專利名稱：：用于生物活性肽表達和純化的可溶性標記的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及來自微生物細胞的蛋白質(zhì)表達和純化領域。更具體地講，提供一個小肽標記家族用于生成不溶解的融合蛋白。
背景技術：
：生物活性蛋白和肽的有效生產(chǎn)已經(jīng)成為生物醫(yī)學和工業(yè)化生物醫(yī)學行業(yè)的一個特征。將生物活性肽和蛋白用作治療劑用于多種疾病，舉例來說，如糖尿病(胰島素)、病毒感染和白血病(干擾素)、免疫系統(tǒng)疾病(白介素)和血紅細胞缺乏癥(促紅細胞生成素)。此外，需要大量蛋白或肽用于多種工業(yè)應用，包括例如紙漿和紙以及紙漿工業(yè)、紡織物、食品工業(yè)、個人護理和化妝品工業(yè)、糖精煉、廢水處理、酒精飲料生產(chǎn)、以及用作新藥生產(chǎn)的催化劑。隨著組合肽篩選技術的發(fā)現(xiàn)和應用，如細菌展示技術(Kemp，D.J.；Proc.Natl.Acad.Sci.USA78(7)4520-4524(1981)；酵母展示技術(Chien等人，ProcNatlAcadSciUSA88(21):9578-82(1991))、組合固相肽合成技術(美國專利公開5，449，754;美國專利公開5，480，971；美國專利公開5，585，275和美國專利公開5，639，603)、噬菌體展示技術(美國專利公開5，223，409；美國專利公開5，403，484；美國專利公開5，571，698；和美國專利公開5，837，500)、核糖體展示技術(美國專利公開5，643，768；美國專利公開5，658，754；和美國專利公開7，074，557)、以及mRNA展示技術(PROFUSION；美國專利公開6，258，558；美國專利公開6，518，018；美國專利公開6，281，344；美國專利公開6，214，553；美國專利公開6，261，804；美國專利公開6，207，446；美國專利公開6，846，655；美國專利公開6，312，927；美國專禾Ij公開6，602，685；美國專利公開6，416，950；美國專利公開6，429，300；美國專利公開7，078，197；和美國專利公開6，436，665)，已經(jīng)開發(fā)出具有特異性結(jié)合親和力的肽的新應用。具體地講，在生物醫(yī)學領域中將肽視為用于把診斷劑和藥劑連接到表面上的接頭(參見Grinstaff等人，美國專利公開申請公布2003/0185870和Linter，美國專利公開6，620，419)，以及在個人護理工業(yè)中將肽用于把有益劑連接到身體表面如毛發(fā)和皮膚上(參見共有的美國專利公開申請10/935642，和Janssen等人，美國專利公開申請公布2003/0152976)，和在印刷工業(yè)中將肽用于把色素連接到印刷介質(zhì)上(參見共有的美國專利公開申請10/935254)。在一些實例中，可以從天然資源中合成或分離商業(yè)上有用的蛋白和肽。然而，這些方法常常是昂貴的、耗時的并且特征在于生產(chǎn)能力有限。蛋白和肽生產(chǎn)的優(yōu)選方法是通過發(fā)酵重組構(gòu)建生物體，工程化以過表達目的蛋白或肽。雖然比合成或分離方法更優(yōu)選，但要想成為高性價比的生產(chǎn)方法，肽的重組表達仍有許多障礙需要被克服。例如，細胞環(huán)境中產(chǎn)生的肽(尤其是短肽)易于受天然細胞蛋白酶的作用而發(fā)生降解。此外，取決于目的蛋白或肽的特性，純化可能是困難的，從而導致產(chǎn)量較低?！N克服上述困難的方法是使用遺傳嵌合體用于蛋白和肽的表達。嵌合蛋白或“融合蛋白”是包含至少一部分所需蛋白產(chǎn)物的多肽，該蛋白產(chǎn)物融合到至少一個包含肽標記的部分上。所述肽標記可用于幫助蛋白折疊、幫助表達后純化、保護蛋白不受降解酶的作用和/或幫助蛋白通過細胞膜。在許多實例中，以不溶形式表達蛋白或肽是有用的，尤其是當目的肽相當短、正常情況下可溶解和/或在宿主細胞中易受蛋白水解降解時。以不溶形式生產(chǎn)的肽有利于回收和防止肽發(fā)生不期望的蛋白水解降解。一種生產(chǎn)不溶形式的肽的方法是重組生產(chǎn)作為不溶解融合蛋白的部分的肽，該方法通過在融合構(gòu)建體中包括至少一個誘導包含體形成的肽標記(即，一個包含體標記)。通常將融合蛋白設計成包括至少一個可裂解的肽接頭，以便目的肽可隨后從融合蛋白中回收?？蓪⑷诤系鞍自O計成包括多個包含體標記、可裂解的肽接頭、以及編碼目的肽的區(qū)域。包含有利于不溶性蛋白表達的肽標記的融合蛋白是本領域熟知的。通常，嵌合蛋白或融合蛋白的標記部分較大，這增加了融合蛋白不溶解的可能性。通常使用的較大的肽的實例包括但不限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Dykes等人，Eur.J.Biochem.,174411(1988)、β-半乳醣苷酶(Schellenberger等人，Int.J.P印tideProteinRes.,41326(1993)；Shen等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA2814627(1984)；andKempe等人，Gene，39:239(1985))、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Ray等人，Bio/Technology，1164(1993)和Hancock等人(W094/04688))、L-核酮糖激酶的N末端(美國專利公開5，206，154和Lai等人，Antimicrob.Agents&Chemo.，371614(1993)、噬菌體T4gp55蛋白(Gramm等人，Bio/Technology,121017(1994)、細菌酮類固醇異構(gòu)酶蛋白(Kuliopulos等人，J.Am.Chem.Soc.1164599(1994)、泛素(Pilon等人，Biotechnol.Prog.，13:374_79(1997)、牛凝乳酶原(Haught等人，Biotechnol.Bioengineer.57:55-61(1998)和殺菌性/通透性增加蛋白(“BPI”;Better，M.D.和Gavit，PD.，美國專利公開6，242，219)。本領域有很多此技術的具體實例，參見例如US6，613，548，它描述蛋白質(zhì)標記的融合蛋白和可溶性蛋白以及后來從細胞溶解產(chǎn)物的純化；US6,037,145，它教導了一種保護表達的嵌合蛋白不受特異性蛋白酶作用的標記；參見美國專利公開5，648，244，它教導合成具有標記和可裂解的接頭使得所需蛋白易于純化的融合蛋白；并且參見美國專利公開5，215，896;美國專利公開5，302，526；美國專利公開5，330，902；以及美國專利公開申請公布2005/221444，它描述了包含氨基酸組合物的融合標記，該氨基酸組合物經(jīng)特定設計用于增加嵌合蛋白或肽的不溶性。最近已經(jīng)從玉米蛋白(共有的美國專利公開申請11/641936)、胡蘿卜半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)(共有的美國專利公開申請11/641273)和來自秀麗廣桿線蟲的淀粉樣假定蛋白(共有的美國專利公開申請11/516362)中開發(fā)出了更短的包含體標記。短包含體標記的使用增加了在重組宿主細胞中產(chǎn)生的靶肽的產(chǎn)量。需要解決的問題是提供在制備包含目的肽的融合蛋白中有效的可溶性標記。發(fā)明概述通過發(fā)現(xiàn)一組結(jié)構(gòu)上相似的短包含體標記(IBT)已經(jīng)解決了所述問題，該短包含體標記用于合成增加短肽(“目的肽”)表達并簡化其純化的融合蛋白。本發(fā)明涉及一組可被連接至目的肽上的肽包含體標記，表達所述標記有利于表達的肽的不溶性以及隨后的回收。因此，本發(fā)明提供一種包含體標記，所述包含體標記包含以下結(jié)構(gòu)Gln-Gln-Xaal-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln-間隔區(qū)-[[Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln]-[間隔區(qū)]m]n其中Xaal=Arg、His、或Lys；Xaa2=Gln>His>^Lys；Xaa3=Gln、His^Lys;Xaa4=Glu或Gln；Xaa5=Gln或Lys；η=1至10；m=n-l;并且其中所述間隔區(qū)是包含選自脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的氨基酸的肽。在另一個實施方案中，本包含體標記包含至少兩拷貝的核心序列(Gln-Gln-Xaal-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln；SEQIDNO:58)，其中Xaal=Arg,His、或Lys；Xaa2=Gin、His、或Lys；Xaa3=Gin、His、或Lys；Xaa4=Glu或Gln；和Xaa5=Gln和Lys；其中所述核心序列被至少一個上文定義的間隔區(qū)分隔。在另一個實施方案中，包含體標記還包含至少一個可交聯(lián)的四半胱氨酸部分(CCPGCC；SEQIDNO:33)。在另一個實施方案中，可交聯(lián)的半胱氨酸部分位于上文定義的包含體標記的氨基和/或羧基末端。在另一個實施方案中，包含體標記選自IBT103(SEQIDNO:15)、IBT138(SEQIDN0:19)、IBT139(SEQIDNO:21)、IBT139.CCPGCC(SEQIDN031)；IBT139(5C)(SEQIDNO265)；IBT182(SEQIDNO:39)、IBT183(SEQIDNO:41)、IBT184(SEQIDNO:43)、IBT185(SEQIDN0:45)、IBT186(SEQIDNO:27)、IBT187a(SEQIDNO47)和IBT187b(SEQIDNO49)。在另一個實施方案中，提供的不溶性融合肽包含本包含體標記(IBT)，它被可操作地連接至目的肽(POI)并被至少一個可裂解的肽連接序列(CS)分隔。在另一個實施方案中，目的肽選自毛發(fā)結(jié)合肽、指/趾甲結(jié)合肽、皮膚結(jié)合肽、牙齒結(jié)合肽、聚合物結(jié)合肽、粘土結(jié)合肽、抗微生物肽、色素結(jié)合肽和纖維素結(jié)合肽。在另一個實施方案中，目的肽是多重嵌段肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于表達不溶形式的目的肽的方法，所述方法包括a)合成編碼融合肽的遺傳構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼本發(fā)明的包含體標記的第一部分，它被可操作地連接至編碼目的肽的第二部分；b)用(a)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化表達宿主細胞；c)在表達遺傳構(gòu)建體并以不溶形式產(chǎn)生編碼的融合肽的條件下使(b)中轉(zhuǎn)化過的宿主細胞生長；和d)以所述不溶形式回收所述融合肽。在另一個實施方案中，提供了生產(chǎn)目的肽的方法，所述方法包括a)合成編碼融合肽的遺傳構(gòu)建體，所述融合肽包含本發(fā)明包含體標記的第一部分，它被可操作地連接至包含目的肽的第二部分；其中所述第一部分和所述第二部分被至少一個可裂解的肽接頭分隔；b)用(a)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化表達宿主細胞；c)在表達遺傳構(gòu)建體并以不溶形式產(chǎn)生編碼的融合肽的條件下使(b)中轉(zhuǎn)化過的宿主細胞生長；d)以所述不溶形式回收所述融合肽。e)裂解所述至少一個可裂解的肽接頭，由此所述融合肽的第一部分不再與所述第二部分融合；和f)回收所述目的肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種編碼融合蛋白的嵌合遺傳構(gòu)建體，所述融合蛋白包含至少一個本發(fā)明的包含體標記和至少一個目的肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明嵌合遺傳構(gòu)建體的表達載體和微生物宿主細胞。附圖簡述圖1是若干個本發(fā)明包含體標記的CLUSTALW比對。代表核心序列的區(qū)域用下劃線示出。圖2是表達質(zhì)粒pLX121的圖表。pLX121的構(gòu)建描述于美國專利公開申請11/516362；以引用方式并入本文。圖3是表達質(zhì)粒pSF032的圖表。圖4是表達質(zhì)粒pLR186的圖表。圖5是表達質(zhì)粒pSF043的圖表。生物序列簡述下面的序列遵循37C.F.R.§1.821-1.825(“對包含核苷酸序列和/或氨基酸序列公開內(nèi)容的專利申請的要求-序列規(guī)則”("RequirementsforPatentApplicationsContainingNuceotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules”))，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WorldIntellectualPropertyOrganization)(WIPO)ST.25標準(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)以及行政指令(AdministrativeInstructions)的208節(jié)和附錄C)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的規(guī)則。SEQIDNO1是質(zhì)粒pLX121的核苷酸序列。SEQIDNO2是質(zhì)粒pSF032的核苷酸序列。SEQIDNO3毛發(fā)結(jié)合肽A09的氨基酸序列。SEQIDNO4毛發(fā)結(jié)合肽KFll的氨基酸序列。SEQIDN0:5毛發(fā)結(jié)合肽D21，的氨基酸序列。SEQIDNO6是編碼HC77607的核酸序列。SEQIDNO:7是HC77607的氨基酸序列。SEQIDNO8是編碼HC77638的核酸序列。SEQIDNO:9是HC77638的氨基酸序列。SEQIDNO10是編碼HC77643的核酸序列。SEQIDNQ:11是HC77643的氨基酸序列。SEQIDNO12是編碼HC77681的核酸序列。SEQIDNO:13是HC77681的氨基酸序列。SEQIDNO14是編碼IBT103的核酸序列。SEQIDNO15是IBT103的氨基酸序列。SEQIDNO16是編碼IBT136的核酸序列。SEQIDNO17是IBT136的氨基酸序列，并且P11-II肽描述于Aggeli等人(PNAS98(21)11857-11862(2001)。SEQIDNO18是編碼IBT138的核酸序列。SEQIDNO19是IBT138的氨基酸序列。SEQIDNO20是編碼IBT139的核酸序列。SEQIDNO:21是IBT139的氨基酸序列。SEQIDNO22是編碼HC776124的核酸序列。SEQIDNO23是HC776124的氨基酸序列。