專利名稱：來自尿的祖細(xì)胞及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及從尿中分離細(xì)胞，以及所分離的細(xì)胞及其使用方法。
背景技術(shù)：
再生性藥物是組織工程的應(yīng)用領(lǐng)域，其著眼于機體的損傷組織的再生。再生性藥 物的應(yīng)用包括器官例如膀胱的重建或替換。很多疾病和損傷可引起膀胱的傷害或喪失，需要修復(fù)或替換該器官。具有先天性 異常例如膀胱外翻、后尿道瓣膜或脊髓脊膜突出(通常稱為脊柱裂)的兒童可以發(fā)展高壓 和高滲的低順應(yīng)性膀胱。在美國，在成年群體中，膀胱癌是男性中第四常見的診斷的惡性腫 瘤，女性中是第九常見的診斷的惡性腫瘤。膀胱的基礎(chǔ)功能是提供可以在低壓下存儲尿并且在意志力控制下清空的寬敞的 容器。遭受包括膀胱功能喪失的痛苦的病人經(jīng)歷其生活質(zhì)量的顯著的消極改變，并且有腎 盂積水和腎衰竭的風(fēng)險。當(dāng)藥物治療不足時，通常需要進行膀胱重建，或膀胱成形術(shù)。目前，膀胱擴大術(shù)通 常是通過將去管狀的腸段置于膀胱中而實現(xiàn)的。雖然是功能性的，但是可以因使用用于泌 尿重建的腸段或胃瓣(gstric flap)產(chǎn)生幾種并發(fā)癥。有害的副作用包括感染、腸堵塞、產(chǎn) 生粘液、電解液異常、穿孔和致癌性。因此，需要臨床上更適用的通過組織工程化再生的膀 胱重建過程。組織工程的進展已經(jīng)證明可能通過使用接種原代培養(yǎng)細(xì)胞的生物可降解膜進 行膀胱重建(Kropp 等人(1996) J. Urol. 156 599 ；Atala 等人(1992) J. Urol. 148 658 ； Oberpenning等人(1999)Nat. Biotechnol. 17 149)。已經(jīng)在人中證明了這個概念的可 行性，并且實現(xiàn)了膀胱重建和膀胱體積的擴大(Atala等人.(2006)The Lancet 367 1241-46)。用于實現(xiàn)成功的膀胱重建的生物材料支架包括非細(xì)胞的膠原基質(zhì)和合成的聚合 物。膠原基質(zhì)包括豬的膀胱粘膜下層膜(BSM)和小腸粘膜下層(SIS)，二者均含有正常細(xì)胞 生長、分化和功能所需的眾多的天然組分，包括膠原、糖蛋白、蛋白聚糖和功能性生長因子 (Hodde 等人(2001)Endothelium 8 11 ；Voytik-Harbin 等人(1997) J. Cell. Biochem. 67 478)。合成的聚合物支架包括聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)和乳酸-羥基乙酸的 共聚物(PLGA) (Oberpenning 等人(1999) Nat. Biotechnol. 17 149 ；Atala 等人(1993) J. Urol. 150 608)。自體膀胱細(xì)胞是用于無癌癥病人中組織工程構(gòu)建體的最常見的細(xì)胞來源。接種到生物材料支架的病人自己的培養(yǎng)細(xì)胞可以用作再生組織的框架。但是，為了獲得膀胱細(xì) 胞，需要進行侵入性組織活檢程序以便收獲細(xì)胞，這增加了醫(yī)療保健的代價并且伴有潛在 的并發(fā)癥例如流血、感染和尿道或膀胱損傷。此外，由于在活檢前或活檢時對粘膜組織的破 壞，從膀胱活檢獲得的細(xì)胞有時候不能夠生長(Zhang&Frey (2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907)。正在研究用于尿道重建的替代性細(xì)胞來源，包括胚胎、胎兒和成體干細(xì)胞。干細(xì)胞是自我更新的且非終末分化的，因此可產(chǎn)生各種類型的細(xì)胞。人類胚胎干細(xì)胞對于組織 工程目的是有前途的(Frimberger 等人(2005)Urology65 827 ；Lakshmanan 等人(2005) Urology 65 :821)，但是存在免疫相容性、腫瘤形成和倫理學(xué)問題。發(fā)現(xiàn)胎兒或成體干細(xì)胞 在宿主組織中只有非常稀少的數(shù)目，可能不能在培養(yǎng)中很好地擴增，且具有更加受限制的 分化潛能(Vogel (2001) Science 292:1820)。所以，目前干細(xì)胞在組織工程上的臨床應(yīng)用 可能是有限的。需要比通過活檢收獲自體細(xì)胞更優(yōu)選的替代方案以用于尿道組織工程和細(xì)胞治 療，特別是當(dāng)活檢不能獲得自體來源細(xì)胞時。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了產(chǎn)生尿祖細(xì)胞(UPC)培養(yǎng)物的方法，包括提供尿樣品；然后從所述 尿樣品中分離尿祖細(xì)胞。在一些實施方式中，所述分離步驟通過以下進行(a)從尿樣品中 收集細(xì)胞以提供粗制細(xì)胞樣品；和(b)從所述粗制細(xì)胞樣品中選擇尿祖細(xì)胞。在一些實施 方式中，所述收集步驟通過所述尿樣品的離心進行。在一些實施方式中，所述選擇通過將所述細(xì)胞平板接種于(plating)包含選擇性 細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物中而進行。在一些實施方式中，所述選擇基于形態(tài)學(xué)而進行。在一些實 施方式中，所述選擇通過選擇對尿祖細(xì)胞特異的標(biāo)記而進行，例如C-kit(CD117)、SSEA-4、 ⑶105、⑶73、⑶90、⑶133和/或⑶44。在一些實施方式中，尿祖細(xì)胞來自哺乳動物對象 (例如，人對象)。通過本文公開的任何方法制備的尿祖細(xì)胞是本發(fā)明的另一個方面。還提供了分離的尿祖細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是c-kit陽性的，且其中所述細(xì)胞可分 化成選自下列的兩個或多個譜系尿道上皮、平滑肌、內(nèi)皮和間質(zhì)細(xì)胞。提供了將細(xì)胞接種到組織支架上的方法，包括提供UPC，分化UPC和將分化的細(xì)胞 接種到生物可降解的組織支架上。組織支架可包含膠原基質(zhì)和/或合成的聚合物，例如聚 羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。提供了治療有需要的對象的方法，包括提供膀胱組織基底(substrate)，其中所述 基底包含分化的UPC ；和將所述基底移植到病人中?；卓梢园z原基質(zhì)和/或合成的 聚合物，例如聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)或乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。提供了試劑盒，所述試劑盒可包含適于尿樣品運輸?shù)娜萜?；培養(yǎng)基；一種或多種 抗生素；容納所述容器、培養(yǎng)基和抗生素的包裝體；以及任選地，使用說明書。本發(fā)明的另一個方面是如上所述的細(xì)胞在制備用于進行如上所述的治療方法的 藥物中的用途。本發(fā)明的前述和其它目標(biāo)和方面通過本文的附圖和以下說明書更詳細(xì)地解釋。


