專利名稱：：克隆核酸序列的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。微生物是用于擴(kuò)增和表達(dá)核酸的有吸引力的宿主。編碼蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)是產(chǎn)生足夠量的目的蛋白質(zhì)(例如如(治療性)酶)的一種重要工具。已確立的表達(dá)宿主為大腸桿菌和酵母。但是，這一方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)并非總具有天然的構(gòu)型，或者它們根本無法產(chǎn)生。例如，蛋白質(zhì)并非總能由產(chǎn)生它們的微生物正確地折疊，并有可能包含不想要的翻譯后修飾。異源表達(dá)處于功能性感受態(tài)的大的多組件和膜蛋白質(zhì)通常在已確立的表達(dá)宿主大腸桿菌和酵母中存在問題。因此急需替代的表達(dá)系統(tǒng)來克服結(jié)構(gòu)基因組工程中的這一主要障礙。經(jīng)常地，有效的DNA操作成為探索新型宿主的蛋白質(zhì)表達(dá)可能性的瓶頸，因而阻礙了快速和例行的篩選。在大腸桿菌及替代的宿主中復(fù)制的穿梭載體提供了一條出路，但是由于需要雙重復(fù)制因子(dualr印licationfactor)和多個選擇標(biāo)記而使得它們的使用非常復(fù)雜。這增大了質(zhì)粒的大小，且通常損害其穩(wěn)定增殖。例如，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)被廣泛認(rèn)為可作為基于大腸桿菌和酵母的表達(dá)系統(tǒng)的吸引人的一種替代。但是，生物體中基因操作的低效率以及乳酸乳球菌_大腸桿菌穿梭載體的不穩(wěn)定性嚴(yán)重阻礙了乳酸乳球菌中的表達(dá)篩選。此外，缺乏有效的克隆程序已經(jīng)限制了在乳酸乳球菌中用于定向進(jìn)化研究的大的基因文庫的制備；類似的局限性還阻礙了完全地利用其它微生物作為表達(dá)和篩選宿主。本發(fā)明的目的在于提供在微生物中克隆目的核酸的替代的裝置和方法。優(yōu)選地，本發(fā)明提供了在微生物中克隆目的核酸的裝置和方法，與大腸桿菌相比，該微生物較不適于常規(guī)的核酸操作。因此，本發(fā)明提供了在第一種微生物中克隆目的核酸序列的方法，該方法包括_將所述目的核酸插入核酸載體，該載體包含第二種微生物的復(fù)制起點；-在所述第二種微生物的培養(yǎng)中克隆所述載體；-分離包含所述目的核酸序列的克隆載體；-使用所述第一種微生物的復(fù)制起點取代載體的第二種微生物的復(fù)制起點；禾口-在所述第一種微生物的培養(yǎng)中克隆得到的載體。優(yōu)選地，所述第一種生物體不同于第二種生物體，例如，它們可能需要截然不同的因子來穩(wěn)定地增殖克隆的載體。最優(yōu)選地，與所述第二種微生物相比，所述第一種生物體屬于另一種和/或?qū)佟Ｒ虼?，?yōu)選的實施方式提供了本發(fā)明的方法，其中，所述第一種生物體和所述第二種生物體互不相同。它們優(yōu)選屬于不同的種和/或?qū)?。通過本發(fā)明的方法，有可能在與大腸桿菌相比較不適于常規(guī)核酸操作的微生物中有效地克隆目的核酸序列。本發(fā)明使得能夠在第一種微生物中高通量地克隆(和優(yōu)選地表達(dá))目的核酸，而目的核酸的初始(優(yōu)選高通量)克隆是在第二種微生物中進(jìn)行的。優(yōu)選地，第二種生物體使用本領(lǐng)域可獲得其復(fù)制起點(ori)的，和/或可獲得其選擇標(biāo)記(例如如抗生素選擇標(biāo)記)的生物體。所述第二種微生物優(yōu)選為大腸桿菌。所述第一種微生物優(yōu)選為大腸桿菌以外的任何微生物。不需要穿梭載體。通過本發(fā)明的方法，有可能利用所述第一種和所述第二種微生物兩者的克隆性質(zhì)。所述第二微生物優(yōu)選為具有高克隆效率的一種微生物，例如大腸桿菌。所述第一種微生物優(yōu)選包含所關(guān)注的表達(dá)性質(zhì)。所述第一種微生物例如優(yōu)選能夠產(chǎn)生具有理想的構(gòu)型的目的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的方法的第一步中，目的核酸被插入核酸載體中，該載體包含第二種微生物的復(fù)制起點(ori)。核酸載體的定義為包含核酸的化合物。優(yōu)選地，所述核酸載體由核酸組成。術(shù)語"核酸"包括包含天然核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶)和/或非天然核苷酸(例如如肌苷)的序列。術(shù)語"核酸"還包括人工的核酸類似物，例如如但不局限于肽核酸(PNA)。所述核酸載體優(yōu)選包括質(zhì)?；蜉d體。在這一第一步驟中，使用包含第二種微生物的復(fù)制起點的核酸載體。所述復(fù)制起點為開始核酸載體復(fù)制必需的核酸區(qū)域。第二種微生物的復(fù)制起點被所述第二種微生物的核酸復(fù)制機(jī)構(gòu)識別。不同的微生物需要不同種類的復(fù)制起點；微生物的起點識別蛋白質(zhì)(例如大腸桿菌中的DnaA)能夠結(jié)合復(fù)制起點。識別之后開始進(jìn)行復(fù)制，這需要對特定的微生物具有特異性的附加蛋白質(zhì)。因此，必須選擇被所選擇的微生物識別的復(fù)制起點。如果選擇大腸桿菌作為第二種微生物，使用例如來自pBR322、pSC101或pl5A的大腸桿菌復(fù)制起點。如果選擇枯草芽孢桿菌(B.subtilis)作為第二種微生物，則使用例如來自pAMP1或pC194的枯草芽孢桿菌復(fù)制起點。但是，所選擇的微生物的任何復(fù)制起點都是合適的。使用本領(lǐng)域中的任何克隆方法將目的核酸插入核酸載體中。在一個優(yōu)選實施方式中，使用選自非連接依賴克隆(LigationInd印endentCloning)(LIC)方法、Gateway、通用載體質(zhì)粒融合系統(tǒng)(UnivectorPlasmid-fusionSystem)(UPS)和源自LIC的方法例如無酶克隆(Enzyme-FreeCloning)(EFC)或非序列和連接依賴克隆(SequenceandLigationInd印endentCloning)(SLIC)的方法，所述目的核酸被插入所述第一載體，并在所述第二種微生物的培養(yǎng)中進(jìn)行克隆。在一個實施方式中，使用非連接依賴克隆(LIC)方法(Aslanidis和deJong，1990)。與依賴于重組事件的方法(例如Gateway(Walhout等人，2000)或通用載體質(zhì)粒融合系統(tǒng)(UPS)(Liu等人，1998))相反，非連接依賴克隆在設(shè)計基因的側(cè)翼序列時限制較小。因此，連接到重組蛋白質(zhì)上的克隆相關(guān)序列可被最小化。圖IB示意性地描繪了LIC方法的一個實施方式。LIC克隆方法的這個實施方式包括通過在LIC盒(cassette)中間的唯一SwaI位點上的限制使得載體線性化，然后使用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理來產(chǎn)生與核酸序列(例如PCR產(chǎn)物)的懸端互補(bǔ)的長的、限定的單鏈懸端?；旌袭a(chǎn)生的載體和核酸序列，并通過例如使用CaCl2的化學(xué)轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主中。LIC盒之前是對于預(yù)期的表達(dá)宿主特異性的啟動子區(qū)。核酸產(chǎn)物的非連接依賴克隆證實了其對于大腸桿菌載體的高有效性，表明了載體和插入物的互補(bǔ)懸端的長度和組成足以形成穩(wěn)定的異源雙鏈。與之相反的是，用LIC載體和匹配(compatible)的插入物的穩(wěn)定異源雙鏈直接轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌不產(chǎn)生或只產(chǎn)生非常少的陽性克隆。因此，第二種微生物優(yōu)選選擇允許有效地進(jìn)行克隆的微生物，例如但不局限于大腸桿菌。在本發(fā)明的方法的第二步驟中，分離了包含目的核酸的克隆的載體。這是使用本領(lǐng)域已知的任何核酸分離方法進(jìn)行的，例如如Birnboim和Doly(1979)的方法。接下來，克隆的載體的復(fù)制起點由第一種微生物的復(fù)制起點進(jìn)行替代。這優(yōu)選使用重組酶或甚至更優(yōu)選使用限制性酶進(jìn)行。在這種情況下，載體被設(shè)計成為重組酶位點或限制性酶識別序列位于第二種微生物的復(fù)制起點之前。第二重組酶位點或限制性酶識別序列優(yōu)選位于所述復(fù)制起點之后。在與重組酶或識別所述序列的限制性酶一起進(jìn)行孵育時，識別位點被從載體上切除掉。隨后，第一微生物的復(fù)制起點插入到載體中。得到的載體優(yōu)選基本不含源自所述第二種微生物的元件，以使得載體在所述第一種微生物中有效克隆和穩(wěn)定性最大化。