SEQIDNO24是編碼融合肽IBT139.HC776124的核酸序列。SEQIDNO25是IBT139.HC776124的氨基酸序列。SEQIDNO26是編碼IBT186的核酸序列。SEQIDNO27是IBT186的氨基酸序列。SEQIDNO28是編碼融合肽IBT186.HC776124的核酸序列。SEQIDNO29是IBT186.HC776124的氨基酸序列。SEQIDNO30是編碼IBT139.CCPGCC的核酸序列。SEQIDNO:31是IBT139.CCPGCC的氨基酸序列。SEQIDNO32是編碼可交聯(lián)的半胱氨酸部分CCPGCC的核酸序列。SEQIDNO33是可交聯(lián)的半胱氨酸部分CCPGCC的氨基酸序列。SEQIDNO34至35是用于制備IBT139.CCPGCC的寡核苷酸的核酸序列。SEQIDNO36是融合肽IBT139.CCPGCC.HC776124的核酸序列。SEQIDNO37是融合肽IBT139.CCPGCC.HC776124的氨基酸序列。SEQIDNO38是編碼IBT182的核酸序列。SEQIDNO39是IBT182的氨基酸序列。SEQIDNO40是編碼IBT183的核酸序列。SEQIDNO41是IBT183的氨基酸序列。SEQIDNO42是編碼IBT184的核酸序列SEQIDNO43是IBT184的氨基酸序列。SEQIDNO44是編碼IBT185的核酸序列SEQIDNO45是IBT185的氨基酸序列。SEQIDNO46是編碼IBT187a的核酸序列.SEQIDNO47是IBT187a的氨基酸序列。SEQIDNO48是編碼IBT187b的核酸序列SEQIDNO49是IBT187b的氨基酸序列。SEQIDNO50是質(zhì)粒pSF043的核酸序列。SEQIDNO51是質(zhì)粒pLR186的核酸序列。SEQIDNO:52是KSI(C4)的核酸序列。SEQIDNO:53是KSI(C4)的氨基酸序列。SEQIDNO54是編碼融合肽KSI(C4)-HC7643的核酸序列。SEQIDNO55是融合肽KSI(C4)-HC77643的氨基酸序列。SEQIDNO56至57是用于本發(fā)明包含體標記的間隔區(qū)的氨基酸序列。SEQIDNO:58是存在于本發(fā)明包含體標記中的核心序列的氨基酸序列。SEQIDNO59至147是毛發(fā)結(jié)合肽的氨基酸序列。SEQIDNO148-155是皮膚結(jié)合肽的氨基酸序列。SEQIDN0:156-157是指/趾甲結(jié)合肽的氨基酸序列。SEQIDNO:158-186是抗微生物肽的氨基酸序列。SEQIDNO:187至211是色素結(jié)合肽的氨基酸序列。具體地講，SEQIDNO187至190結(jié)合炭黑，SEQIDNO191至199結(jié)合CROMOPHTAL黃(CibaSpecialtyChemicals,Basel,Switzerland)，SEQIDNO200至202結(jié)合SUNFAST品紅(SunChemicalCorp.，Parsippany,NJ)，以及SEQIDNO203至211結(jié)合SUNFAST藍。SEQIDNO212至217是纖維素結(jié)合肽。SEQIDN0:218-244是聚合物結(jié)合肽的氨基酸序列。具體地講，SEQIDNO:218結(jié)合聚對苯二甲酸乙二酯(PET)，SEQIDNO:219至229結(jié)合聚異丁烯酸甲酯，SEQIDNO230至235結(jié)合尼龍，以及SEQIDNO236至244結(jié)合聚(四氟乙烯)。SEQIDN0:245-260是粘土結(jié)合肽的氨基酸序列。SEQIDNO261是半胱天冬酶_3裂解序列的氨基酸序列。SEQIDNO:262是本發(fā)明優(yōu)選的包含一個間隔區(qū)的包含體標記的氨基酸序列。SEQIDNO263是質(zhì)粒pLR435的核酸序列。SEQIDNO:264是編碼包含體標記IBT139(5C)的核酸序列。SEQIDNO:265是包含體標記IBT139(5C)的氨基酸序列。SEQIDNO266是編碼融合肽IBT139(5C).HC776124的核酸序列。SEQIDNO267是融合肽IBT139(5C).HC776124的氨基酸序列。SEQIDNO:268至307是牙齒結(jié)合肽的氨基酸序列(美國專利公開申請11/877，692)。發(fā)明詳述本發(fā)明描述一組能夠與目的肽一起形成融合肽的肽標記(包含體標記)。如此裝配的融合肽以不溶形式表達并且在表達宿主細胞中的包含體內(nèi)積累。將包含體回收并隨后裂解以從包含體標記中分離目的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白包含至少一個可裂解的肽接頭，它分隔包含體標記與目的肽。在另一個優(yōu)選的實施方案中，可裂解的肽接頭包含至少一個酸裂解天冬氨酸_脯氨酸部分。在另一個實施方案中，包含體標記包含有效數(shù)目的可交聯(lián)的半胱氨酸殘基，在后續(xù)加工中用于分隔包含體標記與目的肽。在另一個實施方案中，包含體標記包含至少一個可交聯(lián)的半胱氨酸部分CCPGCC(SEQIDNO:33)，它在IBT的氨基和/或羧基末端。本發(fā)明用于表達和回收重組表達的任何生物活性肽和蛋白。此類蛋白通常在許多應用中具有高價值，所述應用包括但不限于醫(yī)療、生物醫(yī)學、診斷、個人護理和親和力應用，其中將目的肽用作對多種表面的接頭。以下定義用于本文中并且應為解釋權(quán)利要求和說明書提供參考。除非另外指明，本文引用的所有美國專利公開和美國專利公開申請全文以引用方式并入本文。如本文所用，術語“包含”是指如權(quán)利要求中提及的所述特征、整數(shù)、步驟或成分的存在，但它不預先排除一種或多種其他特征、整數(shù)、步驟、成分或其組的存在或添加。如本文所用，術語“約，，是指本發(fā)明的成分或反應物的數(shù)量變化，或用于是指數(shù)字數(shù)量的變化，它們可能發(fā)生在，例如，典型的測量和用于制備濃縮液或?qū)嶋H使用溶液的液體處理程序中；這些程序中的偶然誤差中；制造、來源、或用于制備組合物或?qū)嵤┓椒ǖ某煞值募兌鹊牟町愔?；等。術語“約”還包括由于對于起因于特定起始混合物的組合物的不同平衡條件而不同的量。無論是否通過術語“約”來修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。如本文所用，術語“分離的核酸分子”是指RNA或DNA的聚合物，它是單鏈或雙鏈的，任選地包含合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸分子可由cDNA、基因組DNA或合成DNA的一個或多個區(qū)段構(gòu)成。如本文所用，術語“色素”是指一種不溶性的、有機的或無機的著色劑。如本文所用，術語“毛發(fā)”是指人的毛發(fā)、眉毛和睫毛。如本文所用，術語“皮膚”是指人類皮膚、或人類皮膚的替代品，如豬皮、VITROSKIN和EPIDERM.Skin，如本文所用，將指一般包括一層上皮細胞和可附加地包括一層內(nèi)皮細胞的身體表面。如本文所用，術語“指/趾甲”是指人的指甲和趾甲。如本文所用，術語“TBP”是指牙齒結(jié)合肽。牙齒結(jié)合肽是與哺乳動物或人類牙齒表面具有高親和力的肽。如本文所用，術語“牙齒結(jié)合肽”將指結(jié)合到牙釉或牙膜上的肽。在一個實施方案中，牙齒結(jié)合肽的長度為約7個氨基酸至約50個氨基酸，更優(yōu)選約7個氨基酸至約25個氨基酸，最優(yōu)選地約7個至約20個氨基酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，牙齒結(jié)合肽是組合生成的肽。在共同未決的和共有的美國專利申請11/877,692中已經(jīng)公開了牙齒結(jié)合肽的實例。在一個優(yōu)選的實施方案中，牙齒結(jié)合肽選自SEQIDN0:268至307。術語“牙齒表面”是指由牙釉(通常在專業(yè)的清潔或打磨后暴露出來)或牙膜(包括唾液糖蛋白的獲得性表面)構(gòu)成的表面。可以用唾液糖蛋白涂覆羥基磷灰石以模擬天然牙膜表面(牙釉主要由羥基磷灰石構(gòu)成)。如本文所用，術語“薄膜”或“牙膜”來源于唾液糖蛋白的薄膜(通常約Iym至約200μm厚)，唾液糖蛋白在牙冠表面上形成。日常的刷牙趨于僅僅移除一部分牙膜表面，然而研磨清潔牙齒和/或打磨(通常由職業(yè)牙醫(yī)進行)將使更多的牙釉表面暴露出來。如本文所用，術語“釉質(zhì)”和“牙釉”是指形成牙齒外層的高度礦化的組織。釉質(zhì)層主要由結(jié)晶磷酸鈣(即羥基磷灰石；Ca5(PO4)3OH)與水和一些有機材料構(gòu)成。在一個實施方案中，牙齒表面選自牙釉和牙膜。如本文所用，術語“PBP”是指聚合物結(jié)合肽。如本文所用，術語“聚合物結(jié)合肽”指與特定聚合物(美國專利公開申請11/516362)具有高親和力的肽序列。實例包括結(jié)合到聚對苯二甲酸乙二酯(SEQIDNO:218)、聚異丁烯酸甲酯(SEQIDNO:219至229)、尼龍(SEQIDNO230至235)和聚四氟乙烯(SEQIDNO236至244)上的肽。如本文所用，術語“HBP”是指毛發(fā)結(jié)合肽。如本文所用，術語“毛發(fā)結(jié)合肽”是指與毛發(fā)具有高親和力的肽序列。毛發(fā)結(jié)合肽可由單個毛發(fā)結(jié)合結(jié)構(gòu)域或多個結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中至少一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合到毛發(fā)上(即多重嵌段肽)。已經(jīng)報道了毛發(fā)結(jié)合肽的實例(美國專利公開申請11/074473，Huang等人；WO0179479；美國專利公開申請公布2002/0098524，Murray等人Janssen等人，美國專利公開申請公布2003/0152976，Janssen等人；WO2004048399；美國專利申請11/512910，和美國專利公開申請11/696380)。提供了毛發(fā)結(jié)合肽的實例如下SEQIDNO3至5、7、9、11、13、23和59至147。如本文所用，術語“SBP”是指皮膚結(jié)合肽。如本文所用，術語“皮膚結(jié)合肽”指與皮膚具有高親和力的肽序列。已經(jīng)報道了皮膚結(jié)合肽的實例(美國專利公開申請11/069858，Buseman-Williams；Rothe等人，WO2004/000257；和美國專利公開申請11/696380)。如本文所用，作為身體表面的皮膚將一般包括一層上皮細胞并可附加的包括一層內(nèi)皮細胞。提供了皮膚結(jié)合肽的實例如下=SEQIDNO148至155。如本文所用，術語“NBP，，是指指/趾甲結(jié)合肽。如本文所用，術語“指/趾甲結(jié)合肽”指與指/趾甲具有高親和力的肽序列。已經(jīng)報道了指/趾甲結(jié)合肽的實例(美國專利公開申請11/696380)。提供了指/趾甲結(jié)合肽的實例如下SEQIDN0:156至157。如本文所用，“抗微生物肽”是指具有殺死微生物細胞群體能力的肽(美國專利公開申請11/516362)。提供了抗微生物肽的實例如下SEQIDN0:158至186。如本文所用，“纖維素結(jié)合肽”是指與纖維素具有高親和力的肽。提供了纖維素結(jié)合肽的實例如下=SEQIDNO212至217。如本文所用，“粘土結(jié)合肽”是指與粘土(美國專利公開申請11/696380)具有高親和力的肽。提供了粘土結(jié)合肽的實例如下SEQIDN0:245至260。如本文所用，“多重嵌段肽”是指包括至少兩個結(jié)合部分的肽。每個結(jié)合部分具有對底物靶的親和力(例如毛發(fā)、皮膚、色素等)。結(jié)合部分可具有對相同或不同底物的親和力(例如，融合到色素結(jié)合部分上的毛發(fā)結(jié)合部分用于靶向遞送色素至毛發(fā)上或具有多個毛發(fā)結(jié)合部分的肽上)。如本文所用，術語“包含體標記”將被縮寫為“IBT”并將指當融合到目的肽上時有利于包含體形成的多肽。當目的肽不與包含體標記融合時，它在宿主細胞和/或宿主細胞溶解產(chǎn)物中通常是可溶的。將目的肽融合到包含體標記上產(chǎn)生融合蛋白，該融合蛋白在宿主細胞中附聚成胞內(nèi)體(包含體)。如本文所用，術語“間隔區(qū)”將指一種在本發(fā)明包含體中的肽，它用于分隔核心序列(SEQIDN0:58)。在一個實施方案中，間隔區(qū)的長度為2至10個氨基酸，優(yōu)選地3至6個氨基酸，最優(yōu)選地3至4個氨基酸，并且由選自脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸和谷氨酸的氨基酸構(gòu)成。在一個實施方案中，所述間隔區(qū)選自Pr0-Arg-Gly、Pr0-Cys-Gly、Pro-Arg-Cys-Gly(SEQIDNO:56)、Pro-Glu-Gly和Pro-Glu-Cys-Gly(SEQIDNO:57)。如本文所用，“可裂解的接頭元件”、“肽接頭”、“可裂解的肽接頭”和“裂解位點”將被互換使用，并將指位于包含體標記和目的肽之間的可裂解的肽片段。在將所述包含體從細胞溶解產(chǎn)物中分離和/或部分純化或純化后，能把所述可裂解的接頭元件化學裂解和/或酶裂解以從目的肽中分離包含體標記。融合肽也可包括多個編碼一個或多個目的肽的區(qū)域，它們由一個或多個可裂解的肽接頭分隔。如必要的話，然后能從包含體中分離目的肽。在一個實施方案中，包含體標記和目的肽在限定的培養(yǎng)基(通常是含水培養(yǎng)基)中表現(xiàn)出不同的可溶性，這有利于從目的多肽中分離包含體標記。在一個優(yōu)選的實施方案中，包含體標記在水溶液中是不溶的，然而目的蛋白/多肽微溶于水溶液?？蓪⑺芤旱膒H、溫度和/或離子強度調(diào)節(jié)至有利于回收目的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，在PH5至10，溫度介于15°C至50°C之間的水溶液中，包含體標記和目的肽之間的溶解度不同。可裂解的肽接頭的長度可以是1至約50個氨基酸，優(yōu)選地1至約20個氨基酸。提供了酶裂解的肽接頭的實例SEQIDNO261(半胱天冬酶-3裂解序列)。在一個優(yōu)選的實施方案中，裂解位點是酸裂解的天冬氨酸-脯氨酸二肽(D-P)部分?？墒褂帽绢I域熟知的多種技術將可裂解的肽接頭摻入融合蛋白。在另一個實施方案中，本發(fā)明的包含體標記包含有效數(shù)目的可交聯(lián)的半胱氨酸殘基，由此一旦IBT從POI中裂解，可使用氧化交聯(lián)選擇沉淀IBT。如本文所用，術語“有效數(shù)目的半胱氨酸殘基”和“有效數(shù)目的可交聯(lián)半胱氨酸殘基”用于描述當IBT在氧化條件下獲取氧化交聯(lián)所需的半胱氨酸殘基的數(shù)目。本領域的技術人員將認識到氧化交聯(lián)對從POI中選擇性沉淀IBT(在融合肽裂解后)的用途將需要缺乏半胱氨酸殘基的Ρ0Ι。本領域的技術人員可改變?nèi)诤想闹邪腚装彼釟埢臄?shù)目和/或位置來實踐本發(fā)明的方法。在一個實施方案中，半胱氨酸殘基的有效數(shù)目是至少3，優(yōu)選地至少4。