圖1.提議的尿祖細(xì)胞(UPC)分化路徑的示意圖。圖2.經(jīng)過體外培養(yǎng)的來自尿的祖細(xì)胞的顯微圖像。細(xì)胞可以在不存在飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下增殖。圖3.尿細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞生長曲線。在10至12天內(nèi)在6-cm培養(yǎng)皿中細(xì)胞從單 一細(xì)胞生長至匯合。圖4.熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)圖像證明從尿中分離的細(xì)胞中存在祖細(xì)胞標(biāo)記 物，例如 CD44、105、73、90 和 133。圖5.在從膀胱活檢獲得的人尿道上皮中(A-D)和UPC(E-H)中用 uroplakin(UPIa)、細(xì)胞角蛋白7、13、19、17和核酸進行免疫熒光染色的顯微圖像。圖6.用核酸和對平滑肌特異性的標(biāo)記物雙染色的UPC的顯微圖像。圖像顯示源 自尿的平滑肌祖細(xì)胞表達平滑肌蛋白標(biāo)記物，例如α-平滑肌肌動蛋白(ASM) (Α)、調(diào)寧蛋 白(Calponin) (B)、結(jié)蛋白和肌球蛋白(D)。圖7.體內(nèi)移植后一個月的UPC-膀胱粘膜下層膜(BSM)和UPC-小腸粘膜下層 (SIS)構(gòu)建體的組織學(xué)特征。A. Masson三重(Trichrome)染色和UPC在SIS支架上生長的 檢測。B.在SIS基質(zhì)上鑒定的Lac-Z標(biāo)記的UPC。C.接種尿細(xì)胞的BSM移植物的蘇木精& 伊紅(Η&Ε)染色的部分。D.在BSM基質(zhì)內(nèi)記錄到UPC的人Χ/Υ染色體。圖8.在培養(yǎng)的尿細(xì)胞中觀測到的四種細(xì)胞類型內(nèi)皮樣細(xì)胞、平滑肌樣細(xì)胞、上 皮樣細(xì)胞和間質(zhì)樣細(xì)胞。圖9.通過FACS分析細(xì)胞的細(xì)胞特異性標(biāo)記物ΑΕ1/ΑΕ3、結(jié)蛋白、波形蛋白和紅細(xì) 胞生成素。圖10.克隆的UPC的吉姆薩(Giemsa)帶核型圖在第6代顯示出正常的染色體式樣。優(yōu)選實施方式詳述本發(fā)明涉及祖細(xì)胞和從尿中選擇和培養(yǎng)祖細(xì)胞的方法。有利地，尿中所發(fā)現(xiàn)的細(xì) 胞可以不需要組織活檢而獲得，免除了病人的不舒適度和可能的并發(fā)癥。所有引用的美國專利參考文獻的公開均在這里引入作為參考，達到其與本文的公 開一致的程度。如本發(fā)明的說明書和隨附的權(quán)利要求書所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和 “所述”也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清晰地另有說明。此外，當(dāng)提及可測定值，例如化合物 的量、劑量、時間、溫度等時，本文使用的術(shù)語“約”和“大約”是指包括指定量20%、10%、 5%、1%、0.5%或甚至是0. 的變化。同樣，如本文所用的“和/或”和“/”是指并且包括 所列項目相關(guān)的一個或多個任何和所有可能的組合，以及當(dāng)在或者(“或”)中分析時組合 的缺失?！澳蜃婕?xì)胞”或“UPC”是從尿中收集和/或分離的細(xì)胞，其具有多能性和增殖潛能。 UPC是“多能性的”，是指其能夠產(chǎn)生一個或多個譜系內(nèi)的各種細(xì)胞類型。例如，根據(jù)一些實 施方式的UPC具有分化成下列的一種或多種的潛能膀胱尿道上皮、平滑肌、內(nèi)皮、間質(zhì)細(xì) 胞，甚至是骨、肌肉、上皮細(xì)胞和其它類型的細(xì)胞和組織。以前的研究已經(jīng)表明尿道上皮細(xì) 胞可分化為成熟的軟骨細(xì)胞(Fernandez-Conde，Bone(1996) 18(3) :289_91)。從尿道腔中脫落的細(xì)胞通常被認(rèn)為是難以在體外培養(yǎng)和保持的老的或損壞的表面細(xì)胞。從尿中獲得的幾種細(xì)胞可以在飼養(yǎng)層細(xì)胞上迅速生長。但是，當(dāng)用小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞 培養(yǎng)人細(xì)胞時，飼養(yǎng)層細(xì)胞通常來源于可能將病毒從動物轉(zhuǎn)移到人類的胚胎小鼠組織。為 了避免這個并發(fā)癥，我們最近在沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下從尿中培養(yǎng)了細(xì)胞。獲得了具有 祖細(xì)胞特征且保持了增殖能力和多能性潛能的細(xì)胞。 我們的研究表明在尿中有混合的細(xì)胞群體有祖細(xì)胞，也有成熟細(xì)胞。如本文所討 論，尿含有尿道上皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞，以及內(nèi)皮和間質(zhì)祖細(xì)胞。尿中發(fā)現(xiàn)的祖細(xì)胞可 來源于膀胱組織、腎組織等。在一些實施方式中，對UPC進行排除腎臟來源的選擇。這可通 過例如將收集的細(xì)胞傳代而進行，因為人們認(rèn)為腎臟細(xì)胞在傳代時通常不能存活。在一些 實施方式中，在生長24-48小時內(nèi)(例如每31. 3小時)，UPC良好地倍增，這允許它們大量 生長。在另外的實施方式中，UPC不誘導(dǎo)腫瘤形成，在一些實施方式中，UPC的生長或分化不 需要飼養(yǎng)細(xì)胞?！胺蛛x的”是指將細(xì)胞置于非其天然環(huán)境的條件中。但是，術(shù)語“分離的”不排除后 來將這些細(xì)胞與其它細(xì)胞組合或混合使用?！皩ο蟆蓖ǔ槿藢ο?，包括但不限于“病人”。對象可以是男性或女性，可以是任 何種族或種族劃分，包括但不限于高加索人、非洲裔美國人、非洲人、亞洲人、西班牙人、印 度人等。對象可以是任何年齡的，包括新生兒、嬰兒、嬰幼兒、兒童、青年人、成年人和老人。對象也可以包括用于(例如)獸藥和/或藥物開發(fā)目的的動物對象，特別是哺乳 動物對象，例如犬、貓、牛、山羊、馬、綿羊、豬、嚙齒動物(例如大鼠和小鼠)、兔類動物、靈長 類(包括非人靈長類)等。細(xì)胞的收集可以從任何產(chǎn)生尿的動物(包括人類)收集UPC。在本發(fā)明的一些實施方式中，尿 祖細(xì)胞從哺乳動物的尿中收集。例如，UPC可以從狗、貓、豬、母牛(cow)、馬、猴子或人的尿 中收集。在具體實施方式
中，尿祖細(xì)胞從人尿中獲得。在一些實施方式中，UPC從新鮮的自發(fā)尿樣品中獲得，或從通過尿道導(dǎo)尿管或膀胱 洗滌排出的尿獲得。尿樣品可在4°C于1500RPM離心5分鐘，吸取上清液并用合適的溶液例 如磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞。PBS可任選地含有5%胎牛血清(FBS)和青霉素-鏈 霉素以分別保護細(xì)胞免受損傷和潛在感染?？梢栽诶缑绹鴮＠鸑o. 5,912, 116 ；美國專利申請No. 20040087017 ；美國專利申 請No. 20020012953 ；和WO 2005/047529中發(fā)現(xiàn)從生物液體中分離細(xì)胞的方法和設(shè)備的其
