專利名稱：具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及通過增加植物中產(chǎn)率增加性多肽的編 碼核酸序列的表達來增強多種植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述產(chǎn)率增加性多肽選自
核定位AT-hook 基序蛋白 19/20 (AHL19/20)、GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽，和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。本發(fā)明還涉及具有增加的編碼所述產(chǎn)率增加性多 肽的核酸序列的表達的植物，該植物相對于對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀。本發(fā)明還 提供了用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。
背景技術(shù)：
不斷增長的世界人口和逐漸減少的農(nóng)業(yè)可用耕地助長了提高農(nóng)業(yè)效率研究之勢。 傳統(tǒng)的作物和園藝學(xué)改良方法利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，此類選育 技術(shù)有若干缺陷，即這些技術(shù)一般為勞動密集型的，而且產(chǎn)生的植物通常含有異質(zhì)的遺傳 組分，這些異質(zhì)的遺傳組分不一定總是導(dǎo)致期望性狀自親本植物的傳遞。分子生物學(xué)的進 展已經(jīng)使人類能夠修飾動物和植物的種質(zhì)。植物遺傳工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(一般 為DNA或RNA的形式)以及隨后將遺傳物質(zhì)引入植物。這類技術(shù)能夠產(chǎn)生具多種改良的經(jīng) 濟、農(nóng)藝或園藝性狀的作物或植物。具有特別經(jīng)濟意義的一種性狀是增加的產(chǎn)率。產(chǎn)率通常定義為作物可測量經(jīng)濟價 值的產(chǎn)出。這可以以數(shù)量和/或質(zhì)量的方式進行定義。產(chǎn)率直接取決于若干因素，例如器 官的數(shù)量和大小、植物構(gòu)造(例如，分枝的數(shù)量)、種子產(chǎn)量、葉子衰老等等。根的發(fā)育、營養(yǎng) 吸收、脅迫耐受性和早期活力也是決定產(chǎn)率的重要因素。因此優(yōu)化一個或多個上述因素也 可以促進作物產(chǎn)率的增加。種子產(chǎn)率是特別重要的性狀，這是因為許多植物的種子對于人類和動物營養(yǎng)而言 至關(guān)重要。通過對種子本身的直接消耗，或是通過消耗由加工的種子所飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品，作 物諸如玉米、稻、小麥、蕓苔(canola)和大豆等占人類總卡路里攝取量的一半以上。它們也 是工業(yè)加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚(新的枝條和根的來源) 和胚乳(萌發(fā)過程和幼苗早期生長過程中胚生長的營養(yǎng)源)。種子的發(fā)育涉及許多基因，并 且需要代謝物自根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長的種子。特別是胚乳，同化糖類、油類和蛋白質(zhì) 的代謝前體，將其合成為貯存性高分子，以充盈籽粒。收獲指數(shù)為種子產(chǎn)率與地上干重之間的比值，其在許多環(huán)境條件下相對穩(wěn)定，因 此在植物大小和糧谷(grain)產(chǎn)率之間通常能夠獲得比較穩(wěn)靠的相關(guān)性(如Rebetzke等 人(2002)Crop Science 42:739)。這些方法存在固有的聯(lián)系，原因是大多數(shù)糧谷生物量取 決于植物葉和莖的當前的或貯存的光合產(chǎn)率(Gardener等人(1985)Physiology of Crop Plants. Iowa StateUniversity Press，68-73頁)。因此，對植物大小的選擇，甚至是在 發(fā)育早期階段的選擇，已經(jīng)用作為未來潛在產(chǎn)率的指標(如Tittonell等人(2005)AgricEcosys&Environ 105 213)。當檢查遺傳差異對脅迫耐受性的影響時，溫室或植物生長室環(huán) 境與田間相比具有固有的優(yōu)勢，即，能夠使土壤性能、溫度、水和養(yǎng)分可利用度以及光強度 標準化。不過，由于因缺乏風(fēng)力或昆蟲導(dǎo)致的不良授粉，或由于空間不足以讓成熟根或冠層 生長等等，而對產(chǎn)率造成的人為局限性，會限制這些受控環(huán)境在測試產(chǎn)率差異中的應(yīng)用。因 此，在生長室或溫室中在標準化條件下測量早期發(fā)育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產(chǎn) 率優(yōu)勢指標的標準作法。另一重要的性狀為增加的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是導(dǎo)致全世界作 物損失的首要原因，使大多數(shù)主要作物植物的平均產(chǎn)率下降超過50% (Wang等人， Planta(2003) 218:1-14)。非生物脅迫可以因干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性、養(yǎng)分(大量 元素和/或微量元素)過量或不足、輻射和氧化脅迫而引起。提高植物非生物脅迫耐受性 的能力將對全世界的農(nóng)場主帶來重大的經(jīng)濟利益，并將使得能夠在不利條件下以及在原本 不可能栽培作物的地域中栽培作物。
對于許多作物而言，另一重要的性狀是早期活力(early vigour) 0改良早期活力 是溫帶和熱帶稻類栽培種的現(xiàn)代稻類育種項目的重要目標。長根對于水栽稻的恰當土壤錨 固至關(guān)重要。在直接向澇地里播種稻米的情況下，以及在植物必須迅速穿過水出苗的情況 下，較長的枝條與活力有關(guān)。在進行條播的情況下，較長的中胚軸和胚芽鞘對于優(yōu)良的出苗 至關(guān)重要。改造植物早期活力的能力在農(nóng)業(yè)上將具有極其重要的意義。例如，一直以來早 期活力弱限制了在歐洲大西洋地區(qū)引入基于玉米帶種質(zhì)的玉米(玉蜀黍，Zea mays L.)雜 交種。另一重要的性狀是在非生物脅迫條件下生長的植物的增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀。非 生物脅迫是導(dǎo)致全世界作物損失的首要原因，使大多數(shù)主要作物植物的平均產(chǎn)率下降超過 50% (Wang等人，Planta(2003) 218 1-14)。非生物脅迫可以因干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué) 毒性、養(yǎng)分(大量元素和/或微量元素)過量或不足、輻射和氧化脅迫而引起。增強在非生 物脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的能力將對全世界的農(nóng)場主帶來重大的經(jīng)濟利 益，并將使得能夠在不利條件下以及在原本不可能栽培作物的地域中栽培作物。因此通過優(yōu)化上述因素之一可以增加作物產(chǎn)率。視最終用途而定，可能更優(yōu)選修飾某些產(chǎn)率性狀。例如，對于諸如飼料或木材生產(chǎn) 或者生物燃料資源等應(yīng)用，可能期望植物營養(yǎng)部分的增長，而對于諸如面粉、淀粉或油料生 產(chǎn)等應(yīng)用，可能特別期望種子參數(shù)的增長。即便是在種子參數(shù)之中，視用途而定，一些參數(shù) 也可能比另一些更優(yōu)。多種機制可促成增加的種子產(chǎn)率，無論形式是增加的種子大小、還是 增加的種子數(shù)量。增加植物產(chǎn)率相關(guān)性狀(種子產(chǎn)率和/或生物量)的一種方法可以是修飾植物的 內(nèi)在生長機制，如細胞周期或者參與植物生長或防御機制的各種信號傳遞路徑。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過在植物中增加編碼核定位AT-hook基序蛋白Igz^O(AHLigAO)多 肽的核酸序列的表達，可以相對于對照植物增強植物的多種種子產(chǎn)率相關(guān)性狀，而無延遲 的開花。增強的種子產(chǎn)率性狀相關(guān)性狀包括一個或多個下列性狀增加的每圓錐花序的花 數(shù)、增加的每株植物的種子總產(chǎn)率、增加的飽滿種子數(shù)和增加的收獲指數(shù)。
此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，增加編碼GRP多肽(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a) 多肽)的核酸序列的表達，可以產(chǎn)生在非生物脅迫條件下生長時相對于在相當條件下生長 的對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。此外，現(xiàn)還發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)ATT樣多肽編碼核酸在地上植物部分中的表達，可以產(chǎn)生相 對于對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別是增加的產(chǎn)率，的植物。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在非限氮條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀可通過調(diào)節(jié)ATT多 肽編碼核酸在這樣的植物中的表達來增強。
背景技術(shù)：
DNA結(jié)合蛋白是包含任何DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域并因此對DNA具有特定的或一般的親和力的蛋白質(zhì)。DNA結(jié)合蛋白包括例如調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程的轉(zhuǎn)錄因子、切割DNA分子的核酸酶以及 參與細胞核中DNA包裝的組蛋白。AT-hook基序是首先在高遷移率組非組蛋白染色體蛋白質(zhì)HMG-I/Y中描述的短 DNA 結(jié)合蛋白基序(Reeves 和 Nissen (1990) J Biol Chem 265:8573-8582)。已知 AT-hook 與富含AT的核酸序列的小溝相互作用(Huth等(1997)Nat Struc Biol 4:657-665)。已 在廣泛的來自動物、植物和微生物的DNA結(jié)合蛋白中鑒定到AT-hook基序。與幾種已良好 表征的DNA結(jié)合基序不同，AT-hook基序短，不超過13個氨基酸殘基，并且在其中心具有典 型的三肽序列甘氨酸_精氨酸_脯氨酸(Gly-Arg-Pro或GRP)。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，大約30種包含至少一個AT-hook基序的 多肽還包含植物及原核生物保守(nlant and nrokaryotes conserved, PPC)結(jié)構(gòu)域，該結(jié) 構(gòu)域在歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinformatics Institute) (EBI)的 InterPro 結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫中被描述為DUF296(未知功能結(jié)構(gòu)域296) (Fujimoto等(2004)Plant Molec Biol 56:225-239)。這些蛋白質(zhì)之一被發(fā)現(xiàn)定位于核質(zhì)中，從而被稱為核定位AT_hook基 序蛋白丄(AHL1 ；Fujimoto等，同上)。類似地命名了旁系同源多肽，即AHL，并順序編號。在美國專利7，193，129和美國專利申請2005/0097638中，將擬南芥AHL多肽 AHL19 (根據(jù)Fujimoto等，同上)(標識為G2153)轉(zhuǎn)化入擬南芥，并且使用35S CaMV啟動 子進行表達。轉(zhuǎn)基因植物顯示出改良的性狀，例如增加的鹽脅迫耐受性、增加的滲透脅迫耐 受性、增加的干旱耐受性、增加的對冷凍的耐受性和增加的對糖的植物應(yīng)答。在美國專利申 請2005/0097638中，與對照植物相比較，AHL19多肽以及幾種旁系同源AHL多肽的過量表 達(在35S CaMV啟動子的控制下)顯著延遲了轉(zhuǎn)基因植物的開花，從而增加產(chǎn)率。發(fā)明_既述根據(jù)一個實施方案，提供了相對于對照植物增強植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方 法，該方法包括增加編碼AHL19/20多肽的核酸序列在植物中的表達。增強的種子產(chǎn)率相關(guān) 性狀包括一個或多個下列性狀增加的每圓錐花序的花數(shù)、增加的每株植物的種子總產(chǎn)率、 增加的飽滿種子數(shù)和增加的收獲指數(shù)。根據(jù)一個實施方案，提供了相對于對照植物增強在非生物脅迫條件下生長的植物 的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，該方法包括增加GRP多肽編碼核酸序列在植物中的表達，其中所 述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽，增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多個下列性狀±曾 加的地上生物量、增加的每株植物的種子總產(chǎn)率、增加的飽滿種子數(shù)、增加的種子總數(shù)、增 加的一級圓錐花序(primary panicles)數(shù)、和增加的種子飽滿率。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了相對于對照植物增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的 方法，該方法包括調(diào)節(jié)編碼AAT-樣多肽的核酸在地上植物部分中的表達。在優(yōu)選實施方案 中，編碼AAT-樣多肽的核酸的表達通過將所述核酸有效連接至在地上植物部分中具有活 性的啟動子來進行調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)。根據(jù)一個實施方案，提供了增強在非限氮條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方 法，該方法包括調(diào)節(jié)ATT多肽編碼核酸在植物中的表達。定義 多肽/蛋白質(zhì)術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在文中互換使用，是指通過肽鍵連接起來的、任意長度的 氨基酸多聚體。雜_ / _ /豐亥_歹丨丨/浦_歹丨丨術(shù)語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”在文中互換使用，是指任何 長度的無支鏈形式的多聚核苷酸，所述核苷酸或者為核糖核苷酸或者為脫氧核糖核苷酸或 者為兩者的組合。對照棺物選擇合適的對照植物是實驗設(shè)置的常規(guī)部分，并且可以包括相應(yīng)的野生型植物或 不含目的基因的相應(yīng)植物。對照植物通常與待評估植物為相同的植物物種，或者甚至為同 一品種。對照植物還可以是待評估植物的無效合子(nullizygote)。如本文所用的“對照 植物”不僅指完整植物，而且指植物部分，包括種子和種子部分。同源物蛋白質(zhì)的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)和酶，其相對于所討論的未修飾蛋 白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且具有與其源自的未修飾蛋白質(zhì)相似的生物活 性和功能活性。缺失是指從蛋白質(zhì)中除去一個或多個氨基酸。插入是指在蛋白質(zhì)的預(yù)定位置引入一個或多個氨基酸殘基。插入可以包括單個或 多個氨基酸的N-末端和/或C-末端融合以及序列內(nèi)插入。一般氨基酸序列內(nèi)部的插入將 小于N-或C-末端的融合，數(shù)量級約1到10個殘基。N-或C-末端融合蛋白質(zhì)或肽的實例 包括如在酵母雙雜交系統(tǒng)中應(yīng)用的轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼 蛋白、(組氨酸)-6_標簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶標簽、蛋白質(zhì)A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還 原酶、Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG 表位、lacz, CMP (鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、 蛋白質(zhì)C表位和VSV表位。取代是指蛋白質(zhì)中的氨基酸用具有相似性質(zhì)(如相似的疏水性、親水性、抗原性、 形成或打破α螺旋結(jié)構(gòu)或β片層結(jié)構(gòu)的傾向性)的其他氨基酸替換。氨基酸取代通常是 單個殘基的取代，但是視施加于多肽上的功能性限制而定也可以發(fā)生成簇取代；取代通常 在大約1到10個氨基酸殘基數(shù)量級。氨基酸取代優(yōu)選為保守氨基酸取代。保守取代表在本 領(lǐng)域眾所周知(參見例如 Creighton (1984)Proteins. W. H. Freeman and Company (編輯) 和下表1)。表1 保守氨基酸取代的實例 可通過本領(lǐng)域眾所周知的肽合成技術(shù)，如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作， 容易地進行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的取代、插入或缺失變體的DNA 序列操作方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知在DNA預(yù)定位置進行取 代突變的技術(shù)，包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH) ,QuickChange定點誘 變(Stratagene，San Diego, CA)、PCR介導(dǎo)的定點誘變或其他定點誘變方案。衍牛物“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，與蛋白質(zhì)如目的蛋白質(zhì)的天然形式的氨基酸序列相 比，其可以包括用非天然氨基酸殘基進行的氨基酸取代、或者添加非天然氨基酸殘基。蛋白 質(zhì)的“衍生物”還包括肽、寡肽、多肽，與多肽天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然 改變的(糖基化、酰基化、異戊二烯化、磷酸化、豆蔻?；?、硫酸化等)或非天然改變的氨基 酸殘基。衍生物與其源自的氨基酸序列相比，還可以包括一個或多個非氨基酸替代或添加， 例如共價或非共價地結(jié)合于氨基酸序列的報告分子或其他配體，如與之結(jié)合有利于衍生物 檢測的報告分子，以及相對于天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列而言的非天然氨基酸殘基。此外，“衍生物”還包括天然形式的蛋白質(zhì)與標簽肽如FLAG、HIS6或硫氧還蛋白 的融合物(關(guān)于標簽肽的綜述請參見Terpe，Appl. Microbiol. Biotechnol. 60，523-533， 2003)。盲系同源物/旁系同源物直系同源物和旁系同源物涵蓋用于描述基因祖先關(guān)系的進化概念。旁系同源物為 相同物種內(nèi)的基因，其源自于祖先基因的復(fù)制；而直系同源物為來自不同生物體的基因，其起源于物種形成，并且也源自于共同的祖先基因。結(jié)構(gòu)域術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”是指在進化相關(guān)蛋白質(zhì)序列的比對中，在特定位置上保守的一組氨基酸。盡管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改變，但是在特定位置上高度保守的 氨基酸則意味著對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸?！敖Y(jié)構(gòu) 域”因其在所比對的家族蛋白質(zhì)同源物序列中高度保守而得以鑒定，故能夠用作為標識符 以確定任何所討論的多肽是否屬于先前鑒定到的多肽家族。基序/共有序列/標簽序列術(shù)語“基序”或“共有序列”或“標簽序列”(signature)是指進化相關(guān)蛋白質(zhì)序列 中短的保守區(qū)域?；虺３Ｊ歉叨缺Ｊ氐慕Y(jié)構(gòu)域部分，但也可能僅僅包括部分結(jié)構(gòu)域，或者 位于保守結(jié)構(gòu)域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定義的結(jié)構(gòu)域之外的話)。^^本文定義的術(shù)語“雜交”指其中基本同源互補的核苷酸序列彼此退火的過程。雜 交過程能夠完全在溶液中發(fā)生，即互補的兩核酸分子都處在溶液中。雜交過程也能夠這樣 進行，即互補核酸分子之一固定于基質(zhì)上，如磁珠、瓊脂糖珠或任何其它樹脂上。此外，雜交 過程也能夠這樣進行，即其中互補核酸分子之一固定在固相支持物如硝酸纖維素或尼龍膜 上，或者通過例如照相平板印刷術(shù)固定在例如硅質(zhì)玻璃支持物上(后者稱為核酸序列陣列 或微陣列，或稱為核酸序列芯片)。為了使雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以 使雙鏈解鏈成兩條單鏈，和/或除去單鏈核酸分子中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或其它二級結(jié)構(gòu)。術(shù)語“嚴格性”是指發(fā)生雜交的條件。雜交的嚴格性受諸如溫度、鹽濃度、離子強度 和雜交緩沖液組成等條件的影響。通常，對于特定序列而言，在確定的離子強度和PH值下， 低嚴格條件選擇為比熱解鏈溫度(Tm)低大約30°C。中等嚴格條件為溫度比TJS 20°C，而 高嚴格條件為溫度比1低10°C。高嚴格雜交條件通常用于分離與靶核酸序列具有高序列 相似性的雜交序列。不過，由于遺傳密碼的簡并性，核酸序列可以在序列上有偏差而依然編 碼基本上相同的多肽。因此有時可能需要中等嚴格雜交條件來鑒定這樣的核酸序列分子。Tm是在確定的離子強度和pH值下，50%的靶序列與完全匹配的探針雜交的溫度。 1取決于溶液條件和探針的堿基組成及長度。例如，較長的序列在較高溫度下特異性雜交。 在低于Tm值大約16°C到32°C獲得最大雜交速率。在雜交溶液中存在一價陽離子會減少 兩核酸序列鏈之間的靜電排斥作用，從而促進雜交體形成；當鈉濃度高達0. 4M時，這一作 用可見(對于更高的濃度，此效應(yīng)可以忽略不計)。每個百分點的甲酰胺可使DNA-DNA和 DNA-RNA雙鏈體的解鏈溫度降低0. 6到0. 7V，加入50%甲酰胺能夠使雜交在30到45°C完 成，盡管這將降低雜交速率。堿基對錯配降低雜交速率和雙鏈體的熱穩(wěn)定性。平均而言，對 于大的探針，每個百分點堿基錯配使Tm值下降約1°C。依賴于雜交體類型，Tm值可以利用下 列公式計算1)DNA-DNA 雜交體(Meinkoth 和 Wahl，Anal. Biochem.，138 :267_284，1984)Tm = 81. 5°C +16. 6 X Iog10 [Na+] a+0. 41X % [G/Cb] -500 X [LT1-O. 61 X % 甲酰胺2) DNA-RNA 或 RNA-RNA 雜交體Tm = 79. 8+18. 5 (Iog10 [Na+]a) +0. 58(% G/Cb)+ll. 8(% G/Cb) 2_820/Lc
3)寡DNA或寡RNAd雜交體
< 20 個核苷酸Tm = 2 (In)20-35 個核苷酸Tm = 22+1. 46 (In)a或?qū)τ谄渌粌r陽離子，但是僅在0. 01-0. 4M范圍內(nèi)精確。b僅對于在30%到75%范圍內(nèi)的％ GC精確。cL =雙鏈體的堿基對長度。d寡，寡核苷酸；ln，=引物的有效長度=2 X (G/C數(shù))+ (A/T數(shù))。非特異性結(jié)合可以通過許多已知技術(shù)中的任一來控制，例如用含蛋白質(zhì)的溶液封 閉膜，在雜交緩沖液中添加異源RNA、DNA和SDS，以及用RNA酶處理。對于非同源探針，可以 通過改變?nèi)缦聴l件之一來進行系列雜交⑴逐漸降低退火溫度(例如從68°C降至42°C )， 或(ii)逐漸降低甲酰胺濃度(例如從50%降至0%)。熟練技術(shù)人員知曉可以在雜交過程 中改變的多種參數(shù)，從而保持或者改變嚴格條件。除雜交條件外，雜交特異性通常還是雜交后洗滌的函數(shù)。為了除去非特異雜交產(chǎn) 生的背景，用稀釋的鹽溶液洗滌樣品。這類洗滌的關(guān)鍵因素包括最終洗滌溶液的離子強度 和溫度鹽濃度越低、洗滌溫度越高，洗滌的嚴格性就越高。洗滌條件通常在等于或低于雜 交嚴格性的條件下進行。陽性雜交給出至少為背景兩倍的信號。一般按如上來設(shè)置適用于 核酸序列雜交試驗或基因擴增檢測操作的適宜嚴格條件。也可以選擇更高或更低的嚴格條 件。熟練技術(shù)人員知曉可以在洗滌過程中改變的多種參數(shù)，從而保持或者改變嚴格條件。例如，長于50個核苷酸的DNA雜交體的典型的高嚴格雜交條件包括在IXSSC中 于65 °C雜交或者在1 XSSC和50%甲酰胺中于42 °C雜交，接著在0. 3 X SSC中于65°C洗滌。 長于50個核苷酸的DNA雜交體的中等嚴格雜交條件的實例包括在4X SSC中于50°C雜交或 者在6 X SSC和50%甲酰胺中于40°C雜交，接著在2 X SSC中于50°C洗滌。雜交體的長度是 針對雜交的核酸預(yù)期的長度。當已知序列的核酸分子進行雜交時，雜交體的長度可以通過 比對序列并鑒定本文所述的保守區(qū)域進行確定。IX SSC是0. 15M NaCl和15mM檸檬酸鈉； 雜交溶液和洗滌溶液可以另外地包括5XDenhardt，s試劑、0. 5-1. 0% SDSUOO μ g/ml片段 化的變性鮭精DNA、0. 5%焦磷酸鈉。為了定義嚴格性水平，可以參考Sambrook等(2001)的《分子克隆實驗室手冊》，第三版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約，或者CurrentProtocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989 及年度更新資料)。剪接變體本文所用的術(shù)語“剪接變體”包括這樣的核酸序列變體，其中選擇的內(nèi)含子和/或 外顯子已被切除、替換、置換或添加，或者其中內(nèi)含子已被縮短或增長。這樣的變體可以基 本上保持蛋白質(zhì)的生物活性；這可以通過選擇性地保留蛋白質(zhì)的功能性區(qū)段來實現(xiàn)。這樣 的剪接變體可以是天然的或人造的。預(yù)測和分離這類剪接變體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的 (參見例如 Foissac 和 Schiex (2005)BMC Bioinformatics 6 25)。等位基因變體等位基因或等位基因變體為處于相同的染色體位置上的給定基因的可選形式。等 位基因變體包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)，以及小的插入/缺失多態(tài)性(INDEL)。INDEL的大 小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多數(shù)生物體的天然存在的多態(tài)性品系中形成最大的 一組序列變體。