在另一個實施方案中，半胱氨酸殘基的有效數(shù)目是3至20，優(yōu)選地3至10，更優(yōu)選地4至約6，最優(yōu)選地4或5個可交聯(lián)的半胱氨酸殘基。如本文所用，術語“交聯(lián)”、“氧化交聯(lián)”和“半胱氨酸交聯(lián)”是指半胱氨酸殘基的硫醇基在氧化條件下的交聯(lián)過程(即形成分子間的和分子內(nèi)的二硫鍵)。根據(jù)定義，在包含有效數(shù)目的交聯(lián)半胱氨酸殘基的兩個或更多個分子間(即“多個”)形成分子間二硫鍵。如本文所用，“多個”分子本文將可供選擇地指分子“群體”。為了啟動分子間交聯(lián)，將有效數(shù)目(即至少3個)的交聯(lián)半胱氨酸殘基摻入包含體標記，前提條件是包含POI的部分缺乏可交聯(lián)的半胱氨酸殘基。在一個優(yōu)選的實施方案中，將可交聯(lián)的半胱氨酸殘基工程化進入包含體標記以便目的肽(它不包含可交聯(lián)的半胱氨酸殘基)以可溶性肽的形式從不溶性交聯(lián)包含體標記中分離。如本文所用，術語“氧化條件”是指有利于并促進半胱氨酸殘基間二硫鍵形成的反應條件。二硫鍵形成能通過本領域熟知的多種方法進行誘導，包括但不限于使可交聯(lián)的半胱氨酸殘基接觸含氧氣體(即二原子氧和/或臭氧)和/或加入化學氧化劑。優(yōu)選使用含分子氧的氣體。在另一個實施方案中，將含二原子氧和/或臭氧的氣體吹送和/或噴射通過反應溶液一定時間以完成有效的氧化交聯(lián)。氧化交聯(lián)步驟可任選地包括混合和/或攪拌反應溶液的操作以獲得最佳效果?；瘜W氧化劑的實例是本領域熟知的，可包括但不限于過氧化物化合物、次氯酸鹽、商素和高錳酸鹽；舉例來說。如本文所用，術語“還原條件”是指有利于并促進半胱氨酸殘基間二硫鍵還原的反應條件(即打斷用于交聯(lián)的二硫鍵)。二硫鍵能通過熟知的多種方法進行還原，例如使用氮氣吹掃和/或化學還原劑如Na2S03、DTT(二硫蘇糖醇)、TCEP(tris(2-羧乙基)膦、2-巰基乙醇、2-巰基乙胺、以及它們的混合物。一般的還原劑包括那些含硫醇基的、那些是膦和它們的衍生物的、以及亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽。如本文所用，術語“可操作地連接”是指單個核酸片段上的核酸序列的結(jié)合，使得其中一個核酸序列的功能受到另一個核酸序列的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即，該編碼序列受到該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)時，則該啟動子與該編碼序列可操作地連接。在另一個實施方案中，也可將“可操作地連接”的定義延伸為描述嵌合基因的產(chǎn)物如融合肽。同樣的，“可操作地連接”也將指連接包含體標記與需被生產(chǎn)和回收的目的肽。如果表達的融合蛋白是不溶性的，所述包含體標記被“可操作地連接”至目的肽上，并以包含體形式在表達宿主細胞內(nèi)積聚。如本文所用，術語“融合蛋白”、“融合肽”、“嵌合蛋白，，和“嵌合肽”將被互換使用，并且將指氨基酸的聚合物(肽、低聚肽、多肽、或蛋白)，它包括至少兩部分，每部分包括不同的功能。融合肽的至少一個第一部分包括至少一個本發(fā)明的包含體標記。融合肽的至少一個第二部分包括至少一個目的肽。制備本發(fā)明肽(包含體標記、可裂解的肽接頭、目的肽、間隔區(qū)肽和融合肽)的方法是本領域熟知的(參見例如Stewart等人，SolidPhasePeptideSynthesis,PierceChemicalCo.,Rockford,IL,1984；Bodanszky,PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,NewYork,1984；禾口Pennington等人，PeptideSynthesisProtocols,HumanaPress,Totowa,NJ，1994)。本文所述的融合肽的不同組分(包含體標記、目的肽和可裂解的接頭/裂解序列)能使用碳二亞胺偶聯(lián)劑(參見例如，Hermanson,GregT.，BioconjugateTechniques,AcademicPress,NewYork(1996))、二甲酰氯、二異氰酸酯和其它雙官能偶聯(lián)劑進行結(jié)合，上述試劑可以與肽上的末端胺和/或羧酸基發(fā)生反應。然而，對長度小于50個氨基酸的肽來說，因為成本和/或雜質(zhì)，化學合成常常是受限的。在一個優(yōu)選的實施方案中，使用標準重組DNA和分子克隆技術制備本文所述的生物分子(IBT、P0I、融合肽等)。如本文所用，術語“多肽”和“肽”將被互換使用，它們指兩個或更多個氨基酸通過肽鍵連接的聚合物，其中未指明所述肽的長度，因此，該定義包括肽、低聚肽、多肽和蛋白。在一個方面，此術語也包括多肽的表達后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。該定義中包括的是，例如，包含一個或多個氨基酸或標記氨基酸和擬肽的類似物的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的IBT由L-氨基酸構(gòu)成。如本文所用，術語“目的蛋白”、“目的多肽”、“目的肽”、“靶向蛋白”、“靶向多肽”、“靶向肽”、“表達蛋白”和“表達多肽”將被互換使用，并指具有生物活性并且可通過宿主細胞的遺傳機制表達的蛋白、多肽、或肽。如本文所用，術語“生物活性”或“目的肽的活性”是指與目的肽和/或蛋白相關的活性或特性。生物活性肽有多種應用，包括但不限于疾病治療劑(例如胰島素、干擾素、白介素、抗血管生成肽(美國專利公開6，815，426)和結(jié)合限定細胞靶的多肽(前提條件是目的肽不是抗體或抗體的Fab片段)舉例來說如受體、通道、脂質(zhì)、胞質(zhì)蛋白和膜蛋白)、具有抗微生物活性的肽、具有對特定材料親和力的肽(例如，毛發(fā)結(jié)合多肽、皮膚結(jié)合多肽、指/趾甲結(jié)合多肽、纖維素結(jié)合多肽、聚合物結(jié)合多肽、粘土結(jié)合多肽、硅結(jié)合多肽、碳納米管結(jié)合多肽和對特定動物或植物組織有親和力的肽)，用于靶向遞送有益試劑。目的肽的長度通常不超過300個氨基酸，優(yōu)選地小于200個氨基酸，最優(yōu)選地小于100個氨基酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，目的肽是選自組合生成的文庫的肽，其中所述肽基于對靶底物的特異親和力進行選擇。如本文所用，術語“有益劑”是指賦予所需功能給涉及目的肽的限定應用的復合物的分子。有益劑可以是目的肽本身，或者可以是與其結(jié)合的(共價地或非共價地)或相連的一個或多個分子，其中靶向多肽的結(jié)合親和力用于選擇性地把有益劑靶向靶材料。在另一個實施方案中，靶向多肽包括至少一個具有對至少一個靶材料(例如，生物分子、聚合物、毛發(fā)、皮膚、指/趾甲、粘土、其它肽等)的親和力的區(qū)域和至少一個具有對有益劑(例如，藥物制劑、色素、調(diào)理劑、染料、芳香劑等)的親和力的區(qū)域。在另一個實施方案中，目的肽包含多個具有對靶材料的親和力的區(qū)域和多個具有對有益劑的親和力的區(qū)域。在另一個實施方案中，目的肽包含至少一個具有對靶材料的親和力的區(qū)域和多個具有對多種有益劑的親和力的區(qū)域，其中所述有益劑可以是相同的，也可以是不同的。舉例來說，有益劑的實例可包括但不限于用于個人護理產(chǎn)品的調(diào)理劑、色素、染料、芳香劑、藥物制劑(例如靶向遞送的癌治療劑)、診斷/標記劑、紫外光阻斷劑(即用于防曬保護的活化試劑)和抗微生物劑(例如抗微生物肽)。如本文所用，“包含體”是包括存在于細胞質(zhì)中的聚集蛋白的胞內(nèi)無定形沉淀?？蓪⑼ǔ？扇苡谒拗骷毎?或細胞溶解產(chǎn)物中的目的肽與一種或多種本發(fā)明的包含體標記融合，以利于形成不溶性融合蛋白。在一個可供選擇的實施方案中，目的肽可部分溶解在宿主細胞中，但產(chǎn)生的水平相對較低，其中不形成顯著的包含體。同樣地，包含體的形成將增加肽的產(chǎn)生。在另一個實施方案中，目的肽與一個或多個包含體標記(IBT)的融合增加宿主細胞中產(chǎn)生的蛋白的量。包含體的形成有利于融合肽從細胞溶解產(chǎn)物中使用本領域熟知的技術如離心和過濾進行簡單有效的純化。在另一個實施方案中，包含體標記包含有效數(shù)目的可交聯(lián)半胱氨酸殘基用于從目的肽中分離IBT(在裂解成肽片段混合物后)，前提條件是目的肽缺乏半胱氨酸殘基。融合蛋白通常包括一個或多個可裂解的肽接頭用于從包含體標記中分離目的蛋白/多肽。設計可裂解的肽接頭以便包含體標記和目的蛋白/多肽能通過裂解接頭元件被容易地分開?？苫瘜W裂解(例如酸水解)或酶裂解(即，使用優(yōu)先識別在可裂解的肽接頭中的氨基酸裂解位點和/或序列的蛋白酶/肽酶)肽接頭。“密碼子簡并性”是指允許核苷酸序列在不影響所編碼多肽的氨基酸序列的情況下發(fā)生變化的遺傳密碼的性質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明氨基酸序列的任何核酸片段。技術人員非常了解具體宿主細胞在使用核苷酸密碼子以確定給定氨基酸時所表現(xiàn)出的“密碼子偏倚性”。因此，當合成基因用以改善在宿主細胞中的表達時，希望對基因進行設計，使得其密碼子使用頻率接近該宿主細胞優(yōu)選的密碼子使用頻率。如本文所用，術語“溶解度”是指在指定條件下能溶解在單位體積液體中的物質(zhì)的量。在本發(fā)明的應用中，術語“溶解度”用于描述肽(包含體標記、目的肽、或融合肽)重懸在一定體積的溶劑(如生物緩沖液)中的能力。在一個實施方案中，靶向生產(chǎn)的肽(“目的肽”)在正常的生理條件下通常可溶于細胞和/或細胞溶解產(chǎn)物中。一個或多個包含體標記(IBT)與靶肽的融合導致形成在正常生理條件下不溶解的融合肽，導致形成包含體。在一個實施方案中，目的肽不溶于PH范圍5至12，優(yōu)選地6至10；以及溫度范圍5°C至50°C，優(yōu)選地10°C至40°C的含水基質(zhì)中。術語“氨基酸”是指蛋白質(zhì)或多肽的基本化學結(jié)構(gòu)單位。在本文中使用下列縮寫來表示具體氨基酸三字母單字母氨基酸縮寫縮寫丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天冬酰胺AsnN天冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GlnQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG組氨酸HisH異亮氨酸lieI亮氨酸LeuL賴氨酸LysK甲硫氨酸MetM苯基丙氨酸PheF脯氨酸ProP絲氨酸SerS蘇氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrYValine=纈氨酸ValV任何天然存在的氨基酸XaaX(或如本文所定義)“基因”是指能夠表達特定蛋白質(zhì)的核酸片段，其包括編碼序列前的調(diào)控序列(5'非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)控序列(3'非編碼序列)?！疤烊换颉笔侵妇哂衅渥陨碚{(diào)控序列的天然存在的基因，“嵌合基因”是指非天然基因的任何基因，它包含非天然存在的調(diào)控序列和編碼序列(包括進行工程化以編碼融合肽的編碼區(qū))。因此，嵌合基因可包括源于不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包括源于同一來源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列?！巴鈦砘颉笔侵刚Ｇ闆r下不存在于宿主生物中的基因，它通過基因轉(zhuǎn)移導入宿主生物。外來基因可以包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因，或嵌合基因。如本文所用，術語“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！昂线m的調(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、中間或下游(3'非編碼序列)的核苷酸序列，其可影響相關編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或者翻譯。調(diào)控序列可包括啟動子、增強子、核糖體結(jié)合位點、翻譯前導序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應子結(jié)合位點和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。本領域的技術人員認識到，合適的調(diào)控序列的選擇將取決于使用的宿主細胞和/或表達系統(tǒng)。如本文所用，術語“遺傳構(gòu)建體”是指一系列用于調(diào)節(jié)生物體基因型或表型的鄰接核酸。遺傳構(gòu)建體的非限制性實例包括但不限于核酸分子和開放閱讀框、基因、質(zhì)粒等。如本文所用，術語“表達排名，，是指視覺評估的、以相對標度0(無不溶性融合肽)至3(產(chǎn)量最高的不溶性融合肽)進行評分的不溶性融合蛋白的相對產(chǎn)量。本領域的技術人員可使用多種方法來評估重組宿主細胞中的包含體形成。如本發(fā)明實例所述，從染色的聚丙烯酰胺凝膠上對不溶性融合肽的相對產(chǎn)量進行視覺評估。將能夠產(chǎn)生高于零(即1、2、或3)的表達排名的任何IBT認為是有效的可溶性標記。相反，也可以使用定性評估(即觀察包含體)鑒定有效的可溶性標記。如本文所用，術語“宿主細胞”是指已經(jīng)被外來多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的、或能夠被外來多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。如本文所用的，術語“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”是指通常攜帶有不屬于細胞中心代謝的部分的基因的染色體外元件并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何來源的自主復制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線性或環(huán)狀)，其中多個核苷酸序列已連接或重組進入一種獨特構(gòu)建體中，該獨特構(gòu)建體能夠?qū)⑺x基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列與相應的3'末端非翻譯序列一起引入細胞中?！稗D(zhuǎn)化框”是指含有外來基因并且除了該外來基因外還含有有利于轉(zhuǎn)化特定宿主細胞轉(zhuǎn)化的元件的特定載體。“表達盒”是指包含外來基因并且除該外來基因以外還具有使得該基因在外來宿主中的表達增強的元件的特定載體。本文所用的標準的重組DNA和分子克隆技術為本領域所熟知，并且描述于Sambrook,J.禾口Russell，D.