它例子。細(xì)胞的選擇和繁殖在一些實施方式中，擴增收集的UPC。“擴增”是指有活力的細(xì)胞數(shù)目的增加。可 通過例如使細(xì)胞生長一個或多個細(xì)胞周期而實現(xiàn)擴增，其中至少一部分細(xì)胞分裂以產(chǎn)生另 外的細(xì)胞?！霸囵B(yǎng)物”是將收集的細(xì)胞接種到培養(yǎng)容器后建立的首次培養(yǎng)物?！皞鞔笔?指將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移或次培養(yǎng)至第二個培養(yǎng)容器，通常包括機械或酶學(xué)解聚，再接種，且通常分 裂為兩個或兩個以上子代培養(yǎng)物，這取決于增殖的速率。如果為了特定的基因型或表型而 選擇群體，則培養(yǎng)物經(jīng)次培養(yǎng)成為“細(xì)胞株”，即培養(yǎng)物為勻質(zhì)的且具有所需要的特征?！凹?xì) 胞系”的建立，與細(xì)胞株相反，是基本上未分化的，雖然它們可能成為特定的譜系。
“選擇”可基于將一種細(xì)胞類型與另一種區(qū)別開的任何獨特性質(zhì)，例如、密度、大 小、獨特標(biāo)記物、獨特代謝途徑、營養(yǎng)需求、蛋白表達、蛋白分泌等。例如，可以使用梯度離心 基于密度和大小而選擇細(xì)胞。可使用熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)、免疫磁珠分選、磁激活的 細(xì)胞分選(MACS)、淘選(Panning)等選擇獨特標(biāo)記物?？赏ㄟ^改變細(xì)胞生長的培養(yǎng)基特別 是無血清環(huán)境的營養(yǎng)成分的組成和/或數(shù)量來利用獨特的代謝途徑和營養(yǎng)需求?？墒褂酶?種檢驗(例如ELISA)檢測蛋白表達和/或分泌。在一些實施方式中，通過將由尿分離的細(xì)胞提供在促進祖細(xì)胞生長的特定生長環(huán) 境(例如祖細(xì)胞培養(yǎng)基)中而選擇UPC。在一些實施方式中，祖細(xì)胞培養(yǎng)基含有3/4DMEM、 l/4Ham' s F12U0% FBS、0. 4mg/ml 氫化可的松、IO^10M, Chron毒素、5mg/ml 胰島素、1. 2mg/ ml腺嘌呤、2. 5mg/ml鐵傳遞蛋白加0. 136mg/ml 3，39，5-三碘-L-甲腺原氨酸、10mg/ml EGF、和 1 % 青霉素-鏈霉素(Zhang 等人，In vitro Cell Dev. Biol. -Animal 37:419， 2001)。在其它實施方式中，將分離的UPC提供在促進祖細(xì)胞選擇性分化的特定生長環(huán)境 中。例如，在一些實施方式中，在角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)基中生長的UPC發(fā)育為尿道上皮。在 其它實施方式中，在含有10%胎牛血清的DMEM中生長的UPC發(fā)育成平滑肌樣細(xì)胞。在一 些實施方式中，內(nèi)皮樣細(xì)胞可在含有20% FBS、2mmol/lL-谷氨酰胺、EGF(5nl/ml) 1 %丙酮 酸鈉和青霉素-鏈霉素的M199中培養(yǎng)。在一些實施方式中，間質(zhì)樣細(xì)胞可在含有10% FBS、2mmol/lL-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。在其它實施方式中，通過形態(tài)學(xué)選擇UPC。例如，可將從尿中分離的細(xì)胞稀釋至允 許分離單個細(xì)胞的濃度(例如，細(xì)胞可在多孔板中被稀釋至約0. 5細(xì)胞/孔)，并在顯微鏡 下觀察?？梢员Ａ艉袉蝹€細(xì)胞的孔用于擴增，通過觀察形態(tài)而選擇，例如尿道上皮、平滑 肌、內(nèi)皮和/或間質(zhì)細(xì)胞(見圖6A)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的尿祖細(xì)胞可基于一種或多種“標(biāo)記物”而鑒定、選擇 和/或分離。這樣的標(biāo)記物包括特異性基因表達、在這類細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的抗原性分子等。在 特定的實施方式中，尿祖細(xì)胞基于至少一種特異性標(biāo)記物選擇和分離。在一些實施方式中， UPC具有以下的一種或多種標(biāo)記物，例如⑶117(c-kit)、SSEA-4、⑶105、⑶73、⑶90、⑶133 和⑶44，并且不具有可評估量的一種或多種以下標(biāo)記物⑶31、⑶34和⑶45。因此，某些實 施方式包括選擇和分離表達⑶117、SSEA-4、⑶105、⑶73、⑶90、⑶133和⑶44中的一種或 多種和/或不表達⑶31、⑶34和⑶45中的一種或多種的尿祖細(xì)胞。例如，在一些實施方式 中，本發(fā)明的尿祖細(xì)胞是基于CD117的表達而鑒定、選擇和/或分離的。在一些實施方式中，可按照本文的公開內(nèi)容通過下述而獲得UPC:從尿樣品中收 集細(xì)胞(例如通過離心)，和/或直接將細(xì)胞置于合適的培養(yǎng)基之中或之上，和/或基于祖 細(xì)胞特異性細(xì)胞標(biāo)記物的表達而選擇并分離尿祖細(xì)胞(例如通過免疫組化或western印跡 分析)?；蛘撸赏ㄟ^收集并選擇細(xì)胞而獲得尿祖細(xì)胞，所述選擇通過熒光激活的細(xì)胞分選， 例如使用與熒光團(例如APC、藻紅蛋白、別藻藍(lán)蛋白、熒光素、德克薩斯紅(TEXAS RED)等) 偶聯(lián)的標(biāo)記物特異性抗體(例如抗CD117抗體)，或使用與磁性顆粒偶聯(lián)的標(biāo)記物特異性抗 體進行磁性選擇。說明性地，可使用與CD117報告蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸23-322) 特異性結(jié)合的兔多克隆抗體孵育細(xì)胞(De Coppi等人(2007) Nat. Biotechnol. 25 100)。可 通過使用磁性山羊抗兔IgG微珠孵育并在Mini-MACS設(shè)備上選擇而純化⑶117-陽性細(xì)胞。還可使用直接與微珠偶聯(lián)的抗-CD117單克隆抗體來選擇尿祖細(xì)胞。任何適合于選擇的方法，包括與固相結(jié)合和分離，均涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的尿祖細(xì)胞可常規(guī)傳代或次培養(yǎng)，例如以1 4稀釋 并允許擴增至約50 70%匯合度。尿祖細(xì)胞的分離的群體可常規(guī)生長并在常規(guī)培養(yǎng)條件 下保持，例如37°C在5% CO2的濕潤空氣中。雖然本發(fā)明的細(xì)胞可在含有KFSM-祖細(xì)胞培養(yǎng) 基的復(fù)合培養(yǎng)基(1 1)中生長(Zhang 等人，In vitro Cell Dev. Biol. -Animal 37:419， 2001)，但是通常優(yōu)選的是細(xì)胞在簡單的無血清培養(yǎng)基中保持，例如用于尿道上皮祖細(xì)胞的 KSFM ；或含有10% FBS的用于平滑肌或間質(zhì)祖細(xì)胞的培養(yǎng)基，例如Dulbecco最低必需培養(yǎng) 基(DMEM) ,Hank堿性鹽溶液(HBSS) ,Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS)、RPMI、或Iscove改進 的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)，從而實現(xiàn)對祖細(xì)胞分化為所需要細(xì)胞的更精確控制?？赏ㄟ^常 規(guī)的限制性稀釋方法在96孔板或24孔板中產(chǎn)生克隆尿祖細(xì)胞系。一旦形成細(xì)胞克隆，將 細(xì)胞分離并轉(zhuǎn)移至多孔培養(yǎng)皿。在一些實施方式中，培養(yǎng)基中包含生長因子或其它促有絲分裂劑以促進不同細(xì)胞 群體的增殖和分化。從這個意義上，本發(fā)明的具體實施方式
