專利名稱：：分泌高水平植酸酶的耐膽汁芽孢桿菌組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌組合物，其特征在于在膽鹽(模擬腸道環(huán)境)中快速出芽和增生以及分泌高水平的植酸酶。該芽孢桿菌組合物可用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑，在飼料中其具有益生(健康促進(jìn))作用并增加動(dòng)物飼料中營養(yǎng)的消化和可利用度。
背景技術(shù)：
：益生菌諸如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在動(dòng)物飼料工業(yè)中用作膳食補(bǔ)充劑。其使用與芽孢桿菌代替或減少抗生素使用的能力有關(guān)，其在動(dòng)物飼料工業(yè)中用作生長促進(jìn)劑。ChristianHansenA/S(丹麥)將此益生的生長促進(jìn)產(chǎn)品的一個(gè)實(shí)例以商品名GalliPro(保藏號(hào)為DSM17231)實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。GalliPro⑧為枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞組合物。除了推薦的作用方式以外(例如，免疫調(diào)節(jié)、腸道菌群調(diào)節(jié)劑)，益生的芽孢桿菌能夠產(chǎn)生許多有益的成分，諸如酶類，當(dāng)其用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑時(shí)酶類被分泌至胃腸道(GIT)中。諸如植酸酶的酶類被分泌并改善動(dòng)物祠料的消化和較好的攝取(較高的消化率)。膳食(飼料)主要為植物來源諸如谷物、玉米、大豆、豆油和氨基酸。所有這些作用都有利于生產(chǎn)低成本的動(dòng)物產(chǎn)品。在動(dòng)物銅料工業(yè)中廣泛〗吏用的酶類之一是才直酸酶。才直酸酶纟皮應(yīng)用于改善動(dòng)物膳食中磷的消化率。植酸鹽是谷物、油籽和豆類中磷的主要形式。然而，單胃動(dòng)物諸如豬、家禽和魚類對(duì)此磷酸鹽源的利用很差，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈τ糜趶闹菜猁}的有機(jī)絡(luò)合物中釋放磷酸鹽的必需胃腸道酶。因此，被消費(fèi)的飼料中大部分的植酸鹽經(jīng)過胃腸道并排泄在糞便中。在土壤和水環(huán)境中發(fā)生磷酸鹽的催化釋放，且糞便中的植酸鹽構(gòu)成了嚴(yán)重的磷污染問題，導(dǎo)致地表水的富營養(yǎng)化。另外，生產(chǎn)者不得不使用昂貴的磷補(bǔ)充飼料5來滿足動(dòng)物膳食的需求。此外，植酸鹽具有抗?fàn)I養(yǎng)特性包括與蛋白質(zhì)和二價(jià)陽離子形成絡(luò)合物，從而降低其生物利用度。文獻(xiàn)中已經(jīng)很好地證明補(bǔ)充植酸酶能改善單胃動(dòng)物飼養(yǎng)中植酸鹽的利用，并且對(duì)于礦物質(zhì)的生物利用度具有積極作用。芽孢桿菌孢子可通過酸性胃屏障，并在動(dòng)物的胃腸道(GIT)內(nèi)出芽和增生。此特性具有很大的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)楫?dāng)被攝入時(shí)，它們可分泌許多類型的有^A"、/v7r.ii一口jt/v、、、/.士m丄厶；ffi^;#i一<^士tl口A饑"&刀—,'l"j:xw，-w陶樂，7TJ^J^刀一/'^Xi7Fj乂tjtrji^r大闊3口4且脫^0ttujil,仏t口j料?；^程中，芽孢桿菌孢子是耐熱的，因此其是使細(xì)菌素和酶類都進(jìn)入胃腸道的優(yōu)異的遞送系統(tǒng)。在芽孢桿菌在胃腸道中的生存和增殖過程中，膽汁的作用很重要。膽汁在肝臟中產(chǎn)生并儲(chǔ)存在膽囊中。膽汁含有水、卵磷脂、膽紅素和膽綠素以及爿旦鹽。從文獻(xiàn)中知道，膽汁對(duì)芽孢桿菌孢子細(xì)胞在動(dòng)物胃腸道中的生存以及出芽并增生為營養(yǎng)細(xì)胞具有一些負(fù)面影響。因此正在進(jìn)行研究以找到益生的耐膽汁的芽孢桿菌菌^f朱。論文(AntonieVanLeeuwenhoek.2006Aug;90(2):139-46.Epub2006年7月4日)說明了直接從雞腸中分離許多芽孢桿菌標(biāo)本/細(xì)胞。檢測分離的芽孢桿菌細(xì)胞的益生活性。檢測具有最高益生活性的6種芽孢桿菌的耐膽鹽性，并且發(fā)現(xiàn)益生性特別高的芽孢桿菌具有相對(duì)高水平的耐膽鹽性。在此論文中沒有特別地將重點(diǎn)集中在檢測耐膽汁性的任何時(shí)段。在試驗(yàn)部分，在膽鹽存在5天后簡單地檢測了芽孢桿菌孢子細(xì)胞的耐受性(見141頁的段落"Simulatedsmallintestinalfluidtolerancetest"("才莫擬耐小腸液試'驗(yàn)"))。US2003/0124104A說明了益生的常規(guī)芽孢桿菌內(nèi)生孢子對(duì)低濃度的膽鹽敏感，即，甚至低濃度的膽鹽的存在都會(huì)抑制孢子出芽和/或再水化。這與其他細(xì)菌諸如腸道病原體，諸如大腸桿菌或金黃色葡萄球菌相反(見段落至)。就此而言，建議篩選/選擇對(duì)膽鹽的抑制性活性具有抗性并因此能出芽成為營養(yǎng)細(xì)胞，然后在結(jié)腸定植的芽孢桿菌孢子(見)。在該說明書中提供的都是工作實(shí)施例，沒有提供實(shí)際篩選的具體芽孢桿菌細(xì)胞的真實(shí)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，膽鹽篩選條件的說明是相對(duì)概括的。具體地，沒有指出選擇耐膽汁性的任何時(shí)段。換句話說，基于此文獻(xiàn)的粗略或概括性的說明，僅可選擇僅可緩慢生長(出芽)的芽孢桿菌細(xì)胞，即，能夠在適當(dāng)量的膽鹽的存在下在例如20小時(shí)后從孢子出芽成為營養(yǎng)細(xì)胞的芽孢桿菌細(xì)胞。在此文獻(xiàn)中，沒有對(duì)迅速增生(出芽)的芽孢桿菌細(xì)胞，即，能夠在適當(dāng)量的膽鹽的存在下在特定時(shí)間間隔內(nèi)達(dá)到規(guī)定生長點(diǎn)的從孢子出芽rf丄丄逸蘭2—nA甘Jti廿LnA士"/=r，丄-7T夕百工^V'呂力、SW/JCiH'WOC^n閨5W"Ci々J4田A3人^^人?？傊?，關(guān)于耐膽汁芽孢桿菌細(xì)胞的選擇/篩選的現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)沒有集中在從孢子細(xì)胞迅速增生/出芽成為芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞?，F(xiàn)有技術(shù)說明了用于選擇產(chǎn)生植酸酶的芽孢桿菌菌抹的許多檢測/篩選系統(tǒng)。US6255098中的一個(gè)實(shí)施例中鑒定了產(chǎn)生植酸酶的芽孢桿菌菌抹。但沒有提到鑒定的芽孢桿菌菌抹的耐膽汁性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的問題是提供一種芽孢桿菌組合物，其在動(dòng)物的胃腸道(GIT)中分泌大量的植酸酶。該技術(shù)方案基于本發(fā)明人已經(jīng)開發(fā)了一種用于鑒定的新的改良芽孢桿菌組合物的新選擇方法。本文所述的新選擇方法的新的重要步驟是特異地篩選/選"t奪在膽鹽的存在下較快/迅速地從孢子出芽并增生為營養(yǎng)細(xì)胞的芽孢桿菌孢子細(xì)胞。如上所述，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)說明了用于篩選能夠在膽鹽的存在下生長的芽孢桿菌的許多方法，但現(xiàn)有的篩選/選擇方法沒有將重點(diǎn)集中于在膽鹽的存在下出芽并增生的速度。因此，現(xiàn)有技術(shù)中篩選的耐膽汁細(xì)胞出芽并增生的速度不符合本文所述出芽并增生的速度標(biāo)準(zhǔn)。