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第三片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(2001)；禾口Silhavy,Τ.J.,Bennan,Μ.L.與Enquist,L.W.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryColdPressSpringHarbor,NY(1984)；以及Ausubel,F.Μ.等人，ShortProtocolsinMolecularBiology，第5片反，CurrentProtocolsandJohnWileyandSons,Inc.，N.Y.，2002。包含體標記淀粉樣蛋白趨于具有淀粉纖維狀形態(tài)，并且聚集的蛋白常常表現(xiàn)出片層帶結(jié)構(gòu)。已經(jīng)描述了11個氨基酸的合成肽(即肽“ΡΙΙ-2”；也稱為肽“Dm”)，它能夠在水中自裝配成β-片層帶、帶、纖絲和纖維(Aggeli等人，J.Amer.Chem.Soc.,1259619-9628(2003)；Aggeli等人，PNAS，98(21):11857_11862(2001)；Aggeli等人，Nature，386:259-262(1997)；和Aggeli等人，J.MaterChem,7(7):1135_1145(1997)。選擇P11-2肽(與IBT-136相同；SEQIDNO17)作為原料用于制備結(jié)構(gòu)相關的包含體標記家族，該包含體標記包含至少兩拷貝的核心序列Gln-Gln-Xaal-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln(SEQIDNO:58)，其中Xaal=Arg、His、或Lys；Xaa2=Gin,His,或Lys；Xaa3=Gln、His、或Lys；Xaa4=Glu或Gln；以及Xaa5=Gln和Lys(參見下文配方1的粗體部分)。制備并評估一系列IBT-I36類似物。采用若干個方法，包括改變拷貝數(shù)、改變標記電荷、改變分隔核心序列的間隔區(qū)元件的組成、以及改變可交聯(lián)的半胱氨酸殘基/部分的數(shù)目。在核心序列之間插入一個短間隔區(qū)序列。在一個實施方案中，配方1的“間隔區(qū)”是長度為2至10個氨基酸，優(yōu)選地3至6個氨基酸，最優(yōu)選地3至4個氨基酸的多肽，并且由選自脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸和谷氨酸的氨基酸構(gòu)成。在另一個實施方案中，所述“間隔區(qū)”選自Pro-Arg-Gly、Pro-Cys-Gly、Pro-Arg-Cys-Gly(SEQIDNO56),Pro-Glu-Gly和Pro-Glu-Cys-Gly(SEQIDNO57)。本發(fā)明的包含體標記的結(jié)構(gòu)由配方1限定(除非另外指明，使用不同氨基酸的3-字母縮寫)。配方1。Gln-Gln-Xaal-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln-間隔區(qū)-[[Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln]-[間隔區(qū)]m]n(SEQIDNO262)其中Xaal=Arg、His、或Lys；Xaa2=Gin、His、或Lys；Xaa3=Gin、His、或Lys；Xaa4=Glu或Gln；Xaa5=Gln或Lys；η=1至10；m=n-l;并且其中所述間隔區(qū)=是包含選自脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的氨基酸的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，η=1至3。將每一個本發(fā)明的包含體標記可操作地連接至一個目的短肽(POI)，所述短肽在正常的生理條件下微溶于宿主細胞。所得融合蛋白/肽以不溶性包含體形式產(chǎn)生。在合適的宿主細胞中重組表達每個融合肽并評估不溶性融合肽的形成。測定包含體形成的方法是本領域已知的，包括但不限于凝膠分離和分析技術(例如SDS-PAGE)。在另一個實施方案中，包含體標記還包含至少一個可交聯(lián)的半胱氨酸部分(CCPGCC；SEQIDNO:33)。在另一個實施方案中，至少一個可交聯(lián)的半胱氨酸部分位于配方1定義的包含體標記的氨基和/或羧基末端。在另一個實施方案中，包含體標記選自IBT103(SEQIDNO15)、IBT138(SEQIDN0:19)、IBT139(SEQIDNO:21)、IBT139(5C)；IBT139.CCPGCC(SEQIDNO:31)、IBT182(SEQIDNO39),IBT183(SEQIDNO:41)、IBT184(SEQIDNO:43)、IBT185(SEQIDNO:45)、IBT186(SEQIDN0:27)、IBT187a(SEQIDNO47)和IBT187b(SEQIDNO:49)。圖1提供了若干本發(fā)明包含體標記的CLUSTALW比對(重復核心序列用下劃線示出)。在另一個實施方案中，提供的不溶性融合蛋白包含至少一個本發(fā)明的包含體標記(IBT)，它被可操作地連接至目的肽(POI)并被至少一個可裂解的肽連接序列(CS)分隔。在一個優(yōu)選的方面，可裂解的肽接頭(CS)包含至少一個酸裂解天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)部分。IBT-CS-POI或POI-CS-IBT在另一個實施方案中，融合肽包含一個包含體標記，該標記包含有效數(shù)目的可交聯(lián)半胱氨酸殘基。包含有效數(shù)目的可交聯(lián)的半胱氨酸殘基用于在加工過程中從目的肽中選擇性沉淀和分離包含體標記。一旦融合肽裂解，使片段混合物(IBT和Ρ0Ι)經(jīng)受足夠時間的氧化條件，使得有效數(shù)目的半胱氨酸殘基交聯(lián)到IBT中。氧化交聯(lián)選擇性地從目的可溶性肽中沉淀IBT，前提條件是目的肽缺乏可交聯(lián)的半胱氨酸殘基?？蓪腚装彼釟埢腎BT有效地用作可溶性標記，與具有可交聯(lián)半胱氨酸殘基的目的肽組合使用。然而，在此類情況下，在隨后的POI分離期間氧化交聯(lián)步驟將通常被省略。表汰目的肽使用本發(fā)明的方法靶向生產(chǎn)的目的肽(“表達肽”)是線性肽，它在正常的生理條件下微溶于宿主細胞和/或宿主細胞液體溶解產(chǎn)物。在一個優(yōu)選的方面，目的肽一般較短(長度<300個氨基酸)，并且由于蛋白水解降解，難以產(chǎn)生足夠的量。將目的肽融合到至少一個本發(fā)明的包含體形成標記上產(chǎn)生一個融合肽，該融合肽在正常的生理條件下不溶于宿主細胞和/或宿主細胞溶解產(chǎn)物。當以不溶性包含體形式表達并積累時，產(chǎn)生的目的肽通常增加，這是因為所述肽一般更不易發(fā)生蛋白水解降解。此外，可使用離心或過濾從宿主細胞溶解產(chǎn)物中容易地分離不溶性融合蛋白。通常，可在方法中使用本發(fā)明的包含體標記以制備目的任何肽(1)在一般的生理條件下通?？扇苡诩毎?或細胞溶解產(chǎn)物的肽，和/或(2)那些當以包含體形式表達時能產(chǎn)生更高含量的肽。在一個優(yōu)選的實施方案中，目的肽在正常的生理條件和/或加工條件下微溶于宿主細胞和/或?qū)募毎芙猱a(chǎn)物。當以下情況發(fā)生時，目的肽的長度可發(fā)生改變(1)所述肽微溶于宿主細胞和/或細胞溶解產(chǎn)物，和/或(2)當以不溶性融合肽/包含體的形式(即，以融合蛋白的形式表達，保護目的肽不受蛋白水解降解)表達時，靶向產(chǎn)生的肽的量顯著增加。通常目的肽的長度小于300個氨基酸，優(yōu)選地小于100個氨基酸，更優(yōu)選小于75個氨基酸，甚至更優(yōu)選地小于50個氨基酸，最優(yōu)選地小于25個氨基酸。目的肽的功能不受本發(fā)明方法的限制并且可包括但不限于生物活性分子，如疾病治療劑(例如胰島素、干擾素、白介素、肽激素、抗血管生成肽和結(jié)合并影響限定細胞靶如受體、通道、脂質(zhì)、胞質(zhì)蛋白和膜蛋白的肽(前提條件是肽不是抗體或抗體的Fab部分或單鏈可變片段抗體；scFv)；參見美國專利公開6，696，089，)、具有對特定材料親和力的肽(例如，生物組織、生物分子、毛發(fā)結(jié)合肽(美國專利公開申請11/074473；WO0179479；美國專利公開申請2002/0098524；美國專利公開申請2003/0152976；WO04048399；美國專利公開申請11/512910；美國專利公開申請11/516362；和美國專利公開申請11/696380)、皮膚結(jié)合肽(美國專利公開申請11/069858；WO2004/000257；美國專利公開申請11/516362；和美國專利公開申請11/696380)、指/趾甲結(jié)合肽(美國專利公開申請11/074473；美國專利公開申請11/696380)、纖維素結(jié)合肽、聚合物結(jié)合肽(美國專利公開申請11/607723、11/607792、11/607734、11/607672和11/607673)、以及粘土結(jié)合肽(美國專利公開申請11/696380)，用于靶向遞送至少一個有益劑(參見美國專利公開申請10/935642；美國專利公開申請11/074473；和美國專利公開申請11/696380)。在一個優(yōu)選的方面，目的肽是一種鑒定自組合生成的肽文庫的親和肽。在另一方面，所述肽選自組合生成的文庫，其中制備所述文庫使用的技術選自噬菌體展示技術、酵母展示技術、細菌展示技術、核糖體展示技術和mRNA展示技術。在一個優(yōu)選的方面，目的肽選自毛發(fā)結(jié)合肽、皮膚結(jié)合肽、指/趾甲結(jié)合肽、牙齒結(jié)合肽、抗微生物肽、色素結(jié)合肽、粘土結(jié)合肽和聚合物結(jié)合肽。在另一個優(yōu)選的方面，目的肽選自毛發(fā)結(jié)合肽，該肽包含選自SEQIDN0:3、4、5、7、9、ll、13、23和59至147的氨基酸序列、皮膚結(jié)合肽，該肽包含選自SEQIDNO:148至155的氨基酸序列、指/趾甲結(jié)合肽，該肽包含選自SEQIDNO156和157的氨基酸序列和牙齒結(jié)合肽，該肽包含選自SEQIDNO268至307的氨基酸序列。在另一個實施方案中，目的肽是多重嵌段毛發(fā)結(jié)合肽。多重嵌段毛發(fā)結(jié)合肽的實例包括但不限于HC77607(SEQIDNO:7)、HC77638(SEQIDNO:9)、HC77643(SEQIDNO:11)、HC77681(SEQIDNO13)和HC776124(SEQIDNO:23)。親和肽尤其可用于靶向有益劑，所述有益劑賦予靶材料(例如毛發(fā)、皮膚等)所需的功能用于限定的應用(美國專利公開申請10/935642；美國專利公開申請11/074473；美國專利公開申請11/512910；和美國專利公開申請11/696380，用于一系列典型的有益劑如調(diào)理劑、色素/著色劑、芳香劑等)。有益劑可以是目的肽本身，或者可以是與其結(jié)合的(共價地或非共價地)或相連的一個或多個分子，其中目的肽的結(jié)合親和力用于選擇性地將有益劑靶向靶材料。在另一個實施方案中，目的肽包括至少一個具有對至少一個靶材料(例如，生物分子、聚合物、毛發(fā)、皮膚、指/趾甲、其它肽等)的親和力的區(qū)域和至少一個具有對有益劑(例如，藥物制劑、抗微生物劑、色素、調(diào)理劑、染料、芳香劑等)的親和力的區(qū)域。在另一個實施方案中，目的肽包含多個具有對靶材料的親和力的區(qū)域和多個具有對一種或多種有益劑的親和力的區(qū)域。在另一個實施方案中，目的肽包含至少一個具有對靶材料的親和力的區(qū)域和多個具有對多種有益劑的親和力的區(qū)域，其中所述有益劑可以是相同的，也可以是不同的。舉例來說，有益劑的實例可包括但不限于用于個人護理產(chǎn)品的調(diào)理劑、色素、染料、芳香劑、藥物制劑(例如靶向遞送的癌治療劑)、診斷/標記劑、紫外光阻斷劑(即用于防曬保護的活化試劑)和抗微生物劑(例如抗微生物肽)?？闪呀獾碾慕宇^可裂解的肽接頭(即裂解位點或裂解序列)的用途是本領域熟知的。包含本發(fā)明包含體標記的融合肽將通常包括至少一個可裂解的序列，它從目的多肽中分離包含體標記?？闪呀獾男蛄杏欣趶哪康碾闹蟹蛛x包含體標記。在一個實施方案中，可裂解的序列可通過一部分包含體標記和/或目的肽(例如，包括一個酸裂解天冬氨酸_脯氨酸部分)提供。在一個優(yōu)選的實施方案中，可裂解的序列可通過在包含體標記和目的肽之間包括(在融合肽中)至少一個可裂解的肽接頭提供。裂解肽接頭的方法是本領域熟知的，并且可包括化學水解、酶裂解試劑、以及它們的組合。在一個實施方案中，在融合構(gòu)建體中包括一個或多個可化學裂解的肽接頭以利于從包含體融合蛋白中回收目的肽。化學裂解試劑的實例包括溴化氰(裂解甲硫氨酸殘基)、N-氯(代)琥珀酰亞胺、碘苯甲酸或BNPS-糞臭素[2-(2-硝基苯硫)-3-甲基吲哚](裂解色氨酸殘基)、稀酸(裂解天冬氨?；鵢脯氨酰鍵)和羥胺(在PH9.0條件下裂解天冬酰胺-甘氨酸鍵)；參見Gavit，P.和Better，Μ·，J.Biotechnol.，79127-136(2000)；Szoka等人，DNA,5(1)11-20(1986)；和Walker，J.Μ.,TheProteomicsProtocolsHandbook,2005，HumanaPress,Totowa，NJ.))。在一個優(yōu)選的實施方案中，在融合蛋白構(gòu)建體中包含一個或多個天冬氨酸-脯氨酸裂解識別位點(即，包含一個或多個D-P二肽部分的可裂解肽接頭)以利于從目的肽中分離包含體標記。在另一個實施方案中，融合肽可包括多個編碼目的肽的區(qū)域，它們由一個或多個可裂解的肽接頭分隔。在另一個實施方案中，在融合蛋白構(gòu)建體中包括一個或多個酶裂解序列，以利于回收目的肽。蛋白水解酶和它們各自的裂解位點特征是本領域熟知的。在一個優(yōu)選的實施方案中，選擇蛋白水解酶以特異性地僅僅裂解分隔包含體標記和目的肽的肽接頭。用于裂解肽接頭的酶的實例包括但不限于Arg-C蛋白酶、Asp-N肽鏈內(nèi)切酶、胰凝乳蛋白酶、梭菌蛋白酶、腸激酶、Xa因子、谷氨酰肽鏈內(nèi)切酶、顆粒酶B、無色菌蛋白酶I、胃蛋白酶、脯氨酸肽鏈內(nèi)切酶、蛋白酶K、葡萄球菌肽酶I、嗜熱菌蛋白酶、凝血酶、胰蛋白酶和蛋白水解酶的半胱天冬酶家族成員(例如半胱天冬酶1至10)(Walker,J.Μ.，同上)。提供了裂解位點序列的實例=SEQIDNO261(半胱天冬酶_3裂解位點；Thornberry等人·J.Biol.Chem.，272:17907-17911(1997)和Tyas等人，EMBOReports,1(3):266_270(2000))。通常，裂解步驟發(fā)生在從細胞溶解產(chǎn)物中分離出不溶性包含體和/或不溶性融合肽之后?？墒褂帽绢I域熟知的多種方法溶解細胞(例如機械和/或化學溶解)。用于從細胞溶解產(chǎn)物中分離不溶性包含體/融合肽的方法是本領域熟知的(例如離心、過濾、以及它們的組合)。一旦從細胞溶解產(chǎn)物中回收得到，不溶性包含體和/或融合肽能用裂解試劑(化學試劑或酶試劑)進行處理以從目的肽中裂解包含體標記。在一個實施方案中，在用裂解試劑處理之前，將融合蛋白和/或包含體稀釋和/或溶解在合適的溶劑中。