包括用支持尿祖細(xì)胞生長并分 化為尿道上皮、平滑肌、間質(zhì)細(xì)胞等的選擇性培養(yǎng)基來培養(yǎng)尿祖細(xì)胞。在本文上下文中，分 化是指細(xì)胞狀態(tài)，其中細(xì)胞發(fā)展特定的形態(tài)學(xué)或功能性特征。說明性地，當(dāng)尿祖細(xì)胞在補充 了 0.09mM鈣的角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KSFM)中生長時，細(xì)胞分化成尿道上皮。同樣地，在 補充了血清例如10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)的尿祖細(xì)胞促進向平滑肌細(xì)胞的分化。 因此，本發(fā)明還包括分化并表達至少一種尿道上皮特異性標(biāo)記物或至少一種平滑肌特異性 標(biāo)記物或至少一種其它組織特異性標(biāo)記物(例如間質(zhì)特異性)的尿祖細(xì)胞群體?？赏ㄟ^檢測對特定細(xì)胞類型特異性的標(biāo)記物來確定UPC是否分化成這些特定類 型的細(xì)胞。例如，可通過一種或多種尿道上皮特異性標(biāo)記物(包括例如uroplakin、細(xì)胞 角蛋白7、細(xì)胞角蛋白13、細(xì)胞角蛋白17、細(xì)胞角蛋白19和細(xì)胞角蛋白20)的存在來鑒定尿 道上皮細(xì)胞；可通過一種或多種平滑肌特異性標(biāo)記物(包括，例如α-平滑肌肌動蛋白、結(jié) 蛋白、調(diào)寧蛋白和肌球蛋白)的存在來鑒定平滑肌細(xì)胞?？赏ㄟ^使用任何合適的常規(guī)方法 例如免疫組化和/或western印跡分析來確定細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物的表達。此外，如果需要，可在使用前將細(xì)胞冷凍或冷藏，然后解凍成有活力的形式。冷凍 或冷藏細(xì)胞的方法(用于以后回復(fù)至有活力的形式)在本領(lǐng)域是熟知的。例如細(xì)胞的冷藏 可包括將細(xì)胞在生長培養(yǎng)基與另一種防止水形成冰晶體的液體的混合物中冷凍，然后將細(xì) 胞儲存于液氮溫度(例如，約-80°C至約-196°C )。參見例如美國專利No. 6，783，964。治療方法可使用本文公開的方法治療的疾病，包括但不限于尿道組織的擴大或替換。本文 所用的“治療”是指任何種類的對病人有益的治療，所述病人為例如患有疾病的病人或具有 患疾病風(fēng)險的病人。治療包括為了改善病人病狀(例如一種或多種癥狀的減輕)、延緩疾病 的發(fā)生或發(fā)展等而進行和禁止進行的行動。已經(jīng)證明根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的尿祖細(xì)胞可分化成各種功能細(xì)胞類型，本 發(fā)明的尿祖細(xì)胞可應(yīng)用于治療尿道的疾病和病狀，包括例如膀胱外翻；膀胱體積不足；部 分或全部切除后的膀胱重建；膀胱修復(fù)；外傷引起的腎或輸尿管損傷等。按照一些實施方 式的治療包括尿道疾病和病狀，例如先天性異常、癌癥、外傷、輻射、感染、醫(yī)原性損傷、神經(jīng) 損傷或其它誘因。通常，治療包括改變尿道功能；改善尿道功能；或重建、修復(fù)、擴大或替換損傷的尿道細(xì)胞或全組織或器官，以預(yù)防或治療尿道疾病或病狀。從這個意義上，尿祖細(xì)胞可用于如下尿道結(jié)構(gòu)的組織工程例如輸尿管、膀胱、尿道、腎盂(renal pelvic)、腎臟、骨、 軟骨、肌肉、皮膚等。此外，尿祖細(xì)胞可應(yīng)用于下尿道藥理學(xué)和尿道疾病的診斷。根據(jù)本發(fā)明的一些實 施方式的細(xì)胞可用于診斷疾病，例如，血尿癥或尿道系統(tǒng)的腫瘤，如膀胱、腎盂、腎臟、輸尿 管、前列腺和尿道的腫瘤；腎臟疾病，例如腎糖尿病、腎小管壞死、急性或慢性腎衰竭和腎移 植后的腎臟排斥；和其它疾病，包括間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱、輻照膀胱和膀胱輸尿管 反流或反流腎病。參見例如美國專利No. 5，733，739,5, 325，169和5，741，648。按照本發(fā)明，在一些實施方式中，治療包括給予需要治療的對象有效量的尿祖細(xì) 胞，例如未分化的、分化的或其混合物，從而改善或減輕對象疾病或病狀的至少一種體征或 癥狀。在組織移植的應(yīng)用中，在一些實施方式中，細(xì)胞是與移植入組織的對象相同物種 的細(xì)胞。在一些實施方式中，細(xì)胞為自體的(即來自待治療的對象)、同基因的(即，遺傳學(xué) 上相同的不同對象，例如來自相同的雙胞胎)、同種異體的(即來自相同物種的非遺傳相同 成員)或異種的(即來自不同物種的成員)。在一些實施方式中，當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞用于治療對象時，細(xì)胞被配制成藥物組 合物，所述組合物包含與藥學(xué)上可接受的溶媒或載體混合的細(xì)胞。這樣的制劑可通 過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備。參見例如美國專利申請2003/0180289 ；Remington =The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro,編輯，第 20 版 Lippincott Williams&ffilkins :Philadelphia，PA，2000。在制備根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑時，細(xì)胞通常與 特別是可接受的載體混合。當(dāng)然載體必須是在可以與制劑中的其它任何成分兼容的意義上 可接受的，且必須對病人無害。載體可以是固體或液體或二者皆有(例如，水凝膠)，可與細(xì) 胞配制成單位劑量的制劑。在一個實施方式中，以載體中的懸浮液的形式提供細(xì)胞以減少 細(xì)胞凝塊。在另一些實施方式中，細(xì)胞配制成膠囊化形式(例如封裝在可通透營養(yǎng)物和氧氣 的膠囊中以維持細(xì)胞在體內(nèi)的活力)。用于將細(xì)胞封裝在通透性膠囊中的材料和方法是熟 知的，在例如美國專利No. 6，783，964中有描述。例如，細(xì)胞可封裝在直徑為50或100 μ π!至 1或2mm的微膠囊中，微膠囊包含含有細(xì)胞的內(nèi)部多糖樹膠核心，所述核心被半透膜包圍； 微膠囊包含藻酸鹽與聚賴氨酸、聚鳥氨酸及其組合的組合。其它合適的封裝材料包括但不 限于在美國專利No. 5，702，444中描述的那些。在具體實施方式