因此，使用本發(fā)明的方法，不是必需使用穿梭載體。這是有利的，因為任何附加的序列都會增加得到的載體的大小。為了能夠有效地進(jìn)行克隆，得到的載體的大小優(yōu)選盡可能的小。此外，越小的載體越穩(wěn)定。因此，附加的外源序列的存在不必要地增大了得到的載體，降低了穩(wěn)定性，并降低了允許具有的目的核酸序列的最大大小。因而其中得到的載體基本上不含源自所述第二種微生物的元件的本發(fā)明的實施方式是優(yōu)選的。基本上不含是指得到的載體包含不多于15個、優(yōu)選不多于IO個源自所述第二種微生物的核苷酸。此外，得到的載體優(yōu)選包含不多于100個、更優(yōu)選不多于50個、最優(yōu)選不多于30個起源自原始載體的重組酶識別位點和/或限制性酶識別位點的"外源"核苷酸。圖1A示意性地示出了非限制性的、優(yōu)選的實施方式。根據(jù)這個實施方式，目的核酸被插入包含大腸桿菌復(fù)制起點的第一載體中。所述載體在大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。接下來，分離載體并使用Sfil限制性酶切割，優(yōu)選在包含側(cè)翼為相似的Sfil位點的乳酸乳球菌復(fù)制起點的另一載體的存在下。使用T4DNA連接酶和ATP處理時，第一載體的大腸桿菌復(fù)制起點隨后在載體的相當(dāng)部分被乳酸乳球菌復(fù)制起點替代。當(dāng)然，本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括許多替代的實施方式。任何交換復(fù)制起點的方式都是合適的。在本發(fā)明方法的接下來的步驟中，將得到的包含目的核酸序列和第一種微生物的復(fù)制起點的核酸載體轉(zhuǎn)化到所述第一種微生物中。所述目的核酸序列優(yōu)選在所述第一種微生物中表達(dá)。在可獲得質(zhì)粒的任何微生物中有效克隆和表達(dá)目的核酸的這種方式已經(jīng)成為可能。由于本發(fā)明允許使用更適于(高通量)克隆的第二種微生物，許多第一種微生物的克隆效率的局限性至少可以部分地得以避免。在一個優(yōu)選的實施方式中，使用至少兩種核酸載體。一種載體包含第一種微生物的復(fù)制起點，一種載體包含第二種微生物的復(fù)制起點。將目的核酸序列插入包含第二種微生物的復(fù)制起點的載體中，并將產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化到所述第二種微生物中。接下來，包含目的核酸序列的載體的復(fù)制起點被其它載體的復(fù)制起點替代，然后將產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化到第一種微生物中。因此，優(yōu)選的實施方式提供了本發(fā)明的方法，包括-提供包含所述第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；-向所述第一載體引入目的核酸序列；-提供包含所述第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；禾口-使用所述第二載體的包含所述第一微生物的所述復(fù)制起點的部分替代所述第一載體的包含所述第二微生物的所述復(fù)制起點但不包含所述目的核酸的部分。優(yōu)選地，所述第二載體包含所述第一種微生物的完整復(fù)制起點。在一個替代的實施方式中，所述第二載體包含所述第一種微生物的復(fù)制起點的一部分。在這一實施方式中，所述第一載體優(yōu)選還包含所述第一種微生物的所述復(fù)制起點的一部分，該部分優(yōu)選不存在于所述第二載體中。在目的核酸被插入到所述第一載體之后，包含所述第一種微生物的所述復(fù)制起點一部分的所述第二載體的序列優(yōu)選被插入所述第一載體中。在一個實施方式中，存在于所述第一載體中的所述第一種微生物的所述復(fù)制起點的部分與存在于所述第二載體中的所述第一種微生物的所述復(fù)制起點的部分功能性地連接在一起，因而所述部分能夠在一起發(fā)揮作用。所述第二載體優(yōu)選包含所述第一種微生物的所述復(fù)制起點的主要部分，更優(yōu)選包含其功能性部分。本發(fā)明還提供了用于進(jìn)一步優(yōu)化核酸操作效率的裝置和方法。本發(fā)明人已認(rèn)識到，為了提高克隆效率，優(yōu)選使用產(chǎn)生互不匹配的不同的、非回文懸端的限制性酶。這樣的限制性酶的非限定性的例子為Sfil、S即I、Ksp632工、Aarl、Bgll、PflMI和BstXI。所述限制性酶優(yōu)選識別在原核生物和真核生物基因組中很少出現(xiàn)的核酸序列，因此很好地避免目的核酸插入物的非目的性切割。原則上，識別位點具有越特異性的堿基對，其出現(xiàn)在特定的核酸序列中的幾率就越小。Ksp6321、Bgll、PflMI和BstXI的識別位點具有6個特異性的堿基對，S即I和Aarl的識別位點具有7個特異性的堿基對，而Siil的識別位點具有8個特異性的堿基對。因此，為了更好地避免目的核酸插入物序列的非目的性切割，本發(fā)明的方法優(yōu)選使用S即I、Aarl或Sfil進(jìn)行。最優(yōu)選地，使用Sfil。使用Sfil是特別優(yōu)選的，因為對于本領(lǐng)域中可獲得的產(chǎn)生互不匹配的不同的、非回文懸端的其它限制性酶而言，基因組中更頻繁地出現(xiàn)被識別的核酸序列，和/或其突出序列(protrudingsequences)的最大組合少于SfiI的突出序列的最大組合。因此，使用SfiI是特別有效的。此外，優(yōu)選使用在其中T4DNA連接酶有活性的同種緩沖液中有活性的限制性酶，從而在一個實施方式中，進(jìn)行使用至少一種限制性酶的切割反應(yīng)和使用T4DNA連接酶的連接反應(yīng)而不需改變反應(yīng)緩沖液，僅向緩沖液補(bǔ)充T4連接酶和ATP便足以開始連接反應(yīng)。Sfil在其中T4DNA連接酶有活性的同種緩沖液中是有活性的。因此，由于此種性質(zhì)，Sfil也是優(yōu)選的。匹配是指由于兩個核酸序列由于包含足夠長的單鏈互補(bǔ)序列而能夠互相結(jié)合。因此，互不匹配的核酸序列不能相互退火，因為它們不包含足夠長的單鏈互補(bǔ)序列。特別優(yōu)選的限制性酶為Sfil。Sfil識別5'GGCCNNNNNGGCC3'序列(N為任意核苷酸)。該序列被切割在5'GGCCNNNN'NGGCC3'3'CCGGN'NNNNCCGG5'因此，產(chǎn)生了NNN的懸端。因此，如圖1C所示，Sfil的核酸切割產(chǎn)生可以由三個核苷酸的任意組合組成的3'懸端。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方式中，使用的第一核酸載體優(yōu)選包含兩個不同的Sfil位點，其為第二種微生物的復(fù)制起點的側(cè)翼，該Sfil位點在與Sfil—起孵育時產(chǎn)生互不匹配的不同的、非回文懸端。與Sfil的孵育產(chǎn)生不含所述第二種微生物的復(fù)制起點的切割載體。已被Sfil切割的該載體的兩個末端不會相互發(fā)生退火。根據(jù)進(jìn)一步優(yōu)選的實施方式，所述兩個末端能夠與包含不同的復(fù)制起點的第二核酸發(fā)生退火。這樣，所述第二核酸被非常高效地引入所述載體中。包含不同復(fù)制起點的所述第二核酸優(yōu)選源自包含所述側(cè)鄰Sfil位點的復(fù)制起點的第二核酸載體。選擇Sfil位點使得產(chǎn)生的懸端與已經(jīng)過Sfil切割的上述載體的Sfil懸端匹配。與Sfil—起孵育時，第二載體被切割，并得到了包含帶有能與已經(jīng)過SfiI切割的所述第一載體發(fā)生退火的Sfil懸端的第一種微生物的復(fù)制起點的核酸序列。因此，一個優(yōu)選的實施方式提供了在第一種微生物中克隆目的核酸序列的方法，該方法包括-提供包含所述第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；-向所述第一載體引入目的核酸序列；-提供包含所述第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；禾口-使用所述第二載體的包含所述第一微生物的所述復(fù)制起點的部分代替所述第一載體的包含所述第二微生物的所述復(fù)制起點但不包含所述目的核酸的部分，其中所述第一載體的所述部分具有互不匹配的不同的、非回文懸端。優(yōu)選地，所述懸端與所述第二載體的所述部分的懸端匹配。所述部分優(yōu)選用Sfil切割所述載體而獲得。本發(fā)明的方法的優(yōu)勢在于，所述第一和第二載體的操作無需純化載體片段即可進(jìn)行。因此，本發(fā)明的方法使得樣品處理最少化以及允許方法自動化。本發(fā)明的方法包括將目的核酸序列轉(zhuǎn)化到微生物中。為了選擇包含目的核酸序列的微生物，優(yōu)選使用選擇標(biāo)記。優(yōu)選地，使用包含第一種微生物的復(fù)制起點和第一選擇標(biāo)記的核酸序列。