基因改組/定向講化基因改組或定向進化包括重復(fù)實施DNA改組，繼之適當篩選和/或選擇，以產(chǎn) 生編碼具有修飾生物活性的蛋白質(zhì)的核酸序列變體或其部分(Castle等(2004) Science 304(5674) 1151-4 ；美國專利 5，811，238 和 6，395，547)。調(diào)控元件/控制序列/啟動子術(shù)語“調(diào)控元件”、“控制序列”和“啟動子”在文中均可互換使用，按廣義來理解，指能夠?qū)崿F(xiàn)與之相連的序列表達的調(diào)控核酸序列。術(shù)語“啟動子”通常是指位于基因轉(zhuǎn)錄起 始位點上游的核酸控制序列，其參與RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)的識別和結(jié)合，由此指導(dǎo)有 效連接的核酸進行轉(zhuǎn)錄。上述術(shù)語包括源自經(jīng)典真核生物基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包 括精確轉(zhuǎn)錄起始所必需的TATA盒，以及具有或沒有CCAAT盒序列)，以及另外的調(diào)控元件 (即上游激活序列、增強子和沉默子)——它們通過應(yīng)答發(fā)育刺激和/或外部刺激或以組織 特異的方式改變基因表達。所述術(shù)語還包括經(jīng)典原核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，在此情況 下其可以包括-35盒序列和/或-10盒轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。術(shù)語“調(diào)控元件”也包括合成的融 合分子或衍生物，其賦予、激活或增加細胞、組織或器官中核酸序列分子的表達。“植物啟動子”包含能夠介導(dǎo)編碼序列區(qū)段在植物細胞中表達的調(diào)控元件。“植物 啟動子”優(yōu)選來源于植物細胞，例如，來源于待被欲在本發(fā)明方法中表達的以及本文所述的 核酸序列轉(zhuǎn)化的植物。這對于其他“植物”調(diào)控信號同樣適用，例如“植物”終止子的情況。 位于可用于本發(fā)明方法的核苷酸序列上游的啟動子可以通過一個或多個核苷酸取代、插入 和/或缺失進行修飾，而不會干擾啟動子、開放讀框(ORF)或者3’調(diào)控區(qū)如終止子或遠離 ORF的其他3’調(diào)控區(qū)的功能或活性。此外還有可能通過修飾啟動子的序列而增強其活性， 或者將其完全替換為活性更強的啟動子、甚至是來自異源生物體的啟動子。為在植物中表 達，核酸序列分子必須如上文所述的那樣，有效連接于或者包含適宜的啟動子，其中所述啟 動子將在正確的時間點以所需的空間表達模式表達所述基因。為鑒定功能上等同的啟動子，可以例如通過將啟動子與報告基因有效連接、測定 所述報告基因在植物多種組織中的表達水平和模式，來分析候選啟動子的啟動子強度和/ 或表達模式。眾所周知的適宜報告基因包括例如葡糖醛酸糖苷酶或半乳糖苷酶。 通過測量葡糖醛酸糖苷酶或半乳糖苷酶的酶活性可以確定啟動子活性。然后可以 將該啟動子強度和/或表達模式與參照啟動子(如本發(fā)明方法中所用的啟動子)相比較。 可選地，可以利用本領(lǐng)域公知的方法，如Northern印跡(RNA分析)結(jié)合放射自顯影圖的光 密度測量分析、定量實時 PCR 或 RT-PCR(Heid 等，1996 Genome Methods 6 :986_994)，通過 定量本發(fā)明方法所用核酸序列的mRNA水平或者將該mRNA水平與持家基因如18S rRNA的 mRNA水平進行比較，來測定啟動子強度。通常，“弱啟動子”旨在表示驅(qū)動編碼序列低水平 表達的啟動子?！暗退健敝荚诒硎久總€細胞大約1/10，000個轉(zhuǎn)錄物到大約1/100，000個 轉(zhuǎn)錄物、到大約1/500，0000個轉(zhuǎn)錄物的水平。相反，“強啟動子”驅(qū)動編碼序列高水平表達， 或者說以每個細胞大約1/10個轉(zhuǎn)錄物到大約1/100個轉(zhuǎn)錄物、到大約1/1000個轉(zhuǎn)錄物的 水平表達。通常，“中等強度啟動子”旨在表示以在所有情況下都低于在35S CaMV啟動子控 制下獲得的水平的水平驅(qū)動編碼序列表達的啟動子。有效連接本文所用的術(shù)語“有效連接”是指啟動子序列和目的基因之間的功能性連接，從而啟動子序列能夠起始目的基因的轉(zhuǎn)錄。組成型啟動子“組成型啟動子”是指在生長和發(fā)育的大多數(shù)但不必是所有階段，并且在大多數(shù)環(huán) 境條件下在至少一種細胞、組織或器官中轉(zhuǎn)錄激活的啟動子。下表2a給出了組成型啟動子 的實例。表2a 植物組成型啟動子的實例 遍在啟動子遍在啟動子在生物體的基本上所有組織或細胞中都有活性。
發(fā)育調(diào)控型啟動子發(fā)育調(diào)控型啟動子在某些發(fā)育階段或在經(jīng)歷發(fā)育改變的植物部分中有活性。誘導(dǎo)型啟動子誘導(dǎo)型啟動子響應(yīng)于化學(xué)(有關(guān)綜述請參見Gatz 1997，Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. ,48 :89_108)、環(huán)境或物理刺激而具有誘導(dǎo)的或增加的轉(zhuǎn)錄起 始；或者可以是“脅迫誘導(dǎo)型”，即在植物接觸各種脅迫條件時激活；或者是“病原體誘導(dǎo) 型”，即在植物接觸各種病原體時激活。器官特異件/組織特異件啟動子器官特異性或組織特異性的啟動子是能夠在某些器官或組織，如在葉、根、種子等 組織中優(yōu)先起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。例如，“根特異性啟動子”是主要在植物根中轉(zhuǎn)錄激活的啟 動子，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允許在這些其他植物部分中的任何 滲漏表達。能夠僅在某些細胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子在文中稱為“細胞特異性”啟動子。根特異性啟動子的實例列于下面的表2b中。表2b 根特異性啟動子的實例 種子特異性啟動子主要在種子組織中，但不必僅在種子組織中(滲漏表達的情 況)轉(zhuǎn)錄激活。種子特異性啟動可以在種子發(fā)育和/或萌發(fā)期間激活。種子特異性啟動子的 實例示于下面的表2c中。種子特異性啟動子的其他實例可參見Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol. J. 2，113-125，2004)，其中揭示的內(nèi)容在此納入本文作為參考就如同陳述了其 全部內(nèi)容那樣。表2c 種子特異性啟動子的實例“在地上部分中具有活性的啟動子”是指能夠優(yōu)先地在植物的地上部分中起始轉(zhuǎn) 錄的啟動子，基本上排除了在任何其他植物部分(特別是地下部分)的激活，但仍允許在這 些其他植物部分中的任何滲漏表達。下面的表2d顯示主要在綠色組織中具有轉(zhuǎn)錄活性的 此類啟動子的實例。如文中所定義的綠色組織特異性啟動子是主要在綠色組織中轉(zhuǎn)錄激活的啟動子， 基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允許有在這些其他植物部分中的任何滲漏 表達?？捎糜诒景l(fā)明方法的綠色組織特異性啟動子的實例示于下面的表2d中。表2d 綠色組織特異性啟動子的實例 組織特異性啟動子的另一實例是分生組織特異性啟動子，其主要在分生組織中轉(zhuǎn) 錄激活，基本上排除了在任何其他植物部分的激活，但仍允許有在這些其他植物部分中的 任何滲漏表達?？捎糜谶M行本發(fā)明方法的分生組織特異性啟動子的實例示于下面的表2e 表2f 胚乳組織特異性啟動子的實例 表2g 胚特異性啟動子的實例 表2h 糊粉特異性啟動子的實例 終Ih子術(shù)語“終止子”包括如下控制序列，其為位于轉(zhuǎn)錄單位末端的DNA序列，發(fā)送對初 級轉(zhuǎn)錄物進行3’加工和多聚腺苷酸化以及終止轉(zhuǎn)錄的信號。終止子可以源自天然基因、多 種其他植物基因、或T-DNA。例如，待加入的終止子可以源自例如胭脂堿合酶或章魚堿合酶 基因、或可選地源自其它植物基因、或次優(yōu)選地源自任何其它真核基因。與表達或基因表達相關(guān)聯(lián)時，術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指與對照植物相比，所述基因表達 的表達水平被改變的過程，優(yōu)選使所述表達水平增加。原始未調(diào)節(jié)的表達可以是結(jié)構(gòu) RNA(rRNA.tRNA)或隨后進行翻譯的mRNA的任何類型的表達。術(shù)語“調(diào)節(jié)活性”應(yīng)理解為對 本發(fā)明核酸序列或編碼蛋白質(zhì)的表達的如下任何改變，所述改變導(dǎo)致植物產(chǎn)率增加和/或 生長增加。術(shù)語“表達”或“基因表達”是指一種或多種特定基因或特定遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄。術(shù) 語“表達”或“基因表達”特別指一種或多種基因或遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄為結(jié)構(gòu)RNA(rRNA、tRNA) 或mRNA，并隨后翻譯或不翻譯為蛋白質(zhì)。該過程包括DNA的轉(zhuǎn)錄、以及所產(chǎn)生mRNA產(chǎn)物的加工。增加的表汰/過表汰如本文所用的術(shù)語“增加的表達”或“過表達”表示超出原始野生型表達水平的任 何形式的表達。增加基因或基因產(chǎn)物表達的方法在本領(lǐng)域有充分的記載，這包括，例如通過適當 的啟動子驅(qū)動的過表達、轉(zhuǎn)錄增增強子或翻譯增強子的使用?？梢詫⒂米鲉幼踊蛟鰪娮?元件的分離的核酸序列引入非異源形式多核苷酸的適當位置(一般是上游)，從而上調(diào)目 的多肽編碼核酸序列的表達。例如，可以通過突變、缺失和/或取代，體內(nèi)地改變內(nèi)源啟動 子(見Kmiec，US5, 565，350 ；Zarling等，W09322443)，或者將分離的啟動子引入植物細胞 中使其相對于本發(fā)明基因具有恰當?shù)姆较蚝途嚯x，從而控制基因的表達。如果期望多肽表達，通常期望在多核苷酸編碼區(qū)的3’末端納入多聚腺苷酸化區(qū)域。多聚腺苷酸化區(qū)域可以源自天然基因、多種其它植物基因或T-DNA。例如，待加入的3’ 末端序列可以源自胭脂堿合酶或章魚堿合酶基因、或可選地源自其他植物基因、或次優(yōu)選 地源自任何其它真核基因。也可以在5’非翻譯區(qū)(UTR)或部分編碼區(qū)的編碼序列中加入內(nèi)含子序列，來增加 在胞質(zhì)中累積的成熟信使的量。已顯示，在植物和動物表達構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單位中納入可剪 接內(nèi)含子可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平使基因表達增加高達1000倍(Buchman和Berg (1988) Mol. Cell biol. 8 :4395-4405 ;Callis 等(1987)Genes Dev. 1 :1183_1200)。通常這類內(nèi) 含子被放置在轉(zhuǎn)錄單位5’末端附近時，其增加基因表達的作用最大。玉米內(nèi)含子Adhl-S 內(nèi)含子1、2和6以及Bronze-I內(nèi)含子的使用是本領(lǐng)域公知的。一般信息請參見TheMaize Handbook，第 116 章，F(xiàn)reeling 和 Walbot 編輯，Springer，N. Y. (1994)。內(nèi)源基因 本文述及的“內(nèi)源”基因不僅指見于植物之中的天然形式的所討論基因(即未經(jīng) 人為干預(yù))，而且指隨后(重新)引入到植物中的分離形式的相同基因(或基本上同源的核 酸/基因)(轉(zhuǎn)基因)。例如，含有這樣的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因植物可以發(fā)生轉(zhuǎn)基因表達的實質(zhì) 性下降和/或內(nèi)源基因表達的實質(zhì)性下降。分離的基因可以從生物體中分離，或者可以是人造例如通過化學(xué)合成制備的。降低的表汰本文述及的“降低的表達”或者表達“下降或基本上消除”應(yīng)理解為表示內(nèi)源基因 表達和/或多肽水平和/或多肽活性相對于對照植物降低。所述下降或基本上消除按照 遞增的優(yōu)選順序是與對照植物相比，下降至少10%、20%、30%、40%或50%、60%、70%、 80%、85%、90% 或 95%、96%、97%、98%、99% 或更多。為了降低或者基本上消除植物中內(nèi)源基因的表達，需要一段足夠長度的基本上連 續(xù)核苷酸的核酸序列。為了實施基因沉默，這可以少到20，19，18，17，16，15，14，13，12，11， 10或更少個核苷酸，備選地可以多到整個基因(包括5’和/或3’ UTR,部分地或全部地)。 該基本上連續(xù)的核苷酸鏈可以來自編碼目的蛋白質(zhì)(靶基因)的核酸序列，或者來自任何 能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列。優(yōu)選地，該基本連續(xù)的 核苷酸鏈能與靶基因(有義或反義鏈)形成氫鍵，更優(yōu)選地，該基本連續(xù)的核苷酸鏈按遞增 的優(yōu)選順序與靶基因(有義或反義鏈)具有50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，96%， 97%，98%，99%，100%序列同一性。編碼(功能性)多肽的核酸序列對于本文所討論的多 種用于降低或基本上消除內(nèi)源基因表達的方法不是必需的。降低或基本上消除表達可利用常規(guī)工具和技術(shù)實現(xiàn)。降低或基本消除內(nèi)源基因 表達的一個方法是RNA-介導(dǎo)的沉默，其中使用核酸序列或其部分(在這種情況下，一段 基本上連續(xù)的核苷酸鏈，其來自目的基因，或者來自任何能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同源 物、旁系同源物或同源物的核酸序列)的反向重復(fù)——優(yōu)選能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。RNA沉默 方法的另一個實例涉及向植物中以有義方向?qū)牒怂嵝蛄谢蛘咂洳糠?在這種情況下， 一段基本連續(xù)的核苷酸鏈，其來自目的基因，或者來自任何能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同 源物，旁系同源物或同源物的核酸序列)。RNA沉默方法的另一個實例涉及反義核酸序 列的使用。基因沉默還可通過插入誘變(例如，T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過例如 Angell 和 Baulcombe((1999)Plant J 20(3) :357_62)， (Amplicon VIGS WO 98/36083)或Baulcombe (WO 99/15682)描述的策略來實現(xiàn)。其他方法，例如使用抗內(nèi)源多肽的抗體在 植物中抑制其功能或干擾其中牽涉多肽的信號傳遞路徑，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知 的?？墒褂萌嗽旌?或天然microRNAOiiiRNA)敲除基因表達和/或mRNA翻譯。內(nèi)源miRNA 是長度通常為19至24個核苷酸的單鏈小RNA?？梢蕴禺惖貙﹂L度通常為21個核苷酸的人 造micr0RNA(amiRNA)進行遺傳工程改造以使之負調(diào)節(jié)單個或多個目的基因的基因表達。 植物microRNA靶的選擇的決定因素是本領(lǐng)域眾所周知的。用于靶識別的經(jīng)驗參數(shù)已經(jīng)確 定并且可以用來輔助設(shè)計特定的amiRNA (Schwab等，Dev. Cell 8 (4)，517-527，2005)。用于 設(shè)計并產(chǎn)生amiRNA及其前體的便利工具也是公眾可獲得的(Schwab等，Plant Cell, 18, 1121-1133,2006)。
更詳細的降低或基本上消除表達可利用常規(guī)工具和技術(shù)實現(xiàn)。降低或基本消除內(nèi)源基因表 達的一個優(yōu)選方法是在植物中引入和表達遺傳構(gòu)建體，在該遺傳構(gòu)建體中核酸(在這種情 況下，一段基本連續(xù)的核苷酸鏈，其來自目的基因，或者來自任何能編碼任何目的蛋白質(zhì)的 直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸)被克隆為由間隔序列(非編碼DNA)分隔開的反 向重復(fù)序列(部分地或者全部地)。在這種優(yōu)選的方法中，內(nèi)源基因的表達通過RNA-介導(dǎo)的沉默，被降低或基本消 除，在該RNA-介導(dǎo)的沉默中使用核酸或其部分(在這種情況下，一段基本上連續(xù)的核苷酸 鏈，其來自目的基因，或者來自任何能編碼目的蛋白質(zhì)的直系同源物、旁系同源物或同源物 的核酸)的反向重復(fù)——優(yōu)選能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)——來實現(xiàn)。該反向重復(fù)被克隆在含有控制 序列的表達載體上。非編碼DNA核酸序列(間隔序列，例如基質(zhì)附著區(qū)片段(MAR)，內(nèi)含子， 多接頭等)被放置在形成該反向重復(fù)的兩個反向核酸之間。該反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄后，形成 具有(部分或者全部)自互補結(jié)構(gòu)的嵌合RNA。該雙鏈RNA結(jié)構(gòu)稱為發(fā)夾RNA(hpRNA)。發(fā) 夾RNA被植物加工為siRNAs，siRNAs整合進入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中。RISC進一 步斷裂mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此實質(zhì)性地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量。有關(guān)其它一般 細節(jié)，敬請參見例如，Grierson 等(1998)W098/53083 ；Waterhouse 等(1999)W0 99/53050)。本發(fā)明方法的實施并不依賴于在植物中引入和表達其中以反向重復(fù)形式克隆核 酸的遺傳構(gòu)建體；而是可以使用幾種眾所周知的“基因沉默”方法中的任何一種或多種來獲 得相同的效果。用于降低內(nèi)源基因表達的一種此類方法是RNA介導(dǎo)的基因表達沉默(下調(diào))。這種 情況下的沉默在植物中由與靶內(nèi)源基因基本相似的雙鏈RNA序列(dsRNA)觸發(fā)。該dsRNA 進一步被植物加工成大約20到大約26個核苷酸，稱為小干擾RNA(siRNAs)。siRNAs整合 進RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，該沉默復(fù)合物斷裂內(nèi)源靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此實 質(zhì)性地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量。優(yōu)選地，該雙鏈RNA序列對應(yīng)于靶基因。RNA沉默方法的另一個實例涉及向植物中以有義方向?qū)牒怂嵝蛄谢蛘咂洳糠?(在這種情況下，一段基本連續(xù)的核苷酸鏈，其來自目的基因，或者來自任何能編碼目的蛋 白質(zhì)的直系同源物，旁系同源物或同源物的核酸)?！坝辛x方向”指DNA序列與其mRNA轉(zhuǎn)錄 物是同源的。因此導(dǎo)入植物中的將是核酸序列的至少一個拷貝。該額外的核酸序列將降低 此內(nèi)源基因的表達，造成被稱為共抑制(co-suppression)的現(xiàn)象。如果在植物中導(dǎo)入核酸 序列的幾個額外拷貝，基因表達的降低將會更加明顯，原因是高轉(zhuǎn)錄水平和共抑制的觸發(fā)之間存在正相關(guān)。RNA沉默方法的另一個實例涉及反義核酸序列的使用。反義核酸序列包括與編碼 蛋白質(zhì)的“有義”核酸序列互補，即，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補，或者與mRNA轉(zhuǎn)錄序列 互補，的核苷酸序列。反義核酸序列優(yōu)選與要沉默的內(nèi)源基因互補?；パa可位于基因的“編 碼區(qū)”和/或“非編碼區(qū)”。術(shù)語“編碼區(qū)”指包含可翻譯成氨基酸殘基的密碼子的核苷酸序 列區(qū)域。術(shù)語“非編碼區(qū)”指位于編碼區(qū)兩側(cè)的5'和3'序列，該區(qū)可轉(zhuǎn)錄但不翻譯成氨 基酸(也稱為5'和3'非翻譯區(qū))。 反義核酸序列可以根據(jù)Watson和Crick堿基配對規(guī)則設(shè)計。反義核酸序列可以 與整個核酸序列(在此情況下，一段基本上連續(xù)的核苷酸鏈，其來自目的基因、或來自任何 能夠編碼目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸)互補，不過也可以是僅與 核酸序列的一部分(包括mRNA 5’和3’ UTR)反義的寡核苷酸。例如，反義寡核苷酸序列 可以與圍繞編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯起始位點的區(qū)域互補。合適的反義寡核苷酸序 列的長度是本領(lǐng)域已知的并且可以從長度約50、45、40、35、30、25、20、15或10個核苷酸或 更少的核苷酸開始。本發(fā)明的反義核酸序列可以利用本領(lǐng)域已知方法，使用化學(xué)合成和酶 連接反應(yīng)而構(gòu)建。例如，反義核酸序列(例如反義寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核 苷酸或多種修飾的核苷酸化學(xué)地合成，其中所述修飾的核苷酸被設(shè)計旨在增加分子的生物 學(xué)穩(wěn)定性或增加反義核酸序列與有義核酸序列之間所形成雙鏈體的物理穩(wěn)定性，例如，可 以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸?？梢杂脕懋a(chǎn)生反義核酸序列的修飾核苷酸 的實例是本領(lǐng)域眾所周知的。已知的核苷酸修飾包括甲基化、環(huán)化和'加帽'及用類似物 (如肌苷)取代一個或多個天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修飾是本領(lǐng)域眾所周知的。這種反義核酸序列可以使用核酸序列已經(jīng)以反義方向亞克隆入其中(即從插入 的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將與目的靶核酸呈反義方向)的表達載體，以生物學(xué)方式產(chǎn)生。優(yōu)選地， 反義核酸序列在植物中的產(chǎn)生借助穩(wěn)定整合的核酸構(gòu)建體進行，其中所述的核酸構(gòu)建體包 含啟動子、有效連接的反義寡核苷酸和終止子。用于本發(fā)明方法中實現(xiàn)沉默的核酸分子(無論向植物中導(dǎo)入或在原位(in situ) 產(chǎn)生)將與編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物和/或基因組DNA雜交或結(jié)合，由此通過例如抑制轉(zhuǎn)錄 和/或翻譯而抑制蛋白質(zhì)表達。雜交可以是常規(guī)核苷酸互補以形成穩(wěn)定雙鏈體，或在結(jié)合 DNA雙鏈體的反義核酸序列的情況下，為在雙螺旋大溝內(nèi)的特異相互作用。反義核酸序列可 以通過轉(zhuǎn)化或在特定組織部位直接注射而導(dǎo)入植物。備選地，可以對反義核酸序列進行靶 向選定細胞的修飾，并且隨后系統(tǒng)性施用。例如，對于系統(tǒng)性施用，反義核酸序列可以被修 飾以便它們能夠特異結(jié)合表達在所選擇的細胞表面上的受體或抗原，例如使反義核酸序列 與可以和細胞表面受體或抗原結(jié)合的肽或抗體連接。反義核酸序列也可以使用本文中所述 的載體送遞至細胞內(nèi)。根據(jù)又一個方面，反義核酸序列是α-異頭核酸序列。α異頭核酸序列與互補性 RNA形成特異的雙鏈雜交分子，其中與慣常b-單元相反，所述鏈走向相互平行(Gaultier 等(1987)Nucl Ac Res 15:6625-6641)。反義核酸序列也可以包含2' _o_甲基核糖核苷 酸(Inoue 等(1987) Nucl Ac Res 15,6131-6148)或嵌合 RNA-DNA 類似物(Inoue 等(1987) FEBS Lett. 215,327-330)。內(nèi)源基因表達的降低或基本消除也可以使用核酶而進行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能夠切割與其具有互補區(qū)域的單鏈核酸序列，如mRNA。因此，核酶 (例如錘頭核酶(在Haselhoff和Gerlach (1988) Nature 334，585-591中描述)可以用來 催化性地切割編碼多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物，由此實質(zhì)性地降低待翻譯成多肽的mRNA轉(zhuǎn)錄物的 數(shù)目?？梢栽O(shè)計對核酸序列具特異性的核酶(見例如&(^等美國專利號4，987，071 ；和 Cech等美國專利號5，116，742)。備選地，可以使用對應(yīng)于核酸序列的mRNA轉(zhuǎn)錄物，從RNA 分子庫中選出具有特異性核糖核酸酶活性的催化性RNA (Bartel和Szostak (1993) Science 261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本領(lǐng)域已知的(例如Atkins等(1994) W094/00012 ;Lenne 等(1995)W0 95/03404 ;Lutziger 等(2000)W0 00/00619 ;Prinsen 等 (1997)WO 97/13865和 Scott 等(1997)WO 97/38116)?；虺聊部梢酝ㄟ^插入誘變(例如T-DNA插入或轉(zhuǎn)座子插入)或通過如 Angell 和 Baulcombe((1999)Plant J. 20(3) :357_62)、(AmpIicon VIGSffO 98/36083)或 Baulcombe (WO 99/15682)及其它人描述的策略而實現(xiàn)。當在內(nèi)源基因上存在突變和/或在隨后導(dǎo)入植物的分離的基因/核酸上存在突變 時 ，基因沉默也可發(fā)生。降低或基本消除可以由無功能的多肽引起。例如，多肽可以與多種 相互作用性蛋白質(zhì)結(jié)合；由此通過一個或多個突變和/或截短可以提供仍能夠結(jié)合相互作 用性蛋白質(zhì)(如受體蛋白質(zhì))但不能表現(xiàn)其正常功能(如起信號作用的配體)的多肽。另一種基因沉默的方法是靶定與基因調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子和/或增強子)互補 的核酸序列以形成阻止基因在靶細胞中轉(zhuǎn)錄的三螺旋結(jié)構(gòu)。見Helene，C.，Anticancer Drug Res. 6,569-84,1991 ；Helene 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 660，27-361992 和 Maher， L. J. Bioassays 14，807-15，1992。其它方法，如使用針對內(nèi)源性多肽的抗體以抑制此多肽在植物中的功能，或干擾 所述多肽參與的信號途徑，對于技術(shù)人員將是眾所周知的。尤其可以構(gòu)思的是，人造分子可 以用于抑制靶多肽的生物學(xué)功能，或用于干擾靶多肽參與的信號途徑。備選地，可以建立篩選程序以在植物群體中鑒定基因的天然變體，所述變體編碼 具有降低活性的多肽。此類天然變體也可以用于例如進行同源重組。人工和/或天然的microRNAOiiiRNA)可以用來敲除基因表達和/或mRNA翻譯。內(nèi) 源性miRNA是通常19-24個核苷酸長度的單鏈小RNA0它們的主要功能是調(diào)節(jié)基因表達和 /或mRNA翻譯。大多數(shù)的植物microRNA (miRNA)與其靶序列具有完全的或接近完全的互補 性。然而，存在具有多達5個錯配的天然靶標。它們由切酶家族的雙鏈特異性RNA酶從具 有特征性折回結(jié)構(gòu)的較長非編碼性RNA中加工而來。加工后，它們通過與RNA誘導(dǎo)的沉默 復(fù)合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白質(zhì)結(jié)合而摻入該復(fù)合體。MiRNA充當RISC的特 異性成分，因為它們可以與細胞質(zhì)中的靶核酸(大多是mRNA)堿基配對。后續(xù)的調(diào)節(jié)事件 包括靶mRNA的切割和破壞和/或翻譯抑制。因此，miRNA過表達的效應(yīng)常常反映為靶基因 降低的mRNA水平?？梢蕴禺惖剡z傳構(gòu)建通常21個核苷酸長度的人工microRNAfemiRNAs)，以負調(diào) 節(jié)單個或多個目的基因的基因表達。植物microRNA靶的選擇的決定因素是本領(lǐng)域眾所周 知的。用于靶識別的經(jīng)驗參數(shù)已經(jīng)確定并且可以用來輔助設(shè)計特定的amiRNA(Schwab等， Dev. Cell 8，517-527，2005)。用于設(shè)計并產(chǎn)生amiRNA及其前體的便利工具也是公眾可獲 得的(Schwab 等，Plant Cell, 18，1121-1133，2006)。
