專利名稱：：用于檢測肺炎鏈球菌的引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開涉及用于檢測肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae)的引物和探針，以及包含探針和引物的試劑盒，和使用探針和引物的方法。
背景技術(shù)：
：月市炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae(S.pneumoniae))是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，造成了相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率(特別是在年輕人和老年人中)，引起疾病例如肺炎、菌血癥、腦脊膜炎、急性中耳炎和鼻竇炎。據(jù)估計(jì)，20%的肺炎鏈球菌病例引起了菌血癥，而其它表現(xiàn)例如腦脊膜炎，即使使用抗生素治療，也有接近30%的死亡率。在11-76%的人群中，在鼻咽部發(fā)現(xiàn)有肺炎鏈球菌，兒童平均為40-50%，成年人平均為20-30%(Ghaffar等，J.Infect.Dis.18,638—46，1999)。最具肺炎球菌感染風(fēng)險的人群是年齡在6個月到4歲之間的兒童，以及60歲以上的成年人。事實(shí)上，每個兒童在5歲之前都將經(jīng)歷肺炎球菌中耳炎。據(jù)估計(jì)，所有社區(qū)獲得性肺炎中有25%是由于肺炎球菌(每100，000個居民中1，000人)。最近，疾病的流行已經(jīng)在例如慢性病護(hù)理機(jī)構(gòu)、軍營和日間護(hù)理中心的環(huán)境中重新出現(xiàn)，這種情況自從抗生素前時代以來還沒有被認(rèn)識到。由于在幼兒、老年人和免疫受損患者中引起的發(fā)病率和死亡率，肺炎鏈球菌仍然是重要的人類病原菌。常規(guī)的肺炎鏈球菌診斷檢驗(yàn)，受到培養(yǎng)的限制，難以建立明確的診斷。例如，從血液分離肺炎鏈球菌，這種公認(rèn)的肺炎鏈球菌存在與否的確定性檢驗(yàn)可能缺乏靈敏性，只在20-30%的肺炎球菌肺炎成年人病例中以及不到10%的兒童病例中給出陽性結(jié)果。用于抗體和抗原檢測的血清學(xué)分析測試受困于缺乏特異性和靈敏性，例如最近引入的尿液抗原檢驗(yàn)BinaxNOW,盡管通過一些研究顯示出對于成年人是靈敏和特異的，但是在兒童中不能辨別攜帶和疾病。此外，將類似肺炎球菌的草綠色鏈球菌(P-LVS)錯誤鑒定成肺炎鏈球菌，為誤診提供了額外的機(jī)會，特別是在試圖使用非無菌位點(diǎn)的樣本例如痰液時。肺炎鏈球菌的鑒定一般是基于膽汁溶解性、奧普托欣(optochin)靈敏性以及GenProbeACCUPROBE肺炎球菌鑒定檢驗(yàn)；但是已有不斷增加的從臨床樣本中分離出P-LVS的報道，它們可能在一個或多個這些標(biāo)準(zhǔn)的肺炎球菌檢驗(yàn)中給出陽性或可變的反應(yīng)。在一部分報道的P-LVS分離株中，一個新鑒定的種，被分類為假肺炎鏈球菌(S.pseudopneumoniae(Spseudo)),已經(jīng)被描述和表征(Arbique等，J.Clin.Microbiol.42=4686-4696,2004)。假肺炎鏈球菌生物體膽汁溶解性陰性，在存在5%C02的情況下對奧普托欣有抗性，但是ACCUPROBE陽性(Arbique等，J.Clin.Microbiol.42=4686-4696,2004)，因此產(chǎn)生了肺炎鏈球菌感染的假陽性。這些肺炎球菌類生物體的出現(xiàn)，使鑒定和診斷進(jìn)一步復(fù)雜化，特別是使用非無菌位點(diǎn)的呼吸系統(tǒng)樣本來確定時。因此，在臨床背景下必須特別小心地監(jiān)測和正確鑒定證實(shí)的肺炎球菌。因此，為了作出準(zhǔn)確的診斷，存在著對能夠辨別肺炎鏈球菌和假肺炎鏈球菌以及其它P-LVS物種的分析方法的需求。本公開內(nèi)容通過提供能夠區(qū)分肺炎鏈球菌和其它生物體、同時仍保留對肺炎鏈球菌的高度靈敏性的分析方法，滿足了這種需求。
發(fā)明內(nèi)容肺炎球菌疾病的準(zhǔn)確診斷，通常受到將類似肺炎球菌的草綠色鏈球菌種(P-LVS)錯誤鑒定為肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumoniae(S.pneumoniae))的妨礙。為了實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確診斷，分析方法應(yīng)該對疾病的診斷、例如肺炎鏈球菌感染的診斷，既靈敏又高度特異。通過分析肺炎鏈球菌獨(dú)特的lytA、ply和psaA基因區(qū)域，開發(fā)了本文公開的分析方法，它對肺炎鏈球菌高度特異，同時也對肺炎鏈球菌保持了高度靈敏性。因?yàn)楣_的分析方法既靈敏又特異，因此可以可靠地確定非無菌樣品、例如從對象獲得的樣品中肺炎鏈球菌的存在。這樣的準(zhǔn)確性對于醫(yī)學(xué)專業(yè)人員作出最好的可能的診斷和治療計(jì)劃，是重要的，特別是在藥物濫用、例如抗生素濫用的時代。此外，因?yàn)榉治龇椒▽τ趤碜苑窝祖溓蚓暮怂岣叨忍禺悾c來自其它生物體的核酸沒有顯示出交叉反應(yīng)，因此分析方法非常適合于多重分析，例如在多重實(shí)時PCR分析中，用于檢測在樣品、例如從對象獲得的樣品中存在的多種病原體。本公開涉及在樣品中、例如在從對象獲得的生物樣品中，檢測肺炎鏈球菌核酸的存在的方法，例如在樣品中檢測肺炎鏈球菌。公開的方法可用于在例如懷疑患有肺炎鏈球菌感染的對象中診斷肺炎鏈球菌感染，診斷是通過分析來自對象的生物樣本，使用本文公開的探針和/或引物檢測廣泛的各種不同的肺炎鏈球菌核酸，例如肺炎鏈球菌lytA、ply和psaA核酸。此外，提供的探針和引物，允許通過快速確定感染是由肺炎鏈球菌還是另一種生物體引起的，來快速評估具有表觀肺炎鏈球菌感染的對象。這種快速評估包括在例如多重實(shí)時PCR分析中排除肺炎鏈球菌的存在、判斷肺炎鏈球菌的存在，或二者的組合。在某些實(shí)施方案中，方法包括將肺炎鏈球菌核酸與長度在20到40個核苷酸之間的肺炎鏈球菌特異性探針進(jìn)行雜交，并檢測肺炎鏈球菌核酸與探針之間的雜交。在某些實(shí)施方案中，探針被可檢測地標(biāo)記。在某些實(shí)施方案中，探針能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下，與顯示在SEQIDN0:13(來自肺炎鏈球菌的lytA基因)、SEQIDNO14(來自肺炎鏈球菌的psaA基因)或SEQIDNO:15(來自肺炎鏈球菌的ply基因)中的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在具體實(shí)施方案中，探針包含與SEQIDN0:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9或SEQIDNO12中顯示的核酸序列具有至少95%同一性的核酸序列。本公開還涉及檢測和/或區(qū)分肺炎鏈球菌或另一種生物體、例如細(xì)菌生物體、例如類似肺炎鏈球菌的草綠色鏈球菌(P-LVS)、例如假肺炎鏈球菌(S.pseudopneumoniae(Spseudo))的方法。在某些實(shí)施方案中，本文公開的方法包括使用至少一個對肺炎鏈球菌核酸特異性的引物，來擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸。在某些實(shí)施方案中，對肺炎鏈球菌核酸特異性的引物，長度為15到40個核苷酸，能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:13、SEQIDNO14或SEQIDNO:15中顯示的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在某些實(shí)施方案中，對肺炎鏈球菌核酸特異性的引物，長度為15到40個核苷酸，包含有與SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10或SEQIDNO11中顯示的核苷酸序列有至少95%同一性的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，使用至少一個、例如一對特異性針對肺炎鏈球菌基因、例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply基因的引物，來擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸。在某些實(shí)施方案中，特異性針對肺炎鏈球菌lytA的引物，包含與SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中的一個中顯示的核酸序列具有至少95%同一性的核酸序列。在其它實(shí)施方案中，特異性針對肺炎鏈球菌psaA的引物，包含與SEQIDNO:7或SEQIDNO:8中的一個中顯示的核酸序列有至少95%同一性的核酸序列。在其它實(shí)施例中，特異性針對肺炎鏈球菌Ply的引物，包含與SEQIDNO10或SEQIDNO:11中的一個中顯示的核酸序列具有至少95%同一性的核酸序列。本公開還涉及能夠與肺炎鏈球菌核酸、例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply核酸雜交的探針。在某些實(shí)施方案中，這些探針的長度在20到40個核苷酸之間，能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDNO:12、SEQIDNO13或SEQIDNO14中顯示的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在幾個實(shí)施例中，這些探針的長度在20到40個核苷酸之間，并包含在SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDNO12中顯示的核酸序列。本公開還涉及能夠與肺炎鏈球菌核酸、例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply核酸雜交并擴(kuò)增它們的引物。在某些實(shí)施方案中，這些引物長度在20到40個核苷酸之間，能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下，與SEQIDN0:13、SEQIDN0:14或SEQIDNO:15中顯示的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在幾個實(shí)施例中，這些引物的長度在15到40個核苷酸之間，并包含與SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:11或SEQIDNO12中顯示的核酸序列有至少95%同一性的核酸序列。本公開還提供了用于在懷疑含有肺炎鏈球菌的樣品中檢測肺炎鏈球菌核酸的裝置，例如陣列，以及試劑盒。本發(fā)明的上述的以及其它的目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)，從下面的詳細(xì)描述中，并參考隨附的圖，將變得更加顯而易見。圖1是用于肺炎鏈球菌特異性探針與肺炎鏈球菌核酸雜交的通用步驟的示意圖。圖2是用于肺炎鏈球菌特異性探針與肺炎鏈球菌核酸雜交的通用步驟的示意圖，其中肺炎鏈球菌核酸在開始時是雙鏈核酸。圖3是使用肺炎鏈球菌特異性TAQMAN探針雜交和檢測肺炎鏈球菌的通用步驟的示意圖。圖4是使用TAQMAN探針從實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(實(shí)時PCR)產(chǎn)生的理論數(shù)據(jù)的圖。圖5是在多重實(shí)時PCR分析中使用的肺炎鏈球菌特異性TAQMAN探針的圖，顯示了指示的探針和引物組的效率。序列表使用在37C.F.R.§1.822中定義的標(biāo)準(zhǔn)的核苷酸堿基三字母縮寫和氨基酸單字母編碼，顯示了在隨附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列。如果對于每個核酸序列只顯示一條鏈，對顯示的鏈的任何指稱應(yīng)該被理解為包含了互補(bǔ)鏈。SEQIDNO1是理論寡聚物的核苷酸序列。SEQIDNO2是理論寡聚物的核苷酸序列。SEQIDNO3是肺炎鏈球菌lytA正向?qū)崟rPCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO4是肺炎鏈球菌lytA反向?qū)崟rPCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO5是肺炎鏈球菌lytA實(shí)時PCR探針的核苷酸序列。SEQIDNO6是肺炎鏈球菌lytA實(shí)時PCR探針的核苷酸序列。SEQIDNO7是肺炎鏈球菌psaA正向?qū)崟rPCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO8是肺炎鏈球菌psaA反向?qū)崟rPCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO9是肺炎鏈球菌psaA實(shí)時PCR探針的核苷酸序列。SEQIDNO10是肺炎鏈球菌ply正向?qū)崟rPCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO11是肺炎鏈球菌ply反向?qū)崟rPCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO12是肺炎鏈球菌ply實(shí)時PCR探針的核苷酸序列。SEQIDNO13是肺炎鏈球菌lytA的示例性核苷酸序列。SEQIDNO14是肺炎鏈球菌psaA的示例性核苷酸序列。SEQIDNO15是肺炎鏈球菌ply的示例性核苷酸序列。發(fā)明詳述I.術(shù)語的解釋除非另有指明，技術(shù)術(shù)語都按照其常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)常用術(shù)語的定義可以在BenjaminLewin的《基因VII》(GenesVII，由OxfordUniversityPress出版，1999)；Kendrew等主編的《分子生物學(xué)百科全書》(TheEncyclopediaofMolecularBiology,由BlackwellScienceLtd.出版，1994)；和RobertA.Meyers主編的《分子生物學(xué)與生物技術(shù)綜合桌面參考〉〉(MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference，由VCHPublishers,Inc.出版，1995)；以及其它類似參考書中發(fā)現(xiàn)。本文使用的不帶兩次的形式既指單數(shù)也指復(fù)數(shù)，除非上下文明確表明不是這樣。例如，術(shù)語“探針”包括了單個和多個探針，可以被認(rèn)為與詞組“至少一個探針”等價。本文使用的術(shù)語“包含”是指“包括”。因此，“包含探針”意味著“包括探針”而不排除其它元件。此外，應(yīng)該理解，所有對核酸或多肽給出的堿基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子質(zhì)量值，都是近似值，用于描述目的而提供，除非特別指明。盡管可以使用與本文描述的相似或等價的許多方法和材料，但在下面描述了特別適合的方法和材料。在有沖突的情況下，以本發(fā)明的說明、包括術(shù)語的解釋為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅僅是說明性的，不是限制性的。為了便于研究本發(fā)明的各種不同實(shí)施方案，提供了下列術(shù)語解釋動物活的多細(xì)胞脊椎或無脊椎生物體，該類別包括例如哺乳動物和鳥類。術(shù)語哺乳動物包括人類和非人類哺乳動物。類似地，術(shù)語“對象”包括人類和獸醫(yī)對象。擴(kuò)增為了增加核酸分子的拷貝數(shù)。獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物被稱為“擴(kuò)增子”。核酸分子(例如DNA或RNA分子)的擴(kuò)增，是指使用技術(shù)增加樣品中核酸分子的拷貝數(shù)，例如肺炎鏈球菌核酸、例如肺炎鏈球菌lyU核酸或其片段的拷貝數(shù)。擴(kuò)增的一個例子是聚合酶鏈反8應(yīng)(PCR)，其中將樣品與一對寡核苷酸引物，在允許引物與樣品中的核酸模板雜交的條件下相接觸。引物在適合的條件下延伸，從模板解離，重新退火、延伸并解離，以擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)。該循環(huán)可以重復(fù)。擴(kuò)增的產(chǎn)物可以通過例如電泳、限制性內(nèi)切酶裂解圖、寡核苷酸雜交或連接，和/或核酸測序等技術(shù)來表征。其它的體外擴(kuò)增技術(shù)的例子包括定量實(shí)時PCR，反轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)，實(shí)時PCR，實(shí)時反轉(zhuǎn)錄酶PCR(rtRT-PCR)，巢式PCR，鏈置換擴(kuò)增(參見美國專利No.5，744，311)，無轉(zhuǎn)錄恒溫?cái)U(kuò)增(參見美國專利No.6，033，881)，修復(fù)鏈反應(yīng)擴(kuò)增(參見W090/01069)，連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(參見歐洲專利公開EP-A-320308)，缺口填補(bǔ)連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增(參見美國專利No.5，427，930)；偶聯(lián)的連接酶檢測和PCR(參見美國專利No.6，027，889)，以及NASBARNA無轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(參見美國專利No.6，025，134)等。cDNA(互補(bǔ)性DNA)—段缺少內(nèi)部非編碼區(qū)段(內(nèi)含子)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的DNA。cDNA也可以包含非翻譯區(qū)(UTRs)，它們負(fù)責(zé)相應(yīng)的RNA分子的翻譯控制。