另外地，或可選地，優(yōu)選使用包含第二種微生物的復(fù)制起點和第二選擇標(biāo)記的核酸序列。合適的選擇標(biāo)記的非限定的例子為提供對酶和/或抗生素作用的耐受性的基因，例如如氯霉素耐藥性基因或e-內(nèi)酰胺抗生素耐藥性基因?？蛇x地，或另外地，使用的選擇標(biāo)記在核酸序列優(yōu)選被表達(dá)的微生物中補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷(例如生物合成缺陷)(例如如編碼丙氨酸消旋酶的alr基因(Bron等人，2002))，或者使得能夠基于可選的選擇過程進(jìn)行選擇(例如如編碼小熱休克蛋白質(zhì)的shsp基因(ElDemerdash等人，2003))。如果核酸序列與選擇標(biāo)記相結(jié)合，則通過確定是否存在選擇標(biāo)記來確定微生物中所述核酸序列的存在。例如，第二種微生物的復(fù)制起點與e-內(nèi)酰胺酶耐受性基因相結(jié)合。轉(zhuǎn)化之后，得到的微生物在e-內(nèi)酰胺酶的存在下進(jìn)行增殖。明顯增殖的微生物攜帶P-內(nèi)酰胺酶耐受性基因，這說明它們也攜帶了第二種微生物的復(fù)制起點。圖1A示意性地描述的使用選擇標(biāo)記的非限定性例子。包含大腸桿菌復(fù)制起點的載體具有目的核酸序列，并被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。該載體同時具有氯霉素耐藥性基因(cat)和e-內(nèi)酰胺酶耐受性基因(bla)。攜帶該載體的大腸桿菌微生物對e-內(nèi)酰胺酶有耐藥性。之后，大腸桿菌復(fù)制起點被乳酸乳球菌復(fù)制起點取代。產(chǎn)生的載體不再包含P-內(nèi)酰胺酶耐受性基因，但是包含乳酸乳球菌復(fù)制起點。因此，對氯霉素耐受的乳酸乳球菌克隆包含含有氯霉素耐藥性基因和乳酸乳球菌復(fù)制起點的核酸載體，乳酸乳球菌復(fù)制起點使得能夠在乳酸乳球菌中進(jìn)行核酸的增殖。當(dāng)然，許多其它的選擇標(biāo)記(選擇標(biāo)記的組合)也適于選擇目的微生物。因此，進(jìn)一步提供了在第一種微生物中克隆目的核酸序列的方法，該方法包括-提供包含第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；-向所述第一載體引入目的核酸序列；-提供包含所述第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；禾口-使用所述第二載體的包含所述第一微生物的所述復(fù)制起點的部分代替所述第一載體的包含所述第二微生物的所述復(fù)制起點但不包含所述目的核酸的部分，其中包含所述第二微生物的復(fù)制起點的所述第一載體的部分包含選擇標(biāo)記，例如如耐受性基因。在一個實施方式中，包含所述第一微生物的復(fù)制起點的所述第二載體包含不同的選擇標(biāo)記，例如如不同的耐受性基因。本發(fā)明的方法特別適于提高目的核酸序列在目的微生物中的克隆和表達(dá)的效率。優(yōu)選地，進(jìn)行第一克隆步驟，其中目的核酸被高效地插入核酸載體中，并在與最終在其中表達(dá)目的核酸的微生物相比具有更好的克隆性質(zhì)的另一種微生物中進(jìn)行克隆。優(yōu)選地，使用第二種與所述第一種微生物相比能夠更有效地克隆目的核酸的第二種生物體。例如，優(yōu)選使用其復(fù)制起點(ori)是本領(lǐng)域可獲得的和/或選擇標(biāo)記(例如如抗生素選擇標(biāo)記)是本領(lǐng)域可獲得的第二種生物體。因此，一個實施方式提供了在第一種微生物中克隆目的核酸序列的方法，該方法包括-提供包含第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；-向所述第一載體引入目的核酸序列；-在所述第二種微生物的培養(yǎng)中克隆所述載體；-提供包含所述第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；-使用所述第二載體的包含所述第一微生物的所述復(fù)制起點的部分代替所述第一載體的包含所述第二微生物的所述復(fù)制起點但不包含所述目的核酸的部分；禾口-在所述第一種微生物的培養(yǎng)中克隆產(chǎn)生的載體；其中，與將所述目的核酸插入所述第二載體并在所述第一種微生物的培養(yǎng)中進(jìn)行克隆的方法相比，將所述目的核酸插入所述第一載體并在所述第二種微生物的培養(yǎng)中進(jìn)行克隆的方法更加有效。在一個優(yōu)選實施方式中，所述第一種和所述第二種微生物為細(xì)菌。優(yōu)選地，所述第二種微生物為大腸桿菌，且所述第一種微生物為不同于大腸桿菌的微生物。本發(fā)明的方法特別適于高效地克隆目的核酸，并在本領(lǐng)域中沒有高效克隆方法的微生物中進(jìn)行所述目的核酸的表達(dá)。這樣的微生物在此被稱為頑固性微生物(recalcitrantmicro-organisms)。頑固性微生物在此被定義為使用現(xiàn)有的技術(shù)很難在其中克隆目的核酸的微生物。正如此處所使用的，如果在克隆過程中形成每微克核酸少于1000菌落形成單位的話，克隆目的核酸通常是非常困難的。通過頑固性微生物，難以以中至高通量的速率制備基因構(gòu)建體，意味著用連接混合物轉(zhuǎn)化這些微生物通常得到低的轉(zhuǎn)化效率(通常每微克DNA小于1000菌落形成單位)。正如此處所使用的，基因構(gòu)建體包含但不局限于待插入載體的同源基因和/或核酸序列。在一些實施方式中，所述基因構(gòu)建體包含已發(fā)生突變，例如通過易錯PCR，和需要篩選大的質(zhì)粒文庫的核酸序列。與現(xiàn)有技術(shù)方法，例如WO96/40724和W000/29000中公開的方法(其中，得到的目的載體在常規(guī)使用的大腸桿菌中克隆之后在載體之間進(jìn)行核酸序列交換)相反，本發(fā)明優(yōu)選的方法包括高效地克隆目的核酸，并在本領(lǐng)域沒有有效的克隆方法的大腸桿菌以外的微生物中、優(yōu)選為頑固性細(xì)菌中表達(dá)所述目的核酸。使用本發(fā)明的方法使得在頑固性微生物中進(jìn)行高通量表達(dá)過程成為可能。表3給出了本領(lǐng)域公知的頑固性微生物的非限定性列表。但是，還知道更多其它頑固性微生物。與大腸桿菌相比，在頑固性微生物中核酸操作和/或核酸克隆更難和/或更低效。例如，在最近的研究中，使用了現(xiàn)有的技術(shù)(Surade等人，2006)對大腸桿菌和乳酸乳球菌中的基因克隆進(jìn)行了比較。對于大腸桿菌而言，成功率為222中成功216，而對于乳酸乳球菌而言，成功率僅為71中成功39。因此，即使作者Surade等人進(jìn)行了大量的嘗試，未能在乳酸乳球菌中克隆32種基因。相反地，如果使用本發(fā)明的方法可以得到好得多的結(jié)果。例如，如實施例所示，在其中所述第一種微生物為乳酸乳球菌和其中所述第二種微生物為大腸桿菌的本發(fā)明實施方式中，初始的克隆步驟具有與標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌載體相同的高效性；在至今為止根據(jù)本發(fā)明方法已完成的試驗中，在轉(zhuǎn)化過程中還未發(fā)現(xiàn)一例失敗，目前已經(jīng)得到了超過300種基因構(gòu)建體。因此本發(fā)明的優(yōu)選實施方式提供了本發(fā)明的方法，其中，所述第一種微生物為頑固性微生物。在一個實施方式中，所述第一種微生物為表3中列舉的公知微生物中的一種。在一個實施方式中，所述第一微生物為例如乳酸乳球菌、鏈霉菌(Str印tomycessp)或硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)，但是大部分現(xiàn)今已知的微生物與本內(nèi)容相關(guān)。大腸桿菌以外的微生物通常是優(yōu)選的，因為與大腸桿菌相比，這些微生物更好地表達(dá)各種不同的蛋白質(zhì)。例如，與大腸桿菌相比，由于其它微生物的細(xì)胞環(huán)境，各種不同的蛋白質(zhì)能夠獲得更好的構(gòu)型和/或翻譯后修飾。此外，其它參數(shù)，例如它們的密碼子選擇、蛋白伴侶(ch即erone)的類型和數(shù)量、對大腸桿菌毒性蛋白質(zhì)的表達(dá)的耐受性以及質(zhì)膜的脂質(zhì)組成，通常與大腸桿菌相比更利于表達(dá)功能態(tài)的蛋白質(zhì)。如果產(chǎn)生的蛋白質(zhì)在其接近自身的細(xì)胞環(huán)境時更穩(wěn)定，大腸桿菌以外的微生物也優(yōu)選用于表達(dá)蛋白質(zhì)。因此，盡管常規(guī)的克隆方法(例如LIC方法)在例如乳酸乳球菌、鏈霉菌或硫磺礦硫化葉菌中比在大腸桿菌中的效率要低得多，通常仍然優(yōu)選在大腸桿菌以外的微生物中克隆和表達(dá)核酸序列。使用本發(fā)明的方法，在頑固性微生物中有效地克隆和表達(dá)核酸序列成為可能。優(yōu)選提供其中所述第二微生物為大腸桿菌的本發(fā)明的方法，因為這種微生物已知具有高的轉(zhuǎn)化效率，并且也已特別地對于這種生物體開發(fā)和優(yōu)化了各種不同的基因操作工具。