例如，在腸道環(huán)境中從例如雞腸中直接分離的芽孢桿菌纟田胞(如，例如在上面討"i侖的AntonieVanLeeuwenhoek的論文中所述)沒有被選擇(在常壓下)為在腸內(nèi)迅速地出芽并增生。如在本文中的工作實(shí)施例中所示，對(duì)于市售的芽孢桿菌組合物GalliPro⑧也是如此，在生理水平的膽鹽的存在下，其出芽和增生太緩慢，并在第一個(gè)20小時(shí)內(nèi)不能達(dá)到規(guī)定的生長點(diǎn)，不符合本文所述的出芽并增生的速度標(biāo)準(zhǔn)。GalliPro⑧是在商業(yè)上成功的一種枯草芽孢桿菌組合物。通過使用GalliPro⑧作為起始菌抹以及如本文所述的選擇壓力法和隨而選擇了本文所述的新的DSM19467。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)見表l(在本文中GalliPro⑧也可稱為DSM17231)。在本文的圖1中對(duì)此進(jìn)行了示意性地圖示?？傊?，相信現(xiàn)有技術(shù)中沒有說明一種分離的芽孢桿菌組合物，其包括105-1012CFU/g芽孢桿菌細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌組合物的細(xì)胞符合如本文所述的在膽鹽的存在下迅速出芽并增生的標(biāo)準(zhǔn)。不限于理論，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出迅速出芽和增生是本發(fā)明的一個(gè)非常重要的方面，因?yàn)檠挎邨U菌孢子對(duì)膽汁有耐受性，但不能足夠快速的出芽和增生，會(huì)在芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞發(fā)揮任意顯著的積極特性諸如產(chǎn)生顯著量的一直酸酶之前^皮排泄掉。出芽太緩慢的芽孢桿菌孢子在細(xì)菌可產(chǎn)生任意顯著量的例如植酸酶之前^f義僅通過胃腸道(GIT)。在進(jìn)行了大量詳盡的試驗(yàn)和分析后，本發(fā)明人因此選擇在多達(dá)20小時(shí)的時(shí)間范圍進(jìn)行工作，并且在此時(shí)段內(nèi)在很高的生理濃度的膽鹽的存在下選擇最快出芽和增生的孢子。不限于理論并基于本文詳細(xì)公開的試驗(yàn)工作，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出在4和6mM膽鹽的存在下，分別在第一個(gè)18和19小時(shí)內(nèi)迅速出芽和增生是很重要的。本發(fā)明人然后鑒定出一旦選擇出在膽鹽培養(yǎng)基中迅速出芽和增生的高的植酸酶生產(chǎn)能力的新細(xì)胞。如在圖1和表2中所示，迅速增生的耐膽汁選擇抹DSM19467用作起始菌抹用于經(jīng)典突變，并且選擇出高植酸酶產(chǎn)量的DSM19489抹。類似地，通過使用DSM19467作為起始菌林制備基因修飾生物(GMO)DSM19466才朱。如表2和實(shí)施例4的相關(guān)描述可見，DSM19489和DSM19466比DSM19467和GalliPro⑧產(chǎn)生顯著更多的植酸酶。重新檢查高植酸酶產(chǎn)量的DSM19489和DSM19466^^朱的如本文所述那樣快速出芽和增生的能力，它們保持了迅速增生的耐膽汁選擇抹DSM19467的迅速出芽和增生特性(見本文的實(shí)施例5)。在本文的圖1中，對(duì)此進(jìn)行了示意性地圖示。由此本文公開的新的益生的芽孢桿菌細(xì)胞是一種耐膽汁的，迅速出芽和增生的，并且分泌大量植酸酶的芽孢桿菌細(xì)胞。獲得的菌林非常有用的用作添加至動(dòng)物飼料中的益生芽孢桿菌組合物。其綜合了益生菌在動(dòng)物的腸道(存在高膽鹽水平)中生存和增殖，抑制病原菌(產(chǎn)生細(xì)菌素)，并另外地分泌大量的益于和用于消化和攝取獲自植酸鹽的磷的植酸酶的所有有益能力。因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及一種芽孢桿菌組合物，其包括105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其中芽孢桿菌組合物的特征在于(i):芽孢桿菌孢子在包括4和6mM膽鹽的膽鹽培養(yǎng)基的存在下從孢子快速出芽和增生為營養(yǎng)細(xì)胞，其中快速出芽和增生定義為芽孢桿菌孢子分別在小于18小時(shí)和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到OD63o為0.4的營養(yǎng)細(xì)力包生長點(diǎn)，其中營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)是生長曲線中OD值開始以連續(xù)的方式增加(由營養(yǎng)細(xì)胞的生長所引起)并達(dá)到OD63o為0.4的點(diǎn)；(I):其中膽鹽培養(yǎng)基是本文實(shí)施例1的補(bǔ)充了膽鹽混合物的標(biāo)準(zhǔn)已知非選擇性小牛肉浸出液肉湯(VIB)培養(yǎng)基，所述膽鹽混合物包括結(jié)合型膽鹽牛碌脫氧膽酸鹽和甘氨脫氧膽酸鹽以及去結(jié)合型膽鹽脫氧膽酸鹽，其比例為60%的?；敲撗跄懰猁}、30%的甘氨脫氧膽酸鹽和10%的脫氧膽酸鹽；以及其中OD測定分析通過下列步驟進(jìn)行(a):在微量滴定板的孔內(nèi)裝入0.l50ml的每ml培養(yǎng)基108芽孢桿菌孢子的膽鹽培養(yǎng)基(即，此為0時(shí)刻)；以及(b):將滴定板在37°C下在大氣條件下孵育，使用分光光度計(jì)測定OD63o值并在每次讀數(shù)之前攪動(dòng)，從而獲得代表性的隨時(shí)間變化的生長曲線；以及(ii)芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生植酸酶的量為參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的至少1.25倍，其中產(chǎn)生的才直酸酶的量是在本文實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)已知非選擇性心浸液肉湯(HIB)培養(yǎng)基中在37°C下生長4小時(shí)后通過本文實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)才直酸酶測定法來測定；以及其中才直酸酶測定分析通過下列步驟進(jìn)行(a):在增菌培養(yǎng)基中制備芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物；以及(b):從過夜培養(yǎng)物中將1。/。接種物轉(zhuǎn)移至HIB培養(yǎng)基中(即，此為0時(shí)刻)并在37°C下孵育直至進(jìn)行植酸酶活性測定。如上所述，通過使用GalliPro⑧作為起始菌抹選擇參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467在膽鹽的存在下的迅速出芽和增生。未選擇出DSM19467的植酸酶產(chǎn)量有提高。不限于理論，相信DSM19467的相關(guān)植酸酶產(chǎn)量與GalliPro⑥相當(dāng)。關(guān)于特4正(i),GalliPro⑧的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)為在4和6mM膽鹽中孵育后的至少20小時(shí)，并且對(duì)于新的DSM19489林，如本文所述，其營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)在4和6mM膽鹽中分別在14和15小時(shí)后(見本文的圖2和工作實(shí)施例3)。在此要注意，本發(fā)明人還測試了市售產(chǎn)品CALSPORIN(CalpisCo.,Ltd.,Japan)以測定在第一方面的特征(i)的條件下的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。至于GalliPro,市售產(chǎn)品CALSPORIN⑧是用作益生飼料添加劑的一種枯草芽孢桿菌組合物。對(duì)于CALSPORIN,在第一方面的特征(i)的條件下的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)為分別在4和6mM膽鹽中20小時(shí)以上。