專利名稱：大規(guī)模一次性生物反應器的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明為用于細胞/組織培養(yǎng)的大規(guī)模一次性生物反應器(disposable bioreactor)，具體而言，是用于植物細胞培養(yǎng)的大規(guī)模生物反應器。
背景技術(shù)：
細胞和組織培養(yǎng)常規(guī)用于各種化合物的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，這些化合物包括例如激 素、酶、蛋白質(zhì)、抗原、食品添加劑和天然殺蟲劑。目前用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)細胞和/或組織培養(yǎng)的技術(shù)基于可反復使用的玻璃或不 銹鋼生物反應器系統(tǒng)，裝配和維護這樣的系統(tǒng)花費巨大。在批與批之間需要對所述生物反 應器系統(tǒng)進行清洗和消毒，而在更換產(chǎn)物時需要更加徹底的清洗，因為需要費錢耗時來驗 證清洗后的清潔度和殘留清洗劑的存在情況。另外，這些類型的工業(yè)化生物反應器系統(tǒng)采用復雜昂貴的混合技術(shù)，例如，穿過昂貴復雜的無菌密封產(chǎn)生動力的葉輪；某些昂貴的生物反應器包含氣升式多部件構(gòu)造，這些 部件構(gòu)造設計用于通過使氣體鼓泡到生物反應器中提供培養(yǎng)基的混合及氣體飽和。然而， 氣壓、氣泡大小和在培養(yǎng)基中產(chǎn)生不合需要的剪切力使得有必要實施復雜的通氣技術(shù)。另 夕卜，所述生物反應器按照當時需要的最高體積容量設計。因此，當從中試植物生物反應器放 大到大規(guī)模生物反應器時，或當出現(xiàn)需要提高超過現(xiàn)有生物反應器的生產(chǎn)容量時，問題就 產(chǎn)生了。目前操作大容量生物反應器的備選方法是將許多玻璃或不銹鋼生物反應器較小模 塊組合起來，其總體積容量與需要相匹配，同時提供某種程度的增加或降低總?cè)萘康膹椥浴?然而，對若干較小生物反應器的使用增加了成本和維護時間，因此，使用若干較小生物反應 器比使用單個的較大的生物反應器花費更大，勞動強度更大。由于這些限制，在現(xiàn)有技術(shù)的生物反應器中培養(yǎng)植物細胞導致其可提取產(chǎn)物(包 括次級代謝物和重組蛋白兩種)相對昂貴，它們在商業(yè)上無法與由備選生產(chǎn)系統(tǒng)生產(chǎn)的同
等產(chǎn)物競爭。目前，在植物細胞生物反應器中生產(chǎn)的唯一基于培養(yǎng)的重組蛋白藥物為用于獸醫(yī) 上治療新城疫病毒(Newcastle virus)的市售抗病毒疫苗。然而，除了這種疫苗之外，目 前僅有極少數(shù)次級代謝物通過在生物反應器中的細胞培養(yǎng)來生產(chǎn)，例如植物代謝物紫杉醇 (paclitaxel)(泰素(Taxol))和紫草素(Shikonin)。在工業(yè)規(guī)模上，生物反應器系統(tǒng)傳統(tǒng)上采用永久性或半永久性生長室。盡管一次 性生長室在本領域眾所周知，但所述生長室通常用于小規(guī)模生產(chǎn)體積，例如家庭釀造和試 驗性的實驗室工作。小規(guī)模生物反應器通常采用可在實驗室裝置中使用的一次性袋。也已經(jīng)提出了適用于較大體積的一次性生物反應器。在現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)中，以多種 方式解決對培養(yǎng)基攪拌和通氣的需要，這種需要對于放大反應器體積更加重要。Applikon Biotechnology (荷蘭)和StedimInc.(法國)提供用50升柔性培養(yǎng)袋的單次使用的生物 反應器系統(tǒng)Appliflex ，所述袋經(jīng)過設計而置于搖動該袋的運動平臺上，以便為培養(yǎng)基提 供通氣和攪拌。Wave Biotech, LLD (Somerset，新澤西州)提供相似的一次性生物反應器設備，其提供體積高達IOOOL的培養(yǎng)袋，該袋也由運動平臺來通氣和攪拌。Hyclone Inc. (Logan，猶他州)與Baxter Biosciences聯(lián)合提供設計用于至多250L的動物細胞培養(yǎng)物 的一次性培養(yǎng)袋(單次使用的生物反應器(Single Use Bioreactor) “SUB”)，該袋設計是 為了對不銹鋼生物反應器容器進行改進。由非一次性的葉輪驅(qū)動器提供通氣和攪拌，該驅(qū) 動器與整合到所述培養(yǎng)袋的復雜葉輪單位連接。Hodge等的美國專利申請第2005/0272146 號公開了具有葉輪片(impellor blade)或其它機械混合裝置的150升一次性生物反應器。 又一類型的一次性生物反應器具有U形袋，需要起重機樣的器械通過往復地提升各側(cè)邊使 培養(yǎng)基攪拌和通氣。還一解決方法基于柔性的培養(yǎng)袋周圍的加壓箍帶(pressured cuff), 該箍帶使得能以有規(guī)律的時間間隔膨脹和收縮，提供擠壓型的混合運動。
在上述所有系統(tǒng)中，支撐及通氣/攪拌系統(tǒng)都使復雜，花費大，容量單一且有限。 因此，盡管所述反應器容器本身可為一次性的并意欲用于單獨使用，但使用這些系統(tǒng)需要 昂貴的設備和維護。也已經(jīng)提出了用空氣使培養(yǎng)物攪拌和通氣的一次性生物反應器設備，然而，將基 于氣泡的通氣和混合改用于大的體積是有問題的。很多較小體積的生物反應器用單個進氣 口和鼓泡器或其它類型的氣泡擴散器來提供充分的通氣[參見例如由以色列Osmotec提供 的ζ生物反應器(Agritech Israel，第一期，1997秋天，第19頁)]。所述系統(tǒng)的一個缺點 是通過引入極小的空氣泡(來自擴散器)來完成通氣導致?lián)p傷細胞，尤其是在對剪切力特 別敏感的植物細胞培養(yǎng)物情況下。用于藥物用途的蛋白質(zhì)傳統(tǒng)上一直在哺乳動物或細菌表達系統(tǒng)中生產(chǎn)。然而，由 于使用例如植物分子生物學系統(tǒng)例如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)方法將基因?qū)胫参锛爸?物細胞用于大量生產(chǎn)蛋白和肽相對簡單，植物細胞技術(shù)成為越來越受歡迎的備選蛋白表達 系統(tǒng)(Ma, J. K. C.，Drake, P. Μ. W.，和 Christou，P. (2003) Nature reviews 4，794-805)。植物細胞培養(yǎng)不同于細菌或哺乳動物細胞培養(yǎng)，這不僅僅是在代謝需求方面，而 且因為通常較大的植物細胞對在常規(guī)工業(yè)生物反應器中的剪切力極度脆弱。因此，在一方 面，在植物細胞培養(yǎng)中提供適當?shù)幕旌弦源_保植物細胞培養(yǎng)物各方面足量通氣非常重要， 但另一方面，必須以適合于脆弱的植物細胞在培養(yǎng)基中生長的方式來做到這點。因此，為了提供較高的產(chǎn)量和產(chǎn)品的質(zhì)量以及提高費用效益，不斷需要改進用于 一次性細胞/組織培養(yǎng)的現(xiàn)有系統(tǒng)和設備。本發(fā)明提供大體積一次性但也可重復使用的生 物反應器，其有效用于生產(chǎn)重組蛋白的多種細胞/細胞培養(yǎng)物，其中業(yè)已解決一次性反應 器體積放大所固有的問題。發(fā)明簡述本發(fā)明一方面提供用于培養(yǎng)和收獲植物組織和/或細胞的一次性設備，所述設 備包含具有至少400升體積并配置有換氣口(gas exchang印ort)和收獲口(harvesting port)的非剛性容器，所述換氣口和收獲口使得所述設備能夠連續(xù)用于至少兩個連續(xù)培養(yǎng) /收獲周期，其中所述設備經(jīng)過設計和構(gòu)建用于保持適于培養(yǎng)所述植物組織和/或細胞的 氧飽和度和剪切力。本發(fā)明另一方面提供用于培養(yǎng)和收獲體積大于400升的植物組織和/或植物細 胞的方法，該方法包括(a)提供具有至少400升體積的一次性非剛性的容器，該容器配置 有使得所述設備能夠連續(xù)用于至少兩個連續(xù)培養(yǎng)/收獲周期的換氣口和收獲口，其中所述設備經(jīng)過設計和構(gòu)建用于保持適于培養(yǎng)所述植物組織和/或細胞的氧飽和度和剪切力；和 (b)經(jīng)由所述收獲口提供接種物；(C)提供無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑；(d)任選地用外 部光源照明所述容器；和(e)允許所述細胞和/或組織在所述培養(yǎng)基中生長到所需產(chǎn)量。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，通過以下參數(shù)的值或值范圍的組合 來保持適于培養(yǎng)所述植物組織和/或細胞的所述氧飽和度與所述剪切力a)高度體積比；b)進氣壓力；c)每橫截面積的進氣口密度；d)進口通氣速率；和e)進口氣泡體積。本發(fā)明另一方面提供包含用于培養(yǎng)和收獲植物組織和/或細胞的一次性設備的 植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)；和適于培養(yǎng)所述植物組織和/或細胞的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述系統(tǒng)進一步包含在所述培養(yǎng) 基中生長的植物細胞懸浮液或組織培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述植物細胞培養(yǎng)物包含從植物根 獲得的植物細胞。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，植物細胞選自被發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacterium rihzogenes)轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細胞、生姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細 胞。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案進一步的特征，所述植物細胞為煙草(tobacco)細胞， 更優(yōu)選煙草(Nicotiana tabaccum)細胞。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案進一步的特征，所述煙草細胞表達人重組乙酰膽堿酯 酶。所述人重組乙酰膽堿酯酶可為乙酰膽堿酯酶-R。所述乙酰膽堿酯酶-R可具有如SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明某些實施方案進一步的特征，所述煙草細胞包含編碼如SEQ ID NO 9 所示的多肽的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述參數(shù)值或值范圍選自至少一種以下值或值范圍 a)約0. 06-約1厘米/升的高度體積比；b)約1巴-5巴的進氣壓力；c)約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度；d)約0. 05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率；和e)約20立方毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述氧飽和度為至少15%體積/ 所述容器中所含的液體體積。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述組合為約0. 06-約1厘米/升 的高度體積比和約1巴_5巴的進氣壓力。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述組合為約0. 06-約1厘米/升 的高度體積比和約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述組合為約0. 06-約1厘米/ 升的高度體積比和約0. 05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述組合為約0. 06-約1厘米/升的高度體積比和約20立方毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述組合進一步包含約20立方 毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積這一參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述組合進一步包含約1巴-5巴 的進氣壓力這一參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述組合進一步包含約20個進口 / 平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度這一參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述組合進一步包含約 0. 05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率這一參數(shù)。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述組合包含約0.06-約1厘米/ 升的高度體積比、約1巴_5巴的進氣壓力、約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米 的進氣口 /橫截面積密度和約20立方毫升(cubic milliliter)-約1800立方毫升的進口 氣泡體積。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述組合為約0. 06-約1厘米/ 升的高度體積比、約1巴_5巴的進氣壓力、約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米 的進氣口 /橫截面積密度、約0. 05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率；和 約20立方毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述高度體積比為約0. Icm/升-約 0. 5cm/ 升。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述高度體積比為約0.44cm/升。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述進氣壓為約1. 5巴-約4巴。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述進氣壓為約1. 5巴-約2. 5巴。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述進氣口 /橫截面積密度為約 40個/平方米-約60個/平方米。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述進氣口 /橫截面積密度為55 個/平方米。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述氣體冒泡速率為約20升/分 鐘-約50升/分鐘，更優(yōu)選30升/分鐘。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述進口氣泡體積為約300立方毫米。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述一次性容器為透明和/或半透 明。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述容器由選自以下的材料制 成聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯和尼龍共聚物、PVC和EVA。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述容器由超過一層的所述材料的層壓材料制成。