除了其它因素以外，這特別是由于本領(lǐng)域中存在的合適的復(fù)制起點和質(zhì)粒系統(tǒng)的事實。將目的核酸插入這樣的質(zhì)粒系統(tǒng)以及克隆產(chǎn)生的質(zhì)粒已在大腸桿菌中證明是非常有效的。因此，這種微生物非常適合用于本發(fā)明方法的第一克隆步驟中。因此，在一個特別優(yōu)選的實施方式中，第二微生物為大腸桿菌。正如實施例表明的那樣，大腸桿菌非常適于在本發(fā)明方法的第一階段進(jìn)行有效的核酸克隆。本發(fā)明的方法特別適于通過選擇的微生物、優(yōu)選通過頑固性微生物有效地克隆和表達(dá)目的核酸序列。因此同時還提供本發(fā)明的方法，其進(jìn)一步包括允許通過所述第一種微生物的培養(yǎng)表達(dá)所述目的核酸。一旦目的核酸根據(jù)本發(fā)明的方法在微生物中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選獲得用于進(jìn)一步使用的這樣的表達(dá)產(chǎn)物。例如，制備、分離并使用用于制備藥物的治療性蛋白質(zhì)。獲得、分離和/或純化已被微生物產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的許多方法是本領(lǐng)域已知的。非限定性的例子包括使用親和標(biāo)記物(例如寡-His-標(biāo)記物)與金屬-螯合物親和色譜法結(jié)合，MBP-標(biāo)記物與直鏈淀粉_樹脂親和色譜法結(jié)合以及其它通用色譜方法來純化蛋白質(zhì)。因此，在此還提供了進(jìn)一步包括獲得所述目的核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物的本發(fā)明的方法，以及通過本發(fā)明的方法獲得的表達(dá)產(chǎn)物。在一個實施方式中，所述目的核酸編碼多區(qū)域蛋白質(zhì)和/或膜蛋白質(zhì)。異源表達(dá)功能性感受態(tài)的這類蛋白質(zhì)通常在已建立的表達(dá)宿主大腸桿菌和酵母中存在問題。但是，使用本發(fā)明的方法使得在替代的表達(dá)宿主中有效地克隆和表達(dá)編碼這類蛋白質(zhì)的核酸序列成為可能。既然在多種微生物中有效地克隆和表達(dá)核酸序列已經(jīng)成為可能，本發(fā)明的方法可用于多種應(yīng)用中。例如，核酸序列可發(fā)生突變(例如使用易錯PCR)且產(chǎn)生的核酸序列進(jìn)行克隆和表達(dá)。為了尋找改進(jìn)的變異體的突變蛋白質(zhì)的高通量篩選已經(jīng)成為可能。已被良好中未獲得理想的構(gòu)型或翻譯后修飾的突變蛋白質(zhì)現(xiàn)在使用其它種類的微生物進(jìn)行有效地表達(dá)。因此，本發(fā)明還提供了一種克隆分析，其中，使用本發(fā)明的方法克隆和表達(dá)目的核酸。所述克隆分析優(yōu)選為高通量克隆分析。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種試劑盒，包含-包含第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；禾口-包含第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；其中各載體包含至少兩個重組酶位點和/或限制性酶切位點，其中所述重組酶位點和/或限制性酶切位點優(yōu)選不在所述復(fù)制起點內(nèi)。這樣，復(fù)制起點被從載體中切除，并可根據(jù)意愿由其它種類的復(fù)制起點替換。優(yōu)選地，各載體包含至少兩個限制性酶切位點，其在切割時產(chǎn)生兩個互不匹配的不同的、非回文懸端，因而已被切割的載體的兩個末端不會相互發(fā)生退火。這樣，克隆效率被進(jìn)一步提高了。當(dāng)使用非互補(bǔ)性非回文懸端時，目的核酸序列原則上僅能夠以一個方向插入到核酸載體中。因此，為了獲得帶有正確定向的目的核酸序列的核酸載體，非互補(bǔ)性非回文懸端為優(yōu)選的。優(yōu)選地，所述第一種微生物不同于所述第二種微生物。更優(yōu)選地，所述第一種微生物屬于與第二種微生物相比的另一種和/或?qū)佟Ｋ龅谝环N微生物優(yōu)選包括大腸桿菌以外的微生物。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述第一種微生物為頑固性微生物。在一個實施方式中，所述第一核酸載體包含編碼親和標(biāo)記物(例如如His-標(biāo)記物)和/或另一種融合伴體(fusionpartner)(例如如GFP)的序列，該親和標(biāo)記物或融合伴體將與目的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)相連接。這樣的親和標(biāo)記物或融合伴體有利于分離、和/或檢測、和/或純化所述蛋白質(zhì)。這樣的試劑盒特別適合用于本發(fā)明的方法，其中目的核酸序列被引入到所述第一載體中，而后產(chǎn)生的載體在所述第二種微生物培養(yǎng)中進(jìn)行克隆，而后克隆的載體的復(fù)制起點被所述第二載體的復(fù)制起點取代，而后產(chǎn)生的載體在所述第一種微生物培養(yǎng)中進(jìn)行克隆。所述復(fù)制起點優(yōu)選由重組酶或一種或多種限制性酶的作用與最初存在的載體分離。因此，重組酶位點和/或限制性酶切位點優(yōu)選是在所述復(fù)制起點的側(cè)翼區(qū)域中。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選包含第一和第二載體，其中各載體包含相同種類的限制性酶切位點，其在切割時產(chǎn)生互不匹配的兩個不同的、非回文懸端，因而已被切割的載體的兩個末端不會相互發(fā)生退火。這樣，克隆效率進(jìn)一步得以提高。載體的限制性酶位點優(yōu)選是這樣選擇的，在與所述限制性酶一起孵育時，意圖相互連接的載體的部分具有互補(bǔ)的單鏈懸端。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒的至少一種載體具有至少兩個SfiI切割位點。最優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒的所有載體具有至少兩個Sfil切割位點?！獋€優(yōu)選的實施方式提供了本發(fā)明的試劑盒，其中所述第一載體包含大腸桿菌復(fù)制起點。正如前面已經(jīng)描述的那樣，大腸桿菌特別適于本發(fā)明的方法的第一克隆步驟。在一個實施方式中，所述大腸桿菌復(fù)制起點源自pBR322。本發(fā)明的試劑盒的第二載體優(yōu)選包含大腸桿菌以外的微生物的復(fù)制起點，優(yōu)選是頑固性微生物的復(fù)制起點。正如前面所討論的那樣，這些微生物優(yōu)選用于制備各種類型的(人)蛋白質(zhì)。在一個實施方式中，使用源自PSH71的乳酸乳球菌復(fù)制起點。本發(fā)明的試劑盒第一載體優(yōu)選包含選擇標(biāo)記，例如如抗生素耐藥性基因。此外，所述試劑盒的第二載體優(yōu)選包含選擇標(biāo)記，例如如抗生素耐藥性基因。正如前面所說明的那樣，選擇標(biāo)記用于選擇攜帶核酸載體的微生物。使用本發(fā)明的方法，有可能使用較不適用于常規(guī)核酸操作的微生物種類有效地克隆目的核酸。例如，已經(jīng)得到其中每微克用于所述方法的核酸的菌落形成單位的量為至少105CFU/iigDNA的乳酸乳球菌培養(yǎng)物。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過本發(fā)明的方法得到的乳酸乳球菌培養(yǎng)物，其中每微克用于所述方法的目的核酸的菌落形成單位的量為至少105CFU/i!gDNA。本發(fā)明還提供了包含核酸載體的重組微生物，該載體包含-所述種類微生物的復(fù)制起點；-目的核酸序列；禾口_至少兩個限制性酶切位點，其在切割時產(chǎn)生兩個互不匹配的不同的、非回文懸端，且其中所述限制性酶切位點不在所述復(fù)制起點內(nèi)。所述微生物優(yōu)選為大腸桿菌以外的微生物。在一個優(yōu)選實施方式中，所述微生物為頑固性微生物。在一個實施方式中，所述微生物為乳酸乳球菌。此外，所述限制性酶切位點優(yōu)選為Sfil、SapI、Ksp632I、Aarl、BglI、PflMI和/或BstXI切割位點，更優(yōu)選為S即I、Aarl或SfiI切割位點。最優(yōu)選地，所述限制性酶切位點為Sfil切割位點。正如前面所描述的那樣，使用Sfil、SapI、Ksp632I、Aarl、BglI、PflMI和/或BstXI允許核酸載體被切割，由此已被切割的載體的兩個末端不會相互發(fā)生退火。Sfil、SapI、Ksp632I、Aarl、BglI、PflMI和/或BstXI切割位點是這樣設(shè)計的，從而意在相互連接的兩種不同載體的部分具有互補(bǔ)的單鏈懸端。