這大大超過了在特征(i)中所需的18和19小時(shí)，并且此說明，迄今為止，沒有一種市售產(chǎn)品能被選擇用于迅速出芽和增生。如上所述，"天然"芽孢桿菌細(xì)胞不能在任何選4^壓力下迅速出芽和增生。不限于理論，因此相信"天然"芽孢桿菌細(xì)胞不符合第一方面的特征(i)的條件。的耐膽汁性測定和[特征(ii)]的植酸酶測定都基于已知的市售的標(biāo)準(zhǔn)要素(諸如，例如，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、膽鹽；標(biāo)準(zhǔn)OD測定法和標(biāo)準(zhǔn)才企測)。參考芽孢桿菌細(xì)胞保藏為DSM19467，因此是公眾可以得到的?？莶菅挎邨U菌細(xì)胞GalliPro⑧保藏為DSM17231(命名為"GalliPro")，并且因此也是公眾可以獲得的。因此，基于本文詳細(xì)的測定說明(見，例如，本文的實(shí)施例l的耐膽汁10性測定和實(shí)施例2的植酸酶測定)，專業(yè)技術(shù)人員能夠常規(guī)地重復(fù)這些測定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌細(xì)胞是否符合本發(fā)明的第一方面的[特征(i)]的耐膽汁性和[特征(ii)]的才直酸酶水平。如本文所述的新芽孢桿菌組合物可用作動(dòng)物飼料的益生補(bǔ)充劑。劑量和施用可根據(jù)本領(lǐng)域，例如現(xiàn)有技術(shù)GalliPro⑧芽孢桿菌組合物所采用的方案來進(jìn)行。因此，本發(fā)明的第二方面涉及一種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關(guān)實(shí)施方式的芽孢桿菌組合物結(jié)合其他動(dòng)物飼料成分給予動(dòng)物。本發(fā)明的第三方面涉及一種篩選和分離新芽孢桿菌細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a):從單芽孢桿菌孢子細(xì)胞的集合體內(nèi)篩選并分離出新芽孢桿菌孢子細(xì)胞，該新芽孢桿菌孢子細(xì)胞能夠迅速地出芽和增生，使得其在第一方面的特征(i)的條件下在小于18和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)；(b):從步驟(a)的分離孢子細(xì)胞制備芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，并且將新的選擇和分離的細(xì)胞突變以得到新單芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的集合體；(c):從步驟(b)的新單芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的集合體中選擇和分離新芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，該新芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞能夠在第一方面的特征(ii)的條件下產(chǎn)生的植酸酶的量為以DSM保藏號(hào)19467保藏的參考芽孢桿菌細(xì)胞的至少1.25倍；以及(d):分析步驟(c)的高產(chǎn)的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞以確認(rèn)其保持了步驟(a)的迅速出芽和增生能力，并分離所述被選擇的細(xì)胞。對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員顯而易見的是，一旦本發(fā)明人在本文中公開了相關(guān)的檢測測定法(特別是實(shí)施例1的用于檢測迅速出芽和增生的測定法)力口上參考菌4朱DSM19467，對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員來說，選擇符合本文第一方面的標(biāo)準(zhǔn)的其他新的芽孢桿菌細(xì)胞將是常規(guī)的工作。如本文所討論的，通過使用如本文所述的新的篩選/選擇方法，本發(fā)明人已經(jīng)選擇和分離了許多新的改良芽孢桿菌細(xì)胞，這些細(xì)胞已被保藏。因此，本發(fā)明的第四方面涉及選自下列的芽孢桿菌細(xì)胞(a)保藏號(hào)為DSM19467的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；(b)保藏號(hào)為DSM19489的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；和(c)保藏號(hào)為DSM19466的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；或其突變林，其中所述突變林通過使用所述保藏菌林之一作為起始原料而獲得，并且其中所述突變抹保留了所述保藏菌林的基本特性。下面僅通過實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式。定義本文相關(guān)術(shù)語的所有定義均與本文相關(guān)技術(shù)內(nèi)容所屬領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員所理解的一致。本文中術(shù)語"芽孢桿菌細(xì)胞"是指芽孢桿菌孢子細(xì)胞和芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。關(guān)于芽孢桿菌孢子細(xì)胞，本文中術(shù)語"芽孢桿菌孢子"所指的孢子根據(jù)本領(lǐng)域其特征可以是由芽孢桿菌產(chǎn)生的休眠的、堅(jiān)韌的、無生殖力的結(jié)構(gòu)。孢子的主要功能通常是在環(huán)境應(yīng)激期間確保細(xì)菌的生存。因此它們對(duì)紫外線和Y射線照射、干燥、溶菌酶、溫度、饑餓和化學(xué)消毒劑有耐受性。孢子通常見于土壤和水中，它們?cè)诖丝梢陨婧荛L的時(shí)間。孢子殼對(duì)許多毒性分子不通透，并且還含有參與出芽的酶類。核心具有正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，諸如DNA和核糖體，但是代謝不活躍的。當(dāng)細(xì)菌檢測到環(huán)境條件變得不利時(shí)，它可啟動(dòng)孢子形成過程，需要大約8小時(shí)。術(shù)語"芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞"是指功能性營養(yǎng)芽孢桿菌細(xì)胞，其可分裂產(chǎn)生更多的營養(yǎng)細(xì)胞。術(shù)語"出芽和增生，，是指芽孢桿菌孢子出芽并增生為芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞。如專業(yè)技術(shù)人員所公知的那樣，當(dāng)條件有利時(shí)發(fā)生孢子的復(fù)活，并涉及出芽和增生。出芽是指休眠孢子開啟代謝活性并由此打斷休眠。其普遍的特征在于孢子殼的破裂或吸收，孢子的腫脹，代謝活性的增加，以及對(duì)環(huán)境應(yīng)激的耐受性喪失。增生在出芽之后發(fā)生，并涉及孢子核心制造新的化學(xué)成分并脫離老的孢子殼以發(fā)育成為功能性營養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，該營養(yǎng)細(xì)胞殼分裂以產(chǎn)生更多的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞的生長曲線(OD隨時(shí)間變化)顯示不同的生長期。當(dāng)孢子^f皮轉(zhuǎn)移至富營養(yǎng)培養(yǎng)基中時(shí)，開始出芽，緊接著OD暫時(shí)下降(I期)，這是由于吡。定二羧酸的釋放以及因此孢子殼的水合作用而造成的。