專利名稱：酵母中生產(chǎn)乙酰-CoA的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于使用異源表達(dá)體系在酵母中生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉 及對(duì)下述酵母菌株的代謝改造，所述酵母菌株能夠生產(chǎn)需要胞質(zhì)乙酰-CoA作為前體的代 謝產(chǎn)物，例如生產(chǎn)丁醇的酵母菌株。本發(fā)明涉及鑒定異源酶的實(shí)驗(yàn)體系，所述異源酶在酵母 胞質(zhì)中表達(dá)時(shí)能夠?qū)⒈?、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA。
背景技術(shù)：
乙酰-輔酶A (CoA)是大量代謝通路的必需中間產(chǎn)物，并且是許多工業(yè)相關(guān)化合物 合成中的關(guān)鍵前體，所述化合物例如為脂肪酸、類胡蘿卜素、類異戊二烯、維生素、氨基酸、 脂質(zhì)、蠟酯、(多)糖多羥基鏈烷酸酯、他汀、聚酮化合物和乙酸酯(例如乙酸乙酯和乙酸異 戊酯)。具體地，乙酰-CoA也是工業(yè)上重要的大量使用的化學(xué)品1- 丁醇的前體。與細(xì)菌例如E. coli相比，酵母細(xì)胞提供了生產(chǎn)上述乙酰-CoA衍生產(chǎn)物的非常合 適的替代方式，原因是因?yàn)榛诮湍傅倪^(guò)程可以在低PH下運(yùn)行，所以酵母對(duì)噬菌體或其它 感染不易感。因此，使用酵母不需要無(wú)菌的過(guò)程，從而降低了感興趣的產(chǎn)物的成本價(jià)格。當(dāng)天然(野生型)酵母不能夠生產(chǎn)感興趣的乙酰-CoA衍生產(chǎn)物時(shí)，使用代謝工 程改造能夠提供表達(dá)能夠支持這類過(guò)程的異源基因的酵母細(xì)胞。在這類情況下，異源基 因產(chǎn)物通常被靶向酵母的胞質(zhì)區(qū)室。因?yàn)橐阴?CoA-衍生產(chǎn)物的生物合成會(huì)完全或部分 地在胞質(zhì)溶膠中進(jìn)行，所以在胞質(zhì)區(qū)室中供應(yīng)足量的前體乙酰-CoA是至關(guān)重要的。在 Saccharomycescerevisiae中，乙酰-CoA的生物合成發(fā)生于兩個(gè)分開(kāi)的區(qū)室中。在線粒體 中，通過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(PDH)催化的丙酮酸氧化脫羧作用合成乙酰-CoA，該合成具 有以下的總反應(yīng)化學(xué)計(jì)量丙酮酸(Pyr)+CoA+NAD+ =乙酰-CoA+C02+NADH+H+在胞質(zhì)溶膠中，通過(guò)丙酮酸脫氫酶(PDH)旁路合成乙酰-CoA，該旁路涉及酶丙酮 酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)，其具有以下的總體反應(yīng)化學(xué) 計(jì)量Pyr+CoA+ATP+NAD (P) + =乙酰 _CoA+C02+NAD (P) H+AMP+PPi+H+。酵母S. cerevisiae的丙酮酸-脫氫酶-負(fù)性(Pdc_)突變體不具有功能性PDH旁 路，并且由于不能為生長(zhǎng)提供(足量的)胞質(zhì)乙酰-CoA而不能在含葡萄糖作為唯一碳源的 最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(Flikweert et al.，(1996) Ycastl2 :247_57)。因此，PDH旁路對(duì)在胞 質(zhì)區(qū)室中提供乙酰-CoA而言是必需的。然而，從以下的總體反應(yīng)化學(xué)計(jì)量中可以看出，對(duì) 能量平衡而言酵母中的PDH旁路不是最適的通過(guò)PDH-旁路合成每摩爾乙酰-CoA需要2 摩爾ATP，因?yàn)橐阴?CoA合成酶反應(yīng)ATP被水解為AMP。相反，經(jīng)由PDH的線粒體通路不需 要ATP。