專利名稱：實時pcr監(jiān)控裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及實時聚合酶鏈式反應(PCR)監(jiān)控裝置，更具體來講，涉及實時PCR監(jiān)控 裝置，該實時PCR監(jiān)控裝置用于實時監(jiān)控在對于各種微量樣品執(zhí)行核酸擴增(例如，PCR)時 反應期間生成的反應產物的生成。
背景技術：
近來，已經開發(fā)出可以實時監(jiān)控PCR工藝期間的反應產物的實時PCR技術。采用 該技術，不必要對凝膠體執(zhí)行電泳分離，可以確認在反應周期期間擴增的產物，并且可以得 到定量結果。為了執(zhí)行該實時PCR，使用結合有用于PCR反應的熱循環(huán)儀和用于實時檢測反 應物的熒光光度計的裝置。 通常，使用熒光試劑的熒光檢測用于監(jiān)控實時PCR，常規(guī)方法包括如下方法
1)嵌入法向反應系統(tǒng)添加嵌入劑(例如，SYBR Green I、 EtBr等)，即通過與雙 鏈DNA結合而表現(xiàn)出熒光的試劑，并且檢測通過擴增產生的熒光。也就是說，當嵌入劑與通 過PCR合成的雙鏈DNA結合時產生熒光，并且通過檢測熒光強度，可以測量出擴增DNA的熔 化溫度以及量。 2)T叫ManTM探針法添加寡核苷酸，在寡核苷酸中，5'端被改性為熒光材料(例 如，F(xiàn)AM等)并且3'端被改性為淬火材料(例如，TAMRA等)。在退火的條件下，TaqMan 探 針專門與模板DNA雜交，但是熒光被淬火劑阻擋。在擴增反應期間，檢測當模板被T叫DNA 聚合酶的5' -3'核酸外切酶活性消化然后釋放由捕獲進行的阻擋時產生的熒光。
3)分子信標法向反應添加形成二級發(fā)卡結構的寡核苷酸(分子信標探針)，在 該二級發(fā)卡結構中，其兩端被改性為熒光材料(例如，F(xiàn)AM、 TAMRA等)和淬火材料(例如， DABCYL等)。在退火條件下，分子信標探針專門與配對區(qū)域雜交成模板。此時，檢測當熒光 染料和淬火劑之間的距離變得更遠并且由淬火劑進行的阻擋由此被釋放時產生的熒光。同 時，未雜交的分子信標探針沒有產生熒光，這是由于其具有二級結構并且因此被淬火劑阻 擋。 如圖1所示，用于實時PCR的常規(guī)裝置(美國專利6，818，437)包括熱電元件lc ; 塊l，該塊1用于將熱傳送到容納樣品的反應管2a ;光源ll，該光源11用于將光束照射到 反應管中容納的樣品；以及傳感器部件78，該傳感器部件78用于接收樣品所產生的熒光。 上述裝置的原理如下為了使核樣品溶液在管內反應，使用熱電元件lc反復執(zhí)行冷卻和加 熱循環(huán)；在完成了每個循環(huán)的情況下，通過操作光源11和傳感器部件78來測量樣品產生的 熒光強度，由此實時檢測反應的進程。光源11是白色光源，并且使用帶通濾波器7來產生 激發(fā)光，該激發(fā)光的頻率對應于所使用的熒光探針的頻率。二向色分光器6是用于分離激 發(fā)光和熒光的裝置。在圖1中，其反射頻率比特定頻率低的光，并且使頻率高于特定頻率的 光通過。另一個帶通濾波器8用于只選擇性地使從樣品發(fā)射到傳感器部件78的熒光通過。 另外，菲涅爾透鏡3用于使激發(fā)光平行。 近來，已經引進了實時PCR實驗，在該實驗中，同時使用各種顏色的熒光探針。然而，在常規(guī)技術中，如果所使用熒光探針的頻率不同，則根據熒光探針不同而需要不同的二 向色分光器。