在另一個實施方案中，如果包含體標記不干擾目的肽的活性，可省略裂解步驟。在裂解步驟之后，并且在一個優(yōu)選的實施方案中，基于組分的不同溶解度，能從融合蛋白和包含體標記中分開和/或分離目的肽?？蓪?shù)如PH、鹽濃度和溫度調(diào)節(jié)至有利于從目的肽中分離包含體標記。在一個實施方案中，在限定的加工基質(zhì)(通常是含水基質(zhì))中目的肽是可溶解的，然而包含體標記和/或融合蛋白是不溶解的。在另一個實施方案中，在限定的加工基質(zhì)中，目的肽是不溶解的，然而包含體標記是可溶解的。在一個優(yōu)選的實施方案中，包含體標記包含有效數(shù)目的可交聯(lián)半胱氨酸殘基，前提條件是目的肽缺乏半胱氨酸殘基。一旦裂解，使用氧化交聯(lián)以選擇性地交聯(lián)IBT(通常不溶解的)?？刂茥l件以便當目的肽是可溶的時，交聯(lián)IBT是不溶解的。目的可溶性肽隨后使用簡單的分離技術如離心和/或過濾從交聯(lián)IBT中分離。在一個任選的實施方案中，目的肽可使用多種本領域熟知的純化技術進行進一步純化，舉例來說如離子交換、凝膠純化技術和柱層析(參見US5，648，244)。融合肽使用本發(fā)明的包含體標記產(chǎn)生嵌合多肽(“融合肽”或“融合蛋白”)，它不溶于宿主細胞，形成包含體。編碼本發(fā)明融合肽(提供本發(fā)明的包含體標記)的表達遺傳構(gòu)建體的合成和表達是本領域的技術人員熟知的。本發(fā)明的融合肽將包括至少一個本發(fā)明的包含體標記(IBT)，它被可操作地連接到至少一個目的肽上。通常，融合肽也將包括至少一個可裂解的肽接頭，該接頭在包含體標記和目的肽之間具有裂解位點。在一個實施方案中，包含體標記可包括一個裂解位點，由此可以不需要包括一個分開的可裂解肽接頭。在一個優(yōu)選的實施方案中，選擇裂解方法以保證目的肽不受使用的裂解試劑的負面影響。在另一個實施方案中，只要肽的所需活性不受負面影響，可修飾目的肽以消除肽上可能的裂解位點。本領域的技術人員將認識到，融合蛋白的元件能以多種方法進行結(jié)構(gòu)化。通常，融合蛋白將包括至少一個IBT、至少一個目的肽(POI)和至少一個可裂解的肽接頭(CL)，該肽接頭包含位于IBT和POI之間的裂解位點(CS)。在融合肽中可相對于目的肽的位置將包含體標記組織成一個引導序列或終止序列。在另一個實施方案中，當工程化融合肽時使用多個IBT、POI和CL。在另一個實施方案中，融合肽可包括多個IBT(如本文所定義)、POI和CL，它們可以是相同的或不同的。融合肽在溫度為10°C至50°C，優(yōu)選地10°C至40°C的含水基質(zhì)中將是不溶解的。含水基質(zhì)通常PH范圍介于5至12，優(yōu)選地6至10，最優(yōu)選地6至8之間?？烧{(diào)節(jié)含水基質(zhì)的溫度、PH和/或離子強度以獲得所需的融合肽/包含體的溶解度特性。使用不溶件融合肽制備目的肽的方法使用本發(fā)明的包含體標記以制備融合肽，該融合肽在生產(chǎn)宿主中形成包含體。此方法對生產(chǎn)顯著量的目的可溶性肽來說尤其具有吸引力，該可溶性肽(1)難以從細胞溶解產(chǎn)物的其它可溶性組分中分離，和/或(2)難以在靶生產(chǎn)宿主中產(chǎn)生顯著量的產(chǎn)物。在本發(fā)明的方法中，將目的肽融合到至少一個本發(fā)明的包含體標記上，形成不溶性融合蛋白。編碼融合蛋白的遺傳構(gòu)建體的表達產(chǎn)生不溶形式的目的肽，該肽在宿主細胞中以包含體形式積累。宿主細胞生長足夠的時間，使得不溶性融合肽在細胞中積累。隨后使用本領域熟知的多種技術溶解宿主細胞。然后使用簡單的和經(jīng)濟的技術如離心和/或膜過濾從細胞溶解產(chǎn)物的可溶性組分中分離不溶性融合肽/包含體。然后可進一步加工不溶性融合肽/包含體以分離目的肽。通常，這將包括將融合肽/包含體重懸在適于裂解融合肽的液體基質(zhì)中并從目的肽中分離包含體標記。通常設計融合蛋白包括一個可裂解的肽接頭，它分隔包含體標記與目的肽?？墒褂帽绢I域熟知的多種技術(化學裂解、酶裂解、以及它們的組合)實施裂解步驟。然后可以使用本領域熟知的多種技術(離心、過濾、沉淀、柱層析等)，從包含體標記和/或融合肽中分離目的肽。優(yōu)選地，目的肽(一旦從融合肽中裂解)具有與包含體標記和/或剩余融合肽顯著不同的溶解度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，使用氧化交聯(lián)從目的肽中(當缺乏可交聯(lián)的半胱氨酸殘基時)選擇性地沉淀IBT(包含有效數(shù)目的可交聯(lián)的半胱氨酸殘基)。如本文圖所示，設計IBT-136的衍生物(即IBT139.CCPGCC,IBT139(5C)、IBT185和IBT186)以包括有效數(shù)目的可交聯(lián)的半胱氨酸殘基。轉(zhuǎn)化和表達一旦已經(jīng)鑒定出包含體標記并使其與合適的目的肽成對，構(gòu)建可以被轉(zhuǎn)化到合適表達宿主中的表達盒和載體是常見的和本領域熟知的。通常載體或盒含有引導相關嵌合基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標記和允許自主復制或染色體整合的序列。合適的載體包含含有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5'區(qū)域和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3'區(qū)域。最優(yōu)選的是，這兩個控制區(qū)都來源于來自轉(zhuǎn)化的宿主細胞的同源基因，但應當了解，這種控制區(qū)不必源自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因。可用于驅(qū)動編碼融合肽的遺傳構(gòu)建體在所需宿主細胞中表達的轉(zhuǎn)錄起始控制區(qū)或啟動子有很多并且是本領域技術人員熟悉的。實際上能夠驅(qū)動這些構(gòu)建體的任何啟動子都適用于本發(fā)明，包括但不限于CYCl、HIS3、GALl、GALlO、ADHl、PGK、PH05、GAPDH、ADCl、TRP1、URA3、LEU2、EN0、TPI(用于在糖酵母屬中表達)；AOXl(用于在畢赤酵母屬中表達)；禾口lac、ara(pBAD)、tet、trp、IPl、1PK、T7、tac和trc(用于在大腸桿菌中表達)以及amy、apr、npr啟動子，和多種用于在芽孢桿菌屬中表達的噬菌體啟動子。終止控制區(qū)也可以源于優(yōu)選宿主的天然的多種基因。任選地，終止位點可能是不必要的，然而，如果含有終止位點則是最優(yōu)選的。用于表達本發(fā)明融合肽的優(yōu)選宿主細胞是微生物宿主，其可以廣泛存在于真菌或細菌家族內(nèi)并且在寬范圍的溫度、PH值和溶劑耐受力下生長。例如，預期任何細菌、酵母和絲狀真菌將是表達編碼的融合肽的本發(fā)明核酸分子的合適宿主。因為轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白生物合成裝置一樣與細胞給料無關，基因的表達與用于生成細胞生物量的碳給料無關。在光合作用宿主或化學自養(yǎng)宿主的情況下，大規(guī)模的微生物生長和功能基因表達可利用廣泛的簡單或復雜碳水化合物、有機酸和醇(即甲醇)、飽和烴如甲烷或二氧化碳。然而，可通過特定生長條件調(diào)節(jié)、抑制或降低功能性基因，這可包括氮、磷、硫、氧、碳或任何痕量微量營養(yǎng)素包括小無機離子的形式和量。此外，可通過存在或不存在特異性調(diào)節(jié)分子來調(diào)節(jié)功能性基因，該調(diào)節(jié)分子被加入培養(yǎng)物中并且通常不認為它們是營養(yǎng)物質(zhì)或能源。生長速率也可以是基因表達中的重要調(diào)節(jié)因素。宿主菌株的實例包括但不限于真菌或酵母物種例如曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、糖酵母屬(Saccharomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、耶氏酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、或細菌物種例如沙門氏菌屬(Salmonella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、赤細菌屬(Erythrobacter)、綠菌屬(Chlorobium)、著色菌屬(Chromatium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、噬纖維菌屬(Cytophaga)、紅細菌屬(Rhodobacter)、紅球菌屬(Rhodococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacteria)、分支桿菌屬(Mycobacterium)、異常球菌屬(Deinococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、泛菌屬(Pantoea)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基單胞菌屬(Methylomonas)、甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基彎菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌屬(Methylocystis)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、集胞藍細菌屬(Synechocystis)、聚球藍細菌屬(Synechococcus)、魚腥藍細菌屬(Anabaena)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、甲燒桿菌屬(Methanobacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和粘球菌屬(Myxococcus)物種。優(yōu)選的細菌宿主菌株包括埃希氏菌屬、假單胞菌屬和芽孢桿菌屬。在一個高度優(yōu)選的方面，所述細菌宿主菌株是大腸桿菌。發(fā)酵培養(yǎng)基本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的碳底物。合適的底物可包括但不限于單糖，例如葡萄糖和果糖；低聚糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纖維素或它們的混合物；以及來自可再生原料的未純化混合物，例如干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖蜜及大麥麥芽。另外，碳底物也可以為已證明可以被代謝轉(zhuǎn)化為關鍵生化中間產(chǎn)物的諸如二氧化碳之類的一碳底物或甲醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基營養(yǎng)生物體也已知可以利用多種其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代謝活動的多種氨基酸。例如，甲基營養(yǎng)酵母已知可利用來自甲胺的碳來形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.GrowthClCompd.，[Int.Symp.]，第7版(1993)，415-32，編輯=Murrell,J.Collin；Kelly,DonP.PublisherIntercept,Andover,UK)。類似地，假絲酵母屬的多種物種將會代謝丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch.Microbiol.153:485_489(1990))。因此，預期本發(fā)明中所利用的碳源可涵蓋各種含碳底物并且將僅受限于生物體的選擇。盡管預期所有上述碳底物及它們的混合物都適用于本發(fā)明，但優(yōu)選的碳底物為葡萄糖、果糖和蔗糖。除了合適的碳源外，發(fā)酵培養(yǎng)基還必須含有本領域技術人員已知的適于培養(yǎng)物生長并促進本發(fā)明融合肽表達的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖劑、以及其他組分。培養(yǎng)條件合適的培養(yǎng)條件的選擇取決于所選的生產(chǎn)宿主。通常，使細胞在約25°C至約40°C的溫度范圍下在合適的培養(yǎng)基中生長。合適的生長培養(yǎng)基可包括普通的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，例如LuriaBertani(LB)肉湯、SabouraudDextrose(SD)肉湯或酵母培養(yǎng)基(YM)肉湯。也可以使用其他確定的或合成的生長培養(yǎng)基，微生物學或發(fā)酵科學領域的技術人員將知道用于具體微生物生長的合適培養(yǎng)基。已知可以直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物阻遏的試劑，如環(huán)腺苷酸2',3'-單磷酸也可被摻入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。適于發(fā)酵的pH范圍通常在pH5.O到pH9.O之間，其中優(yōu)選pH6.O至pH8.O。發(fā)酵可以在有氧或厭氧條件下進行，其中有氧條件一般是優(yōu)選的。工業(yè)分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵分批發(fā)酵是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開始時設定并且在發(fā)酵過程中不進行人工改變。因此在發(fā)酵開始時，用所需生物體對培養(yǎng)基進行接種，在不向系統(tǒng)添加任何物質(zhì)的情況下進行發(fā)酵。通常來說，“分批”發(fā)酵是指碳源的添加是成批的，但經(jīng)常試圖控制諸如PH和氧濃度之類的因素。在分批發(fā)酵系統(tǒng)中，代謝產(chǎn)物和生物質(zhì)組成持續(xù)改變直至發(fā)酵結(jié)束時。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細胞緩慢通過靜態(tài)延滯期到達高速生長對數(shù)期，并最后達到穩(wěn)定期，此時生長速率減緩或終止。如果不加以處理，穩(wěn)定期中的細胞將最終死亡。通常，對數(shù)期中的細胞負責產(chǎn)生大部分終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。標準分批式系統(tǒng)的一種變型是補料分批系統(tǒng)。補料分批發(fā)酵工藝也適用于本發(fā)明并且包括典型的分批式系統(tǒng)，不同的是隨著發(fā)酵進程遞增地添加底物。