根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述設備進一步包含用于支撐所述 設備的支承結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述支承結(jié)構(gòu)包含具有圓錐形底 部的剛性圓筒結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述收獲口位于所述容器底端的 底部。 根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述收獲口接近所述容器底端的底 部，以至于在每個收獲周期結(jié)束時，所述含細胞和/或組織的培養(yǎng)基的所述剩余物自動保 留在所述容器的所述底端至所述收獲口的下水平之間。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述底端基本上為圓錐形。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述底端為大體上的截頭圓錐形。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述容器包含約400升-約30000 升、優(yōu)選約500升-8000升并優(yōu)選約1000升的內(nèi)部可填充體積。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，所述方法進一步包括檢查污染物 和/或所述容器中生產(chǎn)的細胞/組織的質(zhì)量，若發(fā)現(xiàn)污染物或生產(chǎn)的細胞/組織質(zhì)量不好， 則將設備及其內(nèi)容物丟棄；若未發(fā)現(xiàn)污染物，則收獲一部分所述含細胞和/或組織的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，當收獲所述部分時，留下含細胞和/ 或組織的培養(yǎng)基的剩余部分在所述容器中，其中所述培養(yǎng)基剩余物用作下一個培養(yǎng)/收獲 周期的接種物。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案再進一步的特征，所述方法進一步包括提供用于 下一個培養(yǎng)/收獲周期的無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑；和重復生長周期直到發(fā)現(xiàn)所述污 染物或所生產(chǎn)的細胞/組織質(zhì)量不好，此時將設備及其內(nèi)容物丟棄。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案又進一步的特征，其中在至少一個培養(yǎng)/收獲周期 始終通過所述換氣口連續(xù)供應無菌空氣。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，在至少一個培養(yǎng)/收獲周期期間通 過所述多個進氣口脈沖式供應無菌空氣。根據(jù)本發(fā)明下述優(yōu)選實施方案進一步的特征，所述設備沒有用于使培養(yǎng)基混合和 通氣的機械裝置。本發(fā)明通過提供有效用于生產(chǎn)重組蛋白的多種細胞/細胞培養(yǎng)物的大體積一次 性但也可重復使用的生物反應器及其使用方法和系統(tǒng)，成功地解決了目前已知構(gòu)造的缺
點ο附圖簡述本文通過引入附圖僅以例示的方式闡述本發(fā)明?，F(xiàn)在對附圖進行具體詳細的提 及，應該強調(diào)的是，所顯示的細節(jié)是作為例示的方式的，并且僅以闡述性討論本發(fā)明優(yōu)選實 施方案為目的，介紹它們的原因是為了提供被認為是最有用和最易于理解的對本發(fā)明原理 和概念方面的說明。在這一點上，不試圖以比基本理解本發(fā)明所需要的更詳細的方式來顯 示本發(fā)明結(jié)構(gòu)細節(jié)，對附圖所進行的說明使本領域技術(shù)人員清楚地明白本發(fā)明的若干形式是怎樣在實踐中具體實施。在附圖中 圖1以側(cè)面剖視圖闡明本發(fā)明設備的例示性實施方案的主要部件；圖2以正視圖闡明本發(fā)明設備的例示性實施方案的主要部件和例示性支承結(jié)構(gòu)；圖3為顯示在用大規(guī)模一次性生物反應器的植物細胞培養(yǎng)中達到的良好氧飽 和度的柱狀圖。將胡蘿卜細胞接種到不同體積的生物反應器中的培養(yǎng)基中錐形瓶(藍 色柱)；10升反應器(PX-10，紅色柱)；100升反應器(PX-100，白色柱)和400升反應器 (PX-400，橙色柱)，并在各系統(tǒng)的最佳條件下培養(yǎng)3-4天(參見下文材料和方法)。每個反 應器都裝備有用于在指出的天數(shù)測定O2飽和度[用Fibox 3 (PresensPresision Sensing GmbH)測定 O2]的無菌硅芯片[(貨號 SFPST3Y0PSUP (Presens Presision Sensing GmbH)]。 注意在大規(guī)模(PX-100和PX-400)生物反應器中優(yōu)越的O2飽和度水平；圖4為顯示用大規(guī)模一次性生物反應器的優(yōu)選產(chǎn)量的重組G⑶的蛋白印跡照片。 在PAGE上分離如下文所述制備的(參見材料和方法)來自不同體積的生物反應器的4或 7天細胞培養(yǎng)提取物的5 μ 1粗提物樣品，印跡到硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜上，并與特異性兔抗GCD 多克隆抗體反應。通過SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物顯現(xiàn)條帶。第1道-具有 鼓泡器的10升反應器；第2道-具有8mm鉆孔口(bore opening)的10升反應器；第3 道-從第4天開始加入100 %氧氣的10升反應器；第4和5道-第4天的400升反應器；第 6道-第7天的400升反應器；第7和8道-第7天的100升反應器；第9和10道-prG⑶ 標準品25ng。注意與10和100升反應器比較，在大規(guī)模一次性生物反應器中G⑶顯著更高 的產(chǎn)量；圖5a_5b為顯示離子交換色譜消除消泡劑_C的RP-HPLC分析。將0. 075 % C型 消泡劑乳液(Dow Coming , Corning，NY)加樣到15ml陽離子交換柱(Bio Rad USA)，在 262nm處監(jiān)測流過樣品、洗滌樣品和鹽梯度(0. 2M NaCl ；1. 2M NaCl ；和含12% EtOH的1. 2M NaCl)洗脫樣品，以檢測消泡劑-C。圖5a顯示加樣到柱中的溶液中消泡劑-C的檢測。圖 5b顯示流過色譜柱的消泡劑-C的檢測。注意到消泡劑-C沒有在色譜柱上被保留；圖6為顯示在大規(guī)模一次性生物反應器中生產(chǎn)的G⑶的身份(identity)的 SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE上分離來自400升反應器(第1道，10 μ g)、80升反應器(第 2和3道，分別為10 μ g和20 μ g)的G⑶樣品和商業(yè)上制備的葡糖腦苷脂酶Cerezyme (IOng 和20ng)(第4和5道，分別為IOyg和20yg)。通過用考馬斯藍染色顯現(xiàn)帶。第6道為分 子量標記。注意到來自大規(guī)模、小規(guī)模生物反應器的GCD和市售葡糖腦苷脂酶制備物的電 泳等同性；圖7為顯示大規(guī)模一次性生物反應器中產(chǎn)生的G⑶的身份的蛋白印跡。在 SDS-PAGE上分離來自400升反應器(第1和2道，分別為50ng和IOOng)、80升反應器(第 3和4道，分別為50ng和IOOng)的G⑶樣品和商業(yè)上制備的葡糖腦苷脂酶Cerezyme (第 5和6道，分別為50ng和IOOng)，印跡到硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜，并與特異性兔抗GCD多克隆抗 體反應。通過SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物顯現(xiàn)條帶。注意到來自大規(guī)模、小規(guī) 模生物反應器的GCD和市售葡糖腦苷脂酶(Cerezyme )制品的電泳和免疫學等同性；圖8a_8d顯示在大規(guī)模一次性生物反應器中生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶的肽作圖(胰蛋 白酶消化)。用蛋白酶消化從小規(guī)模一次性生物反應器(80升)和大規(guī)模一次性生物反應器(400 升)收獲的葡糖腦苷脂酶樣品，在 RP-HPLC Jupiter 4u Proteo 90A 柱(Phenomenex， 00G-4396-E0)上分離，以產(chǎn)生氨基酸“指紋圖譜”，在214nm和280nm處監(jiān)測各片段。圖8a 和8b為在10升生物反應器中產(chǎn)生的葡糖腦苷脂酶的概況(profile) (8a在214nm處檢測； 8b在280nm處檢測)。圖8c和8d為在400升生物反應器中產(chǎn)生的葡糖腦苷脂酶的概況 (圖8c在214nm處檢測，圖8d在280nm處檢測)。注意到大規(guī)模和小規(guī)模一次性生物反應 器中的產(chǎn)物的等同性；
圖9a_9b為顯示在大規(guī)模一次性生物反應器中生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶的RP-HPLC 分析的圖。根據(jù)下文所詳述來純化收獲自大規(guī)模一次性生物反應器(400升)的葡糖腦苷 脂酶，在C-4RP-HPLC柱上分析，并在214nm處(圖9a)和280nm處(圖9b)監(jiān)測。注意到 prG⑶作為具有64. 12分鐘保留時間的單峰出現(xiàn)，與prG⑶標準品(64. 70分鐘)相似；圖10為顯示用大規(guī)模一次性生物反應器生產(chǎn)的prG⑶的良好純度的IEF凝膠照 片。在等電點聚焦凝膠中分離在大規(guī)模一次性生物反應器(400升)中生產(chǎn)并在如下文所 述的5個柱純化過程中純化的prGCD樣品，以及純化自小規(guī)模一次性生物反應器(10升) 的prG⑶樣品。第2道-來自大規(guī)模，第3個純化階段；第3道-來自大規(guī)模，第4個純化 階段；第4道-來自大規(guī)模，第5個純化階段；第5道-來自小規(guī)模；第1和6道，IEF PI標 準品。注意到來自大規(guī)模一次性生物反應器的在所有純化階段中的prGCD的等同性和高純 度水平；圖11為顯示用大規(guī)模一次性生物反應器生產(chǎn)的prG⑶的純度的蛋白印跡。在 SDS-PAGE上分離來自400升反應器(第1和2道，分別為50ng和IOOng)、80升反應器(第 3和4道，分別為50ng和IOOng)的G⑶樣品、商業(yè)上制備的葡糖腦苷脂酶Cerezyme (第5和 6道，分別為50ng和IOOng)和胡蘿卜宿主蛋白(CHP)(第7和8道，分別為50ng和IOOng), 印跡并與特異性抗CHP多克隆抗體反應。通過SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物顯現(xiàn) 條帶。注意到如所有其它prGCD制備物一樣，在大規(guī)模一次性生物反應器中沒有雜質(zhì)；圖12為顯示用于為培養(yǎng)基提供通氣和混合的多個進氣口的本發(fā)明例示性一次性 生物反應器的底端和例示性圓錐形剛性支承結(jié)構(gòu)的照片。圖13為顯示本發(fā)明例示性大規(guī)模一次性生物反應器的整套裝置(bartery)的照 片；圖14為顯示可重復使用的收獲口的本發(fā)明例示性生物反應器的照片；圖15為顯示免疫檢測植物表達的人重組AChE的蛋白印跡的照片。用針對人源 AChE的N-末端肽產(chǎn)生的親和純化的山羊多克隆抗體(Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)(在AChE-R和AChE-S中一樣)，檢測按照本發(fā)明一個實施方案在大規(guī)模一次性生 物反應器中生產(chǎn)的重組人AChE-R(第1-3道)和商業(yè)上制備的重組人AChE-S (第4-6道) 的以下量50(第3和7道)、100(第2和6道)和200ng (第1和5道)。第4道為分子量 標準品。在所有樣品中明顯都有強的抗體結(jié)合；圖16為按照本發(fā)明一個實施方案在大規(guī)模一次性生物反應器中生產(chǎn)的植物表達 的人重組AChE-R與市購AChE-S概況比較的Flamingo 非特異性蛋白染色SDS-PAGE凝膠 的照片。如圖13分離植物表達的AChE-R(第1-3道)和哺乳動物細胞產(chǎn)生的AChE-S (第 5-7道)，如本文所述用Flamingo 試劑染色凝膠。注意到AChE-R遷移概況符合用抗AChE 抗體免疫測定所檢測的AChE-R的遷移概況(上述圖13)。另外，圖13所示的凝膠上觀察到的單個條帶表明純化效率；圖17為檢測在大規(guī)模一次性生物反應器中培養(yǎng)的植物細胞的乙酰膽堿酯酶催化活性的染色Karnovsky測定凝膠。從BY-2細胞中純化具有催化活性的乙酰膽堿酯酶-R，所 述BY-2細胞收獲自根據(jù)本發(fā)明一個實施方案在400L大規(guī)模一次性生物反應器中培養(yǎng)的細 胞的合并批次。在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠上在非變性條件下分離純化自細胞的減少量 的蛋白(第1和4道=200ng;第2和5道=lOOng，第3和6道=50ng)，經(jīng)洗滌，處理以 顯示乙酰膽堿催化活性(Karnovsky染色)。用相應的乙酰膽堿-S的量(第4_6道)作為 對照。在10%不變性聚丙烯酰胺凝膠上在非變性條件下進行AChE-R和AChE-S電泳。凝 膠在4°C下運行，用H2O漂洗3次，并在含硫代乙酰膽堿(0. 5mg/mL ；Sigma)、乙酸鈉(65mM， pH6. O ；Sigma)、檸檬酸鈉(5mM ；Sigma)、硫酸銅(3mM ；Sigma)和鐵氰化鉀(0. 5mM ；Riedel De Haen)的緩沖液中攪拌孵育1小時。肉眼檢測催化活性。上面的箭頭表示AChE-S的四 聚體的遷移。下面的箭頭表示AChE單體的遷移。優(yōu)選實施方案說明本發(fā)明為用于培養(yǎng)植物組織或細胞的可重復使用的一次性設備。具體而言，本發(fā) 明設備包括具有以下尺寸和氣體交換口的非剛性容器所述尺寸和氣體交換口經(jīng)過設計用 于保持適于在400升或更多培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織或細胞的溶氧濃度和剪切力。所述設備 可用于培養(yǎng)用于從細胞和/或培養(yǎng)基生產(chǎn)來源于植的重組生物學活性物質(zhì)(例如藥物)的 轉(zhuǎn)化植物細胞。本發(fā)明還提供使用本發(fā)明設備的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。參考附圖和


可更好地理解本發(fā)明原理和運作。在詳細解釋至少一個本發(fā)明實施方案之前，應該理解的是，本發(fā)明不限于其在以 下說明中闡述的或通過實施例例述的細節(jié)中的應用。本發(fā)明能夠為其它實施方案或以各種 方式來實行或執(zhí)行。還應該理解的是，本文采用的措辭和術(shù)語用于說明目的，不應該當作限 制。如上所述，使一次性生物反應器放大到大體積需要特殊的解決通氣和混合問 題的方法。某些現(xiàn)有技術(shù)生物反應器為此目的采用氣體。Proulx等的美國專利申請第 2005/0282269號公開了為了提供通氣和混合具有多個進氣口及內(nèi)置氣體分散器和在進口 處的過濾器的一次性生物反應器，這些部件都置于容器底端。由于過濾器與液體培養(yǎng)基接 觸往往會被阻塞并干擾適當?shù)臍怏w供應，所述構(gòu)造受到限制。沒有公開體積容量或尺寸。Cellexus Biosystems，PCC(Cambridge，英國)提供使用氣體用于通氣和攪拌的另 一個類型的一次性生物反應器。這種生物反應器為柔性袋，其具有沿著設備底端內(nèi)部固定 或放置的整體鼓泡器，用于導入空氣或氣體來通氣和混合。Cellexus的生物反應器袋按照 獨特的不對稱幾何學來設計，它將大部分袋內(nèi)流體體積集中在生物反應器上半部分。為了 運作這種設計需要特別設計的支承圍欄(Cellmaker Lite )。Gaugler等的美國專利第6，432，698號公開了用于培養(yǎng)線蟲類的柔性的一次性培 養(yǎng)袋。該培養(yǎng)袋配備有管形的進氣口和擴散器用于培養(yǎng)基的通氣和混合。盡管沒有付諸實 踐，但預想體積達200升。具體的尺寸沒有公開。Hodge等的美國專利申請第2005/0272146號公開了具有用于混合的整合葉輪片 的150升一次性生物反應器。已知在生物反應器中由葉輪進行的混合培養(yǎng)基會產(chǎn)生不適于 培養(yǎng)植物細胞的剪切力。
Shaaltiel等美國專利第6，391，683號(其如同在本文中完全提出一樣在此引作 參考)公開了一次性培養(yǎng)設備，其包含具有進氣口和出氣口的非剛性的袋，其設計用于單 次使用或用于多周期培養(yǎng)和收獲。該設備通過細調(diào)氣泡體積和數(shù)量來利用空氣壓力，以使 培養(yǎng)物混合和通氣。業(yè)已報道用Shaaltiel所述的生物反應器有效培養(yǎng)準確表達多種異 源(哺乳動物和非哺乳動物)的重組蛋白的轉(zhuǎn)化植物細胞(參見美國專利第6，391，683 號、美國專利申請第10/784，295號；國際專利公開PCTW02004/091475、W02005/080544 和TO2006/040761，所有的都如同在本文中完全提出一樣在此引作參考)所述。然而， Shaaltiel等在6，691，683中公開了適于較小和中等大小的體積的設計，其限制了在其之 中合成的重組蛋白的產(chǎn)量。