因此，在傳統(tǒng)技術中，帶通濾波器7和8以及二向色分光器6合并成單個模塊， 并且在根據熒光探針改變模塊時得到數據。例如，如果使用了五種帶通濾波器，則需要五種 二向色分光器來匹配帶同濾波器。 另外，在傳統(tǒng)技術中使用的二向色分光器的情況下，由于激發(fā)光通常比樣品產生 的熒光亮105倍，因此不能完全將激發(fā)光和熒光分開。另外，激發(fā)光被光路上的光學組件反 射的光入射到熒光檢測部件上，與樣品產生的熒光發(fā)生干涉。
造成激發(fā)光反射的因素包括 1)用于使激發(fā)光平行的菲涅爾透鏡3;2)用于防止反應管2a中的樣品蒸發(fā)的蓋 子2b或透明帶以及3)反應管本身。

發(fā)明內容
技術問題 本發(fā)明的目的在于分離激發(fā)光和熒光(不管頻率如何)，并且在不使用傳統(tǒng)用于 劃分激發(fā)光和熒光的二向色分光器的情況下，利用光的偏振特性，通過使激發(fā)光和熒光彼 此具有不同方向的偏振分量，防止激發(fā)光中的反射光入射到熒光檢測部件。
技術方案 實時聚合酶鏈式反應(PCR)監(jiān)控裝置包括偏振轉換器102，該偏振轉換器102用 于轉換光源100激發(fā)出的激發(fā)光；聚光透鏡103，該聚光透鏡103用于將偏振轉換器102轉 換的偏振光聚光；光隧道104，該光隧道104用于使聚光透鏡103所聚集的偏振光轉換成均 勻的表面光并將其傳送；第一帶通濾波器105，該第一帶通濾波器105用于使光隧道104所 傳送的表面光中具有特定頻率的偏振光能夠從其通過，所述具有特定頻率的偏振光與熒光 探針的激發(fā)特性匹配；偏振分光器108，該偏振分光器108用于分離出穿過所述第一帶通濾 波器105的所述具有特定頻率的偏振光；表面鏡109，該表面鏡109用于將所述偏振分光器 108沿著特定方向分離的偏振光傳送到樣品，并且反射所述樣品所產生的熒光，以將所述熒 光傳送到所述偏振分光器108 ;第一偏振器lll，該第一偏振器lll偏振所述激發(fā)光，以使得 所述表面鏡109所反射的熒光具有與傳送到偏振分光器108的偏振光相同的分量，其中，只 有與所述激發(fā)光的方向不同方向的偏振分量被反射并傳送到熒光檢測透鏡113，并且被所 述偏振轉換器102轉換；以及熒光檢測透鏡113，該熒光檢測透鏡113用于接收由所述樣品 產生的熒光。 所述PCR監(jiān)控裝置還可以包括第二偏振器107，該第二偏振器107用于使所述熒光 偏振，以使其具有與偏振轉換器102和第一偏振器111相反的分量，從而防止偏振的激發(fā)光 被反射并入射到熒光檢測部件。 所述PCR監(jiān)控裝置還可以包括第二帶通濾波器112，該第二帶通濾波器112用于使 得從穿過所述第一偏振器111的偏振激發(fā)光產生的熒光中具有特定頻率的熒光能夠從其 通過，所述具有特定頻率的熒光與熒光探針的發(fā)射特性匹配。 所述PCR監(jiān)控裝置還可以包括設置在所述光源100和所述偏振轉換器102之間用
于截止紫外線(UV)和紅外線(IR)的UV和IR截止濾波器101。 所述PCR監(jiān)控裝置還可以包括用于容納所述樣品的樣品容器。
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所述樣品容器優(yōu)選地是從設置有管或多井板、培養(yǎng)皿、載玻片、寺崎板、PCR板的容 器中選擇的任意一種。