在代謝產(chǎn)物往往抑制細胞的代謝作用以及其中期望培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補料分批式系統(tǒng)是有用的。補料分批式系統(tǒng)中的實際底物濃度難于測量并因而可根據(jù)一些可測量因素(例如pH、溶解的氧以及廢氣例如CO2的分壓)進行評估。分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵在本領域內(nèi)是常用的且眾所周知，并且實例可見于如下文獻ThomasD.Brock，Biotechnology=ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.(在下文中“Brock，，),或Deshpande,MukundV.,App1.Biochem.Biotechnol.,36227(1992)。盡管本發(fā)明通常是以分批模式進行，但預期該方法將可適用于連續(xù)發(fā)酵方法。連續(xù)發(fā)酵是一種開放式系統(tǒng)，其中將設定好的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)加入到生物反應器中，并同時移出等量條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵一般使培養(yǎng)物維持在其中細胞主要處于對數(shù)生長期的恒定高密度。連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)一種因素或任意數(shù)目的因素，這些因素影響細胞生長或終產(chǎn)物濃度。例如，一種方法將以固定的速率維持限制性營養(yǎng)物質(zhì)例如碳源或氮水平并且允許所有其他參數(shù)適度。在其他系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以連續(xù)改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持不變。連續(xù)系統(tǒng)力求維持穩(wěn)態(tài)的生長條件，并因而在發(fā)酵過程中由于培養(yǎng)基被取出而導致的細胞損失必須與細胞的生長率保持平衡。用于調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵工藝中的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的方法以及使產(chǎn)物形成速率保持最高水平的方法是工業(yè)微生物領域眾所周知的，并且多種方法已由Brock(同上)詳細描述。預期可以或者采用分批發(fā)酵、補料分批發(fā)酵或者采用連續(xù)發(fā)酵工藝來實施本發(fā)明，并且任何已知的發(fā)酵模式均將適用。應當指出，當數(shù)量、濃度或其他數(shù)值或參數(shù)以范圍、優(yōu)選范圍或優(yōu)選上限數(shù)值和優(yōu)選下限數(shù)值的列表形式給出時，它應理解為具體地公開由任何范圍上限或優(yōu)選數(shù)值和任何范圍下限或優(yōu)選數(shù)值的任何一對所構(gòu)成的所有范圍，而無論所述范圍是否被單獨地公開。凡在本文中給出某一數(shù)值范圍之處，該范圍均旨在包含其端點，以及位于該范圍內(nèi)的所有整數(shù)和分數(shù)，除非另行指出。當定義一個范圍時，不旨在將本發(fā)明的范圍限定于所列舉的具體數(shù)值。實施例本發(fā)明將在下面的實施例中進一步限定。應當理解，盡管這些實施例說明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過上述論述和這些實施例，本領域的技術人員可確定本發(fā)明的實質(zhì)性特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可對本發(fā)明進行各種變化和修改以適應多種用途和條件。所用縮寫的意義如下“min”表示分鐘，“h”表示小時，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“nm”表示納米，“mm”表示毫米，“cm”表示厘米，“μm”表示微米，“rnM”表示毫摩爾，“M”表示摩爾，“mmol”表示毫摩爾，“μmol”表示微摩爾，“pmol”表示皮摩爾，“g”表示克，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“g”表示重力常數(shù)，“rpm”表示每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“DTT”表示二硫蘇糖醇，而“cat#”表示目錄號。一般方法本文所用的標準的重組DNA和分子克隆技術為本領域所熟知，并且描述于Sambrook,J.禾口Russell，D.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第三片反，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY(2001)；禾口Silhavy，Τ.J.，Bennan,Μ.L與Enquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratoryColdPressSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F(xiàn).Μ.等人，ShortProtocolsinMolecularBiology，第5片反，CurrentProtocolsandJohnWileyandSons，Inc.，N.Y.，2002。適合細菌培養(yǎng)物維持及生長的材料和方法在領域內(nèi)也是眾所周知的。適用于Tffl^MMWii^ManualofMethodsforGeneralBacteriology,PhillippGerhardt,R.G.Ε.Murray,RalphN.Costilow,EugeneW.Nester,WillisA.Wood,NoelR.Krieg禾口G.BriggsPhillips編輯，AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.，1994，或Brock中(同上)。除非另外說明，所有用于培養(yǎng)并維持細菌細胞的試劑、限制性酶和材料均獲取自BDDiagnosticSystems(Sparks,MD),Invitrogen(Carlsbad,CA),LifeTechnologies(Rockville,MD),QIAGEN(Valencia,CA)gJcSigma-AldrichChemicalCompany(St.Louis,MO)。實施例1構(gòu)津表汰質(zhì)粒使用若干個表達系統(tǒng)在大腸桿菌宿主細胞中生產(chǎn)融合蛋白。一個表達系統(tǒng)基于大腸桿菌菌株BL21-AI(Invitrogen)，與基于T7的表達載體(pLX121；SEQIDNO:1；圖2)組合使用，其中T7RNA聚合酶的表達受araBAD啟動子的控制。另一個表達系統(tǒng)基于大腸桿菌MG1655(ATCC46076)來源的菌株，與基于pBAD的表達載體(pSF032，圖3，SEQIDN0:2禾口PLR186，圖4，SEQIDNO:51)組合使用，其中刪除了araBAD操縱子的內(nèi)源染色體拷貝(在內(nèi)源araBAD操縱子中包含中斷的修飾大腸桿菌MG1655菌株本文稱為大腸桿菌菌株KK2000)。設計3’下游區(qū)域和可操作地連接至其上的在每個載體中的各自的啟動子，使其有利于編碼各自的包含體標記和/或目的肽的DNA的簡單交換。NdeI和BamHI限制性位點側(cè)接編碼包含體標記(IBT)的區(qū)域。BamHI和AscI限制性位點側(cè)接編碼目的肽(POI)的區(qū)域。設計編碼多種融合肽的核酸分子，使其包括至少一個編碼與目的肽(POI)相連的包含體標記(IBT)的區(qū)域。如上所述，設計編碼融合肽組分的核酸分子，使其包括合適的Ndel/BamHI(編碼包含體標記的區(qū)域)和BamHI/AscI限制性位點(編碼目的肽的區(qū)域)以利于插入表達載體。核酸分子的插入產(chǎn)生一個編碼可操作地連接至各自的啟動子上的融合肽的嵌合基因。設計融合肽使其具有與目的肽(POI)相連的包含體標記(IBT)，其中通過可裂解的肽接頭(CS；例如一個酸裂解的DP部分)分隔兩個組分構(gòu)建PLX121表達質(zhì)粒(基于T7的表達)制備遺傳構(gòu)建體用于評估包含體標記當融合到可溶性的目的肽上時的性能。使用包含一個PBR322復制起點和一個賦予氨芐青霉素抗性的bla基因的質(zhì)粒(pLX121；圖2；SEQIDNO:1)。嵌合基因的表達由T7啟動子驅(qū)動。此質(zhì)粒的構(gòu)建以前描述于共同未決的美國專利公開申請11/516362，該申請以引用方式并入本文。簡而言之，從目的質(zhì)粒pDEST17(Invitrogen.Carlsbad,CA)設計pLX121表達載體。修飾表達載體以便編碼融合蛋白的嵌合基因在T7啟動子的控制下表達。使用NdeI和BamHI限制性位點以利用交換不同包含體標記。使用BamHI和AscI限制性位點以利于交換不同的目的肽。設計編碼在包含體標記和目的肽之間的連接的序列以編碼酸裂解的D-P部分。構(gòu)建表達載體PSF043載體pKSI(C4)-HC77623來源于可商購獲得的載體pDEST17(Invitrogen)。此載體的構(gòu)建以前已經(jīng)被描述于共同未決的美國專利公開申請11/389948，該申請以引用方式并入本文。它包括來源于可商購獲得的載體pET31b(Novagen，Madison，WI)的序列，該序列編碼酮類固醇異構(gòu)酶的片段(KSI；Kuliopulos,A.禾ΠWalsh,C.Τ.，J.Am.Chem.Soc.1164599-4607(1994))。將KSI片段用作包含體標記以促進所述肽的部分進入大腸桿菌中的不溶性包含體。使用標準誘變程序(QuickChangeII，Stratagene，LaJolla,CA)修飾編碼來自pET31b的KSI序列的核酸分子以包括三個附加的半胱氨酸密碼子(除了存在于野生型KSI序列中的一個半胱氨酸密碼子之外)，導致產(chǎn)生包含體標記KSI(C4)(SEQIDNO52和53)。使用本領域的技術人員熟知的標準重組DNA方法構(gòu)建質(zhì)粒pKSI(C4)-HC77623。BamHI和AscI限制性位點有利于交換編碼不同的目的肽的核酸分子。設計插入序列使其編碼酸裂解的DP部分，用于分開包含體標記和目的肽。通過DNA2.0合成HC77643基因，它在任一末端具有合適的限制性位點，并如上所述被克隆到KSI(C4)-HC77623載體中，產(chǎn)生pSF043(SEQIDNO:50；圖5)。提供嵌合基因和對應的基因產(chǎn)物(融合肽KSI(C4)-HC77643)的序列如下分別是SEQIDNO54和55)。構(gòu)津DSF032表汰質(zhì)粒(基于dBAD的表汰)質(zhì)粒pSF032(SEQIDNO:2；圖3)包含一個ColEl型復制起始位點和賦予氨芐青霉素抗性的bla基因。標記/肽融合構(gòu)建體通過araBAD啟動子驅(qū)動。該質(zhì)粒也編araC調(diào)節(jié)子的基因。質(zhì)粒pSF032來源于可商購獲得的質(zhì)粒pBAD-HisA(Invitrogen)。簡而言之，將修飾的多克隆位點(MCS)克隆到pBAD-HisA中，并將在位點2844的NdeI限制性位點移除以產(chǎn)生pBAD啟動子的單NdeI位點下游。將所得質(zhì)粒命名為pBAD-HiSA_MCSmod。將質(zhì)粒PKSIC4-HC77623的Ndel/EcoRI片段插入pBAD_HisA_MCSmod的Ndel/EcoRI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pSF004_pBAD-KSIC4-HC77623。通過移除HC77623肽的編碼區(qū)并插入肽HC77638的編碼區(qū)，從質(zhì)粒pSF004中產(chǎn)生質(zhì)粒pSF032(參見實施例2)。構(gòu)津DLR186表汰質(zhì)粒(基于araBAD的表汰)質(zhì)粒pLR186(SEQIDNO51；圖4)包含一個ColEl型復制起點、賦予氨芐青霉素抗性的bla基因和賦予壯觀霉素(Spec)抗性的aadA-1基因。標記/肽融合構(gòu)建體通過araBAD啟動子驅(qū)動。該質(zhì)粒也編araC調(diào)節(jié)子的基因。質(zhì)粒pLR186來源于可商購獲得的質(zhì)粒pBAD-HisA(Invitrogen)。簡而言之，將修飾的多克隆位點(MCS)克隆到pBAD-HisA中，并將在位點2844的NdeI限制性位點移除以產(chǎn)生pBAD啟動子的單NdeI位點下游。將所得質(zhì)粒命名為pBAD-HiSA_MCSmod。將質(zhì)粒pKSIC4-HC77623(美國專利公開申請11/389948)的Ndel/EcoRI片段插入pBAD_HisA_MCSmod的Ndel/EcoRI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pSF004_pBAD_KSIC4_HC77623。將包含壯觀霉素抗性基因(aadA-Ι)的質(zhì)粒pCL1920(Lerner和Inouye，NucleicAcidsResearch,18=4631(1990)；GENBANK登陸號AB236930)的HindIII片段插入pSF004_PBAD-KSI4-HC77623，產(chǎn)生質(zhì)粒pLR042。質(zhì)粒pLR186(圖4;SEQIDN0:49)通過移除KSIC4-HC77623融合肽的編碼區(qū)并插入融合肽IBT139-HC776124(即，包含連接到目的肽HC776124上的包含體標記IBT-139的融合肽；參見實施例4)的編碼區(qū)，從質(zhì)粒pLR042中產(chǎn)生。實施例2構(gòu)建多種目的肽設計具有以下氨基酸序列的五個多重嵌段毛發(fā)結(jié)合肽。已經(jīng)報道了多重嵌段毛發(fā)結(jié)合肽的構(gòu)建(參見共同未決的美國專利公開申請11/389948和11/074473)。使用可溶性多重嵌段肽(即“目的肽”)評估本發(fā)明的包含體標記。每個多重嵌段毛發(fā)結(jié)合肽包含一個或多個毛發(fā)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。表1提供了功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。毛發(fā)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(用粗體示出)包括A09(IPWWNIRAPLNA；SEQIDNO3；也發(fā)現(xiàn)其結(jié)合聚甲基丙烯酸甲酯)、KF11(NTSQLST；SEQIDNO4)和D21，(RTNAADHP;SEQIDNO:5)。具有多重嵌段肽的親和結(jié)構(gòu)域通常由短肽間隔區(qū)分隔。DP酸裂解部分用斜體字示出。