使用Sfil進(jìn)一步提供了額外的優(yōu)勢，即它在T4DNA連接酶具有活性的相同種類的緩沖液中是具有活性的。因此，在一個使用T4DNA連接酶和Sfil的優(yōu)選的實施方式中，無需更換反應(yīng)緩沖液即可進(jìn)行切割反應(yīng)和連接反應(yīng)(意味著除了添加Sfil、T4DNA連接酶和ATP以外無需進(jìn)行其它活動)。本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的實施例進(jìn)行闡述。這些實施例無意于限制本發(fā)明的范圍，僅用于闡明本發(fā)明。實施例我們現(xiàn)在提供了一種與高通量操作兼容的通用克隆策略，產(chǎn)生了對于表達(dá)宿主優(yōu)化和去除外源(例如大腸桿菌來源的)元件的天然質(zhì)粒載體。這里描述的載體骨架交換(VectorBackboneExchange)(VBEx)方法是具體用于在乳酸乳球菌中的克隆，但是它很容易適用于已存在質(zhì)粒、選擇標(biāo)記和轉(zhuǎn)化方法的所有生物體。VBEx已被用于產(chǎn)生了超過300種基因構(gòu)建體，且在乳酸乳球菌中的基因克隆至表達(dá)篩選正在以每周48種的速度進(jìn)行。為了便于初始步驟用于大量開放閱讀框的克隆，我們使用了非連接依賴克隆(LIC)方法(Aslanidis和deJong，1990)。與依賴于重組事件的方法(例如Gateway(Walhout等人，2000)或通用載體質(zhì)粒融合系統(tǒng)(UPS)(Liu等人，1998))相比，非連接依賴克隆在基因側(cè)翼的序列的設(shè)計上限制較少。因此，連接到重組蛋白質(zhì)上的克隆相關(guān)的序列可被最小化?？寺∵^程包括通過在LIC盒中間的唯一Swal位點上的限制性酶切使得載體線性化，然后使用T4DNA聚合酶進(jìn)行處理來產(chǎn)生與PCR產(chǎn)物的那些懸端互補(bǔ)的長的、確定的單鏈懸端(圖1B)。LIC盒之前是對預(yù)期表達(dá)宿主特異性的啟動子區(qū)域。因此，我們分別使用大腸桿菌和乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒pBAD24(Guzman等人，1995)和pNZ8048(deRuyter等人，1996)的PBAD和PNIS啟動子。PCR產(chǎn)物的非連接依賴克隆證明對于大腸桿菌載體是高效的，表明載體和插入物的互補(bǔ)懸端的長度和組成足以形成穩(wěn)定的異源雙鏈。與之相反，用源自pNZ8048的LIC載體和匹配的插入物的穩(wěn)定異源雙鏈直接轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生非常少的陽性克隆(未顯示數(shù)據(jù))。為了克服乳酸乳球菌中差的克隆效率，設(shè)計了新的策略(VBEx)，使得在大腸桿菌中進(jìn)行初始(高通量)克隆，但是又避免使用穿梭載體。盡管我們與LIC結(jié)合使用VBEx，但是本策略與Gateway、UPS以及LIC變化形式(例如無酶克隆(deJong等人，2007)和SLIC(Li和Elledge，2007))完全相容。該方法依賴于將表達(dá)宿主的真正的質(zhì)粒載體對切(bisection)成兩個部分，因而將選擇標(biāo)記和復(fù)制起點分離。對于乳酸乳球菌而言，pNZ8048質(zhì)粒的復(fù)制起點(PSH71復(fù)制子)與氯霉素耐藥性基因(cat)分開(圖la)。包含cat和LIC序列的片段與包含大腸桿菌復(fù)制起點和e-內(nèi)酰胺酶耐受性基因(bla)的載體的骨架相融合。產(chǎn)生的質(zhì)粒pRExLIC使得在大腸桿菌中進(jìn)行LIC操作。包含乳酸乳球菌復(fù)制起點的片段與紅霉素選擇標(biāo)記相融合(產(chǎn)生質(zhì)粒PERL)，其使得能夠在表達(dá)宿主中進(jìn)行復(fù)制和選擇。來自相關(guān)pRExLIC和pERL片段的原始乳酸乳球菌表達(dá)質(zhì)粒的快速和高通量相容性重建通過使每一半的末端側(cè)鄰不同的Sfil限制性位點(圖la中的Sfily和SfiIY)確保。Sfil的DNA切割產(chǎn)生了由三個核苷酸的任意組合組成的3'懸端。使用的兩個SfiI位點產(chǎn)生了互不匹配的不同的、非回文懸端(圖lc)。i)原始表達(dá)載體的兩半具有可被選擇的性質(zhì)和ii)在各質(zhì)粒片段的任一側(cè)進(jìn)行Sfil消化后不同的3'懸端的組合確保了最少的樣品處理，并允許該方法的自動化。由于表達(dá)載體的每一半具有獨特的可選擇性質(zhì)，不需要Sfil片段的凝膠電泳和純化。在氯霉素的存在下選擇質(zhì)粒在乳酸乳球菌中的復(fù)制能力允許獨特的回收僅來自Sfil消化的pRExLIC和pERL質(zhì)粒的復(fù)合混合物的原始表達(dá)載體。此外，不需要在消化和連接反應(yīng)之間更換緩沖液。僅僅向Sfil緩沖液中補(bǔ)充ATP即足以使T4DNA連接酶完全活化。實踐中，全部的過程可以在單管中3小時內(nèi)發(fā)生。在pRExLIC和pERL共同的Sfil消化(5(TC下80分鐘)、然后熱滅活限制性酶(8(TC下20分鐘)之后，通過加入ATP和T4DNA連接酶開始片段的連接(2(TC下60分鐘)。加熱滅活T4DNA連接酶(65。C下20分鐘)之后，可使用等分的混合物進(jìn)行(電)轉(zhuǎn)化而無需進(jìn)一步純化(圖1)。對于乳酸乳球菌而言，我們常規(guī)地觀察到了高的可再現(xiàn)的轉(zhuǎn)化效率(106CFU/i!gDNA)，這與傳統(tǒng)的限制-連接克隆的效率低的和變化的轉(zhuǎn)化效率(102CFU/iigDNA;例如參見Surade等人，2006)形成對比。值得注意的是，使用VBEx方法，得到的所有的乳酸乳球菌轉(zhuǎn)化體都攜帶插入pNZxLIC中的目的基因。使用這一系統(tǒng)，我們產(chǎn)生了超過300種表達(dá)構(gòu)建體，并在不使用機(jī)器人的條件下以每周48種構(gòu)建體的速率評估蛋白質(zhì)的水平。一個膜蛋白質(zhì)的小亞群在乳酸乳球菌中的過表達(dá)示于圖ld中。重要地，來自實質(zhì)上所有測序的基因組中的DNA序列都與本克隆策略相容，因為Sfil位點(5'GGCCNNNN'NGGCC3')非常罕見(圖2a)。分別在NCBI數(shù)據(jù)庫(2007年2月)和Ensembl(版本43)中的492種古細(xì)菌和細(xì)菌染色體及30種真核基因組的所有預(yù)計基因轉(zhuǎn)錄體的分析表明超過92X的這些轉(zhuǎn)錄體都不含任何Sfil位點(表l)。此外，本發(fā)明的使用并不局限于不含Sfil位點的轉(zhuǎn)錄體。由于在Sfil消化后可產(chǎn)生64種不同的3'懸端，帶有不與載體的懸端匹配的3'懸端的內(nèi)Sfil位點將會造成三向或多向的連接，而不會形成該方法的瓶頸。如果需要的話，載體很容易適應(yīng)以用于天然不存在(non-occuring)或極其罕見的懸端。在89X所分析的基因組中，至少兩種類型的Sfil懸端未出現(xiàn)(圖2b)。剩余的11%的基因組包含幾種類型的低出現(xiàn)率的Sfil懸端。為了保證本策略對于不同大小的插入物的普遍性，我們比較了帶有高達(dá)3.7kb的插入物的pRExLIC衍生物的Sfil消化率(數(shù)據(jù)未顯示)，并觀察到80分鐘孵育后的完全消化。此外，我們使用基于敏感性活性的分析(數(shù)據(jù)未顯示)證明了在克隆的宿主大腸桿菌中不存在來自P^啟動子的表達(dá)。來自細(xì)菌、植物和哺乳動物來源的重組DNA在pRExLIC和pNZxLIC載體中的成功裝配和穩(wěn)定性被證明非常高，且至今為止未觀察到基因重排(n>300)?？偠灾?，我們已經(jīng)發(fā)展了LIC-VBEx，一種具有空前的高效率的用于乳酸乳球菌的高通量相容的克隆系統(tǒng)，其可容易地適應(yīng)于任何其它表達(dá)宿主。穿梭載體產(chǎn)生的問題可以通過使用正源的(ge皿ine)表達(dá)質(zhì)粒得以避免。產(chǎn)生的LIC盒使得能夠用在N-或C末端用可切割的十His-標(biāo)記物標(biāo)記目的蛋白質(zhì)(帶有這些盒的載體和具有替代的標(biāo)記物或融合伴體的衍生物示于材料和方法部分中)。因此，描述的方法已在我們實驗室被用于高效地制備超過300種基因構(gòu)建體(90X為LIC;100X為VBEx(數(shù)據(jù)未顯示))。在非自動化的設(shè)置中，在大腸桿菌和乳酸乳球菌中從克隆到表達(dá)篩選的完整過程以大約每周48種構(gòu)建體的速度進(jìn)行。材料和方法非連接依賴克隆(LIC)。使用PhusionDNA聚合酶(Finnzymes)和LIC特異性尾在5'端延長的基因特異性引物(表A)進(jìn)行插入物的擴(kuò)增。使用質(zhì)粒分離試劑盒(WizardPlus,Promega)純化包含LIC盒的載體。使用苯酚氯仿和氯仿提取來進(jìn)一步純化DNA，以去除痕量蛋白質(zhì)。