在第二期(II期=增生期)中，有一個(gè)時(shí)期OD的變化相對(duì)小，直至孢子發(fā)育成為功能性營養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞，該營養(yǎng)細(xì)胞可分裂以產(chǎn)生更多的細(xì)胞，從而使OD值連續(xù)增加。當(dāng)OD值開始持續(xù)增加達(dá)到0.4的OD時(shí)的點(diǎn)，在本文中被稱為"營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)"。術(shù)語"光密度"被定義為使用分光光度計(jì)測定吸光度的指標(biāo)。光密度(OD)是光學(xué)元件對(duì)給定波長入每單位距離的吸光度。如果，例如，OD在波長630nm下測定，則其可稱為OD630。圖1:在此圖中，圖示了得到本文的新的改良抹的步驟。本文的工作實(shí)施例從DSM17231(GalliPro⑧)開始，其被典型地突變并篩選/選擇在膽鹽的存在下迅速出芽并增生以得到新的選擇抹DSM19467。DSM19467用作用于典型突變的起始菌林，并選擇高植酸酶產(chǎn)量的DSM19489林。類似地，通過使用DSM19467作為起始菌林制備基因修飾生物(GMO)DSM19466林。圖2a和2b:這些圖清楚地顯示與DSM17231相比，在如本文所述的4和6mM膽鹽的存在下，本發(fā)明的DSM19489芽孢桿菌孢子較快地出芽和增生。具體實(shí)施例方式芽孢桿菌組合物去、；五"龍^j^^貧々HA^7"/^i'^ig士&女力石+J^并i—7t太子tb也^點(diǎn)j審解為包括許多具有目的特性的芽孢桿菌孢子細(xì)胞的芽孢桿菌組合物。芽孢桿菌組合物可包括不同類型的芽孢桿菌細(xì)胞(例如，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)。本質(zhì)上，該組合物應(yīng)當(dāng)簡單地包括一定量的本文第一方面中指定的芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞符合第一方面中指定的標(biāo)準(zhǔn)。如專業(yè)技術(shù)人員所公知的，本文中市售的適當(dāng)芽孢桿菌孢子細(xì)胞組合物通常通過發(fā)酵來制備。獲得的孢子細(xì)胞通過被濃縮、干燥、與載體混合并被包裝在合適的容器中。組合物的適當(dāng)?shù)?，例如?05-10^CFU/g芽孢桿菌細(xì)胞可以專業(yè)技術(shù)13人員所公知的市售的適當(dāng)形式存在。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物的105-1012CFU/g芽孢桿菌細(xì)胞作為干燥的(例如，噴霧干燥的)細(xì)胞或作為冷凍的孢子細(xì)胞存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌組合物包括106-1012CFU/g芽孢桿菌細(xì)胞，更優(yōu)選107-1012CFU/g芽孢桿菌細(xì)胞。術(shù)語"CFU/g"是指此組合物的克重量，包括組合物中存在的合適的相關(guān)添加劑。其不包括用來包裝芽孢桿菌組合物的合適容器的重量。一個(gè)實(shí)施方式涉及芽孢桿菌組合物被包裝在合適的容器中。如專業(yè)技術(shù)人員所公知的，市售的相關(guān)細(xì)菌組合物通常還包括其他相關(guān)的添加劑諸如，例如，屬于乳清、乳清滲透物、碳酸鉤/石灰石和防結(jié)塊劑諸如硅酸鋁和硅藻土的一種載體/成分。除了本文的相關(guān)芽孢桿菌細(xì)胞以外，組合物還克包括其他相關(guān)的目的^t生物，諸如，例如，目的乳酸菌。芽孢桿菌細(xì)胞芽孢桿菌細(xì)胞可以是任何相關(guān)的目的芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌細(xì)胞是選自下列芽孢桿菌種的至少一種芽孢桿菌細(xì)胞枯草芽孢桿菌、單鞭毛枯草芽孢桿菌(Sacz7/wMmyZage//a,i),側(cè)孢芽孢桿菌(5fld〃ws/atenw/on/s)、側(cè)孢芽孢桿菌BOD、巨大芽孢桿菌(5ac/〃twmegaten'ww)、多粘芽孑包4干菌(Sac/〃wspo(v附j(luò)^a)、地衣芽孑包桿菌、短小芽孢桿菌(5ac/〃wspw脂7z^)和嗜熱脂肪芽孢桿菌(5ac/〃a)、凝固芽胞桿菌(Sacz7/wcoagw/a似)、嗜熱芽孢桿菌(5acz7/ws/zerwop/n7MS)、蕈卄犬芽孑包4干菌(_Sac/〃ws附少co/i/es1)、蠟才羊芽月包才干菌(5ac/〃附cereMs)牙口環(huán)^1犬芽孑包才干菌(Sac〃/i">cw/a"s)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞或地衣芽3包桿菌細(xì)月包。最優(yōu)選的是其中芽孢桿菌細(xì)胞是枯草桿菌細(xì)胞。選擇在膽鹽的存在下迅速出芽和增生的測定如上所述，第一方面的特征(i)的耐膽汁性測定基于已知的市售標(biāo)準(zhǔn)要素(諸如，例如，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基、膽鹽；標(biāo)準(zhǔn)OD測定法)。因此，基于本文詳細(xì)的測定說明(見，例如本文的實(shí)施例1)，專業(yè)技術(shù)人員能夠常規(guī)地重復(fù)該測定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌孢子細(xì)胞是否符合如特征(i)中所述的從孢子迅速出芽并增生為營養(yǎng)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。在特征(i)中，解釋了營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)是在生長曲線中從對(duì)應(yīng)于0.2-0.3左右的OD的1()S孢子/ml開始直至OD值已經(jīng)以連續(xù)方式增加(由于營養(yǎng)細(xì)胞的生長所引起)，并達(dá)到OD0.4的點(diǎn)的時(shí)刻。如本文所解釋的，即沖艮據(jù)專業(yè)技術(shù)人員如何理解此營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)并基于生長曲線，在約±30分鐘的有限誤差范圍內(nèi)，專業(yè)技術(shù)人員可常規(guī)地確定此生長點(diǎn)。本文的工作實(shí)施例1提供了適于選擇在膽鹽的存在下迅速出芽和增生的耐膽汁性測定的詳細(xì)描述。此實(shí)施例1的詳細(xì)條件是確定目的芽孢桿菌孢子細(xì)胞是否符合第一方面的特征(i)的標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)選測定法。術(shù)語"膽鹽"是指膽汁酸的鹽。膽汁酸是主要在哺乳動(dòng)物的膽汁中發(fā)現(xiàn)的類固醇酸。它們通過膽固醇的氧化在肝內(nèi)產(chǎn)生，并儲(chǔ)存在膽囊中并以鹽的形式分泌至腸內(nèi)。它們用作表面活性劑、乳化脂質(zhì)并協(xié)助其吸收和消化。模擬豬膽鹽的生理濃度和組合物制備用于實(shí)施例1中的膽鹽。如專業(yè)技術(shù)人員所7>知的，與鳥類膽鹽組合物相比，豬膽鹽組合物在本文中可一皮認(rèn)為是相對(duì)"苛刻"的條件。術(shù)語"膽鹽培養(yǎng)基"是指包括相關(guān)的芽孢桿菌生長成分諸如相關(guān)的營養(yǎng)素和膽鹽的培養(yǎng)基。營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)-在膽鹽測定中-第一方面的特征(i)如上所述，關(guān)于第一方面的特征(i),如本文所述，芽孢桿菌孢子細(xì)胞從孢子出芽并增生成為營養(yǎng)細(xì)胞的速度很快使得它們?cè)?和6mM膽鹽中分別在少于18和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到0.4OD的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。