IND00隱IIIIK-fSm表l:用于評估本發(fā)明的包含體標記的目的可溶性肽肽名稱配方(以粗體示出的功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域)HC77607GSDP-KF11-GGG-D2l'-KCGGG-KF11-GGG-D21‘-KCGGG-KF11-GGG-D21，-KCHC77638GS[DPG-KF11-GKG-KF11-GKG-KF11-GKGWG]2DHC77643GSDPG-A09-GAG-A09-GGSGPGSGG-KF11-GGG-KF11-GGPKKHC77681GSDP-KF11-GGGHGHQKQHGLGHGHKHGHGHGHGHGK氨基酸序列GSDPNTSQLSTGGGRTNAADHPKCGGGNTSQLSTGGGRTNAADHPKCGGGNTSQLSTGGGRTNAADHPKCGSDPGNTSQLSTGKGNTSQLSTGKGNTSQLSTGKGWGDPGNTSQLSTGKGNTSQLSTGKGNTSQLSTGKGWGDGSDPGIPWWNIRAPLNAGAGIPWWNIRAPLNAGGSGPGSGGNTSQLSTGGGNTSQLSTGGPKKGSDPNTSQLSTGGGGHGHQKQHGLGHGHKHGHGHGHGHGK氣基酸SEQIDNO:12核酸SEQIDNO:1113〔0295Ui-1i-10ororoCOCOa>1_ii_icz101835898A勢s擊25/34x評估若干個融合伴侶序列(“包含體標記”)驅(qū)動所得融合肽(當被可操作地連接至一個短的、一般溶解的目的肽時)進入胞內(nèi)不溶性包含體的能力。將多個毛發(fā)結(jié)合肽構(gòu)建體(HC77607、HC77638、HC77643和HC77681)克隆到標記文庫中(親本質(zhì)粒pLX121，參見以下序列)。融合產(chǎn)物的表達由T7啟動子驅(qū)動。在大腸桿菌BL21-AI中，T7RNA聚合酶基因的表達受araBAD啟動子的控制(即阿拉伯糖誘導的表達)。此外，還將HC77638克隆到由相同標記、但不同親本質(zhì)粒(親本PSF032，參見以下序列)組成的標記文庫中，親本質(zhì)粒驅(qū)動來自araBAD啟動子的融合產(chǎn)物的表達。使用在5’末端的限制性酶切位點BamHI和在3’末端的限制性酶切位點AscI，通過批克隆方法將編碼可溶性毛發(fā)結(jié)合肽(例如目的肽)的基因克隆到標記序列的下游。將在親本質(zhì)粒pLX121中的所有構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21-AI細胞(Invitrogen)中，將在親本質(zhì)粒pSF032中的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655(ATCC46076)中，同時刪除araBAD操縱子的內(nèi)源染色體拷貝。每個文庫篩選約1000個轉(zhuǎn)化體。在SDS-PAGE凝膠上進行陽性采樣。為了確認結(jié)果，在LB(加lOOyg/mL的氨芐青霉素)中的3mL生長物與30yL每個構(gòu)建體的過夜培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。培養(yǎng)物生長至0D_值為約0.4，并用0.2%的阿拉伯糖誘導，生長3小時。為了測定可溶的細胞內(nèi)容物相對不溶的細胞內(nèi)容物，將細胞溶解并用SDS-PAGE凝膠檢測可溶性和不溶性片段。結(jié)果經(jīng)分析后，就每個經(jīng)篩選的文庫而言，明顯地四個由相似序列組成的包含體標記中的至少一個能夠驅(qū)動融合蛋白進入包含體中(表2)。不僅該標記家族中的成員能夠驅(qū)動每個受試的肽進入不溶性IB，它也能在不同的大腸桿菌菌株中用不同的驅(qū)動表達的啟動子做到這一點。29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>為了測定是否此標記家族一般可用于驅(qū)動蛋白進入包含體，使用未經(jīng)受篩選過程的蛋白以及標記文庫，對此家族最大的成員，IBT139，進行進一步評估。構(gòu)津融合肽IBT139.HC776124核酸分子(SEQIDNO22)編碼HC776124(SEQIDNO:23)，它通過DNA2.0(MenloPark,CA)合成，并將其克隆到親本質(zhì)粒pLR042的限制性位點BamHI(5’)和AscI(3’)，產(chǎn)生質(zhì)粒pLR186(SEQIDNO49)。核酸分子編碼IBT139(SEQIDNO:20)，它被克隆到限制性位點NdeI(5，)和BamHI(3，)，產(chǎn)生嵌合基因(SEQIDNO:24)，該基因編碼融合蛋白IBT139.HC776124(SEQIDNO25)。構(gòu)津體IBT139.HC776124在表3中提供了肽HC776124的設計。肽HC776124(HC77643的二聚體)由若干個毛發(fā)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，該結(jié)構(gòu)域包括A09(SEQIDNO3)和KFll(SEQIDNO4)(用粗體示出)。酸裂解的DP部分用斜體字示出(表3)。表3:HC776124的組織。肽名稱配方氨基酸序列Hm氨基酸SEQIDNOSEQIDNOHC776124GSDGSDPGIPffffNIRAPLNA2223(PG-A09-GAGAGIPffffNIRAPLNAGG-A09-GGSGPGSGPGSGGNTSQLSTGGSGG-KF11-GGGNTSQLSTGGPKKPGGG-KFlI-GGPDPGIPffffNIRAPLNAGKKPGD)2AGIPffffNIRAPLNAGGSGPGSGGNTSQLSTGGGNTSQLSTGGPKKPGD菌株牛長和IB分析。在LB(加lOOyg/mL的氨芐青霉素)中的3mL生長物與30μL每個構(gòu)建體的過夜培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。培養(yǎng)物生長至OD6tltl值為約0.4，并用0.2%的阿拉伯糖誘導，生長3小時。為了測定可溶的細胞內(nèi)容物對不溶的細胞內(nèi)容物，將細胞溶解并用SDS-PAGE凝膠檢測可溶性和不溶性片段。結(jié)果融合蛋白ΙΒΤ139.HC776124以不溶性包含體的形式產(chǎn)生。實施例5伺輔浦目白··輔復_/丨、伺邏統(tǒng)(ΙΒΤ186)翻i寸氧北■麵淀從裂解肽混合物中分離該實施例的目的是為了顯示包含有效數(shù)目的可交聯(lián)半胱氨酸殘基(IBT186包含4個半胱氨酸殘基)的小標記包含體標記(例如IBT186;SEQIDNO26和27)能驅(qū)動包含體形成，并使用氧化交聯(lián)使它們?nèi)菀追蛛x。該實施例也顯示可修飾以前顯示對誘導包含體形成有效的小包含體標記以包含有效量的可交聯(lián)半胱氨酸殘基(IBT186來源于小標記IBT139(實施例3至4)，在它的序列中分布有四個可交聯(lián)的半胱氨酸)，同時保持其有效驅(qū)動包含體形成的能力。四個半胱氨酸的存在允許在裂解標記和多肽后簡單沉淀所述標記。IBT186.HC776124的構(gòu)津、克降和初步分析核酸分子(SEQIDNO26)編碼IBT186，它通過DNA2.0(MenloPark，CA)合成，并被克隆到質(zhì)粒PLR186(由pBAD啟動子驅(qū)動表達)的限制性位點Ndel(5，)和BamHI(3，)以制備具有HC776124構(gòu)建體的融合體，產(chǎn)生嵌合基因(SEQIDNO:28)，該基因編碼融合肽IBT186.HC776124(SEQIDNO:29)。將所得質(zhì)粒(pLR238)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655(ATCC46076)中，其中araBAD操縱子已被刪除。在LB(加100ug/mL的氨芐青霉素)中的3mL生長物與30yL過夜培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。培養(yǎng)物生長至0D■值為約0.4，并用0.2%的阿拉伯糖誘導，生長3小時。為了測定可溶的細胞內(nèi)容物對不溶的細胞內(nèi)容物，將細胞溶解并用SDS-PAGE凝膠檢測可溶性和不溶性片段。融合蛋白以不溶性包含體的形式產(chǎn)生。大規(guī)樽制備和分離融合蛋白IBT186.HC776124牛長條件除非另外指明，大腸桿菌細胞在10L容器中發(fā)酵。發(fā)酵經(jīng)歷三個階段1.制備125mL的種子種菌。包含目的構(gòu)建體的細胞在125mL的2YT種子培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，16g/L蛋白胨，5g/L氯化鈉以及合適的抗生素)中培養(yǎng)，并在37°C生長若干個小時。2.在批生產(chǎn)階段生長。在37°C下，將125mL種菌加到6L批培養(yǎng)基(9g/LKH2P04，4g/L(NH4)2HP041.2g/LMgS04.7H20,1.7g/L檸檬酸，5g/L酵母提取物，0.lmL/LBiospumex153K消泡劑，4.5mg/LThiamine.HC1，23g/L葡萄糖，lOmL/L痕量元素，50mg/L尿嘧啶，合適的抗生素，pH6.7)中。3.在給料批生產(chǎn)階段生長。在批生產(chǎn)階段生長約12小時后，開始給料批生產(chǎn)階段。在37°C下，將給料批培養(yǎng)基(2g/LMgS04.7H20，4g/L(NH4)2HP049g/LKH2P04，1至2g/min葡萄糖)以恒定速率加到反應器中，持續(xù)約15小時。在結(jié)束給料批生產(chǎn)階段4小時前，加入2g/LL-阿拉伯糖誘導細胞表達P0I。發(fā)酵肉湯加工、氧化交聯(lián)和分析全部發(fā)酵肉湯通過12，OOOpsi(82，700kPa)的APV型2000Gaulin型勻化器三次。在每次勻化前將肉湯冷卻至5°C以下。勻化肉湯立即在600mL/min和12，000相對離心力(RCF)條件下通過WestfaliaWHISPERFUGE(WestfaliaSeparatorInc.，Northvale,NJ)疊加盤式離心機，以從懸浮細胞碎片和溶解雜質(zhì)中分離包含體。將回收的沉淀以15g/L(干基)重懸在水中，并使用氫氧化鈉將PH調(diào)節(jié)至約10.0。懸浮液在12，OOOpsi(82，700kPa)條件下通過APV2000GaUlin型勻化器一次以提供嚴格混合。勻化的pHIO懸浮液立即在600mL/min和12，000RCF條件下通過WestfaliaWHISPERFUGE疊加盤式離心機，以從懸浮細胞碎片和溶解雜質(zhì)中分離經(jīng)洗滌的包含體?；厥盏某恋硪?5gm/L(干基)重懸在純水中。懸浮液在12，OOOpsi(82，700kPa)條件下通過APV2000Gaulin型勻化器一次以提供嚴格洗滌。勻化懸浮液立即在600mL/min和12，000RCF條件下通過WestfaliaWHISPERFUGE疊加盤式離心機，以從殘余懸浮細胞碎片和氫氧化鈉中分離經(jīng)洗滌的包含體?；厥盏某恋硪?5g/L(干基)重懸在純水中，并用HCl將pH或混合物調(diào)節(jié)至2.2。將酸化懸浮液加熱至70°C并保持14小時以裂解DP位點，該位點分隔融合肽與產(chǎn)物肽。中和產(chǎn)物的pH(注意取決于回收肽的溶解度，使用的PH可能不同)，并冷卻至5°C，保持12小時。在此步驟期間，將懸浮液保存在500mL或IL的瓶中，懸浮液不超過瓶的3/4滿刻度以確保存在充足的氧氣，從而確保通過二硫化物形成半胱氨酸交聯(lián)。然后在9000RCF離心混合物30分鐘，取上清液進行HPLC分析。HPLC分析用0.2微米膜過濾上清液。將過濾后產(chǎn)物載入22X250mm的反相色譜柱GraceVydac(218TP1022)，該柱包含10微米C18介質(zhì)，它用10%乙腈(ACN)，90%水和0.1%ν/ν三氟乙酸(TFA)進行預處理。通過柱洗脫以純化狀態(tài)回收產(chǎn)物，洗脫用水和乙腈(ACN)的梯度洗脫液，水中的乙腈(ACN)含量由10%變化至25%，TFA為0.1%ν/ν，室溫，流速為大約lOmL/min。使用在220nm處的分光光度曲線檢測監(jiān)控并跟蹤產(chǎn)物肽的洗脫。氧化交聯(lián)以從目的肽中分離IBT如上所述純化蛋白。在酸裂解和pH中和后，在5°C貯存混合物約6小時以使得半胱氨酸形成交聯(lián)鍵。環(huán)境空氣暴露提供氧氣，引起半胱氨酸交聯(lián)。在9000RCF條件下離心混合物30分鐘，并從目的可溶性肽中分離沉淀的包含體標記。氧化交聯(lián)后的結(jié)果對沉淀物和剩余的可溶性片段的SDS-PAGE凝膠分析顯示在不溶性沉淀中和可溶性片段中剩余的HC776124中存在IBT186。通過HPLC進一步證實了這一點，它顯示在可溶性片段(參見表4)中僅存在HC776124。實施例6句,含有效量的可奪聯(lián)半胱氡酸的小句,含體|示記IBT139(5C)能誦i寸氧,化奪聯(lián)禾時冗淀從裂解肽混合物中分離此實施例的目的是為了顯示包含有效數(shù)目的可交聯(lián)半胱氨酸殘基(IBT139(5C)包含5個半胱氨酸殘基)的另一個小標記包含體標記(例如IBT139(5C)；SEQIDNO265)能驅(qū)動包含體形成，并使用氧化交聯(lián)使它們?nèi)菀追蛛x。該實施例也顯示可修飾以前顯示對誘導包含體形成有效的小包含體標記以包含有效量的可交聯(lián)半胱氨酸殘基(IBT139(5C)來源于小標記IBT139(實施例4)，在它的序列中分布有五個可交聯(lián)的半胱氨酸)，同時保持其有效驅(qū)動包含體形成的能力。五個半胱氨酸的存在允許在裂解標記和目的肽后簡單沉淀所述標記。構(gòu)建體IBT139(5C)-HC776124(pLR435)(SEQIDNO266至267)IBT139(5C).HC776124的克隆和初步分析編碼序列(SEQIDNO264)編碼IBT139(5C)(SEQIDNO265),它通過DNA2.0(MenloPark,CA)合成，并被克隆到質(zhì)粒pLR186(由pBAD啟動子驅(qū)動表達)的限制性位點NdeI(5，)和BamHI(3，)以制備具有HC776124(SEQIDNO:22)構(gòu)建體的融合體，產(chǎn)生質(zhì)粒pLR435(SEQIDNO:263)。用刪除的天然araBAD操縱子將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655(ATCC46076)中。下文提供了包含5個半胱氨酸殘基(用粗體示出)的IBT139(5C)序列。IBT139(5C)MASCGQQRFQWQFEQQPRCGQQRFQWQFEQQPRCGQQRFQffQFEQQPECGQQRFQffQFEQQPC(SEQIDNO265)。在LB(加100μg/mL的氨芐青霉素)中的3mL生長物與30μL過夜培養(yǎng)物一起培養(yǎng)。培養(yǎng)物生長至OD6tltl值為約0.4，并用0.2%的阿拉伯糖誘導，生長3小時。為了測定可溶的細胞內(nèi)容物對不溶的細胞內(nèi)容物，將細胞溶解并用SDS-PAGE凝膠檢測可溶性和不溶性片段。