使用25單位的Swal(Roche)在25。C下消化載體(5yg的DNA)過夜。然后使用凝膠純化PCR產(chǎn)物和消化的載體(GFXPCRDNA&GelBand純化試劑盒，GE)，在10mMTris-HCl，pH7.5，0.2mMNa-EDTA中進(jìn)行洗脫，并在4。C下儲存。在20°C、分別2.5mMdCTP禾P2.5mMdGTP的存在下，使用0.5UT4DNA聚合酶(Roche)單獨處理200ngSwal消化的載體和等摩爾量的插入物30分鐘，然后加熱滅活T4DNA聚合酶(75。C下20分鐘)?，F(xiàn)在處于"LIC-備用(LIC-ready)"狀態(tài)的材料可于4°C保存較長的時間(超過6個月)。LIC-備用的載體(liU)和插入物(3iU)進(jìn)行混合，并在室溫下孵育5分鐘后轉(zhuǎn)化到75iU化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌MC1061中。細(xì)胞在氨芐青霉素(100iig/ml)補(bǔ)充的Luria肉湯培養(yǎng)基上進(jìn)行接種。表A.非連接依賴克隆需要的引物延伸<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>引物類型序列(5'—3')cLIC正向ATGGGTGGTGGATTTGCT+基因特異性的cLIC反向TTGGAAGTATAAATTTTC+基因特異性的載體骨架交換。源自pRExLIC的載體的載體骨架交換是在帶有加熱蓋的PCR儀中少量(lOiU)地進(jìn)行以防止縮合。將pERL載體(包含乳酸乳球菌復(fù)制起點)和源自pRExLIC的載體(包含乳酸乳球菌cat基因)進(jìn)行混合(各125ng)，并通過加入1yl10X緩沖液(100mMTris-HCl，pH7.5，100mMMgCl2，500mMNaCl，lmg/mlBSA)、5USfil(Fermentas)和足量的milliQ將體積調(diào)節(jié)到10iU。樣品在5(TC下孵育80分鐘并在8(TC下孵育20分鐘以滅活Sfil。冷卻至室溫之后，通過加入1.5iil的8mMNa廠ATP，pH7和0.5U的T4DNA連接酶(Roche)來啟動連接反應(yīng)。樣品在2(TC下孵育1小時并在65t:下孵育20分鐘以滅活T4DNA連接酶。然后，將2iil樣品轉(zhuǎn)移到30y1電感受態(tài)乳酸乳球菌NZ9000中(參見下面)中，將等分試樣接種在補(bǔ)充有0.5%葡萄糖、0.5M蔗糖、5iig/ml氯霉素的M17板上(Terzaghi和Sandine，1975)(Difco)。封口膜(Parafilm)密封的板在3(TC下進(jìn)行孵育直至出現(xiàn)菌落(18小時)。乳酸乳球菌的電轉(zhuǎn)化。電感受態(tài)的乳酸乳球菌NZ9000的制備基本上按照描述(Holo和Nes，1989;Wells等人，1993)進(jìn)行，但是經(jīng)過一些關(guān)鍵的改進(jìn)。簡而言之，細(xì)胞在補(bǔ)充有0.5%葡萄糖、0.5M蔗糖和2%甘氨酸的M17中在3(TC下生長至0D6。。=0.5。在fC下通過5000xg離心15分鐘收獲細(xì)胞。在使用1體積的冰冷溶液A(在milliQ中制備的0.5M蔗糖和10%甘油)、0.5體積的補(bǔ)充50mMNa-EDTA，pH7.5的溶液A和0.25體積的溶液A洗滌后，細(xì)胞重新懸浮在0.01體積的溶液A中。40iU的等分試樣在液氮中快速冷凍，并儲存在-S(TC直至使用。用于電穿孔時，細(xì)胞在冰上解凍，與質(zhì)粒DNA合并，并轉(zhuǎn)移到冰冷的電穿孔小杯(2mm間隙)中。細(xì)胞置于具有2kv場強(qiáng)、25iiF電容和200Q電阻的單電脈沖中。放電之后立即將細(xì)胞與lml冰冷的補(bǔ)充有O.5%葡萄糖、0.5M蔗糖、20mMMgCl2和2mMCaCl2的M17相混合，然后置于冰上IO分鐘。然后，細(xì)胞在3(TC下孵育2小時，并將等分試樣接種在補(bǔ)充有0.5%葡萄糖、0.5M蔗糖和5iig/ml氯霉素的M17瓊脂上。密封板，并在3(TC下孵育過夜。表1.Sfil位點在原核和真核基因轉(zhuǎn)錄體中的分布分析。對于原核和真核數(shù)據(jù)點，分析了1，484，533和745，558種基因轉(zhuǎn)錄體。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>LIC方法的詳細(xì)總結(jié)。nLIC盒制備了包含N末端的10個His-標(biāo)記物的，然后是TEV蛋白酶切割位點和你的目標(biāo)蛋白質(zhì)(YourFavoriteProtein)(YFP)的構(gòu)建體。使用T4DNA聚合酶的3'—5'核酸外切酶活性和專用的尾部序列，產(chǎn)生了長的限定的懸端。這些懸端具有足夠高的退火溫度，因而僅僅混合互補(bǔ)懸端就足以產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA序列，準(zhǔn)備用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化。載體帶有包含Swal位點的nLIC盒。Swal消化之后，在dCTP的存在下使用T4DNA聚合酶處理載體，以產(chǎn)生nLIC-備用的懸端(如下所示)。l.nLIC盒NMetHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisGlyGluAsnLeuTyr5'ATGCATCATCACCATCATCACCATCACCATCATGGTGAGAATTATTATTTAAATCCCACCCTCCCAG3'TACGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACCACTCTTAAATATAAATTTAGGGTGGGAGGGTC2.使用Swal消化之后NMetHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisGlyGluAsnLeuTyr5'ATGCATCATCACCATCATCACCATCACCATCATGGTGAGAATTTATATTTAAATCCCACCCTCCCAG3'TACGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACCACTCTTAAATATAAATTTAGGGTGGGAGGGTC3.使用T4DNA聚合酶+dCTP處理之后NMetHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisGlyGluAsnLeuTyr5'ATGCATCATCACCATCATCACCATCACCATCAAATCCCACCCTCCCAG3'TACGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACCACTCTTAAATATAAAC使用帶有專用的nLIC尾的引物來對插入物進(jìn)行PCR。去除引物和核苷酸以后，在dGTP的存在下使用T4DNA聚合酶處理插入物，以產(chǎn)生nLIC-備用的懸端(如下所示)。l.PCRNisGlyGluAsnLeuTyrPheGinGlyMetX5'ATGGTGAGAATTTATATTTTCAAGGTATGYFPTAACCCA3'TACCACTCTTAAATATAAAAGTTCCATACYFPATTGGGT2.使用T4DNA聚合酶+dGTP處理之后NisGlyGluAsnLeuTyrPheGinGlyXX5'ATGGTGAGAATTTATATTTTCAAGGTYFPTAATG3'GTTCCAYFPATTACTT然后，將nLIC-備用的載體和插入物進(jìn)行混合。限定的懸端退火成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，對于基因的5'和3'末端Tm分別為大約4fC和58°C。留下的小的一個堿基對的間隙將會在體內(nèi)進(jìn)行填補(bǔ)。a.退火之前的5'末端NMetHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisGlyGiuAsnLeuTyrPheGinGly5'ATGCATCATCACCATCATCACCATCACCATCATGGTGAGAATTTATATTTTCAAGGTYFP3'TACGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACCACTCTTAAATATAAA.GTTCCAYFFb.退火之后的5'末端NMetHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisGlyGluAsnLeuTyrPheGinGly5'ATGCATCATCACCATCATCACCATCACCATCATGGTGAGAATTTATATTTTCAAGGTYFP3'TACGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTACCACTCTTAAATATAM.GTTCCAYFP1.