為最佳性能，用于在植物中降低內(nèi)源基因表達的基因沉默技術(shù)需要使用來自單子 葉植物的核酸序列以轉(zhuǎn)化單子葉植物，和使用來自雙子葉植物的核酸序列以轉(zhuǎn)化雙子葉植 物。優(yōu)選地，將來自任何給定植物物種的核酸序列導(dǎo)入同一個物種內(nèi)。例如，將來自稻的核 酸序列轉(zhuǎn)化至稻植物。然而，并非絕對要求待導(dǎo)入的核酸序列起源于與該核酸序列將要導(dǎo) 入的植物相同的植物物種。只要內(nèi)源性靶基因與待導(dǎo)入的核酸序列之間存在相當大的同源 性就足夠了。上文描述了用于降低或基本消除內(nèi)源基因在植物中表達的多種方法的實例。本領(lǐng) 域技術(shù)人員能夠容易地適應(yīng)性調(diào)整前述用于沉默的方法，以例如通過利用合適啟動子而降 低內(nèi)源基因在整株植物或在其部分中的表達。詵擇標記(基因)/報告基因“選擇標記”、“可選擇標記基因”或“報告基因”包括賦予細胞表型的任何基因， 該基因在細胞中的表達有利于鑒定和/或選擇被本發(fā)明的核酸序列構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化了 的細胞。這些標記基因通過各種不同的原理使得能夠鑒定核酸序列分子的 成功轉(zhuǎn)移。適 宜的標記可以選自賦予抗生素或除草劑抗性的標記，其引入新的代謝性狀或允許可視選 擇?？蛇x擇標記基因的實例包括賦予抗生素抗性的基因(例如磷酸化新霉素和卡那霉素的 nptll，或磷酸化潮霉素的hpt，或賦予例如對博來霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、氨芐青霉 素、慶大霉素、遺傳霉素(G418)、壯觀霉素或殺稻瘟素抗性的基因)、賦予除草劑抗性的基 因(例如提供抗；BaSta 抗性的bar ；提供抗草甘膦抗性的aroA或gox，或賦予例如對咪唑 啉酮、膦絲菌素或磺酰脲抗性的基因)、或者提供代謝性狀的基因(如允許植物使用甘露糖 作為唯一碳源的manA，或?qū)е履咎抢玫哪咎钱悩?gòu)酶，或抗營養(yǎng)標記如對2-脫氧葡萄糖的 抗性)?？梢晿擞浕虻谋磉_導(dǎo)致形成顏色(例如葡糖醛酸糖苷酶⑶S，或β-半乳糖 苷酶及其有色底物，例如X-Gal)、發(fā)光(如螢光素/螢光素酶系統(tǒng))或熒光(綠色熒光蛋白 GFP及其衍生物)。這里僅僅是列出了一小部分可用的標記。技術(shù)人員對這類標記極為熟 悉。取決于生物體和選擇方法，優(yōu)選不同的標記。已知，取決于所用的表達載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)，當核酸序列向植物細胞進行穩(wěn) 定或瞬時整合時，僅少數(shù)細胞能攝入外來DNA，并將其整合入基因組(如果期望的話)。為鑒 定并選擇這些整合體，通常將編碼選擇標記(如上文所述的那些)的基因與目的基因一起 引入宿主細胞中。這些標記能夠例如在如下突變體中使用，在所述突變體中這些基因例如 通過常規(guī)方法缺失而沒有功能。此外，編碼選擇標記的核酸序列分子與編碼本發(fā)明多肽或 用于本發(fā)明方法的序列可以在同一個載體中引入宿主細胞，或者在分開的載體中引入。已 由所引入的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以例如通過選擇(例如，整合有選擇標記的細胞存 活而其他細胞死去)予以鑒定。由于一旦成功引入核酸序列后，將不再需要或不期望轉(zhuǎn)基因宿主細胞中存在標記 基因，特別是抗生素和除草劑抗性基因，所以根據(jù)本發(fā)明引入核酸序列的方法有利地采用 能夠除去或切除這些標記基因的技術(shù)。一種這樣的方法是稱為共轉(zhuǎn)化的方法。共轉(zhuǎn)化法采 用兩個載體同時進行轉(zhuǎn)化，一個載體攜帶根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，而第二個攜帶標記基因。 很大比例的轉(zhuǎn)化體將接收或者對于植物而言(高達40%或以上的轉(zhuǎn)化體)含有兩個載體。 對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化體通常只接收載體的一部分，即被T-DNA側(cè)翼包圍的序列，其通常是 表達盒。隨后可通過雜交(cross)從轉(zhuǎn)化植物中除去標記基因。在另一種方法中，利用整合進轉(zhuǎn)座子的標記基因與期望的核酸序列一起進行轉(zhuǎn)化(稱為Ac/Ds技術(shù))。轉(zhuǎn)化體可與轉(zhuǎn)座酶來源雜交，或者用賦予轉(zhuǎn)座酶表達的核酸序列構(gòu)建體瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體。一旦 成功進行了轉(zhuǎn)化，在有些情況下(約10% )，轉(zhuǎn)座子將跳離宿主細胞基因組并丟失。在另一 些情況下，轉(zhuǎn)座子跳至不同的位置。在這些情況下，必須通過雜交消除標記基因。微生物學(xué) 中，已經(jīng)研發(fā)了可以或便于檢測此類事件的技術(shù)。另一有利的方法有賴于稱為重組系統(tǒng)的 方法，其優(yōu)勢在于可以免除雜交消除步驟。最著名的這類系統(tǒng)稱為Cre/lox系統(tǒng)。Crel為 重組酶，且切除位于IoxP序列之間的序列。如果標記基因整合在IoxP序列之間，一旦成功 進行了轉(zhuǎn)化，將因重組酶的表達而得以切除。其他重組系統(tǒng)有HIN/HIX、FLP/FRT及REP/STB 系統(tǒng)(Tribble 等，J. Biol. Chem.，275，2000 :22255_22267 ；VeImurugan 等，J. Cell Biol.， 149,2000:553-566)。根據(jù)本發(fā)明的核酸序列可以位點特異性地整合進植物基因組。這些 方法自然也可以應(yīng)用于微生物如酵母、真菌或細菌。轉(zhuǎn)基因的/轉(zhuǎn)基因/重組出于本發(fā)明的目的，“轉(zhuǎn)基因的”、“轉(zhuǎn)基因”或“重組”當與例如，核酸序列，含有所 述核酸序列的表達盒、基因構(gòu)建體或載體，或用根據(jù)本發(fā)明的核酸序列、表達盒或載體轉(zhuǎn)化 的生物體相關(guān)時，是指所有這些構(gòu)建體通過重組方法產(chǎn)生，其中(a)編碼可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)的核酸序列，或(b)與本發(fā)明核酸序列有效連接的遺傳控制序列，例如啟動子，或(c) (a)和(b)不位于其天然遺傳環(huán)境中，或者已通過重組方法修飾，該修飾可以為例如一個或 多個核苷酸殘基的取代、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境應(yīng)理解為指在起始植物中 的天然基因組或染色體座位或存在于基因組文庫之中。在基因組文庫的情況下，優(yōu)選至少 部分地保持核酸序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境至少位于核酸序列一側(cè)，且具有至少為50bp、 優(yōu)選至少500bp、特別優(yōu)選至少IOOObp、最優(yōu)選至少5000bp序列長度。當天然存在的表達 盒——例如編碼可用于本發(fā)明方法的多肽的相應(yīng)核酸序列與該核酸序列的天然啟動子之 間天然存在著的組合——經(jīng)非天然的合成(“人造”)方法如誘變處理而被修飾時，此表達 盒成為轉(zhuǎn)基因表達盒。例如，合適的方法描述在US 5，565，350或WO 00/15815中。因此，如上文所述，為了本發(fā)明目的，轉(zhuǎn)基因植物應(yīng)理解為表示在所述植物的基 因組中，本發(fā)明方法中所用的核酸序列不在其天然基因座上，該核酸可以為同源或異源表 達。不過，正如所提到的那樣，轉(zhuǎn)基因也表示當在植物基因組中，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列或 本發(fā)明方法中所用的核酸序列位于其天然位置上時，所述序列已相對于天然序列被修飾， 和/或該天然序列的調(diào)控序列已被修飾。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選指根據(jù)本發(fā)明的核酸序列在基因組 中于非天然的座位上表達，即同源表達，或者優(yōu)選發(fā)生核酸的異源表達。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因植物 在文中述及。 MiL 本文述及的術(shù)語“引入”或“轉(zhuǎn)化”包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進宿主細胞，不考慮轉(zhuǎn) 移所用的方法?？梢允褂帽景l(fā)明的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化能夠通過器官發(fā)生或者胚胎發(fā)生隨后進 行克隆繁殖的植物組織，并從其再生整個植物。具體選擇的組織將因可得的和最適于待轉(zhuǎn) 化的具體物種的克隆繁殖系統(tǒng)而變。示例性的組織靶標包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、 雌配子、愈傷組織、既有的分生組織(例如頂端分生組織、腋芽和根分生組織)，以及誘導(dǎo)的分生組織(例如子葉分生組織和下胚軸分生組織)?？蓪⒍嗪塑账崴矔r或穩(wěn)定地導(dǎo)入宿主 細胞，其可保持非整合狀態(tài)例如作為質(zhì)粒?？蛇x擇地，可將其整合入宿主基因組。然后以本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將所得的轉(zhuǎn)化的植物細胞用于再生轉(zhuǎn)化的植物。外來基因轉(zhuǎn)移進入植 物基因組中稱為轉(zhuǎn)化。植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)在是相當常規(guī)的 技術(shù)。有利地，可使用幾種轉(zhuǎn)化方法中的任一方法將目的基因?qū)脒m宜的祖先細胞?？梢?利用轉(zhuǎn)化方法以及由植物組織或植物細胞再生植物的方法來進行瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化 方法包括脂質(zhì)體的使用、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學(xué)物質(zhì)、DNA至植物的直接注射、 基因槍轟擊(particle gun bombardment)、使用病毒或花粉的轉(zhuǎn)化以及顯微注射。方法 可選自用于原生質(zhì)體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.等人，(1982) Nature296，72-74 ； Negrutiu I 等人(1987)Plant Mol Biol 8 :363_373)、原生質(zhì)體的電穿孔(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Techno 1 3，1099-1102)、至植物材料內(nèi)的顯微注射(Crossway A 等 人，(1986)Mol. Gen Genet 202 179-185) ；DNA 或 RNA 包被的微粒轟擊(Klein TM 等人， (1987)Nature 327:70)；使用(非整合型)病毒的感染等。優(yōu)選通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，包括轉(zhuǎn)基因作物植物。一種有利的轉(zhuǎn)化法是植物原位(in planta)轉(zhuǎn) 化。為此，可以例如使農(nóng)桿菌作用于植物種子，或用農(nóng)桿菌接種植物分生組織。已經(jīng)證明， 根據(jù)本發(fā)明尤為有利的是，使轉(zhuǎn)化了的農(nóng)桿菌懸液作用于完整植株或至少花原基。隨后培 養(yǎng)植物，直至獲得所處理植物的種子(Clough和Bent，Plant J. (1998) 16，735-743)。農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化方法包括眾所周知的稻轉(zhuǎn)化方法，例如在任一如下文獻中描述的方法 歐洲專利申請 EP 1198985A1, Aldemita 和 Hodges (Planta，199 :612_617，1996) ； Chan 等 (Plant Mol. Biol. 22(3)491-506，1993)，Hiei 等(Plant J. 6 (2) :271_282，1994)，其公開 的內(nèi)容在此并入本文作為參考就如同陳述了其全部內(nèi)容那樣。至于玉米轉(zhuǎn)化，優(yōu)選的方法 如 Ishida 等(Nat. Biotechnol. 14(6) :745_50，1996)或Frame 等(Plant Physiol. 129(1) 13-22,2002)中所述，其公開的內(nèi)容全部地并入本文作為參考。作為舉例說明，所述方法還 由 B. Jenes 等，Techniques for GeneTransfer, Transgenic Plants，卷 1，Engineering and Utilization，編輯 S. D. Kung 禾口 R.Wu，Academic Press (1993) 128—143 以及 Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225)中進一步描述。優(yōu)選將 待表達的核酸或構(gòu)建體克隆到載體中，所述載體適用于轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，例如 pBinl9(Bevan 等，Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711)。然后以已知的 方式利用由這樣的載體轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化植物，例如用作模式植物的植物，像擬南芥 (Arabidopsis thaliana，其在本發(fā)明范圍內(nèi)不視為作物植物)；或者作物植物，例如作為舉 例的煙草植物，例如通過在農(nóng)桿菌溶液中浸沒擦傷的葉子或切碎的葉子，然后在合適的培 養(yǎng)基中培養(yǎng)之。通過根癌農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化例如已由HGfgen和Willmitzer在Nucl. Acid Res. (1988) 16,9877 描述，或者尤其是可從 F. F. White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants在Transgenic Plants,卷 1,Engineering and Utilization,編輯S. D. Kung 和 R. Wu，Academic Press，1993，第 15-38 頁獲知。除了體細胞(其隨后必須再生為完整植株)轉(zhuǎn)化以外，還可以轉(zhuǎn)化植物分生組 織的細胞，特別是可以發(fā)育成配子的那些細胞。在這種情況下，轉(zhuǎn)化的配子循著天然植 物的發(fā)育而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。因此，例如，可以用農(nóng)桿菌處理擬南芥的種子，并從一定比 例經(jīng)轉(zhuǎn)化因而是轉(zhuǎn)基因的發(fā)育植物收獲種子[Feldman，KA和Marks MD(1987). Mol GenGenet 208 274-289 ；Feldmann K(1992).在 C Koncz，N_H Chua 和 J Shell 編輯 Methods inArabidopsis Research. Word Scientific，Singapore，第 274-289 頁]?？蛇x的方法基 于反復(fù)去除花序以及使蓮座中心切割部位與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌一起孵育，由此在隨后的時間 點同樣能夠獲得轉(zhuǎn)化的種子(Chang (1994). Plant J. 5 551-558 ；Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245 :363_370)。然而，一種特別有效的方法是真空滲入法，及其改良方法如“花器 浸蘸法”(floral dip)。對于擬南芥的真空滲入，用農(nóng)桿菌懸液在減壓下處理完整植株 [Bechthold, N(1993). C R Acad Sci Paris Life Sci，316 :1194_1199]，而對于“花器浸 蘸法”，將發(fā)育中的花組織與表面活性劑處理的農(nóng)桿菌懸液短暫孵育[Clough，SJ和Bent， AF (1998). The Plant J. 16，735-743]。在兩種情況下均收獲一定比例的轉(zhuǎn)基因種子，這些 種子可通過在上述選擇性條件下培養(yǎng)而與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分開來。另外，質(zhì)體的穩(wěn)定轉(zhuǎn) 化是有利的，因為質(zhì)體在多數(shù)作物中為母系遺傳，從而降低或消除了轉(zhuǎn)基因通過花粉傳播 的風(fēng)險。葉綠體基因組的轉(zhuǎn)化通常通過Klaus等，2004[Nature Biotechnology 22(2)， 225-229]中系統(tǒng)性展示的方法實現(xiàn)。簡言之，將待轉(zhuǎn)化的序列與可選擇標記基因一起克 隆到同源于葉綠體基因組的側(cè)翼序列之間。這些同源側(cè)翼序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因位點特異性 整合到質(zhì)體基因組中。質(zhì)體轉(zhuǎn)化已在許多不同的植物物種中描述，且綜述由Bock(2001) Transgenic plastids in basic research and plantbiotechnology. J Mol Biol·2001年 9 ^ 21 0 ；312(3) 425-38 ^Maliga, P(2003)Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology. Trends Biotechnol· 21，20—28 給出。最近 艮道了形 式為無標記的質(zhì)體轉(zhuǎn)化體的其他生物技術(shù)方法，所述轉(zhuǎn)化體可以利用瞬時共整合的標記基 因產(chǎn)生(Klaus 等，2004，Nature Biotechnology 22 (2)，225-229)。T-DNA激活標簽T-DNA激活標簽(Hayashi等Science (1992) 1350-1353)包括將通常含有啟動子 (也可以是翻譯增強子或內(nèi)含子)的T-DNA插入在目的基因的基因組區(qū)或基因編碼區(qū)上游 或下游IOkb處，從而在構(gòu)型上使啟動子能夠指導(dǎo)被靶向基因的表達。通常天然啟動子對被 靶向基因表達的調(diào)控被破壞，基因落入新引入的啟動子控制。啟動子一般包含于T-DNA中。 可以例如，通過農(nóng)桿菌感染將此T-DNA隨機插入植物基因組中，并導(dǎo)致插入T-DNA附近的基 因的表達被修飾。得到的轉(zhuǎn)基因植物將由于緊靠引入的啟動子的基因的表達改變而表現(xiàn)出 顯性表型。TILLING術(shù)語“TILLING”為“靶向誘導(dǎo)的基因組局部損傷”(Targeted InducedLocal Lesions In Genomes)的縮寫，是一種用于產(chǎn)生和/或鑒定編碼具有修飾的表達和/或活 性的蛋白質(zhì)的核酸序列的誘變技術(shù)。TILLING還允許選擇攜帶此類突變變體的植物。這些 突變變體可以在強度、位置或時間(例如，如果突變影響啟動子的話)上呈現(xiàn)出修飾的表 達。這些突變變體可以比其天然形式基因呈現(xiàn)更高的活性。TILLING將高密度誘變和高 通量篩選方法結(jié)合在一起。TILLING—般遵循的步驟有(a)EMS誘變(Redei GP和Koncz C, (1992) In Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J 編輯，新力口 坡，World Scientific Publishing Co，第 16-82 頁；Feldmann 等，(1994) In Meyerowitz EM, Somerville CR編輯，Arabidopsis.冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，第137-172 Μ ；Lightner J 禾口 CasparT，(1998) In J Martinez-Zapater, J SalinasMethods onMolecularBiology，82 卷 Humana Press，Totowa，NJ，第 91-104 頁)；(b)個體的 DNA 制備和 合并(pooling) ； (c)目的區(qū)域的PCR擴增；(d)變性和退火以使異源雙鏈體能夠形成；(e) DHPLC，其中合并物中異源雙鏈體的存在在色譜圖中檢測為額外的峰；(f)突變個體的鑒 定；和(g)突變PCR產(chǎn)物的測序。用于TILLING的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的(McCallum 等，(2000)NatBiotechnol 18 :455_457 ；由 Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2) 145-50 it 行綜述)。同源重組同源重組允許向基因組中的指定選擇位置引入所選的核酸序列。同源重組是生物 科學(xué)中常規(guī)用于低等生物體如酵母或苔蘚劍葉蘚屬(physcomitrella)的標準技術(shù)。在植 物中進行同源重組的方法已經(jīng)不僅在模式植物中描述(Offringa等(1990)EMB0 J. 9(10) 3077-84)，而且也在作物植物，如稻中描述(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10) 1030-4 ；Iida和 Terada(2004)Curr Opin Biotechnol 15(2) 132-8) 產(chǎn)率術(shù)語“產(chǎn)率”通常表示具有經(jīng)濟價值的可測量產(chǎn)出，其一般是與特定的作物、面積 和時期相關(guān)的。各植物部分基于其數(shù)量、大小和/或重量對產(chǎn)率直接做出貢獻，或者實際產(chǎn) 率是每英畝作物的年產(chǎn)率，用總產(chǎn)量(包括收獲的產(chǎn)量和估定的產(chǎn)量)除以種植的英畝數(shù) 來確定。術(shù)語植物的“產(chǎn)率”可以與該植物的營養(yǎng)性生物量、繁殖器官、和/或繁殖體(如 種子)相關(guān)。術(shù)語植物的“產(chǎn)率”可以與該植物的營養(yǎng)性生物量(根和/或枝條生物量)、繁殖 器官、和/或繁殖體(如種子)相關(guān)。早期活力“早期活力”是指活躍健康且很好均衡的生長，特別是在植物生長的早期階段，其 可以由增強的植物適度(fitness)引起，例如，由植物更好地適應(yīng)其環(huán)境(即優(yōu)化能源資源 的利用以及在枝條和根之間的分配)引起。具有早期活力的植物也可以顯示出增加的幼苗 存活和更佳的作物齊苗(establisment)，這往往產(chǎn)生高度均一的田地(作物以齊整的方式 生長，即大多數(shù)植物基本上同時達到發(fā)育的各階段)，以及常常更優(yōu)更高的產(chǎn)率。因此，早期 活力可以通過測量多種因素來確定，如千粒重、萌發(fā)率、出苗率、幼苗生長、幼苗高度、根長 度、根和枝條生物量，等等。增加/提高/增強術(shù)語“增加”、“提高”或“增強”可互換，且在本發(fā)明意義上表示與文中所定義的 對照植物相比，產(chǎn)率和/或生長多出至少5%、6%、7%、8%、9%或10%，優(yōu)選至少15 %或 20%，更優(yōu)選25%、30%、35%或40%。禾中子產(chǎn)率增加的種子產(chǎn)率可表現(xiàn)為如下一個或多個方面a)種子生物量(種子總重量)的 增加，這可以是以單粒種子和/或每植株和/或每公頃或英畝為基礎(chǔ)的增加；b)每圓錐花 序和/或每植株的花數(shù) 的增加；c)增加的(飽滿)種子數(shù)；d)增加的種子飽滿率(其表達 為飽滿種子數(shù)與種子總數(shù)的比率)；e)增加的收獲指數(shù)，其表達為可收獲部分如種子的產(chǎn) 率除以總生物量的比率；f)增加的一級圓錐花序數(shù)；g)增加的千粒重(TKW)，這通過計數(shù)飽 滿種子數(shù)和它們的總重量外推得到。TKW增加可來自于種子大小和/或種子重量的增加，并且也可來自胚和/或胚乳大小的增加。種子產(chǎn)率的增加也可表現(xiàn)為種子大小和/或種子體積的增加。此外，種子產(chǎn)率的增加也可表現(xiàn)為種子面積和/或種子長度和/或種子寬度和/或種子周長的增加。增加的 產(chǎn)率也可以導(dǎo)致改變的構(gòu)造，或可以因改變的構(gòu)造而發(fā)生。MSII^(greenness index)如本文所用的“綠度指數(shù)”根據(jù)植物的數(shù)字圖像計算。對于圖像中屬于植物目標 的每一個像素，計算綠色值相對于紅色值(在用于編碼顏色的RGB模型中)之比。綠度指 數(shù)表達為綠紅比超過給定閾值的像素百分比。在正常生長條件下、在鹽脅迫生長條件下、在 養(yǎng)分可利用度下降的生長條件下，在開花前末次成像中測量植物的綠度指數(shù)。相反，在干旱 脅迫生長條件下，在干旱后的首次成像中測量植物的綠度指數(shù)。腦本文所用術(shù)語“植物”涵蓋整株植物、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、 枝條、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官，其中上述每一種都包含目的基因/核酸序 列。術(shù)語“植物”也包括植物細胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、 花粉和小孢子，同樣其中上述每一種都包含目的基因/核酸序列。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的所有 植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或豆科牧草、觀賞植物、糧食作物、喬木 或灌木，選自槭樹屬物種(Acer spp.)、獼猴桃屬物種(Actinidia spp.)、秋葵屬物種 (Abelmoschus spp.)、劍麻(Agavesisalana)、冰草屬物種(Agropyron spp·)、匍莖剪股穎 (Agrostis stolonifera)、蔥屬物種(Allium spp.)、莧屬物種(Amaranthus spp·)、濱草 (Ammophilaarenaria)、鳳梨(Ananas comosus)、番蕩枝屬物禾中(Annona spp.)、序菜(Apium graveolens)、落花生屬物種(Arachis spp·)、木波羅屬物種(Artocarpusspp.)、石刁柏 (Asparagus officinalis)、燕麥屬物種(Avena spp.)(如燕麥(Avena sativa)、里予燕麥 (Avena fatua)、比贊燕麥(Avena byzantina) > Avenafatua var. sativa、雜禾中燕麥(Avena hybrida))、陽桃(Averrhoa carambola)、簕竹屬物種(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、蕓笞屬物禾中(Brassica spp.)(如歐洲油菜(Brassica napus)、蕪青(Brassica rapa ssp.)[蕓苔、油菜籽油菜、 ^^ ]) > Cadaba farinosa>^vBf ^ (Camellia sinensis)(Canna indica) (Cannabis sativa) ^MIRM^IJft (Capsicum spp. ) > pfipt (Carex elata)(Carica papaya)、大果假虎朿Ij (Carissa macrocarpa)、山核桃屬物禾中(Caryaspp.)、紅花(Carthamus tinctorius)、胃屬 禾中(Castanea spp· )、/fl卩圭帛(Ceiba pentandra) >1=^1=1 (Cichorium endivia)、才章禾中(Cinnamomumspp.) (Citrullus lanatus) IitM^ft (Citrus spp·)、椰子屬物種(Cocosspp.)、咖啡屬物種(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、 可拉屬(Colaspp.)、黃麻屬物種(Corchorus sp·)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛屬物 禾中(Corylus spp. )、山楂屬物種(Crataegus spp.)、番紅花(Crocus sativus)、南瓜屬物 種(Cucurbita spp·)、香瓜屬物種(Cucumis spp·)、菜薊屬物種(Cynaraspp.)、胡蘿卜 (Daucus carota)、山馬蟥屬物禾中(Desmodium spp·)、龍目艮(Dimocarpus longan)、薯裁屬 物種(Dioscorea spp.)、棉樹屬物種(Diospyrosspp.)、稗屬物種(Echinochloa spp.)、 油棕屬(Elaeis)(如非洲油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、糝子(Eleusine coracana)、！^DS·禾中(Erianthus sp. )(Eriobotrya japonica)、㈱屬
^^ (Eucalyptu sp)^!^^ (Eugenia uniflora)(Fagopyrum spp.)