如上所述，新的DSM19467抹在4和6mM膽鹽中分別在孵育14和15小時(shí)后達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在第一方面的特征(i)的條件下，芽孢桿菌孢子在4和6mM膽鹽中分別在孵育17和18小時(shí)后達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，更優(yōu)選在第一方面的特征(i)的條件下，芽孢桿菌孢子在4和6mM膽鹽中在孵育15和16小時(shí)后達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)。如上所解釋以及在圖1中示意性的顯示，本文所述的新的DSM19467林通過使用市售的GalliPro⑧作為起始菌林如本文所述用于突變和選擇在膽鹽的存在下的迅速生長而選擇。GalliPro⑧是一種包括枯草芽孢桿菌細(xì)胞的組合物，并且該枯草芽孢桿菌被保藏為DSM17231。因此，在本文中GalliPro⑧可被看作是參考菌林。如上所述，GalliPro的營養(yǎng)細(xì)胞生長起始點(diǎn)為在第一方面的特征(i)的條件下在4和6mM膽鹽中孵育20小時(shí)后。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，在第一方面的特征(i)的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM17231("GalliPro⑧")的參考枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞早至少3小時(shí)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，更優(yōu)選在第一方面的特征(i)的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM17231("GalliPro⑧")的參考枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞早至少4小時(shí)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，且最優(yōu)選在第一方面的特征(i)的條件下，芽孢桿菌孢子比保藏為DSM17231("GalliPro⑧，，)的參考枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞早至少5小時(shí)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長起始點(diǎn)。才直酸酶測定如上所述，第一方面的特征(ii)的植酸酶測定基于標(biāo)準(zhǔn)已知的市售要素(諸如，例如，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，標(biāo)準(zhǔn)檢測)。因此，基于本文詳細(xì)的測定說明(見，例如，本文的實(shí)施例2),專業(yè)技術(shù)人員能夠常規(guī)地重復(fù)該測定以客觀地確定特定的目的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞是否符合如特征(ii)中所述的植酸酶產(chǎn)生量。本文的工作實(shí)施例2纟是供了4直酸酶測定的詳細(xì)描述。此實(shí)施例2的詳細(xì)條件在本文中是優(yōu)選的植酸酶測定以確定目的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞是否符合第一方面的特征(ii)的標(biāo)準(zhǔn)。植酸酶的產(chǎn)生量-第一方面的特征(ii)如上所述，關(guān)于第一方面的特征(ii)，在第一方面的特征(ii)的條件下，芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生植酸酶的量為參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的至少1.25倍。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在第一方面的特征(ii)的條件下，芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生植酸酶的量為參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的至少l.5倍，更優(yōu)選在第一方面的特征(ii)的條件下，芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生植酸酶的量為參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的至少1.75倍。將芽孢桿菌孢子祠養(yǎng)/給予動(dòng)物的方法如上所述，本發(fā)明的第二方面涉及一種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關(guān)實(shí)施方式的芽孢桿菌組合物結(jié)合其他動(dòng)物飼料成分給予動(dòng)物。動(dòng)物可以是任意的目的動(dòng)物。優(yōu)選地，動(dòng)物是選自家禽、反芻動(dòng)物、牛、豬、兔、馬、魚和寵物的動(dòng)物。當(dāng)給予才艮據(jù)本領(lǐng)域的GalliPro⑧時(shí)，正常以一餐約104-108CFU/g,通常以一餐105-106CFU/g的劑量或以與正常攝食量/kg動(dòng)物活重相當(dāng)?shù)膭┝康膭┝客瓿伞？蛇x地，芽孢桿菌孢子可以下列方式之一給予動(dòng)物(1):將其方文入動(dòng)物々欠用水中；(2):噴霧至動(dòng)物體表；或(3):經(jīng)糊劑、凝膠或大丸劑應(yīng)用。篩選和分離新的芽孢桿菌細(xì)胞的方法如上所述，第三方面涉及篩選和分離新的芽孢桿菌細(xì)胞的方法。在第三方面的方法中，選擇能夠滿足第一方面的特征(i)和特征(ii)的條件的芽孢桿菌細(xì)胞。如專業(yè)4支術(shù)人員所理解的，本文詳述的具體的耐膽汁性和才直酸酶量測定(見，例如，本文的用于耐膽汁性測定的實(shí)施例1和本文的用于4直酸酶測定的實(shí)施例2)參數(shù)可被改變成替代的篩選方法，該方法仍然能獲得如本文所述的主要目標(biāo)，即，能夠滿足第一方面的特征(i)和特征(ii)的條件的芽孢桿菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，實(shí)施例1的耐膽汁性測定用于第三方面的篩選方法的步驟(a)中，且實(shí)施例2的植酸酶測定用于第三方面的篩選方法的步驟(c)中。在第三方面的步驟(d)中，分離營養(yǎng)芽孢桿菌細(xì)胞。此營養(yǎng)芽孢桿菌細(xì)胞可用來制備芽孢桿菌孢子形式。17因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，緊接著第三方面的篩選方法之后是額外步驟(e)，其中步驟(d)的分離的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞被發(fā)酵以制成105-1012芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，且這些105-1012芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞用來制成105-1012芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其被分離以得到芽孢桿菌組合物，該組合物包括105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞。步驟(e)的最終結(jié)果是新的芽孢桿菌組合物，該組合物包括105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，并且其中芽孢桿菌細(xì)胞能夠滿足第一方面的特征(i)和特征(ii)的條件。