中，本發(fā)明的細(xì)胞與生物可降解支架或基質(zhì)一起給予。已經(jīng)證明 在富含膠原的支架上體外共培養(yǎng)之后，膀胱細(xì)胞可形成特殊層狀(distinctive layers)的 正常膀胱結(jié)構(gòu)，尿道上皮生長在平滑肌細(xì)胞上面(Zhang等人(2000) J.Urol. 164:928)。另 夕卜，已經(jīng)表明在部分膀胱造口術(shù)模型中，接種了膀胱細(xì)胞的支架構(gòu)建體參與了組織重塑的 再生過程(Zhang等人(2005) BJU Int. 96 :1120)。因此，祖細(xì)胞的實施方式可應(yīng)用于體外 工程化細(xì)胞支架構(gòu)建體，以用于后續(xù)的體內(nèi)移植以完全再生膀胱。生物可降解支架或基質(zhì)是無毒或?qū)ι飳W(xué)功能無損害且能夠被宿主分解為其基 礎(chǔ)成分的任何物質(zhì)。理想地，支架或基質(zhì)是多孔結(jié)構(gòu)以允許細(xì)胞沉積在基質(zhì)上和基質(zhì)的孔 內(nèi)，在某些實施方式中，支架或基質(zhì)是定形的。這樣的制劑可以這樣制備向生物可降解支架提供至少一個細(xì)胞群體以將細(xì)胞群體接種在支架上和/或支架內(nèi)。在一些實施方式中， 然后將接種的支架移植入受體對象的體內(nèi)，其中分離的、層化組織的細(xì)胞群體促進新生器 官或組織結(jié)構(gòu)的形成。 可以使用的生物可降解支架包括例如天然或合成的聚合物，例如膠原(例如SIS 和BSM)；聚(α酯)，例如聚乳酸；聚羥基乙酸；聚原酸酯和聚酸酐及它們的共聚物，它們可 以受控速率通過水解被降解且再吸收。在美國專利No. 7，186，554中提供了其它合適材料 的實例?？墒褂萌缦路椒▽⑸锟山到庵Ъ堋岸ㄐ巍?，例如，溶劑澆鑄、壓模、拉絲、網(wǎng)格化 (meshing)、浸出(leaching)、織造(weaving)和包被。在溶劑澆鑄中，將溶于合適溶劑(例 如二氯甲烷)中的一種或多種聚合物的溶液澆鑄為分枝(branching)圖案浮雕結(jié)構(gòu)。溶劑 蒸發(fā)后，獲得薄膜。在壓模時，以最多30，000磅每平方英寸的壓力將聚合物壓入合適的模 樣中。拉絲包括從熔化的聚合物中拉絲，網(wǎng)格化包括通過將纖維壓成氈狀材料而形成網(wǎng)。 在浸出時，將含有兩種材料的溶液鋪展(spread)成類似最后形式的形狀。然后，使用溶劑 熔解掉一種組分，從而形成孔(參見美國專利No. 5，514，378)。在成核時，將重建性尿道上 皮移植物形狀的薄膜暴露于能夠產(chǎn)生放射損壞材料軌跡的放射性裂變產(chǎn)物。然后，用酸或 堿蝕刻聚碳酸酯層，將放射損壞材料軌跡變成孔。最后，可使用激光進行定形并且燒出通過 很多材料的單個孔以形成具有統(tǒng)一孔尺寸的重建性尿道上皮移植物。這些定形技術(shù)可組合 使用。例如，可以將生物可降解基質(zhì)織造、壓模并且還粘合。此外，可以將通過不同方法定 形的不同聚合物材料結(jié)合在一起以形成復(fù)合形狀。復(fù)合形狀可以是層狀結(jié)構(gòu)。例如，可以 將聚合物基質(zhì)與一種或多種聚合物基質(zhì)結(jié)合以形成多層聚合物基質(zhì)結(jié)構(gòu)。所述結(jié)合可通過 使用液態(tài)聚合物粘合或通過縫合而進行。另外，聚合物基質(zhì)可形成為固體塊并通過激光或 其它標(biāo)準(zhǔn)機械加工技術(shù)定形成為其想要的最終形式。激光定形是指使用激光除去材料的方 法?？梢栽谝浦睬?在接種細(xì)胞前或后)用添加劑或藥物處理生物可降解支架以便 例如促進移植后新組織的形成。因此，例如，可將生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞外基質(zhì)組分和 /或其它生物活性材料加入生物可降解支架中以促進移植物愈合和新組織的形成。通常， 這樣的添加劑根據(jù)重建或擴大的組織或器官而選擇，以確保在移植的器官或組織中形成合 適的新組織。用于促進骨愈合的這樣的添加劑的例子參見例如Kirker-Head(1995)Vet. Surg. 24(5) :408-19o可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法將細(xì)胞接種到生物可降解支架上。例如，已經(jīng)報道了將細(xì)胞接 種到聚合物基底以用于組織修復(fù)(參見，例如授予Atala的美國專利No. 6，171，344，引入 本文作為參考；Atala 等人(1992) J. Urol. 148 :658_62 ；Atala 等人(1993) J. Urol. 150 608-12)。作為例子，可將生長于培養(yǎng)物中的細(xì)胞胰蛋白酶化以分離細(xì)胞，分離的細(xì)胞可接 種在生物可降解支架上。或者，從細(xì)胞培養(yǎng)獲得的細(xì)胞可作為細(xì)胞層從培養(yǎng)板中提起，可直 接將細(xì)胞層接種于生物可降解支架上而不預(yù)先分離細(xì)胞。生物可降解支架上接種的細(xì)胞的密度可以變化。例如，在一些實施方式中，較高的 細(xì)胞密度促進所接種的細(xì)胞形成更多的組織，而較小的密度可允許由從宿主滲入移植物的 細(xì)胞形成相對較多的組織。還可依據(jù)生物可降解支架和細(xì)胞使用其它的接種技術(shù)。例如， 可通過真空過濾將細(xì)胞施于生物可降解支架。根據(jù)本文的教導(dǎo)，選擇細(xì)胞類型并將細(xì)胞接種在生物可降解支架上對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說將是常規(guī)的。在其它實施方式中，本發(fā)明的制劑包括用于腸胃外給藥的那些(例如皮下、肌內(nèi)、 真皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)注射)或移植。在一些實施方式中，通過血管內(nèi)給藥，可以 通過簡單注射，也可以通過置于合適的血管(例如腎動脈)中的導(dǎo)管注射。在另一個實施 方式中，以如上討論的待擴大器官或組織上的移植物的方式施用。 適用于腸胃外給藥的本發(fā)明的制劑包括無菌液體，優(yōu)選細(xì)胞的水性注射組合物， 該制劑可以與意向接受者的血液是等滲。這些制劑還可以包含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和 溶質(zhì)，這些物質(zhì)使制劑與意向接受者的血液等滲。除了所給予的細(xì)胞外，制劑是無菌的，其 意義是它們不含微生物污染物，例如細(xì)菌和病毒。制劑可以是可灌注(synringeable)、可注 射形式；可以是適合于手術(shù)移植入(例如)對象的膀胱、尿道、輸尿管或腎臟的形式；或其 它任何適于給予到對象中的形式。根據(jù)一些實施方式，給予對象的細(xì)胞可以是與待治療對象同基因的(syngeneic) (即同系的，包括同基因的(isogeneic)和自體的)，同種異體的(即同源的)或異種的(即 異源的)，這取決于其它的步驟例如是否存在封裝或是否給予細(xì)胞免疫抑制治療。細(xì)胞的治療有效劑量在對象之間有所不同，這取決于例如年齡、體重和對象的狀 況以及遞送途徑等的因素?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的程序來確定此劑量。通常，在一 些實施方式中，可以給予每個對象ι χ ο5、1 X IO6或5 X IO6直至1 X IO7,1 X IO8或1 X IO9個 細(xì)胞的劑量，單獨一次一起給予或分開幾次給予。在其它實施方式中，可以給予每千克對象 體重為I-IOOXlO8個細(xì)胞的劑量，單獨一次一起給予或分開幾次給予。當(dāng)然，如果必要可 以提供后續(xù)的給藥。