棒屬物禾中(Fagus spp·)、蘋狀羊茅(Festuca arundinacea)、無花果(Ficus carica)、金桔 屬物種(Fortunella spp·)、草莓屬物種(Fragaria spp·)、銀杏(Ginkgo biloba)、大豆屬 物禾中(Glycine spp.)(如大豆(Glycine max)、黃豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、 陸地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵屬物種(Helianthusspp.)(如向日葵(Helianthus annus))、萱草(Hemerocallis fulva)、木槿屬物種(Hibiscus spp.)、大麥屬物種(Hordeum spp.)(如大麥(Hordeum vulgare))、甘暮(Ipomoea batatas)、核桃屬物種(Juglans spp·)、豸 H (Lactuca sativa) > ill Si MM ^lJft (Lathyrus spp. )(Lens culinaris) >
亞麻(Linumusitatissimum)、蕩枝(Litchi chinensis)、百脈根屬物禾中(Lotus spp·)、棱 (Luffa acutangula) ,ΜΜ Μ^Φ]^ (Lupinus spp. )(Luzulasylvatica) >
番爺屬物禾中(Lycopersicon spp.)(如番爺(Lycopersiconesculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme)、硬皮豆屬物禾中(Macrotyloma spp.)、蘋果屬物 種(Malus spp.)、西印度櫻桃(Malpighiaemarginata)、曼密蘋果(Mammea americana)、芒 ^ (Mangifera indica)、LM_禾中(Manihot spp.)(Manilkara zapota) ,MtE
苜蓿(Medicagosativa)、草木樨屬物種(Melilotus spp·)、薄荷屬物種(Mentha spp·)、芒 (Miscanthus sinensis)、苦瓜屬物種(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、色蕉屬物 種(Musa spp.)、煙草屬物種(Nicotiana spp.)、木犀欖屬物種(Oleaspp.)、仙人掌屬物種 (Opuntia spp. )、Ornithopus spp.、稻屬物禾中(Oryzaspp.)(如稻(Oryza sativa),闊葉 禾S (Oryza latifolia))、黍糜(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、雞蛋果 (Passiflora edulis)、歐防風(fēng)(Pastinaca sativa)、狼尾草屬(Pennisetum sp.)、鱷梨屬 ^J禾中(Persea spp. )(Petroselinum crispum)、|H (Phalaris arundinacea)、
屬物種(Phaseolus spp.)、梯牧草(PhIeum pratense)、刺葵屬物種(Phoenix spp.)、南方 蘆葦(Phragmites australis)、酸漿屬物種(Physalis spp·)、松屬物種(Pinusspp.)、阿 月渾子(Pistacia vera)、豌豆屬物種(Pisum spp.)、早熟禾屬物種(Poaspp.)、楊屬物種 (Populus spp.)、牧豆樹屬物種(Prosopis spp.)、李屬物種(Prunus spp.)、番石榴屬物種 (Psidium spp.)、石槽(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物禾中(Quercus spp·)、蘿卜(Raphanus sativus)、波葉大黃(Rheum rhabarbarum)、茶薦子屬物種(Ribes spp·)、蓖麻(Ricinuscommunis)、懸鉤子屬物種(Rubus spp·)、甘蔴屬物種(Saccharum spp.)、柳屬物種(Salix sp.)、接骨木屬物種(Sambucus spp·)、黑麥(Secale cereale)、 胡麻屬物種(Sesamum spp.)、白芥屬物 種(Sinapis sp.)、茄屬物種(Solanumspp.) (如馬鈴薯(Solanum tuberosum)、紅爺(Solanum integrifolium)或番棉(Solanum lycopersicum))、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物種(Spinaciaspp.)、蒲桃屬物 禾中(Syzygium spp.)、萬壽菊屬物禾中(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可樹 (Theobroma cacao)、車軸草屬物種(Trifoliumspp.)、黑小麥屬(Triticale sp.)、小黑麥 (Triticosecale rimpaui)、小麥屬物禾中(Triticum spp.)(如小麥(Triticum aestivum)、 硬粒小麥(Triticum durum)、圓維小麥(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、馬卡小 麥(Triticummacha)、面包/J、麥(Triticum sativum)或普通 zj、麥(Triticum vulgare))、/]、 金蓮花(Tropaeolum minus)、旱金蓮(Tropaeolum majus)、越桔屬物禾中(Vaccinium spp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、豇豆屬物種(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄屬 物種(Vitis spp.)、玉蜀黍(Zea mays)、北美洲野生稻(Zizania palustris)、棗屬物種 (Ziziphus spp.)等等。發(fā)明詳述 現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，增加植物中編碼AHL19/20多肽的核酸序列的表達，可以產(chǎn) 生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀、無延遲開花的植物。根據(jù)第一種實施方 案，本發(fā)明提供了相對于對照植物增強植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括增加植物中 編碼AHL19/20多肽的核酸序列的表達。增加編碼AHL19/20多肽的核酸序列的表達的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達編 碼AHL19/20多肽的核酸序列。在一個實施方案中，下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為表示 如本文所定義的AHL19/20多肽。下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的核酸序列”應(yīng)理解 為表示能夠編碼這樣的AHL19/20多肽的核酸序列。待引入植物(從而可用于實施本發(fā)明方 法)的核酸序列是編碼現(xiàn)在將要描述的此類多肽的任何核酸序列，下文也稱為“AHL19/20 核酸序列”或“AHL19/20基因”。如本文定義的"AHLigAO多肽”指包含與SEQ ID NO 36所示的保守結(jié)構(gòu)域(⑶) (包括在 SEQ ID NO :2 中)具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更高 氨基酸序列同一性的結(jié)構(gòu)域的任何多肽。備選地或另外地，如本文定義的“AHL19/20多肽”指如下任何多肽，所述多肽包 含(i)與 SEQ ID N0:37所示的AT-hook基序具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%、 99%或更高氨基酸序列同一性的基序；和(ii)與SEQ ID NO :38所示的植物及原核生物保 守(PPC)結(jié)構(gòu)域具有至少 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%
或更高氨基酸序列同一性的結(jié)構(gòu)域。備選地或另外地，如本文定義的“AHL19/20多肽”指如下任何多肽，所述多肽包含 (i)核定位信號；(ii)具有InterPro登錄號IPR014476的AT-hook DNA結(jié)合基序；和(iii) 具有InterPro登錄號IPR005175的植物及原核生物保守(PPC)結(jié)構(gòu)域。備選地或另外地，如本文定義的“AHL19/20多肽”指如下任何多肽序列，所述多肽 序列，當用于構(gòu)建AHL系統(tǒng)發(fā)生樹，例如圖1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO 2所示多肽序列的AHL19/20多肽群而非任何其他AHL群聚類。備選地或另外地，如本文定義的“AHL19/20多肽”指如下任何多肽，所述多肽按照 遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO 2所示的AHL19/20多肽或與本文表A中所示的任何全長多 肽序列具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更 高的氨基酸序列同一性?，F(xiàn)還發(fā)現(xiàn)，增加植物中編碼GRP多肽(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a) 多肽)的核酸序列的表達，產(chǎn)生在非生物脅迫條件下生長時相對于對照植物相具有增強的 產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。根據(jù)第一種實施方案，本發(fā)明提供了相對于對照植物增強在非生物 脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括增加植物中GRP多肽編碼核酸序列的 表達，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽。用于增加GRP多肽編碼核酸序列的表達的優(yōu)選方法是在植物中引入和表達GRP多肽編碼核酸序列。在一個實施方案中，下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為表示 如本文所定義的GRP多肽。下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的核酸序列”應(yīng)理解為表 示能夠編碼這樣的GRP多肽的核酸序列。待引入植物(從而可用于實施本發(fā)明金屬硫蛋白 2a(MT2a)多肽方法)的核酸序列是編碼現(xiàn)在將要描述的此類蛋白質(zhì)的任何核酸序列，下文 也稱為“GRP核酸序列”或“GRP基因”。本文中定義的“GRP多肽”是指SEQ ID NO :46所示的蛋白質(zhì)以及其直系同源物、 旁系同源物和同源物。優(yōu)選，SEQ ID NO 46的直系同源物、旁系同源物和同源物具有InterPro登錄號 IPR000347，描述為植物金屬硫蛋白，家族15。備選地或另外地，本文中所定義的“GRP多肽”是指按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO :46 所示的 GRP 多肽具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%、99%或更高的氨基酸序列同一性的任何多肽。金屬硫蛋白在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的，關(guān)于最近的綜述和分類，參見Cobbett和 GoldSbroUgh(2002)。金屬硫蛋白是具有啞鈴構(gòu)型的小蛋白質(zhì)，其源于彼此通過具有可 變長度和氨基酸組成的區(qū)域分隔開的保守N末端和C末端富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。基于一 級結(jié)構(gòu)，可區(qū)分4種類型的金屬硫蛋白。SEQ ID NO :46的金屬硫蛋白包含Cobbett和 Goldsbrough (2002)所定義的2型金屬硫蛋白典型的保守N末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含共有 序列“MSCCGG (N/S) CGCG (T/S/A) (G/A/S) C (K/Q/S) C”，因此，用于本發(fā)明方法的優(yōu)選同源物 是包含該保守結(jié)構(gòu)域的金屬硫蛋白。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，優(yōu)先調(diào)節(jié)ATT樣多肽編碼核酸在地上植物部分中的表達，可以產(chǎn) 生相對于對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。根據(jù)優(yōu)選實施方案，優(yōu)先在地上植物 部分中調(diào)節(jié)表達可以通過使用在地上植物部分中具有活性的啟動子來進行。術(shù)語“在地上 部分中具有活性的啟動子”在本文“定義”部分進行了定義。此外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)AAT多肽編碼核酸的表達可以產(chǎn)生當在非限氮條件下生長 時相對于對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。根據(jù)第一實施方案，本發(fā)明提供了相 對于對照植物增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)AAT多肽編碼核酸在非限氮條件 下生長的植物中的表達。在于地上植物部分中具有活性的啟動子控制下調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)AAT樣多肽編碼 核酸的表達的一個優(yōu)選方法是，在植物中引入和表達在于地上植物部分中具有活性的啟動 子控制下的AAT樣多肽編碼核酸。調(diào)節(jié)(優(yōu)選增加)AAT多肽編碼核酸的表達的一個優(yōu)選方法是，在植物中引入和表 達AAT多肽編碼核酸。在一個實施方案中，下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為表示 如本文所定義的AAT樣多肽。下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的核酸”應(yīng)理解為表示 能夠編碼這樣的AAT樣多肽的核酸。待引入植物(從而可用于實施本發(fā)明方法)的核酸是 編碼現(xiàn)在將要描述的此類蛋白質(zhì)的任何核酸，下文也稱為“AAT樣核酸”或“AAT樣基因”。在一個實施方案中，下文 述及的任何“可用于本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為表示 如本文所定義的AAT多肽。下文述及的任何“可用于本發(fā)明方法的核酸”應(yīng)理解為表示能夠編碼這樣的AAT多肽的核酸。待引入植物(從而可用于實施本發(fā)明方法)的核酸是編碼 現(xiàn)在將要描述的此類蛋白質(zhì)的任何核酸，下文也稱為“AAT核酸”或“AAT基因”。本文定義的“AAT樣多肽”或“AAT多肽”是指具有一個或多個下列特征的任何多 肽(a)催化下列反應(yīng)的能力L-丙氨酸+2-酮戊二酸丙酮酸+L-谷氨酸 (b)屬于酶分類編號=EC 2. 6. 1. 2.(c)具有氨基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(在InterPro中稱為IPR004839 ；以及在PFAM中稱為 PF00155)(d)具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶結(jié)構(gòu)域(在InterPro中稱為IPROOl 176)(e)靶向線粒體(f)當用于構(gòu)建包含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO :51或SEQ ID NO 56的AAT樣多肽或AAT多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類。術(shù)語“結(jié)構(gòu)域”和“基序”在本文“定義”部分進行了定義。存在用于鑒定結(jié)構(gòu)域 的專家數(shù)據(jù)庫，例如 SMART (Schultz 等(1998)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,5857-5864 ； Letunic 等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、 InterPro(Mulder 等，(2003)Nucl. Acids. Res. 31,315-318)> Prosite(Bucher 禾口 Bairoch(1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequencesmotifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94 ；第二屆分子生物學(xué)智能系統(tǒng)國際會議記錄(Proceedings 2nd InternationalConference on Intelligent Systems for Molecular Biology)Altman R. , Brutlag D. , Karp P. , Lathrop R. , Searls D.編輯,53-61 頁，AAAI Press, Menlo Park ；Hulo 等，Nucl. Acids. Res. 32 :D134_D137，(2004))或者 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1) :276_280 (2002)。進行蛋白質(zhì)序列芯片(in silico)分析的一組工 具可以從ExPASy蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)器獲得(瑞士生物信息學(xué)研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)(Gasteiger 等 ExPASy :the proteomics server for in-depth protein knowledge andanalysis. Nucleic Acids Res 31:3784-3788(2003))。SEQ ID NO :2 多肽 序列的分析在下面示于本文實施例2和4。例如，SEQ ID NO :2所示的AHL19/20肽包含 具有InterPro登錄號IPR014476的AT_hook DNA結(jié)合基序和在InterPro數(shù)據(jù)庫中具有 InterPro登錄號IPR005175并被描述為DUF296 (未知功能結(jié)構(gòu)域296)的植物及原核生物 保守(PPC)結(jié)構(gòu)域。還可使用常規(guī)技術(shù)，例如利用序列比對來鑒定結(jié)構(gòu)域。一個這樣的結(jié)構(gòu) 域是如SEQ ID NO 36所示的SEQ ID NO 2的保守結(jié)構(gòu)域(⑶)。所述⑶包含預(yù)測的NLS、 AT-hook DNA結(jié)合基序和PCC結(jié)構(gòu)域，如圖3中示意性顯示的和圖4中所示的。為比較而進行序列比對的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，此類方法包括GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 和 TFASTA。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch 的算法((1970) J. Mol. Biol. 48 443-453)來尋找可以使匹配數(shù)最大化且空位數(shù)最小化的兩序列間的全局(即跨越全序列) 比對。BLAST算法(Altschul等(1990) J Mol Biol 215 :403_10)計算序列同一性百分比， 并對兩序列之間的相似性進行統(tǒng)計學(xué)分析。執(zhí)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技 術(shù)信息中心(NCBI)公開地獲得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比對算法(1. 83 版)，采用默認的成對比對參數(shù)以及百分比的記分方法而容易地鑒定。利用可獲自MatGAT軟件包(Campanella 等，(2003)BMC Bioinformatics. 10 29. MatGAT :an application thatgenerates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)的 方法之一，也可以確定全局相似性和同一性百分比?？梢赃M行微小的人工編輯以優(yōu)化保守 基序之間的比對，這對于所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。此外，除了利用全長序 列進行同源物鑒定以外，還可以利用特定的結(jié)構(gòu)域?？梢岳蒙鲜龀绦虿捎媚J參數(shù)，針對 完整核酸序列或多肽序列或者針對選擇的結(jié)構(gòu)域或保守基序，確定序列同一性值。本文中 實施例3在表B中描述了 SEQ ID N0:2所示的AHL19/20多肽與表A中所列的AHL19/20多 肽之間的同一性百分比，其范圍在50%至99%氨基酸序列同一性之間。在表Bl中，顯示了 SEQ ID NO 36 (包含于SEQ ID NO :2中)所示的CD與實施例1表A中所列的AHL19/20多 肽的⑶之間的同一性百分比，其范圍在70%至99%氨基酸序列同一性之間。
蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測任務(wù)是重要的且得到充分研究的。已知蛋白質(zhì)的定位有助 于闡明其功能。用于蛋白質(zhì)定位的實驗方法從免疫定位至使用綠色熒光蛋白(GFP)來標 記蛋白質(zhì)。這些方法是精確的，但是與計算機方法相比非常費勞力。最近在根據(jù)序列數(shù)據(jù) 計算機預(yù)測蛋白質(zhì)定位方面取得了許多進展。其中本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的算法可在Swiss Institute forBioinformatics 托管的 ExPASy Proteomics tools 上獲得，例如，PSort、 TargetP, ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP, MIT0PR0T, PATS、PTSl、SignalP 等。本發(fā)明 多肽的亞細胞定位的鑒定示于實施例6。在SEQID N0:2的AHL19/20多肽中發(fā)現(xiàn)了預(yù)測的 核定位信號(NLS)。NLS是具有帶正電荷的賴氨酸或精氨酸的一個或多個短序列。特別地， 本發(fā)明的SEQ ID NO :2經(jīng)預(yù)測定位在真核細胞的核區(qū)室。此外，用于本發(fā)明方法的AHL19/20多肽(至少以其天然形式)通常，但不是必需 地，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性并能夠與其他蛋白質(zhì)相互作用。因此，具有降低的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性、 無轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性、具有降低的蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用能力或不具有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相 互作用能力的AHL19/20多肽都可同等地用于本發(fā)明的方法?？墒褂帽绢I(lǐng)域中熟知的技 術(shù)(例如 CurrentProtocols in Molecular Biology,第 1 禾口 2 卷，Ausubel 等(1994)， CurrentProtocols)容易地體外或體內(nèi)確定DNA結(jié)合活性和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。為 了確定AHL19/20多肽的DNA結(jié)合活性，幾種測定法是可用的，例如DNA結(jié)合凝膠-遷移測 定法(或凝膠阻滯試驗；Korfhage等(1994) Plant C 6 695-708)，體外DNA結(jié)合測定法 (Schindler等(1993) Plant J4(l) 137-150)，或酵母、動物和植物細胞中AHL19/20多肽的 轉(zhuǎn)錄激活(Halbach 等(2000)Nucleic Acid Res 28(18) :3542_3550)?？墒褂秒S機寡核苷 酸選擇技術(shù)(Viola&Gonzalez(May 26, 2007) Biochemistry)確定特定的 DNA 結(jié)合序列。在一個實施方案中，本發(fā)明以SEQ ID NO 1所示的核酸序列轉(zhuǎn)化植物來進行舉例 說明，其編碼SEQ ID N0:2的ALH19/20多肽序列。然而，本發(fā)明的實施并不局限于這些序 列；本發(fā)明的方法可以有利地利用任何編碼本文所定義的AHL19/20多肽的核酸序列來實 施。編碼AHL19/20多肽的核酸序列的實例在本文實施例1表A中給出。這樣的核 酸序列可用于實施本發(fā)明的方法。實施例1表A中給出的多肽序列為SEQ ID N0:2所示 AHL19/20多肽的直系同源物和旁系同源物的示例序列，其中術(shù)語“直系同源物”和“旁系同 源物”如本文所定義。可以通過進行所謂的交互BLAST搜索，容易地找到其它直系同源物和 旁系同源物。通常，這包括第一 BLAST，S卩，以查詢序列(例如，利用實施例1表A中所列的任一序列)針對任何序列數(shù)據(jù)庫如可公共獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST。當從核苷酸序 列開始時，通常使用BLASTN或TBLASTX (利用標準默認值)，而當從蛋白質(zhì)序列開始時，則 使用BLASTP或TBLASTN(利用標準默認值)。BLAST結(jié)果可以任選地過濾。接著使用過濾 的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長序列針對查詢序列來源生物的序列進行反向BLAST(第 二 BLAST)(在查詢序列為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的情況下，第二 BLAST將針對擬南 芥序列進行)。然后比較第一和第二 BLAST的結(jié)果。如果第一 BLAST中高排序的命中事件 (high-ranking hit)與查詢序列源自相同的物種，然后反向BLAST理想地導(dǎo)致查詢序列處 于最高命中事件之列，則找到了旁系同源物；如果第一 BLAST中高排序的命中事件與查詢 序列不源自相同的物種，且優(yōu)選地在反向BLAST時導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列， 則找到了直系同源物。 此外，GRP多肽，就SEQ ID NO :46和其直系同源物、旁系同源物和同源物而言， 通常具有可在金屬飽和試驗(Scheuhammer 等，Toxicol. Appl Pharmacol. 82，417-425， 1986)中測量的金屬結(jié)合活性和/或可用作氧化還原傳感器(Fabisiak等，Methods Enzymo1. 353，268-281(2002))。在一個實施方案中，本發(fā)明以SEQ ID NO :45所示的核酸序列轉(zhuǎn)化植物來進行舉例 說明，其編碼SEQ ID NO :46的多肽序列。然而，本發(fā)明的實施并不局限于這些序列；本發(fā)明 的方法可以有利地利用本文所定義的任何GRP編碼核酸序列或GRP多肽來實施。GRP多肽編碼核酸序列的實例可在本領(lǐng)域已知的數(shù)據(jù)庫中找到。這樣的核酸序列 可用于實施本發(fā)明的方法。直系同源物和旁系同源物(術(shù)語“直系同源物”和“直系同源 物”如本文所定義)可通過實施所謂的交互BLAST搜索而容易地找到。通常，這包括第一 BLAST，以查詢序列(例如，利用SEQ ID NO 46)針對任何序列數(shù)據(jù)庫如可公共獲得的NCBI 數(shù)據(jù)庫進行BLAST。當從核苷酸序列開始時，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用標準默認 值)，而當從蛋白質(zhì)序列開始時，則使用BLASTP或TBLASTN(利用標準默認值)。BLAST結(jié)果 可以任選地過濾。接著使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長序列針對查詢序列來源 生物的序列進行反向BLAST(第二 BLAST)(在查詢序列為SEQ ID NO 45或SEQ ID NO 46 的情況下，第二 BLAST將會針對擬南芥序列進行)。然后比較第一和第二 BLAST的結(jié)果。如 果第一 BLAST中高排序的命中事件與查詢序列源自相同的物種，然后反向BLAST理想地導(dǎo) 致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了旁系同源物；如果第一 BLAST中高排序的命 中事件與查詢序列源自不同物種，且優(yōu)選地在反向BLAST時導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事 件之列，則找到了直系同源物。在一個實施方案中，本發(fā)明以SEQ ID NO :50所示的核酸序列轉(zhuǎn)化植物來進行舉例 說明，其編碼SEQ ID NO :51的多肽序列。然而，本發(fā)明的實施并不局限于這些序列；本發(fā)明 的方法可以有利地利用本文所定義的任何AAT樣核酸或AAT樣多肽來實施?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的核酸的實例包括SEQ ID NO 51所示的ATT樣多肽的直 系同源物和旁系同源物，其中術(shù)語“直系同源物”和“旁系同源物”如本文所定義。可以通 過進行所謂的交互BLAST搜索，容易地找到直系同源物和旁系同源物。通常，這包括第一 BLAST,以查詢序列(例如SEQ ID NO 50或SEQ ID NO 51)針對任何序列數(shù)據(jù)庫如可公共 獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST。當從核苷酸序列開始時，通常使用BLASTN或TBLASTX (利 用標準默認值)，而當從蛋白質(zhì)序列開始時，則使用BLASTP或TBLASTN(利用標準默認值)。BLAST結(jié)果可以任選地過濾。接著使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長序列針對查 詢序列來源生物的序列進行反向BLAST (第二 BLAST)(在查詢序列為SEQ ID NO 50或SEQ ID N0:51的情況下，第二 BLAST將會針對衣藻(Chlamydomonas)序列進行)。然后比較第 一和第二 BLAST的結(jié)果。如果第一 BLAST中高排序的命中事件與查詢序列源自相同的物 種，然后反向BLAST理想地導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了旁系同源物；如 果第一 BLAST中高排序的命中事件與查詢序列源自不同物種，且優(yōu)選地在反向BLAST時導(dǎo) 致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了直系同源物。在一個實施方案中，本發(fā)明以SEQ ID NO :55所示的核酸序列轉(zhuǎn)化植物來進行舉例 說明，其編碼SEQ ID NO :56的多肽序列。然而，本發(fā)明的實施并不局限于這些序列；本發(fā)明 的方法可以有利地利用本文所定義的任何AAT編碼核酸或AAT多肽來實施。本文實施例1中給出了尋找AAT多肽或其直系同源物或旁系同源物的編碼核酸的 方法實例。這樣的核酸可用于本發(fā)明的方法。直系同源物和旁系同源物可以通過進行所謂 的交互BLAST搜索容易地找到。通常，這包括第一 BLAST，以查詢序列(例如利用SEQ ID N0:55或SEQ ID NO 56)針對任何序列數(shù)據(jù)庫如可公共獲得的NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST。當 從核苷酸序列開始時，通常使用BLASTN或TBLASTX(利用標準默認值)，而當從蛋白質(zhì)序列 開始時，則使用BLASTP或TBLASTN(利用標準默認值)。BLAST結(jié)果可以任選地過濾。接著 使用過濾的結(jié)果或者未過濾的結(jié)果中的全長序列針對查詢序列來源生物的序列進行反向 BLAST (第二 BLAST)(在查詢序列為 SEQ ID NO 55 或 SEQ ID NO 56 的情況下，第二 BLAST 將針對稻序列進行)。然后比較第一和第二 BLAST的結(jié)果。如果第一 BLAST中高排序的命 中事件與查詢序列源自相同的物種，然后反向BLAST理想地導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事 件之列，則找到了旁系同源物；如果第一 BLAST中高排序的命中事件與查詢序列源自不同 物種，且優(yōu)選地在反向BLAST時導(dǎo)致查詢序列處于最高命中事件之列，則找到了直系同源 物。高排序的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有顯著性(或者換 句話說，偶然發(fā)現(xiàn)此命中事件的幾率越低)。E值的計算是本領(lǐng)域眾所周知的。除了 E值之 夕卜，還對比較進行同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核酸(或多肽)序列之間 在特定長度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在大家族的情況下可以使用ClustalWj^i 以鄰接樹，來輔助對相關(guān)基因聚類的可視化和鑒定直系同源物和旁系同源物。在含有SEQ ID NO 2的群內(nèi)聚類的任何序列(AHL19多肽；圖1和2中用圓圈標示的)可被認為落在上 述AHL19/20多肽定義內(nèi)，并且可被認為適合用于本發(fā)明的方法。核酸變體也可用于實施本發(fā)明的方法。這類核酸變體的實例包括編碼實施例1表 A中所示任一多肽序列的同源物和衍生物的核酸序列，其中“同源物”和“衍生物”如本文所 定義。同樣可用于本發(fā)明方法的有編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系同源物或旁 系同源物的同源物和衍生物的核酸序列?？捎糜诒景l(fā)明方法的同源物和衍生物與其源自的 未修飾蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物活性和功能活性?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的其他 核酸變體包括編碼ALH19/20多肽的核酸序列的 部分、與編碼ALH19/20多肽的核酸序列雜交的核酸序列、編碼ALH19/20多肽的核酸序列 的剪接變體、編碼ALH19/20多肽的核酸序列的等位基因變體，以及通過基因改組獲得的 ALH19/20多肽編碼核酸序列的變體。術(shù)語雜交序列、剪接變體、等位基因變體和基因改組如本文所述。編碼ALH19/20多肽的核酸序列無需是全長核酸序列，因為本發(fā)明方法的實施不 依賴于全長核酸序列的使用。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包 括在植物中引入和表達實施例1表A所示任一核酸序列的部分、或者編碼實施例1表A所 示任一多肽序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的部分。 編碼SEQ ID NO 46的同源物和衍生物的核酸序列變體也可用于實施本發(fā)明的方 法，術(shù)語“同源物”和“衍生物”如本文所定義。同樣可用于本發(fā)明方法是編碼SEQ ID NO 46的直系同源物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸序列?？捎糜诒景l(fā)明方法的同源物 和衍生物與其源自的未修飾蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物活性和功能活性。可用于實施本發(fā)明方法的其他核酸序列變體包括GRP多肽編碼核酸序列的部分、 與GRP多肽編碼核酸序列雜交的核酸序列、GRP多肽編碼核酸序列的剪接變體、GRP多肽編 碼核酸序列的等位基因變體，以及通過基因改組獲得的GRP多肽編碼核酸序列的變體。術(shù) 語雜交序列、剪接變體、等位基因變體和基因改組如本文所述。GRP多肽編碼核酸序列無需是全長核酸序列，因為本發(fā)明方法的實施不依賴于全 長核酸序列的使用。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強在非生物脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān) 性狀的方法，包括在植物中引入和表達SEQ IDNO :45的部分或編碼SEQ ID N0:46的直系同 源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的部分。核酸變體也可用于實施本發(fā)明的方法。這類核酸變體的實例包括編碼SEQ ID NO 51的同源物和衍生物的核酸，術(shù)語“同源物”和“衍生物”如本文所定義。同樣可用于本發(fā) 明方法的有編碼SEQ ID NO :51所示AAT樣多肽或SEQ ID NO :56所示AAT多肽的直系同源 物或旁系同源物的同源物和衍生物的核酸。可用于本發(fā)明方法的同源物和衍生物與其源自 的未修飾蛋白質(zhì)具有基本上相同的生物活性和功能活性?