因此，本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立的方面涉及一種芽孢桿菌組合物，該組合物包括105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，并且其中芽孢桿菌細(xì)胞能夠滿足第一方面的特征(i)和特征(ii)的條件，該細(xì)胞可通過第三方面的篩選方法緊接著上述的額外步驟(f)而獲得。在第三方面的篩選方法的步驟(b)中，對(duì)以前選擇的耐膽汁芽孢桿菌細(xì)胞進(jìn)行突變以在步驟(c)中選擇高植酸酶產(chǎn)量細(xì)胞。如專業(yè)技術(shù)人員所理解的，例如，此步驟可通過基因特異性交換的典型突變(例如通過化學(xué)處理或UV)以制成所謂的基因修飾生物(GMO)。例如，本文所述的新的GMO林DSM19466來自GalliPro,并且如本文的工作實(shí)施例中所述纟皮首先制成具有耐膽汁性以獲得DSM19467。此后，DSM194674^中植酸酶的啟動(dòng)子用另一芽孢桿菌啟動(dòng)子交換以使其成為植酸酶高產(chǎn)者，并由此獲得DSM19466。類似地，通過使用從DSM19467開始的典型突變獲得新的高植酸酶產(chǎn)量的DSM19489林。見，例如，圖1。保藏的菌抹如上所述，本發(fā)明的第四方面涉及選自下列的芽孢桿菌細(xì)胞(a)保藏號(hào)為DSM19467的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；(b)保藏號(hào)為DSM19489的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；和(c)保藏號(hào)為DSM19466的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；或其突變林，其中所述突變抹通過使用上述保藏菌林之一作為起始原料而獲得，并且所述突變抹保留了上述保藏菌株的基本特性。本發(fā)明的第四方面涉及本文所述的新菌^^朱或"其突變體，，。對(duì)于專業(yè)技術(shù)人員來說顯而易見的是，通過使用保藏的菌抹作為起始原料，專業(yè)讀者可常規(guī)地通過常規(guī)誘變或再分離技術(shù)，進(jìn)一步獲得保留了本文所述的相關(guān)特征和優(yōu)點(diǎn)的其突變體或其衍生物。因此，第一方面的術(shù)語"其突變體"涉及通過使用保藏菌林作為起始原料獲得的突變林。這可以可選地被表示為獲得菌林的方法，該方法包括-使用本文保藏的菌抹之一作為起始菌抹，制備保藏菌抹的突變體并分離新菌抹，其中突變體保留了保藏菌抹的基本特性。一林新枯草芽孢桿菌菌林的樣品已經(jīng)被保藏在DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MaschroderWeglb,D-38124Braunschweig),保藏號(hào)為DSM19467,保藏日為2007年6月27日。已經(jīng)在國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條件下進(jìn)行了保藏。一抹新枯草芽孢桿菌菌株的樣品已經(jīng)被保藏在DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MaschroderWeglb,D-38124Braunschweig),保藏號(hào)為DSM19489,保藏日為2007年6月進(jìn)行了保藏。一林新枯草芽孢桿菌菌林DSM19466的樣品已經(jīng)被保藏在DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MaschroderWeglb,D-38124Braunschweig)，保藏號(hào)為DSM19466，保藏日為2007年6月27日。已經(jīng)在國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條件下進(jìn)行了保藏。實(shí)施例實(shí)施例1:耐膽汁性測定培養(yǎng)基培養(yǎng)基為標(biāo)準(zhǔn)非選擇性市售培養(yǎng)基小牛肉浸出液肉湯(VIB)(Difco，234420)。在本申{青的申"i青曰時(shí)，來自供應(yīng)商BDDiagnosticSystems(www.bd.com)的產(chǎn)品目錄("DifcoTM/BBLTM手冊(cè))關(guān)于小牛肉浸出液肉湯是如此名又述的"來自瘦小牛肉和蛋白胨的浸出液提供小牛肉浸出液中的氮、微生物、碳和氨基酸。氯化鈉維持制劑的滲透壓平衡"；以及根據(jù)生產(chǎn)廠商的說明書通過下列步驟制備培養(yǎng)基將25g小牛肉浸出液肉湯粉懸浮在lL純水中(2.5。/。溶液)，加熱并頻繁攪動(dòng)，煮沸1分鐘以完全地溶解粉末。2.5%小牛肉浸出液肉湯溶液包4舌每升瘦小牛肉，浸出液10g月示蛋白胨10g氯化鈉5g培養(yǎng)基被分配至無菌瓶中并在121°C下高壓滅菌15min。膽鹽溶液/培養(yǎng)基模擬豬膽汁中膽鹽的生理組成和濃度制備膽鹽混合物，且膽鹽溶解在如上制備的小牛肉浸出液肉湯培養(yǎng)基中以得到膽鹽的終濃度為8mM。結(jié)合型膽鹽為?；敲撗跄懰猁}(SigmaT-0875，美國)和甘氨脫氧膽酸鹽(SigmaG-9910,美國)以及去結(jié)合型膽鹽脫氧膽酸鹽(SigmaD-5670美國)，且最終的8mM混合膽鹽溶液含有60%?；敲撗跄懰猁}，30%甘氨脫氧膽酸鹽和10%脫氧膽酸鹽。使用氫氧化鈉將溶液調(diào)節(jié)至pH7.4,然后在121。C下高壓滅菌15分鐘。將此制備的8mM膽鹽培養(yǎng)基稀釋以得到0、1、2、4、6和8mM的月旦鹽;農(nóng)度。膽鹽以濃縮形式加至小牛肉浸出液肉湯培養(yǎng)基中。因此，在加入膽鹽之前瘦小牛肉浸出液、月示蛋白胨和氯化鈉的最終量與2.5%小牛肉浸出液肉湯培養(yǎng)基基本相同。孢子混懸液為了區(qū)分營養(yǎng)細(xì)胞和孢子，并確保純孢子產(chǎn)品用于接種，使用在80。C下+/-熱處理10min測定芽孢桿菌產(chǎn)品的孢子計(jì)數(shù)。在熱處理并隨后冷卻至室溫后，在蛋白胨鹽水溶液中進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋。從適當(dāng)?shù)氖断♂屢褐腥.lml接種至雙份的胰蛋白月示血瓊脂板(Difco0n01)中。這些板在37。C下孵育至第二天?；谙惹爱a(chǎn)品的孢子計(jì)數(shù)測定，在無菌蒸餾水中制備孢子混懸液以達(dá)到最終計(jì)算的孢子濃度108CFU/ml。使用上述的方法測定最終接種物中營養(yǎng)細(xì)胞和孢子的計(jì)數(shù)。108CFU/ml的終濃度對(duì)應(yīng)于起始OD63o0.2-0.3。生長測定光密度測定4吏用無菌平底96孔孩史量滴定板(GreinerBio-oneGmbH，德國)。每個(gè)孔填充以0.150ml4妄種了孢子(lx108孢子/ml相當(dāng)/對(duì)應(yīng)于起始OD63o0.2-0.3)的VIB,滴定^反在37。C下孵育20小時(shí)，每次讀數(shù)前用強(qiáng)度4(高)的周期振搖1分鐘。為了避免在滴定板蓋的內(nèi)側(cè)上發(fā)生凝聚，蓋子與TritonX-100的稀釋溶液接觸。芽孢桿菌菌抹的出芽和增生動(dòng)力學(xué)使用分光光度計(jì)(Bio-tekInstruments,Inc.VE)在波長630nm(0063())下測定。以10分鐘的間隔進(jìn)行讀數(shù)，并使用KC4TM軟件(Bio-tekInstruments,Inc.,USA)分析。20h后，數(shù)據(jù)輸出至Exce媳電子表格程序以進(jìn)一步分析，輸入至SAS9.0版并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)施例2:植酸酶活性測定在本研究中使用的測定和定量由芽孢桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的植酸酶單位的方法改良自Walsh等人，2004,Biochemistry&MolecularBiologyEducationvol.32no5(336-340)。