從下面結合附圖對優(yōu)選實施方式的描述中，本發(fā)明的以上和其它目的、特征和優(yōu) 點將變得清楚，在附圖中 圖1是示出了傳統(tǒng)實時PCR監(jiān)控裝置的視圖。 圖2是示出了根據本發(fā)明實施方式的實時PCR監(jiān)控裝置的立體圖。 圖3是示出了光的偏振特性的視圖。 圖4是示出了偏振分光器的偏振特性的視圖。 圖5是當使用非偏振光學系統(tǒng)時從熒光檢測部件拍攝反應管(板)的照片。
圖6是當使用根據本發(fā)明實施方式的光學系統(tǒng)時從熒光檢測部件拍攝反應管
(板)的照片[主要元件的詳細說明]
100光源101UV和IR截止濾波器102偏振轉換器103聚光透鏡104光隧道105第一帶通濾波器106聚焦透鏡107第二偏振器108偏振分光器109表面鏡110菲涅爾透鏡111第一偏振器112第二帶通濾波器113熒光檢測透鏡
具體實施例方式
下文中，將參照附圖詳細描述本發(fā)明的實施方式。 本發(fā)明提供了一種裝置，該裝置使用光的偏振特性將來自樣品的激發(fā)光和熒光有 效分離。 圖2是示出了根據本發(fā)明實施方式的實時PCR監(jiān)控裝置的立體圖；圖3是示出了 光束偏振特性的視圖；圖4是示出了偏振分光器的偏振特性的視圖；圖5是當使用非偏振 光學系統(tǒng)時從熒光檢測部件拍攝反應管(板)的照片；并且圖6是當使用根據本發(fā)明實施 方式的光學系統(tǒng)時從熒光檢測部件拍攝反應管(板)的照片。 如圖所示，根據本發(fā)明實施方式的實時PCR監(jiān)控裝置包括偏振轉換器102，用于 使光源100激發(fā)出的激發(fā)光偏振；聚光透鏡103，用于將偏振轉換器102轉換的偏振光聚光；光隧道104，用于使聚光透鏡103所聚集的偏振光成為均勻的表面光；第一帶通濾波器 105，用于使光隧道104傳送的偏振光通過；偏振分光器108，用于將穿過第一帶通濾波器 105的偏振光與熒光分離；表面鏡109，用于將具有特定方向的偏振光傳送到樣品，并且反 射樣品所產生的熒光；第二偏振器，用于使表面鏡109所反射的熒光偏振；第二帶通濾波器 112，用于只使得第二偏振器所傳送的熒光中與熒光探針特性匹配的具有特定頻率的熒光 能夠從其通過；以及熒光檢測透鏡113，用于接收通過第二帶通濾波器112的熒光。
根據本發(fā)明的實時PCR監(jiān)控采用了熒光檢測的方法，該方法使用了本發(fā)明的發(fā)明 者在韓國專利特許公開10-2006-0009246 (名為"實時監(jiān)控生化反應的裝置")中公開的熒 光劑。 光源100的實施例可以包括白色光源(例如，鎢-鹵素燈、氙放電燈等)和單色光 源(例如，激光器等)。就特定的激光器而言，激光器自身發(fā)射偏振光。 從用于產生激發(fā)光的光源100發(fā)射的光具有平行光的特性和非偏振光的特性。這 種光具有S波和P波分量，如圖4所示。換言之，這種光由相對于前進方向彼此垂直的S波 和P波組成。 從光源100發(fā)射的光一般具有可見光以及紫外光(UV)和紅外光(IR)的分量。因 此，為了去除對于光學系統(tǒng)不必要的UV和IR分量，優(yōu)選地要設置UV和IR截止濾波器101， 用于去除UV和IR分量。 偏振轉換器102用于轉換激發(fā)光，使其關于特定方向具有相同的極性。換言之， 偏振轉換器102用于轉換入射的非偏振光束，使其具有單一極性。