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的其他核酸變體包括AAT樣多肽或AAT多肽編碼核酸的部 分、與AAT樣多肽或AAT多肽編碼核酸雜交的核酸、AAT樣多肽或AAT多肽編碼核酸的剪接 變體、AAT樣多肽或AAT多肽編碼核酸的等位基因變體，以及通過基因改組獲得的AAT樣多 肽或AAT多肽編碼核酸的變體。術(shù)語雜交序列、剪接變體、等位基因變體和基因改組如本文 所述。AAT樣多肽或AAT多肽編碼核酸無需是全長核酸，因為本發(fā)明方法的實施不依賴 于全長核酸序列的使用。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物 中引入和表達SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO 55的部分或編碼SEQ ID N0:51或SEQ ID NO: 56的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的部分。核酸序列的“部分”可以例如，通過對核酸序列進行一個或多個缺失來制備?！安?分”可以以分離的形式使用，或者可將其與其他編碼(或非編碼)序列融合，以便例如，產(chǎn)生 組合了若干活性的蛋白質(zhì)。當與其他編碼序列融合時，經(jīng)翻譯后所產(chǎn)生的多肽可能比針對 該蛋白質(zhì)部分所預(yù)測到的要大?？捎糜诒景l(fā)明方法的“部分”編碼如本文所定義的AHL19/20多肽，并與實施例1表 A所示多肽序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選“部分”是實施例1表A所示任一核酸序 列的部分，或是編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系同源物或旁系同源物的核酸序 列的部分。優(yōu)選“部分”按照遞增的優(yōu)選順序是至少400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、940個連續(xù)核苷酸長，所述連續(xù)核苷酸來自實施例1表A所示任一核酸序列 或者編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系同源物或旁系同源物的核酸序列。優(yōu)選， 所述部分是編碼多肽序列的核酸序列的部分，其中所述多肽序列當用于構(gòu)建AHL系統(tǒng)發(fā)生 樹，例如圖1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO:2所示多肽序列的AHL19/20 多肽群而非任何其他AHL群聚類。最優(yōu)選“部分”是核酸序列SEQ ID NO :1的部分?？捎糜诒景l(fā)明方法的“部分”編碼如本文所定義的GRP多肽，并與SEQID NO 46所示多肽序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選部分是SEQ IDNO :45所示核酸序列的部分， 或是編碼SEQ ID NO :46所示多肽序列的直系同源物或旁系同源物的核酸序列的部分。優(yōu) 選“部分”長度是至少50、75、100、125、150、175、200、210、220、230、240或更多個連續(xù)核苷 酸，所述連續(xù)核苷酸來自SEQ ID NO 45或者編碼SEQ ID NO 46的直系同源物或旁系同源 物的核酸序列。最優(yōu)選，所述部分是SEQ ID NO :45的核酸序列的部分?？捎糜诒景l(fā)明方法的“部分”編碼如本文所定義的AAT樣多肽，并與SEQ ID NO 51 的氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選“部分”長度是至少500、550、600、650、700、 750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、 1550個連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸來自SEQ ID NO :50或者編碼SEQ ID NO :51的直系同 源物或旁系同源物的核酸序列。優(yōu)選“部分”編碼這樣的氨基酸序列的片段，當用于構(gòu)建包含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生 樹時，所述氨基酸序列與包含SEQ ID NO :51的AAT樣多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序 列群聚類。可用于本發(fā)明方法的“部分”編碼如本文所定義的AAT多肽，并與SEQID NO 56的 氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選“部分”長度是至少500、550、600、650、700、 750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450 個連續(xù)核 苷酸，所述連續(xù)核苷酸來自SEQ ID NO :55或者編碼SEQ ID NO :56的直系同源物或旁系同 源物的核酸序列。優(yōu)選，所述部分編碼氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列，當用于構(gòu)建包含AAT序 列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO: 56的AAT多肽群而非任何其他AAT序列群聚類。可用于本發(fā)明方法的另一核酸序列變體為在降低的嚴格條件下、優(yōu)選在嚴格條件 下，能夠與本文所定義的產(chǎn)率增加性多肽的編碼核酸序列或者本文所定義的“部分”雜交 的核酸序列，其中所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、 GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。根據(jù)本發(fā)明，在一個實施方案中提供了增加植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包 括在植物中引入和表達能夠與實施例1表A所示任一核酸序列雜交的核酸序列，或者包括 在植物中引入和表達能夠與編碼實施例1表A所示任一核酸序列的直系同源物、旁系同源 物或同源物的核酸序列雜交的核酸序列。可用于本發(fā)明方法的雜交序列編碼如本文所定義的AHL19/20多肽，與實施例1表 A所示多肽序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選雜交序列能夠與實施例1表A所示任一 核酸序列雜交、或與任一前述序列的部分雜交，其中部分如上文所定義；或者其中雜交序列 能夠與編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系同源物或旁系同源物的核酸序列雜交。優(yōu)選，所述雜交序列能夠與編碼多肽序列的核酸序列雜交，所述多肽序列，當用于構(gòu)建AHL 系統(tǒng)發(fā)生樹，例如圖1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO 2所示多肽序列的 AHL19/20多肽群而非任何其他AHL群聚類。最優(yōu)選雜交序列能夠與SEQ ID N0:1所示的 核酸序列或其部分雜交。根據(jù)本發(fā)明，在一個實施方案中提供了強在非生物脅迫條件下生長的的包括SEQ ID NO :45雜交的核酸序列，或包括在植物中引入和表達能夠與編碼SEQ ID NO :46的直系 同源物、旁系同源物或同源物的核酸雜交的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的雜交序列編碼如本文所定義的GRP多肽，與SEQID NO 46所 示多肽序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選雜交序列能夠與SEQ ID N0:45雜交、或與該 序列的部分雜交，其中部分如上文所定義；或者雜交序列能夠與編碼SEQ ID N0:46的直系 同源物或旁系同源物的核酸序列或其部分雜交。根據(jù)本發(fā)明，在一個實施方案中提供了增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達能夠與SEQ ID NO :50雜交或者能夠與編碼SEQ ID NO :51的直系同源 物、旁系同源物或同源物的核酸雜交的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的雜交序列編碼如本文所定義的AAT樣多肽，與SEQ ID NO 51 所示氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選雜交序列能夠與編碼SEQ ID N0:51的 直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸雜交、或與這樣的核酸的部分雜交，部分如上文所 定義。最優(yōu)選，雜交序列能夠與SEQ ID NO :50所示核酸雜交或與其部分雜交。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達 能夠與SEQ ID NO :55雜交或者能夠與編碼SEQ ID NO :56的直系同源物、旁系同源物或同 源物的核酸雜交的核酸?？捎糜诒景l(fā)明方法的雜交序列編碼如本文所定義的AAT多肽，與SEQID NO 56的 氨基酸序列具有基本上相同的生物活性。優(yōu)選雜交序列能夠與編碼SEQ ID N0:56的直系同 源物、旁系同源物或同源物的核酸雜交、或與這樣的核酸的部分雜交，部分如上文所定義。 最優(yōu)選，雜交序列能夠與SEQ ID NO :55所示核酸雜交或與其部分雜交。優(yōu)選雜交序列編碼具有這樣的氨基酸序列的多肽，該氨基酸序列當全長且用于構(gòu) 建包含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO :51的AAT樣多肽群或與包含SEQ ID NO 56的AAT多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類?？捎糜诒景l(fā)明方法的另一類核酸序列變體為編碼前文所定義的產(chǎn)率增加性多肽 的剪接變體，其中剪接變體如本文所定義，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序 蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多 肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。根據(jù)本發(fā)明，提供了增強種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達實 施例1表A所示任一核酸序列的剪接變體、或編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系 同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接變體。在一個實施方案中，剪接變體是SEQ ID NO :1所示核酸序列的剪接變體，或編碼 SEQ ID NO :2的直系同源物或旁系同源物的核酸序列的剪接變體。優(yōu)選剪接變體是編碼這 樣的多肽序列的核酸序列的剪接變體，所述多肽序列，當用于構(gòu)建AHL系統(tǒng)發(fā)生樹，例如圖 1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO 2所示多肽序列的AHL19/20多肽群而非任何其他AHL群聚類。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了相對于對照植物增強在非生物脅迫條件 下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達SEQ ID N0:45的剪接變 體、或編碼SEQ ID NO :46的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的剪接變體。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括 在植物中引入和表達SEQ ID N0:50或SEQ ID NO :55的剪接變體、或編碼SEQ ID N0:51或 SEQ ID NO :56的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接變體。優(yōu)選由剪接變體編碼的氨基酸序列，當用于構(gòu)建包含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時， 與包含SEQ ID NO :51的AAT樣多肽群或與包含SEQ ID NO :56的AAT多肽群而非任何其他 AAT或AAT樣序列群聚類。
可用于實施本發(fā)明方法的另一類核酸序列變體為編碼前文所定義的產(chǎn)率增加性 多肽的核酸序列的等位基因變體，其中等位基因變體如本文所定義，所述產(chǎn)率增加性多肽 選自核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHLigAOhGRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多 肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AAT)多肽。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在 植物中引入和表達實施例1表A所示任一核酸序列的等位基因變體，或者包括在植物中引 入和表達編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸 序列的等位基因變體?？捎糜诒景l(fā)明方法的等位基因變體與SEQ ID NO 2的AHL19/20多肽及實施例1 表A所示的任一多肽序列具有基本上相同的生物活性。等位基因變體天然存在，并且這些 天然等位基因的應(yīng)用包含于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選等位基因變體為SEQ ID NO :1的等位基 因變體，或編碼SEQ ID NO :2的直系同源物或旁系同源物的核酸序列的等位基因變體。優(yōu)選 等位基因變體是這樣的多肽序列的等位基因變體，所述多肽序列當用于構(gòu)建AHL系統(tǒng)發(fā)生 樹，例如圖1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID N0:2所示多肽序列的AHL19/20 多肽群而非任何其他AHL群聚類。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強在非生物脅迫條件下生長的植物的 產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達SEQ ID NO :45的等位基因變體、或包括在 植物中引入和表達編碼SEQ ID NO :46所示多肽序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的 核酸序列的等位基因變體?？捎糜诒景l(fā)明方法的等位基因變體與SEQ ID NO 46的GRP多肽具有基本上相同 的生物活性。等位基因變體天然存在，并且這些天然等位基因的應(yīng)用包含于本發(fā)明的方法 中。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括 在植物中引入和表達SEQ ID N0:50或SEQ ID NO :55的等位基因變體、或編碼SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO :56的氨基酸序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位基因 變體?？捎糜诒景l(fā)明方法的等位基因變體與SEQ ID NO 51的AAT樣多肽或SEQ ID NO 56的AAT多肽具有基本上相同的生物活性。等位基因變體天然存在，并且這些天然等位基因的應(yīng)用包含于本發(fā)明的方法中。優(yōu)選由等位基因變體編碼的氨基酸序列，當用于構(gòu)建包 含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO :51的AAT樣多肽群或與包含SEQ ID NL: 56的AAT多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類?；蚋慕M或定向進化也可用于產(chǎn)生上文所定義的產(chǎn)率增加性多肽的編碼核酸序 列的變體；其中術(shù)語“基因改組”如本文所定義，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook 基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a (MT2a) 多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。 在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在 植物中引入和表達實施例1表A所示任一核酸序列的變體，或者包括在植物中引入和表達 編碼實施例1表A所示任一多肽序列的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的變 體，該變體核酸序列通過基因改組獲得。優(yōu)選，通過基因改組獲得的核酸序列編碼多肽序列，所述多肽序列，當用于構(gòu)建 AHL系統(tǒng)發(fā)生樹，例如圖1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO 2所示多肽序 列的AHL19/20多肽群而非任何其他AHL群聚類。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強在非生物脅迫條件下生長的植物的 產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括在植物中引入和表達SEQ ID NO :45的變體核酸序列，或者包括 在植物中引入和表達編碼SEQ ID NO :46的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸序列的 變體，該變體核酸序列通過基因改組獲得。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括 在植物中引入和表達SEQ ID NO: 50或SEQ ID NO 55的變體，或編碼SEQ ID N0:51或SEQ ID NO 56的直系同源物、旁系同源物或同源物的核酸的變體，該變體核酸通過基因改組獲得。優(yōu)選，通過基因改組獲得的變體核酸編碼這樣的氨基酸序列，當用于構(gòu)建包含AAT 序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，其與包含SEQ ID NO 51的AAT樣多肽群或與包含SEQ ID NO 56的 AAT多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類。此外，還可利用定點誘變獲得核酸序列變體。若干方法可用來實現(xiàn)定點誘變，最常 見的是基于 PCR 的方法(Current Protocols in MolecularBiology. Wiley 編輯)。AHL19/20多肽編碼核酸序列可以來自任何天然或人造的來源。可以通過有意的人 為操作在組成和/或基因組環(huán)境上修飾核酸序列，使之不同于天然形式。優(yōu)選AHL19/20多 肽編碼核酸序列來自植物，還優(yōu)選來自雙子葉植物，更優(yōu)選來自十字花科(Brassicaceae)， 最優(yōu)選所述核酸序列來自擬南芥。GRP多肽編碼核酸序列可以來自任何天然或人造的來源?？梢酝ㄟ^有意的人為操 作在組成和/或基因組環(huán)境上修飾核酸序列，使之不同于天然形式。優(yōu)選GRP多肽編碼核 酸序列來自植物。在SEQ ID NO 45的情況下，GRP多肽編碼核酸序列優(yōu)選來自雙子葉植物， 更優(yōu)選來自十字花科，最優(yōu)選所述核酸序列來自擬南芥。實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。術(shù) 語“產(chǎn)率”和“種子產(chǎn)率”在本文“定義”部分有更詳細的說明。實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在非生物脅迫條件下生長時相對于對照植物具有增強的 產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。特別地，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生當在非生物脅迫條件下生長時相對于對照植物具有增加的早期活力和增加的產(chǎn)率，特別地增加的生物量和增加的種子產(chǎn)率， 的植物。術(shù)語“產(chǎn)率”和“種子產(chǎn)率”在本文“定義”部分有更詳細的說明。此處所述及的增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀應(yīng)理解為表示植物的一個或多個部分的早期 活力和/或生物量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可 收獲)部分。特別地，這樣的可收獲部分為生物量和/或種子，并且實施本發(fā)明的方法使得 在非生物脅迫條件下生長的植物，相對于在相當條件下生長的對照植物的早期活力、生物 量或種子產(chǎn)率，具有增加的早期活力、生物量和/或種子產(chǎn)率。AAT樣多肽編碼核酸可以來自任何天然或人造的來源。可以通過有意的人為 操作在組成和/或基因組環(huán)境上修飾核酸，使之不同于天然形式。優(yōu)選AAT樣核酸來自 藻類，還優(yōu)選來自衣藻屬(Chlamydomonas)，更優(yōu)選來自物種雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。特別地，實施本發(fā)明的 方法產(chǎn)生相對于對照植物具有增加的產(chǎn)率，尤其是具有增加的種子產(chǎn)率，的植物。術(shù)語“產(chǎn) 率”和“種子產(chǎn)率”在本文“定義”部分有更詳細的說明。此處所述及的增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀應(yīng)理解為表示植物的一個或多個部分的生物 量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。特 別地，這樣的可收獲部分為種子。AAT多肽編碼核酸可以來自任何天然或人造的來源?？梢酝ㄟ^有意的人為操作在 組成和/或基因組環(huán)境上修飾核酸，使之不同于天然形式。優(yōu)選POI多肽編碼核酸來自植 物。還優(yōu)選來自單子葉植物，更優(yōu)選來自禾本科(Poaceae)，最優(yōu)選所述核酸來自稻(Oryza sativa)0此處所述及的增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀應(yīng)理解為表示植物的一個或多個部分的生物 量(重量)的增加，所述部分可以包括地上(可收獲)部分和/或地下(可收獲)部分。特 別地，這樣的可收獲部分為種子。并且實施本發(fā)明的方法使得植物相對于對照植物的種子 產(chǎn)率具有增加的種子產(chǎn)率。以玉米為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個或多個方面每公頃或英畝建植 (established))的植物數(shù)的增加；每株植物的穗數(shù)的增加；行數(shù)、行粒數(shù)、粒重、千粒重、穗 長度/直徑的增加；種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù)除以種子總數(shù)并乘以100)的增加，等等。 以稻為例，產(chǎn)率增加可以表現(xiàn)為如下一個或多個方面的增加每公頃或英畝的植物數(shù)、每株 植物的圓錐花序數(shù)、每個圓錐花序的小穗數(shù)、每個圓錐花序的花朵(小花)數(shù)(其表達為飽 滿種子數(shù)占一級圓錐花序(primary panicles)數(shù)的比率)、種子飽滿率(其為飽滿種子數(shù) 除以種子總數(shù)并乘以100)的增加、千粒重的增加，等等。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了相對于對照植物增強植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀 的方法，所述方法包括增加植物中編碼本文所定義的AHL19/20多肽的核酸序列的表達。由于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的種產(chǎn)率相關(guān)性狀，這些植物可呈現(xiàn)出， 相對于對照植物在其生命周期相應(yīng)階段的生長速率而言，增加的生長速率(至少在其部分 生命周期中)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了相對于 在相當?shù)臈l件下生長的對照植物，增強 在非生物脅迫生長條件下的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別地植物的生物量和/或種子產(chǎn)率的方法，所述方法包括增加植物中編碼本文所定義的GRP多肽的核酸序列的表達。由于在非生物脅迫條件下生長的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性 狀，這些植物可呈現(xiàn)出，相對于在相當生長條件下的對照植物在其生命周期的相應(yīng)階段上 的生長速率而言，增加的生長速率(至少在其部分生命周期中)。在一個根據(jù)本發(fā)明的實施方案中，提供了相對于對照植物增加植物的產(chǎn)率、特別 是種子產(chǎn)率的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)植物中編碼本文所定義的AA樣多肽或AAT多肽的核 酸的表達，優(yōu)選增加表達。由于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，這些植物可呈現(xiàn)出，相對于對照植物 在其生命周期相應(yīng)階段的生長速率而言，增加的生長速率(至少在其部分生命周期中)。增加的生長速率可以是對植物的一個或多個部分(包括種子)特異的，或者可以 基本上遍及整株植物。具有增加生長速率的植物可以具有更短的生命周期。植物的生命周 期可以理解為表示從成熟干種子生長至植物產(chǎn)生類似于起始材料的成熟干種子 的階段所 需的時間。此生命周期可以受到諸如早期活力、生長速率、綠度指數(shù)、開花時間和種子成熟 速度等因素的影響。生長速率的增加可以出現(xiàn)在植物生命周期的一個或多個階段，或者出 現(xiàn)在基本上整個植物生命周期的過程中。在植物生命周期的早期階段，生長速率的增加可 以反映出增加的(早期)活力。生長速率的增加可以改變植物的收獲周期，使植物能夠比 原來可能的情況更晚播種和/或更快收獲(類似的效果可以通過較早的開花時間獲得；在 作物中延遲的開花通常不是期望的性狀)。如果生長速率充分增加，可以允許再播種同種植 物物種的種子(例如完全在一個常規(guī)的生長期內(nèi)，播種和收獲稻類植物、接著再播種和收 獲稻類植物)。與此類似，如果生長速率充分地增加，可以允許再播種不同植物物種的種子 (例如播種和收獲玉米植物，隨后，例如，播種和任選地收獲大豆、馬鈴薯或任何其他適合的 植物)。在一些作物植物的情況下，也可能可以從同一砧木得到額外次數(shù)的收獲。改變植物 的收獲周期可以導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(這是由于(比方說在一年中)任何特定 植物可以生長和收獲的次數(shù)的增加)。與野生型對應(yīng)物相比，生長速率的增加還可能允許在 更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，這是因為種植作物的地域限制通常由種植時(早季)或收 獲時(晚季)不利的環(huán)境條件所決定。如果縮短收獲周期，就可以避免這類不利條件?？?以通過從生長曲線獲得多種參數(shù)來確定生長速率，這類參數(shù)可以是T-Mid(植物達到其最 大大小的50%所需的時間)和T-90(植物達到其最大大小90%所需的時間)等等。本文 所定義的生長速率不用于表示延遲的開花。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了相對于對照植物具有增加 的生長速率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，提供了增加植物生長速率的方法，所 述方法包括增加植物中編碼本文所定義的AHL19/20多肽的核酸序列的表達。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了在非生物脅迫條件下生長 時相對于對照植物具有增加的生長速率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，提供了增 加在非生物脅迫條件下生長的植物生長速率的方法，所述方法包括增加植物中編碼本文所 定義的GRP多肽的核酸序列的表達。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了相對于對照植物具有增加 的生長速率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的該實施方案，提供了增加植物生長速率的方法，所 述方法包括調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加，地上植物部分中編碼本文所定義的ATT樣多肽或ATT多肽的核酸的表達。與在相當條件下生長的對照植物相比，增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀可以發(fā)生在植物 處于非脅迫條件下或暴露于多種脅迫時。與對照植物相比，產(chǎn)率相關(guān)性狀的增強(種子產(chǎn) 率和/或生長速率的增加)可以發(fā)生在植物處于非脅迫條件下或暴露于多種脅迫時。 在特別優(yōu)選實施方案中，在非脅迫條件下實施本發(fā)明的方法。然而，無論植物處于 非脅迫條件下還是暴露于不同的脅迫，都可以發(fā)生與對照植物相比，產(chǎn)率和/或生長速率 的增加。植物通常通過更緩慢地生長來對暴露于脅迫作出反應(yīng)。在重度的脅迫條件下，植 物甚至可能完全停止生長。另一方面，輕度的脅迫在此處定義為植物暴露于該脅迫后、不導(dǎo) 致植物出現(xiàn)無重新生長能力的完全停止生長的任何脅迫。在本發(fā)明的意義上，輕度脅迫導(dǎo) 致受脅迫的植物與在非脅迫條件下的對照植物相比，生長減少不足40 %、35 %或30 %，優(yōu) 選不足25%、20%或15%，更優(yōu)選不足14%、13%、12%、11%或10%或更低。由于農(nóng)業(yè)實 踐(灌溉、施肥、農(nóng)藥處理)的進步，在栽培的作物植物中通常不會遇到重度脅迫。因此，由 輕度脅迫誘導(dǎo)的減弱的生長通常是農(nóng)業(yè)上不期望的特征。輕度脅迫可以是植物接觸到的 日常生物和/或非生物(環(huán)境)脅迫。非生物脅迫可以由干旱或過多的水、缺氧脅迫、鹽脅 迫、化學(xué)毒性、氧化脅迫和熱、冷或冰凍溫度引起。非生物脅迫可以是由水脅迫(特別由于 干旱)、鹽脅迫、氧化脅迫或離子脅迫引起的滲透脅迫。生物脅迫通常是由病原體例如細菌、 病毒、真菌、線蟲和昆蟲引起的脅迫。本文所用的術(shù)語“非脅迫”條件是允許植物最佳生長 的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉給定區(qū)域的正常土壤條件和氣候條件。如Wang等(Planta (2003) 218 :1_14)所報道的那樣，非生物脅迫引起一系列的形 態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子變化，對植物生長和生產(chǎn)力造成不利影響。已知干旱、鹽度、 極端溫度和氧化脅迫相互聯(lián)系，并可以通過相似的機制誘發(fā)生長和細胞損害。Rabbani等 (Plant Physiol (2003) 133 :1755_1767)描述了干旱脅迫和高鹽度脅迫之間特別高程度的 “對話(cross-talk)”。例如，干旱和/或鹽度主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致破壞細胞中的穩(wěn) 態(tài)和離子分布。氧化脅迫通常與高溫或低溫、鹽度或干旱脅迫相伴，可以引起功能及結(jié)構(gòu)蛋 白質(zhì)的變性。所以，這些多種多樣的環(huán)境脅迫通常激活相似的細胞信號傳遞路徑和細胞應(yīng) 答，如應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生、抗氧化劑的上調(diào)、相容溶質(zhì)的累積以及生長阻抑。如本文所用的術(shù) 語“非脅迫”條件為那些允許植物最佳生長的環(huán)境條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉給定區(qū)域的 正常土壤條件和氣候條件。在一個實施方案中，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在非脅迫條件下或在輕度脅迫條件下 生長時相對于在相當條件下生長的對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。因此， 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，提供了增強在非脅迫條件下或在輕度脅迫條件下生長的植物 的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增加植物中AHL19/20多肽編碼核酸序列的表 達。在一個實施方案中，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在輕度脅迫條件下生長時相對于在相 當條件下生長的對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實施 方案，提供了增強在輕度脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增 加植物中GRP多肽編碼核酸序列的表達。實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生在非生物脅迫條件下生長時相對于在相當條件下生長的對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。如Wang等(Planta (2003) 218 :1_14)所報道的 那樣，非生物脅迫引起一系列的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子變化，對植物生長和生產(chǎn) 力造成不利影響。已知干旱、鹽度、極端溫度和氧化脅迫相互聯(lián)系，并可以通過相似的機制 誘發(fā)生長和細胞損害。Rabbani等(Plant Physiol (2003) 133 1755-1767)描述了干旱脅 迫和高鹽度脅迫之間存在著的一種特別高程度的“對話(cross-talk)”。例如，干旱和/或 鹽度主要表現(xiàn)為滲透脅迫，導(dǎo)致破壞細胞中的穩(wěn)態(tài)和離子分布。氧化脅迫通常與高溫或低 溫、鹽度或干旱脅迫相伴，可以引起功能及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的變性。所以，這些多種多樣的環(huán)境 脅迫通常激活相似的細胞信號傳遞路徑和細胞應(yīng)答，如應(yīng)激蛋白的產(chǎn)生、抗氧化劑的上調(diào)、 相容溶質(zhì)的累積以及生長阻抑。因為多種多樣的環(huán)境脅迫激活相似的路徑，因此本發(fā)明以 干旱脅迫進行的舉例說明不應(yīng)當被看作局限于干旱脅迫，而是應(yīng)該看作為一個篩選，其顯 示了如本文所定義的AHL19/20多肽可以參與在一般的非生物脅迫條件下增加產(chǎn)率相關(guān)性 狀(相對于在相當?shù)拿{迫條件生長的對照植物而言)。因為多種多樣的環(huán)境脅迫激活相似的路徑，因此本發(fā)明以干旱脅迫和鹽脅迫進行 的舉例不應(yīng)當被看作局限于干旱脅迫或鹽脅迫，而是應(yīng)該看作是一個篩選，其顯示了如本 文所定義的GRP多肽可以參與在一般的非生物脅迫條件下增強產(chǎn)率相關(guān)性狀(相對于在相 當?shù)拿{迫條件生長的對照植物而言)。如本文所定義的術(shù)語“非生物脅迫”應(yīng)當理解為表示任何一個或多個下列脅迫水 脅迫(由干旱或過多的水引起的)、缺氧脅迫、鹽脅迫、溫度脅迫(由熱、冷或冰凍溫度引起 的)、化學(xué)毒性脅迫和氧化脅迫。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，非生物脅迫 是滲透脅迫，其選自水 脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。優(yōu)選，水脅迫是干旱脅迫。術(shù)語鹽脅迫不限于食用鹽 (NaCl)，而可以是由NaCl、KC1、LiCl、MgCl2、CaCl2等中的一種或多種引起的任何脅迫。優(yōu)選，非生物脅迫是干旱脅迫。備選地，非生物脅迫是鹽脅迫。在一個實施方案中，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了在非生物脅迫條件下生長時相對于 在相當?shù)拿{迫條件下生長的對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。因此，根據(jù)本 發(fā)明，提供了增強在非生物脅迫條件下生長的植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述方法 包括增加植物中AHL19/20多肽編碼核酸序列的表達。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，非生物脅迫 是滲透脅迫，其選自一個或多個下列脅迫水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。在一個實施方案中，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了在非生物脅迫條件下生長時相對于 在相當?shù)拿{迫條件下生長的對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明， 提供了增強在非生物脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增加植 物中GRP多肽編碼核酸序列的表達。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，非生物脅迫是滲透脅迫，其選 自一個或多個下列脅迫水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。優(yōu)選，非生物脅迫是干旱脅 迫。備選地或另外地，非生物脅迫是鹽脅迫。非生物環(huán)境脅迫的另一實例是植物為生長和發(fā)育需要同化吸收的一種或多種養(yǎng) 分的可利用度減小。由于養(yǎng)分利用效率對植物產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量的強烈影響，有大量化肥傾 倒在田間以優(yōu)化植物生長和品質(zhì)。植物生產(chǎn)力一般受限于三種主要養(yǎng)分磷、鉀和氮，而這 三者中的氮通常是植物生長的限速元素。因此，植物生長所需的主要營養(yǎng)素是氮(N)。氮是 見于活細胞中的眾多重要化合物(包括氨基酸、蛋白質(zhì)(酶)、核酸和葉綠素)的組成成分。 1. 5% -2%的植物干物質(zhì)是氮，約合植物總蛋白質(zhì)的16%。因而，氮可利用度是作物植物生長和產(chǎn)量的主要限制因素(Frink等人(1999)Proc NatlAcad Sci USA 96(4) :1175_1180)， 而且對蛋白質(zhì)累積和氨基酸組成也具有重大影響。因此，在限氮條件下生長時具有增強的 種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的作物植物具有重大意義。