在將本發(fā)明付諸于實踐時，本發(fā)明人設計了由透明或半透膜非剛性的材料構(gòu)建的 大規(guī)?？芍貜褪褂玫囊淮涡陨锓磻?。該生物反應器具有以下部分取樣口，使得可使用 至少兩個連續(xù)培養(yǎng)周期；特定的尺寸；和換氣口，其以足以使生物反應器中的細胞培養(yǎng)物 混合和通氣的方式提供氣體，且提供用于使植物細胞在大于400升的體積中有效生長的合 適的溶氧濃度和剪切力。因此，本發(fā)明一方面提供用于培養(yǎng)和收獲植物組織和/或細胞的一次性設備。本發(fā)明設備包括具有至少400升體積的非剛性的容器，其配置有使得設備可連續(xù) 用于至少兩個連續(xù)培養(yǎng)/收獲周期的換氣口和收獲口。盡管本發(fā)明設備可用于培養(yǎng)任何類型的細胞或組織，但其被設計為能夠以足夠大 的規(guī)模培養(yǎng)植物細胞和組織。培養(yǎng)基的氧飽和度對于細胞的有效生長和重組蛋白表達至關重要，因此，其對正 確運行生物反應器及其在生產(chǎn)重組細胞產(chǎn)物中的使用很關鍵。用于植物細胞培養(yǎng)生長的生 物反應器的氧飽和度更加重要，因為植物細胞比起細菌或哺乳動物細胞更加易受氧飽和度 波動的影響(參見Schlatmann等，Biotech. Bioeng.，1995 ；45 :435_39)。此外，植物細胞在 常規(guī)生物反應器中對水動力環(huán)境敏感，主要可能是由于植物細胞較大、廣泛的空泡形成和 聚集方式。因此，在通過將氣泡導入容器使培養(yǎng)基通氣也提供混合時，必須避免對脆弱植物 細胞有害的剪切力。最近業(yè)已證明培養(yǎng)中的植物細胞因響應特有的“亞溶解”應答而對亞 致死量的剪切力敏感，這進而顯著限制植物細胞生物反應器的效能(Namdev和Dulop，App. Biochem and Biotech, Part A, Frontiers inBioprocessing,1995)。因此，本發(fā)明設備通過采用對決定培養(yǎng)物中的氧飽和度和剪切力至關重要的參數(shù) 或參數(shù)組合，保持適于在400升或更大體積中培養(yǎng)植物組織和/或細胞的氧飽和度和剪切 力。通過以下值或值范圍來保持適于在該設備中培養(yǎng)植物組織和/或細胞的氧飽和 度和剪切力a)高度體積比；b)進氣壓力；c)進氣口 /橫截面積密度；d)進口通氣速率；和 e)進口氣泡體積。高度體積比機械混合法不適用于植物細胞生物反應器，尤其是當處理大體積培 養(yǎng)基時。大規(guī)模生物反應器中培養(yǎng)基的通氣和混合可通過使氣泡穿過培養(yǎng)基的運動來完 成。氣泡與培養(yǎng)基接觸得越充分，氣體交換的可能性就越大，氣體在培養(yǎng)基中的混合行為就 越有效。因此，盡管可允許較小體積生物反應器的高度體積比有較大的靈活性，但以大體積 (例如400升或更大)使用的生物反應器設備的高度體積比應該保持在約0. 06-1厘米/升的范圍內(nèi)。可由設備容器的高度(長度)和設備的平均橫截面來計算高度體積比。本文所 用設備的體積是高度乘以橫截面積。例如，對于具有200厘米高(長)和400L(具有例如平 均約25厘米的半徑)體積的生物反應器，高度體積比為200/400或0. 5 ；對于具有300Gm高 和3000L體積的生物反應器，高度體積比為300/3000或0. 1。適用于本發(fā)明生物反應器的 高度體積比范圍實例為約0. 06-1厘米/升，優(yōu)選約0. 1-約0. 5，最優(yōu)選約0. 44厘米/升。此外，應該理解，可用容器的可填充總內(nèi)體積或用其指定部分來計算高度體積比，所述指定部分的體積為容器的功能上可填充工作內(nèi)體積，不包括通常在生物反應器流體水 平以上存在的“頂部空間”。進氣壓力為了提供足夠的氣體(例如空氣或氧氣)用于大規(guī)模生物反應器的培 養(yǎng)基的混合和通氣，在一個或多個進口處的氣壓需要足以克服生物反應器中液柱的向下壓 力，同時避免與形成太多氣泡或?qū)χ参锛毎囵B(yǎng)而言大小不適合的氣泡有關的剪切力。具 有適于植物細胞培養(yǎng)的高度體積比的大規(guī)模本發(fā)明生物反應器，比體積更小的生物反應器 需要更大的進氣口氣壓。氣壓以巴單位來表示，其中1巴為每cm2 100, 000帕斯卡(Pa)或 1，000, 000達因。用于監(jiān)測的壓力計和用于控制一個或多個進氣口氣壓的壓力調(diào)節(jié)器在本 領域眾所周知，可到處市購。適于本發(fā)明生物反應器的進氣壓力范圍的實例為約1. 5巴-約 4巴范圍，更優(yōu)選約1.5巴-約2. 5巴。進氣口 /橫截面積密度小體積生物反應器通常限于一個或極少幾個進氣口，以 給生物反應器容器中培養(yǎng)基的混合和通氣提供所需體積的足夠的氣泡。另一方面，大體積 生物反應器例如本發(fā)明設備，需要較大的進氣口密度，以克服設備中培養(yǎng)基柱的壓力，并達 到所需的進氣壓力范圍，以至于以適用于植物細胞培養(yǎng)的方式提供混合和通氣。為了提供 對一個或多個進氣口壓力的控制并保持氣泡大小為最適合用于大體積生物反應器中的培 養(yǎng)基的混合和通氣，提供了多個進氣口，這些進氣口以既定密度安置在設備的一次性非剛 性的容器上。進氣口密度以設備容器的每平方米外表面的進氣口數(shù)量來表示。適用于本發(fā) 明生物反應器的進氣口密度范圍實例為約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米容器 表面。優(yōu)選地，進氣口 /橫截面積密度為約40-60個進口 /平方米，更優(yōu)選55個進口 /平 方米。進口通氣速率增加通氣(即存在更快速的氣體交換)而且具體地為增加氧氣通 常都能提高培養(yǎng)中的細胞的生長速率。用于植物細胞培養(yǎng)的較小體積的生物反應器通常在 進氣口處以0. 15-0. 3vvm(體積空氣/體積培養(yǎng)基/分鐘)的通氣速率提供空氣，且隨著體 積增加提高通氣速率。然而，在較小的封閉體積(enclosed volume)中和在較大的等效體 積(equivalent volume)內(nèi)，氣泡促進細胞循環(huán)的效率是不同的，因此，與具有相同合并體 積的培養(yǎng)基的多個較小體積的通氣速率相比，在大體積內(nèi)需要非成比例的通氣速率來促進 空氣循環(huán)和氧氣分布。在將本發(fā)明付諸于實踐時，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，不是隨著體積增加而成比 例地提高通氣速率(vvm)，而是通過在大規(guī)模生物反應器中減小通氣速率(測量為vvm)范 圍，獲得改進的效果。適于在大體積生物反應器中培養(yǎng)植物細胞的一個或多個進氣口通氣 速率范圍實例為約0. 05-0. 12vvm，優(yōu)選約0. 07vvm-約0. lvvm。所述降低通氣速率的優(yōu)點 包括在大體積生物反應器中產(chǎn)量較高和能量效率提高，這在工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)中非常顯著。進口氣泡體積在大規(guī)模反應器中合適的混合器械的重要性不用多說。在某些情況下，尤其是涉及植物細胞的情況下，氣泡大小對于生物反應器中細胞的有效培養(yǎng)和生長極為重要。小氣泡事實上可損傷植物細胞，不超過20立方毫米的平均氣泡體積基本上能克 服這一潛在的問題。因此，連同進氣口氣壓及進氣口數(shù)目一起，對進氣口氣泡體積的控制， 對于實現(xiàn)使植物細胞有效生長的培養(yǎng)基的混合和通氣很重要。盡管一個或多個進氣口遞送 的氣泡大小可根據(jù)設備的使用而變化，但進口氣泡體積的合適范圍實例為20-超過1800立 方毫米體積，優(yōu)選約40立方毫米-約1000立方毫米，更優(yōu)選約100立方毫米-約500立方 毫米，最優(yōu)選約300立方毫米。在需要較小氣泡的情況下，可在進氣口使用鼓泡器以減小氣 泡大小，但不能低于適于大規(guī)模植物細胞生物反應器的大小。因此，本發(fā)明一次性生物反應器相對于目前已知設備具有很多優(yōu)點，包括但不限 于提供大體積培養(yǎng)條件，同時按照本文所述參數(shù)保持植物細胞培養(yǎng)物和培養(yǎng)基較好的通 氣和非機械混合，從而達到較高產(chǎn)量及較好純度的所培養(yǎng)的細胞及來源于所述細胞的產(chǎn) 物。圖1闡明本發(fā)明設備實施方案，在本文中稱為設備10。如圖1所示，設備10包括用于培養(yǎng)和收獲植物組織和/或細胞的容器12。所顯示 的容器12部分地充滿液體，因此在圖1中呈其膨脹(且相對剛性)的狀態(tài)，然而，應該注意 優(yōu)選將容器12構(gòu)建為非剛性的容器(例如由柔性材料構(gòu)建)。因此，容器12內(nèi)容物對容器 壁的壓力保持容器12的形狀。當將其排空或部分填充時，容器12由于其非剛性設計的性 質(zhì)可能會部分或基本上扁縮。容器12的這一特征有利于在其排空時儲存和運輸。容器12 具有能容納約400升-約30000升、更優(yōu)選約500升-8000升、最優(yōu)選約600-3000升的內(nèi) 體積。容器12可具有約0. 06-1厘米/升的典型高度體積比。容器12優(yōu)選由聚合物構(gòu)成，聚合物例如有聚乙烯、聚碳酸酯、聚乙烯和尼龍共聚 物、聚氯乙烯(PVC)、乙烯-乙酸乙烯共聚物(EVA)和乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)?？墒褂?不同等級、密度和類型的聚合物，例如低密度聚乙烯(LDPE)、極低密度聚乙烯(VLDPE)、超 低密度聚乙烯(ULDPE)、線性低密度聚乙烯(LLDPE)等等?？赏ㄟ^熔接聚合物片，吹塑熔融 的聚合物，或本領域已知的任何其它標準塑料聚合物制造方法，來構(gòu)建容器12。在優(yōu)選的構(gòu)造中，容器12由若干層一個或多個類型的聚合物的層壓材料構(gòu)成。所 述層壓材料可含有2、3、4和多達7、9、15或更多層，這些層可由不同厚度的相似或不同的柔 性材料制成，所述材料和厚度例如按照容器12的流體體積來選擇。所述各層可通過復合擠 壓制成?？稍O計層壓材料以便為容器內(nèi)外表面提供特定的光滑或粗糙質(zhì)地、較大或較小的 拉伸強度、彈性、柔軟性、柔韌性、剛度、耐久性、加工性能等等?？蛇x擇具有低水平或優(yōu)選沒 有失活動物來源的加工助劑的材料。層壓材料中可包含諸如硅石或硅藻土等增滑劑和/或 抗粘連劑，以減少摩擦和/或防止自我粘附。本發(fā)明容器12可由設計以給容器提供透明和/或半透膜性質(zhì)的材料制成，在某些 實施方案中，當光線將損傷細胞或產(chǎn)物時，材料也可為非半透明。本文所用透明定義為清澈 易于傳遞大部分(但不是所有)光線，而半透明定義為傳遞某些而不是所有光線。在一個 實施方案中，設備用于培養(yǎng)植物細胞，所述植物細胞不具有光合作用的能力。在另一實施方 案中，其中設備用于培養(yǎng)其它類型的細胞，例如蘚類細胞或藻類細胞、具有光合作用能力的 光合細菌可在該設備中培養(yǎng)。優(yōu)選地，可傳遞到容器內(nèi)體積的光的波長適于由生物反應器 中培養(yǎng)的植物細胞的光合作用色素和其它集光色素所利用。光也可為次級代謝物的產(chǎn)生所需，例如釀酒葡萄細胞產(chǎn)生的花色素苷。更優(yōu)選地，容器12由以下材料設計而成所述材料 使得可由肉眼或儀器(例如分光光度計)觀察和/或監(jiān)測內(nèi)體積，以至于檢測潛在表明培 養(yǎng)狀態(tài)的培養(yǎng)物和/或培養(yǎng)基的變化(例如顏色、細胞聚集情況、因污染而產(chǎn)生的濁度)。
可以以任何所需外形來制作容器12，優(yōu)選錐形套筒狀外形，其具有經(jīng)由兩側(cè)壁18 連接的頂14和底16 (圖1中的圓錐形)，當容器12排空時壁18扁平，而當容器12充滿時， 壁18提供基本上是圓筒形的橫截面形狀。諸如矩形或多邊形等其它橫截面形狀也可適合。應該了解圓筒形最適合細胞培養(yǎng)容器，其始終提供最均勻且不受阻礙的流體流 動，以在混合時具有最低限度的湍流并產(chǎn)生最小的不合乎需要的對植物細胞培養(yǎng)物有害的 剪切力。優(yōu)選地，底16適當?shù)爻尚我允钩两底钚』?。例如，?6可為至少具有一個或多個 向上傾斜壁的大體上的截頭圓錐形(如圖1所示)。在將本發(fā)明付諸于實踐時，本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)該形狀用于避免細胞沉降優(yōu)于圓錐形，細胞沉降可增加衰退和細胞死亡，從而影響培養(yǎng) 物的總存活率?；蛘撸?6可為大體上的圓筒形或備選的凸起狀。底16的前述外形使得 氣體能夠在底16附近供至容器12，以促使容器內(nèi)容物混合運動，有效使容器中的沉降最小 化。然而，底16在本發(fā)明其它實施方案中可為大體上扁平?？赏ㄟ^粘合/熔接兩塊(形成側(cè)壁18)的合適材料來制成容器12。例如，可將兩 片聚合物材料切成近似拉長的矩形，并將一片疊在另一片上。然后以本領域眾所周知的方 式將所述片熔融粘結(jié)(fusion bonding)在一起，以沿著兩個長邊的邊緣和沿著短端之一的 外周形成接縫，再次平行粘結(jié)并朝內(nèi)移置，以在所述容器的頂14形成接縫?？赏ㄟ^沿著兩個傾斜的接縫線熔融粘結(jié)所述片剩余的短端，使長邊的接縫互相 靠攏，來形成容器的底16。任選地，可通過與長邊接縫接近成直角的另一熔接(fusion welding)縫線，在兩條傾斜接縫的頂端上方使它們連接。在將兩塊片熔接在一起之前，可在 對應于用于相應的進口和出口的連接點的位置熔接剛性塑料凸臺(boss)(以下進一步闡 述)O也可用柔性聚合材料連續(xù)套筒制成容器12，這避免了沿容器長邊熔接接縫的需 要，并始終在大部分容器高度上提供連續(xù)完整的圓形橫截面。使用套筒材料來制作是符合 需要的，因為沒有接縫可使得在培養(yǎng)基的通氣和混合期間湍流和剪切力最小化。如圖1所示，容器12進一步包括收獲口 191，用于收獲至少一部分含細胞和/或組 織的培養(yǎng)基，藉此使設備10連續(xù)用于至少兩個連續(xù)培養(yǎng)或收獲周期，而無需在周期之間進 行清洗、滅菌和/或檢測?；蛘撸山?jīng)由位于生物反應器底的另外的收獲口(1911)來實現(xiàn) 收獲，該收獲口用于排出所有生物反應器內(nèi)容物，由此使得能夠收獲生物反應器的全部培 養(yǎng)物。將含細胞和/或組織的培養(yǎng)基的剩余次要部分作為接種物用于下一個培養(yǎng)和收獲周 期，其中可如下所述來提供培養(yǎng)基和/或所需的添加劑。還可將一個或多個收獲口 19用于 將最初體積的接種物導入到容器中，以及用于使收獲的物質(zhì)能夠流經(jīng)那里并流出容器外。一個或多個收獲口 19包括具有收獲進口 22和收獲出口 24的收獲管20，收獲進口 22與容器12的內(nèi)體積流體相連，收獲出口 24位于容器12的外部?；蛘撸鍪斋@口 19可 由熔接到容器12的單孔構(gòu)成，該孔在內(nèi)側(cè)與內(nèi)體積接觸，并有通到容器外側(cè)的出口。收獲 管20可由聚合物材料或合金制成，其在本領域眾所周知。因為收獲經(jīng)常受到細胞團存在的阻塞，所以優(yōu)選收獲管20制成具有大的內(nèi)徑(例 如在I-IOcm范圍內(nèi))和/或具有使得可排走阻塞的彈性程度。