基本上，作出的僅有的明顯改良是為了生長動(dòng)力學(xué)的目的而對(duì)該方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，該改良為使用分光光度計(jì)測定相對(duì)于活芽孢桿菌細(xì)胞的植酸酶活性并在波長600下測定光密度(OD)，如果需要用稀釋水1:4稀釋細(xì)胞。通過使用該方法，得到相對(duì)有限的標(biāo)準(zhǔn)差。芽孢桿菌細(xì)胞的生長芽孢桿菌細(xì)胞接種并在37°C下生長在增菌芽孢桿菌生長培養(yǎng)基中，芽孢桿菌的生長和植酸酶活性以至多24小時(shí)的間隔進(jìn)行。芽孢桿菌孢子在具有下列組成的心浸液肉湯(HIB)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繁殖HIB(Bacto238400)25g/10.5%Bacto酵母提取物(Difco212750)5g/12mMCaCl2(Merck1.02382)0.294g/l在121。C下高壓滅菌15min,并加入無菌過濾的1%甘露糖和1%葡萄糖。HIB是公知的市售非選擇型培養(yǎng)基。在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日時(shí)，來自供應(yīng)商BDDiagnosticSystems(www.bd.com)的產(chǎn)品目錄說明了每升BactoTM心浸液肉湯的組成/配方為來自500g牛心浸液10.0g胰蛋白月示10.0g氯化鈉5.0g補(bǔ)充的HIB是一種低磷酸鹽含量的培養(yǎng)基，并且因此適合用于植酸酶測定。過夜培養(yǎng)后，使用1。/。接種物用于新鮮HIB培養(yǎng)基中并在37。C下孵育直至活性測定(例如4、6、8和24小時(shí)后)。在藍(lán)帽孔培養(yǎng)板(bluecapNunc)50ml或以較小量(0.150ml)在通風(fēng)良好的96孔ELISA板中完成培養(yǎng)基的孵育。才直酸酶測定對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行植酸酶測定，因?yàn)槊阜置谥僚囵B(yǎng)基中。微量滴定板以3600RPM離心15min。4交大體積在Eppendorf離心才幾中以2400-3600rpm離心15min。小心地去除上清液，在4直酸酶測定前去除細(xì)胞。溶液0、1MTRIS/蘋果酸鹽ph7.0溶液A:0、1MTRIS/蘋果酸鹽(l-蘋果酸，SigmaM1000)pH7.0+0.1w/v來自玉米(sigma8810)的植酸鈉鹽+2mMCaCl2(在測定前新鮮制備的)=底物溶液B:8g鉬酸銨(SigmaA7302)+50mlH20+27ml10MH2S04+H20補(bǔ)足至lOOrnl。溶液C:5gFeS04(sigmaF7002)+90mlH20(攪拌直至溶解)+10ml溶液B(新鮮配制)0.5MTCA(Merck1.00807.1000)8%w/v1mMKH2P04在含有0.020ml的芽孢桿菌上清液的96孔微量滴定板中進(jìn)行測定，其中加入含有0.1%植酸和2mMCaCl2(溶液A)的0.080ml0.1MTris/蘋果酸pH7.0緩沖液。測定板在50°C下孵育30min(遮蓋板以避免蒸發(fā))。顯色反應(yīng)加入0.100ml0.5M三氯乙酸TCA力口入0.100mlFe十+溶液(溶液C)置于在室溫下5分鐘。將出現(xiàn)藍(lán)色。在600nm下讀耳又吸光度。此測定是測定上清液中的總游離磷酸鹽。為了測定游離磷酸鹽的本底量，還在沒有植酸酶的底物(植酸)的存在下進(jìn)行植酸酶測定。這意味著測定中的溶液A(見上)被單一的TRIS/蘋果酸鹽緩沖液pH7.0代替。植酸酶活性的計(jì)算測定中測定的吸光度代表培養(yǎng)基中的游離磷酸鹽和由植酸酶活性釋放的磷酸鹽兩者，因此培養(yǎng)基中的游離磷酸鹽需要被減去。為此，在具有植酸和沒有植酸的緩沖液中測定標(biāo)本，將兩者相減以得到純植酸酶活性。對(duì)于細(xì)胞密度(OD600)的校正，芽孢桿菌培養(yǎng)物的植酸酶活性表示為如此式計(jì)算的活性(單位吸光度)樣品和具有植酸的緩沖液—樣品和沒有植酸的緩沖液離心之前的OD測定值實(shí)施例3:耐膽汁枯草芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的選擇起始芽孢桿菌細(xì)胞為枯草芽孢桿菌細(xì)胞GalliPro⑧。GalliPro⑧被誘變以得到新的單個(gè)芽孢桿菌細(xì)胞的集合體。制備并選擇如上面實(shí)施例1中所述在包括4和6mM膽鹽的膽鹽培養(yǎng)基的存在下從孢子快速出芽和增生為營養(yǎng)細(xì)胞的孢子。選才奪出枯草芽^包桿菌細(xì)胞DSM19467。下面的表1顯示了出芽和增生數(shù)據(jù)。從對(duì)應(yīng)于108CFU/ml的OD0.2-0.3達(dá)到OD0.4的時(shí)間(小時(shí))(3次重復(fù)值的均數(shù))。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在下面的實(shí)施例4中說明耐膽汁和過度表達(dá)植酸酶的DSM19489的選擇。DSM19467具有與DSM19489大致一樣的出芽和增生。結(jié)論DSM19489和DSM19467是耐膽汁菌林，并且很明顯比GalliPro⑧更快地出芽和增生。實(shí)施例4:選擇高植酸酶產(chǎn)量的芽孢桿菌細(xì)胞DSM19489(經(jīng)典型)和DSM19466(GMO)。起始芽孢桿菌細(xì)胞為實(shí)施例3中選擇的枯草芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467。DSM19467通過經(jīng)典突變而被突變以得到新的單個(gè)芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的集合體。通過使用上述實(shí)施例2中所述的植酸酶測定選擇產(chǎn)生大量植酸酶的營養(yǎng)細(xì)胞。選擇了高植酸酶產(chǎn)量的枯草芽孢桿菌細(xì)胞DSM19489(經(jīng)典型)。DSM19467抹中植酸酶的啟動(dòng)子用另一芽孢桿菌啟動(dòng)子交換使其成為植酸酶的高產(chǎn)者，由此獲得DSM19466(GMO)。植酸酶測定的結(jié)果菌林DSM19489枯草芽孢桿菌，耐膽汁和高植酸酶產(chǎn)量DSM19467枯草芽孢桿菌，耐膽汁，DSM19489的母才朱DSM19466枯草芽孢桿菌，耐膽汁和編碼植酸酶的遺傳修飾基因(植酸酶高產(chǎn)者)表2.如上面實(shí)施例2中所述測定的被選擇的菌抹產(chǎn)生的植酸酶的結(jié)果。24<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>DSM19489林產(chǎn)生2.68單位的植酸酶，相比DSM19467(其是參考耐膽汁母抹)產(chǎn)生1.10單位?；蛐揎椀哪湍懼璂SM19466抹(2.30)達(dá)到與DSM19489相似的水平，并且因此它也是植酸酶高產(chǎn)者。結(jié)論DSM19489是耐膽汁的和植酸酶高產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞，并且在此實(shí)施例中在培養(yǎng)基中生長4小時(shí)后，與DSM19467相比產(chǎn)生2倍多的植酸酶。DSM19466(GMO)是耐膽汁菌抹，其中植酸酶基因被基因修飾為植酸酶高產(chǎn)者，并且類似于DSM19489，在培養(yǎng)基中生長4小時(shí)后，其產(chǎn)生的植酸酶為母株(DSM19467)的2倍多。DSM19467來源于GalliPro,且其未^皮選擇有高植酸酶產(chǎn)量。因此，相信，GalliPro⑧產(chǎn)生的植酸酶的量與DSM19467大致相同。實(shí)施例5:植酸酶高產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞DSMl9489(經(jīng)典型)和DSMl9466(GMO)的耐膽汁性"檢查"。在實(shí)施例4中選擇的植酸酶高產(chǎn)的芽孢桿菌細(xì)胞DSM19489(經(jīng)典型)和DSM19466(GMO)如實(shí)施例1中所述，一皮重新;險(xiǎn)查其從孢子迅速出芽和增生為營養(yǎng)細(xì)胞的能力。