如果需要或必要，還可根據(jù)已知的技術(shù)給予對象抑制所給予細(xì)胞的移植排斥的藥 齊U，例如雷帕霉素、咪唑硫嘌呤、皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢霉素和/或1^506。參見例如美國專利 No. 5，461，058 ；5，403，833 ；和 5，100，899 ；另外參見美國專利 No. 6，455，518 ；6，346，243 ； 和 5，321，043。此外，本發(fā)明的細(xì)胞可在接種前用遺傳材料進行轉(zhuǎn)染(例如，用特定基因)?？捎?的遺傳材料可以是例如能夠減少或消除宿主內(nèi)免疫反應(yīng)的遺傳序列。例如，可以抑制諸如I 類和II類組織相容性抗原等細(xì)胞表面抗原的表達。這將使所移植的細(xì)胞被宿主排斥的幾 率降低。用于收集尿祖細(xì)胞的試劑盒本文還提供了用于收集尿樣品的試劑盒。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的試劑盒用于在向 遙遠(yuǎn)地區(qū)(例如合適的實驗室設(shè)施)運輸時保存尿祖細(xì)胞的活力。在一些實施方式中，試 劑盒包括含有合適培養(yǎng)基(例如l_15mL，在一些實施方式中為5mL的血清例如胎牛血清) 的管。培養(yǎng)基可以是冷凍形式提供，在使用前解凍。在其他實施方式中，試劑盒包括含有抗 生素(例如，l_15mL，在一些實施方式中為5mL的含有青霉素和鏈霉素的溶液)的管。 抗生素可以是粉末形式或水性溶液(任選地以凍干形式提供，在使用前解凍)。試劑盒還可包含合適的容器(例如瓶子)，以用于收集尿樣品(例如，三個無菌塑 料瓶，其具有合適體積，例如100-1，OOOmL,在一些實施方式中為500mL)。試劑盒還可包含 醇藥簽。在一些實施方式中包括冷卻裝置例如冰袋、冷卻袋(cold pack)等，以保持尿冷卻 于約4°C (例如，2個尺寸為3英寸X2英寸X0.5英寸的冰袋)。另外的實施方式包括能容納以上所列組分的容器(例如，尺寸為6英寸高X6英寸寬X7英寸長的塑料盒)，任選地，還包括使用說明書。本發(fā)明以以下非限定性實施例進行更詳細(xì)的解釋。實施例1從尿中分離并鑒定祖細(xì)胞從22個男性和1個女性供體(15個健康個體和8個病人，年齡為2至50歲)中 收集58份人尿樣品。在任何培養(yǎng)物中均沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染。尿樣品在4°C于1500RPM離心 5分鐘，用無菌PBS洗滌兩次。使用梯度稀釋方法，將細(xì)胞以平均0. 5細(xì)胞/孔置于含有祖 細(xì)胞培養(yǎng)基的多孔板中。祖細(xì)胞培養(yǎng)基含有3/4DMEM、l/4Ham' s F12U0% FBS.O. 4mg/ml 氫化可的松、10_1QM，Chron毒素、5mg/ml胰島素、1. 2mg/ml腺嘌呤、2. 5mg/ml鐵傳遞蛋白加 0. 136mg/ml 3,39,5-三碘-L-甲腺原氨酸、10mg/ml EGF，、和青霉素-鏈霉素(Zhang 等人，In vitro Cell Dev. Biol. -Animal 37:419,2001)。鑒定單個細(xì)胞并允許其生長至 50%以上的匯合度。然后將細(xì)胞次培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移至6cm的培養(yǎng)皿并擴增。從約39%的源自尿樣品的培養(yǎng)物獲得原代細(xì)胞長出物。集落中的平均細(xì)胞數(shù)目 為在健康個體中在第二天為4. 5/100ml尿(表1和圖1)。細(xì)胞是小的、看起來亮的細(xì)胞， 基于我們的長期觀察經(jīng)驗，其最像是來自于膀胱粘膜的底層，是相對未分化的。從每個克隆 系中得到了一致的高產(chǎn)率的尿細(xì)胞。在含有祖細(xì)胞培養(yǎng)基和KSFM(1 1)的復(fù)合培養(yǎng)基中， 尿細(xì)胞的細(xì)胞倍增時間為31. 3小時。在6-cm培養(yǎng)皿中，尿細(xì)胞從單個細(xì)胞到達到匯合需 要10至12天(圖2)。表 1 為了證明尿細(xì)胞的分子和細(xì)胞特征，分析了祖細(xì)胞特異性和分化細(xì)胞特異性標(biāo) 記物的表達。第1、3和4代的尿細(xì)胞對包括下列的祖細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物染色均為陽 性C_kit、SSEA-4、CD105+、CD73+、CD90+、CD133+ 和 CD44+ ；對于 CD31\ CD34"和 CD45-染 色均為陰性(表2和圖3)。CD44被認(rèn)為是膀胱基底細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記物(Desai等人 (2000)Mod. Pathol. 13 :1315)。由于基底細(xì)胞具有自我更新的潛能并且可以增殖并分化成中間和表面細(xì)胞，所以基底細(xì)胞被稱作尿道上皮祖細(xì)胞或干細(xì)胞(Staack等人(2005) Differentiation 73 :121)。通過CD44和使用細(xì)胞角蛋白13 (其為基底細(xì)胞和中間細(xì)胞的 細(xì)胞內(nèi)蛋白標(biāo)記物)的免疫熒光確定了尿中的基底細(xì)胞(Romih，等人(2005)Cell Tissue Res. 320 259)。表2 看起來在尿中具有混合的細(xì)胞群體有祖細(xì)胞也有成熟細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)尿含有尿道上 皮祖細(xì)胞和平滑肌祖細(xì)胞。如上所示，用⑶標(biāo)記物確認(rèn)了這些細(xì)胞。另外，使用了尿道上 皮祖細(xì)胞標(biāo)記物和平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物以進一步鑒定這些細(xì)胞。在70%的細(xì)胞匯合度時使 用抗尿道上皮祖細(xì)胞特異性標(biāo)記物uroplakin Ia和細(xì)胞角蛋白7、13、17和19的單克隆抗 體，每個抗體按照以下稀釋使用抗-細(xì)胞角蛋白7，1 200 ；抗-細(xì)胞角蛋白13，1 100 ； 抗-細(xì)胞角蛋白17，1 100 ；和抗-細(xì)胞角蛋白19，1 100。確定了尿祖細(xì)胞中uroplakin 和所示細(xì)胞角蛋白的表達，并將其與培養(yǎng)的從常規(guī)活檢組織獲得的尿道上皮(Zhang等人 (2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907 ；Ludwikowski 等人(1999) BJU Int. 84 507 ；Sugasi 等 人(2000) J. Urol. 164:951 ；Zhang 等人(2001) In VitroCell Dev. Biol. Anim. 37 419)以 及正常人膀胱粘膜(Southgate等人，Lablnvestigation (1994) 71 583)中的標(biāo)記物表達相 比較。免疫熒光程度定義為從陰性(_)到強陽性(++++)。與從培養(yǎng)的組織活檢獲得的尿道 上皮相似，尿細(xì)胞表達uroplakin Ia和細(xì)胞角蛋白(CK) 7、13、17和19(圖3和表3)。