根據(jù)容器12體積選擇一個或多個收獲口19的位置，以使培養(yǎng)基及細胞和/或組 織的剩余部分為容器12體積的預定部分(例如5-35% )。收獲口 19可位于容器12底附近位置，這使得可收獲大部分容器12內(nèi)容物，同時 保留一部分含細胞和/或組織的培養(yǎng)基用作接種物。作為備選或此外，收獲口 1911可位于容器12的底16的更低部位，于是操作者可 任選地手動確保在收獲所需部分的培養(yǎng)基及細胞和/或組織后使合適的含細胞和/或組織 的培養(yǎng)基部分能保持在容器12中。在底16的較低部位具有開口 1911使得能夠除去所有 或大部分培養(yǎng)基。應該理解，盡管上文將一個或多個收獲口 19和1911的所述位置作為備選方案提 出，但可將二者都結(jié)合到單個設備10中，為操作者提供可選擇的收獲口。一個或多個收獲口 19進一步包括流量調(diào)節(jié)器26。流量調(diào)節(jié)器26可為例如用于調(diào) 節(jié)物質(zhì)經(jīng)由一個或多個收獲口 19流進或流出容器12的流量的閥。也可經(jīng)由無菌連接器調(diào) 節(jié)流量，該連接器可由耐用的可滅菌材料例如玻璃、不銹鋼、剛性塑料等制成。一個或多個 收獲口 19還可包括諸如流體捕集器(fluid trap)等防污染裝置(未顯示)，以防止收獲后 無意地將物質(zhì)引入到容器12中。容器12可包括附加的取樣口，其構(gòu)造與一個或多個收獲口 19相似，可位于收獲口 19附近。容器12進一步包括用于引入培養(yǎng)基或其它添加劑的任選附加的添加劑進口 51。 在某些實施方案中，添加劑進口 51位于容器12的頂端，與培養(yǎng)基上面的“頂部空間”相連。 在其它實施方案中，添加劑進口 51位于接近容器12的中部或底端。在其它實施方案中，添 加劑進口 51還可包括諸如流體捕集器等防污染裝置(未顯示)，以防止在添加培養(yǎng)基過程 中或以后無意地將物質(zhì)引入到容器12中。設備10進一步包括用于使氣體通入和排出容器12的換氣口。換氣口包括至少一 個進氣口 28和至少一個排氣口 30，前者用于為了植物細胞培養(yǎng)物的通氣和混合使氣體(例 如空氣、氧氣或其它氣體)穿過培養(yǎng)基，后者用于排出穿過容器12的內(nèi)容物(例如培養(yǎng)基 及細胞)的氣體。進氣口和出氣口可裝備有本文所詳述的過濾器49。在一個實施方案中提 供多個進氣口，以更好地分布氣壓，同時為所需氣泡流動提供必需的流入。一個或多個進氣口 28可經(jīng)由一個或多個供氣管連接至供氣裝置(例如泵)。進氣口 28可由柔性(例如聚硅氧烷)或剛性材料(例如不銹鋼)制成。進氣口 28的入氣口 34 (入氣口 34(1)在位置I對應于進氣口 28(1)，入氣口 34(11)在位置II對 應于進氣口 28 (II))，設計為提供適于使植物培養(yǎng)基通氣和混合并防止沉降且不產(chǎn)生不合 乎需要的剪切力的氣泡體積，其如上文所述。入氣口 34形狀可變化(窄的、寬的、錐形的、 圓錐形的、圓形的等等)，以提供所期需的氣泡形狀和大小?；蛘撸龆丝诳沙蕛?nèi)開口和外 開口直徑不同的一個部件的形式，如關于收獲口 19所述。換氣口 28和30、一個或多個收獲口 19和任選的取樣口，都可通過以下方式來形 成在容器12表面制造開口，并在開口周圍用另外的剛性或非剛性的材料加固此開口，其 在本領域眾所周知。為了提供合適的混合和通氣，可以以20-70個進口 /平方米的密度提供許多個進 氣口 28。進氣口 28可按自容器12的底端16的預定距離環(huán)繞容器12的周長來安置。進氣 口 28的位置由容器的體積和高度以及由用于特定植物培養(yǎng)應用所需的通氣類型來確定。進氣口 28可位于距容器底16的15-65厘米處。在本發(fā)明一個實施方案中，至少一個進氣 口位于收獲口 18以下的水平。根據(jù)需要可提供另外的進氣口 28，例如用于具有極大的高度尺寸的容器或用于較大體積的容器，以提供較大的氣體體積而不增加入氣口壓力或氣泡體積。另外的進氣口 28 可定位在容器12表面的任何位置，優(yōu)選定位在容器12的一半高度的底部，以便為培養(yǎng)基提 供充分的混合和通氣。所述具有多個進氣口的構(gòu)造在此由在位置I [28 (I)]和II [28 (II)] 的進氣口顯示，其分別具有入氣口 34(1)和34(11)并且以彼此相距一段距離安置，以便為 植物細胞培養(yǎng)物提供有效的混合和通氣。進氣口可進一步含有防污染的機械裝置，例如過 濾器49或捕集器(未顯示)，其可防止污染性氣體、液體或固體(例如空氣傳播的微生物) 進入到容器12的內(nèi)體積和培養(yǎng)基內(nèi)。容器12包括用于排出和除去聚集在培養(yǎng)基上方的氣體的排氣口 30。排氣口 30位 于容器12的上半部，優(yōu)選位于上三分之一部分，在基本上高于流體(例如培養(yǎng)基)水平的 位置，以便與培養(yǎng)基上方的“頂部空間”流體相連。排氣口 30的外部排氣開口 46可向環(huán)境 開口，在排氣口 30處不能調(diào)節(jié)排出氣體的流動。任選地和備選地，排氣口 30可進一步包括 排氣調(diào)節(jié)器48 (例如壓力閥或夾)，其調(diào)節(jié)氣體從容器12流出，因此能用于在容器12內(nèi)形 成正氣壓，并從而保持容器12充分膨脹并處于所期需的圓筒形。排氣口 30可進一步包括 防污染的機械裝置，例如過濾器49或捕集器(未顯示)，其可防止污染性氣體、液體或固體 (例如空氣傳播的微生物)進入到容器12的內(nèi)體積和培養(yǎng)基內(nèi)。因為本發(fā)明容器12設計為用于至少400和高達幾千升培養(yǎng)基的體積，并因為其具 有柔韌性的特性，所以設備10進一步包括支撐容器12處于適當位置的支承結(jié)構(gòu)。如圖2所示，支座50可包括圓錐形結(jié)構(gòu)，其設計為給容器12提供支撐而不給容器 12或其中的內(nèi)容物施力。支座50可由鋼鐵、木料、塑料或陶瓷來制成。支座可由形成環(huán)形52和桿狀54支 座結(jié)構(gòu)單元的格狀結(jié)構(gòu)的輕質(zhì)圓筒形管或橢圓形管制成。或者，支座結(jié)構(gòu)單元可為板，其與 垂直的桿狀結(jié)構(gòu)單元連接，并進一步與水平的環(huán)形結(jié)構(gòu)單元連接。所述板可為連續(xù)板，其基 本上形成殼狀的容器支座；或可為狹板(stave-like)，提供在它們之間留有間隔的寬支座 元件的環(huán)。支承結(jié)構(gòu)50可為自由直立式，或安裝有腳輪(未顯示)用于移動，或其可進一 步通過連接至剛性結(jié)構(gòu)例如墻、地板、柱子等等來支撐。容器12為一次性的，因此設計為以最小損失和對環(huán)境影響最小的方式使用(一個 或多個培養(yǎng)周期)后丟棄。例如，用塑料(例如用于本發(fā)明設備的柔性塑料)制成的設備 相對便宜，因此如果需要的話可在用后丟棄而經(jīng)濟損失是可忽略的。這些生物反應器設備 的丟棄對于使用者而言并不存在經(jīng)濟上的缺點，因為這些項目的低投資費用恰好補償了使 用、儲存和其它實用考慮的便利性。丟棄是有利的，因為其排除了對使用可能污染環(huán)境的消 毒劑和其它刺激性化學藥品進行徹底洗滌的需要。因此，聚合的一次性生物反應器設備例 如容器12可易于循環(huán)使用，從而降低了因它們的使用而帶來的污染和環(huán)境影響。盡管可對容器12消毒并重新使用，但優(yōu)選以預先消毒的形式提供，藉此排除對費 錢耗時的滅菌程序的需要?？捎脻袷胶?或干式滅菌法對非剛性容器實施滅菌。優(yōu)選地， 滅菌為適用于本文所提及的柔性非剛性的塑料材料的干式滅菌法，例如，Y輻射或電子束 輻射、氣體(例如環(huán)氧乙烷)滅菌等等，其在本領域眾所周知。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，先前所述的單獨的設備和/或整套裝置(battery)的 操作由計算機(未顯示)控制。任選并優(yōu)選計算機能夠控制本發(fā)明整套裝置和/或設備運 行的所述參數(shù)，參數(shù)例如為以下中的一種或多種溫度、進入容器的氣體或氣體組合的量及 定時、允許排出容器的氣體的量及定時、加入至少一種物質(zhì)(例如營養(yǎng)物、培養(yǎng)基等等)的 量及定時、和/或光量。計算機可任選地還能夠檢測所產(chǎn)生的廢料的量。優(yōu)選將計算機連接到運行本發(fā)明所涉及的各種測量儀器，來作為用于自動或半自 動運行本發(fā)明的系統(tǒng)的實例。例如，優(yōu)選將計算機連接到用于控制氣體或氣體組合流動的 一個或多個量表(未顯示)。所述量表優(yōu)選被連接到可連接合適的供氣裝置的管道，并控制 空氣或其它一種或多種氣體流向該管道。還優(yōu)選將計算機連接到溫度計，所述溫度計更優(yōu)選存在于容器12的環(huán)境中，但更 優(yōu)選不在容器12內(nèi)。計算機還任選并優(yōu)選能夠控制用于控制溫度的機械裝置，例如加熱器 和/或冷卻器。任選并優(yōu)選將計算機連接到用于控制培養(yǎng)基和/或其它營養(yǎng)物從營養(yǎng)物/培養(yǎng)基 容器流向容器12的量表。優(yōu)選將計算機連接到容器的至少一個口，更優(yōu)選連接到至少是收獲口 19。計算機 任選地可控制自動取樣器和/或收獲器，用于從任選的取樣口移出容器內(nèi)容物的部分用于 檢測和/或收獲(未顯示)。還可任選地將計算機連接到用于分析這些內(nèi)容物部分的分析 儀，例如以給計算機的操作提供反饋。如上所述，設備10設計為用于培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)物。適于在本發(fā)明設備中的大體 積植物細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可為本領域已知的任何植物細胞培養(yǎng)基。特別的但非限制性 的合適培養(yǎng)基的實例為 Murashige 和 Skoog 培養(yǎng)基(Sigma Ltd, St Louis, MO)、Anderson 培養(yǎng)基、Schenk和Hildebrandt培養(yǎng)基等等。很多植物組織培養(yǎng)基可市購(參見例如 Phytotechnology Laboratories，Shawnee Mission，KY) 0短語“植物細胞培養(yǎng)物”指任何類型的野生型(天然存在的)植物細胞或遺傳修飾 的植物細胞(例如能夠穩(wěn)定或瞬時表達外源基因)。優(yōu)選地，它是指產(chǎn)生活性成分的細胞培 養(yǎng)物，所述活性成分在商業(yè)上需要用于制藥工業(yè)(藥物或藥物API)、食品工業(yè)(例如香料、 芳香劑)、農(nóng)業(yè)(例如殺蟲劑)、化妝品等等。優(yōu)選地，植物細胞培養(yǎng)物包含從植物組織例如根或葉分生組織獲得的植物細胞。 更優(yōu)選地，植物細胞選自發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrihzogenes)轉(zhuǎn)化的根細胞、芹菜細 胞、生姜細胞、煙草細胞、苜蓿細胞、西紅柿細胞、萵苣細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞?？稍诒景l(fā)明中生長的另外的細胞培養(yǎng)物包括酵母、蘚類、藻類、光合細菌。適用于本發(fā)明設備和方法的植物細胞培養(yǎng)物包括但不限于已建立的細胞系和 產(chǎn)生于植物根、葉、莖、花等的細胞系。已建定的細胞系的非限制實例為煙草(Mcotiana tabacum) L. cv Bright Yellow—2 (BY—2)細胞系禾口煙草 Nicotiana tabacum) L. cv. Petit Havana細胞系。應該理解，需要增加進氣口壓力、增加進氣口密度、增加氣體的通氣速率和體積， 以提供適于本發(fā)明大規(guī)模生物反應器的混合和通氣，這可能出現(xiàn)使植物細胞培養(yǎng)基產(chǎn)生泡 沫的問題，這一問題可能對細胞和培養(yǎng)基內(nèi)容物有害。本領域已知用于抑制泡沫形成的方 法包括但不限于使用消泡劑，例如聚硅氧烷、有機磷酸鹽和醇類，它們起促成小氣泡會合為
20較大的危害較小的氣泡的作用。通常用于工業(yè)和食品加工中的食品級消泡劑包括例如聚二 甲基硅氧烷和二甲基硅油(Simethicone)。消泡劑在本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器中的 應用詳述于以下實施例部分。本發(fā)明還涉及用于在大規(guī)模一次性生物反應器中培養(yǎng)和收獲植物細胞的方法。所 述設備任選并優(yōu)選按下文所述設備來配置，最優(yōu)選按以下實施例1所述的設備來配置。在 該方法中，優(yōu)選將植物細胞置于本發(fā)明設備容器內(nèi)。任選并更優(yōu)選地，植物細胞在懸浮液中培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施方案，植物細胞在液態(tài)培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，根據(jù)需要加入至 少一種無菌氣體或氣體組合(多種氣體)。任選并優(yōu)選地，無菌氣體包括無菌氣體組合，其 更優(yōu)選包含無菌空氣。無菌氣體和/或氣體組合優(yōu)選在每個周期中通過空氣進口連續(xù)或脈 沖式加入到容器中，該空氣進口優(yōu)選與除菌過濾器(優(yōu)選為0.2微米的過濾器)連接，其如 上所述。優(yōu)選將無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑置于容器內(nèi)并通過添加劑進口 51轉(zhuǎn)移到生 物反應器中，優(yōu)選經(jīng)過如前所述的一個或多個除菌過濾器。任選并優(yōu)選通過收獲器加入植物細胞(作為無菌接種物實例)。任選并優(yōu)選地，容 器(12)中的植物細胞可例如通過外部光源(在容器外部的照明源)接觸光，尤其是如果該 容器為透明和/或半透明的情況下。任選不使用光源，任選容器保持在黑暗條件下。使細胞能夠生長到所需的細胞產(chǎn)量和/或由細胞產(chǎn)生的物質(zhì)(例如蛋白或次級代 謝物)的產(chǎn)量。根據(jù)優(yōu)選實施方案，優(yōu)選讓過量的空氣和/或廢氣通過氣體出口，任選地經(jīng)過過 濾器，任選并更優(yōu)選連續(xù)和/或間歇排出容器。此外，任選并優(yōu)選地，檢測容器中的物質(zhì)(例如細胞培養(yǎng)基)是否有一種或多種污 染物和/或容器中生產(chǎn)的細胞的質(zhì)量和/或一種或多種細胞產(chǎn)物的質(zhì)量。更優(yōu)選若發(fā)現(xiàn)一 種或多種污染物存在于培養(yǎng)物中，或發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的細胞和/或一種或多種細胞產(chǎn)物的質(zhì)量不 好，則丟棄設備及其內(nèi)容物。在合適的時候，尤其是若未發(fā)現(xiàn)一種或多種污染物和/或未發(fā)現(xiàn)細胞和/或一種 或多種細胞產(chǎn)物質(zhì)量不好，則優(yōu)選收獲容器中的至少第一部分物質(zhì)(例如含細胞和/或一 種或多種細胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基)。更優(yōu)選地，使剩余的第二部分物質(zhì)(例如含細胞和/或一種 或多種細胞產(chǎn)物的培養(yǎng)基)保留在容器中，其中所述第二部分可任選地作為接種物用于下 一個培養(yǎng)/收獲周期。接下來，可通過添加劑進口 51提供無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑用 于下一個培養(yǎng)/收獲周期，添加劑進口 51任選地與過濾器49連接用于防止污染。先前所述周期任選實施多于一次。任選并優(yōu)選地，所述方法使得能夠厭氧培養(yǎng)和 /或收獲細胞。對于厭氧的實施方案，通過設備的進氣口提供惰性氣體來代替氧氣或空氣。對于 其至少一種設備而言，實施以下過程。經(jīng)由收獲口將無菌接種物導入設備。接下來，經(jīng)由共 用的添加劑進口管將無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑加到設備中。任選地，如先前所述來照 明設備。使設備中的細胞在培養(yǎng)基中生長到所需的細胞產(chǎn)量和/或一種或多種細胞產(chǎn)物 的產(chǎn)量。任選并優(yōu)選地，允許過量空氣和/或廢氣經(jīng)由排氣口，任選地經(jīng)過過濾器，更優(yōu)選連續(xù)地排出設備。就先前所述方法而言，根據(jù)一種或多種污染物和/或質(zhì)量不好的細胞和/或一種 或多種質(zhì)量不好的細胞產(chǎn)物的存在情況來監(jiān)測容器中的物質(zhì)，在存在的情況下優(yōu)選丟棄容 器及其內(nèi)容物。此外，就先前所述方法而言，優(yōu)選在合適時間收獲細胞和/或一種或多種細 胞產(chǎn)物，例如當業(yè)已產(chǎn)生了所需量的一種或多種細胞產(chǎn)物時。水純化系統(tǒng)通常將基本上無內(nèi)毒素的去離子水供給含有濃縮培養(yǎng)基的罐，然后將 稀釋的培養(yǎng)基經(jīng)由添加劑進口泵到設備10中。將過濾器(通常為0.2微米)安裝到進料 管中并且恰好在進口上游，以使每個設備10中的容器內(nèi)容物污染風險最小化。作為選擇或 此外，可使用閥來使該風險最小化。對于每個設備10的第一個培養(yǎng)周期，在預先滅菌的容器中將接種物與培養(yǎng)基或 水預先混合，并通常經(jīng)由收獲口但備選或任選地經(jīng)由單獨的添加劑進口導入到設備10中， 所述接種物通常為在設備10中收獲所需的細胞類型的足量樣品。然后經(jīng)由收獲口或經(jīng)由 任選添加劑進口將培養(yǎng)基導入到設備10中。對于隨后的周期，如上文所述，僅導入培養(yǎng)基 和/或添加劑。通常，空氣壓縮機經(jīng)由以下多個儀器為每個設備10提供基本上無菌的空氣 或氣體用于除去顆粒的粗過濾器；用于除去濕氣的干燥器和濕度儀器(humidity apparatus)；和用于除去污染物的精濾器，通常為0. 2微米。優(yōu)選地，恰好在進氣口上游的 另一過濾器進一步使容器內(nèi)容物污染風險最小化。