在一個實施方案中，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了在養(yǎng)分可利用度下降的條件下，特 別是在氮可利用度下降的條件下生長時，相對于在相當條件下生長的對照植物，具有增強 的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增強在養(yǎng)分可利用度下降，優(yōu)選氮 可利用度下降的條件下生長的植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增加植物中 AHL19/20多肽編碼核酸序列的表達。養(yǎng)分可利用度下降可以因養(yǎng)分，諸如氮、磷及其他含磷 化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等，缺乏或過量所致。優(yōu)選，養(yǎng)分可利用度下降是氮可利用 度的下降。在一個實施方案中，實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了在養(yǎng)分可利用度下降的條件下，特 別是在氮可利用度下降的條件下，生長時，相對于在相當條件下生長的對照植物，具有增強 的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增強在養(yǎng)分可利用度下降的條件下生長 的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述方法包括增加植物中GRP多肽編碼核酸序列的表達。 養(yǎng)分可利用度下降可包括養(yǎng)分，諸如氮、磷及其他含磷化合物、鉀、鈣、鎘、鎂、錳、鐵和硼等， 的可利用度下降。實施本發(fā)明的方法產(chǎn)生了在非脅迫條件下生長時相對于對照植物具有增加的產(chǎn) 率的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了增加在非脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率的方法，所述 方法包括增加地上植物部分中AAT樣多肽編碼核酸的表達。本發(fā)明包括可由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物或其部分(包括種子)或其細胞。 所述植物或其部分或其細胞含有編碼如上文所定義的產(chǎn)率增加性多肽的核酸轉(zhuǎn)基因，所述 產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其 中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。本發(fā)明還提供遺傳構(gòu)建體和載體，以利于在植物中引入和/或增加表達編 碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白 19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽?？梢詫⒒驑?gòu)建體插入 適于轉(zhuǎn)化進入植物并適于在轉(zhuǎn)化的細胞中表達目的基因的載體中，該載體可以是可商購的 載體。本發(fā)明還提供了如本文所定義的基因構(gòu)建體在本發(fā)明方法中的用途。更具體地，本發(fā)明提供這樣的構(gòu)建體，其含有(a)編碼如上文所定義的產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列，所述產(chǎn)率增加性多肽選自 核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬 硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。(b) 一個或多個能夠增加(a)中核酸序列表達的控制序列；和任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個實施方案中，編碼AHL19/20多肽的核酸序列如上文所定義。術(shù)語“控制序 列”和“終止序列”如本文所定義。優(yōu)選，構(gòu)建體的控制序列之一是從植物基因組分離的組成型啟動子。植物組成型啟動子的實例是G0S2啟動子，優(yōu)選稻G0S2啟動子，更優(yōu)選由SEQ ID NO :35所示的G0S2啟動子。在一個實施方案中，編碼GRP多肽的核酸序列如上文所定義。術(shù)語“控制序列”和 “終止序列”如本文所定義。優(yōu)選，編碼AAT樣多肽或AAT多肽的核酸如上文所定義。術(shù)語“控制序列”和“終 止序列”如本文所定義?？梢允褂煤腥魏紊鲜龊怂嵝蛄械妮d體轉(zhuǎn)化植物。技術(shù)人員充分知曉載體中必須 存在的遺傳元件，以便成功進行轉(zhuǎn)化、選擇并繁殖含目的序列的宿主細胞?？梢詫⒛康男蛄?有效連接于一個或多個控制序列(至少連接于啟動子)。有利地，可以使用任何類型的天然或合成啟動子增加核酸序列的表達。組成型啟 動子，優(yōu)選從植物基因組分離的組成型啟動子，在所述方法中特別有用。植物組成型啟動子 驅(qū)動編碼序列以在所有情況下均低于在35SCaMV病毒啟動子控制下獲得的水平的水平表 達。其他器官特異性啟動子，例如用于在葉、莖、塊莖、分生組織、種子(胚和/或胚乳) 中優(yōu)先表達的器官特異性啟動子，在實施本發(fā)明的方法中是有用的。關(guān)于各種啟動子類型 的定義，敬請參見本文“定義”部分。應(yīng)當清楚本發(fā)明的可實施性并不受限于SEQ ID NO=I所示的AHL19/20多肽編碼 核酸序列，而且本發(fā)明的可實施性也不受限于由組成型啟動子所驅(qū)動的AHL19/20多肽編 碼核酸序列的表達。應(yīng)當清楚本發(fā)明的可實施性并不受限于SEQ ID NO 45所示的GRP多肽編碼核酸 序列，而且本發(fā)明的可實施性也不受限于由組成型啟動子所驅(qū)動的GRP多肽編碼核酸序列 的表達。組成型啟動子優(yōu)選為G0S2啟動子，優(yōu)選來自稻的G0S2啟動子。還優(yōu)選G0S2啟動 子為基本上類似于SEQ ID N0:47的核酸序列，最優(yōu)選G0S2啟動子如SEQ ID N0:47所示。 有關(guān)組成型啟動子的更多實例，敬請參見本文“定義”部分表2。應(yīng)當清楚本發(fā)明的可實施性并不局限于SEQ ID NO :50所示的AAT樣核酸，而且本 發(fā)明的可實施性也不局限于由原葉綠素酸酯還原酶啟動子所驅(qū)動的AAT樣多肽編碼核酸 的表達。有關(guān)各種啟動子類型的定義，敬請參見“定義”部分。特別可用于本發(fā)明方法的是 根特異性啟動子，特別是根表皮特異性啟動子。根特異性啟動子優(yōu)選是硝酸轉(zhuǎn)運蛋白啟動 子，還優(yōu)選來自稻(如由Lin，2000描述的OsNRTl啟動子)。該啟動子由SEQ ID NO :59顯 示。還可將與SEQ ID NO :59基本上相似的核酸序列用于本發(fā)明的方法。還可用于實施本 發(fā)明方法的其他根特異性啟動子的實例示于上述“定義”部分的表2b中。應(yīng)當清楚本發(fā)明的可實施性并不局限于SEQ ID NO :55所示的AAT核酸，而且本發(fā) 明的可實施性也不局限于由稻硝酸轉(zhuǎn)運蛋白啟動子OsNRTl所驅(qū)動的AAT核酸的表達。任選的，還可以在引入植物的構(gòu)建體中使用一個或多個終止子序列。另外的調(diào)控 元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強子。本領(lǐng)域技術(shù)人員會知道適合用于進行本發(fā)明的終止子和 增強子的序列。如“定義”部分所 說明的那樣，也可以向5’非翻譯區(qū)(UTR)或在編碼序列 中加入內(nèi)含子序列，來增加在胞質(zhì)中累積的成熟信使的量。其他控制序列(除啟動子、增強子、沉默子、內(nèi)含子序列、3’ UTR和/或5’ UTR區(qū)域之外)可以是蛋白質(zhì)和/或RNA穩(wěn)定元件。這類序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知或者可以容易地獲得。本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體可以還包括對于在特定細胞類型中維持和/或復(fù)制所必需 的復(fù)制起點序列。一個實例是需要將遺傳構(gòu)建體作為附加型遺傳元件(如質(zhì)粒或粘粒分 子)在細菌細胞中維持的情況。優(yōu)選的復(fù)制起點包括但不限于fl-ori和colEl。為檢測本發(fā)明方法中所用核酸序列的成功轉(zhuǎn)移和/或選擇含有這些核酸序列的 轉(zhuǎn)基因植物，有利的是使用標記基因(或報告基因)。因此，遺傳構(gòu)建體可以任選地含有選 擇標記基因。選擇標記在本文“定義”部分有更詳細的說明。標記基因一旦不再需要，可以從轉(zhuǎn)基因細胞中除去或切除之。進行標記去除的技 術(shù)在本領(lǐng)域公知，有用的技術(shù)在上文“定義”部分有說明。已知，取決于所用的表達載體和所用的轉(zhuǎn)染技術(shù)，當核酸序列向植物細胞進行穩(wěn) 定或瞬時整合時，僅少數(shù)細胞能攝入外來DNA，并將其整合入基因組(如果期望的話)。為 鑒定并選擇這些整合體，通常將編碼可選擇標記(如上文所述的那些)的基因與目的基因 一起引入宿主細胞中。這些標記能夠例如在如下突變體中使用，在所述突變體中這些基因 例如通過常規(guī)方法缺失而沒有功能。此外，編碼可選擇標記的核酸序列分子可以與編碼本 發(fā)明多肽或用于本發(fā)明方法的序列在同一個載體中引入宿主細胞，或者在分開的載體中引 入。已由所引入的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以例如通過選擇(例如，整合有可選擇標記 的細胞存活而其他細胞死去)予以鑒定。標記基因一旦不再需要，可以從轉(zhuǎn)基因細胞中除 去或切除之。進行標記去除的技術(shù)在本領(lǐng)域公知，有用的技術(shù)在上文“定義”部分有說明。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相 關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達編碼如前文所定義的AHL19/20多 肽的任何核酸序列。更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生相對于對照植物具有增加的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn) 基因植物的方法，所述方法包括(i)在植物、植物部分或植物細胞中引入和表達在植物組成型啟動子控制下的 AHL19/20多肽編碼核酸序列；和(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞、植物部分或植物。(i)中的核酸序列可以是任何能夠編碼如本文所述的AHL19/20多肽的核酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生在非生物脅迫條件下生長時相對于對照 植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在植物中引入和表達任何編碼如 前文所定義的GRP多肽的核酸序列。更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生在非生物脅迫條件下生長時相對于對照植物具有增 強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括1.在植物、植物部分或植物細胞中引入和表達GRP多肽編碼核酸序列；和2.在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物、植物部分或植物細胞。(1)中的核酸序列可以是任何能夠編碼如本文所述的GRP多肽的核酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性 狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在地上植物部分中引入和表達任何編碼如前文所定義的AAT 樣多肽的核酸。
更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所 述方法包括(i)在地上植物部分或在植物細胞中引入和表達在于地上植物部分中具有活性的 啟動子的控制下的AAT樣核酸；和(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細胞。(i)中的核酸可以是任何如本文所述的ATT樣核酸。更具體地，本發(fā)明提供了產(chǎn)生具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀，特別是增加的(種子)產(chǎn) 率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括
(i)在植物或植物細胞中引入和表達AAT核酸；和(ii)在非限氮條件下培養(yǎng)植物細胞。(i)中的核酸可以是任何能夠編碼本文所定義的AAT多肽的核酸?？梢詫⒑怂嵝蛄兄苯右胫参锛毎蛑参锉旧?包括引入組織、器官或植物的任 何其它部分)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方面，優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化將核酸序列引入植物。術(shù)語“轉(zhuǎn)化” 在本文“定義”部分有更詳細的說明。遺傳修飾的植物細胞可以通過技術(shù)人員熟悉的所有方法再生。合適的方法可見于 上述 S. D. Kung 和 R. Wu、Potrykus 或者HSfgei^P Willmitzer 的出版物。通常在轉(zhuǎn)化以后，選出存在一個或多個標記的植物細胞或細胞群，所述標記由與 目的基因共轉(zhuǎn)移的植物可表達基因編碼，繼之將轉(zhuǎn)化的材料再生成整個植物。為選擇轉(zhuǎn)化 的植物，通常將在轉(zhuǎn)化過程中獲得的植物材料置于選擇性條件下，從而可將轉(zhuǎn)化的植物與 非轉(zhuǎn)化植物區(qū)分開來。例如，可以種植以上述方式獲得的種子，并在最初的生長期之后，通 過噴霧對其進行合適的選擇。另一可能方案是將種子，酌情在消毒之后，種在使用合適的選 擇劑的瓊脂板上，從而僅轉(zhuǎn)化的種子能夠長成植物。可選地，針對轉(zhuǎn)化的植物篩選選擇標記 如上文所述標記的存在。DNA轉(zhuǎn)移和再生之后，還可評價推定轉(zhuǎn)化的植物，例如用Southern分析(DNA印 跡)，評價目的基因的存在、拷貝數(shù)和/或基因組構(gòu)造?？蛇x的或額外地，可用Northern和 /或Western分析(蛋白質(zhì)印跡)監(jiān)測新引入的DNA的表達水平，這兩種技術(shù)都是本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員所熟知的。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物可以通過多種方式繁殖，如通過克隆繁殖或經(jīng)典的育種技術(shù)。例 如，第一代(或Tl)轉(zhuǎn)化的植物可自交，選擇純合的第二代(或T2)轉(zhuǎn)化體，然后T2植物可 進一步通過經(jīng)典育種技術(shù)繁殖。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生物體可以有多種形式。例如，它們可以是轉(zhuǎn) 化細胞和非轉(zhuǎn)化細胞的嵌合體；克隆轉(zhuǎn)化體(例如所有細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化含有表達盒)；轉(zhuǎn)化和非 轉(zhuǎn)化組織的嫁接體(例如在植物中，轉(zhuǎn)化的砧木嫁接到非轉(zhuǎn)化的接穗上)。本發(fā)明顯然延及由本文所述方法產(chǎn)生的任何植物細胞或植物，以及所有的植物部 分及繁殖體。本發(fā)明還延及由任何上述方法產(chǎn)生的原代轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞、組織、器官或整 個植物的后代，唯一的要求是所述后代呈現(xiàn)出與在本發(fā)明方法中產(chǎn)生的親本相同的基因型 和/或表型特征。在一個實施方案中，本發(fā)明也包括含有與植物組成型啟動子有效連接的、編碼上 文所定義的AHL19/20多肽的分離核酸序列的宿主細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明也包括含有編碼上文所定義的GRP多肽的分離核酸序列的宿主細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明也包括含有編碼上文所定義的AAT樣多肽或AAT多肽 的分離核酸的宿主細胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細胞是植物細胞。對于用于本發(fā)明方法的核酸或載體、表 達盒或構(gòu)建體或載體，其宿主植物原則上有利地為能夠合成在本發(fā)明方法中使用的多肽的 所有植物。本發(fā)明的方法有利地適用于任何植物。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括屬于 植物界超家族的所有植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括飼料或豆科牧草、觀賞植 物、糧食作物、喬木或灌木。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，植物為作物植物。作物植物的實 例包括大豆、向日葵、蕓苔(canola)、苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、馬鈴薯和煙草。還優(yōu)選植物是單子葉植物。單子葉植物的實例包括甘蔗。更優(yōu)選植物是谷類。谷類的實例包括稻、玉 米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱和燕麥。本發(fā)明也延及含有與植物組成型啟動子有效連接的編碼AHL19/20(如上文所定 義的)的分離核酸序列的植物的可收獲部分，例如但不限于種子、葉、果實、花、莖、根莖、 塊莖和球莖。本發(fā)明還涉及由這樣的植物的可收獲部分衍生的、優(yōu)選直接衍生的產(chǎn)品，如干 丸(pellet)或干粉、油類、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白質(zhì)。增加核酸序列或基因或基因產(chǎn)物表達的方法在本領(lǐng)域有充分的記錄，并且實例在 “定義”部分提供。如上文所述，增加AHL19/20多肽編碼核酸序列表達的優(yōu)選方法是在植物中引入 和表達AHL19/20多肽編碼核酸序列；然而，實施所述方法的效果，即增強種子產(chǎn)率相關(guān)性 狀，也可以利用其他眾所周知的技術(shù)實現(xiàn)，包括但不限于T-DNA激活標簽、TILLING、同源 重組。這些技術(shù)的說明在“定義”部分提供。如上文所述，增加GRP多肽編碼核酸序列表達的優(yōu)選方法是在植物中引入和表 達GRP多肽編碼核酸序列；然而，實施所述方法的效果，即增強在非生物脅迫條件下生長的 植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀，也可以利用其他眾所周知的技術(shù)實現(xiàn)，包括但不限于T-DNA激活標 簽、TILLING、同源重組現(xiàn)。這些技術(shù)的說明在“定義”部分提供。如上文所述，調(diào)節(jié)(優(yōu)選，增加)AAT樣多肽或AAT多肽編碼核酸的表達的優(yōu)選方 法是在植物中引入和表達編碼AAT樣多肽或AAT多肽的核酸；然而，實施所述方法的效果， 即增強產(chǎn)率相關(guān)性狀，也可以利用其他眾所周知的技術(shù)實現(xiàn)，包括但不限于=T-DNA激活標 簽、TILLING、同源重組現(xiàn)。這些技術(shù)的說明在“定義”部分提供。本發(fā)明還包括編碼如本文所述的AHL19/20多肽的核酸序列的用途以及這些 AHL19/20多肽的用途，用于在正常生長條件下和養(yǎng)分可利用度下降的條件下，優(yōu)選氮可利 用度下降的條件下，增強植物的任何上述種子產(chǎn)率相關(guān)性狀。本發(fā)明還包括編碼如本文所述的GRP多肽的核酸序列的用途以及這些GRP多肽的 用途，用于增強在非生物脅迫條件下生長的植物的任何上述產(chǎn)率相關(guān)性狀。本發(fā)明還包括編碼如本文所述的AAT樣多肽或AAT多肽的核酸的用途以及這些 AAT樣多肽或AAT多肽的用途，用于增強植物的任何上述產(chǎn)率相關(guān)性狀?？梢栽谟N程序中使用編碼本文所述產(chǎn)率增加性多肽的核酸或所述產(chǎn)率增加性 多肽本身，其中鑒定可能與產(chǎn)率增加性多肽編碼基因遺傳連鎖的DNA標記?？梢允褂盟龊怂?基因或所述AAT樣多肽本身定義分子標記。接著可以將此DNA或蛋白質(zhì)標記在育種 程序中使用，以在本發(fā)明的方法中選擇具有如上文所定義的增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。產(chǎn)率增加性多肽編碼核酸/基因的等位基因變體也可以用于標記輔助的育種程序。這類育種程序有時需要使用例如EMS誘變，通過植物誘變處理引入等位基因變異；可選 的，此類程序可以以一組無意產(chǎn)生的所謂“天然”起源的等位基因變體開始。然后通過例如 PCR進行等位基因變體的鑒定。隨后是選擇步驟，用以選擇所討論序列的、提供增加的產(chǎn)率 的、優(yōu)良等位基因變體。一般通過監(jiān)測含有所討論序列的不同等位基因變體的植物的生長 行為來進行選擇?？梢栽跍厥一蛱锏刂斜O(jiān)測生長行為。其它任選的步驟包括將經(jīng)鑒定含有 優(yōu)良等位基因變體的植物與另一植物雜交。例如，可使用這種方法產(chǎn)生感興趣表型特征的 組合。產(chǎn)率增加性多肽編碼核酸還可以作為探針，用于對包含其的基因進行遺傳和物 理作圖以及用作與那些基因連鎖的性狀的標志物。這樣的信息可以在植物育種中使用， 以培育具有所期望表型的株系。產(chǎn)率增加性多肽編碼核酸的這類應(yīng)用僅需要長度至少15 個核苷酸的核酸序列。產(chǎn)率增加性多肽編碼核酸可以用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP) 標記。可用AAT樣核酸探測限制酶切消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Sambrook J, Fritsch EF和Maniatis T(1989)《分子克隆實驗室手冊》)。隨后使用計算機程序 如MapMaker (Lander等(1987)Genomics 1 :174_181)對產(chǎn)生的帶型進行遺傳分析，以構(gòu) 建遺傳圖譜。另外，可以使用核酸探測含有一組個體的限制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA 的Southern印跡，所述一組個體為一個確定的遺傳雜交的親本和子代。記錄DNA多態(tài)性 的分離，并用于計算產(chǎn)率增加性多肽編碼核酸在先前用此群體獲得的遺傳圖譜中的位置 (Botstein 等(1980)Am. J. Hum. Genet. 32 :314_331)。用于遺傳作圖的植物基因衍生探針的產(chǎn)生和應(yīng)用描述于Bematzky和 Tanksley(1986)Plant Mol. Biol. Reporter 4:37-41中。眾多出版物中描述過用上述方法 或其變通形式對特定cDNA克隆的遺傳作圖。例如，可以使用F2雜交群體、回交群體、隨機 交配群體、近等基因系和其它個體組作圖。這類方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。核酸序列探針也可以用來進行物理作圖(即在物理圖譜上安置序列；參見 Hoheisel 等 In Noη-mamma1ian Genomic Analysis :A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346頁，及其中引用的參考文獻)。在另一個實施方案中，核酸序列探針可用于進行直接熒光原位雜交(FISH)作圖 (Trask(1991) Trends Genet. 7 :149_154)。盡管目前FISH作圖的方法傾向使用大的克隆 (幾個kb到幾百個kb ；參見Laan等(1995) GenomeRes. 5 13-20)，但是靈敏性的提高可以 允許在FISH作圖中應(yīng)用較短的探針。用于遺傳和物理作圖的多種基于核酸序列擴增的方法可以使用所述核酸序列進 行。實例包括等位基因特異性擴增(Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11 :95_96)、PCR擴 增片段的多態(tài)性(CAPS ；Sheffield等(1993) Genomics 16 :325_332)、等位基因特異性連接 (Landegren 等(1988) Science241 :1077_1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov (1990)Nucleic Acid Res. 18 3671)、放射雜交作圖(Walter 等(1997) Nat. Genet. 7 22~28)和 Happy 作圖 (Dear 和 Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17 :6795_6807)。為實施這些方法，使用核酸序列 設(shè)計和產(chǎn)生用于擴增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)的引物對。這類引物的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。采用基于PCR的遺傳作圖的方法中，可能需要鑒定用于作圖雜交的親本之間在 相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列的區(qū)域中的DNA序列差異。但是，通常這對作圖方法不是必要的。根據(jù)本發(fā)明的方法得到如前文所述具有增加的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。這些性 狀還可以組合其它經(jīng)濟上有利的性狀，如其它產(chǎn)率增加性狀、對其他非生物和生物脅迫的 耐受性、改變多種構(gòu)造特征和/或生物化學(xué)和/或生理學(xué)特征的性狀。根據(jù)本發(fā)明的方法得到如前文所述在非生物脅迫條件下生長時具有增強的產(chǎn)率 相關(guān)性狀的植物。這些性狀還可以組合其它經(jīng)濟上有利的性狀，如其它產(chǎn)率增強性狀、對其 他非生物和生物脅迫的耐受性、改變多種構(gòu)造特征和/或生物化學(xué)和/或生理學(xué)特征的性 狀。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及概述如下的主題 第1項相對于對照植物增強植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括增加植物中 編碼核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)多肽的核酸序列的表達，該AHL19/20多肽 包含與SEQ ID NO :36所示保守結(jié)構(gòu)域(CD)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、 98%、99%或更大氨基酸序列同一性的結(jié)構(gòu)域，以及任選地選擇具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān) 性狀的植物。第2項根據(jù)第1項的方法，其中所述AHL19/20多肽包含i)與SEQ IDNO :37所示 AT-hook基序具有至少75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更大的氨基酸序列同一 性的基序；和(ii)與SEQ ID NO :38所示植物及原核生物保守(PPC)結(jié)構(gòu)域具有至少55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更大的氨基酸序列同一性的結(jié) 構(gòu)域。第3項根據(jù)第1或2項的方法，其中所述AHL19/20多肽包含⑴核定位信號； (ii)具有 InterPro 登錄號 IPR014476 的 AT-hook DNA 結(jié)合基序；和(iii)具有 InterPro 登錄號IPR005175的植物及原核生物保守(PPC)結(jié)構(gòu)域。第4項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述AHL19/20多肽，當用于構(gòu)建AHL系 統(tǒng)發(fā)生樹，例如圖1或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ IDNO 2所示多肽序列的 AHL19/20多肽群而非任何其他AHL群聚類。第5項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述AHL19/20多肽按照遞增的優(yōu)選順序 與SEQ ID NO 2所示的AHL19/20多肽、或本文表A中所示的任何多肽序列具有至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高的氨基酸序列同一性。第6項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述編碼AHL19/20多肽的核酸序列為表A 中所示的任一 SEQ ID NO核酸序列或其部分、或能夠與表A中所示的任一 SEQ ID NO核酸 序列雜交的序列。第7項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述核酸序列編碼表A中所示的任何SEQ ID NO多肽序列的直系同源物或旁系同源物。第8項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述增加的表達通過任何一個或多個下列 技術(shù)實現(xiàn)=T-DNA激活標簽、TILLING、或同源重組。第9項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述增加的表達通過在植物中引入和表達 編碼AHL19/20多肽的核酸序列來實現(xiàn)。
第10項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多 個下列性狀(i)增加的每圓錐花序的花數(shù)；(ii)增加的每植物的種子總重量；(iii)增加 的飽滿種子數(shù)；或(iv)增加的收獲指數(shù)。第11項根據(jù)任何前述項的方法，其中相對于對照植物，所述增強的種子產(chǎn)率相 關(guān)性狀發(fā)生在于養(yǎng)分可利用度下降的條件下，優(yōu)選在氮可利用度下降的條件下生長的植物 中。第12項根據(jù)第11項的方法，其中所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多個下 列性狀(i)增加的每植物的種子總產(chǎn)率；(ii)增加的飽滿種子數(shù)；或(iii)增加的收獲指數(shù)。第13項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述核酸序列與組成型啟動子，優(yōu)選與植 物組成型啟動子，更優(yōu)選與G0S2啟動子，最優(yōu)選與SEQ ID NO :35所示的稻G0S2啟動子有 效連接。第14項根據(jù)任何前述項的方法，其中所述編碼AHL19/20多肽的核酸序列是植物 來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，還優(yōu)選來自十字花科，最優(yōu)選來自擬南芥。第15項可通過任何前述項的方法獲得的植物、其部分(包括種子)或植物細胞， 其中所述植物、其部分或細胞包含與植物組成型啟動子有效連接的編碼AHL19/20多肽的 分離核酸轉(zhuǎn)基因。第16項構(gòu)建體，包含(a)編碼第1至5項的任一項中所定義的AHLigAO多肽的核酸序列；(b) 一個或多個能夠驅(qū)動(a)中的核酸序列表達的控制序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。第17項根據(jù)第16項的構(gòu)建體，其中所述控制序列是植物組成型啟動子，優(yōu)選 G0S2啟動子，更優(yōu)選SEQ ID NO :35所示的G0S2啟動子。第18項根據(jù)第16或17項的構(gòu)建體在產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率 相關(guān)性狀的植物的方法中的用途，所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多個下列性狀 (i)增加的每圓錐花序的花數(shù)；(ii)增加的每植物的種子總重量；(iii)增加的飽滿種子 數(shù)；或(iv)增加的收獲指數(shù)。第19項用根據(jù)第16或17項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。第20項產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方 法，包括(i)在植物、植物部分或植物細胞中引入和表 達處于植物組成型啟動子控制之下 的編碼第1至6之任一項中定義的AHL19/20多肽的核酸序列；和(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細胞、植物部分或植物。第21項由于與植物組成型啟動子有效連接的編碼第1至5項之任一項中定義的 AHL19/20多肽的核酸序列的表達增加而相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的 轉(zhuǎn)基因植物、或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物部分。第22項根據(jù)第15、19或21項的轉(zhuǎn)基因植物或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因 植物細胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑 麥、黑小麥、高粱和燕麥。
第23項根據(jù)第22項的植物的包含AHL19/20多肽編碼核酸序列的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。第24項來源于根據(jù)第22項的植物和/或來源于根據(jù)第23項的植物的可收獲部 分的產(chǎn)品。第25項編碼第1至6之任一項中所定義的AHL19/20多肽的核酸序列在增強種 子產(chǎn)率相關(guān)性狀中的用途，所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀包括一個或多個下列性狀i)增 加的每圓錐花序的花數(shù)；(ii)增加的每植物的種子總重量；(iii)增加的飽滿種子數(shù)；或 (iv)增加的收獲指數(shù)。第26項根據(jù)第25項的用途，其中所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀在養(yǎng)分可利用度 下降的條件下，優(yōu)選在氮可利用度下降的條件下發(fā)生。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及概述如下的主題第27項相對于對照植物增強在非生物脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀 的方法，包括增加植物中編碼GRP多肽的核酸序列的表達，其中所述GRP多肽是SEQ ID NO 46所示的金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽或其直系同源物、旁系同源物或同源物，以及任選地選 擇在非生物脅迫條件下生長時具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。第28項根據(jù)第27項的方法，其中所述SEQ ID NO 46所示的GRP多肽和其直系 同源物、旁系同源物或同源物具有InterPro登錄號IPR000347，被描述為植物金屬硫蛋白 家族15。第29項根據(jù)第27或28項的方法，其中所述GRP多肽按照遞增的優(yōu)選順序與SEQ ID NO 46 所示的 GRP 多肽具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%,98%,99%或更高的氨基酸序列同一性。第30項根據(jù)前述第27至29之任一項的方法，其中所述編碼GRP多肽的核酸序 列為SEQ ID NO 45的核酸序列或其部分、或能夠與SEQ ID NO 45的核酸序列或其部分雜 交的序列。第31項根據(jù)前述第27至30之任一項的方法，其中所述增加的表達通在植物中 引入和表達編碼所述GRP多肽的核酸序列來實現(xiàn)。第32項根據(jù)前述第27至31之任一項的方法，其中所述非生物脅迫是選自一個 或多個下列脅迫的滲透脅迫水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。第33項根據(jù)第32項的方法，其中所述水脅迫是干旱脅迫。第34項根據(jù)第32項的方法，其中所述離子脅迫是鹽脅迫。第35項根據(jù)前述第27至34之任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀是 一個或多個下列性狀相對于對照植物，增加的地上生物量、增加的每植物的種子總產(chǎn)率、 增加的飽滿種子數(shù)、增加的飽滿種子總數(shù)、增加的一級圓錐花序數(shù)和增加的種子飽滿率。第36項根據(jù)前述第27至35之任一項的方法，其中所述核酸序列與組成型啟動 子，優(yōu)選與G0S2啟動子，最優(yōu)選與稻G0S2啟動子有效連接。第37項根據(jù)前述第27至36之任一項的方法，其中所述編碼GRP多肽的核酸序 列是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，還優(yōu)選來自十字花科，最優(yōu)選來自擬南芥。第38項GRP多肽編碼核酸序列在增強在非生物脅迫條件下生長的植物的產(chǎn)率相 關(guān)性狀中的用途。