cDNA可以在實(shí)驗(yàn)室中，通過反轉(zhuǎn)錄，從RNA、例如肺炎鏈球菌的RNA、例如編碼肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply的RNA合成。變化以某種方式變得不同，例如被改變，例如增加或降低。可檢測的變化是可以檢測到的變化，例如電磁信號的強(qiáng)度、頻率或存在與否的變化，例如熒光，例如探針、例如特異性針對肺炎鏈球菌核酸、例如肺炎鏈球菌lyU核酸、肺炎鏈球菌psaA核酸或肺炎鏈球菌Ply核酸的TAQMAN探針的熒光的變化。在某些實(shí)施例中，可檢測的變化是熒光強(qiáng)度的減小。在某些實(shí)施例中，可檢測的變化是熒光強(qiáng)度的增加?；パa(bǔ)的雙鏈DNA或RNA鏈由堿基對的兩條互補(bǔ)鏈構(gòu)成。當(dāng)一個核酸分子的堿基與另一個核酸分子的堿基形成氫鍵時，發(fā)生了互補(bǔ)性結(jié)合。一般來說，堿基腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互補(bǔ)，而胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)互補(bǔ)。例如，一個ssDNA分子的序列5'-ATCG-3'可以與另一個ssDNA的3'-TAGC-5'成鍵，形成dsDNA。在該例子中，序列5‘-ATCG-3'與3'-TAGC-5‘反向互補(bǔ)。核酸分子甚至在每個分子的所有堿基沒有完全形成氫鍵的情況下，也可以彼此互補(bǔ)。例如，與互補(bǔ)核酸序列的雜交可以在不同嚴(yán)緊性的條件下發(fā)生，其中互補(bǔ)鏈將在某些但不是所有的核苷酸位點(diǎn)處結(jié)合。在某些例子中，核酸分子，例如本文公開的特異性針對肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply的探針和引物，與肺炎鏈球菌的lytA、psaA或ply核酸分子或這樣的核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)。檢測確定因子(例如信號、特定核苷酸、氨基酸、核酸分子和/或生物體)是否存在，例如肺炎鏈球菌是否存在。在某些例子中，這還可以包括定量。例如，在具體實(shí)施例中使用公開的探針，允許檢測熒光團(tuán)，例如檢測來自熒光團(tuán)的信號，它可用于確定是否存在對應(yīng)于肺炎鏈球菌核酸(例如肺炎鏈球菌lyU核酸分子、肺炎鏈球菌psaA核酸分子或肺炎鏈球菌Ply核酸分子)的核酸。檢測到肺炎鏈球菌核酸分子表明樣品中存在肺炎鏈球菌，例如樣品中存在肺炎鏈球菌感染。電磁輻照可以通過電場和磁場強(qiáng)度的同時周期性變化傳播的一系列電磁波，包括無線電波、紅外、可見光、紫外光、X-射線和、射線。在具體的例子中，電磁輻照由激光器發(fā)射，它可以具有單色性、定向性、相干性、偏振和強(qiáng)度的性質(zhì)。激光器能夠發(fā)射例如特定波長(或在相對狹窄波長范圍內(nèi))的光，使得來自激光器的能量可以激發(fā)供體但不激發(fā)受9體熒光團(tuán)。發(fā)射或發(fā)射信號從源產(chǎn)生的特定波長的光。在具體實(shí)施例中，發(fā)射信號在熒光團(tuán)吸收了其激發(fā)波長處的光后，從熒光團(tuán)發(fā)射。激發(fā)或激發(fā)信號必需和/或足以激發(fā)電子躍遷到較高能級的特定波長的光。在具體實(shí)施例中，激發(fā)是必需和/或足以將熒光團(tuán)激發(fā)到某個狀態(tài)的特定波長的光，使得熒光團(tuán)發(fā)射出與激發(fā)信號的光的波長不同(例如更長)的波長的光。熒光團(tuán)化學(xué)化合物，當(dāng)通過暴露于特定刺激例如確定波長的光進(jìn)行激發(fā)時，發(fā)射出例如不同波長的光(熒光)(例如波長更長的光)。熒光團(tuán)是較大類別的發(fā)光化合物的一部分。發(fā)光化合物包括化學(xué)發(fā)光分子，它不需要特定波長的光來發(fā)光，而是使用化學(xué)能量源。因此，使用化學(xué)發(fā)光分子(例如水母素)，消除了對外部電磁輻照源、例如激光器的需要。可用于本文公開的肺炎鏈球菌特異性探針和引物的具體的熒光團(tuán)的例子，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，包括在Nazarenko等的美國專利No.5，866，366中提供的，例如4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸芪_2，2'二磺酸；吖啶及衍生物，例如吖啶和吖啶異硫氰酸酯，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亞胺_3，5二磺酸酯(螢光黃VS)，N-(4-苯胺基-1-萘基)馬來酰亞胺，2-氨基苯甲酰胺；亮黃；香豆素及衍生物，例如香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)，7_氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；四氯四溴熒光素(cyanosine)；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'，5〃-二溴焦掊酚-磺酞(溴鄰苯三酚紅)；7_二乙基氨基-3-(4'-異硫氰酸基苯基)_4_甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯；4，4'-二異硫氰酸基二氫-芪_2，2'-二磺酸；4，4'-二異硫氰酸芪_2，2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-異硫氰酸酯(DABITC)；曙紅及衍生物，例如曙紅和曙紅異硫氰酸酯；藻紅及衍生物，例如藻紅B和藻紅異硫氰酸酯；溴化乙錠；熒光素及衍生物，例如5-羧基熒光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基熒光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯_6_羧基熒光素(JOE)、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、QFITC(XRITC)、-6-羧基-熒光素(HEX)和TET(四甲基熒光素)；熒光胺；IR144；IR1446；孔雀石綠異硫氰酸酯；4-甲基-傘形酮；鄰甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰紅(pararosaniline)；酚紅；B_藻紅蛋白；鄰苯二甲醛；嵌二萘及衍生物，例如嵌二萘、嵌二萘丁酸酯和琥珀酰亞胺基1-嵌二萘丁酸酯；反應(yīng)紅4(CIBACR0N，亮紅3B-A)；羅丹明及衍生物，例如6-羧基-X-羅丹明(R0X)、6-羧基羅丹明(R6G)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、羅丹明(Rhod)、羅丹明B、羅丹明123、羅丹明X異硫氰酸酯、N，N，N',N'-四甲基_6_羧基羅丹明(TAMRA)、四甲基羅丹明和四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)；磺酰羅丹明B;磺酰羅丹明101和磺酰羅丹明101的磺酰氯衍生物(德克薩斯紅)；核黃素；玫紅酸和鋱螯合物衍生物；LightCycler紅640；Cy5.5以及Cy56_羧基熒光素；氟硼熒(borondipyrromethenedifluoride)(B0DIPY)；吖啶；芪；6-羧基-X-羅丹明(R0X)；德克薩斯紅；Cy3；Cy5；VIC(AppliedBiosystems)；LC紅640；LC紅705；以及Yakima黃，等等。其它適合的熒光團(tuán)包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如可以從MolecularProbes公司(Eugene，0R)獲得的熒光團(tuán)。在具體實(shí)施例中，熒光團(tuán)被用作供體熒光團(tuán)或受體熒光團(tuán)?！笆荏w熒光團(tuán)”是吸收來自供體熒光團(tuán)能量、例如大約400到900nm范圍內(nèi)(例如大約500到800nm范圍內(nèi))的能量的熒光團(tuán)。一般來說，受體熒光團(tuán)吸收的光的波長通常比供體熒光團(tuán)的最大吸收波長高至少lOnm(例如高至少20nm)，并在大約400到900nm波長范圍內(nèi)具有最大熒光發(fā)射。受體熒光團(tuán)具有與供體熒光團(tuán)的發(fā)射光譜重疊的激發(fā)光譜，使得供體發(fā)射的能量可以激發(fā)受體。理想情況下，受體熒光團(tuán)能夠連接到核酸分子上。在具體實(shí)施例中，受體熒光團(tuán)是暗淬滅劑(darkquencher)，例如Dabcyl、QSY7(MolecularProbes)、QSY33(MolecularProbes)、BLACKHOLEQUENCHERS(GlenResearch)、ECLIPSEDarkQuencher(EpochBiosciences)或IOWABLACK(IntegratedDNATechnologies)0淬滅劑可以降低或淬滅供體熒光團(tuán)的發(fā)射。在這樣的例子中，不是檢測當(dāng)與供體熒光團(tuán)足夠接近時來自受體熒光團(tuán)的發(fā)射信號的增加(或檢測當(dāng)與供體熒光團(tuán)顯著遠(yuǎn)時來自受體熒光團(tuán)的發(fā)射信號的降低)，而是檢測當(dāng)淬滅劑距離供體熒光團(tuán)顯著遠(yuǎn)時來自供體熒光團(tuán)的發(fā)射信號的增加(或當(dāng)與淬滅劑受體熒光團(tuán)足夠近時來自供體熒光團(tuán)的發(fā)射信號的降低)?！肮w熒光團(tuán)”是能夠?qū)⒛芰總魉偷绞荏w熒光團(tuán)、從而從受體產(chǎn)生可檢測的熒光信號的熒光團(tuán)或發(fā)光分子。供體熒光團(tuán)一般來說是吸收波長大約300到900nm，例如吸收波長大約350到800nm范圍內(nèi)的化合物。供體熒光團(tuán)在所需激發(fā)波長處具有強(qiáng)的摩爾吸光系數(shù)，例如大于大約lOlicnT1。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)能量在相隔10-100人的最初被激發(fā)供體與受體分子之間傳送的光譜學(xué)過程。供體分子一般在較短的波長處發(fā)射，該波長與受體分子的吸收波長重疊。能量轉(zhuǎn)移的效率與供體與受體熒光團(tuán)之間的距離(R)的負(fù)六次方(1/R6)成正比，發(fā)生時不發(fā)射光子。在使用FRET的應(yīng)用中，供體和受體染料是不同的，在這種情況下，F(xiàn)RET可以通過受體的感應(yīng)熒光的出現(xiàn)或通過供體熒光的淬滅來檢測。例如，如果供體的熒光被淬滅，表明供體和受體分子在F6rster半徑(FRET具有50%效率時的距離，大約為20-60A)范圍內(nèi)，而如果供體在其特征性波長處發(fā)射熒光，表明供體和受體之間的距離增加到了超過F6rster半徑，例如在TAQMAN探針與靶核酸雜交后被Taq聚合酶降解時，或當(dāng)發(fā)夾探針與靶核酸序列雜交時。在另一個例子中，能量通過FRET在不同的熒光團(tuán)之間轉(zhuǎn)移，使得受體分子可以在其特征性波長處發(fā)射光，該波長總是比供體分子的發(fā)射波長更長。使用FRET的可用于檢測擴(kuò)增子的寡核苷酸的例子包括線性寡聚探針例如HybProbes,5'核酸酶寡聚探針例如TAQMAN探針，發(fā)夾寡聚探針例如分子信標(biāo)、蝎狀引物和UniPrimers，小溝結(jié)合探針，以及自身發(fā)熒光擴(kuò)增子例如發(fā)卡式引物(sunriseprimer)。雜交互補(bǔ)的單鏈DNA或RNA形成雙鏈體分子(也被稱為雜交復(fù)合物)的能力。核酸雜交技術(shù)可用于在探針或引物與核酸、例如肺炎鏈球菌核酸分子、例如肺炎鏈球菌lyU、psaA或ply核酸分子之間，形成雜交復(fù)合物。例如，與肺炎鏈球菌核酸分子具有一定同源性的探針或引物(例如SEQIDNOs3-12中的任一個)，將與肺炎鏈球菌核酸分子(例如SEQIDNOs13-15中任一個)形成雜交復(fù)合物。參考圖1，雜交復(fù)合物110的形成，發(fā)生在單鏈探針105與單鏈靶核酸100(例如肺炎鏈球菌核酸分子，例如lytA、psaA或ply核酸分子)之間。參考圖2，當(dāng)靶核酸210最初是雙鏈體核酸200的一條鏈時，必須將雙鏈體解鏈(至少部分地)成靶核酸210和互補(bǔ)鏈220，用于探針205的雜交和形成雜交復(fù)合物230。導(dǎo)致特定嚴(yán)緊性程度的雜交條件，將根據(jù)雜交方法的性質(zhì)以及雜交核酸序列的組成和長度而變化。一般來說，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(例如Na+濃度)將決定雜交的嚴(yán)緊性。關(guān)于獲得特定嚴(yán)緊性程度的雜交條件的計(jì)算，討論在Sambrook等，《分子克隆》(第二片反((1989)MolecularCloning,secondedition,ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,NY)的第9和11章中。下面是一組示例性而不是限制性的雜交條件的例子非常高嚴(yán)緊性(檢測具有至少90%同一性的序列)雜交:5xSSC，在65°C進(jìn)行16小時清洗兩次2xSSC,在室溫(RT)進(jìn)行，每次15分鐘清洗兩次0.5xSSC,在65°C進(jìn)行，每次20分鐘高嚴(yán)緊性(檢測具有至少80%同一性的序列)雜交5x_6xSSC，在65°C_70°C進(jìn)行16-20小時清洗兩次2xSSC,在RT進(jìn)行，每次5-20分鐘清洗兩次lxSSC，在55°C-70°C進(jìn)行，每次30分鐘低嚴(yán)緊性(檢測具有至少50%同一性的序列)雜交6xSSC,在RT到55°C進(jìn)行16-20小時清洗至少兩次2x_3xSSC，在RT到55°C進(jìn)行，每次20-30分鐘。本文公開的探針和引物可以在低嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性和非常高嚴(yán)緊性條件下，與肺炎鏈球菌核酸分子、例如lytA、psaA或ply核酸分子雜交。分離的“分離的”生物學(xué)成分(例如核酸)，已經(jīng)與成分天然存在的其它的生物學(xué)成分，例如其它染色體和染色體外DNA、RNA和蛋白，基本上分離開或純化出來。已經(jīng)被“分離的”核酸包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸。該術(shù)語還包括在宿主細(xì)胞中通過重組表達(dá)制備的核酸，以及化學(xué)合成的核酸，例如探針和引物，例如本文公開的肺炎鏈球菌特異性探針和引物。分離不要求絕對純度，可以包括至少50%分離的，例如至少75%、80%、90%、95%、98%、99%或甚至100%分離的核酸分子。標(biāo)記物能夠例如通過光譜術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)或顯微術(shù)檢測的試劑。例如，標(biāo)記物可以連接于核苷酸，從而允許檢測該核苷酸，例如檢測該核苷酸是其一部分的核酸分子，例如肺炎鏈球菌特異性探針和/或引物。標(biāo)記物的例子包括但不限于放射性同位素、酶的底物、輔因子、配體、化學(xué)發(fā)光試劑、熒光團(tuán)、半抗原、酶及其組合。用于標(biāo)記的方法以及選擇適合于各種不同目的的標(biāo)記物的準(zhǔn)則，討論在例如Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)禾口Ausubel等《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons，NewYork,1998)中。核酸(分子或序列)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括但不限于cDNA、mRNA、基因組DNA和合成的(例如化學(xué)合成的)DNA或RNA。核酸可以是雙鏈(ds)或單鏈(ss)的。當(dāng)核酸是單鏈時，可以是正義鏈或反義鏈。核酸可以包括天然核苷酸(例如A、T/U、C和G)，可以包含天然核苷酸的類似物，例如標(biāo)記的核苷酸。在某些實(shí)施例中，核酸是肺炎鏈球菌核酸，它可以包括從肺炎鏈球菌純化的核酸，以及這樣的核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。核苷酸核酸分子的基本單元。核苷酸包括含氮堿基，它連接在戊糖單糖上，并具有1個、2個或3個通過酯鍵與糖基團(tuán)連接的磷酸基團(tuán)。DNA的絕大部分核苷酸是脫氧腺苷5'-三磷酸(dATP或A)、脫氧鳥苷5‘-三磷酸(dGTP或G)、脫氧胞苷5‘-三磷酸(dCTP或C)和脫氧胸苷5‘-三磷酸(dTTP或T)。RNA的絕大部分核苷酸是腺苷5'-三磷酸(ATP或A)、鳥苷5'-三磷酸(GTP或G)、胞苷5‘-三磷酸(CTP或C)和尿苷5‘-三磷酸(UTP或U)。核苷酸包括含有修飾的堿基、修飾的糖基團(tuán)和修飾的磷酸骨架的核苷酸，例如在Nazarenko等的美國專利No.5，866，336中描述的(在此引為參考)?？捎糜谠诤塑账峤Y(jié)構(gòu)上的任何位置修飾核苷酸的修飾的堿基部分的例子，包括但不限于5_氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，乙酰胞嘧啶，5-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，0-D-半乳糖Q核苷(galactosylqueosine)，肌苷，N6_異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，甲氧基氨基甲基2-硫尿嘧啶，3-D-甘露糖Q核苷，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸，假尿嘧啶，Q核苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-S-氧基乙酸，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，以及2，6_二氨基嘌呤等等?？