對于每個設備10，對容器12的所有連接，即對一個或多個進氣口、添加劑進口的 連接和優(yōu)選地還有對一個或多個排氣口和收獲口的連接，都要在使用前滅菌，并在對外圍 設備連接期間保持無菌，對外圍設備的連接包括例如通過在層流氣流罩(laminar airflow hood)中進行連接來供氣和排氣。對于每個設備10的溫度控制優(yōu)選由合適的空氣調(diào)節(jié)裝置來提供。當需要用于細 胞生長或化合物生產(chǎn)時，任選的照明設備可由適當?shù)匕仓迷谠O備10周圍的合適的熒光燈 來提供。在每個設備10的每個培養(yǎng)周期期間，對應于容器12的各內(nèi)容物通常在控溫和光 照條件下通氣并混合約3天-約14天或更長時間。根據(jù)每個培養(yǎng)周期的個別需要來確定 培養(yǎng)條件和培養(yǎng)持續(xù)時間，這些需要例如為所培養(yǎng)的細胞類型、待收獲的重組產(chǎn)物、接種物 的濃度等等。在每個設備10的培養(yǎng)周期結(jié)束時，通常用合適的連接器(如上文所述在連接 前和連接期間滅菌)將對應的收獲器口連接到預先滅菌的環(huán)境。然后進行收獲，留下約 2. 5%-約45% (但通常為約10%-約35%)的細胞和/或組織作為接種物用于下一個周期。然后根據(jù)需要可任選地干燥或提取所收獲的細胞/組織和/或一種或多種細胞產(chǎn) 物。另外任選的調(diào)節(jié)是在細胞培養(yǎng)過程期間加入純氧氣，更優(yōu)選在開始培養(yǎng)過程后的 第3或第4天加入。適于在本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器中培養(yǎng)的優(yōu)選細胞類型的實例，為在 以下實施例部分所述的轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞。如實施例部分所述，該細胞為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞，其表達編碼人葡糖腦苷脂酶(hGCD)的 外源基因。在本發(fā)明一方面的另一實施方案中，細胞類型為煙草(Nicotiana tabacum) 0 在本發(fā)明又一實施方案中，所述煙草(Nicotiana tabacum)細胞為BY_2細胞。用于在適 用于本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器的胡蘿卜細胞和其它細胞類型中轉(zhuǎn)化和表達外源基 因的方法在本領域眾所周知。用一次性生物反應器在胡蘿卜細胞和其它細胞培養(yǎng)物中轉(zhuǎn) 化和表達有生物活性的外源蛋白詳細公開于美國專利申請第10/784，295號和PCT公開 W02004/096978，它們完全在此弓|作參考。以下實施例部分例證了本發(fā)明設備在培養(yǎng)上述胡蘿卜細胞和煙草(Nicotiana tabacum)細胞中的應用。如其中所述，在具有大于400升體積的大規(guī)模生物反應器設備10 中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的胡蘿卜和煙草細胞，產(chǎn)生較高產(chǎn)量和純度的重組蛋白。在大規(guī)模和較小規(guī) 模的一次性生物反應器中培養(yǎng)表達人葡糖腦苷脂酶的胡蘿卜細胞和表達乙酰膽堿酯酶-R 的煙草細胞，并且分析和比較了培養(yǎng)條件、產(chǎn)量和產(chǎn)物(參見實施例2和3)。結(jié)果顯示本 發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器提供了 在顯著低的進口通氣速率條件下增加的培養(yǎng)基02飽 和度(即以高達30%持續(xù)至少7天培養(yǎng)時間)，以及較高的培養(yǎng)效率，得到較高的重組蛋白 產(chǎn)物產(chǎn)量。通過肽作圖(圖8)、IEF(圖10)、SDS-PAGE和免疫學分析(圖7和15-17)和色 譜法(圖6和9)分析重組蛋白，結(jié)果顯示來自收獲自大規(guī)模一次性生物反應器的細胞的葡 糖腦苷脂酶和乙酰膽堿酯酶的酶制備物，等同于用標準規(guī)模技術(shù)獲得的標準制備物，這強 有力地表明從80L、400L和800L生物反應器收獲的細胞所產(chǎn)生的酶制備物的一致性和身份 (identity)。還顯示來自大規(guī)模一次性生物反應器的酶制備物表現(xiàn)出相當(如果不是更高 的話)的催化活性和比活性(參見表5和圖17)。另外，還顯示在本發(fā)明大規(guī)模一次性生物 反應器中產(chǎn)生的重組葡糖腦苷脂酶不含有可檢測的胡蘿卜宿主細胞蛋白水平，其仍然 比由標準體積生產(chǎn)方法(圖11)制備的葡糖腦苷脂酶更純。因此，本發(fā)明大規(guī)模一次 性生物反應器可提供準確有效和更優(yōu)越的條件用于放大在較小甚至小很多的體積中產(chǎn)生 (develop)的表達重組蛋白的植物細胞培養(yǎng)物的規(guī)模。
實施例現(xiàn)在提及以下實施例連同以上說明以非限制性方式闡明本發(fā)明。通常，本文所用術(shù)語和本發(fā)明中使用的實驗室方法包括分子、生物化學、微生物 學和重組DNA技術(shù)。所述技術(shù)在文獻中有詳盡的解釋。參見例如“Molecular Cloning :A laboratory Manual (分子克隆實驗室手冊)”Sambrook 等，(1989) ；"Current Protocols in MolecularBiology(目前分子生物學方案)”第 I-III 卷，Ausubel，R. M.編輯(1994)； Ausubel 等，“Current Protocols in Molecular Biology (目前分子生物學方案)”，John Wiley 禾口 Sons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, "APractical Guide-Molecular Cloning(實用指南-分子克隆)”，John ffiley&Sons, New York(1988) ；Watson 等 "Recombinant DNA( M 砠 DNA)Scientific American Books, New York ；Birren 等 (編輯)“GenomeAnalysis :A Laboratory Manual Series (基因組分析實驗室手冊叢 書)”,第 1-4 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)；在美國專利 第 4，666，828 號、第 4，683，202 號、第 4，801，531 號、第 5，192，659 號和第 5，272，057 號 中所示的方法；"Cell Biology :A LaboratoryHandbook(細胞生物學實驗室手冊)”，第
23I-III 卷，Cellis，J. E.編輯(1994) ；Freshney, ffiley-Liss, N. Y.的 “Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique (動物細胞培養(yǎng)-基本技術(shù)手冊)”(1994)，第三版; "Current Protocols in Immunology (免疫學當前方案)”第 I-III 卷，Coligan J. E.編 輯(1994) ；Stites 等(編輯)的 “Basic and Clinical Immunology (基礎及臨床免疫 學)”(第 8 版)，Appleton 和 Lange，Norwalk, CT(1994) ；Mishell 和 Shiigi (編輯)的 "Selected Methods inCellular Immunology (細胞免疫學選擇方法)”，W. H. Freeman 和 Co. , New York(1980)；廣泛闡述于專利和科學文獻中的有用的免疫測定，參見例如美國專 利第 3，791，932 號、第 3，839，153 號、第 3，850，752 號、第 3，850，578 號、第 3，853，987 號、 第 3，867，517 號、第 3，879，262 號、第 3，901，654 號、第 3，935，074 號、第 3，984，533 號、 第 3，996，345 號、第 4，034，074 號、第 4，098，876 號、第 4，879，219 號、第 5，011，771 號 和第 5，281，521 號；"Oligonucleotide Synthesis (寡核苷酸合成)”Gait，M. J.，編輯 (1984) ；"Nucleic Acid Hybridization (核酸雜交)” Hame、B. D.，和 Higgins S.J.編 輯(1985) ；"Transcription and Translation (轉(zhuǎn)錄和翻譯)”Hame、B. D.，和 Higgins S. J.編輯(1984) ；"Animal Cell Culture (動物細胞培養(yǎng))” Freshney，R. I.編輯 (1986) ；"Immobilized Cells and Enzymes (固定化細胞和酶)” IRL Press, (1986) ；"A Practical Guide_MolecularCloning(實用指南-分子克隆)”Perbal，B.，(1984)和 "Methods inEnzymology"H 1-317^,Academic Press ；"PCRProtocols :A
Guide (PCR 方案指南-方法和應用)”，Academic Press, SanDiego, CA (1990) ；Marshak 等， "Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual (蛋白純化和表征策略-實驗過程手冊)”CSHL Press (1996)；所有的這些文獻都如 同全部提出一樣在此引作參考。本文各處提供了其它一般參考資料。認為其中的方法在本 領域眾所周知，提供它們是為了讀者方便。其中含有的所有信息在此引作參考。實施例1在大規(guī)模一次性生物反應器中有效培養(yǎng)植物細胞為了檢測用大規(guī)模一次性生物反應器生產(chǎn)的培養(yǎng)物和細胞產(chǎn)物的生長參數(shù)、產(chǎn)量 和特性，在大規(guī)模和較小規(guī)模的一次性生物反應器中培養(yǎng)表達人葡糖腦苷脂酶的胡蘿卜細 胞，并且分析和比較了培養(yǎng)條件、產(chǎn)量和產(chǎn)物。材料和實驗方法轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)表達GCD的胡蘿卜細胞如實施例2所述實施細胞轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)。在生物反應器中放大培養(yǎng)物生長將含rh-G⑶基因的約1cm(直徑)遺傳 修飾的胡蘿卜細胞愈傷組織，接種到含4.4gr/l MSD培養(yǎng)基(Duchefa，Haarlem, The Netherlands)、9. 9mg/l 鹽酸硫胺素(Duchefa)、0. 5mg 葉酸(Sigma Ltd, St Louis, M0)、 0. 5mg/l 生物素(Duchefa)、0. 8g/l 酪蛋白水解物(Duchefa)、糖 30g/l 和激素 2-4D (Sigma) 的9cm平板中的瓊脂培養(yǎng)基上。愈傷組織在25°C生長14天。通過在含0. 2mg/l 2,4- 二氯乙酸的MSD液態(tài)培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織 來制備細胞懸浮培養(yǎng)物，其在本領域眾所周知。然后將細胞懸浮培養(yǎng)物培養(yǎng)在250ml的錐 形瓶中，開始時為25ml工作體積，在25°C振蕩速度為60rpm下培養(yǎng)7天后增加體積至50ml。 隨后，在同樣的條件下在1L錐形瓶中將細胞培養(yǎng)物體積增加到高達300ml。通過加入源自兩個1L錐形瓶的培養(yǎng)7天的400ml細胞懸浮液，獲得含4L MSD培
24養(yǎng)基的小生物反應器(10L)[參見W098/13469]接種物。在25°C下用lLpm氣流培養(yǎng)1周 后，加入MDS培養(yǎng)基至10L，在同樣的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。再培養(yǎng)(5天)后，通過讓細胞培養(yǎng) 基流過80微米的網(wǎng)來收獲并收集大部分細胞。擠出多余的培養(yǎng)基，將堆積的細胞塊儲存 在-70°C。消泡劑為了避免泡沫形成，使用C型醫(yī)用消泡劑乳液(聚二甲基硅氧烷-PDMS， Dow Coming, Midland MI)，其含30%二甲基硅油(USP)、甲基纖維素、山梨酸和水。將消泡 劑以lOppm濃度加入到400L生物反應器培養(yǎng)基中。消泡劑分析使用Antifoam C Emulsion(PDMS)作為消脹藥和非標準化食品中的 成分。依據(jù)并依照USP對二甲基硅油乳液的所有要求來評估PDMS的存在情況。將450ml的 0. 075% PDMS溶液加樣到 15ml 陽離子交換色譜柱(Macro_Prep High S Support,BioRad, Hercules,CA)上。從加樣樣品、流過樣品(未結(jié)合的材料)和來自0. 2MNaCl、l. 2M NaCl禾口 含12%乙醇的1. 2M NaCl這三個洗脫步驟的樣品中取用于PDMS分析的等份樣。收集收獲的培養(yǎng)物在不同色譜步驟(加樣、流過、洗滌和洗脫步驟)期間的等份 樣品，并使用RP-HPLC法用在262nm處監(jiān)測的C4柱分析PDMS的存在情況(Antifoam C Emulsion的峰值吸收)。SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)主要根據(jù)其分子量 來分離蛋白。另外，該技術(shù)提供關于蛋白純度和組成的大量信息。通過按照標準化凝膠分 離方案的用考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE分析，來檢查從收獲自大規(guī)模一次性生物反應器 的細胞產(chǎn)生的prGCD的分子量身份和蛋白雜質(zhì)帶型。簡言之，SDS凝膠由成層膠(3% )和 分離膠(12% )組成。運行緩沖液為Tris/SDS、pH 8. 3，加樣緩沖液為甘油-Tris-巰基乙 醇、pH 6. 8。反相高效(壓)液相色譜(RP-HPLC) :RP_HPLC包括來自蛋白溶液的完整蛋白 和其它組分的分離。各種化合物的準確的保留時間是特征性的，使得可以測定目標蛋白 的身份和純度。用固定相 C-4 柱(Phenomenex Jupiter 5u C4 proteo 300A 4. 6x250mm Phenomenex,Torance CA)并用 A(0. 1% TFA/H20)和 B(0. 1% TFA/ 乙腈)流動相梯度，來測 定植物重組G⑶(prG⑶)的特征峰和保留時間。蛋白檢測是用二極管陣列分光光度計在兩 個波長214nm和280nm處檢測。多克隆抗體的制備將重組GCD(75 微克，Cerezyme Genzyme, Cambridge, MA)懸 浮在3ml完全弗氏佐劑(Difco，Voigt，Lawrence，Kansas)中，給兩只兔中的每一只注射，接 著在2周后進行加強注射。加強注射后約10天從兔采血，以一周間隔再次進行這一過程， 直到抗體滴度開始下降。將除去血凝塊的血清分為等份樣并儲存在-20°C下。蛋白印跡通過用特異性親和純化的抗GCD抗體進行蛋白印跡，以鑒定從收獲自 大規(guī)模一次性生物反應器中的細胞純化的植物重組GCD (prGCD)分子，并將其與先前制備 的批次和市售的人葡糖腦苷脂酶(Cerezyme , Genzyme，Cambridge，MA)比較?；?上如本文所述進行蛋白轉(zhuǎn)移。簡言之，在4°C下以100伏電壓來進行從凝膠到硝酸纖維素 的轉(zhuǎn)移，歷時90分鐘。轉(zhuǎn)移以后，讓膜在封閉緩沖液[含奶粉、0.1% Tween 20(貨號 P1379 ；Sigma Ltd, St Louis,M0)的磷酸鹽緩沖液]中孵育。然后通過用抗G⑶抗體孵育、 洗滌并與合適的第二抗體(例如山羊抗兔(全分子)HRP(貨號A-4914)反應，來免疫檢測 蛋白。然后用 ECL 顯影試劑(RPN 2209，Amersham, Pharmacia Biotech UKLTD)使印跡顯色，并使用放射自顯影來進行可視化。在不同生物反應器和不同通氣方案中prG⑶產(chǎn)生之間的比較讓表達prG⑶的 重組細胞在不同體積生物反應器(10L、100L、400L)中生長4-7天。使細胞在三個不同的 10L生物反應器中生長，對其實施不同的通氣方案(使用鼓泡器；使用8mm的鉆孔口(bore opening)；從第4天開始加入100 %氧氣)。在第4天或第7天取粗提物(5 yl)樣品，與 25ng的prGCD標準品一起在PAGE上分離，印跡到硝酸纖維素轉(zhuǎn)移膜，并與特異性兔抗GCD 多克隆抗體反應。