第39項根據(jù)第38項的編碼GRP多肽的核酸序列的用途，其中所述增強的產(chǎn)率相 關(guān)性狀選自一個或多個下列性狀與對照植物相比，增加的地上生物量、增加的每植物的種 子總產(chǎn)率、增加的飽滿種子數(shù)、增加的飽滿種子總數(shù)、增加的一級圓錐花序數(shù)和增加的種子 飽滿率。第40項根據(jù)第39項的編碼GRP多肽的核酸序列的用途，其中所述非生物脅迫是 選自一個或多個下列脅迫的滲透脅迫水脅迫、鹽脅迫、氧化脅迫和離子脅迫。
第41項根據(jù)第40項的編碼GRP多肽的核酸序列的用途，所述水脅迫是干旱脅 迫。 第42項根據(jù)第40項的編碼GRP多肽的核酸序列的用途，所述離子脅迫是鹽脅 迫。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及概述如下的主題第43項相對于對照植物增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)地上植物部 分中編碼丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽的核酸的表達。第44項根據(jù)第43項的方法，其中所述AAT樣多肽包括一個或多個下列特征(i)催化下列反應(yīng)的能力 (ii)屬于酶分類編號=EC 2. 6. 1. 2.(iii)具有氨基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(在InterPro中稱為IPR004839 ；以及在PFAM中稱 為 PF00155)(iv)具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶結(jié)構(gòu)域(在InterPro中稱為IPROOl 176)(ν)靶向線粒體(vi)當用于構(gòu)建包含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO :51的AAT樣 多肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類。第45項根據(jù)第43或44項的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達通過在植物中引入和表達 處于在地上植物部分中具有活性的啟動子控制之下的AAT樣多肽編碼核酸來實現(xiàn)。第46項根據(jù)前述第43至45之任一項的方法，其中所述AAT樣多肽編碼核酸能 夠與SEQ ID NO 50所示的核酸雜交。第47項根據(jù)前述第43至46之任一項的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO 51所示蛋白質(zhì)的直系同源物或旁系同源物。第48項根據(jù)前述第43至47之任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀包 括與對照植物相比，增加的產(chǎn)率，優(yōu)選增加的種子產(chǎn)率。第49項根據(jù)前述第43至48之任一項的方法，其中在非脅迫條件下獲得所述增 強的產(chǎn)率相關(guān)性狀。第50項根據(jù)第45至49之任一項的方法，其中所述在地上部分中具有活性的啟 動子是枝條特異性和/或葉特異性啟動子。第51項根據(jù)第43至50之任一項的方法，其中所述AAT樣多肽編碼核酸是藻類 來源的，優(yōu)選來自衣藻屬，還優(yōu)選來自物種雷氏衣藻。第52項可通過前述第43至51之任一項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼AAT樣多肽的重組核酸。第53項構(gòu)建體，包含(a)編碼第44、46或47項之任一中定義的AAT樣多肽的核酸；(b)能夠驅(qū)動(a)中的核酸序列在地上部分中表達的啟動子序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。第54項根據(jù)第53項的構(gòu)建體在用于產(chǎn)生相對于對照植物具有增加的產(chǎn)率，特別地增加的種子產(chǎn)率的植物的方法中的用途。第55項用根據(jù)第53項的購建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。.第56項產(chǎn)生與對照植物相比具有增加的產(chǎn)率，特別地增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因 植物的方法，包括(i)在植物中引入和表達編碼第44、46或47之任一項中所定義的AAT樣多肽的核 酸，該核酸處于在地上部分中具有活性的啟動子的控制之下；和(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細胞。第57項由于編碼第44、46或47之任一項中定義的AAT樣多肽的核酸的表達增 加而與對照植物相比具有增加的產(chǎn)率，特別是增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物、或源自所述 轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述核酸處于在地上部分中具有活性的啟動子的控制 之下。第58項根據(jù)第52、55或57項的轉(zhuǎn)基因植物或源自其的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其 中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥 (triticale)、高粱和燕麥。第59項根據(jù)第58項的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分是種子。第60項來源于根據(jù)第58項的植物和/或來源于根據(jù)第59項的植物的可收獲部 分的產(chǎn)品。第61項AAT樣多肽編碼核酸用于相對于對照植物增加植物的產(chǎn)率，特別是增加 種子產(chǎn)率的用途，其中該核酸處于在地上部分中具有活性的啟動子的控制之下。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及概述如下的主題第62項相對于對照植物增強植物的產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)植物中編碼 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)的核酸的表達，該植物在氮可利用度未限制的條件下生長。第63項根據(jù)第62項的方法，其中所述AAT樣多肽包含一個或多個下列特征(i)催化下列反應(yīng)的能力 (ii)屬于酶分類編號=EC 2. 6. 1. 2.(iii)具有氨基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(在InterPro中稱為IPR004839 ；以及在PFAM中稱 為 PF00155)(iv)具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶結(jié)構(gòu)域(在InterPro中稱為IPR001176)(ν)當用于構(gòu)建包含AAT序列的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ ID NO 56的AAT樣多 肽群而非任何其他AAT或AAT樣序列群聚類。第64項根據(jù)第62或63項的方法，其中所述調(diào)節(jié)表達通過在植物中引入和表達編碼AAT樣多肽的核酸來實現(xiàn)。第65項根據(jù)前述第62至64之任一項的方法，其中所述AAT樣多肽編碼核酸能 夠與SEQ ID NO 55所示的核酸雜交。第66項根據(jù)前述第62至65之任一項的方法，其中所述核酸序列編碼SEQ ID NO 56所示蛋白質(zhì)的直系同源物或旁系同源物。第67項根據(jù)前述第62至66之任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀包 括與對照植物相比，增加的產(chǎn)率，優(yōu)選增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率。第68項根據(jù)第64至67之任一項的方法，其中所述核酸與組織特異性啟動子，優(yōu)選根特異性啟動子，最優(yōu)選根_表皮-特異性啟動子有效連接。第69項根據(jù)第68項的方法，其中所述根_表皮-特異性啟動子是硝酸轉(zhuǎn)運蛋白啟動子，優(yōu)選來自稻。第70項根據(jù)前述第62至69之任一項的方法，其中所述AAT編碼核酸是植物來 源的，優(yōu)選來自單子葉植物，優(yōu)選來自禾本科，更優(yōu)選來自稻屬，最優(yōu)選來自稻。第71項可通過根據(jù)前述第62至70之任一項的方法獲得的植物或其部分，包括 種子，其中所述植物或其部分包含編碼AAT的重組核酸。第72項構(gòu)建體，包括(a)編碼第63項中所定義的AAT的核酸；(b)硝酸轉(zhuǎn)運蛋白啟動子，優(yōu)選來自稻；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。第73項根據(jù)第72項的構(gòu)建體的用途，其用于產(chǎn)生相對于對照植物在非限氮條件 下具有增加的產(chǎn)率，特別是增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率，的植物的方法。第74項用根據(jù)第71項的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。第75項產(chǎn)生與對照植物相比在非限氮條件下具有增加的產(chǎn)率，特別地增加的生 物量和/或增加的種子產(chǎn)率的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(i)在植物中引入和表達編碼第63項中所定義的AAT的核酸；和(ii)在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細胞。第76項由于編碼第63項中所定義的AAT的核酸的表達增加而與對照植物相比 在非限氮條件下具有增加的產(chǎn)率，特別地增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)率，的轉(zhuǎn)基因 植物、或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞。第77項根據(jù)第71、74或76項的轉(zhuǎn)基因植物或源自其的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所 述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱 和燕麥。第78項根據(jù)第77項的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選是枝條生物
量和/或種子。第79項來源于根據(jù)第77項的植物和/或來源于根據(jù)第78項的植物的可收獲部 分的產(chǎn)品。第80項AAT編碼核酸用于相對于對照植物增加在非限氮條件下植物的產(chǎn)率，特 別地增加種子產(chǎn)率和/或枝條生物量，的用途。


現(xiàn)參考以下附圖描述本發(fā)明，其中圖1顯示在使用漸進式比對Clustal算法(1. 83)，利用默認值對屬于AHL家族的 所有多肽(描述于Fujimoto等，(2004)Plant Molec Biol, 56 225-239)進行比對后構(gòu)建 的鄰接樹(neighbour-joining tree)。包含兩個擬南芥旁系同源物，即AHL19 (SEQ ID NO: 2 或 AT3G04570)和 AHL20 (SEQ ID NO 4 或 AT4G14465)，的目的群已被圈出。圖2顯示在使用漸進式比對Clustal算法(1. 83)，利用默認值對屬于AHL家族的 所有多肽(描述在Fujimoto等，(2004)Plant Molec Biol, 56 :225_239中)以及本文實施 例1表A的所有AHL19/20直系同源物和旁系同源物進行比對后構(gòu)建的鄰接樹。圖3以卡通形式顯示SEQ ID NO 2所示的AHL19/20多肽，其包含下列特征預(yù)測 的NLS、AT-hook DNA結(jié)合基序(其核心是三肽GRP ；包含于InterPro登錄號IPR014476(預(yù) 測的AT-hook DNA-結(jié)合)中)、PPC結(jié)構(gòu)域(植物及原核生物保守結(jié)構(gòu)域；包含于InterPro 登錄號IPR005175(未知功能蛋白質(zhì)DUF296)中)、和包含AT-hook DNA結(jié)合基序和PPC結(jié) 構(gòu)域的保守結(jié)構(gòu)域(CD)。圖4顯示表A的AHLWAO多肽的保守結(jié)構(gòu)域(如對于SEQ ID NO 2由SEQ ID N0:38顯示)的CLUSTAL W(1 ；83)多重序列比對，其中鑒定了多個特征。從多肽的N端至C 端，它們是⑴預(yù)測的核定位信號(NLS) ； (ii) AT-hook DNA結(jié)合基序，具有核心三肽GRP; 禾口(iii)PPC 結(jié)構(gòu)域(DUF296)。圖5顯示雙元載體(binary vector)，其用于稻中于稻G0S2啟動子(pG0S2)控制 之下的AHL19/20多肽編碼核酸序列的增加表達。圖6詳述了可用于實施本發(fā)明方法的序列的實例。圖7顯示雙元載體，其用于稻中處于稻G0S2啟動子控制之下的GRP編碼核酸序列 (其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)(pG0S2: :GRP)的增加表達。圖8詳述了可用于實施本發(fā)明方法的序列的實例。圖9顯示了雙元載體，其用于稻中處于稻的原葉綠素酸酯啟動子控制之下的AAT 樣核酸的增加表達。圖10詳述了可用于實施本發(fā)明方法的序列的實例。圖11顯示雙元載體，其用于稻中處于稻OsNRTl啟動子控制之下的AAT核酸的增 加表達。圖12詳述了可用于實施本發(fā)明方法的序列的實例。 實施例現(xiàn)參考以下實施例描述本發(fā)明，所述實施例僅意在舉例說明。如下實施例并非旨 在完全界定或以其他方式限制本發(fā)明的范圍。DNA操作除非另外說明，重組DNA技術(shù)根據(jù)描述于(Sambrook(2001)《分子克隆 實驗室手冊》，第三版，冷泉港實驗室出版，冷泉港，紐約)或者Ausubel等(1994)，CUrrent Protocols in Molecular Biology, CurrentProtocols 第一卷禾口第二卷的標準方法進 行。植物分子操作的標準材料和方法由R.D.D. Croy描述于 Plant Molecular Biology Labfase(1993),由 BIOSScientific Publications Ltd(UK)和 Blackwell ScientificPublications(UK)出版。實施例1 與本發(fā)明方法所用核酸序列相關(guān)的序列的鑒定利用數(shù)據(jù)庫序列搜索工具，如基本局部比對工具(BLAST) (Altschul等(1990)J. Mol. Biol. 215 :403-410 ；和 Altschul 等(1997) Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402)，在 美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)Entrez核苷酸數(shù)據(jù)庫維護的序列中，鑒定了與本發(fā)明 方法所用的核酸序列相關(guān)的序列(全長cDNA、EST或基因組序列)。BLAST程序通過將核酸 序列或多肽序列與序列數(shù)據(jù)庫進行比較，以及通過計算匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性，用于尋找序 列之間具有局部相似性的區(qū)域。例如，對本發(fā)明核酸序列所編碼的多肽運用了 TBLASTN算 法，使用默認設(shè)置，開啟過濾器以濾過低復(fù)雜度序列。分析的輸出視窗為兩兩比較，并根據(jù) 概率分值(E值)排序，其中分值反映特定比對偶然發(fā)生的概率(E值越低，命中事件的顯著 性越高)。除了 E值之外，還對比較進行了同一性百分比記分。同一性百分比是指兩比較核 酸(或多肽)序列之間在特定長度上的相同核苷酸(或氨基酸)數(shù)。在有些情況下，可以 調(diào)整默認參數(shù)以更改搜索的嚴格度。例如，可以增加E值以顯示嚴格度較低的匹配。以此 方式，可鑒定短的幾乎精確的匹配。表A提供了與本發(fā)明方法所用的核酸序列相關(guān)的核酸序列的列表。表A :AHL19/20多肽的實例
Genome Institute，針對特定生物例如白楊和Ostreococcus tauri，建立了專門的核酸序 列數(shù)據(jù)庫。實施例2 本發(fā)明多肽序列的比對使用基于流行的漸進式比對ClustalW算法(Thompson等(1997) Nucleic Acids Res 25 4876-4882 ；Chenna 等(2003) Nucleic Acids Res31 :3497_3500)的 Vector NTI 軟 件包(Invitrogen)AlignX程序，實施多肽序列的比對。默認值為空位開放罰分10，空位延 伸罰分0.1，而選擇的權(quán)重矩陣為Blosum 62(如果比對多肽的話)?？梢赃M行微小的人造 編輯以進一步優(yōu)化比對。利用Vector NTI (Invitrogen)的AlignX程序中提供的鄰接聚類 算法，構(gòu)建多肽的系統(tǒng)發(fā)生樹。使用漸進式比對Clustal算法(1. 83)，利用默認值(Thompson等，(1997)Nucleic Acids Res 25 4876-4882 ；Chenna等，(2003). Nucleic Acids Res31 3497-3500)，對Fujimoto等(2004 ； 下面表Al)中鑒定的所有擬南芥A^多肽序列進行了比對。然后構(gòu)建了鄰接樹，并且示于本 申請的圖1中。包含兩個擬南芥旁系同源物，Am.l9(SEQ ID NO :2或AT3G04570)和AM^iKSEQ ID N0:4或AT4G14465)，的目的群已被圈出。(在上文所述的新多重序列比對步驟后)落在該 ΑΙΙΘΛΟ群中的任何多肽被認為可用于實施如本文所述的本發(fā)明方法。表Al 在擬南芥中鑒定的AHL多肽 進行了第二多重序列比對，包括表A中的所有AHL19/20直系同源物多肽和表Al 中的所有AHL序列。之后構(gòu)建鄰接樹，并且示于本申請的圖2中。包含兩個擬南芥旁系同 源物，AHL19(SEQ ID NO :2 或 AT3G04570)和 AHL20 (SEQ ID NO :4 或 AT4G14465)，的目的群 已被圈出。落在該AHL19/20群中的任何多肽被認為可用于實施如本文所述的本發(fā)明方法。在表A的AHL19/20多肽的多重序列比對后鑒定了 SEQ ID NO 36所示的SEQ ID NO :2的保守結(jié)構(gòu)域(⑶)。在第二步驟中，使用漸進式比對Clustal算法(1.83)，利用默認值，選擇(從全長多肽序列中)和比對了表A的AHL19/20多肽的CD。許多特征可被鑒定，并且標示于圖4中。從多肽的N端至C端，它們是⑴預(yù)測的核定位信號(NLS) ； (ii) AT-hookDNA結(jié)合基序，具有核心三肽GRP ；和(iii)PPC結(jié)構(gòu)域(DUF 296)。利用Vector NTI (Invitrogen)的AlignX程序中提供的鄰接聚類算法，構(gòu)建AAT 樣多肽和AAT多肽的系統(tǒng)發(fā)生樹。實施例3 可用于實施本發(fā)明方法的多肽序列之間的全局同一性百分比計算可用于實施本發(fā)明方法的全長多肽序列之間的全局相似性和同一性百分比，利用 本領(lǐng)域可用方法之一，即MatGAT(矩陣全局比對工具)軟件(BMC Bioinformatics. 2003 4 29. MatGAT :an application that generatessimilarity/identity matrices using protein or DNA sequences. CampanelIaJJ, Bitincka L, Smalley J;由 Ledion Bitincka 托管的軟件)，進行了確定。MatGAT軟件無需對數(shù)據(jù)進行預(yù)比對，即可產(chǎn)生DNA或蛋白質(zhì)序 列的相似性/同一性矩陣。該程序利用Myers和Miller全局比對算法(空位開放罰分為 12，而空位延伸罰分為2)進行一系列的兩兩比對，利用例如Blosum 62(對于多肽而言)計 算相似性和同一性，然后將結(jié)果排列成距離矩陣。序列相似性示于對角線下半部，而序列同 一性示于對角線上半部。比較所用的參數(shù)有記分矩陣Blosum62首個空位12延伸空位2還可以產(chǎn)生針對特定結(jié)構(gòu)域的局部比對的MATGAT表或有關(guān)特定結(jié)構(gòu)域之間的同 一性/相似性百分比的數(shù)據(jù)。對于多肽序列全長上的全局相似性和同一性(將部分多肽序列排除在外)，軟件 分析的結(jié)果示于表B。對角線上方給出同一性百分比，而對角線下方給出相似性百分比。與SEQ ID NO :2相比，可用于實施本發(fā)明方法的多肽序列之間的同一性百分比可低至52%氨基酸同一性。表B 多肽序列全長上的全局相似性和同一性的MatGAT結(jié)果 如果在SEQ ID NO 2的保守結(jié)構(gòu)域(CD) (SEQ ID NO 36所示)與可用于實施本 發(fā)明的多肽的⑶之間進行同一性計算的話，則同一性百分比可顯著增加。⑶包含AT-hook DNA結(jié)合基序(對于SEQ ID NO :2 JnSEQ IDNO :37所示)和PPC結(jié)構(gòu)域(對于SEQ ID N0: 2，如SEQ ID N0:38所示)?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的多肽序列在CD上的同一性百分比為 75%至99%氨基酸同一性，見表Bi。這顯著高于在全長AHL19/20多肽序列之間計算的氨 基酸同一性百分比。表Bl 多肽序列間在⑶結(jié)構(gòu)域上的全局相似性和同一性的MatGAT結(jié)果。 實施例4 可用于實施本發(fā)明方法的多肽序列中所含結(jié)構(gòu)域的鑒定蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和位點整合資源(Integrated Resource of ProteinFamilies, Domains and Sites (InterPro))數(shù)據(jù)庫是用于基于文本以及序列的搜 索的常用標簽數(shù)據(jù)庫的整合界面。InterPro數(shù)據(jù)庫將這些數(shù)據(jù)庫結(jié)合起來，它們利用不同 的方法學(xué)和有關(guān)已充分表征的蛋白質(zhì)的不同角度生物學(xué)信息來產(chǎn)生蛋白質(zhì)標簽。合作數(shù)據(jù) 庫包括 SWISS-PR0T、PR0SITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和 Pfam、Smart 和 TIGRFAMs。Interpro 由位于英國的歐洲生物信息學(xué)研究所(European Bioinformatics Institute)托管。SEQ ID NO 2所示多肽序列的InterPro掃描結(jié)果示于表C表C :SEQ ID NO 2所示多肽序列的InterPro掃描結(jié)果 將GRP多肽序列用作查詢序列搜索InterPro數(shù)據(jù)庫?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明方法的 GRP多肽匹配一個InterPro登錄號，如在下面表中所示的 SEQ ID NO 51和SEQ ID NO 56所示的多肽序列的InterPro掃描結(jié)果示于下面InterPro
IPROOl 176 結(jié)構(gòu)域1_氨基環(huán)丙烷羧酸合酶，區(qū)域[203-224] [256-280] [292-315]IPR004839 結(jié)構(gòu)域氨基轉(zhuǎn)移酶，I類和II類，區(qū)域[145-314]PFAM PF00155結(jié)構(gòu)域氨基轉(zhuǎn)移酶I類和II類，評分為8. 4e_19，區(qū)域[108-509]實施例5 用于實施本發(fā)明方法的多肽序列的亞細胞定位預(yù)測TargetP 1. 1預(yù)測真核蛋白質(zhì)的亞細胞定位?；谌缦氯我?N-端前序列的預(yù)測性存在，進行定位確定葉綠體轉(zhuǎn)運肽(cTP)、線粒體靶向肽(mTP)或分泌途徑信號肽(SP)。 最終預(yù)測所基于的分值并非真正的概率，且它們加起來不一定為1。不過，根據(jù)TargetP，得 分最高的定位是最可能的，且分值之間的關(guān)系(可靠性級別)可作為所述預(yù)測的可靠性的 指標?？煽啃约墑e(RC)范圍從1到5，其中1表示最強的預(yù)測。TargetP由丹麥技術(shù)大學(xué) (Technical University of Denmark)的月艮務(wù)器維護。對于經(jīng)預(yù)測含有N-端前序列的序列，還可以預(yù)測潛在的切割位點。選擇了多種參數(shù)，例如生物體類型(非植物或植物)、截斷值設(shè)置(無、預(yù)先規(guī)定的 截斷值設(shè)置或者用戶指定的截斷值設(shè)置)以及切割位點的預(yù)測計算(是或否)。SEQ ID NO 2所示多肽序列的TargetP 1. 1分析結(jié)果示于表D7。選擇的是“植物” 生物體類型，并且未規(guī)定截斷值。SEQ ID NO :2所示多肽序列的預(yù)測的亞細胞定位不是葉 綠體，不是線粒體，也不是分泌途徑，而最可能是細胞核。在SEQ ID NO 2的AHL19/20多肽中發(fā)現(xiàn)(例如通過多重序列比對，然后目檢)預(yù) 測的核定位信號(NLS)。NLS是一個或多個具有帶正電荷的賴氨酸或精氨酸的短序列。本 發(fā)明的SEQ ID NO :2經(jīng)預(yù)測定位在真核細胞的細胞核區(qū)室。表D :SEQ ID NO 2所示多肽序列的TargetP 1. 1分析 SEQ ID NO 51所示多肽序列的TargetP 1. 1分析結(jié)果如下。TargetP 預(yù)測線粒體(0. 837，質(zhì)量 2)可以利用許多算法進行亞細胞定位預(yù)測分析，包括· ChloroP 1. 1，由丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器托管；
蛋白質(zhì)尋覓亞細胞定位預(yù)測軟件(Protein Prowler SubcellularLocalisation Predictor)，1. 2版，由澳大利亞布里斯班昆士蘭大學(xué)分子生物科學(xué)研究所(Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australia)的月艮務(wù)器托 管；‘ PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2. 5，由加拿大大阿爾貝塔埃德蒙頓阿爾貝 塔大學(xué)(University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada)的服務(wù)器托管；· TMHMM,由丹麥技術(shù)大學(xué)服務(wù)器托管。實施例6 與可用于本發(fā)明方法的多肽序列相關(guān)的分析AAT樣多肽可具有催化下列反應(yīng)的能力 本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠容易地檢查該活性。實施例7 本發(fā)明核酸序列的克隆除非另外指出，否則按照(Sambrook(2001)Molecular Cloning :alaboratory manual,第 3 版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York)或 Ausubel 等， (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols 的第 1 禾口 2 卷 中所述標準方案進行重組DNA技術(shù)。用于植物分子工作的標準材料和方法描述于由BIOS Scientific PublicationsLtd (UK)禾口 Blackwell Scientific Publications (UK)出版的 R. D. D. Croy 編著的 Plant Molecular Biology Labfax (1993)中。使用從混合植物組織提取的mRNA合成的擬南芥cDNA文庫作為模板，通過PCR，擴 增編碼AHL19多肽的擬南芥cDNA。PCR擴增使用引物prm8135 (SEQ ID NO 41 ；有義5’-g gggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcgaatccatggtg-3')禾口弓 L prm08136(SEQ ID NO 42 sJ^J^_，H :5，-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttaaaaaccattttaacgcacg-3' )，^il 含用于Gateway重組的AttB位點。在標準條件下使用Hifi Taq DNA聚合酶進行PCR。同樣 利用標準方法擴增和純化預(yù)期長度(包括attB位點)的PCR片段。接著進行Gateway操作 的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與pD0NR201質(zhì)粒體內(nèi)重組，產(chǎn)生Gateway術(shù)語所稱 的“進入(entry)克隆”。作為Gateway 技術(shù)一部分的質(zhì)粒PD0NR201購自Invitrogen。SEQ ID NO :45 的克隆使用定制的擬南芥混合組織cDNA文庫(在pCMV Sport 6. O中；Invitrogen， Paisley,UK)作為模板，通過PCR，擴增本發(fā)明方法所用的核酸序列SEQ ID NO :45。在5(^1 PCR混合物中使用200ng的模板，在標準條件下利用Hifi Taq DNA聚合酶進行PCR。使用 t^^l^Jjk prm03240 (SEQ ID NO 48 ；5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgtc ttgctgtggaggaa 3，)禾口 prm03241 (SEQ ID NO :49 ；反義，] 補5，-ggggaccactttgtacaaga aagctgggtttcacttgcaggtgcaag 3’)，其包括進行Gateway重組的AttB位點。同樣利用標 準方法純化擴增的PCR片段。接著進行Gateway操作的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間PCR 片段與pD0NR20i質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生Gateway術(shù)語所稱的“進入克隆”。作為Gateway 技術(shù)一部分的質(zhì)粒PD0NR201購自英駿公司(Invitrogen)。在50 μ 1 PCR混合物中使用200ng的模板，在標準條件下利用HifiTaq DNA聚合酶通過PCR擴增本發(fā)明方法所用的核酸序列SEQ ID N0:50。使用的引物是prm08408 (SEQ ID NO 53 ； ^n^jlJi) 5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatgcgg aaggaagcgac_3，禾口 prm08409 (SEQ ID NO :54 ；反義， 補)5，_ggggaccactttgtacaagaaagc tgggtcgaattgctaagctgttacga-3，，其包括進行Gateway重組的AttB位點。同樣利用標準 方法純化擴增的PCR片段。接著進行Gateway操作的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片 段與pD0NR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生Gateway術(shù)語所稱的“進入克隆”，即pAAT-like。作為 Gateway 技術(shù)一部分的質(zhì)粒 PD0NR201 購自 Invitrogen。使用稻cDNA文庫(在pCMV Sport 6. O 中；Invitrogen，Paisley，UK)作為模板，通 過PCR，擴增本發(fā)明方法所用的核酸序列SEQ ID而55。在5(^1 PCR混合物中使用200ng 的模板，在標準條件下利用Hifi Taq DNA聚合酶進行PCR。使用的引物是prmOO 1646 (SEQ ID NO 58 ；WJ^. ^nW54 ^JIl# ) 5' -ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatggct g ctcccagc_3，禾口 prmOO 1647 (SEQ ID NO :59 ；反義, 補)5，—ggggaccactttgtacaagaaagc tgggtaattcagtcgcggtacg-3，，其包括進行Gateway重組的AttB位點。同樣利用標準方法 純化擴增的PCR片段。接著進行Gateway操作的第一步，即BP反應(yīng)，在此期間PCR片段與 PD0NR201質(zhì)粒體內(nèi)重組以產(chǎn)生Gateway術(shù)語所稱的“進入克隆”，即pAAT。作為Gateway 技術(shù)一部分的質(zhì)粒PD0NR201購自Invitrogen。實施例8 使用公開的核酸序列構(gòu)建表達載體隨后將包含SEQ ID NO 1的進入克隆與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體(destination vector) 一起用于LR反應(yīng)。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含如下功能性元件植物選擇標記；可 篩選標記表達盒；旨在與已克隆到進入克隆中的目的核酸序列進行LR體內(nèi)重組的Gateway 盒。用于組成型表達的稻G0S2啟動子(SEQ ID NO 35)位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將所產(chǎn)生的表達載體 pG0S2 :AHL19/20(圖5)轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌菌株LBA4044。隨后將包含SEQ ID NO :45的進入克隆與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起用于LR反 應(yīng)。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含如下功能性元件植物選擇標記；可篩選標記表達盒；旨在 與已克隆到進入克隆中的目的核酸序列進行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于組成型表達 的稻HMGB啟動子(SEQ IDNO 47)位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將所產(chǎn)生的表達載體 pG0S2 :GRP (圖7)轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌菌株LBA4044。隨后將包含SEQ ID NO :50的進入克隆與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起用于LR反 應(yīng)。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含如下功能性元件植物選擇標記；可篩選標記表達盒；旨在 與已克隆到進入克隆中的目的核酸序列進行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于枝條和葉特 異性表達的稻推定原葉綠素酸酯還原酶啟動子(SEQ ID NO 52)位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將所產(chǎn)生的表達載體(圖9)轉(zhuǎn) 化進農(nóng)桿菌菌株LBA4044。隨后將包含SEQ ID NO :55的進入克隆與用于稻轉(zhuǎn)化的目的載體一起用于LR反 應(yīng)。此載體在T-DNA邊界內(nèi)包含如下功能性元件植物選擇標記；可篩選標記表達盒；旨在 與已克隆到進入克隆中的目的核酸序列進行LR體內(nèi)重組的Gateway盒。用于根表皮和根毛特異性表達的稻NRT1啟動子(SEQ ID NO 57)位于此Gateway盒的上游。在LR重組步驟之后，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法將所產(chǎn)生的表達載體 pNRTl: :ATT(圖11)轉(zhuǎn)化進農(nóng)桿菌菌株LBA4044。