表 3 此外，如免疫熒光所確定(圖4和表4)，與原始膀胱細(xì)胞相比，從尿獲得的細(xì)胞表 達平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物、a-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、結(jié)蛋白、肌球蛋白和調(diào)寧蛋白。表 4 實施例3 尿祖細(xì)胞的細(xì)胞收縮件和緊密連接通過用膠原柵格測定細(xì)胞收縮性而確定了源自尿的平滑肌細(xì)胞的功能特征。膠原 柵格收縮檢驗的方法在本領(lǐng)域是已知的(Kropp等人(1999) J.Urol. 162 :1779)。對激動劑 的收縮反應(yīng)以相似的方式進行，只是在柵格即將釋放前向無血清培養(yǎng)基中加入激動劑。所 測試的激動劑包括Ca-離子載體A23187 (1025M)和KC1。分析了源自尿的尿道上皮祖細(xì)胞的緊密連接。尿道上皮的屏障功能由頂膜斑和 細(xì)胞間緊密連接來維持。用常規(guī)方法例如電子顯微鏡研究了尿祖細(xì)胞內(nèi)的緊密連接組分 (Zhang 等人(2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907 ；Ludwikowski 等人(1999) BJU Int. 84 507 ；Sugasi 等人(2000) J. Urol. 164 951 ；Zhang 等人(2001) In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 37 419 ；Cross 等人(2005) Am. J. Physiol. Renal Physiol. 289 :F459)。實施例4 尿祖細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞為了確定上皮-間質(zhì)(stromal)細(xì)胞相互作用或細(xì)胞-細(xì)胞相互作用對尿祖細(xì) 胞分化為平滑肌細(xì)胞的作用(Staack等人(2005) Differentiation73 121 ；DiSandro等人(1998) J. Urol. 160 1040)，使用了兩種共培養(yǎng)方法。第一種是使用具有4. 5 y m尺寸排除的 跨孔(transwell)裝置進行間接共培養(yǎng)。將尿平滑肌祖細(xì)胞置于上部小室的孔中，將來自 組織活檢的膀胱平滑肌細(xì)胞和/或尿道上皮接種在跨孔單元底部的孔中(Luk等人(2005) J. Immunol. Methods 305 39 ；Gerstenfeld 等人(2003) Connect Tissue Res. 44 (±曾干丨J 1) 85)。第二種方法是直接的共培養(yǎng)方法，用0. 4 y m孔尺寸的跨孔插入物進行。跨孔用作基底 膜，其中在下側(cè)培養(yǎng)尿祖細(xì)胞，而在相對的上側(cè)培養(yǎng)正常人膀胱尿道上皮和平滑肌細(xì)胞(Le Visage等人92004) Tissue Eng. 10:1426)。然后通過在接種細(xì)胞后3、7、14和28天后的表 型外觀、分子分析和針對平滑肌蛋白表達的免疫組化染色來評價尿細(xì)胞。實施例5 接種尿祖細(xì)胞的支架評價了膀胱粘膜下層膜(BSM)和小腸粘膜下層(SIS)上的尿祖細(xì)胞的細(xì)胞粘附、 增殖和分化，以確定臨床應(yīng)用的細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。在體外接種細(xì)胞的構(gòu)建體中，在混合 培養(yǎng)基(KSFM DMEM, 1 1)得存在下，將源自尿祖細(xì)胞的尿道上皮接種在BSM粘膜一側(cè)， 將源自尿祖細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞接種在漿膜一側(cè)。接下來，將接種的基質(zhì)皮下移植到無胸腺小鼠內(nèi)。取回移植的工程化組織并通 過組織化學(xué)(H&E和Trichrom)、免疫組化(細(xì)胞角蛋白和平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物)、 western印跡分析和人X/Y染色體檢測檢驗(FISH)進行評價。對于組織化學(xué)和免疫組化 分析，使用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒐こ袒M織固定于10%中性緩沖的福爾馬林中，脫水，并包埋于石蠟 中。切取5毫米的部分并固定。進行常規(guī)的蘇木精伊紅(H&E)染色和Masson三重染色。使 用以下單克隆抗體進行免疫組化染色抗平滑肌細(xì)胞蛋白的單克隆抗體a -平滑肌肌動 蛋白(1 1000稀釋)、結(jié)蛋白(1 20)、調(diào)寧蛋白(1 50)和肌球蛋白(1 100)；以及抗 尿道上皮細(xì)胞特異性蛋白的單克隆抗體細(xì)胞角蛋白AE 1/AE3(1 100抗體稀釋)(Zhang 等人(2005) BJU Int. 96 1120 ；Zhang 等人(2003) Adv. Exp. Med. Biol. 539 907 ；Zhang 等 人(2000) J. Urol. 164 928 ；Zhang 等人(2006) BJUInt. 98 1100 ；Zhang 等人(2004) Tissue Eng. 10 181 ；Zhang 等人(2001) In VitroCell Dev. Biol. Anim. 37 419)。根據(jù)已知方法(Zhang等人(2005)BJU Int. 96 1120 ；Lin 等人(2004) J.Urol. 171 1348)用裂解緩沖液裂解細(xì)胞或接種細(xì)胞的支架組織而分離用于western印 跡分析的蛋白。小鼠抗-人a-平滑肌肌動蛋白、結(jié)蛋白、肌球蛋白和AE 1/AE3用作一抗， 過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgG用作二抗。通過商售的加強化學(xué)發(fā)光檢驗試劑盒檢測 蛋白條帶的存在。在移植后一個月用LacZ染色在移植物組織中觀察尿祖細(xì)胞。還通過人X/Y染色 體確認(rèn)了移植的細(xì)胞。有利地，在體內(nèi)支架中尿祖細(xì)胞形成多層尿道上皮細(xì)胞和平滑肌樣 組織結(jié)構(gòu)(圖5)。此外，移植后三個月未在移植物組織中發(fā)現(xiàn)腫瘤。因此這些數(shù)據(jù)提供了體外和體內(nèi)證據(jù)，其證明從尿中獲得的細(xì)胞可以作為膀胱組 織工程的來源。尿祖細(xì)胞是容易獲得的，并且已經(jīng)表明它們在體外增殖并分化成尿道上皮 和平滑肌。源自尿祖細(xì)胞的膀胱細(xì)胞顯示出尿道上皮和平滑肌樣的表型，包括分別表達尿 道上皮和平滑肌特異性蛋白。膠原基質(zhì)支持尿祖細(xì)胞的三維生長，這對于膀胱重建是基本 的需要。體內(nèi)接種尿祖細(xì)胞的支架為膀胱重建提供了具有成本有效性的方法。以上是本發(fā)明的示例，不應(yīng)被理解為其限制。本發(fā)明通過以下權(quán)利要求限定，其中 包括權(quán)利要求的等同物。
權(quán)利要求