退火之前的3'末端NMetXX5'ATGYFPTAATGAAATCCCACCCTCCCAG3'TACYFPATTACTTTTAGGGTGGGAGGGTC2.退火之后的3'末端NMetXXXTGAAAATCCCACCCTACTTTTAGGGTGGGATTTAGGGTGGGAGGG5'ATGYFPTAATG.AAATCCCACCCTCCCAG3'TACYFPATTACTTTTAGGGTGGGAGGGTCcLIC盒制備了包含相對較小的N末端修飾(MGGGFA)、你的目標(biāo)蛋白質(zhì)(YFP)和C末端TEV蛋白酶切割位點，然后是10個His-標(biāo)記物的構(gòu)建體。使用T4DNA聚合酶的3'—5'核酸外切酶活性和專用的尾部序列，產(chǎn)生了長的確定的懸端。這些懸端具有足夠高的退火溫度，從而僅混合互補(bǔ)的懸端就足以產(chǎn)生穩(wěn)定的DNA序列，準(zhǔn)備用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化。載體帶有包含Swal位點的cLIC盒。Swal消化之后，在dCTP的存在下使用T4DNA聚合酶處理載體，以產(chǎn)生nLIC-備用的懸端(如下所示)。l.cLIC盒MGGGHHHHHX5'CATGGGTGGTGGACACCATCACCATCATTAA3'GTACCCACCACCTGTGGTAGTGGTAGTAATT2.使用Swal消化之后MGGGHHHHHHX5'CATGGGTGGTGGACATCACCATCACCATCATTAA3'GTACCCACCACCTGTAGTGGTAGTGGTAGTAATT3.使用T4DNA聚合酶+dCTP處理之后MGGGFNLYFOGHHHHHHHHHHX5'CAAATTTATACTTCCAAGGTCATCATCACCATCATCACCATCACCATCATTAA3'GTACCCACCACCTAAACCAGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTAATT使用帶有專用的cLIC尾的引物來對插入物進(jìn)行PCR。去除引物和核苷酸以后，在dGTP的存在下使用T4DNA聚合酶處理插入物，以產(chǎn)生cLIC-備用的懸端(如下所示)。MGGGFAENLYFQ5'ATGGGTGGTGGATTTGCTYFPGAAAATTTATACTTCCAA3'TACCCACCACCTAAACGAYFPCTTTTAAATATGAAGGTT2.使用T4DNA聚合酶+dGTP處理之后MGGGFAENLYFQ5'ATGGGTGGTGGATTTGCTYFPG3'GAYFPCTTTTAAATATGAAGGTT然后，將cLIC-備用的載體和插入物進(jìn)行混合。限定的懸端被退火成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)NLYFQGHHHHHTTTAAATTTATACTTCCAAGGTCATCATCACCATCATAAATTTAAATATGAAGGTTCCAGTAGTAGTGGTAGTAFNLYFQGHHHHTTTAMTTTATACTTCCAAGGTCATGATCACCATAMTTTAMTATGAAGGTTCCAGTAGTAGTGGTA18對于基因的5'和3'末端Tm分別為大約4rC和31°C。留下的小的一個堿基對的間隙將會在體內(nèi)進(jìn)行填補(bǔ)。a.退火之前的5'末端MGGGFA5'CATGGGTGGTGGATTTGCTYFP3'GTACCCACCACCTAAAGAYFPb.退火之后的5'末端MGGGFA5'CATGGGTGGTGGATTTGCTYFP3'GTACCCACCACCTAAA.GAYFP1.退火之前的3'末端FNLYFQNLYFQGHHHHHHHX5'YFPGAMTTTATACTTCCMGGTCATCATCACCATQACCATCATTAA3'YFPCTTTTAMTATGMGGTTCCAGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTAATT2.退火之后的3'末端ENLYFQGHHHHHHHHHHX5'YFPG.AAATTTATACTTCCAAGGTCATCATCACCATCATCACCATCACCATCATTAA3'YFPCTTTTAAATATGMGGTTCCAGTAGTAGTGGTAGTAGTGGTAGTGGTAGTAATT附圖簡述圖1.LIC-VBEx策略的概述。(a)示出了乳酸乳球菌表達(dá)載體pNZxLIC的對切的示意圖。包含cat和LIC序列的片段被置于大腸桿菌的骨架中，從而產(chǎn)生了pRExLIC。然后這一載體可用于LIC過程中(b中描繪的)。(b)包含插入物的pRExLIC衍生物通過VBEx過程轉(zhuǎn)化成pNZxLIC衍生物。(c)質(zhì)粒載體的兩個片段側(cè)翼的SfiI位點產(chǎn)生不同的懸端。(d)乳酸乳球菌中膜蛋白質(zhì)的過表達(dá)。左圖代表了考馬斯染色的蛋白質(zhì)凝膠，右圖為抗His抗體染色的免疫印跡。減號和正號標(biāo)記表示未經(jīng)乳酸鏈球菌肽A(nisinA)誘導(dǎo)和經(jīng)乳酸鏈球菌肽A誘導(dǎo)的樣品。實心和空心箭頭分別表示His標(biāo)記的和非標(biāo)記的亞基/蛋白質(zhì)。標(biāo)志物帶為170、130、100、70、55、40、35、25和15kDa。從左至右顯示的分別為來自乳酸乳球菌的ABC運(yùn)載體(transporter)和二級核黃素運(yùn)載體、來自金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的ABC運(yùn)載體，以及來自流感嗜血桿菌的TRAP運(yùn)載體的整合膜組分；登錄號顯示在圖下方。圖2.Sfil特性的分析。(a)在492種原核基因組和30種真核生物的多聯(lián)基因轉(zhuǎn)錄體中Sfil位點的出現(xiàn)幾率隨DNA的GC含量變化。由于Sfil消化后會產(chǎn)生64種不同的懸端，互補(bǔ)的Sfil位點的頻率甚至更低(圖3)。(b)在基因組或組合的基因轉(zhuǎn)錄體中不存在的Sfil懸端的數(shù)目隨與DNA的GC含量變化(最多64種)。在插入物包含干擾VBEx過程的Sfil位點的罕見情況中，可以使用不存在的懸端鄰接載體的兩個片段。圖3.在基因組和組合的轉(zhuǎn)錄體中產(chǎn)生相同的懸端的Sfil位點出現(xiàn)率隨DNA的GC含量變化的分析。對于各DNA而言，顯示該種類最常出現(xiàn)的Sfil位點的數(shù)據(jù)點。參考文獻(xiàn)Aslanidis，C禾PP.J.deJong，NucleicAcidsRes18(20)，6069(1990).Birnboim禾口Doly，NucleicAcidsRes.1979Nov24;7(6):1513-1523BronPA，BenchimolMG，LambertJ，PalumboE，DeghorainM，DelcourJ，DeVos麗，KleerebezemM，HolsP.Useoftheairgeneasafood—gradeselectionmarkerinlacticacidbacteria.ApplEnvironMicrobiol.2002Nov;68(11):5663-70deJong，R.N.禾口M.A.Daniels,R.Kaptein等人，JStructF皿ctGe謹(jǐn)ics(2007).deRuyter，P.G.禾口0.P.Kuipers禾口W.M.deVos，ApplEnvironMicrobiol62(10)，3662(1996).ElDemerdashHA，HellerKJ，GeisA.Applicationoftheshspgene，encodingasmallheatshockprotein,asafood—gradeselectionmarkerforlacticacidbacteria.ApplEnvironMicrobiol.2003Aug;69(8):4408-12.G體an，L.M.和D.Belin，M.J.Carson等人，JBacteriol177(14)，4121(1995)Holo，H和I.F.Nes，A卯lEnvironMicrobiol55(12)，3119(1989)Li，M.Z.和S.J.Elledge，NatMethods4(3)，251(2007)Liu，Q和M.Z.Li，和D.Leibham等人，CurrBiol8(24)，1300(1998)Surade，S.和M.Klein，P.C.Stolt-Bergne等人，ProteinSci15(9)，2178(2006)Terzaghi，B.E.禾口W.E.Sandine，ApplMicrobiol29(6)，807(1975).Walhout，A.J.和G.F.Temple和M.A.Brasch等人，MethodsEnzymol328，575(2000).Wells，J.M.