捎糜谠诤塑账峤Y(jié)構(gòu)的任何位置上修飾核苷酸的修飾的糖基團(tuán)的例子，包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木糖和己糖，或磷酸骨架的修飾成分，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、膦酸甲酯、烷基磷酸三酯或縮甲醛(formacetal)或其類似物。弓丨物短的核酸分子，例如DNA寡核苷酸，例如至少15個核苷酸的序列，可以通過核酸雜交與互補(bǔ)的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸鏈之間形成雜交體。引物可以通過聚合酶沿著靶核酸分子延伸。因此，引物可用于擴(kuò)增靶核酸分子(例如肺炎鏈球菌核酸分子的一部分，例如lytA、psaA或ply核酸分子的一部分)，其中引物的序列對于靶核酸分子是特異性的，因此例如引物將在非常高嚴(yán)緊性雜交條件下與靶核酸分子雜交。引物的特異性隨著其長度增加。因此，例如，含有30個連續(xù)核苷酸的引物，將以與只有15個核苷酸的相應(yīng)引物相比更高的特異性與靶序列退火。因此，為了獲得更高的特異性，可以選擇含有至少15、20、25、30、35、40、45、50個或以上連續(xù)核苷酸的探針和引物。在具體的實(shí)施例中，引物長度為至少15個核苷酸，例如與靶核酸分子互補(bǔ)的至少15個連續(xù)的核苷酸?？捎糜趯?shí)施本公開的方法(例如用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸分子的區(qū)域，例如lytA、psaA或ply核酸分子的一部分)的引物的具體長度，包括具有至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少45、至少50個或以上的、與待擴(kuò)增的靶核酸分子互補(bǔ)的連續(xù)的核苷酸的引物，例如15-60個核苷酸、15-50個核苷酸、20-40個核苷酸、25-50個核苷酸或15-30個核苷酸的引物?？梢岳缤ㄟ^PCR、實(shí)時PCR或其它本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的核酸擴(kuò)增方法，使用引物對來擴(kuò)增核酸序列。“上游”或“正向”引物是相對于核酸序列上的參比點(diǎn)5’方向的引物?！跋掠巍被颉胺聪颉币锸窍鄬τ诤怂嵝蛄猩系膮⒈赛c(diǎn)3’方向的引物。一般來說，在擴(kuò)增反應(yīng)中包含至少一個正向和一個反向引物。PCR引物對可以源自于已知序列(例如顯示為SEQIDN0S:13-15的肺炎鏈球菌核酸序列)，例如通過使用用于此目的的計(jì)算機(jī)程序，例如Primer(0.5版，1991,WhiteheadlnstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)^PRIMEREXPRESS^^(AppliedBiosystems,AB,FosterCity，CA)。制備和使用引物的方法描述在例如Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》((1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork)；Ausubel等《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》((1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePubl.Assoc.&ffiley-Intersciences)中。在一個實(shí)施例中，引物包含標(biāo)記物。探針探針包含能夠與靶核酸(例如肺炎鏈球菌核酸，例如肺炎鏈球菌lyU、psaA或Ply核酸分子)雜交的分離的核酸。探針上可以連接可檢測標(biāo)記物或報告分子。典型的標(biāo)記物包括放射性同位素、酶的底物、輔因子、配體、化學(xué)發(fā)光或熒光試劑、半抗原和酶。用于標(biāo)記的方法和選擇適合于各種不同目的的標(biāo)記物的準(zhǔn)則，討論在Sambrook等《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))和Ausubel等《分子生物學(xué)現(xiàn)代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandffiley-Intersciences(1987))中。在具體實(shí)施例中，探針包含至少一個熒光團(tuán)，例如受體熒光團(tuán)或供體熒光團(tuán)。例如，熒光團(tuán)可以連接到探針的5'-或3'-末端。在具體實(shí)施例中，熒光團(tuán)連接到探針5’-末端的堿基上，其3’-末端的堿基上，其5’-末端的磷酸基團(tuán)上或修飾的堿基上，例如探針內(nèi)部的T。探針的長度一般為至少20個核苷酸，例如至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60個或以上與靶核酸分子互補(bǔ)的連續(xù)的核苷酸，例如20-60個核苷酸、30-60個核苷酸、20-50個核苷酸、30-50個核苷酸、20-40個核苷酸或20-30個核苷酸。聚合試劑在化學(xué)反應(yīng)中能夠?qū)误w分子(例如核苷酸)反應(yīng)在一起，形成線性鏈或聚合物鏈的三維網(wǎng)絡(luò)的化合物。聚合試劑的具體的例子是聚合酶，即催化與核酸模板互補(bǔ)的引物鏈的5’到3’延伸的酶?？捎糜跀U(kuò)增核酸分子的聚合酶的例子包括但不限于大腸桿菌DNA聚合酶I，特別是具有3’到5’核酸外切酶活性的Klenow片段，Taq聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶(例如HIV-1RT)，大腸桿菌RNA聚合酶，以及小麥胚芽RNA聚合酶II。聚合酶的選擇依賴于待擴(kuò)增的核酸。如果模板是單鏈DNA分子，可以使用DNA指導(dǎo)的DNA或RNA聚合酶；如果模板是單鏈RNA分子，那么可以使用反轉(zhuǎn)錄酶(例如RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶)。定量核酸分子測定或測量存在的核酸分子的量(例如相對量)，例如樣品中存在的擴(kuò)增子的數(shù)量或核酸分子的數(shù)量。在具體實(shí)施例中，它是測定樣品中存在的核酸分子、例如樣品中存在的肺炎鏈球菌核酸分子的相對量或?qū)嶋H數(shù)量。熒光的淬滅熒光的降低。例如，當(dāng)淬滅劑分子(例如上面列出的熒光淬滅劑)位于與熒光團(tuán)足夠接近的位置，使得它降低了熒光信號時(例如當(dāng)探針含有熒光團(tuán)和淬滅劑時，在探針與肺炎鏈球菌核酸序列結(jié)合之前)，發(fā)生了熒光團(tuán)的熒光的淬滅。實(shí)時PCR:用于檢測和測量在每個PCR循環(huán)過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物的方法，產(chǎn)生的產(chǎn)物與開始PCR之前模板核酸的量成正比。獲得的信息，例如擴(kuò)增曲線，可用于確定靶核酸(例如肺炎鏈球菌核酸)的存在和/或定量靶核酸序列的起始量。實(shí)時PCR的示例性步驟可以在PerkinElmerAppliedBiosystems公司出版的“使用實(shí)時PCR檢測定量DNA/RNA”("QuantitationofDNA/RNAUsingReal-TimePCRDetection，，，(1999))禾口《PCR方法》(PCRProtocols(AcademicPressNewYork,1989))中發(fā)現(xiàn)。在某些實(shí)施例中，被擴(kuò)增的靶核酸(例如肺炎鏈球菌核酸分子，例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply核酸分子)的量，使用標(biāo)記探針、例如用熒光團(tuán)標(biāo)記的探針、例如TAQMAN探針來檢測。在該實(shí)施例中，在實(shí)時PCR過程中，實(shí)時測量熒光發(fā)射的增加。這種熒光發(fā)射的增加與靶核酸擴(kuò)增(例如肺炎鏈球菌核酸)的增加直接相關(guān)。在某些實(shí)施例中，熒光的變化(dRn)使用方程dRn=Rn+-Rn_來計(jì)算，其中Rn+是在每個時間點(diǎn)時產(chǎn)物的熒光發(fā)射，RrT是基線熒光發(fā)射。將dRn值對循環(huán)數(shù)進(jìn)行作圖，得到了每個樣品的擴(kuò)增圖，如圖4中所示。參考圖4，閾值(Ct)是熒光發(fā)射(dRn)超過選定閾值時的PCR循環(huán)數(shù)，一般為基線標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍(但是，如果需要，該閾值水平可以改變)。閾值循環(huán)是在對數(shù)_線性階段中，系統(tǒng)開始檢測到與PCR產(chǎn)物的指數(shù)增長相關(guān)的信號的增加的時間。該階段提供了關(guān)于反應(yīng)的信息。對數(shù)-線性階段的斜率反映了擴(kuò)增的效率。反應(yīng)的效率可以通過下列方程計(jì)算E=10H/W)-1。PCR的效率應(yīng)該為在每個循環(huán)擴(kuò)增子90-100%的平均加倍。這相當(dāng)于在Ct相對于對數(shù)-模板量標(biāo)準(zhǔn)曲線中斜率為-3.1到-3.6。為了獲得準(zhǔn)確的、可重復(fù)的結(jié)果，反應(yīng)的效率應(yīng)該盡可能接近100%(在每個循環(huán)擴(kuò)增子平均增加2倍)。樣品樣品，例如生物學(xué)樣品，是從動物或植物對象獲得的樣品。本文中使用的生物樣品包括所有可用于在對象中檢測肺炎鏈球菌感染的臨床樣品，包括但不限于細(xì)胞、組織和體液，例如血液；血液衍生物或級份，例如血清；提取的膽汁；活組織檢查或手術(shù)取出的組織，包括例如未固定的、冷凍的、固定在福爾馬林和/或包埋在石蠟中的組織；淚液；乳汁；皮屑；表面清洗液；尿液；痰液；腦脊液；前列腺液；膿；骨髓吸出物；中耳流出物，支氣管肺泡灌洗物(levage)，氣管吸出物，痰液，鼻咽吸出物，口咽吸出物或唾液。在具體實(shí)施方案中，生物學(xué)樣品從動物對象獲得，例如以中耳流出物、支氣管肺泡灌洗物、氣管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液的形式。序列同一性/相似性兩個或多個核酸序列，或兩個或多個氨基酸序列之間的同一性/相似性，根據(jù)序列之間的同一性或相似性來表示。序列同一性可以根據(jù)百分同一性來度量；百分率越高，序列越一致。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法比對時，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物，具有相對高水平的序列同一性/相似性。用于比對序列進(jìn)行比較的方法在本
技術(shù)領(lǐng)域：
的眾所周知的。各種不同的程序和比對算法描述在Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482，1981；Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipm￡in，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85-.2444,1988；Higgins&Sharp，Gene，73:237_44，1988;Higgins&Sharp，CABIOS5:151-3，1989；Corpet等’Nuc.AcidsRes.1610881—90，1988；Huang等’ComputerAppls.intheBiosciences8，155-65，1992；以及Pearson等，Meth.Mol.Bio.24:307_31，1994中。Altschul等，J.Mol.Biol.215:403_10，1990，提出了對序列比對方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)^慮oNCBI的基本局部比對搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215=403-10,1990)可以從幾個來源獲得，包括國家生物信息中心(NationalCenterforBiologicallnformation(NCBI,NationalLibraryofMedicine,Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894))和互聯(lián)網(wǎng)上，與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn禾口tblastx結(jié)合使用。Blastn用于比較核酸序列，而blastp用于比較氨基酸序列。其它信息可以在NCBI網(wǎng)站上找到。比對后，通過對兩個序列中存在一致的核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，確定匹配數(shù)。通過用匹配數(shù)除以在鑒定的序列中提出的序列長度，或除以明確指定的長度(例如來自在鑒定的序列中提出的序列的100個連續(xù)的核苷酸或氨基酸殘基)，然后將得到的值乘以100，來確定百分序列同一性。例如，當(dāng)核酸序列與具有1554個核苷酸的測試序列比對時，具有1166個匹配，則與測試序列的百分同一性是75.0(1166+1554*100=75.0)。百分序列同一性值被約到最接近的小數(shù)點(diǎn)后1位。例如，75.11,75.12,75.13和75.14被約到75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18和75.19被約到75.2。長度值總是整數(shù)。在另一個例子中，含有20個核苷酸區(qū)域的靶序列與如下所示的來自被鑒定序列的20個連續(xù)的核苷酸進(jìn)行比對，含有與該被鑒定序列具有75百分序列同一性的區(qū)域(即15+20*100=75)。120革巴序列atggtggacccggtgggctt(SEQIDN0:1)|||III||II被鑒定的序列acgggggatccggcgggcct(SEQIDNO:2)兩個核酸分子密切相關(guān)的一個指示是兩個分子彼此之間在嚴(yán)緊條件下雜交。嚴(yán)緊性條件是序列依賴性的，在不同環(huán)境參數(shù)下是不同的。本文公開的核酸探針和引物不限于顯示的精確序列，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到的，如果需要，可以對序列進(jìn)行改變，而不顯著影響探針或引物發(fā)揮作用的能力。例如，在本文中提供了與SEQIDNOs3-12中的任一個具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，例如100%序列同一性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到，這些提供的序列同一性范圍僅僅是指導(dǎo)的目的；不在這些范圍內(nèi)的探針和引物可能也可以使用。信號提供了信息的物理性質(zhì)的可檢測的變化或脈沖。在本公開的方法的情況下，例子包括電磁信號，例如光，例如特定數(shù)量和波長的光。在某些實(shí)施例中，信號是物理事件的消失，例如光的淬滅。肺炎鏈球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(lytA):肺炎鏈球菌的lytA編碼的自溶素。本文中使用的“l(fā)ytA”是指lytA的核苷酸序列，因此例如在本文中公開的針對lytA的探針或引物，能夠與lytA的核苷酸序列，例如下面給出的lytA核苷酸序列(或其互補(bǔ)體)雜交。示例的lytA核苷酸序列，例如在2007年5月7日提交的GENBANK登記16號AE005672，顯示如下ttattttactgtaatcaagccatctggctctactgtgaattctggcttgtctgccagtgttccgtctggtttgaggtagtaccagcctgttccgtccgctgactggataaaggcatttgataccatggcgccttctttagcgtctaagtagtaccaagtgtccttgtacttgacccagcctgtcttcatggcaccttcttcgttgaaatagtaccacttatcagcgattttcttccagcctgtagccatttcgcctgagttgtcgaaccagtaccagttgccgtctgtgtgcttcctccagcggtctgcaagcatatagcctgaactgtcaaagtagtaccaagtgccattgattttctcaaacttgtcttttggataagagccgtctgaatgtacgtaccagtagccagtgtcattcttctgccagcctgtttcaatcgtcaagccgttctcaatatcatgcttaaactgctcacggctaatgccccatttagcaagatatggataagggtcaacgtggtctgagtggttgtttggttggttattcgtgcaatactcgtgcgttttaattccagctaaactccctgtatcaagcgttttcggcaaacctgcttcatctgctagattgcgtaagagttcgatataaaggcggtagtccgtcatgaactcttctttggttgaatggctttcaatcagttcaaccgctgcataggtctcagcattccaaccgcccccaacgtcccaggcaccattatcaacaggtcctacctgcatgatgcaaccgttcccaacaatgtgcgagaaaaaacctaattctgggtctttccgccagtgataatccgcttcattctgtacggttgaatgcggattcccagttgagtgtgcgtgtacttgcctatatggttgcacgccgacttgaggcaaatctgttcttaatttactcacattaatttccat(SEQIDNO13)0肺炎鏈球菌溶血素(ply)肺炎鏈球菌的毒力因子，是由4個結(jié)構(gòu)域組成的硫醇活化的細(xì)胞溶素(TACYs)的一個成員。