實施例9 植物轉(zhuǎn)化稻轉(zhuǎn)化獨立地使用包含表達載體的這些農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化稻植物。使梗稻栽培種日本晴(rice japonica cultivar Nipponbare)的成熟干種子脫殼。通過在70%的乙醇中孵育1分鐘， 然后在0. 2% HgCl2中孵育30分鐘，之后用無菌蒸餾水洗滌6次，每次15分鐘來進行消毒。 然后在包含2，4-D的培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中萌發(fā)無菌種子。在黑暗中孵育4周 后，切取盾片來源的胚發(fā)生愈傷組織，然后在相同的培養(yǎng)基上進行繁殖。2周后，通過在相同 的培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)再另外2周來繁殖或增殖愈傷組織。在共培養(yǎng)前3天在新鮮培養(yǎng)基上 傳代培養(yǎng)胚發(fā)生愈傷組織塊(以增強細胞分裂活性)。包含各表達載體的農(nóng)桿菌株LBA4404獨立地用于共培養(yǎng)。將農(nóng)桿菌接種在具有適 宜的抗生素的AB培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)3天。然后收集細菌，將其懸浮在液體共培養(yǎng)培養(yǎng) 基中至大約為1的密度(0D_)。然后將懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿(Petri dish)，將愈傷組織浸 漬在懸浮液中15分鐘。然后將愈傷組織在濾紙上吸干，之后轉(zhuǎn)移至固化的共培養(yǎng)培養(yǎng)基， 在25°C黑暗中孵育3天。然后在選擇劑存在的情況下在28°C黑暗中，在包含2，4-D的培養(yǎng) 基上生長共培養(yǎng)的愈傷組織4周。在此期間，產(chǎn)生了快速生長的抗性愈傷組織島。在將該 物質(zhì)轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基和在光照下孵育后，胚發(fā)生潛力被釋放，在接下來的4至5周中發(fā)育 出芽。將芽從愈傷組織切下，然后在包含生長素的培養(yǎng)基上孵育2至3周，然后將它們從所 述培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至土壤中。在溫室中在高濕度和短日照下生長出變硬的芽(shoot)。對于每個構(gòu)建體產(chǎn)生了大約35個獨立的T0稻轉(zhuǎn)化體。將原代轉(zhuǎn)化體從組織培養(yǎng) 室轉(zhuǎn)移至溫室。在進行確認T-DNA插入物的拷貝數(shù)的定量PCR分析后，只保留展示對選擇劑 具抗性的單拷貝轉(zhuǎn)基因植物用于T1種子的收獲。然后在移植后3至5個月收獲種子。該 方法以50%多的比率產(chǎn)生了單基因座轉(zhuǎn)化體(Aldemita和Hodgesl996，Chan等1993，Hiei 等 1994)。實施例10 表型評估方法10. 1評估設(shè)置產(chǎn)生了大約35個獨立的T0稻轉(zhuǎn)化體。原代轉(zhuǎn)化體由組織培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到溫室生長 并收獲T1種子。保留了 6個事件，這些事件中T1后代發(fā)生轉(zhuǎn)基因存在/缺乏的3 1分 離。通過監(jiān)測可視標記的表達，對于這些事件之每一個，各選出大約10個含轉(zhuǎn)基因的T1幼 苗(雜合子和純合子)，以及大約10個缺少轉(zhuǎn)基因的T1幼苗(無效合子)。轉(zhuǎn)基因植物和 相應(yīng)的無效合子在隨機位置上并排生長。溫室條件為短日照(12小時光照)，日間28°C，夜 間22 °C，相對濕度70%。從播種期到成熟期，植物數(shù)次通過數(shù)碼成像箱。在每個時間點上對每株植物從至 少6個不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048X 1536像素，1千6百萬色素)。減少的養(yǎng)分(氮)可利用度篩選在除營養(yǎng)液以外正常的條件下在花盆土中培養(yǎng)來自6個事件(T2種子)的植物。 從植物移植到成熟，用特定的營養(yǎng)液對花盆進行澆灌，所述營養(yǎng)液的氮(N)含量降低，通常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相 同。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和產(chǎn)率參數(shù)。10. 2統(tǒng)計分析F檢驗利用雙因素AN0VA(方差分析)作為統(tǒng)計模型，對植物表型特征進行總體評估。 對用 本發(fā)明基因轉(zhuǎn)化的所有事件的所有植株的測量到的所有參數(shù)進行F檢驗。進行F檢 驗以在所有轉(zhuǎn)化事件上檢查基因的效應(yīng)，并檢驗基因的總體效應(yīng)，亦稱為“整體基因效 應(yīng)”(global gene effect) 0真實的整體基因效應(yīng)的顯著性閾值設(shè)置為F檢驗的5%概率 水平。顯著性F檢驗值指向基因效應(yīng)，意味著不僅僅只是基因的存在或位置引起表型差異。按照用于T1代相同的評估方法但是每個事件評估更多個體，對4個T1事件的T2 代進行進一步的評估。當進行了具有重疊事件的兩個實驗時，進行組合分析。這可用于檢查效應(yīng)在兩個 實驗中的一致性，并且如果情況果真如此，其可用于將來自兩個實驗的證據(jù)集合起來以增 加結(jié)論的可信度。使用的方法是考慮到數(shù)據(jù)的多層結(jié)構(gòu)(即實驗-事件-分離子)的混合 模型方法。通過比較似然比檢驗與卡方分布，獲得P值。從播種期到成熟期，植物數(shù)次通過數(shù)碼成像箱。在每個時間點上對每株植物從至 少6個不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048X 1536像素，1千6百萬色素)。在GRP多肽的情況下的干旱篩選在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來自Tl、T2或更后代的稻植物，直到它們進入抽穗 期。然后將其轉(zhuǎn)移到限制灌溉的“干燥”區(qū)域。向隨機選擇的花盆中插入濕度探測儀，以監(jiān) 測土壤水含量(SWC)。當SWC低于一定的閾值時，自動向植物持續(xù)補水，直到再次達到正常 水平。然后將植物再次重新轉(zhuǎn)移到正常條件下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不 在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長 和產(chǎn)率參數(shù)。在GRP多肽的情況下的鹽脅迫篩選將來自T1、T2或更后代的稻植物生長在椰子纖維和argeX(3 1的比率)制造的 基質(zhì)上。在將小植株移植入溫室后前兩周中使用正常的營養(yǎng)液。在前兩周后，向營養(yǎng)液中 加入25mM鹽(NaCl)，直至收獲植物。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和
產(chǎn)率參數(shù)。在AAT樣多肽和AAT多肽的情況下的干旱篩選在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來自T2種子的植物，直到它們進入抽穗期。然后將 其轉(zhuǎn)移到限制灌溉的“干燥”區(qū)域。向隨機選擇的花盆中插入濕度探測儀，以監(jiān)測土壤水含 量(SWC)。當SWC低于一定的閾值時，自動向植物持續(xù)補水，直到再次達到正常水平。然后 將植物再次重新轉(zhuǎn)移到正常條件下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅 迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和產(chǎn)率參數(shù)。在AAT樣多肽和AAT多肽的情況下的氮利用效率篩選在除營養(yǎng)液以外正常的條件下在花盆土中培養(yǎng)來自T2種子的稻植物。從植物移 植到成熟，用特定的營養(yǎng)液對花盆進行澆灌，所述營養(yǎng)液的氮(N)含量降低，通常低7到8 倍。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針 對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和產(chǎn)率參數(shù)。
10. 3測量的參數(shù)生物量相關(guān)參數(shù)測量從播種期到成熟期，植物數(shù)次通過數(shù)碼成像箱。在每個時間點上對每株植物從至 少6個不同的角度獲取數(shù)碼圖像(2048X 1536像素，1千6百萬色素)。植物地上面積(或者說葉生物量)通過計數(shù)數(shù)碼圖像上區(qū)別于背景的來自于地上 植物部分的像素的總數(shù)而確定。此值為同一時間點從不同的角度拍攝的照片的平均值，并 通過校準轉(zhuǎn)換為以平方毫米表示的物理表面值(physical surface value)。實驗表明通過 這種方法測量的地上植物面積與植物地上部分的生物量相關(guān)。所述地上面積為在植物達到 其最大葉生物量的時間點測量的面積。早期活力是萌發(fā)后3周植物(幼苗)的地上面積。 根生物量的增加表示為總根生物量的增加(測量為在植物生命期中觀察到的根的最大生 物量)；或表示為根/條指數(shù)的增加(測量為在根和枝條活躍生長期中根質(zhì)量與枝條質(zhì)量 之間的比率)。早期活力通過計數(shù)區(qū)別于背景的來自地上植物部分的像數(shù)的總數(shù)來確定。此值為 同一時間點從不同的角度拍攝的照片的平均值，并通過校準轉(zhuǎn)換為以平方毫米表示的物理 表面值。下面所述的關(guān)于早期活力的結(jié)果是萌發(fā)后3周的植物的結(jié)果。種子相關(guān)參數(shù)測量收獲成熟的一級圓錐花序、計數(shù)、裝袋、貼上條形碼標記，然后在烤箱中于37°C干 燥三天。隨后將圓錐花序脫粒，收集并計數(shù)所有的種子。使用鼓風(fēng)裝置將飽滿谷殼和空殼 分開。棄去空殼，再次計數(shù)剩下的部分。在分析天平上稱重飽滿的谷殼。通過計數(shù)在分離 步驟之后剩下的飽滿谷殼數(shù)確定飽滿種子數(shù)。通過稱量從一株植物收獲的所有飽滿谷殼來 測量每植物的種子總重量。通過計數(shù)從植物收獲的谷殼數(shù)來測量每株植物的種子總數(shù)。根 據(jù)計數(shù)的飽滿種子數(shù)及其總重量外推得出千粒重(TKW)。收獲指數(shù)(HI)在本發(fā)明中定義為 每植物的種子總重量和地上面積(mm2)之間的比值再乘以因子106。每圓錐花序的花總數(shù) 在本發(fā)明中定義為種子總數(shù)與成熟的一級圓錐花序數(shù)之間的比值。種子飽滿率在本發(fā)明中 定義為飽滿種子數(shù)占種子(或小花)總數(shù)的比例(以％表示)。實施例11 在|H常生長條件下的轉(zhuǎn)基因稻植物的表型評估結(jié)果對在用于組成型表達的G0S2啟動子控制之下表達編碼SEQ ID N0:2所示 AHL19/20多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)基因稻植物，在生長于正常生長條件下時進行了評估，評估 結(jié)果如下所示。與相應(yīng)的無效合子(對照植物)相比，轉(zhuǎn)基因植物的每圓錐花序的花數(shù)、每植物的 種子總產(chǎn)率、飽滿種子總數(shù)和收獲指數(shù)均有顯著增加，如表E中所示。表E:在正常生長條件下，對在用于組成型表達的G0S2啟動子控制之下表達編碼 SEQ ID N0:2所示AHL19/20多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)基因稻植物的評估結(jié)果。
對在非脅迫條件下生長的并且在稻的原葉綠素酸酯還原酶啟動子控制之下表達 AAT樣核酸的轉(zhuǎn)基因稻植物的評估，顯示出與對照植物相比轉(zhuǎn)基因植物的收獲指數(shù)(HI)顯 著增加。還觀察到與對照植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的早期活力、種子總重量和飽滿種子數(shù)增 加。對在非限氮條件下生長的并且在稻NRTl啟動子控制之下表達AAT核酸的轉(zhuǎn)基因 稻植物的評估，顯示出與對照植物相比，地上面積、植物重量、早期活力增加。實施例12 在養(yǎng)分(氮,)可利用度降低的牛長備件下的轉(zhuǎn)某因稻棺物的表型評估 結(jié)果對在養(yǎng)分(氮)可利用度降低的生長條件下生長的并且在用于組成型表達的G0S2 啟動子控制之下表達編碼SEQ ID N0:2所示AHL19/20多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)基因稻植物的 評估結(jié)果示于下面。與相應(yīng)的無效合子(對照植物)相比，轉(zhuǎn)基因植物的每植物的種子總產(chǎn)率、飽滿種 子總數(shù)和收獲指數(shù)均顯著增加，如表F中所示。表F 對在養(yǎng)分(氮)可利用度降低的生長條件下，對在用于組成型表達的G0S2啟 動子控制之下表達編碼SEQ ID N0:2所示AHL19/20多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)基因稻植物的評 估結(jié)果。 實施例13 在JkMZ^iM迫生長條件下的轉(zhuǎn)基因稻植物的表型評估結(jié)果在鹽脅迫條件下牛長時于G0S2啟動子控制之下表達SEQ ID NO 45所示的GRP核 酸序列的轉(zhuǎn)基因稻植物，顯示出與在相當條件下生長的對照植物相比，地上生物量、每植物的種子總產(chǎn)率、飽滿種子數(shù)、種子總數(shù)和一級圓錐花序(first panicles)數(shù)的5%以上增 力口，如下表中所示。 在干旱脅迫條件下牛長的、于G0S2啟動子控制之下表汰SEQ ID NO :45所示GRP 核酸序列的轉(zhuǎn)基因稻植物，顯示出與在相當條件下生長的對照植物相比，地上生物量、每植 物的種子總產(chǎn)率、飽滿種子數(shù)、種子總數(shù)和種子飽滿率的5%以上增加，如下表中所示。 實施例14 其他作物的轉(zhuǎn)化實例玉米的轉(zhuǎn)化使用由Ishida 等(1996)Nature Biotech 14(6) :745_50 描述的方法的改進方法 進行玉米(Zea mays)的轉(zhuǎn)化。在玉米中轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的，只有特定的基因型易于進 行轉(zhuǎn)化和再生。近交系A(chǔ)188 (University ofMinnesota)或以A188作為親本的雜種是用于 轉(zhuǎn)化的供體材料的良好來源，但也可成功地使用其他基因型。在授粉后大約11天(DAP)當 未成熟的胚的長度為大約1至1. 2mm時，從玉米植物收獲穗子。將未成熟的胚與包含表達 載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)基因植物。將切離的胚培養(yǎng)在包含選擇劑 (例如咪唑啉酮，但可使用不同的選擇標記)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，然后是玉米再生培養(yǎng) 基上。在光照的情況下在25°C孵育培養(yǎng)皿2至3周，或直至芽產(chǎn)生。將綠色的芽從各胚轉(zhuǎn)移至玉米生根培養(yǎng)基，在25°C孵育2-3周，直至根產(chǎn)生。然后將生根的芽移植至溫室土壤 中。從展示對選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。小麥轉(zhuǎn)化
使用由Ishida 等(1996)Nature Biotech 14(6) :745_50 描述的方法進行小麥的 轉(zhuǎn)化。通常將栽培品種Bobwhite (可從CIMMYT，Mexico獲得)用于轉(zhuǎn)化。將未成熟的胚與 包含表達載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過器官發(fā)生再生轉(zhuǎn)基因植物。在與農(nóng)桿菌孵育后，將 胚體外培養(yǎng)在包含選擇劑(例如咪唑啉酮，但可使用不同的選擇標記)的愈傷組織誘導(dǎo)培 養(yǎng)基，然后是再生培養(yǎng)基上。在光照的情況下在25°C孵育培養(yǎng)皿2至3周，或直至芽產(chǎn)生。 將綠色的芽從各胚轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，在25°C孵育2-3周，直至根產(chǎn)生。將生根的芽移植至 溫室土壤中。從展示對選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。大豆轉(zhuǎn)化按照Texas A&M專利US 5，164，310中描述的方法的改進方法轉(zhuǎn)化大豆。幾種 商品化大豆品種易于通過該方法進行轉(zhuǎn)化。通常將栽培品種Jack(可從Illinois Seed foundation獲得)用于轉(zhuǎn)化。對大豆種子消毒以便體外播種。從7日齡幼苗切取下胚軸、 胚根和一片子葉。讓上胚軸和剩下的子葉進一步生長產(chǎn)生腋節(jié)(axillary node) 0切取這 些腋節(jié)，將其與包含表達載體的根癌農(nóng)桿菌一起孵育。在共培養(yǎng)處理后，洗滌外植體，然后 轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基。切取再生的芽，將其置于芽伸長培養(yǎng)基上。將長度不超過Icm的芽置 于生根培養(yǎng)基上直至根產(chǎn)生。將生根的芽轉(zhuǎn)移至溫室的土壤中。從展示對選擇劑具有抗性 的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。油菜(rapeseed)/蕓苔(Canola)的轉(zhuǎn)化5-6日齡的幼苗的子葉柄和下胚軸用作組織培養(yǎng)的外植體，按照Babic等(1998， Plant Cell Rep 17 183-188)對其進行轉(zhuǎn)化。商業(yè)栽培品種Westar (Agriculture Canada) 是用于轉(zhuǎn)化的標準品種，但也可使用其他品種。對Canola種子進行表面消毒以進行體外播 種。從體外幼苗切取具有附著的子葉的子葉柄外植體，然后通過將子葉柄外植體的切口末 端浸入細菌懸浮液中接種農(nóng)桿菌(包含表達載體)。然后將外植體在23°C、16小時光照下， 在包含3mg/l 8々 、3%蔗糖、0.7% 1^丨3831~的1^84 -3培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天。在與農(nóng)桿菌 共培養(yǎng)2天后，將子葉柄外植體轉(zhuǎn)移至包含3mg/l BAP、頭孢氨噻肟、羧芐青霉素或替卡西 林_克拉維酸(timentin) (300mg/l)的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，然后在具有頭孢氨噻 肟(cefotaxime)、羧芐青霉素或替卡西林_克拉維酸和選擇劑的MSBAP-3培養(yǎng)基上培養(yǎng)直 至芽再生。當芽的長度為5-10mm時，將其切離，然后轉(zhuǎn)移至芽伸長培養(yǎng)基(MSBAP-0. 5，包含 0. 5mg/l BAP)。將長度大約2cm的芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MSO)以進行根誘導(dǎo)。將生根的芽 移植至溫室的土壤中。從展示對選擇劑具有抗性的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生 Tl種子。苜蓿的轉(zhuǎn)化使用(McKersie等，1999 Plant Physiol 119 :839_847)的方法轉(zhuǎn)化苜蓿 (Medicago sativa)的再生克隆。苜蓿的再生和轉(zhuǎn)化是基因型依賴性的，因而需要再 生的植物。已描述了用于獲得再生植物的方法。例如，這些再生植物可選自栽培品種 Rangelander(Agriculture Canada)或由 Brown DCW 禾口 A Atanassov(1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4:111-112)描述的任何其他商業(yè)苜蓿品種?？蛇x擇地，RA3品種(University of Wisconsin)已選擇用于組織培養(yǎng)(Walker 等，1978 Am J Bot65: 654-659)。將子葉柄外植體與包含表達載體的根癌農(nóng)桿菌C58C1 pMP90 (McKersie等，1999 PlantPhysiol 119:839-847)或LBA4404的過夜培養(yǎng)物共培養(yǎng)。將外植體在黑暗中在包含 288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4. 35g/L K2SO4^P 100 μ m乙酰丁香酮的SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 共培養(yǎng)3天。在一半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中洗滌 外植體，然后將其種在不含乙酰丁香酮但具有適宜的選擇劑和適宜的抗生素(以抑制農(nóng)桿 菌的生長)的相同SH誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在幾周后，將體細胞胚轉(zhuǎn)移至不含生長調(diào)節(jié)劑、無抗 生素但含有50g/L蔗糖的B0i2Y發(fā)育培養(yǎng)基中。隨后在一半濃度的Murashige-Skoog培養(yǎng) 基上萌發(fā)體細胞胚。將生根的幼苗移植入花盆和生長在溫室中。從展示對選擇劑具有抗性 的且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。棉花轉(zhuǎn)化使用根癌農(nóng)桿菌在下胚軸外植體上轉(zhuǎn)化棉花(Gossypium hirsutum L.)。商業(yè)品 種例如Coker 130或Coker 312 (SeedCo, Lubbock, TX)是用于轉(zhuǎn)化的標準品種，但也可使用 其他品種。對種子進行表面消毒，然后在黑暗處萌發(fā)。從萌發(fā)的幼苗切取長度大約1-1. 5厘 米的下胚軸外植體。將下胚軸外植體浸沒在含有表達載體的根癌農(nóng)桿菌接種物中5分鐘， 然后在黑暗處在24°C在MS+1. 8mg/l KN03+2%葡萄糖上共培養(yǎng)大約48小時。將外植體轉(zhuǎn) 移至含有適當?shù)募毦椭参镞x擇標記(更換數(shù)次)的相同培養(yǎng)基中，直至看到胚發(fā)生愈傷 組織。分離愈傷組織，然后進行傳代培養(yǎng)直至體細胞胚出現(xiàn)。將來源于體細胞胚的小植株 在生根培養(yǎng)基上成熟直至根發(fā)育。將生根的幼苗移植至溫室中的花盆土中。從展示對選擇 劑具有抗性的并且包含單拷貝T-DNA插入物的植物產(chǎn)生Tl種子。實施例13 非生物脅迫篩選的實例干旱篩選在正常條件下在花盆土中培養(yǎng)來自所選數(shù)目的事件的植物，直到它們進入抽穗 期。然后將其轉(zhuǎn)移到限制灌溉的“干燥”區(qū)域。向隨機選擇的花盆中插入濕度探測儀，以監(jiān) 測土壤水含量(SWC)。當SWC低于一定的閾值時，自動向植物持續(xù)補水，直到再次達到正常 水平。然后將植物重新轉(zhuǎn)移到正常條件下。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非 生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物相同。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和產(chǎn) 率參數(shù)。鹽脅迫篩選將植物生長在椰子纖維和argeX(3 1的比率)制造的基質(zhì)上。在將小植株移植 入溫室后前2兩周中使用正常的營養(yǎng)液。在前兩周后，向營養(yǎng)液中加入25mM鹽(NaCl)，直 至收獲植物。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和產(chǎn)率參數(shù)。實施例14 非生物脅迫篩選氮利用效率篩選在除營養(yǎng)液以外正常的條件下在花盆土中培養(yǎng)來自T1、T2或更后代的稻植物。從 植物移植到成熟一直用特定的營養(yǎng)液對花盆進行澆灌，所述營養(yǎng)液的氮(N)含量降低，通 常低7到8倍。其余的栽培(植物成熟、種子收獲)與不在非生物脅迫條件下培養(yǎng)的植物 相同。如針對正常條件下的生長所詳述的那樣，記錄生長和產(chǎn)率參數(shù)。
權(quán)利要求
相對于對照植物增強植物的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，包括增加植物中編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列的表達，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽，和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽，以及任選地選擇具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的植物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)率增加性多肽是核定位AT-hook基序蛋白 19/20 (AHL19/20)多肽，該AHL19/20多肽包含與SEQ ID NO :36所示保守結(jié)構(gòu)域(CD)具有 至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更大的氨基酸序列同一性的結(jié)構(gòu)域， 或所述AHL19/20多肽包含(i)與SEQ ID NO :37所示AT-hook基序具有至少75%、80%、 85%、90%、95%、98%、99%或更大的氨基酸序列同一性的基序；和(ii)與SEQID NO 38 所示植物及原核生物保守(PPC)結(jié)構(gòu)域具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、98%、99%或更大的氨基酸序列同一性的結(jié)構(gòu)域。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述AHL19/20多肽包含(i)核定位信號；(ii)具 有InterPro登錄號IPR014476的AT-hook DNA結(jié)合基序；和(iii)具有InterPro登錄號 IPR005175的植物及原核生物保守(PPC)結(jié)構(gòu)域。
4.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述AHL19/20多肽，當用于構(gòu)建AHL系統(tǒng)發(fā)生樹，例 如圖1 或圖2中描述的系統(tǒng)發(fā)生樹時，與包含SEQ IDNO 2所示多肽序列的AHL19/20多肽 群而非任何其他AHL群聚類。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述產(chǎn)率增加性多肽按照遞增的優(yōu)選順序分別與SEQID NO :2所示的AHL19/20多肽、或本文表A中所示的任何多肽序列、或SEQ ID N0:46所示GRP 多肽、或SEQ ID NO :51所示AAT樣多肽、或SEQ ID NO :56所示AAT多肽具有至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 或更高的氨基酸序列同一 性。
6.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述編碼AHL19/20多肽的核酸序列為表A中所示的 任一 SEQ ID NO核酸序列或其部分、或能夠與表A中所示的任一 SEQ ID NO核酸序列雜交 的序列。
7.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述核酸序列編碼表A中所示的任何SEQID NO多 肽序列的直系同源物或旁系同源物。
8.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述增加的表達通過任何一個或多個下列技術(shù)實 現(xiàn)T-DNA激活標簽、TILLING、或同源重組。
9.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述增加的表達通過在植物中引入和表達編碼 AHL19/20多肽的核酸序列來實現(xiàn)。
10.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多個下列 性狀(i)增加的每圓錐花序的花數(shù)；(ii)增加的每植物的種子總重量；(iii)增加的飽滿 種子數(shù)；或(iv)增加的收獲指數(shù)。
11.權(quán)利要求2的方法，其中相對于對照植物，所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀發(fā)生在于 養(yǎng)分可利用度下降的條件下，優(yōu)選氮可利用度下降的條件下生長的植物中。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多個下列性狀 (i)增加的每植物的種子總產(chǎn)率；(ii)增加的飽滿種子數(shù)；或(iii)增加的收獲指數(shù)。
13.權(quán)利要求2的方法，其中所述核酸序列與組成型啟動子，優(yōu)選與植物組成型啟動 子，更優(yōu)選與G0S2啟動子，最優(yōu)選與SEQ ID NO :35所示的稻的G0S2啟動子有效連接。
14.任何前述權(quán)利要求的方法，其中所述編碼AHL19/20多肽的核酸序列是植物來源 的，優(yōu)選來自雙子葉植物，還優(yōu)選來自十字花科，最優(yōu)選來自擬南芥。
15.可通過任何前述權(quán)利要求的方法獲得的植物、其部分(包括種子)、或植物細胞，其 中所述植物、其部分或細胞包含與植物組成型啟動子有效連接的編碼產(chǎn)率增加性多肽的分 離的核酸轉(zhuǎn)基因，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、 GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。
16.構(gòu)建體，其包含(a)編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列，所述產(chǎn)率增加性多肽選自權(quán)利要求2至7中任 一項所定義的核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述 GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn) 移酶(AAT)多肽；(b)一個或多個能夠驅(qū)動(a)中的核酸序列表達的控制序列；和任選地(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
17.權(quán)利要求16的構(gòu)建體，其中所述控制序列是植物組成型啟動子，優(yōu)選G0S2啟動子， 更優(yōu)選SEQ ID NO 35所示的G0S2啟動子。
18.權(quán)利要求16或17的構(gòu)建體在產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性 狀的植物的方法中的用途，所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀是一個或多個下列性狀(i)增 加的每圓錐花序的花數(shù)；(ii)增加的每植物的種子總重量；(iii)增加的飽滿種子數(shù)；或 (iv)增加的收獲指數(shù)。
19.用權(quán)利要求16或17的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細胞。
20.產(chǎn)生相對于對照植物具有增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括(i)在植物、植物部分或植物細胞中引入和表達處于植物組成型啟動子控制之下的編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列，所述產(chǎn)率增加性多肽選自權(quán)利要求2至7中任一項所定義 的核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是 金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT) 多肽；和( )在促進植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細胞、植物部分或植物。
21.由于編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列的增加表達而相對于對照植物具有增強的種 子產(chǎn)率相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物、或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞或轉(zhuǎn)基因植物部 分，其中所述核酸序列與植物組成型啟動子有效連接，所述產(chǎn)率增加性多肽選自權(quán)利要求2 至7中任一項所定義的核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白， 其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨 酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。
22.權(quán)利要求15、19或21的轉(zhuǎn)基因植物或源自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其 中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷類，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、 高粱和燕麥。
23.權(quán)利要求22的植物的可收獲部分，其包含編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列，所述 產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其 中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸 氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽，其中所述可收獲部分優(yōu)選是種子。
24.來源于權(quán)利要求22的植物和/或來源于權(quán)利要求23的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。
25.編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列在增強種子產(chǎn)率相關(guān)性狀中的用途，所述產(chǎn) 率增加性多肽選自如權(quán)利要求2至7中任一項所定義的核定位AT-hook基序蛋白 19/20 (AHL19/20)、GRP (生長調(diào)節(jié)蛋白，其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽，所述增強的種子產(chǎn)率相 關(guān)性狀包括一個或多個下列性狀i)增加的每圓錐花序的花數(shù)；(ii)增加的每植物的種子 總重量；(iii)增加的飽滿種子數(shù)；或(iv)增加的收獲指數(shù)。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述增強的種子產(chǎn)率相關(guān)性狀在養(yǎng)分可利用度下降的條 件下，優(yōu)選在氮可利用度下降的條件下發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并且涉及通過調(diào)節(jié)植物中編碼產(chǎn)率增加性多肽的核酸序列的表達來增強多種植物產(chǎn)率相關(guān)性狀的方法，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白)(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽、和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽。本發(fā)明還涉及具有調(diào)節(jié)的產(chǎn)率增加性多肽編碼核酸序列表達的植物，所述產(chǎn)率增加性多肽選自核定位AT-hook基序蛋白19/20(AHL19/20)、GRP(生長調(diào)節(jié)蛋白)(其中所述GRP多肽是金屬硫蛋白2a(MT2a)多肽)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)樣多肽、和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AAT)多肽，該植物相對于對照植物具有增強的產(chǎn)率相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供了可以用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體。
文檔編號C12N15/82GK101849009SQ200880025418
公開日2010年9月29日 申請日期2008年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日
發(fā)明者V·弗蘭卡德, Y·海茨費爾德 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司