將融合蛋白再次制備成不溶性包含體。牛產(chǎn)蛋白產(chǎn)品如上所述(實施例5)生產(chǎn)和加工蛋白。在酸裂解和ρΗ中和后，在5°C貯存混合物約6小時以使得半胱氨酸殘基氧化并形成交聯(lián)鍵。環(huán)境空氣暴露提供足夠的氧氣，引起半胱氨酸交聯(lián)。隨后在9000RCF條件下離心混合物30分鐘，并從目的可溶性肽中分離沉淀的包含體標記。結(jié)果對沉淀物和剩余的可溶性片段的SDS-PAGE凝膠分析顯示在不溶性沉淀中和可溶性片段中剩余的HC776124中存在IBT139(5C)。通過HPLC(參見如實施例5所述的方法)進一步證實了這一點，它顯示在可溶性片段中僅存在HC776124。表4綜述了交聯(lián)實驗的結(jié)果。實施例7齡輔^伺邏fe械職麵氧北肽講入包含體的能力此實施例的目的是為了顯示將至少一個包含有效數(shù)目半胱氨酸殘基的可交聯(lián)的半胱氨酸基序加到包含體標記末端可產(chǎn)生可交聯(lián)的IBT，即使半胱氨酸彼此接近。將可交聯(lián)的半胱氨酸基序加到包含體標記上，該標記正常情況下缺乏可交聯(lián)的半胱氨酸殘基(即IBT139；SEQIDNO:21)，產(chǎn)生半胱氨酸修飾的標記“IBT139.CCPGCC”(SEQIDN0:30至31)。加入基序不改變IBT的驅(qū)動包含體形成的能力，同時所述修飾有利于使用氧化交聯(lián)簡單分離該標記。表4綜述了交聯(lián)實驗的結(jié)果。融合肽IBT139.CCPGCC.HC776124的克隆和初步分析為了有利于交聯(lián)，將四半胱氨酸標記CCPGCC(SEQIDNO:32至33)導入天然不包含半胱氨酸殘基的包含體促進序列IBT139(SEQIDNO21)末端，導致產(chǎn)生IBT139.CCPGCC(SEQIDNO:30和31)。CCPGCC四半胱氨酸標記是LUMI0雙砷染料結(jié)合基序。LUMI0Green^IHi^O^^tlX自Invitrogen(Invitrogen,Carlsbad,CA)。通過SigmaGenosys合成編碼四半胱氨酸標記的寡核苷酸。頂鏈寡5'-GATCTTGCTGTCCGGGCTGTTGCG-3‘(SEQIDNO:34)和底鏈寡5'-GATCCGCAACAGCCCGGACAGCAA-3‘(SEQIDNO35)用在5’末端的BglII突出端和在3’末端的BamHI突出端進行退火。將退火的雙鏈片段克隆到肽表達質(zhì)粒PLR186的BamHI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pLR199。質(zhì)粒pLR199包含目的肽HC776124，它與通過Pbad啟動子表達的包含體促進序列IBT139融合。所得克隆包含四半胱氨酸標記CCPGCC(SEQIDNO:33)，該標記插入包含體促進序列之后，酸裂解位點之前。提供編碼融合肽IBT139.CCPGCC.HC776124的核酸分子SEQIDNO:36，并提供所得融合肽SEQIDNO:37ο通過在蛋白凝膠上泳動相同數(shù)目的細胞并觀察相同水平的表達，發(fā)現(xiàn)導入四半胱氨酸部分不影響肽的表達或定位。通過用CELLYTICTMEXpresS處理細胞并檢查它們是否是不溶性片段，顯示過表達蛋白以包含體的形式存在。在包含體促進序列IBT139上加上可交聯(lián)的CCPGCC標記不改變包含體標記形成包含體的能力(表4)。牛產(chǎn)蛋白產(chǎn)品如實施例5所述純化蛋白。在酸裂解和pH中和后，在5°C貯存混合物至少6小時以使得半胱氨酸形成交聯(lián)鍵。環(huán)境空氣暴露提供氧氣，引起半胱氨酸交聯(lián)。在9000RCF條件下離心混合物30分鐘，并從可溶性肽中分離沉淀的標記。MMSDS-PAGE凝膠分析沉淀物和剩余可溶性片段，結(jié)果顯示在不溶性沉淀和可溶性片段中剩余的目的肽(HC776124)中存在包含體標記(IBT139.CCPGCC)。通過HPLC分析進一步證實了這一點，它顯示在可溶性片段中僅存在HC776124。表4綜述了交聯(lián)實驗的結(jié)果。表4交聯(lián)結(jié)果綜述評估的構(gòu)建體IBT誘導細胞中~在包含體標記中經(jīng)由氧化交聯(lián)和的IB形成的半胱氨酸數(shù)目離心分離IBT139.HC776124MIBT186.HC776124是4是IBT139.CCPGCC.HC776124^4^IBT139(5C).HC776124是5是實施例8制備附加的包含體標記基于IBT136設計附加的包含體標記。測試伴侶序列(IBT182、IBT183、IBT184、IBT185、IBT186(如上所述，也用HC776124進行評估)、IBT187a和IBT187b)的總體方案是為了設計(當退火的時候)生成粘性末端的DNA寡核苷酸，需要該粘性末端來定向克隆框內(nèi)融合伴侶與測試表達肽HC77643。裝配合成的互補寡核苷酸的不同組合，它們具有大腸桿菌密碼子偏倚密碼子。設計寡核苷酸對以測試基于序列IBT136的不同序列修飾(表5)。牛成和測試推定的IBT核酸分子(SEQIDNO:38)編碼氨基酸序列IBT182(QQHFHWHFQQQPRGQQHFHWHFQQQPEGQQHFHWHFQQQ；SEQIDNO39)，它從兩個互補合成大腸桿菌密碼子偏倚寡核苷酸(Sigma-Genosys)裝配得到。在每個寡核苷酸中包括突出端以生成與限制性位點NdeI和BamHI相容的退火末端。通過將去離子水中的IOOpmol每種寡核苷酸在一個管中組合并在99°C水浴中加熱10分鐘(然后關閉水浴)來退火寡核苷酸。允許緩慢退火寡核苷酸直至水浴達到室溫(20至25°C)。在連接到測試載體中之前，將退火的寡核苷酸稀釋于IOOyL水中。載體pSF043(SEQIDNO50)包含HC77643目的肽，它與KSI(C4)(SEQIDNO52至53)包含體標記相連，產(chǎn)生融合肽KSI(C4)·HC77643(SEQIDNO:54至55)。在緩沖液2(NewEnglandBioLabs,BeverlyΜΑ)中消化載體，緩沖液2包含IOmMTris-HCl,IOmMMgCl2,50mM氯化鈉，ImM二硫蘇糖醇(DTT)；pH7.9)，使用NdeI和BamHI限制性酶以釋放一個381個堿基對(bp)的片段，對應于IBTKSI(C4)。來自消化質(zhì)粒的NdeI-BamHI片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，并使用QiagenQIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGENValencia,CA；cat#28704)從凝膠中純化載體。在12°C，用T4DNA連接酶(NewEnglandBioLabsBeverly,MA；catalog#M0202)將經(jīng)稀釋和退火的寡核苷酸(大約0.2pmol)連接到經(jīng)NdeI-BamHI消化、凝膠純化的質(zhì)粒上(大約50ng)18小時。DNA序列分析確認所期望的質(zhì)粒序列。將包含編碼融合到HC77643目的肽上的IBT182的嵌合基因的表達載體轉(zhuǎn)化到阿拉伯糖誘導的表達菌株大腸桿菌BL21-A1中(Invitrogen)。為了制備重組蛋白，用轉(zhuǎn)化細菌的單菌落接種3mLLB-氨芐青霉素肉湯(10g/L胰化蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉，100mg/L氨芐青霉素；pH7.0)，并在37°C振蕩培養(yǎng)物直至0D_值為0.6。通過加入0.03mL20%的L-阿拉伯糖(終濃度0.2%,Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)到培養(yǎng)物中誘導表達，并持續(xù)振蕩3小時。為了進行全細胞分析，收集、沉淀0.10D_mL細胞，并把0.06mLSDSPAGE樣本緩沖液(IXLDS樣本緩沖液(Invitrogencat#NP0007)，6M尿素，IOOmMDTT)直接加到全細胞中。在99°C加熱樣本10分鐘以增溶蛋白。將增溶后的蛋白加載至IJ4%至12%的梯度MESNUPAGE凝膠(^11卩八0￡@凝膠(^邙肥0322，1^3Buffercat#NP0002；Invitrogen)上，并用考馬斯亮藍G-250染色(SimplyBlueSafeStain；Invitrogen；cat#LC6060)使其可見，用于包含體形成。上述克隆和表達方案對IBT183、IBT184、IBT185、IBT186、IBT187a和IBT187b重復實施。IBT187b是由IBT187a生成的偽克隆。測定是否存在包含體形式的融合肽。在表5中測定并報道了多種包含體標記的序列以及它們驅(qū)動包含體形成正常條件下可溶的目的肽(HC77643)的能力。表5通過來源于IBT136的附加IBT獲取的結(jié)果綜述。測定是否存在形成的包含體。表5。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>權(quán)利要求包含體標記，所述包含體標記包含下列通式結(jié)構(gòu)Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln-間隔區(qū)-[[Gln-Gln-Xaa1-Phe-Xaa2-Trp-Xaa3-Phe-Xaa4-Xaa5-Gln]-[間隔區(qū)]m]n其中Xaa1＝Arg、His、或Lys；Xaa2＝Gln、His、或Lys；Xaa3＝Gln、His、或Lys；Xaa4＝Glu或Gln；Xaa5＝Gln或Lys；n＝1至10；m＝n-1；并且間隔區(qū)＝多肽，所述多肽包含氨基酸，所述氨基酸選自脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸。2.權(quán)利要求1的包含體標記，所述包含體標記還包含至少一個可交聯(lián)的半胱氨酸部分，所述半胱氨酸部分包括SEQIDN0:33。3.權(quán)利要求1的包含體標記，所述包含體標記還包含至少一個可交聯(lián)的半胱氨酸部分，所述半胱氨酸部分位于所述包含體標記的氨基末端或羧基末端。4.權(quán)利要求1的包含體標記，所述包含體標記選自:SEQIDN0:15、SEQIDNO19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:27、SEQIDNO:31、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO49和SEQIDNO:265。5.包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的包含體標記的融合肽，其中所述包含體標記被可操作地連接到至少一個目的肽上。6.權(quán)利要求5的融合肽，所述融合肽還包含至少一個裂解位點，所述裂解位點將所述包含體標記從所述至少一個目的肽上分隔開。7.權(quán)利要求6的融合肽，其中所述目的肽選自聚合物結(jié)合肽、毛發(fā)結(jié)合肽、指/趾甲結(jié)合肽、皮膚結(jié)合肽、牙齒結(jié)合肽、抗微生物肽、粘土結(jié)合肽、色素結(jié)合肽和纖維素結(jié)合肽。8.核酸分子，所述核酸分子編碼包含權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的包含體標記的融合肽，其中所述包含體標記被可操作地連接到至少一個目的肽上。9.表達盒，所述表達盒包含權(quán)利要求8的核酸分子。10.載體，所述載體包含權(quán)利要求9的表達盒。11.微生物宿主細胞，所述宿主細胞包含權(quán)利要求10的載體。12.權(quán)利要求11的微生物宿主細胞，其中所述宿主細胞選自曲霉屬、木霉屬、糖酵母屬、畢赤酵母屬、耶氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜酵母屬、沙門氏菌屬、芽孢桿菌屬、不動桿菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、土壤桿菌屬、赤細菌屬、綠菌屬、著色菌屬、黃桿菌屬、噬纖維菌屬、紅細菌屬、紅球菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬、棒狀桿菌屬、分支桿菌屬、異常球菌屬、埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、甲基單胞菌屬、甲基細菌屬、甲基球菌屬、甲基彎菌屬、甲基微菌屬、甲基孢囊菌屬、產(chǎn)堿菌屬、集胞藍細菌屬、聚球藍細菌屬、魚腥藍細菌屬、硫桿菌屬、甲烷桿菌屬、克雷伯氏菌屬和粘球菌屬。13.用于表達不溶形式的肽的方法，所述方法包括a)合成編碼融合肽的可表達的遺傳構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的包含體標記的第一部分，所述第一部分被可操作地連接至編碼目的肽的第二部分；b)用所述(a)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化表達宿主細胞；c)在可表達的遺傳構(gòu)建體被表達并以不溶形式產(chǎn)生編碼的融合肽的條件下使所述(b)中轉(zhuǎn)化過的宿主細胞生長；和d)以所述不溶形式回收所述融合肽。14.用于生產(chǎn)目的肽的方法，所述方法包括a)合成編碼融合肽的遺傳構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的包含體標記的第一部分，所述第一部分被可操作地連接至編碼至少一個目的肽的第二部分；其中所述第一部分和所述第二部分被至少一個可裂解的肽接頭分隔；b)用所述(a)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化表達宿主細胞；c)在表達所述遺傳構(gòu)建體并以不溶形式產(chǎn)生編碼的融合肽的條件下使所述(b)中轉(zhuǎn)化過的宿主細胞生長；d)以所述不溶形式回收融合肽；e)在所述至少一個可裂解的肽接頭處裂解所述融合肽，由此融合肽的所述第一部分不再與所述第二部分融合；以及f)回收所述目的肽。15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述目的肽選自聚合物結(jié)合肽、毛發(fā)結(jié)合肽、指/趾甲結(jié)合肽、皮膚結(jié)合肽、牙齒結(jié)合肽、粘土結(jié)合肽、色素結(jié)合肽、纖維素結(jié)合肽和抗微生物全文摘要肽標記此處是指包含體標記，它被公開用于產(chǎn)生不溶性融合肽。所述融合肽包含至少一個包含體標記，它被可操作地連接到目的肽上。在宿主細胞中融合肽的表達導致在細胞和/或細胞溶解產(chǎn)物中產(chǎn)生一種不溶性的、包含在包含體中的產(chǎn)物。然后可將所述包含體進行純化，并可以將目的蛋白在裂解后從包含體標記中分離出來。文檔編號C12N15/62GK101835898SQ200880025376公開日2010年9月15日申請日期2008年7月23日優(yōu)先權(quán)日2007年7月25日發(fā)明者L·D·里斯,L·J·德卡羅利斯,P·E·魯維埃,Q·程,S·R·法內(nèi)斯托克,T·M·格魯伯申請人:納幕爾杜邦公司