本文中使用的“ply”是指ply的核苷酸序列，因此例如在本文中公幵的針對ply的探針或引物，能夠與ply的核苷酸序列，例如下面給出的ply核苷酸序列(或其互補(bǔ)體)雜交。示例的Ply核苷酸序列，例如在2007年5月7日提交的GENBANK登記號AE008539，顯示如下ctagtcattttctaccttatcctctacctgaggatagagagttgttccccaaatagaaatcgtccgcttacgcactagtggcaaatcggttttttcataaaccgtacgccaccattcccaggcaagcccggtacactctctaattttgacagagagattacgaacattcccttttaaaggaatactagtggtaaagtgagccgtcaaatcctgcccatttctgtcccaagccttaggagtcaagacttccttaccttgatgatcataggataattcatcccaagtaatataatattgggcaacataggcaccactatgatccagcagtaaatctccgtttctgtaagctgtaaccttagtctcaacatagtctgtactgttttgaaaggtcgcaactacattgtcacgtaaaaaagaagttgtataggaaatcggcaagcctggatgatctgctgtaaagcgactgccttcttgaatcaagtcctctaccatatccaccttgcctgttacaactcgggcacccgaacttgggtcgccccctaaaataaccgccttcacttctgtattgtccaaaatctgcttccactctgtctgaggagctaccttgactccttttatcaaagcttcaaaagcagcctctacttcatcactcttactcgtggtttccaacttgagatagacttggcgcccataagcaacactcgaaatatagaccaaaggacgctctgcagaaattcctctctgttttaaatcctctaccgttacagtatcttgaaacacatctcctggatttttaacagcgtctacgctgactgtataataaatctgcttaaaattaacaatctgaatctgcttttcacctgaatggacagagttaaaatcaatatcaagagaattccctgtcttttcaaagtcagaaccaaacttgaccttgagttgttccatgctgtgagccgttattttttcatactgcattctagctgggacattattgacctgaccataatcttgatgccacttagccaacaaatcgtttaccgctccgcgaacacttgaattgctggggtcttccacttggagaaagctatcgctacttgccaaaccaggcaaatcaatactataagtcatcggagcacgatcaaccgcaagaagagtgggattattctctaacaaggtctcatccactacgagaagtgctccaggatagaggcgactgtcgttggtagctgttacagaaatatcacttgtatttgtcgacaagctccgcttctttctttcgataacaacaaactcatcgggtagctgattaccctctttgatgaaacgattttcaatactttctccctgatgggtcaagagtttctttttatcgtaattcatagctagtataaagtcatttactgctttatttgccat(SEQIDN0:14)o肺炎鏈球菌表面粘附素A前體(psaA):pSaA編碼37_kDa的肺炎球菌脂蛋白，是ABCMn(II)轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體的一部分。本文中使用的“psaA”是指psaA的核苷酸序列，因此例如在本文中公開的針對psaA的探針或引物，能夠與psaA的核苷酸序列，例如下面給出的psaA核苷酸序列(或其互補(bǔ)體)雜交。示例的psaA核苷酸序列，例如在2007年5月7日提交的GENBANK登記號U53509，顯示如下tactgcttcagttttgggactctttattggctatagttttaatgttgcggcaggttctagtatcgtgcttacagctgctagtttctttctcattagcttctttatcgctcccaaacaacgatatttgaaactgaaaaataaacatttgttaaaataaggggcaaagccctaataaattggaggatctaatgaaaaaattaggtacattactcgttctctttctttctgcaatcattcttgtagcatgtgctagcggaaaaaaagatacaacttctggtcaaaaactaaaagttgttgctacaaactcaatcatcgctgatattactaaaaatattgctggtgacaaaattgaccttcatagtatcgttccgattgggcaagacccacacgaatacgaaccacttcctgaagacgttaagaaaacttctgaggctgatttgattttctataacggtatcaaccttgaaacaggtggcaatgcttggtttacaaaattggtagaaaatgccaagaaaactgaaaacaaagactacttcgcagtcagcgacggcgttgatgttatctaccttgaaggtcaaaatgaaaaaggaaaagaagacccacacgcttggcttaaccttgaaaacggtattatttttgctaaaaatatcgccaaacaattgagcgccaaagaccctaacaataaagaattctatgaaaaaaatctcaaagaatatactgataagttagacaaacttgataaagaaagtaaggataaatttaataagatccctgctgaaaagaaactcattgtaaccagcgaaggagcattcaaatacttctctaaagcctatggtgtcccaagtgcctacatctgggaaatcaatactgaagaagaaggaactcctgaacaaatcaagaccttggttgaaaaacttcgccaaacaaaagttccatcactctttgtagaatcaagtgtggatgaccgtccaatgaaaactgtttctcaagacacaaacatcccaatctacgcacaaatctttactgactctatcgcagaacaaggtaaagaaggcgacagctactacagcatgatgaaatacaaccttgacaagattgctgaaggattggcaaaataagcctctgaaaaacgtcattctcatgtgagctggcgttttttctatgcccacatttccggtcaaatcattggaaaattctgactgtttcagatacaatggaagaaaaaagattggagtatcctatggtaacttttctcggaaatcctgtgagctttacaggtaaacaactacaagtcggcgacaaggcgcttgatttttctcttactacaaca(SEQIDNO:15)。TAQMANPCR參考圖3，選擇了TAQMAN探針360與靶核酸330的一條鏈結(jié)合，該探針典型地含有報告分子320(例如短波長熒光團(tuán)，例如6-羧基熒光素(FAM))和淬滅劑350(例如長波長的熒光團(tuán)，例如BLACKHOLEQUENCHER1(BHQ1))。當(dāng)輻照時，能量從報告分子320轉(zhuǎn)移(通過FRET)到完整TAQMAN探針360的另一個末端上的淬滅劑350。因此，當(dāng)TAQMAN探針360完整時，報告分子320與淬滅劑350的接近性阻止了任何信號的檢測。當(dāng)Taq聚合酶使用結(jié)合有TAQMAN探針360的引物300、301復(fù)制靶核酸330時，聚合酶380的5'外切核酸酶活性裂解了TAQMAN探針360。在降解后，F(xiàn)RET中斷，結(jié)束了淬滅劑350的活性。報告分子320開始發(fā)射信號，該信號在每個循環(huán)中，與TAQMAN探針360裂解的速度成正比增加。PCR產(chǎn)物370的積累，通過監(jiān)測報告分子320的信號的增加來檢測。因?yàn)榱呀庵辉赥AQMAN探針360與靶核酸330雜交的情況下才發(fā)生，因此檢測到的熒光的來源是特異性的擴(kuò)增。雜交和裂解的過程不干擾PCR產(chǎn)物370的指數(shù)性積累。靶核酸分子打算對其進(jìn)行檢測、定量、定性檢測或其組合的核酸分子。核酸分子不是必須處于純化的形式。各種不同的其它核酸分子也可以與靶核酸分子共存。例如，靶核酸分子可以是意在對其進(jìn)行擴(kuò)增的特異性核酸分子(可以包括RNA例如肺炎鏈球菌RNA，或DNA例如肺炎鏈球菌DNA，例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或plyDNA)。如果需要，靶核酸分子的純化或分離可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來進(jìn)行，例如使用可商購的純化試劑18盒等。在一個例子中，靶核酸分子是肺炎鏈球菌核酸序列。II.幾個實(shí)施方案的概述肺炎球菌疾病的準(zhǔn)確診斷常常不僅受到從患者樣本獲得生物體分離株的困難性的阻礙，而且受到將類似肺炎球菌的草綠色鏈球菌種(P-LVS)錯誤地鑒定為肺炎鏈球菌的妨礙。為了獲得準(zhǔn)確的診斷，分析方法應(yīng)該對疾病的診斷、例如肺炎鏈球菌感染的診斷既靈敏又高特異性。本文公開了被設(shè)計(jì)用于檢測肺炎鏈球菌的探針和引物，它們可以在例如實(shí)時PCR分析，例如在多重實(shí)時PCR分析中，檢測肺炎鏈球菌lytA、ply和psaA基因的特定序列區(qū)域。當(dāng)在代表性的實(shí)時PCR分析中使用時，本文公開的探針和引物被證實(shí)對肺炎鏈球菌既高度靈敏又高度特異，代表了與典型的用于檢測肺炎鏈球菌的探針和引物，例如由Corless等(Corless等，J.Clin.Microbiol.391553-1558，2001)和McAvin等(McAvin等，J.Clin.Microbiol.39=3446-3451,2001)描述的探針和引物相比，顯著的進(jìn)步。將本公開的探針和引物(lytA-CDC，psaA_CDC和ply-CDC)與Corless等和McAvin等描述的探針和引物(lytA-McAvin和ply-Corless)，在下列一組分離株中進(jìn)行了直接比較(使用了實(shí)時PCR):67株肺炎鏈球菌(44個不同的血清型和3種來自結(jié)膜炎發(fā)作的無莢膜的肺炎鏈球菌)，以及104株非肺炎球菌分離株，結(jié)果證明，本文公開的探針和引物，例如特異性針對肺炎鏈球菌lytA、ply和psaA的探針和引物，在辨別肺炎鏈球菌分離株和非肺炎鏈球菌分離株方面更加優(yōu)越。公開的探針，以及Corless等和McAvin等描述的探針，都能檢測67株肺炎鏈球菌分離株。但是，公開的肺炎鏈球菌lytA和psaA特異性探針和引物，被證實(shí)對于肺炎鏈球菌具有比Corless等和McAvin等描述的分析方法更高的特異性。例如，Corless等和McAvin等描述的探針和引物記錄了假陽性，在某些情況下可能導(dǎo)致肺炎鏈球菌的誤診。lytA-⑶C和psaA-⑶C實(shí)時PCR分析都是高特異性的，使用P-LVS分離株時沒有顯示出擴(kuò)增。本文描述的新開發(fā)的方法，提供了比目前使用的分析方法具有更高的靈敏性和改進(jìn)的特異性的分析測試。特異性的改進(jìn)允許它們能夠使用來自非無菌位點(diǎn)和無菌位點(diǎn)的樣本，使得它們既適用于診斷又適用于攜帶研究中。lytA-⑶C和psaA-⑶C分析、特別是lytA-⑶C分析，代表了在特異性方面超過目前可用的分析方法的改進(jìn)，因此應(yīng)該被當(dāng)作用于檢測肺炎球菌DNA的分析方法的選擇，特別是當(dāng)臨床樣本中可能存在上呼吸道P-LVS時。使用本公開的探針和引物診斷肺炎鏈球菌，將導(dǎo)致誤診的減少，改進(jìn)患者管理，并改進(jìn)肺炎鏈球菌發(fā)作的監(jiān)測。此外，正如實(shí)施例5證實(shí)的(參見圖5)，本公開的探針和引物可以理想地用于多重PCR分析，用于同時檢測多種不同病原體。本文公開的肺炎鏈球菌特異性探針和引物，例如lytA、psaA和ply特異性引物和探針，在使用用于檢測其它呼吸道病原體的引物和探針的呼吸道多重平臺中，提供了高的特異性。這種執(zhí)行的多重化和速度的潛力，使得這些分析方法成為分子檢測和流行病攜帶研究的有益工具。探針和引物公開了能夠雜交并檢測肺炎鏈球菌核酸分子、例如肺炎鏈球菌lytA核酸分子、肺炎鏈球菌psaA核酸分子或肺炎鏈球菌ply核酸分子的存在的探針。在某些實(shí)施方案中，這樣的探針對于肺炎鏈球菌是特異性的，因此它們不與來自其它生物體、例如其它細(xì)菌的序列特異性雜交。公開的探針長度在20到40個核苷酸之間，例如長度為20、21、22、23、24、25、26、27、2829、30、31、32、32、34、35、36、37、38、39或40個核苷酸，并且能夠與肺炎鏈球菌核酸分子雜交，例如顯示為SEQIDNO:13的肺炎鏈球菌lytA序列、顯示為SEQIDNO14的肺炎鏈球菌psaA序列，或顯示為SEQIDNO15的肺炎鏈球菌ply序列。在幾個實(shí)施方案中，探針能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDN013的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在其它實(shí)施方案中，探針能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDN0:14的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在其它實(shí)施方案中，探針能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDNO15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌核酸分子雜交的探針，含有與顯示為下列序列之一的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG(SEQIDNO5),TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG(SEQIDNO:6)，CTAGCACATGCTACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA(SEQIDNO:9)，或CTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAA(SEQIDN0:12)。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌lytA核酸分子雜交的探針，含有與顯示為SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌lytA核酸分子雜交的探針，基本上由顯示為SEQIDNO:5或SEQIDNO6的核酸序列組成。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌psaA核酸分子雜交的探針，含有與顯示為SEQIDNO:9的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌psaA核酸分子雜交的探針，基本上由顯示為SEQIDNO9的核酸序列組成。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌ply核酸分子雜交的探針，含有與顯示為SEQIDNO:12的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在幾個實(shí)施方案中，能夠與肺炎鏈球菌ply核酸分子雜交的探針，基本上由顯示為SEQIDNO:12的核酸序列組成。在某些實(shí)施方案中，探針或者用同位素、或者用非同位素標(biāo)記物可檢測地標(biāo)記，或者，將靶核酸(例如肺炎鏈球菌核酸分子，例如顯示為例如SEQIDN0:13的肺炎鏈球菌lytA核酸分子或其子序列，顯示為例如SEQIDNO14的肺炎鏈球菌psaA核酸分子或其子序列，或顯示為例如SEQIDNO:15的肺炎鏈球菌ply核酸分子或其子序列)標(biāo)記。非同位素標(biāo)記物可以包括熒光或發(fā)光分子、生物素、酶或酶的底物或化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選選擇這樣的標(biāo)記物，使得探針與靶核酸(例如肺炎鏈球菌核酸分子，例如肺炎鏈球菌lytA、肺炎鏈球菌psaA或肺炎鏈球菌ply核酸分子或其子序列)的雜交可以被檢測。在某些實(shí)施方案中，探針用熒光團(tuán)標(biāo)記。適合的熒光團(tuán)標(biāo)記物的例子在上面給出了。在某些實(shí)施例中，熒光團(tuán)是供體熒光團(tuán)。在其它實(shí)施例中，熒光團(tuán)是受體熒光團(tuán)，例如熒光淬滅劑。在某些實(shí)施例中，探針包括供體熒光團(tuán)和受體熒光團(tuán)二者，例如供體熒光團(tuán)例如FAM和受體熒光團(tuán)例如BLACKHOLE淬滅劑。可以使用常規(guī)的方法選擇適合的供體/受體熒光團(tuán)對。在一個實(shí)施例中，供體發(fā)射波長可以顯著激發(fā)受體，從而從受體產(chǎn)生可檢測的發(fā)射。在某些實(shí)施例中，探針在3’-末端被修飾，以防止探針被聚合酶延伸。在具體實(shí)施例中，受體熒光團(tuán)(例如熒光淬滅劑)被連接到探針的3’末端，供體熒光團(tuán)被連接到探針的5’末端。在其它實(shí)施例中，受體熒光團(tuán)(例如熒光淬滅劑)被連接20到探針的5’末端，供體熒光團(tuán)被連接到探針的3’末端。在另一個具體實(shí)施例中，受體熒光團(tuán)(例如熒光淬滅劑)被連接到修飾的核苷酸上(例如T)，供體熒光團(tuán)被連接到探針的5’末端。公開了能夠雜交并指導(dǎo)肺炎鏈球菌核酸分子的擴(kuò)增的引物。在某些實(shí)施方案中，這樣的引物對于肺炎鏈球菌是特異性的，因?yàn)樗鼈儾慌c來自其它生物體、例如其它細(xì)菌的核酸序列特異性雜交。本文公開的引物長度在15到40個核苷酸之間，例如長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或甚至40個核苷酸。