使用偏振轉換器102的 原因在于由于當從由S波和P波組成的光中去除一個極性而只得到另一個極性時整個光 強度降低至小于50%，因此可以通過將待去除的極性分量轉換成與使用目標匹配的極性分 量，來提高光的使用效率。 聚光透鏡103對偏振轉換器102所轉換的偏振光進行聚光，以使得轉換后的偏振 光入射到具有小尺寸的光隧道104。 光隧道104用作產生均勻表面光的裝置，如W02004/088291所公開的。 第一帶通濾波器105只使得光隧道104所傳送的偏振激發(fā)光中具有特定頻率的偏
振激發(fā)光從其通過，所述具有特定頻率的偏振激發(fā)光與熒光探針的激發(fā)特性匹配。 本發(fā)明對傳統(tǒng)問題的改進在于，當使用各種熒光探針時，根據各個熒光探針應該
使用不同的帶通濾波器，因此應該使用不同種類的二向色分光器(圖1中的參考標號6)
(例如，五組帶通濾波器也需要五個二向色分光器)，并且因此可以在不使用二向色分光器
的情況下將熒光和激發(fā)光分離。 偏振分光器108是一個光學部件，它將入射到它上面的非偏振光分離成具有一個 偏振分量的光和具有其它偏振分量的光，使這兩種光之間形成90度的角度。換言之，在圖 2中，非偏振激發(fā)光被沿著④方向分離。 偏振分光器108將穿過第一帶通濾波器105的特定頻率的激發(fā)光劃分成各個偏振 由偏振分光器108分離的偏振光被傳送到表面鏡109，偏振光中的剩余部分從相 反方向向著熒光檢測透鏡113分離，S卩沿著④方向分離。 在本發(fā)明中，為了進行說明，偏振轉換器102將非偏振光轉換成S波。當然，即使
6當非偏振光束被轉換成P波時，通過調節(jié)偏振器和偏振轉換器的角度也可以得到相同的效 果。 因此，激發(fā)光分量的S波穿過偏振分光器108， P波被偏振分光器108反射并且沿 著@方向入射。因此，只有S波分量的激發(fā)光通過表面鏡109被傳送到樣品。
此時，優(yōu)選地，還設置用于容納樣品的樣品容器。 樣品容器優(yōu)選地是從設置有管或多井板、培養(yǎng)皿、載玻片、寺崎板、PCR板的容器中 選擇的任意一種，但是可以使用能夠容納和測量樣品的任意樣品容器。
另外，優(yōu)選地，在第一帶通濾波器105和偏振分光器108之間設置了聚焦透鏡106， 用于產生與容納樣品的樣品容器的尺寸對應的均勻表面光。聚焦透鏡106散播表面光，以 使得在激發(fā)光到達容納樣品(其熒光待檢測)的管(板)時，激發(fā)光的強度是均勻的。
表面鏡109將來自偏振分光器108的分離后的偏振光傳送到樣品，并且反射樣品 所產生的熒光，以將其傳送到偏振分光器108。換言之，表面鏡109只是用于改變光路。
菲涅爾透鏡110用于使表面鏡109所反射的激發(fā)光成為平行光，以使得光良好地 到達容納樣品的管。所得的入射激發(fā)光使得熒光探針被激發(fā)并由此發(fā)射熒光。樣品所產生 的熒光通過菲涅爾透鏡和偏振分光器入射到熒光檢測部分。 第一偏振器111用于在激發(fā)光入射到偏振分光器108之前最大程度地去除不必要 方向的偏振分量，這是由于當偏振轉換器102偏振的激發(fā)光穿過光學部件(即，聚光透鏡 103、光隧道104、聚焦透鏡106等)時可以分散激發(fā)光的偏振特性。換言之，第一偏振器111 用于在S波分量的偏振激發(fā)光穿過光路時去除通過分散偏振光而產生的少量P波分量。
