鐘，之后 加入500i! L 1M的氯化鈉和100 y L庚烷。在徹底混合并離心后，通過GC來分析脂肪酸甲酯 (FAME)。使用配有Omegawax 320熔融石英毛細(xì)柱的Hewlett-Packard 6890氣相色譜(目 錄號24152，Supelco Inc.)對FAME (從己烷層取5 u L注射上樣)進(jìn)行分離和定量。用程 序控制烘箱溫度在220°C保持2. 6分鐘，以20°C /分鐘升溫至240°C，然后另外保持2. 4分 鐘。載氣通過Whatman氫發(fā)生器供應(yīng)。將保留時(shí)間與那些市售的甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品(Nu_Chek Prep, Inc)的保留時(shí)間進(jìn)行比較。表達(dá)pY173和pY174的解脂耶氏酵母的脂肪酸概況在表7中示出。脂肪酸確定為 16:0、16:1、18:0、18:1 (油酸)、LA、20:0、20:1(11)、EDA、22:0、24:0 和 24:1。通過如下方式 計(jì)算A 9延長百分比(A9% Elong)將EDA的重量百分比除以EDA和LA的總重量百分比再乘以100以表示為百分比形式。Ave表示平均值。表 7表達(dá)DY173(EaD9Elol)和 DY174 (EaD9Elo2) 的解脂耶氏酵母的脂肪酸組分重 量％ ) 實(shí)施例5m^mmm&mmm^m^mmm A9延伸_某因(EaD9Es)的合成以與PCT公開W0 2004/101753和美國專利7，125,672中所描述的類似方式，將 Euglena anabaena的A 9延伸酶基因(EaD9Elol)的密碼子使用最優(yōu)化以便在解脂耶氏酵 母中表達(dá)。具體地講，基于EaD9Elol(SEQID N0:11)的編碼序列，根據(jù)耶氏酵母密碼子使用 模式(PCT公開W0 2004/101753)、‘ATG，翻譯起始密碼子周圍的共有序列以及RNA穩(wěn)定性的 一般規(guī)則(Guhaniyogi，G.和 J. Brewer，Gene，265 (1-2) 11-23 (2001))，設(shè)計(jì)經(jīng)密碼子最優(yōu) 化的A 9延伸酶基因(稱為“EaD9ES”，SEQ ID NO :26)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)之外，還對 774bp編碼區(qū)中的106bp進(jìn)行了修飾(13. 7% )并最優(yōu)化了 98個(gè)密碼子(38. 0% )。野生型 基因(即EaD9Elol)和合成基因(即EaD9ES)的GC含量(52. 1% )幾乎相同。分別將Ncol 位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)整合到EaD9ES(SEQ ID NO 26)的翻譯起始密碼子的周圍和終止密碼子之 后。圖 4A和4B示出了 EaD9Elol(SEQ ID NO :11)和EaD9ES(SEQ ID NO 26)的核苷酸序列的 比較。由經(jīng)密碼子最優(yōu)化的基因編碼的蛋白質(zhì)序列(即SEQ ID NO 27)與野生型蛋白質(zhì)序 列(即 SEQ ID NO 13)相同。設(shè)計(jì)的 EaD9ES 基因由 GenScript Corporation (Piscataway,NJ)合成并將其克隆到pUC57(基因庫編號Y14837)中，以產(chǎn)生pEaD9ES (SEQ ID N0:28;圖 5A)。實(shí)施例6伺含總石好j|優(yōu)北__娜_軸表汰艦成說A9MIS細(xì)(剩肝 Euglena anabaena) (EaD9ES)的解脂耶氏酵母表汰載體DZUFmEaD9ES的構(gòu)津和功能分析本實(shí)施例描述了包含F(xiàn)BAINm: :EaD9ES: :Pex20嵌合基因的解脂耶氏酵母載體 pZUFmEaD9ES的功能性表達(dá)，其中EaD9ES是來源于Euglena anabaena的經(jīng)密碼子最優(yōu)化以 便在耶氏酵母屬中表達(dá)的合成的A 9延伸酶。質(zhì)粒PZUFmEaD9ES(圖5B)含有如下組分表 8質(zhì)粒 DZUFmEaD9ES (SEQ ID NO 29)的組分 句,含DZUFmEaD9ES的解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化株的功能分析如“一般方法”中所述，將質(zhì)粒PZUFmEaD9ES轉(zhuǎn)化進(jìn)菌株Y2224 (由野生型耶氏酵 母菌株ATCC#20362的Ura3基因自發(fā)突變而產(chǎn)生的F0A抗性突變體)中。在MM平板上選 擇轉(zhuǎn)化株。在30°C下培育2天后，挑取轉(zhuǎn)化株并將其再次劃線至新鮮的MM平板上。生長之 后，將這些菌株單個(gè)地接種在30°C下的3mL液體匪中，以250rpm/min搖動(dòng)2天。離心收 集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過酯交換反應(yīng)來制備脂肪酸甲酯，并隨后用Hewlett-Packard 6890GC 進(jìn)行分析。
GC分析顯示，在所有5個(gè)轉(zhuǎn)化株中產(chǎn)生了占總脂質(zhì)約2.2%的C20:2(EDA)和15.3%的C18:2(LA)，其中測得這5個(gè)菌株中C18:2轉(zhuǎn)化成C20:2的轉(zhuǎn)化效率為約13%。 因此，該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，經(jīng)密碼子最優(yōu)化以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)的合成的Euglena anabaenaA9延伸酶(即EaD9ES，在SEQ ID NO 26和27中示出)有效地將LA延長成了 EDA。
權(quán)利要求