在幾個實(shí)施方案中，引物能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與肺炎鏈球菌lyU核酸序列、例如顯示為SEQIDN0:13的肺炎鏈球菌lyU序列雜交，并指導(dǎo)肺炎鏈球菌lyU核酸分子的擴(kuò)增，例如SEQIDNO:13或其子序列的擴(kuò)增。在幾個實(shí)施方案中，引物能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與肺炎鏈球菌psaA核酸序列、例如顯示為SEQIDNO14的肺炎鏈球菌psaA序列雜交，并指導(dǎo)肺炎鏈球菌psaA核酸分子的擴(kuò)增，例如SEQIDNO:14或其子序列的擴(kuò)增。在幾個實(shí)施方案中，引物能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與肺炎鏈球菌ply核酸序列、例如顯示為SEQIDNO:15的肺炎鏈球菌ply序列雜交，并指導(dǎo)肺炎鏈球菌ply核酸分子的擴(kuò)增，例如SEQIDNO15或其子序列的擴(kuò)增。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，含有與顯示為下列序列的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA(SEQIDNO3),TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT(SEQIDNO4),GCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA(SEQIDNO:7)，GACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG(SEQIDNO:8)，GCTTATGGGCGCCAAGTCTA(SEQIDNO:10)或CAAAGCTTCAAAAGCAGCCTCTA(SEQIDNO:11)。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌核酸分子的引物，基本上由顯示為SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10或SEQIDNO11的核酸序列組成。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌lyU核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，含有與顯示為SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌lyU核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，基本上由顯示為SEQIDN0:3或SEQIDNO:4的核酸序列組成。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌psaA核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，含有與顯示為SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌psaA核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，基本上由顯示為SEQIDNO7或SEQIDNO8的核酸序列組成。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌Ply核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，含有與顯示為SEQIDN0:10或SEQIDNO:11的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在幾個實(shí)施方案中，能夠雜交肺炎鏈球菌ply核酸分子并指導(dǎo)其擴(kuò)增的引物，基本上由顯示為SEQIDN0:10或SEQIDN0:11的核酸序列組成。在某些實(shí)施方案中，引物是引物組，例如引物對，能夠雜交并擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸分子，例如肺炎鏈球菌lytA、肺炎鏈球菌psaA或肺炎鏈球菌ply核酸分子。這樣的引物組包含至少一個正向引物和至少一個反向引物，其中引物對于肺炎鏈球菌核酸分子，例如肺炎鏈球菌lytA、肺炎鏈球菌psaA或肺炎鏈球菌ply核酸分子的擴(kuò)增是特異性的。在某些實(shí)施方案中，引物組包含至少一對引物，它們對于肺炎鏈球菌lytA、肺炎鏈球菌psaA或肺炎鏈球菌Ply核酸分子的擴(kuò)增是特異性的，例如這樣的引物組可以包括一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌lytA的引物，一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌psaA的引物，或一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌ply的引物，或其任何組合，例如一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌lytA的引物和一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌psaA的引物，一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌lytA的引物和一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌ply的引物，一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌ply的引物和一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌psaA的引物，或甚至一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌lytA的引物、一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌psaA的引物和一對用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌Ply的引物。在某些實(shí)施例中，引物組包含一對特異性用于肺炎鏈球菌核酸分子擴(kuò)增的引物，該肺炎鏈球菌核酸分子包括肺炎鏈球菌lytA基因的核酸序列、例如顯示為SEQIDNO13的核酸序列的一部分。在某些實(shí)施例中，引物對特異性用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌lytA核酸分子，并包含與SEQIDNO:3至少95%同一，例如與SEQIDNO:3至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的正向引物，以及與SEQIDNO:4至少95%同一，例如與SEQIDNO:4至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的反向引物。在某些實(shí)施例中，引物組包含一對特異性用于肺炎鏈球菌核酸分子擴(kuò)增的引物，該肺炎鏈球菌核酸分子包括肺炎鏈球菌psaA基因的核酸序列、例如顯示為SEQIDNO14的核酸序列的一部分。在某些實(shí)施例中，引物對特異性用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌psaA核酸分子，并包含與SEQIDN0:7至少95%同一，例如與SEQIDNO:7至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的正向引物，以及與SEQIDNO:8至少95%同一，例如與SEQIDNO:8至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的反向引物。在某些實(shí)施例中，引物組包含一對特異性用于肺炎鏈球菌核酸分子擴(kuò)增的引物，該肺炎鏈球菌核酸分子包括肺炎鏈球菌ply基因的核酸序列、例如顯示為SEQIDN0:14的核酸序列的一部分。在某些實(shí)施例中，引物對特異性用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌Ply核酸分子，并包含與SEQIDN0:10至少95%同一，例如與SEQIDNO:10至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的正向引物，以及與SEQIDNO:11至少95%同一，例如與SEQIDNO11至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的反向引物。盡管在SEQIDN0S:3_12中提供了示例性探針和引物，但引物和/或探針序列可以通過將探針從它們在肺炎鏈球菌核酸分子上雜交的核苷酸位置向上游或下游移動幾個核苷酸，來輕微地改變，只要探針和/或引物仍然對肺炎鏈球菌核酸序列特異，例如對SEQIDNO13,SEQIDN0:14或SEQIDN0:15特異。例如，公開為SEQIDNOs:3_12的探針和引物的改變，可以通過將探針和/或引物從它們的位置向5’或3’方向“滑動”幾個核苷酸來進(jìn)行，這樣的變化將仍然對肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply特異。本申請還提供了包含有對SEQIDNOs:3-12任一個中顯示的核苷酸序列作出了改變的探針和引物，只要這樣的改變?nèi)匀辉试S檢測肺炎鏈球菌核酸分子。例如，探針或引物可以與由SEQIDNOs:3-12任一個中顯示的序列組成的核酸具有至少95%的序列同一性，例如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在這樣的實(shí)施例中，核苷酸的數(shù)量沒有變化，但是在SEQIDNOs:3-12任一個中顯示的核酸序列可能改變幾個核苷酸，例如改變1、2、3或4個核苷酸。本申請還提供了比SEQIDNOs:3-12任一個中顯示的核苷酸序列略長或略短的探針和引物，只要這樣的刪除或添加仍然允許檢測目標(biāo)肺炎鏈球菌核酸分子，例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply序列。例如，探針可以在SEQIDNOs:3_12任一個中顯示的探針或引物的5’-或3’-末端包含幾個核苷酸的缺失或添加，例如從5’-或3’-末端添加或缺失1、2、3或4個核苷酸，或其組合(例如從一個末端缺失，在另一個末端添加)。在這樣的實(shí)施例中，核苷酸數(shù)量改變了。肺炎鏈球菌的檢測本文公開的肺炎鏈球菌特異性引物和探針的主要應(yīng)用，是用于檢測樣品中的肺炎鏈球菌，例如從具有或懷疑具有肺炎鏈球菌感染的對象獲得的生物學(xué)樣品檢測肺炎鏈球菌。因此，公開的方法可以用于診斷對象是否具有肺炎鏈球菌。因此，公開了用于檢測肺炎鏈球菌核酸的方法，以便例如確定對象是否感染有肺炎鏈球菌。本文描述的方法可用于任何需要檢測肺炎鏈球菌的目的，包括診斷和預(yù)后應(yīng)用，例如在實(shí)驗(yàn)室和臨床環(huán)境中。適合的樣品包括任何常規(guī)的環(huán)境或生物學(xué)樣品，包括從人類或獸醫(yī)對象獲得的臨床樣品。適合的樣品包括所有可用于在對象中檢測細(xì)菌感染的生物樣品，包括但不限于細(xì)胞，組織(例如肺、肝和腎)，骨髓吸出物，體液(例如血液、血清、尿液、腦脊液、支氣管肺泡灌洗物、氣管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物、唾液)，眼部拭子，子宮頸拭子，陰道拭子，直腸拭子，糞便和糞便懸浮液。其它適合的樣品包括從中耳流出物、支氣管肺泡灌洗物、氣管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液獲得的樣品。用于獲得這樣的樣品的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是可獲得的。參見例如3油1呢吐等，丄即』6(1.176:1327-33(1992)；Bigby等，Am.Rev.Respir.Dis.133:515_18(1986)；Kovacs等，NEJM318589-93(1988)；以及Ognibene等，Am.Rev.Respir.Dis.129:929_32(1984)。檢測樣品中的肺炎鏈球菌核酸，包括將樣品與至少一個本文公開的、能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與肺炎鏈球菌核酸、例如肺炎鏈球菌lyU核酸、肺炎鏈球菌psaA核酸或肺炎鏈球菌Ply核酸雜交的肺炎鏈球菌特異性探針(例如能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDN0:13、SEQIDN0:14或SEQIDNO15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交的核酸探針，例如與顯示為SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDNO12之一的核苷酸序列至少95%同一的核酸序列，例如基本上由顯示為SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDN012之一的核酸序列組成的核酸序列)相接觸，并檢測肺炎鏈球菌核酸與探針之間的雜交。探針與肺炎鏈球菌核酸之間的雜交的檢測，指示了樣品中肺炎鏈球菌核酸的存在，例如肺炎鏈球菌lyU探針和肺炎鏈球菌lyU核酸之間的雜交的檢測，指示了樣品中肺炎鏈球菌核酸的存在，肺炎鏈球菌psaA探針和肺炎鏈球菌psaA核酸之間的雜交的檢測，指示了樣品中肺炎鏈球菌核酸的存在，肺炎鏈球菌ply探針和肺炎鏈球菌ply核酸之間的雜交的檢測，指示了樣品中肺炎鏈球菌核酸的存在。在某些實(shí)施方案中，樣品中存在的肺炎鏈球菌核酸，在使用雜交探針進(jìn)行檢測前，被擴(kuò)增。例如，擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸的一部分，然后檢測被擴(kuò)增的肺炎鏈球菌核酸的存在，可能是有利的。例如，為了增加可以被檢測的核酸的數(shù)量，從而增加獲得的信號。肺炎鏈球菌特異性核酸引物可以用于擴(kuò)增長度為至少大約50、至少大約60、至少大約70、至少大約80、至少大約90、至少大約100、至少大約200或以上堿基對的區(qū)域，產(chǎn)生擴(kuò)增的肺炎鏈球菌特異性核酸。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測典型情況下包括使用與被擴(kuò)增的肺炎鏈球菌核酸序列足夠互補(bǔ)并與其雜交的標(biāo)記的探針。因此，可以通過與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的標(biāo)記的探針、例如熒光標(biāo)記的探針的雜交，來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在、量和/或身份。在一個實(shí)施方案中，目標(biāo)靶核酸序列、例如肺炎鏈球菌lytA核酸、肺炎鏈球菌psaA核酸或肺炎鏈球菌ply核酸的檢測，包括組合地使用PCR擴(kuò)增和標(biāo)記探針，以便使用實(shí)時PCR測量產(chǎn)物。在另一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增的目標(biāo)靶核酸序列的檢測，包括將擴(kuò)增的靶核酸轉(zhuǎn)移到固相支持物、例如印跡、例如Northern印跡上，并用與擴(kuò)增的靶核酸序列互補(bǔ)的探針、例如標(biāo)記的探針探測印跡。在另一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增的目標(biāo)靶核酸序列的檢測，包括將標(biāo)記的擴(kuò)增靶核酸，排列在具有可尋址位置的預(yù)定的陣列中、并且與擴(kuò)增的靶核酸互補(bǔ)的本文公開的探針進(jìn)行雜交。可以使用任何核酸擴(kuò)增方法來檢測樣品中肺炎鏈球菌的存在。在一個具體的非限制性的實(shí)施例中，使用了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸序列。在其它具體的、非限制性實(shí)施方案中，使用了實(shí)時PCR、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實(shí)時反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(rtRT-PCR)、連接酶鏈反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)來擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸。在具體的實(shí)施例中，肺炎鏈球菌lytA核酸通過實(shí)時PCR、例如實(shí)時TAQMANPCR擴(kuò)增。用于核酸擴(kuò)增的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的。典型情況下，在擴(kuò)增反應(yīng)中使用至少兩個引物，肺炎鏈球菌核酸的擴(kuò)增，包括將肺炎鏈球菌核酸，與能夠雜交并指導(dǎo)肺炎鏈球菌的擴(kuò)增的一個或多個引物(例如能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQN0:13、SEQIDN0:14或SEQIDNO15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交的引物，例如與顯示為SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11之一的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物)相接觸。在某些實(shí)施方案中，將樣品與包含正向和反向引物的一對引物相接觸，兩個引物都與肺炎鏈球菌lytA核酸雜交，例如與顯示為SEQIDN03的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物，和與顯示為SEQIDNO:4的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物。