樣品所產生的熒光還具有非偏振光特性，因此同時具有S波和P波分量。當具有 該特性的熒光入射到如圖4所示的偏振分光器108時，P波被反射然后輸入到熒光檢測透鏡 113，S波穿過偏振分光器108，然后入射到激發(fā)光光源。第二偏振器107與第一偏振器111 的種類相同但是旋轉了 90度，從而只是使P波能夠穿過。因此，第二偏振器107用于去除 可能沒有被偏振分光器108完全去除的S波分量的光。 在此，即使激發(fā)光在光路上被反射并且因此入射到熒光檢測透鏡113，由于其S波 的特性，激發(fā)光通過偏振分光器再次入射到激發(fā)光光源，并且還被第二偏振器107阻擋。因 此，激發(fā)光不能入射到熒光檢測透鏡113. 反射到表面鏡109的熒光傳送到偏振分光器108，并且變成具有與第一偏振器111
和偏振轉換器102所轉換的偏振光相反的分量。換言之，激發(fā)光和熒光具有彼此不同的極
性。因此，由于激發(fā)光的干涉不會對熒光產生影響，可以有效分離熒光。 如上所述，在本發(fā)明中，通過使激發(fā)光具有單個偏振分量，去除單個偏振分量并且
使剩余的偏振分量通過，將剩余的偏振分量傳送到收集樣品所輸出熒光的熒光檢測部件處
的熒光檢測傳感器，從而可以有效地去除激發(fā)光。 第二帶通濾波器112只是使第二偏振器107傳送的偏振熒光中具有特定頻率的熒 光穿過，該熒光與熒光探針的發(fā)射特性匹配。 熒光檢測透鏡113接收穿過第二帶通濾波器112的熒光，并且設置有熒光探針 (未示出)以從樣品收集熒光。透鏡113將樣品所產生的熒光聚焦到圖像傳感器。
優(yōu)選地，本發(fā)明的實時PCR監(jiān)控裝置還設置有第一偏振器111 ，用于偏振沒有被偏 振轉換器102轉換的激發(fā)光。由于在偏振光穿過光學部件時會破壞偏振特性，因此第一偏
7振器111用于作為在偏振分光器108之前使用的預偏振器來保持偏振特性，以提高偏振分 光器108的光束分離效率。 另外，本發(fā)明的實時PCR監(jiān)控裝置還可以包括UV和IR截止濾波器IOI，該截止濾 波器101設置在光源100和偏振轉換器102之間，用于截止UV和IR。 本發(fā)明的特征在于，激發(fā)光和熒光具有彼此不同的偏振特性，因此激發(fā)光對熒光 的干涉程度最小，從而防止了激發(fā)光被光路上的特定光學部件、蓋子(圖1中的參考標號 2b)或透明帶、反應管(圖1中參考標號2a)等反射并且防止了其入射到熒光檢測部件，蓋 子或透明帶用于防止樣品的蒸發(fā)。由于反射后的偏振光仍然具有相同的偏振特性，因此可 以有效地劃分激發(fā)光和熒光。 圖5是當使用非偏振光學系統(tǒng)時從熒光檢測部件拍攝到的反應管(板)的照片。 在該照片中，在中部的左側和右側示出了容納熒光探針的井，并且在中部的若干井示出了 反射光的亮度。 圖6是當使用根據本發(fā)明實施方式的光學系統(tǒng)時從熒光檢測部件拍攝到的反應 管(板)的照片。如圖所示，在中下部的反射光完全消失。
工業(yè)應用性 在常規(guī)實時PCR監(jiān)控裝置中，不可能只收集由樣品產生的熒光，這是由于激發(fā)光 被位于光路上的光學部件(例如，菲涅爾透鏡、玻璃加熱器等)、蓋子或透明帶、反應管等反 射，然后入射到熒光檢測部件，其中，蓋子或透明帶用于防止樣品蒸發(fā)。當處理大規(guī)模的樣 品時，樣品的數量減小，因此樣品所產生的熒光量也減小。這導致了更嚴重的問題。