結(jié)果為，DSM19489和DSM19466保持了與用來獲得它們的起始細(xì)胞DSM19467基本上相同的良好的迅速出芽和增生能力。參考文獻(xiàn)1.AntonieVanLeeuwenhoek.2006Aug;90(2):139-46.Epub2006年7月4曰2.US2003/0124104A3.US6255098權(quán)利要求1.一種芽孢桿菌組合物，包括105-1012CFU/g芽孢桿菌孢子細(xì)胞，其中所述芽孢桿菌組合物的特征在于(i)所述芽孢桿菌孢子在包括4和6mM膽鹽的膽鹽培養(yǎng)基的存在下從孢子快速出芽和增生為營養(yǎng)細(xì)胞，表現(xiàn)為所述芽孢桿菌孢子分別在小于18小時(shí)和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到OD630為0.4的營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)，其中所述營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)是生長曲線中OD值開始以連續(xù)的方式增加(由所述營養(yǎng)細(xì)胞的生長所引起)并達(dá)到OD630為0.4的點(diǎn)；(I)其中所述膽鹽培養(yǎng)基是本文實(shí)施例1的補(bǔ)充了膽鹽混合物的標(biāo)準(zhǔn)已知非選擇性小牛肉浸出液肉湯(VIB)培養(yǎng)基，所述膽鹽混合物包括結(jié)合型膽鹽?；敲撗跄懰猁}和甘氨脫氧膽酸鹽以及去結(jié)合型膽鹽脫氧膽酸鹽，其比例為60％的?；敲撗跄懰猁}、30％的甘氨脫氧膽酸鹽和10％的脫氧膽酸鹽；以及其中所述OD測定分析通過下列步驟進(jìn)行(a)在微量滴定板的孔內(nèi)填充0.150ml的每ml培養(yǎng)基108芽孢桿菌孢子的膽鹽培養(yǎng)基(即，此為0時(shí)刻)；以及(b)將所述滴定板在37℃下在大氣條件下孵育，使用分光光度計(jì)測定OD630值并在每次讀數(shù)之前攪動(dòng)，從而獲得代表性的隨時(shí)間變化的生長曲線；以及(ii)所述芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生植酸酶的量為參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的至少1.25倍多，其中產(chǎn)生的植酸酶的量是在本文實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)已知非選擇性心浸液肉湯(HIB)培養(yǎng)基中在37℃下生長4小時(shí)后通過本文實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)植酸酶測定法來測定；以及其中所述植酸酶測定分析通過下列步驟進(jìn)行(a)在增菌培養(yǎng)基中制備芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的過夜培養(yǎng)物；以及(b)從所述過夜培養(yǎng)物中將1％接種物轉(zhuǎn)移至HIB培養(yǎng)基中(即，此為0時(shí)刻)并在37℃下孵育直至進(jìn)行植酸酶活性測定。2.如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌組合物，其中所述組合物的芽孢桿菌孢子細(xì)胞作為干燥的(例如，噴霧干燥的)孢子細(xì)胞存在。3.如權(quán)利要求1或2所述的芽孢桿菌組合物，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。4.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的芽孢桿菌組合物，其中在如權(quán)利要求1所述的特征(i)的條件下，所述芽孢桿菌孢子比以DSM17231("GalliPro")保藏的參考枯草芽孢桿菌孢子細(xì)胞提前至少3小時(shí)達(dá)到所述營養(yǎng)細(xì)胞生長占J、*、o5.如權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的芽孢桿菌組合物，其中在如權(quán)利要求1所述的特征(ii)的條件下，所述芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生植酸酶的量為參考芽孢桿菌細(xì)胞DSM19467的至少1.5倍。6.—種飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，包括將第一方面和本文所述的相關(guān)實(shí)施方式的芽孢桿菌組合物結(jié)合其他動(dòng)物飼料成分給予動(dòng)物。7.如權(quán)利要求6所述的飼養(yǎng)動(dòng)物的方法，其中所述的動(dòng)物是選自家禽、反芻動(dòng)物、牛、豬、兔、馬、魚和寵物的動(dòng)物。8.—種篩選和分離新芽孢桿菌細(xì)胞的方法，包括下列步驟(a):從單芽孢桿菌孢子細(xì)胞的集合體內(nèi)篩選并分離出新芽孢桿菌孢子細(xì)胞，該新芽孢桿菌孢子細(xì)胞能夠迅速地出芽和增生使得其在第一方面的特征(i)的條件下在小于18和19小時(shí)內(nèi)達(dá)到營養(yǎng)細(xì)胞生長點(diǎn)；(b):從步驟(a)的分離孢子細(xì)胞制備芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，并且將所述新的選擇和分離的細(xì)胞突變以得到新單芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的集合體；(c):從步驟(b)的新單芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞的集合體中選擇和分離新芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞，該新芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞能夠在第一方面的特征(ii)的條件下產(chǎn)生的4直酸酶的量為以DSM保藏號(hào)19467保藏的參考芽孢桿菌細(xì)胞的至少1.25倍多；以及(d):分析步驟(c)的高產(chǎn)的芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞以確認(rèn)其保持了步驟(a)的迅速出芽和增生能力，并分離所述被選擇的細(xì)胞。9.如權(quán)利要求8所述的篩選和分離新芽孢桿菌細(xì)胞的方法，其中所述芽孢桿菌細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。10.—種芽孢桿菌細(xì)胞，選自(a)保藏號(hào)為DSM19467的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；(b)保藏號(hào)為DSM19489的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；和(c)保藏號(hào)為DSM19466的枯草芽孢桿菌細(xì)胞；或其突變林，其中所述突變抹通過使用所述保藏菌林之一作為起始原料而獲得，并且所述突變林保留了所述保藏菌林的基本特性。全文摘要一種芽孢桿菌組合物，其特征在于在膽鹽(模擬腸道環(huán)境)中快速出芽和增生以及高水平的分泌植酸酶。該芽孢桿菌組合物可用作動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑，在飼料中其具有益生(健康促進(jìn))作用并增加動(dòng)物飼料中營養(yǎng)的消化和可利用度。文檔編號(hào)C12N1/20GK101688173SQ200880023522公開日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年6月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月6日發(fā)明者托馬斯·達(dá)爾曼·萊澤,本特·隆德,艾恩·納萊伯格,英吉·奈普申請(qǐng)人:科.漢森有限公司