在某些實(shí)施方案中，將樣品與包含正向和反向引物的一對引物相接觸，兩個引物都與肺炎鏈球菌psaA核酸雜交，例如與顯示為SEQIDN07的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物，和與顯示為SEQIDNO:8的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物。在某些實(shí)施方案中，將樣品與包含正向和反向引物的一對引物相接觸，兩個引物都與肺炎鏈球菌ply核酸雜交，例如與顯示為SEQIDN0:10的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物，和與顯示為SEQIDNO:11的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物。擴(kuò)增的肺炎鏈球菌核酸，可以被實(shí)時檢測，例如通過實(shí)時PCR，以便確定樣品中肺炎鏈球菌特異性核酸、例如肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply核酸的存在和/或量。通過這種方式，可以使用特異性針對從目標(biāo)肺炎鏈球菌序列擴(kuò)增的產(chǎn)物、例如擴(kuò)增的肺炎鏈球菌lytA、24psaA或ply核酸序列的探針，來檢測擴(kuò)增的核酸序列，例如擴(kuò)增的肺炎鏈球菌lytA、pSaA或ply核酸序列。實(shí)時PCR監(jiān)測反應(yīng)過程中發(fā)射的熒光，作為每個PCR循環(huán)過程中擴(kuò)增子的產(chǎn)生的指示，而不是終點(diǎn)檢測。在某些系統(tǒng)中，反應(yīng)的實(shí)時進(jìn)程可以被可視化。典型情況下，實(shí)時PCR使用熒光報告分子的檢測。典型情況下，熒光報告分子的信號與反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的量成正比增加。通過記錄每個循環(huán)的熒光發(fā)射量，有可能監(jiān)測在指數(shù)期過程中的PCR反應(yīng)，此時PCR產(chǎn)物量的顯著增加第一次與靶模板的起始量相關(guān)。核酸靶的起始拷貝數(shù)越高，觀察到熒光的顯著增加越早。在一個實(shí)施方案中，熒光標(biāo)記的探針利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、或者樣品的熒光發(fā)射波長的變化，作為實(shí)時檢測DNA探針與擴(kuò)增的靶核酸的雜交的方法。例如，在不同探針上的產(chǎn)熒光標(biāo)記物(例如使用HybProbes)之間、或相同探針上熒光團(tuán)和非熒光淬滅劑(例如使用分子信標(biāo)或TAQMAN探針)之間發(fā)生的FRET，可以鑒定與目標(biāo)DNA序列特異性雜交的探針，通過這種方式，使用肺炎鏈球菌lytA探針、肺炎鏈球菌psaA探針、肺炎鏈球菌Ply探針，可以檢測樣品中肺炎鏈球菌的存在和/或量。在某些實(shí)施方案中，用于鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光標(biāo)記DNA探針具有光譜獨(dú)特的發(fā)射波長，使得可以在同樣的反應(yīng)管中、例如在多重PCR、例如多重實(shí)時PCR中，將它們區(qū)分開。在某些實(shí)施方案中，本文公開的探針和引物被用于多重實(shí)時PCR。例如，多重PCR允許使用公開的探針同時檢測lytA、pSaA和ply核酸，或甚至其它核酸、例如對照核酸、例如RNAseP核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。使用公開的引物和探針，可以檢測lytA、psaA和ply的任何組合。在另一個實(shí)施方案中，在擴(kuò)增步驟后，可以進(jìn)行擴(kuò)增的靶核酸的熔解(解鏈)曲線分析。核酸序列的Tm依賴于序列的長度及其G/C含量。因此，鑒定核酸序列的1可用于鑒定擴(kuò)增的核酸，例如通過使用雙鏈DNA結(jié)合染料化學(xué)方法，這種方法通過使用非序列特異性熒光嵌入劑(例如SYBR綠或溴化乙錠)來定量擴(kuò)增子的產(chǎn)生。SYBR綠是一種產(chǎn)熒光的小溝結(jié)合染料，在溶液中幾乎不顯示熒光，但是在與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)射強(qiáng)烈的熒光信號。典型情況下，SYBR綠用于單式反應(yīng)，但是在與熔點(diǎn)分析結(jié)合時，可用于多重反應(yīng)?？梢允褂萌魏晤愋偷臒嵫h(huán)儀裝置，進(jìn)行肺炎鏈球菌核酸、例如lytA、psaA或ply核酸的擴(kuò)增和/或雜交的測定。適合的裝置的例子包括PTC-100Peltier熱循環(huán)儀(MJResearch,Inc.；SanFrancisco,CA)，ROBOCYCLER40溫度循環(huán)儀(Stratagene；LaJolla,CA),^GENEAMPPCR%^t9700(AppliedBiosystems；FosterCity,CA)。對于實(shí)時PCR來說，可以使用任何類型的實(shí)時熱循環(huán)儀裝置。例如，BioRadiCycleriQTM,LIGHTCYCLER(Roche；Mannheim,Germany),7700序列檢測器(PerkinElmer/AppliedBiosystems；FosterCity,CA)，ABI系統(tǒng)例如7000,7500,7700或7900系統(tǒng)(AppliedBiosystems；FosterCity,CA)，或MX4000、MX3000或MX3005(Stratagene；LaJolla,CA),DNAEngineOpticon連續(xù)熒光檢測系統(tǒng)(MJResearch)，以及C印heidSMARTCYCLER，可以用于實(shí)時擴(kuò)增核酸序列。在某些實(shí)施方案中，檢測樣品中肺炎鏈球菌核酸序列的存在，包括提取肺炎鏈球菌DNA。DNA提取涉及將DNA從細(xì)胞或樣品中的潛伏或不可接近的形式中釋放出來，并使DNA變得可以自由使用。在這樣的狀態(tài)下，它適合于肺炎鏈球菌核酸的有效檢測和/或擴(kuò)增。釋放DNA可以包括實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎的步驟。此外，DNA的提取可以包括獲得溶解在水性介質(zhì)中，25與其它細(xì)胞成分至少部分分離的DNA的步驟，其中這些其它細(xì)胞成分可以是顆粒狀的或溶解的。在某些實(shí)施方案中，檢測樣品中肺炎鏈球菌lytA核酸序列的存在，包括提取肺炎鏈球菌RNA。RNA提取涉及將RNA從細(xì)胞或樣品中的潛伏或不可接近的形式中釋放出來，并使RNA變得可以自由使用。在這樣的狀態(tài)下，它適合于肺炎鏈球菌核酸的有效檢測和/或擴(kuò)增。釋放RNA可以包括實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎的步驟。RNA的提取一般在有效排除或抑制可能存在的任何核酸酶活性的條件下進(jìn)行。此外，RNA的提取可以包括獲得溶解在水性介質(zhì)中，與其它細(xì)胞成分至少部分分離的RNA的步驟，其中這些其它細(xì)胞成分可以是顆粒狀的或溶解的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會了解適合于從樣品中提取核酸例如RNA和/或DNA的方法；這樣的方法將依賴于例如在其中發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌核酸的樣品的類型。例如，核酸可以使用異硫氰酸胍提取，例如Chomczynski等的通過酸性異硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提的一步分離方法(Anal.Biochem.162156-59，1987)。樣品可以直接使用，或者可以被處理，例如通過加入溶劑、防腐劑、緩沖液或其它化合物或物質(zhì)。核酸可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法來提取。例如，核酸的快速制備可以使用可商購試劑盒來進(jìn)行(例如QIAGENDNA小型試劑盒(QIAGEN)，RocheMagNA純化緊湊型核酸分離試劑盒I或RNEASY小型試劑盒(QIAGEN)；NUCLISENSNASBA診斷試劑(bioM6rieux)；或MASTERPURE全DNA和RNA純化試劑盒(EPICENTRE))。在某些實(shí)施方案中，探針用同位素或非同位素標(biāo)記物可檢測地標(biāo)記；在可選實(shí)施方案中，將肺炎鏈球菌核酸標(biāo)記。非同位素標(biāo)記物可以例如包括熒光或發(fā)光分子，或者酶、輔因子、酶的底物或半抗原。將探針與RNA、DNA的單鏈或雙鏈制備物、或二者的混合物溫育，然后測定雜交。在某些實(shí)施例中，雜交導(dǎo)致了信號的可檢測的變化，例如來自標(biāo)記探針的信號的增加或降低。因此，檢測雜交，包括在雜交期間或之后，檢測來自標(biāo)記探針的信號相對于雜交之前來自標(biāo)記物的信號的變化。肺炎鏈球菌鑒定陣列公開了含有用于檢測肺炎鏈球菌的多種異源探針的陣列。這樣的陣列可用于快速檢測樣品中的肺炎鏈球菌。陣列是基質(zhì)上可尋址的位置的排列，每個地址含有核酸，例如探針，例如本文公開的肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply探針。在某些實(shí)施方案中，每個地址對應(yīng)于單一類型或類別的核酸，例如單個探針，盡管具體的核酸可以多次包含在多個地址上?！拔㈥嚵小笔怯糜跈z測雜交的小型化的、需要顯微鏡觀察的陣列。較大的“微陣列”允許每個地址可以被人類裸眼識別，在某些實(shí)施方案中，雜交信號不需要另外放大就可檢測。地址可以是標(biāo)記的、適合于獨(dú)立的引導(dǎo)物，或可以通過位置識別。在某些實(shí)施方案中，肺炎鏈球菌檢測陣列是陣列地址上的獨(dú)立探針的集合。然后將肺炎鏈球菌檢測陣列與懷疑含有肺炎鏈球菌核酸的樣品，在允許探針與樣品中的核酸之間發(fā)生雜交的條件下相接觸。可以使用任何潛在地含有、或甚至懷疑含有肺炎鏈球菌核酸的樣品，包括核酸提取物，例如擴(kuò)增的或未擴(kuò)增的DNA或RNA制備物。來自陣列上單個地址的雜交信號，指示了探針與樣品中的核苷酸的雜交。該系統(tǒng)允許同時通過多個探針分析樣品，并產(chǎn)生識別了樣品中包含的肺炎鏈球菌核酸的信息。在可選實(shí)施方案中，陣列含有肺炎26鏈球菌核酸，陣列與含有探針的樣品接觸。在任何這樣的實(shí)施方案中，探針或肺炎鏈球菌核酸任何一個都可以被標(biāo)記，以便于雜交的檢測。核酸可以干燥或液體形式加到陣列基質(zhì)上。其它化合物或物質(zhì)也可以添加到陣列上，例如緩沖液、穩(wěn)定劑、用于檢測雜交信號的試劑、乳化劑或防腐劑。在某些實(shí)施例中，陣列包括在陣列上存在多次(兩次或以上)的一種或多種分子或樣品，用于為陣列提供附加的特征，例如多余的活性或提供內(nèi)部對照。在陣列中，每個排列的核酸是可尋址的，使得其位置可以在陣列表面的至少兩個維度中被可靠地、一致地確定。因此，定制的陣列允許在將每個核酸放置在陣列中時指派它的位置。通常情況下，提供了陣列圖或索引，以將每個地址與適當(dāng)?shù)暮怂嵯嚓P(guān)聯(lián)。定制的陣列通過以對稱的格網(wǎng)樣式排列，但是核酸可以其它的樣式排列(例如以徑向分布的線，“輪輻和輪”樣式或定制的簇的樣式)?？蓪ぶ返年嚵锌梢允怯?jì)算機(jī)可讀的；計(jì)算機(jī)可以被編程，以便將陣列上的具體地址與關(guān)于該位置上的樣品的信息相關(guān)聯(lián)，例如雜交或結(jié)合數(shù)據(jù)，包括信號強(qiáng)度。在某些示例性計(jì)算機(jī)可讀格式中，陣列中的個體樣品或分子有規(guī)律地排列(例如以笛卡爾格網(wǎng)樣式)，可以由計(jì)算機(jī)與地址信息相關(guān)聯(lián)。陣列中的地址可以具有任何適合的形狀和尺寸。在某些實(shí)施方案中，核酸懸浮在液體介質(zhì)中，包含在陣列基質(zhì)上的正方形或長方形孔中。但是，核酸也可以包含在基本上三角形、橢圓形、圓形或不規(guī)則的區(qū)域中。陣列本身的總體形狀也可以變化，盡管在某些實(shí)施方案中，它基本上是平的，形狀為長方形或正方形。肺炎鏈球菌檢測陣列在結(jié)構(gòu)、組成和目的功能性方面可以不同，可以基于宏陣列(macroarray)或微陣列格式，或其組合。這樣的陣列可以包括例如至少10個、至少25個、至少50個、至少100個或以上的地址，通常在每個地址上具有單一類型的核酸。在宏陣列的情況下，通常不需要尖端復(fù)雜的設(shè)備來檢測陣列上的雜交信號，盡管可以通過標(biāo)準(zhǔn)的掃描和/或定量技術(shù)和設(shè)備來幫助定量。因此，本文描述的宏陣列分析可以在大多數(shù)醫(yī)院、農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室、大學(xué)或其它機(jī)構(gòu)中進(jìn)行，而不需要投資專門的、昂貴的讀取設(shè)備。用于本文公開的陣列的基質(zhì)的例子包括玻璃(例如功能化的玻璃)、Si、Ge、GaAs、GaP、Si02、SiN4、改性的硅硝酸纖維素、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、尼龍、纖維或其組合。陣列基質(zhì)可以是剛性和相對不易彎曲的(例如玻璃或支持膜)，或者是撓性的(例如聚合物膜)。一種適合于本文描述的探針陣列的可商購的產(chǎn)品系列是可以從DynexTechnologiesUK(Middlesex，英國)獲得的MICROTITER板的Microlite系列，例如Microlite1+96孔板，或384Microlite+384孔板。陣列上的地址應(yīng)該是分離的，因?yàn)閬碜悦總€地址的雜交信號，可以通過裸眼(宏陣列)或通過一件設(shè)備的掃描或讀取或在顯微鏡的幫助下(微陣列)，與來自鄰近地址的信號區(qū)分開。陣列中的地址可以具有相對大的尺寸，例如大的足以允許不需要顯微鏡或其它設(shè)備的幫助就可以檢測雜交信號。因此，地址可以小至大約0.1mm的跨度，并隔開大約相同的距離?；蛘?，地址可以為大約0.5、1、2、3、5、7或10!11111的跨度，并隔開相似的或不同的距離。在某些實(shí)施方案中使用較大的地址(大于10mm的跨度)。陣列的總尺寸一般與地址的尺寸相關(guān)聯(lián)(例如，較大的地址通?？梢栽谳^大的陣列上發(fā)現(xiàn)，而較小的地址可以在較小的陣列上發(fā)現(xiàn))。但是，這樣的關(guān)聯(lián)性不是必需的。本文的陣列可以用它們的密度(在一定特定表面面積中的地址的數(shù)量)來描述。對于宏陣列來說，陣列密度可以是大約每平方分米一個地址(或在陣列基質(zhì)的10em乘10cm區(qū)域中一個地址)到大約每平方厘米50個地址(在基質(zhì)的1cm乘lem區(qū)域中50個靶)。對于微陣列來說，陣列密度通常為每平方厘米一個或多個地址，例如每平方厘米大約50個、大約100個、大約200個、大約300個、大約400個、大約500個、大約1000個、大約1500個、大約2，500或以上地址。術(shù)語“陣列”的使用包括在DNA微芯片技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的陣列。作為一個非限制性的例子，探針可以包含在與可以從Affymetrix，Inc.(SantaClara，CA)商購的GENECHIP產(chǎn)品或相關(guān)產(chǎn)品類似的DNA微芯片中。簡單來說，DNA微芯片是在玻璃晶圓基質(zhì)上的微型化的、高密度的探針陣列。選擇特定的探針，并設(shè)計(jì)了光蝕刻掩模，使用在基于固相化學(xué)合成和與半導(dǎo)體工業(yè)中使用的類似的光蝕刻制造技術(shù)的工藝過程中。掩模用于隔離芯片的暴露位點(diǎn)，將探針化學(xué)合成在這些位點(diǎn)上，每個探針在陣列中指定的位置上。在制造后，可以將陣列用于雜交。樣品中的探針或核酸可以用例如熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，在雜交后，可以檢測和分析雜交信號。試劑盒本文公開的核酸引物和探針可以用于檢測肺炎鏈球菌的試劑盒的形式提供，包括用于任何上面描述的陣列的試劑盒。在這樣的試劑盒中，適合量的一種或多種核酸探針和/或引物(例如本文公開的肺炎鏈球菌lytA、psaA或ply探針和引物)，被提供在一個或多個容器中，或固定在基質(zhì)上。核酸探針和/或引物可以被提供成懸浮在水溶液中，或例如作為冷凍干燥的或凍干的粉末。其中提供有核酸的容器可以是任何能夠容納所提供的形式的常規(guī)容器，例如微量離心管、安瓿瓶或瓶。試劑盒可以包含標(biāo)記的或未標(biāo)記的、用于檢測肺炎鏈球菌核苷酸序列的探針。在某些應(yīng)用中，一個或多個引物(如上所述)，例如引物對，可以預(yù)先測量好的單次使用量提供在獨(dú)立的、典型情況下用后即可拋棄的管或相當(dāng)?shù)娜萜髦?。使用這樣的設(shè)置，用于測試肺炎鏈球菌核酸的存在的樣品，可以加入到獨(dú)立的管中，直接進(jìn)行擴(kuò)增。試劑盒中提供的核酸引物的量，可以是任何適合的量，可以依賴于產(chǎn)品所針對的靶市場。例如，如果試劑盒適用于研究或臨床應(yīng)用，提供的每種核酸引物的量，可以是足夠引發(fā)幾個PCR擴(kuò)增反應(yīng)的量。確定適合的量的一般性指導(dǎo)，可以在Irmis等、Sambrook等和Ausubel等的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)。試劑盒可以包含兩個以上的引物，以便于較大量肺炎鏈球菌核苷酸序列的PCR擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，試劑盒可以含有執(zhí)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)所必需的反應(yīng)試劑，包括DNA樣品制備試劑、適合的緩沖液(例如聚合酶緩沖液)、鹽(例如氯化鎂)和脫氧核糖核苷酸(dNTPs)。