通過SuperSignal WestPico化學發(fā)光底物(Pierce Biotechnology, Rockford, IL.)顯現(xiàn)帶。溶解氧以Kla單位描述溶氧率dC/dT = Kla, (Cs_C)，其中Cs為mg/1的氧氣的 飽和水平，C為mg/1的實際氧氣濃度。通氣速率通氣速率定義為在lAtm壓力下進氣口處每體積液體體積每分鐘的空 氣體積(體積/體積/分鐘)，通過將進口空氣流量除以生物反應器的工作體積來計算得 到。測定最佳通氣速率為了測定最佳通氣速率，通過放大空氣流量以實現(xiàn)較小體 積生物反應器的通氣速率，并改變通氣速率直到達到最佳預定參數(shù)，來實現(xiàn)每次增加體積 (從100L到400和800L的大規(guī)模生物反應器)的最優(yōu)化。測定不同通氣速率對物理參數(shù) 的影響，所述物理參數(shù)包括起泡水平、液體湍流水平、過濾器對空氣流出的阻力和生物反應 器的膨脹。生物學參數(shù)包括培養(yǎng)細胞的生長曲線，其通過在生長周期(7天)每天記錄的細 胞鮮重(gr/L)和7天的蛋白產(chǎn)物產(chǎn)量來描繪。為了獲得最佳的通氣速率，比較10-15個生 長周期。結(jié)果大規(guī)模一次性生物反應器培養(yǎng)需要較低的通氣速率增加通氣就增加培養(yǎng)細胞的生長率，這是細胞培養(yǎng)的常理。用于植物細胞培養(yǎng)的 較小體積生物反應器通常以0. 15-0. 3vvm的通氣速率提供空氣。出人意料地，當在適于促 進空氣循環(huán)和氧氣分布同時保持最小剪切力的通氣速率范圍內(nèi)評估不同體積的生物反應 器的培養(yǎng)效率時，發(fā)現(xiàn)大規(guī)模生物反應器的最佳通氣速率成比例地低于較小體積的反應器 的最佳通氣速率。以下表1闡明盡管在較小體積生物反應器(至多100L)中，體積增加需 要增加通氣速率以維持效率，但在大規(guī)模生物反應器(400L及更大)中，最佳通氣速率實際 上隨著生物反應器體積增加而降低。所述降低在工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)對于減小剪切力的能力和較 大的能量效率二者都是有利的。表1 不同體積生物反應器的最優(yōu)化的通氣速率 大規(guī)模一次性生物反應器提供優(yōu)越的氧飽和水平有效導入、混合和排出生物反 應器氣體的參數(shù)的適當組合，對于有效操作本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器至關重要。氣 泡體積、通氣速率、進口氣壓、氣泡中的氣壓和氣泡通過培養(yǎng)基的路徑必須平衡，以使通氣 和混合最優(yōu)化，并使破壞性的剪切力和懸浮液內(nèi)的湍流最小化。為了評估這些參數(shù)，測定了 氧飽和水平。圖3顯示了 與用較小反應器容器(錐形瓶、10升生物反應器和100升生物反應 器)中的培養(yǎng)基的O2飽和度的相比，在400升大規(guī)模一次性生物反應器中的培養(yǎng)基的O2飽 和度％，其在接種時(第0天)和培養(yǎng)3、4和7天時的等份樣樣品中測量。在大規(guī)模生物 反應器中空氣壓力和流速為35L/分鐘，在較小的10和100升反應器中為IOL/分鐘。接種 后，隨著懸浮液中細胞內(nèi)容物成比例增加而飽和度則降低，這是眾所周知的現(xiàn)象。然而，盡 管7天內(nèi)逐漸降低，但大規(guī)模一次性生物反應器明顯地為培養(yǎng)基優(yōu)選的O2飽和度提供了條 件，即在接種后任何既定的時間(直至7天)O2飽和度都超過30%。以下表2闡明800升生物反應器與較小體積的生物反應器相比達到甚至更大的O2 飽和度水平，其表示為Kla(mg/L)。這種優(yōu)越性在整個通氣速率范圍內(nèi)都能保持。表2 在400和800L大規(guī)模一次性生物反應器間在不同通氣速率(vvm)下比較溶 氧濃度(以mg/L表示的Kla) 大規(guī)模一次性生物反應器提供優(yōu)選的重組蛋白產(chǎn)量為了測定在大規(guī)模一次性生 物反應器中培養(yǎng)對培養(yǎng)物中的重組蛋白產(chǎn)生效率的影響，使來自各個反應器的懸浮液中的 提取物通過SDS-PAGE分離，印跡，并通過用抗人葡糖腦苷脂酶(GCD)抗體免疫檢測來分析。 400L大規(guī)模一次性生物反應器中重組產(chǎn)物的產(chǎn)量(圖4，第4-6道)與IOL (圖4，第1_3 道)和100L(圖4，第7和8道)反應器中重組產(chǎn)物的產(chǎn)量的比較，明顯顯示在大規(guī)模生物 反應器中蛋白水平增加，培養(yǎng)基利用效率更高。確實，在4和7天的培養(yǎng)中，大規(guī)模生物反 應器中的G⑶產(chǎn)量(分別為第4、5和6道)比具有增加的進氣口鉆孔(圖4，第2道)和從 第4天開始加入O2 (圖4，第3道)的IOL反應器的產(chǎn)量高。這些結(jié)果表明本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器提供了增加的培養(yǎng)基O2飽和度和 更高的培養(yǎng)效率，這導致較高的重組蛋白產(chǎn)物產(chǎn)量和更高的能量效率。從大規(guī)模一次性生物反應器的培養(yǎng)基中有效簡單地除去消泡劑在將較高的空氣壓力用于大規(guī)模一次性生物反應器通氣時，需要注意培養(yǎng)基的泡沫形成問題(出于多種理 由而應該避免泡沫形成)。當將細胞生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到400L生物反應器時，向其加入消泡 劑(IOppm)。使用標準實驗室技術(shù)例如HPLC和原子吸收檢測的最低水平為大約7ppm。為了確證來自大規(guī)模一次性生物反應器的收獲和純化重組產(chǎn)物能夠消除消泡劑 殘留，對大量過剩的PDMS消泡劑進行最初純化過程步驟，始終監(jiān)測消泡劑的存在情況。圖5a為陽離子交換柱的加樣溶液等份樣中的PDMS消泡劑(0. 075% )的RP-HPLC 分析。保留時間(峰)為22. 531分鐘。圖5b顯示流過色譜柱的消泡劑(保留時間為22. 554 分鐘)，峰的大小和在262nm處的吸收與加樣材料相似。來自3個隨后的洗脫步驟(0. 2M NaClU. 2M NaCl和含12%乙醇的1. 2M NaCl)中任一個的樣品未檢測到PDMS。以下表3明 顯表明PDMS沒在色譜柱上被保留。 這些結(jié)果清楚地表明消泡劑剩余易于從培養(yǎng)基除去，并從分離和純化過程的第一 步開始就保持在可檢測水平以下。實施例2用大規(guī)模一次性生物反應器在胡蘿卜細胞懸浮液中有效表達人葡糖腦苷脂酶本實施例提供了用轉(zhuǎn)化的植物細胞實施的實驗的說明，所述細胞按照本發(fā)明某些 實施方案培養(yǎng)在本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器中。材料和實驗方法質(zhì)粒載體^CE-T-由獲自Galili教授的質(zhì)粒CE構(gòu)建而成[美國專利第5，367，110 號，11 月 22 日，(1994)]。用SalI消化質(zhì)粒CE。用DNA聚合酶I大片段使SalI粘性端變?yōu)槠蕉獭Ｈ缓笥?PstI消化該質(zhì)粒，并將其與用SmaI和PstI消化的以下DNA片段連接來自堿性內(nèi)切幾丁 質(zhì)酶基因[擬南芥(Arabidopsisthaliana)]的編碼ER靶向信號的DNA片段ATGAAGACTAA TCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC(SEQ ID NO 6)；和編碼來 自煙草幾丁質(zhì)酶A的液泡靶向信號的DNA段GATCTTTTAGTCGATACTATG (SEQ ID NO 5)。*pGREENII-從 P. Mullineaux 博士獲得[Roger P. Hellens 等，(2000)Plant Mol. Bio. 42 :819-832]。pGREEN II載體的表達受到來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、TMV(煙 草花葉病毒)的ω翻譯增強子元件和來自根癌農(nóng)桿菌的章魚堿合成酶終止子序列的調(diào)控。
人葡糖腦苷脂酶(hGCD)cDNA 從含葡萄糖苷酶β酸[葡糖腦苷脂酶]的ATCC (登 記號 65696)，GC-2. 2 [GCS_2kb ； λ -EZZ- γ3 人(Homosapiens)]獲得人葡糖腦苷脂酶。插入長度(kb) 2. 20 ；組織成纖維細胞WI-38細胞。hG⑶表達質(zhì)粒的構(gòu)建用如下正向引物和反向引物擴增編碼hG⑶(ATTC克隆編號 65696)的 cDNA ιΗ向引物 5，CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (SEQ ID NO :3)和反向引物 5，CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3，(SEQ ID NO 4)。用核酸內(nèi)切酶 EcoRI 和 BglII (參見弓丨 物中有下劃線的識別序列)消化純化的PCRDNA產(chǎn)物，并連接到具有用同樣酶消化的表達盒 CE-T的中間載體。用限制性酶SmaI和XbaI切下表達盒并從中間載體洗脫，將其連接到二 元載體pGREENII，形成最終的表達載體。由NPTII基因提供卡那霉素(kanamycin)抗性，所 述基因通過與提供表達盒的PGREEN載體一起獲得的nos啟動子驅(qū)動。用以下測序引物對所獲得的質(zhì)粒進行測序，以確保正確的信號框內(nèi)融合5’ 35S 啟動子 5，CTCAGAAGACCAGAGGGC 3，(SEQ ID NO 1),和 3，終止子 5，CAAAGCGGCCATCGTGC 3，(SEQ ID NO 2)。胡蘿卜愈傷組織和細胞懸浮培養(yǎng)物的建立如先前Torres K. C. (Tissue culture techniques for horticular crops (園藝作物的組織培養(yǎng)技術(shù))，第111、169頁)所述建 立胡蘿卜愈傷組織和細胞懸浮培養(yǎng)物。胡蘿卜細胞的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化細胞的分離用改良過的前述方法[Wurtele，Ε. S.和 Bulka，K.Plant Sci. 61 =253-262(1989)]由農(nóng)桿菌滲入實現(xiàn)胡蘿卜細胞的轉(zhuǎn)化。在整個過 程中用在液態(tài)培養(yǎng)基中生長的細胞代替愈傷組織。孵育和生長時間適合轉(zhuǎn)化液體培養(yǎng)中 的細胞。簡言之，用pGREEN II載體通過電穿孔轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌[den Dulk-Ra,Α.和Hooykaa、 P. J. Methods Mol.Biol.55 :63_72 (1995)]，然后用卡那霉素選擇。隨后用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化胡蘿
卜細胞，在液態(tài)培養(yǎng)基中用巴龍霉素(paromomycine)抗生素選擇。篩選轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞用于分離表達高水平GCD的愈傷組織在SDS樣品緩沖液 中使細胞勻菜化，在 SDS-PAGE[Laemmli U.，(1970)Nature 227 :680_685]上分離所得到 的蛋白提取物并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(hybond C硝酸纖維素，0.45微米，貨號RPN203C; Amersham, Pharmacia Biotech UK LTD)。用多克隆抗hGCD抗體實施用于檢測GCD的蛋白 印跡(在下文闡述)。在大規(guī)模生物反應器中培養(yǎng)并放大細胞規(guī)模如上文實施例1所詳述實施細胞培養(yǎng)。蛋白分析如上文實施例1所詳述實施蛋白身份和純度的分析。質(zhì)譜用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間/飛行時間(MALDI-T0F)質(zhì)譜儀 (4700，Applied Biosystems, Foster City CA)和離子講質(zhì)譜儀(LCQ classic, Finnigan, San Jose，CA)實施質(zhì)譜(MS)分析。用RP-HPLC的肽作圖或蛋白“指紋圖譜”肽作圖是用于在進行提供高分辨率分 離的RP-HPLC后分析水解消化蛋白所得到的肽的方法，其因稱為“指紋圖譜”的不同概況 (profile)而具有可重現(xiàn)性。作為高度特異性的鑒定方法，該分析用于確認在標準制備過 程中產(chǎn)生的酶制備物和來自從400L生物反應器(PX-400-GC-2 ；在技術(shù)限制內(nèi))收獲的細 胞的酶制備物的身份。通過以1 50 /^的胰蛋白酶/501111(朋4)20)3( !18.0)在371孵育 6小時接著在室溫過夜孵育，來用胰蛋白酶消化prGCD。對于RP-HPLC分析，將50 μ g經(jīng)過消化的肽加樣到C-18柱(柱Phenomenex Jupiter 4u proteo 90A 4. 6x250mm, Phenomenex, ToranceCA)上，分離月太，如上所述檢測。
IEF 等電點聚焦(IEF)是基于蛋白在電場中的電荷來分離蛋白的技術(shù)。IEF用 作鑒定工具，以確保按具有正確Pi范圍帶型所證明的蛋白的同質(zhì)性。按照標準方案進行 prG⑶和Cerezyme 的等電點聚焦。簡言之，為了鑒定prG⑶的等電點(pl)，用指定的陽 極和陰極緩沖液和Pl標準品(Amersham Pharmacia Biotech UK LTD)在預制的pH 3-10 范圍的聚丙烯酰胺IEF凝膠(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)上對純化的酶進行電 泳。向每一 PrG⑶和Cerezyme 樣品中加入0.05%牛膽酸(弱陰離子去污劑)以提高在 凝膠中的遷移率。按照廠商指導通過Bio-Safe 考馬斯染色(Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)顯現(xiàn)prG⑶和Cerezyme 蛋白的帶型。通過用IEF標定試劑盒高范圍pi 5-10. 5的 蛋白標準品(Amersham Pharmacia BiotechUK LTD)來估測各蛋白帶的pi。確定了prGCD 與工業(yè)生產(chǎn)的Cerezyme 的帶型相似性。prG⑶帶型也用于批與批之間一致性的檢查。酶活性測定β -葡糖腦苷脂酶催化葡糖腦苷脂這種糖脂水解為葡萄糖和神經(jīng)酰 胺。為了評估重組葡糖腦苷脂酶的催化活性，采用用合成底物的酶測定來評估每一批次。 酶單位定義為在37°C每分鐘催化一微摩爾合成底物對-硝基苯基- β -D-吡喃葡萄糖苷 (pNP-Glc)水解的酶的量。結(jié)果來自大規(guī)模一次性生物反應器的重組葡糖腦苷脂酶的特征為了測定由大規(guī)模一 次性生物反應器提供的改良的培養(yǎng)條件的最佳特征，并且為了檢測這些條件的可靠性和可 重復性，對在大規(guī)模一次性生物反應器中生產(chǎn)的重組產(chǎn)物與在較小規(guī)模生物反應器生產(chǎn)的 制備物進行了分子量和物理化學特性的比較。通過質(zhì)譜測定葡糖腦苷脂酶的分子量進行質(zhì)譜分析以測定蛋白的分子量而無需 使用蛋白標準品。使用兩種質(zhì)譜法以測定從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的酶的分子 量，并將其與在較小規(guī)模反應器中生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶比較。所有的酶制備物用同樣的方 式分離并純化。以下表4概述了通過兩種儀器LCQ classic和MALDI-T0F獲得的若干酶批次的分 子量。從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的prG⑶批次由PX400-GC表示。表4 不同批次生產(chǎn)的不同prG⑶的分子量 質(zhì)譜結(jié)果顯示對所有制備物中蛋白分子量的估測常規(guī)地為大約60800道爾頓，并 且在從400L生物反應器和80L生物反應器中收獲的細胞生產(chǎn)的批次之間保持一致。該分 子量符合具有構(gòu)成56642. 6道爾頓的506個氨基酸和構(gòu)成其余的4158道爾頓的另外多糖 結(jié)構(gòu)(大約7%)的糖基化多肽。SDS-PAGE和蛋白印跡分析鑒定、測定分子量和純度通過SDS-PAGE分析用考馬斯 亮藍染色檢查了從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶的分子量的身份和蛋 白雜質(zhì)帶型。