包含分離的多核苷酸的微生物宿主細(xì)胞，所述分離的多核苷酸包含(a)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于ClustalV比對方法在與SEQ ID NO13或SEQ ID NO14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，所述多肽具有至少80％的氨基酸同一性；(b)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中基于BLASTN比對方法在與SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO26中示出的核苷酸序列進(jìn)行比較時(shí)，所述核苷酸序列具有至少80％的序列同一性；(c)編碼具有Δ9延伸酶活性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO11、SEQ ID NO12或SEQ ID NO26中示出的核苷酸序列雜交；或(d)(a)、(b)或(c)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，其中所述互補(bǔ)序列與所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且100％互補(bǔ)。
2.權(quán)利要求1的微生物宿主細(xì)胞，其中所述分離的多核苷酸編碼SEQID N0:13或SEQ ID NO 14中示出的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1的微生物宿主細(xì)胞，其中所述微生物宿主細(xì)胞選自酵母、藻類、細(xì)菌、類 眼蟲、原生藻菌和真菌。
4.權(quán)利要求3的微生物宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是被孢霉屬物種的真菌。
5.權(quán)利要求3的微生物宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是選自下列的原生藻菌破囊壺菌屬 物種和裂殖壺菌屬物種。
6.權(quán)利要求3的微生物宿主細(xì)胞，其中所述酵母是含油酵母。
7.權(quán)利要求6的微生物宿主細(xì)胞，其中所述含油酵母選自耶氏酵母屬、假絲酵母屬、 紅酵母屬、紅冬孢酵母屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
8.用于產(chǎn)生二十碳二烯酸的方法，所述方法包括a)提供微生物宿主細(xì)胞，所述微生物宿主細(xì)胞包含(i)編碼Δ9延伸酶多肽的重組核苷酸分子，基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，所述延伸酶多肽具有至少80%的氨 基酸同一性；和( )亞油酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細(xì)胞在使編碼△9延伸酶多肽的核酸片段表達(dá)并使所述亞 油酸轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸的條件下生長；以及，c)任選回收步驟(b)的二十碳二烯酸。
9.用于產(chǎn)生二十碳三烯酸的方法，所述方法包括a)提供微生物宿主細(xì)胞，所述微生物宿主細(xì)胞包含(i)編碼Δ9延伸酶多肽的重組核苷酸分子，基于ClustalV比對方法在與SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO :14中示出的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，所述延伸酶多肽具有至少80%的氨 基酸同一性；和(ii)α-亞麻酸源；b)使步驟(a)的微生物宿主細(xì)胞在使編碼△9延伸酶多肽的核酸片段表達(dá)并使所述 α-亞麻酸轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸的條件下生長；以及，c)任選回收步驟(b)的二十碳三烯酸。
10.權(quán)利要求8或9的方法，其中所述微生物宿主細(xì)胞是包含如SEQIDNO :26中示出 的編碼Δ9延伸酶多肽的重組核苷酸分子的耶氏酵母屬物種，其中所述重組核苷酸分子包 含至少98個(gè)經(jīng)最優(yōu)化以便在耶氏酵母屬中表達(dá)的密碼子。
11.權(quán)利要求8或9的方法，其中a.)所述重組核酸分子具有選自SEQID NO 11、SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 26的核 酸序列；并且b.)所述宿主細(xì)胞是解脂耶氏酵母。
12.如SEQID NO :26中示出的編碼Δ9延伸酶的分離的核酸分子，其中至少98個(gè)密 碼子經(jīng)密碼子最優(yōu)化以便在耶氏酵母屬物種中表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及Δ9延伸酶，所述Δ9延伸酶具有將亞油酸(LA；18:2ω-6)轉(zhuǎn)化成二十碳二烯酸(EDA；20:2ω-6)和/或?qū)ⅵ?亞麻酸(ALA；18:3ω-3)轉(zhuǎn)化成二十碳三烯酸(ETrA；20:3ω-3)的能力。公開了分離的核酸片段和包含這種編碼Δ9延伸酶的片段的重組構(gòu)建體，以及用這些Δ9延伸酶在含油酵母中制備長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)的方法。
文檔編號C12N15/54GK101848996SQ200880020395
公開日2010年9月29日 申請日期2008年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月16日
發(fā)明者H·G·達(dá)穆德, Q·Q·朱 申請人:納幕爾杜邦公司