和P.W.Wilson和R.W.LePage,JApplBacteriol74(6)，629(1993)表2可獲得的LIC載體載體名稱蛋白質(zhì)序列TEV蛋白酶切割之后的蛋白質(zhì)序列表達(dá)宿主pREnLICM-HisfG-TEV位點-蛋白質(zhì)G-蛋白質(zhì)乳酸乳球菌NZ9000pREcLICMGGGFA-蛋白質(zhì)-TEV位點_His10MGGGFA-蛋白質(zhì)-ENLYFQ乳酸乳球菌NZ9000<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>"ssUSP45是指乳酸乳球菌USP45蛋白質(zhì)的信號序列。如果預(yù)測目的膜蛋白質(zhì)的N末端位于細(xì)胞質(zhì)膜外，那么使用pRE-USP45-nLIC載體，或者使用ssUSP45取代目的蛋白質(zhì)的信號序列。2)ssOmpA是指大腸桿菌OmpA蛋白質(zhì)的信號序列。如果預(yù)測目的膜蛋白質(zhì)的N末端位于細(xì)胞質(zhì)膜外，那么使用pBAD-OmpA-nLIC載體，或者使用ssOmpA取代目的蛋白質(zhì)的信號序列。表3對于基因克隆(例如基因文庫的構(gòu)建)而言的頑固性微生物~乳酸乳球菌乳桿菌屬種類(例如保加利亞乳桿菌(bulgaricus)、瑞士乳桿菌(helveticus)、植物乳桿菌(planta進(jìn)))硫磺礦硫化葉菌21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權(quán)利要求一種用于在第一種微生物中克隆目的核酸序列的方法，該方法包括-將所述目的核酸插入核酸載體，該載體包含第二種微生物的復(fù)制起點；-在所述第二種微生物的培養(yǎng)中克隆所述載體；-分離包含所述目的核酸序列的克隆的載體；-用所述第一種微生物的復(fù)制起點取代載體的第二種微生物的復(fù)制起點；和-將形成的載體在所述第一種微生物的培養(yǎng)中克隆。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述形成的載體基本上不含來自所述第二種微生物的元件。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，包括_提供包含所述第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；_向所述第一載體引入目的核酸序列；_提供包含所述第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；禾口-使用所述第二載體的包含所述第一微生物的所述復(fù)制起點的部分代替所述第一載體的包含所述第二微生物的所述復(fù)制起點但不包含所述目的核酸的部分。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述第一載體的所述部分具有互不匹配的不同的、非回文懸端，該回文懸端與所述第二載體的所述部分的懸端匹配。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其中，所述這些部分是由Sfil切割所述載體獲得的。6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項所述的方法，其中含有所述第二微生物的復(fù)制起點的所述第一載體的部分包含選擇標(biāo)記，例如如抗生素耐藥性基因，且其中含有所述第一微生物的復(fù)制起點的所述第二載體的部分包含選擇標(biāo)記，例如如抗生素耐藥性基因。7.根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一項所述的方法，其中，通過使用選自非連接依賴克隆(LIC)法、Gateway、通用載體質(zhì)粒融合系統(tǒng)(UPS)和LIC變化形式如無酶克隆(EFC)和非序列和連接依賴克隆(SLIC)的方法，所述目的核酸被插入所述第一載體并在所述第二種微生物的培養(yǎng)中進(jìn)行克隆。8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一項所述的方法，其中，將所述目的核酸插入所述第一載體并在所述第二種微生物的培養(yǎng)中進(jìn)行克隆的方法比將所述目的核酸插入所述第二載體并在所述第一種微生物的培養(yǎng)中進(jìn)行克隆的方法更有效。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中，所述第二種微生物為大腸桿菌。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中，所述第一種微生物為大腸桿菌以外的微生物，優(yōu)選為頑固性微生物。11.根據(jù)權(quán)利要求i-io中任一項所述的方法，進(jìn)一步包括通過所述第一種微生物的培養(yǎng)使得所述目的核酸表達(dá)。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，進(jìn)一步包括獲得所述目的核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中，所述目的核酸編碼多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)和/或膜蛋白質(zhì)。14.通過權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法所獲得的表達(dá)產(chǎn)物。15.—種克隆方法，其中，目的核酸通過權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法進(jìn)行克隆和表達(dá)。16.—種試劑盒，包括_包含第二種微生物的復(fù)制起點的第一核酸載體；禾口_包含第一種微生物的復(fù)制起點的第二核酸載體；其中各載體包含至少兩個重組酶位點和/或限制性酶切位點，且其中所述重組酶位點和/或限制性酶切位點優(yōu)選不在所述復(fù)制起點內(nèi)。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的試劑盒，其中，各載體包含至少兩個限制性酶切位點，其在切割時產(chǎn)生互不匹配的兩個不同的、非回文懸端。18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的試劑盒，其中，所述第一載體和所述第二載體包含相同種類的限制性酶切位點，其在切割時產(chǎn)生互不匹配的兩個不同的、非回文懸端。19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項所述的試劑盒，其中，所述限制性酶切位點為Sfil切割位點。20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項所述的試劑盒，其中，所述第一載體包含大腸桿菌復(fù)制起點的至少一部分。21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項所述的試劑盒，其中，所述第二載體包含大腸桿菌以外的微生物的復(fù)制起點的至少一部分，優(yōu)選頑固性微生物的復(fù)制起點的至少一部分。22.根據(jù)權(quán)利要求16-21中任一項所述的試劑盒，其中，所述第一載體包含選擇標(biāo)記，例如如抗生素耐藥性基因，且其中，所述第二載體包含選擇標(biāo)記，例如如抗生素耐藥性基因。23.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的方法獲得的乳酸乳球菌培養(yǎng)物，其中，用于所述方法中的每微克目的核酸的菌落形成單位量為至少105CFU/iigDNA。24.—種包含核酸載體的重組微生物，該載體包含-所述種類微生物的復(fù)制起點；_目的核酸序列；禾口_至少兩個限制性酶切位點，其在切割時產(chǎn)生互不匹配的兩個不同的、非回文懸端，且其中，所述限制性酶切位點不在所述復(fù)制起點內(nèi)。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的微生物，其是大腸桿菌以外的微生物，優(yōu)選為頑固性微生物。26.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的微生物，其中，所述限制性酶切位點為Sfil切割位點。全文摘要本發(fā)明提供了在較不適于常規(guī)的核酸操作的微生物(例如與大腸桿菌相比)中有效地克隆目的核酸序列的裝置和方法。本發(fā)明能夠使目的核酸在第一種微生物中高通量地進(jìn)行克隆(和優(yōu)選進(jìn)行表達(dá))，而目的核酸的初始(優(yōu)選高通量)克隆是在第二種微生物中進(jìn)行的。文檔編號C12N15/64GK101743312SQ200880022877公開日2010年6月16日申請日期2008年5月30日優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日發(fā)明者B·波爾曼,E·R·吉爾特斯瑪申請人:格羅寧根大學(xué)