在試劑盒中也可以提供一個或多個用于PCR反應(yīng)的對照序列(例如用于檢測人類RNAseP)。具體實(shí)施方案包括用于基于上面描述的陣列檢測肺炎鏈球菌核酸的試劑盒。這樣的試劑盒包含了至少一種特異性針對肺炎鏈球菌核酸(如上所述)的探針，以及說明書。試劑盒可以含有一種以上不同的探針，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50,100種或以上的探針。說明書可以包括關(guān)于獲得樣品、處理樣品、制備探針和/或?qū)⒚糠N探針與樣品的等份試樣接觸的指導(dǎo)。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括了用于分離不同的探針的裝置，例如獨(dú)立的容器(例如微量管)或陣列基質(zhì)(例如96孔或384孔微量滴定板)。在具體實(shí)施方案中，試劑盒包括預(yù)先包裝的探針，例如在獨(dú)立的容器(例如獨(dú)立密封的EPPENDORF管)中、或陣列基質(zhì)的孔中(例如用保護(hù)性塑料薄膜密封的96孔微量滴定板)懸浮在適合介質(zhì)中的探針。在其它具體實(shí)施方案中，試劑盒含有用于從樣品中提取和/或純化核苷酸的設(shè)備、試劑和說明書。合成寡核苷酸弓|物和探針用于合成寡核苷酸的體外方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的；這樣的方法可用于生產(chǎn)本公開的方法的引物和探針。體外寡核苷酸合成的最常用的方法是亞磷酰胺方法，由Letsinger提出并由Caruthers進(jìn)一步發(fā)展(Caruthers等，脫氧寡核苷酸的化學(xué)合成，(Chemicalsynthesisofdeoxyoligonucleotides),inMethodsEnzymol.154287-313,1987)。這是一種以分步的方式進(jìn)行的非水性的固相反應(yīng)，其中單個核苷酸(或修飾的核苷酸)被添加到不斷增長的寡核苷酸上。每個核苷酸以反應(yīng)性的3’-亞磷酰胺衍生物的形式進(jìn)行添加。也參見Gait主編的《寡核苷酸合成實(shí)用方法》(OligonucleotideSynthesis.Apracticalapproach,IRLPress,1984)。一般來說，合成反應(yīng)如下進(jìn)行通過酸處理，移除位于不斷增長的寡核苷酸鏈的5’-末端的二甲氧基三苯甲基或等價的保護(hù)基團(tuán)。(不斷增長的鏈通過其3’末端錨定在固相支持物例如硅珠上)。將新釋放的寡核苷酸鏈的5’末端與將要添加到鏈上的下一個脫氧核苷酸的3’-亞磷酰胺衍生物，使用連接試劑四唑進(jìn)行連接。連接反應(yīng)通常以大約99%的效率進(jìn)行；將任何未反應(yīng)的5’末端通過乙酰化加帽，以阻斷其在隨后的連接中的延伸。最后，將通過結(jié)合步驟產(chǎn)生的亞磷酸三酯氧化成磷酸三酯，產(chǎn)生了已經(jīng)被延長一個核苷酸殘基的鏈。將該過程重復(fù)，每個循環(huán)添加一個殘基。參見例如美國專利Nos.4，415，732,4,458，066,4,500，707,4,973，679和5，132，418。使用這種或類似方法的寡核苷酸合成儀是可商購的(例如來自GeneMachines,SanCarlos,CA的PolyPlex寡核苷酸合成儀)。此外，許多公司也進(jìn)行這樣的合成(例如Sigma-Genosys，TheWoodlands,TX；QiagenOperon,Alameda,CA；IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA;以及TriLinkBioTechnologies,SanDiego,CA)。提供了下面的實(shí)施例來說明某些實(shí)施方案的具體特點(diǎn)。但是，下面描述的具體特征不應(yīng)該被解釋為對本發(fā)明的范圍的限制，而是作為實(shí)施例，其等價物可以被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所認(rèn)識到。實(shí)施例實(shí)施例1材料和方法本實(shí)施例描述了用于確定本公開的探針和引物的特異性和靈敏性的材料和方法。細(xì)菌分離株本公開的探針和引物被用于測試對肺炎鏈球菌的特異性，使用的一組肺炎鏈球菌包含了67株肺炎鏈球菌菌株，代表了44種不同的肺炎鏈球菌血清型(1、2、4、5、6A、6B、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、13、14、15B、15A、15C、16F、17A、17F、18B、18C、18F、19A、19C、19F、20、21、22A、22F、23B、23F、24A、24B、28A、28F、32F、33A、33F、35A、35F、40，以及3株來自結(jié)膜炎發(fā)作的無莢膜型)，以及104株非肺炎球菌分離株，包括假肺炎鏈球菌(S.pseudopneumoniae)、緩癥鏈球菌(S.mitis)、口腔鏈球菌(S.oralis)、血鏈球菌(S.sanguinis)、副血鏈球菌(S.parasanguinis)、S.peroris、嬰兒鏈球菌(S.infantis)、革登氏鏈球菌(S.gordonii)、嵴鏈球菌(S.cristatus)、唾液鏈球菌(S.salivarius)、前庭鏈球菌(S.vestibularis)、澳洲鏈球菌(S.australis)、中國鏈球菌(S.sinensis)、寡發(fā)酵鏈球菌(S.oligofermentans)、腸鏈球菌(S.intestinalis)、化膿性鏈球菌(S.pyogenes)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、犬鏈球菌(S.canis)、咽峽炎鏈球菌(S.anginosus)、馬鏈球菌馬亞種(S.equisubsp.Equi)、馬鏈球菌獸疫亞種(S.equisubsp.Zooepidemicus)、豬鏈球菌(S.porcinus)、停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)、群集鏈球菌(S.constellatus)、海豚鏈球菌(S.iniae)、中間鏈球菌(S.intermedius)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、13株尚未鑒定到種的水平的草綠色鏈球菌、Dolostigranulumpigrum、!^腸球菌(Enterococcusfaecalis)、大腸埃希氏桿菌(Escherichiacoli)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)、月市炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)、嗜月市軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)a_f■禾口NT型、副、流感嗜血桿菌(H.parainfluenzae)>白喉?xiàng)U菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、假結(jié)核棒狀桿菌(C.pseudotuberculosis)、鼻疽諾卡氏菌(Nocardiafarcinica)、星形諾卡氏菌(N.asteroides)、肺炎克氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)、偶然分枝桿菌(Mycobateriumfortuitum)、結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、百臼咳桿菌(Bordetellapertussis)和支氣管炎博德特菌(B.bronchis印tica)。肺炎鏈球菌ATCC33400株，在下面描述的所有分析中用作陽性對照。所有的細(xì)菌分離株從CDC實(shí)驗(yàn)室(鏈球菌實(shí)驗(yàn)室，呼吸道疾病分部和分子測序?qū)嶒?yàn)室，腦膜炎禾口疫苗可予頁防疾病分部)(StreptococcusLaboratory,RespiratoryDiseasesBranchandMolecularSequencingLaboratory,MeningitisandVaccinePreventableDiseasesBranch)的培養(yǎng)物保藏中心獲得。奧普托欣(Optochin)易感性測試(OPT)OPT易感性測試在5%綿羊血瓊脂平板上，在5%C02環(huán)境下，按照Arbique等中的描述進(jìn)行(Arbique等，J.Clin.Microbiol.42:4686_4696，2004，在此以其公開本測試的程度引為參考)。膽汁溶解性(BS)測試試管BS測試按照以前的描述進(jìn)行(Arbique等，J.Clin.Microbiol.424686-4696,2004,以及Ruoff等，“鏈球菌”(Str印tococcusp.405-421)，在P.R.Murray等主編的《臨床微生物學(xué)手冊》(第8版)中(Manualofclinicalmicrobiology8thed.AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C,2003)，二者都在此以其公開本測試的程度引為參考)。DNA探針雜交試驗(yàn)基于rRNA基因序列的ACCUPROBE肺炎鏈球菌培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)，按照制造商的說明書進(jìn)行(Gen-Probe，SanDiego,CA)。DNA-DNA重新結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞的生長、收獲和裂解按照以前的描述進(jìn)行(Arbique等，J.Clin.Microbiol.424686-4696,2004,以及Brenner等，J.Clin.Microbiol.15:1133_1140，1982)。DNA的提取和純化，以及DNA-DNA重新結(jié)合研究，包括通過羥基磷灰石雜交方法確定DNA的相關(guān)性，按照Brenner及同事的描述進(jìn)行(Brenner等，J.Clin.Microbiol.151133-1140，1982)。DNA雜交實(shí)驗(yàn)，在DNA重新結(jié)合的最適溫度55°C和嚴(yán)緊的DNA重新結(jié)合溫度70°C下進(jìn)行。相關(guān)序列內(nèi)的趨異水平，通過假定每種程度的異源雙鏈體不穩(wěn)定性是由1%未配對堿基引起的，來確定。趨異性，被表示為解鏈溫度的變化，是異源DNA雙鏈體相對于同源雙鏈體的熱穩(wěn)定性的降低(單位為攝氏度)。趨異性被計(jì)算到最接近的0.5%。臨床樣本臨床樣本包括血清、中耳流出物(MEFs)、以及腦脊液(CSFs)，按照⑶C倫理審查委員會(IRB)的規(guī)定獲取。血清和MEFs從以色列Beer-Sheva的Soroka大學(xué)醫(yī)學(xué)院獲得。血清樣本從15個患有肺炎球菌菌血癥的患者，以及15個年齡匹配、種族類型匹配、其鼻咽(NP)培養(yǎng)物對肺炎鏈球菌陰性的健康對照兒童獲得。MEF樣本由10個肺炎鏈球菌培養(yǎng)陽性中耳流出物，以及10個肺炎鏈球菌培養(yǎng)陰性、但是流感嗜血桿菌(H.influenzae)陽性的MEFs構(gòu)成。從巴西PortoAlegre的LaboratorioCentraldoEstadodoRioGrandedoSul獲得了25個CSFs，由15份來自腦膜炎患者的、對肺炎球菌培養(yǎng)陽性的樣本，以及10個來自肺炎球菌陰性、腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)陽性患者的CSFs。樣本在干冰上運(yùn)輸，抵達(dá)后冷凍在_70°C。用于實(shí)時PCR分析的DNA提取通過修改的QIAGENDNA小提試劑盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)方法，從分離株提取了DNA。簡單來說，將一滿環(huán)從血瓊脂平板生長過夜的培養(yǎng)物，重新懸浮在裂解緩沖液中(20mMTris-HCLpH8.0,2.OmMEDTA,1.2%TritonX100，含有0.04g/ml溶菌酶和75U/ml變?nèi)芫?SigmaChemicalCo,StLouis，M0)，在37°C水浴中溫育1小時。剩下的步驟按照制造商的推薦方法進(jìn)行。對于臨床樣本來說，將200ill臨床材料添加到100ill含有0.04g/ml溶菌酶和75U/ml變?nèi)芫?SigmaChemicalCo.)的TE緩沖液中，在37°C水浴中溫育1小時。所有隨后的步驟按照QIAGENDNA小量提取方法手冊的描述進(jìn)行。將DNA洗脫在100u1QIAGENEA洗脫緩沖液中，儲存在_20°C。從細(xì)菌培養(yǎng)物提取的DNA的濃度，通過NANODROP(NANODROPTechnologies，Wilmington，DE)進(jìn)行測定。用于lytA、ply和psaA的實(shí)時PCRs按照描述進(jìn)行了兩種以前發(fā)表過的實(shí)時PCR分析方法(Corless等，J.Clin.Microbiol.39:1553_1558，2001；McAvin等，J.Clin.Microbiol.39:3446_3451，2001)。為了開發(fā)本文公開的分析方法，根據(jù)以前發(fā)表的lytA、ply和psaA基因序列以及在GENBANK中可獲得的序列，使用PRIMEREXPRESS軟件(AppliedBiosystems，AB，F(xiàn)osterCity,CA)設(shè)計(jì)了寡核苷酸引物和熒光染料標(biāo)記的探針。探針在5’端用6-羧基熒光素(FAM)進(jìn)行，或者在psaA探針的情況下用六氯-6-羧基熒光素(HEX)進(jìn)行標(biāo)記。黑洞淬滅劑(BHQl，BiosearchTechnologies,Novate,CA)被放置在探針的3，末端，或內(nèi)部的胸腺嘧啶上(表1)。如果內(nèi)部淬滅，將3’末端用磷酸基團(tuán)加帽，以防止探針的延31伸。引物和探針的序列列于表1中。表1、實(shí)時PCR引物和探針a,psaA探針被設(shè)計(jì)為與擴(kuò)增子的反向鏈結(jié)合b，1表示其上連接有內(nèi)部BHQ淬滅劑的胸腺嘧啶c，對于多重檢測來說，5’末端標(biāo)記物被改變?yōu)镃ALFlour610分析測試在25u1終反應(yīng)體積中，使用TAQMANUniversalMasterMix試劑盒(AB)，按照說明書進(jìn)行，使用了2.5iU樣品DNA。對三種分析測試中每種的引物和探針濃度進(jìn)行了最適化；根據(jù)實(shí)驗(yàn)性最適化濃度，分別使用了500、200、200nM的psaA-⑶C、lytA-CDC、ply-CDC引物和100、200、200nM的psaA-CDC、lytA-CDC、ply-CDC探針，進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)。在每次運(yùn)行中包含了無模板的對照和肺炎鏈球菌陽性DNA對照(肺炎鏈球菌ATCC33400)。DNA使用Mx3000P(Stratagene，LaJolla，CA)或7500實(shí)時PCR系統(tǒng)(AB)來擴(kuò)增，使用了下面的循環(huán)參數(shù)95°C10分鐘，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95°C15s和60°C1分鐘。擴(kuò)增數(shù)據(jù)通過儀器軟件(STRATAGENE或AppliedBiosystems)來分析。陰性樣品被定義為循環(huán)閾值大于40。新的分析測試被命名為lytA-CDC、ply-CDC和psaA-CDC。實(shí)時PCR分析靈敏度和特異性測定對于檢測下限(LLD)的評估來說，制備了來自肺炎球菌參比菌株ATCC33400的純化的DNA的連續(xù)的10倍稀釋液(相當(dāng)于6666到6.6個拷貝)，并使用所有5種實(shí)時PCR方案對等份試樣進(jìn)行了測試。通過在所有5種分析測試中測試從67株肺炎鏈球菌分離株和104株非肺炎球菌分離株(上面列出的)提取的5ng/ul的濃度的DNA，進(jìn)行了特異性測定。臨床樣品的實(shí)時PCR在血清、MEFs和CSFs中肺炎鏈球菌DNA的檢測，對于所有分析測試來說在同樣樣本的等份試樣上平行進(jìn)行。將從血清、MEFs或CSF提取的DNA(2.5u1未稀釋的或2.5yl13稀釋的)，使用在擴(kuò)增反應(yīng)中。每種臨床樣品的所有分析測試進(jìn)行三份平行樣。如果三份平行樣中的兩份在小于40個循環(huán)的截止期內(nèi)給出陽性結(jié)果，樣本被認(rèn)為是陽性的。分析測試方案如上所述。對于每種樣品，獨(dú)立地進(jìn)行了RNaseP人類基因?qū)φ辗磻?yīng)，以檢查抑制劑的存在。在該反應(yīng)中不能得到擴(kuò)增，被認(rèn)為表明了抑制劑。用于psaA-CDC、lytA-CDC和ply-CDC的多重實(shí)時PCRs將三組引物和探針合并成單一反應(yīng)混合物，用于多重檢測。對單一基因檢測分析方法的修改包括使用QIAGEN的QUANTITECT多重PCRNoROXMaster混合物，將ply-CDC基因探針的熒光標(biāo)記物從FAM改變成5，CALFLOURRED610、3，BHQ2(BiosearchTechnologies)，將lytAFAM探針的濃度從原始的200nM降低到100nM。溫度和循環(huán)數(shù)保持與原始的單一PCR方案中描述的相同。實(shí)施例2用于肺炎鏈球菌檢測的分析方法的檢測下限本實(shí)施例描述了用于確定本公開的探針和引物的靈敏度的方法，以及使用這樣的探針和引物與Corless等和McAvin等描述的探針和引物組的方法的比較。通過擴(kuò)增來自陽性對照菌株肺炎鏈球菌ATCC33400的純化提取的基因組DNA的系列稀釋物，測量了5種分析方法的分析檢測下限(LLD)。所有5種分析測試在使用它們相應(yīng)的引物對和探針時顯示了高度靈敏性，檢測下限相當(dāng)于小于10個拷貝，除了psaA-CDC之外，它具有大約低2倍的靈敏度。產(chǎn)生的所有標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有-3.4到-3.2的斜率，R2>0.96。分析測試的效率非常相似，在96%到100%的范圍內(nèi)。