圖6顯示用考馬斯亮藍染色的標準酶制備物(PLX-GC-016-0505DS)、Cerezyme 和從400L大規(guī)模一次性生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶(PX-400-GC-2)的 SDS-PAGE。圖6進一步證實，來自在大規(guī)模生物反應器中培養(yǎng)的細胞的prGCD顯示與用其它 方法生產(chǎn)的GCD具有接近的等同的性質(zhì)。在各批次中的蛋白的遷移率相似，具有所估測的 60.9kD的分子量。另外，來自標準反應器和400L生物反應器的各批次間的蛋白帶型相同， 表明從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的酶中沒有明顯的蛋白雜質(zhì)。使用特異性親和純化的抗β -葡糖腦苷脂酶抗體，實施用抗葡糖腦苷脂酶抗體進 行的SDS-PAGE分離蛋白的免疫檢測(蛋白印跡)，以鑒定從400L生物反應器收獲的細胞 純化的葡糖腦苷脂酶分子，并將其與先前制備的批次和市售的人葡糖腦苷脂酶 (Cerezyme , Genzyme)進行比較。圖7顯示用特異性兔抗β-葡糖腦苷脂酶抗體用于檢測標準β-葡糖腦苷脂 酶(PLX-GC-016-0505DS)、Cerezyme 和從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的蛋白 (PX-400-GC-2)的蛋白印跡分析。由特異性抗體鑒定的蛋白帶在標準方法和400L生物反應 器方法的各批次間一致。本分析顯示在從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的酶蛋白中沒 有另外的降解帶。因此，根據(jù)SDS-PAGE和免疫學分析，沒有證據(jù)表明在從標準(80L)生物反應器或 從所述400L生物反應器中收獲的細胞生產(chǎn)的酶之間的身份和純度有差別。用反相高效(壓)液相色譜(RP-HPLC)的肽作圖或蛋白“指紋圖譜”為了確證在 標準生產(chǎn)過程(80L)和從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的酶制備物(PX-400-GC-2)的 身份，對從80和400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的prGCD進行了蛋白指紋圖譜分析。圖8a和8b顯示在C_18色譜柱上進行的對市售葡糖腦苷脂酶 (PLX-GC-016-0505DS)的胰蛋白酶酶解的典型圖譜。圖8a顯示在214nm處(肽鍵)監(jiān)測 的分離的肽，圖8b顯示在280nm處(色氨酸和酪氨酸)監(jiān)測的分離的肽。圖8c和8d代表 在214nm(圖8c)處和在280nm(圖8d)處監(jiān)測的從400L生物反應器收獲的細胞制備的葡糖腦苷脂酶(PX-400-GC-2)的胰蛋白酶圖譜。因此，來自大規(guī)模一次性生物反應器所收獲的細胞的葡糖腦苷脂酶酶制備物的肽 圖與用標準規(guī)模技術(shù)獲得的標準制備物的肽圖一致，這強有力地表明從80L和400L生物反 應器收獲的細胞所生產(chǎn)的酶制備物的一致性和身份。反相高效(壓)液相色譜(RP-HPLC)用RP-HPLC進一步表征由在400L大規(guī)模生 物反應器中培養(yǎng)的細胞生產(chǎn)的蛋白。圖9a和9b代表從400L生物反應器所收獲的細胞純化的葡糖腦苷脂酶 (PX-400-GC-2)在214nm(9a)處和280nm(9b)處的色譜圖。在大規(guī)模一次性生物反應器生 產(chǎn)的酶蛋白色譜圖中，酶作為保留時間為64. 12分鐘的一個完整峰出現(xiàn)，與先前制備的葡 糖腦苷脂酶的64. 70分鐘的保留時間相似。因此，在標準色譜條件下，由大規(guī)模和標準規(guī)模一次性生物反應器生產(chǎn)的兩種重 組葡糖腦苷脂酶以相似且一致的保留時間被洗脫。一個完整峰的出現(xiàn)與對先前的酶制備物 各批次進行的分析所獲得的結(jié)果一致。微量雜質(zhì)峰的峰型和大小與葡糖腦苷脂酶標準品相 似，雜質(zhì)水平在所需的規(guī)范范圍內(nèi)。等電點聚焦(IEF)為了進一步鑒定并確保在本發(fā)明大規(guī)模生物反應器中 培養(yǎng)的細胞生產(chǎn)的重組蛋白的同質(zhì)性，測定了從大規(guī)模400L生物反應器收獲的細胞 (PX-400-GC-2)和從標準80L反應器制備物收獲的細胞(PLX-GC-016-0505DS)的葡糖腦苷 脂酶帶型的Pl范圍。圖10顯示通過考馬斯亮藍染色顯現(xiàn)的pi帶型，所述帶型分別為以下酶樣品的帶 型來自標準體積生物反應器制備物的酶樣品(PLX-GC-016-0505DS)和來自400L生物反 應器所收獲的細胞的在不同純化階段(在第3、第4和第5純化柱后，其分別由C-3、C-4和 C-5表示)的酶樣品(PX-400-GC-2)。由標準體積的生物反應器生產(chǎn)的酶和從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的酶的 概況在條帶數(shù)目、各個類似帶的帶型和亮度等方面都是等同的。因此，在大規(guī)模一次性生物 反應器中生產(chǎn)的酶和先前生產(chǎn)的制備物中生產(chǎn)的酶的IEF同等型型式(isoform pattern) 是等同的。酶活性檢測為了評估在大規(guī)模生物反應器中生產(chǎn)的重組葡糖腦苷脂酶的催化活 性，采用用合成底物對-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-Glc)的酶測定。表5概述了 從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶(由PX-400-GC表示)和由標準體積 反應器生產(chǎn)的葡糖腦苷脂酶的比活性。表5 重組葡糖腦苷脂酶各批次的比活性 因此，從400L生物反應器收獲的細胞生產(chǎn)的酶的比活性在用標準規(guī)模生產(chǎn)的酶 的比活性范圍內(nèi)。此外，當將在800升生物反應器中生長的3批表達prG⑶的細胞培養(yǎng)物 的生長參數(shù)與在400升生物反應器中生長的培養(yǎng)物的值進行比較時，對于在兩種大規(guī)模一 次性生物反應器中的培養(yǎng)物來說，傳導率、摩爾滲透壓濃度和產(chǎn)量(細胞和蛋白)參數(shù)都在 相同的范圍內(nèi)，其如下表6所示。表6 在400和800L生物反應器中培養(yǎng)的表達prG⑶的細胞的生產(chǎn)生長參數(shù) 來自大規(guī)模一次性生物反應器的β -葡糖腦苷脂酶無宿主細胞蛋白為了檢測胡 蘿卜宿主細胞蛋白(CHP)，開發(fā)了能夠檢測大范圍蛋白雜質(zhì)的敏感的免疫測定。對于該檢 測，通過用由非轉(zhuǎn)化的胡蘿卜細胞(不荷有葡糖腦苷脂酶構(gòu)建體的胡蘿卜細胞)產(chǎn)生 的蛋白制備物免疫接種，來產(chǎn)生多克隆抗體。進一步分離這些多克隆抗體，以獲得與蛋白的 多肽核心而不是與糖部分/殘基的特異性結(jié)合，從而防止與連接重組β -葡糖腦苷脂酶的 糖發(fā)生交叉反應。將胡蘿卜宿主蛋白(CHP)制備物用作宿主相關蛋白雜質(zhì)的參考標準品，并用作抗 原用于免疫測定的多克隆抗體的制備。
圖11顯示了通過使用特異性抗胡蘿卜細胞宿主蛋白抗體進行的SDS-PAGE和蛋白印跡，分析特異性抗宿主蛋白抗體對宿主蛋白樣品和各葡糖腦苷脂酶批次的反應性。 分析了來自標準體積生物反應器β-葡糖腦苷脂酶批次(PLX-GC-016-0505 DS)和從400L 生物反應器收獲的細胞所生產(chǎn)的β-葡糖腦苷脂酶批次(PX-400-GC-2)，以及來自胡蘿卜 宿主蛋白提取物的樣品。確定了胡蘿卜細胞宿主蛋白樣品中的四個主要的蛋白條帶(圖 11，第7和8道)，然而，在任一種β -葡糖腦苷脂酶樣品中都沒有檢測到相對應的CHP蛋白 帶，表明在本發(fā)明大規(guī)模一次性生物反應器中生產(chǎn)的重組β-葡糖腦苷脂酶不含有可檢測 水平的胡蘿卜宿主細胞蛋白，其并不比由標準體積生產(chǎn)方法制備的葡糖腦苷脂酶的純 度差。實施例3用大規(guī)模一次性生物反應器在ΒΥ-2細胞懸浮液中有效表達人乙酰膽堿酯酶本實施例提供用轉(zhuǎn)化人乙酰膽堿酯酶的煙草ΒΥ-2細胞實施的實驗的說明，所述 細胞按照本發(fā)明一個實施方案培養(yǎng)在大規(guī)模一次性生物反應器中。材料和實驗方法cDNA:從以色列耶路撒冷的希伯來大學的Hermona Soreq教授處獲得編碼插入 的人乙酰膽堿酯酶“通讀(read through) ” 變體(AChE-R)的 cDNA(Yissum Technology Transfer Company of the Hebrew Universityof Jerusalem,編號為 pTM240)。該基因序列 經(jīng)過植物最優(yōu)化，包含定位到ER中的天然前導序列(N-末端的33個氨基酸，SEQ ID NO :7， 在成熟蛋白中降解)和融合到重組基因(SEQ ID NO 9)的C-末端的ER保留序列(SEKDEL ； SEQ ID NO :8)。乙酰膽堿酯酶表達質(zhì)粒的構(gòu)建將pBluescript SK+質(zhì)粒(貨號212205， Stratagene,La Jolla,CA)用作構(gòu)建植物表達盒的骨架。將具有用于高水平表達所需的必 需元件的植物表達盒構(gòu)建到pBluescript SK+質(zhì)粒中。該表達盒(CE)包含CaMV35S啟動 子、ω翻譯增強子、根癌農(nóng)桿菌章魚堿合成酶基因的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸信號(CE盒)。通過用含Sal I和PstI限制性位點的引物進行PCR擴增AChE-R，將AChE-R 亞克隆到含表達盒的Bluescript 表達載體，限制性位點用粗體下劃線描述(正向 弓I 物5 ‘ -CGGC GTCGAC ACAAGAGGCCTCCACAAT-3 ‘ (SEQ ID NO 10)；反向弓丨物 5' -CCCC CTGCAG CTAGAGTTCATCCTTCTC-3 ‘ (SEQ IDNO :11)。然后從中間載體取出 含AChE-R編碼序列的表達盒，并用NotI和Acc651進一步亞克隆到雙元載體pGREENII nos-Kana (Hellens等，2000)，其如本文所述。用PCR和限制性分析選擇陽性克隆。表達Ache-R的BY_2細胞的轉(zhuǎn)化、篩選和培養(yǎng)如先前所述，在滲入BY2細胞之前 先對農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化(den Dulk-Ras和Hooykaas，1995)?？敲顾氐目剐杂糜诤Y選和選擇 轉(zhuǎn)化株，其由NPTII基因提供，所述基因通過與pGREEN載體一起獲得的nos啟動子驅(qū)動。基本上按照上文實施例2關于轉(zhuǎn)化胡蘿卜細胞所述，用農(nóng)桿菌滲透遺傳修飾的煙 草細胞(BY2細胞系)并隨后培養(yǎng)。用本文所述Elman催化活性測定和蛋白印跡來實現(xiàn)對 表達高水平Ache-R的愈傷組織的篩選。所選定細胞的細胞懸浮培養(yǎng)物以50ml懸浮液在持 續(xù)攪拌和控溫條件(在軌道振蕩器(SOrpm)上25士2°C )下保持在250ml錐形瓶中。生產(chǎn) 過程包括在含作為選擇劑的抗生素巴龍霉素和頭孢噻肟(Cefotaxime)的培養(yǎng)基中生長階 段。
在生物反應器中放大培養(yǎng)生長逐漸將培養(yǎng)放大到10L。首先，將200_400mL懸浮 細胞接種物導入到含3. 6-9. 8L培養(yǎng)基的12L生物反應器中。培養(yǎng)(25 士 2°C，1. 5Lpm無菌空 氣)7天后，加培養(yǎng)基至10L，在同樣的條件下再繼續(xù)培養(yǎng)7天。用IOL懸浮細胞接種400L 生物反應器，隨后逐漸加培養(yǎng)基到至多350L，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
當轉(zhuǎn)移到400L時，將消泡劑(IOppm)加到細胞生長培養(yǎng)基中。所用消泡劑為如本 文所述的C型醫(yī)用消泡劑乳液(聚二甲基硅氧烷-PDMS)。蛋白印跡用針對人源AChE的N-末端肽生產(chǎn)的親和純化的山羊多克隆抗體 (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)進行蛋白印跡。在所有 AChE 形式中 N-末 端都一樣，因此，該抗體也可識別AChE-R。用ECL檢測試劑盒(Pierce)進行檢測。在標準條件下進行SDS-PAGE。在10 % SDS-PAGE上分析AChE-S和AChE-R。用 Criterion 細胞垂直電泳儀(Bio-Rad Laboratories)用預混合的電泳Tris-甘氨酸-SDS 運行緩沖液(Bio-Rad Laboratories)實施電泳。用預混合的40%丙烯酰胺/Bis和10% SDS溶液制備10%丙烯酰胺凝膠。用iBlot Dry Blotting系統(tǒng)(Invitrogen)、用印跡 裝置P3準備計劃，將蛋白從雙丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。在室溫轉(zhuǎn)移8分鐘。 在將蛋白轉(zhuǎn)移到膜后，封閉膜，洗滌，用One-step CompleteWestern試劑盒(GenScript Corporation)與第一和第二抗體結(jié)合。將第一抗體(N-19 ；Santa Cruz,CA)以1 200稀 釋加到One-step (GenScript)工作溶液中。用ECL檢測試劑盒(Pierce)進行檢測。比較 AChE-R 與市售人重組 AChE-S (Sigma)的免疫反應性。用 Molecular Imager GelDoc XR 系 統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)檢測帶。Flamingo 熒光凝膠染色Flamingo 熒光凝膠染色(Bio-RadLaboratories) 是高度敏感的非特異性的蛋白染色方法。以幾種濃度(50、100和200ng/樣品)加樣 AChE-R(第9-11批)來與市售人重組AChE-S (Sigma)比較。如本文所述以標準方法在10% SDS-PAGE上分析樣品，按照廠商說明用Flamingo 熒光凝膠染色液來染色。Ellman測定將Ellman試劑用于修飾蛋白中的游離的巰基(Ellman，等1961)。其 與巰基快速形成二硫鍵并釋出硫醇鹽離子(thiolateion)，硫醇鹽離子具有特征顏色，可在 405nm處測量。實施Ellman測定用于測量粗勻漿樣品中AChE-R活性和活性酶濃度，以及 測定純化樣品中的活性酶濃度。酶單位定義為在室溫和PH = 7. 4下每分鐘催化一微摩爾 合成底物碘化硫代乙酰膽堿(乙酸(2-巰基乙基)三甲基碘化銨)水解為碘化(2-巰基乙 基)三甲基銨和乙酸的酶的量。用碘化硫代乙酰膽堿(Sigma，St Louis MO)作為底物測定 AChE-R催化活性。以約60ng/ml (純化樣品)或50-100ng/ml (粗勻漿)的濃度檢查樣品 的AChE催化活性，將樣品溶解于磷酸鹽緩沖液(0. 1Μ;ρΗ = 7.4 ；0. 025% BSA)，隨后使用由 Ellman等(1961)開發(fā)的分光光度法。在該方法中，使AChE、碘化硫代乙酰膽堿(20mM)和 Ellman試劑-DTNB [5-5，-二硫-雙(2-硝基苯甲酸酯)；9mM ；Sigma]混合，通過在405nm 處在20分鐘內(nèi)以2分鐘間隔測量光密度來用分光光度法監(jiān)測水解。陰性對照含有除待測 提取物外的所有組分。結(jié)果對時間作圖，從圖的線性部分的斜率計算起始速率。用以下方程計算每種AChE制備物的單位活性 用特異性AChE抑制劑-DEPQ的Ellman試劑DEPQ [7_ (0，O- 二乙基-氧膦基氧 基)-1-甲基喹啉鐺甲基硫酸鹽]是AChE的不可逆的有效抑制劑，用于監(jiān)測AChE的活性。在 磷酸鹽緩沖液(0. IM ；pH = 7.4 ；0. 025% BSA)存在下通過加入各種量的DEPQ(0. 2-0. 8nM) 來進行酶溶液的活性部位滴定。如上所述用Ellman測定來測量活性。用抑制百分率對抑 制劑濃度作圖。DEPQ與AChE-R以1 1的比例起反應。這些值用于測定以μΜ表示的 AChE-R 濃度。 用Karnovsky染色的膽堿酯酶活性=Kamovsky和Roots膽堿酯酶活性染色法 (Karnovsky和Roots，1964)是用于肉眼檢測膽堿酯酶(AChE和BChE)活性的特異性方法。 該方法用硫代膽堿酯作為底物，基于通過膽堿酯酶活性釋放的硫代膽堿來使鐵氰化物還原 為亞鐵氰化物。由銅捕獲所形成的亞鐵氰化物，形成亞鐵氰化銅，于是通過肉眼可觀察到。天然(非變性PAGE 由于聚丙烯酰胺凝膠提供一致的孔徑，非變性聚丙烯酰胺凝 膠電泳(PAGE)用于5-2，OOOkDa大小范圍的蛋白。不象SDS-PAGE，非變性凝膠電泳不用帶 電的變性劑。因此，被分離的分子在分子量和固有電荷方面都不同。因為蛋白在分離中始 終保持在天然狀態(tài)，它們就可不僅通過一般的蛋白染色試劑來檢測，而且可通過采用酶的 特異性催化性質(zhì)的試劑來檢測。結(jié)果重組Ache-R概況估測由本發(fā)明方法生產(chǎn)的重組AChE-R蛋白的分子量為64kDa， 如圖15(第1-3道)所示。在中性條件下為四聚體的對照AChE-S (第5-7道)在SDS-PAGE 中還原為其單體，因此與AChE-R的遷移相類似，因為AChE-S單體為約70kDa，比AChE-R重 6kDa。因此，在大規(guī)模一次性生物反應器中的BY2煙草細胞中表達的AChE-R與在HEK 293 細胞中表達的以其單體形式的重組人AChE-S (Sigma)具有相似的3維結(jié)構(gòu)(其由電泳遷移 率所測定)。Flamingo 非特異性染色還驗證了植物表達的重組AChE-R的遷移概況，因為所 檢測的帶表現(xiàn)出與用抗AChE抗體免疫測定所檢測(圖16)的一樣的遷移帶型。另外，如圖 16所示的凝膠上所觀察的單個染色帶表明植物表達的酶蛋白的顯著純化效率。重組AChE-R活性圖17顯示用Karnovsky染色的植物表達的AChE-R和哺乳動 物細胞表達的AChE-S多肽的催化等同性。將50ng(第3和6道)、100ng(第2和5道)和 200ng(第1和4道)的AChE-R加樣到凝膠上。在所有3種幾樣濃度中活性都很明顯，確 證了從收獲自大規(guī)模本發(fā)明生物反應器的BY-2細胞純化的Ache-R的活性。市售人重組 AChE-S呈其四聚體形式(參見上面箭頭)，因此比AChE-R單體(下面的箭頭)遷移得慢一 些，并保持其活性。在第4-6道檢測的較不明顯的條帶與AChE-R單體條帶(第1-3道)相 同地遷移，表明植物表達的AChE-S單體與市售人重組AChE-S不僅在大小上一樣，而且在催 化活性上等同。下表7顯示在小體積生物反應器中生產(chǎn)的各批次與在本發(fā)明實施方案的大規(guī)模 一次性生物反應器中生產(chǎn)的各批次的植物表達的AChE-R活性比較，其通過用DEPQ抑制的Ellman活性測定法來檢測。表7清楚地顯示在大規(guī)模培養(yǎng)設備中AChE蛋白產(chǎn)量(表示為 mg蛋白/Kg細胞)顯著增加，而不降低酶活性范圍。