一種產(chǎn)生尿祖細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，包括提供尿樣品；和然后從所述尿樣品中分離尿祖細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述分離步驟通過以下進行(a)從尿樣品中收集細(xì)胞以提供粗制細(xì)胞樣品；和(b)從所述粗制細(xì)胞樣品中選擇尿祖細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述收集步驟通過所述尿樣品的離心而進行。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過將所述細(xì)胞平板接種于含有選 擇性細(xì)胞培養(yǎng)基的組合物中而進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過基于形態(tài)學(xué)選擇感興趣的細(xì)胞 而進行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過選擇對尿祖細(xì)胞特異性的標(biāo)記 物而進行。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述選擇步驟通過選擇對尿祖細(xì)胞特異性的標(biāo)記 物而進行，其中所述選擇標(biāo)記物通過FACS進行。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其中所述標(biāo)記物選自C-kit(⑶117)、SSEA-4、 CD105、CD73、CD90、CD133 和 CD44。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述尿祖細(xì)胞來自哺乳動物對象。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9所述的方法制備的分離的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，還包括以下步驟使所述尿祖細(xì)胞分化成 至少一種選自下列的細(xì)胞尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。
12.—種分離的尿祖細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是c-kit陽性的，且其中所述細(xì)胞可以分化成 兩種或兩種以上選自下列的譜系尿道上皮、平滑肌、內(nèi)皮和間質(zhì)細(xì)胞。
13.一種提供接種的組織支架的方法，所述方法包括以下步驟 提供權(quán)利要求10所述的分離的尿祖細(xì)胞；使所述尿祖細(xì)胞分化成至少一種選自下列的細(xì)胞尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，從而 產(chǎn)生分化的細(xì)胞；和將所述分化的細(xì)胞接種在生物可降解組織支架上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述組織支架包含膠原基質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述組織支架包含合成聚合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述組織支架包含選自下列的合成聚合物聚 羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。
17.一種包含生物可降解組織支架和尿祖細(xì)胞的接種的組織支架。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的接種的組織支架，其中所述尿祖細(xì)胞是分化的或未分化的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的接種的組織支架，其中所述尿祖細(xì)胞分化為選自下列的細(xì) 胞尿道上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的接種的組織支架，其中所述生物可降解組織 支架包含膠原基質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的接種的組織支架，其中所述生物可降解組織 支架包含合成聚合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項所述的接種的組織支架，其中所述生物可降解組織 支架包含選自下列的合成聚合物聚羥基乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-羥基乙酸的 共聚物(PLGA)。
23.一種治療有需要的對象的方法，所述方法包括以下步驟 提供膀胱組織基底，其中所述基底包含尿祖細(xì)胞；使所述尿祖細(xì)胞分化成至少一種選自下列的細(xì)胞尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，從而 產(chǎn)生分化的細(xì)胞；將所述分化的細(xì)胞接種在生物相容性基底上；和 將所述基底移植入所述病人。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述基底包含膠原基質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述基底包含合成聚合物。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述基底包含選自下列的合成聚合物聚羥基 乙酸(PGA)、聚乳酸(PLA)以及乳酸-羥基乙酸的共聚物(PLGA)。
27.—種試劑盒，包含用于運輸尿樣品的合適的容器； 培養(yǎng)基；一種或多種抗生素；用于容納所述容器、培養(yǎng)基和抗生素的包裝體；和 任選地，使用說明書。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，還包括冷卻裝置。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的試劑盒，還包括醇藥簽。
30.根據(jù)權(quán)利要求27、28或29所述的試劑盒，其中所述容器是無菌的。
全文摘要
本發(fā)明提供尿祖細(xì)胞和從尿樣品中產(chǎn)生尿祖細(xì)胞培養(yǎng)物的方法?？梢曰谑褂眠x擇性培養(yǎng)基、基于形態(tài)學(xué)和/或通過選擇細(xì)胞特異性標(biāo)記物而選擇細(xì)胞。還提供了分離的尿祖細(xì)胞，其為c-kit陽性的，并且可分化成尿道上皮、平滑肌、內(nèi)皮或間質(zhì)細(xì)胞。提供了使用尿祖細(xì)胞的方法，其中提供了接種細(xì)胞的組織支架。還提供了治療有需要的對象的方法，包括提供含有分化的UPC的膀胱組織基底和將基底移植入病人。最后，提供了試劑盒，其包含適合用于尿樣品運輸?shù)娜萜?；培養(yǎng)基；一種或多種抗生素；容納所述容器、培養(yǎng)基和抗生素的包裝體；以及任選地，使用說明書。
文檔編號C12N5/074GK101842105SQ200880025335
公開日2010年9月22日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日
發(fā)明者A·阿塔拉, 張元原 申請人:韋克福里斯特大學(xué)健康科學(xué)院