對于5種方法擴(kuò)增來自代表了45種血清型和不能分型的肺炎鏈球菌的67株肺炎鏈球菌菌株組的DNA的能力進(jìn)行了評估，結(jié)果從所有測試的肺炎鏈球菌菌株中100%擴(kuò)增或檢測到了DNA。實(shí)施例3分析測試對于肺炎鏈球菌檢測的特異性本實(shí)施例描述了用于確定本公開的探針和引物的特異性的方法，以及使用這樣的探針和引物與Corless等和McAvin等描述的探針和引物組的方法的比較。通過對來自104株非肺炎球菌細(xì)菌菌株的提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，評估和比較了5種分析測試中每種的分析特異性。這些菌株代表了革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌的幾個屬，它們中的某些棲息在口腔中。在特異性組中，使用任何非鏈球菌時沒有發(fā)生擴(kuò)增。但是，使用某些P-LVS和假肺炎鏈球菌菌株時發(fā)生了擴(kuò)增。P-LVS是從提交到鏈球菌實(shí)驗(yàn)室的菌株中特意選出的，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)難以鑒定或分類。除了BS、OPT和ACCUPROBE之外，還對這些分離株進(jìn)行了DNA/DNA重新結(jié)合分析。DNA/DNA重新結(jié)合值表明，這些P-LVS和假肺炎鏈球菌(表2)不是肺炎鏈球菌。緊溫度)下；D，被計(jì)算到最接近的0.5%的趨異值；nd，未做；AL，阿拉斯加州；AZ，亞利桑那州；MD，馬里蘭州；NS-CA，加拿大新斯科舍(NovaScotia)0使用實(shí)時PCR對這些菌株進(jìn)行的分析證明，新的lytA-⑶C實(shí)時PCR分析測試是最特異的(100%)，顯示出使用特異性組中的非肺炎鏈球菌生物體的DNA時沒有可檢測的熒光信號(表2)。其次是psaA-CDC實(shí)時PCR(98%)，它對于兩個假肺炎鏈球菌菌株給出了陽性結(jié)果，McAvin等發(fā)表的psaA-McAvin實(shí)時PCR(96%)，它對4株假肺炎鏈球菌陽性。使用psaA-McAvin、lytA-CDC和psaA-CDC引物探針組，使用來自P-LVS的DNA時沒有發(fā)生擴(kuò)增(表2)。對ply肺炎鏈球菌基因進(jìn)行了兩種分析測試對所有假肺炎鏈球菌都給出了陽性反應(yīng)；在其它P-LVS中，使用ply(13個之中有13個)和ply-⑶C(13個之中有10個)分析測試都發(fā)生了陽性反應(yīng)，使得最終特異性分別為78%和81%。lytA-CDC和psaA-CDC實(shí)時PCR都是高度特異性的，使用P-LVS分離株時沒有顯示出擴(kuò)增。psaA-CDC實(shí)時PCR特異性略低，擴(kuò)增了兩株假肺炎鏈球菌。這些結(jié)果與較早的使用常規(guī)PCR的研究相一致，顯示了這些基因在辨別肺炎鏈球菌中的用途。實(shí)施例4在臨床樣品中檢測肺炎鏈球菌本實(shí)施例描述了使用公開的探針和引物在臨床樣品中檢測肺炎鏈球菌，以及使用這樣的探針和引物與Corless等和McAvin等描述的探針和引物組的方法的比較。在三種類型的臨床樣本(上面描述的)上使用了5種分析測試，以對分析測試進(jìn)行評估和比較(表3)。表3、所有5種實(shí)時PCRs對臨床樣本的分析測試結(jié)果aMEF，中耳流出物；CSF，腦脊液b一種血清為RNaseP基因陰性c對于psaA-McAvin、lytA-CDC、ply-CDC來說，Ct平均值=彡38d對于該一個樣本測試的所有5個PCR來說，Ct值彡37所有5種分析測試都顯示出出色的關(guān)聯(lián)性。當(dāng)樣本在一種分析測試中是陽性或陰性時，同樣的樣本在其它分析測試中一般也是陽性或陰性的。區(qū)別只在于每種分析的陽性或陰性的總數(shù)。靈敏度根據(jù)15個培養(yǎng)陽性的血清樣本來計(jì)算，盡管其中有一個是RNaseP陰性的，表明了存在抑制。血清樣品的靈敏度，對于lytA-⑶C和ply-⑶C來說是53%(8/15)(對于每種但不同的樣本來說有1個附加的陽性)，對于lytA和psaA來說是47%(7/15)，對于肺炎鏈球菌ply來說是40%(6/15)。肺炎鏈球菌培養(yǎng)物陰性的血清的分析，在分析之間顯示出良好的相關(guān)性以及良好的特異性。對于psaA、lytA和ply來說，沒有發(fā)生陽性，使用血清時獲得了100%的特異性。MEFs和CSFs的分析顯示，所有5種分析測試對于所有10個Spn陽性MEFs和所有15個CSFs給出了陽性結(jié)果，產(chǎn)生了100%的靈敏性。10個培養(yǎng)物陰性的MEFs的特異性評估，對于同樣的六個MEF樣本，psaA-CDC、psaA-McAvin、lytA-CDC和ply-Corless實(shí)時PCR分析產(chǎn)生了陽性，得到了40%的特異性。此外一個附加的樣本被ply-CDC檢測為陽性，特異性為30%。肺炎鏈球菌陰性CSFs的檢查顯示出良好的特異性。對于psaA來說陽性為10個中有1個(90%特異性)，對于psaA-McAvin、ply-CDC和ply-Corless來說為10個中有2個(80%特異性)，對于lytA-⑶C來說為10個中有3個(70%特異性)。實(shí)施例5psaA、lyU和ply的多重CDC實(shí)時PCRs本實(shí)施例描述了在多重實(shí)時PCR分析中使用公開的探針和引物檢測肺炎鏈球菌。為了確定將引物探針組組合并在一起一次檢測所有三種基因是否能夠有利地改進(jìn)靈敏性，我們構(gòu)建了三種新開發(fā)的分析方法的多重復(fù)合。使用已知濃度的肺炎球菌陽性對照ATCC33400的連續(xù)稀釋物進(jìn)行了LLD評估，并將結(jié)果與每種基因的單式分析測試進(jìn)行了比較。這些研究顯示，當(dāng)與所有單式PCR進(jìn)行比較時，偏差小于士1Ct值(當(dāng)熒光值超過閾值時的循環(huán)數(shù))。假肺炎鏈球菌和其它P-LVS細(xì)菌的評估獲得的結(jié)果與單獨(dú)分析測試相同。沒有附加的陽性或陰性反應(yīng)。目前，趨勢是進(jìn)行多重分析測試以同時檢測各種不同的病原體，這代表了時間和金錢的節(jié)省。我們對于單一病原體進(jìn)行了這種嘗試但是提議我們的lytA-⑶C或psaA-⑶C引物探針組，將在多重復(fù)合了用于檢測其它呼吸道病原體的引物和探針的呼吸道平臺中，提供高的特異性。這種執(zhí)行的多重化和速度的潛力，使得這些分析測試成為用于分子檢測和流行病學(xué)攜帶研究的有希望的工具。當(dāng)與用于肺炎球菌疾病診斷的其它分析方法一起使用時，本技術(shù)的使用將提供附加的優(yōu)點(diǎn)。盡管在對本公開進(jìn)行描述時強(qiáng)調(diào)了具體的實(shí)施方案，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然也可以使用具體實(shí)施方案的變化形式，并且也已計(jì)劃到本公開的內(nèi)容可以在本文的具體描述之外進(jìn)行實(shí)踐。與本發(fā)明的具體方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├黄疬M(jìn)行描述的特征、特性、化合物、化學(xué)基團(tuán)或例子，應(yīng)該被理解為適用于本發(fā)明的任何其它方面、實(shí)施方案和實(shí)施例。因此，本公開包括了在下面的權(quán)利要求書中定義的本公開的精神和范圍所涵蓋的所有修改。3權(quán)利要求用于在樣品中檢測肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)核酸的方法，包括將樣品與至少一種探針接觸，該探針含有長度在20到40個核苷酸之間、能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDNO13或SEQIDNO15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交的核酸序列，其中探針包含與顯示為SEQIDNO5、SEQIDNO6或SEQIDNO12的核苷酸序列具有至少95％同一性的核酸序列；以及檢測肺炎鏈球菌核酸與探針之間的雜交，其中雜交的檢測表明在樣品中存在肺炎鏈球菌核酸。2.權(quán)利要求1的方法，其中探針基本上由顯示為SEQIDN0:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:12的核酸序列組成。3.權(quán)利要求2的方法，其中探針由X-GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO5)或X-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO6)組成，其中X是熒光團(tuán)，其中Y是暗淬滅劑或受體染料。4.權(quán)利要求2的方法，其中探針由X-CTCAAGT“T”GGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAA-Y(SEQIDNO12)組成，其中X是熒光團(tuán)，Y是一個或多個磷酸酯，“T”是連接有暗淬滅劑或受體染料的胸腺嘧啶。5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的方法，其中探針被標(biāo)記。6.權(quán)利要求5的方法，其中探針被放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、酶法標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。7.權(quán)利要求5或6的方法，其中探針用熒光團(tuán)標(biāo)記。8.權(quán)利要求5到7任一項(xiàng)的方法，其中探針用熒光淬滅劑標(biāo)記。9.權(quán)利要求5到8任一項(xiàng)的方法，其中檢測雜交包括檢測雜交過程中或之后來自標(biāo)記探針的信號，相對于雜交之前來自標(biāo)記物的信號的變化。10.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)的方法，其中所述方法將肺炎鏈球菌核酸與類似肺炎球菌的草綠色鏈球菌(P-LVS)核酸區(qū)分開來。11.權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)的方法，還包括通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時PCR、反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實(shí)時反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(rtRT-PCR)、連接酶鏈反應(yīng)或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)，來擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸。12.權(quán)利要求11的方法，其中肺炎鏈球菌核酸通過實(shí)時PCR來擴(kuò)增。13.權(quán)利要求11或12的方法，其中肺炎鏈球菌核酸的擴(kuò)增包括將樣品與至少一種引物接觸，該引物長度在15到40個核苷酸之間，能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下，與顯示為SEQIDN0:13或SEQIDNO:15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交，其中引物能夠擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸。14.權(quán)利要求13的方法，其中引物包含與顯示為SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO10或SEQIDNO11的核苷酸序列有至少95%同一性的核酸序列。15.權(quán)利要求14的方法，其中引物基本上由顯示為SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO10或SEQIDNO11的核酸序列組成。16.權(quán)利要求1到15任一項(xiàng)的方法，其中樣品是從對象獲得的生物樣品。17.權(quán)利要求16的方法，其中肺炎鏈球菌核酸在生物樣品中的存在，表明在從對象獲得的生物樣品中存在肺炎鏈球菌感染。18.權(quán)利要求16到17任一項(xiàng)的方法，其中生物樣品獲自血液、血清、腦脊液、中耳流出物，支氣管肺泡灌洗物、氣管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液。19.權(quán)利要求1到18任一項(xiàng)的方法，其中探針排列在具有可尋址的位置的預(yù)定陣列上。20.一種用于檢測肺炎鏈球菌核酸的探針，含有長度在20到40個核苷酸之間、能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDNO:13或SEQIDNO15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交的核酸序列，其中探針含有與顯示為SEQIDNO:5、SEQIDNO6或SEQIDNO12的核苷酸序列有至少95%同一性的核酸序列。21.權(quán)利要求20的探針，其中探針基本上由顯示為SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO12的核酸序列組成。22.權(quán)利要求21的探針，其中探針由X-GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO5)或X-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO:6)組成，其中X是熒光團(tuán)，其中Y是暗淬滅劑或受體染料。23.權(quán)利要求21的探針，其中探針由X-CTCAAGT"T”GGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAA-Y(SEQIDNO12)組成，其中X是熒光團(tuán)，Y是一個或多個磷酸酯，“T”是連接有暗淬滅劑或受體染料的胸腺嘧啶。24.權(quán)利要求20到23任一項(xiàng)的探針，其中探針被標(biāo)記。25.權(quán)利要求24的探針，其中探針被放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生物素標(biāo)記、酶法標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。26.權(quán)利要求24或25的探針，其中探針用熒光團(tuán)標(biāo)記。27.權(quán)利要求24到26任一項(xiàng)的探針，其中探針用熒光淬滅劑標(biāo)記。28.一種用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸序列的引物，含有長度為15到40個核苷酸，能夠在非常高嚴(yán)緊性條件下與顯示為SEQIDN0:13或SEQIDNO15的肺炎鏈球菌核酸序列雜交的核酸，含有與顯示為SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO10,SEQIDNO11的核酸序列有至少95%同一性的核酸序列，其中引物能夠指導(dǎo)肺炎鏈球菌核酸的擴(kuò)增。29.權(quán)利要求28的引物，其中引物基本上由顯示為SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO10,SEQIDNO11的核酸序列組成。30.用于擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸的引物組，含有一種或多種正向引物，基本上由顯示為SEQIDNO:3或SEQIDNO10的核酸序列組成；以及一種或多種反向引物，基本上由顯示為SEQIDNO:4或SEQIDNO11的核酸序列組成，其中引物組能夠與肺炎鏈球菌核酸雜交并指導(dǎo)其擴(kuò)增。31.權(quán)利要求30的引物組，其中引物組是一個或多個引物對的組，其中一個或多個引物對含有基本上由顯示為SEQIDNO:3的核酸序列組成的正向引物，以及基本上由顯示為SEQIDNO4的核酸序列組成的反向引物；基本上由顯示為SEQIDNO:10的核酸序列組成的正向引物，以及基本上由顯示為SEQIDNO11的核酸序列組成的反向引物；或其組合。32.用于在樣品中檢測肺炎鏈球菌的試劑盒，含有權(quán)利要求20到27任一項(xiàng)的探針；以及用于將探針與樣品中的肺炎鏈球菌核酸進(jìn)行雜交的說明書。33.權(quán)利要求32的試劑盒，還含有權(quán)利要求30的引物。34.用于在樣品中檢測肺炎鏈球菌的裝置，包括含有權(quán)利要求20到27任一項(xiàng)的至少一種探針的核酸陣列。35.用于在懷疑具有肺炎鏈球菌感染的對象中診斷肺炎鏈球菌感染的方法，包括從對象獲得含有核酸的樣品；將樣品與權(quán)利要求20到27任一項(xiàng)的一種或多種核酸探針接觸；檢測樣品中存在的肺炎鏈球菌核酸序列與探針之間的雜交，其中檢測到雜交表明對象被肺炎鏈球菌感染。36.權(quán)利要求35的方法，還包括使用權(quán)利要求30的一種或多種引物擴(kuò)增肺炎鏈球菌核酸。全文摘要公開了用于檢測肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae(S.pneumoniae))的方法。篩選懷疑含有肺炎鏈球菌核酸的樣品中是否存在該核酸。肺炎鏈球菌核酸的存在表明肺炎鏈球菌的存在。確定樣品中是否存在肺炎鏈球菌，可以通過檢測肺炎鏈球菌探針、例如肺炎鏈球菌lytA探針、肺炎鏈球菌psaA探針或肺炎鏈球菌ply探針，之間的雜交來完成。還公開了用于檢測肺炎鏈球菌的探針和引物。還公開了含有所公開的探針和/或引物的試劑盒和陣列。文檔編號C12Q1/68GK101855362SQ200880024577公開日2010年10月6日申請日期2008年5月16日優(yōu)先權(quán)日2007年5月18日發(fā)明者瑪麗亞·達(dá)·格洛婭·西凱拉·卡瓦略,瑪麗亞·露西婭·通代拉,萊斯莉·麥吉申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部，疾病控制和預(yù)防中心