I U = In摩爾(Ellman) 產(chǎn)量(mg蛋白/Kg細胞濕重)mg/ml
IOL生物反應器(第6批)429.6ΟδΓ2
IOL生物反應器(第67489. 3048O 批)
400L (第 8 批)535068 Γ62
400L (第 9-11 批)564066 ΤΤθ因此，綜合以上結(jié)果，進一步支持在本發(fā)明某些實施方案大規(guī)模一次性生物反應 器中培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物細胞的顯著優(yōu)點，所述生物反應器可用于準確并高效表達和翻譯后加 工重組蛋白，而同時避免很多較小體積和基于動物的表達系統(tǒng)的缺點。參考文獻Ma, J. K. C. ，Drake, P. Μ. W.，禾口 Christou，P. (2003) Nature reviews 4，794—805Proulx等的美國專利申請第2005/0282269號Hodge等的美國專利申請第2005/0272146號Gaugler等的美國專利第6，432，698號Schlatmann 等，Biotech. Bioeng.，1995 ；45 :435_39Namdev 禾口 Dulop, App. Biochem and Biotech, Part A, Frontiers inBioprocessing, 199權(quán)利要求
用于培養(yǎng)和收獲植物組織和/或細胞的一次性設備，所述設備包含具有至少400升體積的非剛性容器，所述容器配置有使所述設備能夠連續(xù)用于至少兩個連續(xù)培養(yǎng)/收獲周期的換氣口和收獲口，其中所述設備經(jīng)過設計和構(gòu)建用于保持適于培養(yǎng)所述植物組織和/或細胞的氧飽和度和剪切力。
2.權(quán)利要求1的一次性設備，其中通過組合以下參數(shù)值或值范圍來維持適于培養(yǎng)所述 植物組織和/或細胞的所述氧飽和度與所述剪切力a)高度體積比；b)進氣壓力；c)進氣口/橫截面積密度；d)進口通氣速率；和e)進口氣泡體積。
3.權(quán)利要求1的設備，其具有選自以下值或值范圍中的至少一種的參數(shù)值或值范圍a)約0.06-約1厘米/升的高度體積比；b)約1巴-5巴的進氣壓力；c)約20個進口/平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度；d)約0.05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率；和e)約20立方毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積。
4.權(quán)利要求1的一次性設備，其中所述氧飽和度為至少15%體積/所述容器內(nèi)含有的 液體體積。
5.權(quán)利要求2的設備，其中所述組合為約0.06-約1厘米/升的高度體積比和約1巴-5 巴的進氣壓力。
6.權(quán)利要求2的設備，其中所述組合為約0.06-約1厘米/升的高度體積比和約20個 進口 /平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度。
7.權(quán)利要求2的設備，其中所述組合為約0.06-約1厘米/升的高度體積比和約 0. 05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率。
8.權(quán)利要求2的設備，其中所述組合為約0.06-約1厘米/升的高度體積比和約20立 方毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積。
9.權(quán)利要求5-7中任一項的設備，其中所述組合進一步包含約20立方毫米-約1800 立方毫米的進口氣泡體積這一參數(shù)。
10.權(quán)利要求6-8中任一項的設備，其中所述組合進一步包含約1巴_5巴的進氣壓力 這一參數(shù)。
11.權(quán)利要求5、7和8中任一項的設備，其中所述組合進一步包含約20個進口/平方 米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度這一參數(shù)。
12.權(quán)利要求5、6和8中任一項的設備，其中所述組合進一步包含約0.05-0.12體積氣 體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率這一參數(shù)。
13.權(quán)利要求2的設備，其中所述組合包含約0.06-約1厘米/升的高度體積比、約1 巴-5巴的進氣壓力、約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密 度和約20立方毫升-約1800立方毫升的進口氣泡體積。
14.權(quán)利要求2的設備，其中所述組合為約0.06-約1厘米/升的高度體積比、約1巴-5巴的進氣壓力、約20個進口 /平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度、約 0. 05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率；和約20立方毫米-約1800立 方毫米的進口氣泡體積。
15.權(quán)利要求2的設備，其中所述高度體積比為約0.lcm/升-約升0. 5cm/升。
16.權(quán)利要求2的設備，其中所述高度體積比為約0.44cm/升。
17.權(quán)利要求2的設備，其中所述進氣壓力為約1.5巴-約4巴。
18.權(quán)利要求2的設備，其中所述進氣壓力為約1.5巴-約2. 5巴。
19.權(quán)利要求2的設備，其中所述進氣口/橫截面積密度為約40個/平方米-約60個 /平方米。
20.權(quán)利要求2的設備，其中所述進氣口/橫截面積密度為55個/平方米。
21.權(quán)利要求2的設備，其中所述通氣速率為約0.07-0.10體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘。
22.權(quán)利要求2的設備，其中所述通氣速率為約0.9體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘。
23.權(quán)利要求2的設備，其中所述進口氣泡體積為約300立方毫米。
24.權(quán)利要求1的設備，其中所述一次性容器為透明和/或半透明的。
25.權(quán)利要求24的設備，其中所述容器由選自以下的材料制成聚乙烯、聚碳酸酯、聚 乙烯和尼龍共聚物、PVC和EVA。
26.權(quán)利要求25的設備，其中所述容器由超過一層的所述材料的層壓材料制成。
27.權(quán)利要求1的設備，其進一步包含用于支撐所述設備的支承結(jié)構(gòu)。
28.權(quán)利要求27的設備，其中所述支承結(jié)構(gòu)包含具有圓錐形底部的剛性圓筒結(jié)構(gòu)。
29.權(quán)利要求1的設備，其中所述收獲口位于所述容器底端的底部。
30.權(quán)利要求1的設備，其中所述收獲口位于所述容器底端的底部附近，以至于在每個 收獲周期結(jié)束時，所述含細胞和/或組織的培養(yǎng)基的所述剩余物自動保留在所述容器的所 述底端至所述收獲口的下水平之間。
31.權(quán)利要求1的設備，其中所述底端為大體上的圓錐形。
32.權(quán)利要求1的設備，其中所述底端為大體上的截頭圓錐形。
33.權(quán)利要求1的設備，其中所述容器包含約400升-約30000升、優(yōu)選約500升-8000 升并優(yōu)選約1000升的內(nèi)部可填充體積。
34.權(quán)利要求1的設備，其中不通過機械通氣和混合裝置來實現(xiàn)培養(yǎng)基的通氣和混合。
35.權(quán)利要求34的設備，其中所述機械通氣和混合裝置為葉輪。
36.用于在大于400升的體積中培養(yǎng)和收獲植物組織和/或植物細胞的方法，所述方法 包括(a)提供具有至少400升體積并配置有換氣口和收獲口的一次性非剛性容器，所述換 氣口和收獲口使所述設備能夠連續(xù)使用至少兩個連續(xù)培養(yǎng)/收獲周期，其中所述設備經(jīng)過 設計和構(gòu)建用于保持適于培養(yǎng)所述植物組織和/或細胞的氧飽和度和剪切力；和(b)經(jīng)由所述收獲口提供接種物；(c)提供無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑；(d)任選地用外部光源照明所述容器；和(e)使所述細胞和/或組織能夠在所述培養(yǎng)基中生長到所需產(chǎn)量。
37.權(quán)利要求36的方法，其中通過組合以下參數(shù)值或值范圍來維持所述氧飽和度和剪 切力a)高度體積比；b)進氣壓力；c)進氣口/橫截面積密度；d)進口通氣速率；和e)進口氣泡體積。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述參數(shù)值或值范圍選自以下值或值范圍中的至少一種a)約0.06-約1厘米/升的高度體積比；b)約1巴-5巴的進氣壓力；c)約20個進口/平方米-約70個進口 /平方米的進氣口 /橫截面積密度；d)約0.05-0. 12體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘的進口通氣速率；和e)約20立方毫米-約1800立方毫米的進口氣泡體積。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述穩(wěn)態(tài)氧飽和度為至少15%體積/所述容器中含有的 液體體積。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述高度體積比為約0.lcm/升-0. 5cm/升。
41.權(quán)利要求37的方法，其中所述高度體積比為約0.44cm/升。
42.權(quán)利要求37的方法，其中所述進氣壓力為約1.5巴-約4巴。
43.權(quán)利要求37的方法，其中所述進氣壓力為約1.5巴-約2. 5巴。
44.權(quán)利要求37的方法，其中所述進氣口/橫截面積密度為約40/平方米-約60個/ 平方米。
45.權(quán)利要求35的方法，其中所述進氣口/橫截面積密度為55個/平方米。
46.權(quán)利要求37的方法，其中所述通氣速率為約0.07-0. 10體積氣體/體積培養(yǎng)基/ 分鐘。
47.權(quán)利要求37的方法，其中所述通氣速率為約0.09體積氣體/體積培養(yǎng)基/分鐘。
48.權(quán)利要求37的方法，其中所述進口氣泡體積為約300平方毫米。
49.權(quán)利要求36的方法，所述方法進一步包括檢查污染物和/或在所述容器中生產(chǎn)的細胞/組織的質(zhì)量若發(fā)現(xiàn)污染物或所生產(chǎn)的 細胞/組織質(zhì)量不好，則丟棄所述設備及其內(nèi)容物；若未發(fā)現(xiàn)污染物，則收獲所述含細胞和/或組織的培養(yǎng)基部分。
50.權(quán)利要求49的方法，其中雖然收獲所述部分，但留下含細胞和/或組織的培養(yǎng)基剩 余物在所述容器中，其中所述培養(yǎng)基剩余物用作下一個培養(yǎng)/收獲周期的接種物。
51.權(quán)利要求49的方法，所述方法進一步包括提供無菌培養(yǎng)基和/或無菌添加劑用于下一個培養(yǎng)/收獲周期；和 重復生長周期直到發(fā)現(xiàn)所述污染物或生產(chǎn)的細胞/組織質(zhì)量不好，此時丟棄所述設備 及其內(nèi)容物。
52.權(quán)利要求36的方法，其中在至少一個培養(yǎng)/收獲周期始終通過所述換氣口連續(xù)供給無菌空氣。
53.權(quán)利要求36的方法，其中在至少一個培養(yǎng)/收獲周期期間通過所述多個進氣口以 脈沖方式供給所述無菌空氣。
54.植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含權(quán)利要求1的設備和適于培養(yǎng)所述植物組織和/ 或細胞的培養(yǎng)基。
55.權(quán)利要求54的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)進一步包含在所述培養(yǎng)基中生長的植 物細胞懸浮液或組織培養(yǎng)物。
56.權(quán)利要求55的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述植物細胞表達重組蛋白。
57.權(quán)利要求54的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述植物細胞培養(yǎng)物包含由植物根獲得的 植物細胞。
58.權(quán)利要求55的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述植物細胞選自發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的根細 胞、芹菜細胞、生姜細胞、辣根細胞和胡蘿卜細胞。
59.權(quán)利要求55的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述植物細胞為煙草細胞。
60.權(quán)利要求59的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述煙草細胞為煙草(Mcotiana tabaccum)
61.權(quán)利要求59的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述細胞表達人重組乙酰膽堿酯酶。
62.權(quán)利要求61的植物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中所述人重組乙酰膽堿酯酶為乙酰膽堿酯 酶-R。
全文摘要
本發(fā)明提供用于培養(yǎng)植物組織或細胞的可重復使用的一次性設備，所述設備包括具有以下尺寸和氣體交換口的非剛性容器所述尺寸和氣體交換口經(jīng)過設計用于保持適于在400升或更多培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物組織和/或細胞的氧飽和度和剪切力。本發(fā)明還提供用于使用本說明書的一個實施方案的一次性設備在植物細胞中制備具催化活性的人重組蛋白的方法。
文檔編號C12M3/00GK101861382SQ200880023649
公開日2010年10月13日 申請日期2008年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月7日
發(fā)明者A·什泰尼茨, Y·什尼奧爾, Y·內(nèi)奧斯, Y·柯什納, Y·沙爾蒂爾 申請人:普羅塔里克斯有限公司