通過改進由于激發(fā)光造成的干涉問題，本發(fā)明的實時PCR監(jiān)控裝置的優(yōu)點在于， 激發(fā)光和熒光具有彼此不同的極性，因此激發(fā)光的干涉不會對熒光產生影響。另外，在本 發(fā)明的實時PCR監(jiān)控裝置中，由于可以在不使用二向色分光器的情況下，只使用一個偏振 分光器將激發(fā)光和熒光分開(不管帶通濾波器的頻率和數量如何)，從而接收熒光，因此不 必安裝多個二向色分光器的變化，并且不需要根據每個頻率來設置二向色分光器的機械組 件，因此非常 濟。
權利要求
一種實時聚合酶鏈式反應監(jiān)控裝置，該裝置包括聚光透鏡(103)，該聚光透鏡(103)用于對光源(100)所產生的激發(fā)光進行聚光；光隧道(104)，該光隧道(104)用于將所述聚光透鏡(103)所聚集的激發(fā)光轉換成均勻的表面光并將其傳送；第一帶通濾波器(105)，該第一帶通濾波器(105)用于使所述光隧道(104)所傳送的表面光中具有特定頻率的偏振光能夠從其通過，所述具有特定頻率的偏振光與熒光探針的激發(fā)特性匹配；第一偏振器(111)，該第一偏振器(111)用于使穿過所述第一帶通濾波器(105)的具有特定頻率的激發(fā)光偏振；偏振分光器(108)，該偏振分光器(108)用于分離出穿過所述第一偏振器(111)的具有特定頻率的偏振光；表面鏡(109)，該表面鏡(109)用于將從所述偏振分光器(108)劃分出的偏振光傳送到樣品，并且反射所述樣品所產生的熒光，以將所述熒光傳送到所述偏振分光器(108)；第二偏振器(107)，該第二偏振器(107)用于使所述熒光偏振，以使得所述表面鏡(109)所反射的所述熒光具有與傳送到所述偏振分光器(108)并被第一偏振器(111)轉換的偏振光相反的分量；第二帶通濾波器(112)，該第二帶通濾波器(112)用于使得從所述第二偏振器(107)所傳送的偏振熒光中具有特定頻率的熒光能夠從其通過，所述具有特定頻率的熒光與熒光探針的發(fā)射特性匹配；以及熒光檢測透鏡(113)，該熒光檢測透鏡(113)用于接收穿過所述第二帶通濾波器(112)的熒光。
2. 根據權利要求1所述的實時聚合酶鏈式反應監(jiān)控裝置，該裝置還包括偏振轉換器(102)，該偏振轉換器(102)用于將具有由所述第一偏振器(111)去除的偏振分量的所述激發(fā)光轉換成具有能夠穿過所述第一偏振器(111)的偏振分量的所述激發(fā)光。
3. 根據權利要求1或2所述的實時聚合酶鏈式反應監(jiān)控裝置，該裝置還包括樣品容器，該樣品容器用于容納所述樣品。
4. 根據權利要求3所述的實時聚合酶鏈式反應監(jiān)控裝置，其中，所述樣品容器是從設置有管或多井板、培養(yǎng)皿、載玻片、寺崎板、聚合酶鏈式反應板的容器中選擇的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實時PCR監(jiān)控裝置，該實時PCR監(jiān)控裝置用于實時監(jiān)控在對于各種微量樣品執(zhí)行核酸擴增(例如PCR)時在反應期間生成的反應產物的生成。具體來講，本發(fā)明涉及一種實時監(jiān)控生化反應的裝置，該裝置用于有效劃分激發(fā)光和熒光之間的干涉，并且包括偏振器、偏振分光器、偏振轉換器等。
文檔編號C12Q1/68GK101784672SQ200880022420
公開日2010年7月21日 申請日期2008年6月17日 優(yōu)先權日2007年6月28日
發(fā)明者崔壹奎, 樸翰怡, 樸翰悟 申請人:株式會社百奧尼