PDH旁路的額外ATP需求可能是從胞質(zhì)乙酰-CoA前體合成感興趣的產(chǎn)物的一個(gè)問(wèn) 題，因?yàn)闉榱水a(chǎn)生ATP需要通過(guò)例如氧化磷酸化和/或底物磷酸化(例如糖酵解)將更多 的碳源轉(zhuǎn)化，從而降低基于碳的產(chǎn)物總體產(chǎn)率。將酵母代謝工程改造為生產(chǎn)1-丁醇時(shí)，可以在酵母細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中表達(dá)異源 生物合成基因(WO 2007/041269)。通常，1摩爾葡萄糖通過(guò)糖酵解產(chǎn)生2摩爾乙酰-CoA，這是1摩爾丁醇的前體；因此，如果不考慮細(xì)胞生長(zhǎng)和維持，則每摩爾葡萄糖最多能夠合成1摩爾丁醇。然而，與丁醇生物合成組合使用PDH旁路時(shí)，由于能量不平衡而不能達(dá)到該最大 理論產(chǎn)率其中在糖酵解中每摩爾轉(zhuǎn)化的葡萄糖產(chǎn)生2摩爾ATP，PDH旁路中形成2摩爾乙 酰-CoA需要總計(jì)4摩爾(2乘以2摩爾)ATP，所述2摩爾乙酰-CoA被轉(zhuǎn)化為1摩爾丁醇。 因此，如果使用PDH旁路從1摩爾葡萄糖中合成1摩爾1- 丁醇，則存在ATP的凈短缺。因此，需要鑒定出其中不需要PDH旁路的可能替代性代謝途徑，用于在酵母中生 產(chǎn)胞質(zhì)乙酰-CoA，用于生產(chǎn)乙酰-CoA衍生產(chǎn)物，尤其是丁醇。丁醇是重要的工業(yè)化學(xué)品，并且適合用作替代性的引擎燃料，其具有優(yōu)于乙醇的 改進(jìn)的特性。丁醇還可用作多種化學(xué)和紡織過(guò)程的溶劑，用于塑料的有機(jī)合成中，用作化學(xué) 中間產(chǎn)物，和在涂層和食品和調(diào)味劑工業(yè)中用作溶劑。丁醇可以產(chǎn)自生物質(zhì)(生物丁醇) 以及化石燃料(石油丁醇)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種可用方法完成丁醇異構(gòu)體之一的化學(xué)合成(見(jiàn) 例 如 Ullmann ‘ s Encyclopedia of Industrial Chemistry,6th edition,2003， Wiley-VCHVerlag GmbH and Co. , ffeinheim, Germany, Vol. 5, pp. 716-719) 這些工藝的缺 點(diǎn)是它們基于石油化學(xué)品衍生物的使用，所述石油化學(xué)品衍生物通常是昂貴的并且對(duì)環(huán)境 不友好?？梢允褂眉?xì)菌Clostridium acetobutylicum或其它Clostridium物種進(jìn)行的丙 酮-丁醇-乙醇(ABE)過(guò)程，通過(guò)發(fā)酵實(shí)現(xiàn)丁醇的生物合成。然而，ABE過(guò)程的一個(gè)重要缺 點(diǎn)在于，其產(chǎn)生丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物。另外，細(xì)菌的使用需要無(wú)菌的工藝條件，并通 常使該過(guò)程對(duì)噬菌體感染易感。因此，酵母細(xì)胞提供了上文所述的非常合適的替代方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人目前鑒定了在酵母中提高胞質(zhì)乙酰-CoA生產(chǎn)的替代性代謝途徑，所述 途徑能夠克服PDH旁路的問(wèn)題。一種可能的途徑包括通過(guò)使用乙?；胰┟摎涿?E. C. 1. 2. 1. 10)(見(jiàn)圖2，反 應(yīng)A，A⑶H)將乙醛直接轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA而不消耗ATP。另一途徑包括通過(guò)酶或多酶復(fù)合物， 例如通過(guò)使用丙酮酸NADP氧化還原酶(E. C. 1.2. 1.51)(見(jiàn)圖2，反應(yīng)C，PN0)，將丙酮酸直 接轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA而不消耗ATP。在這兩種可能的途徑中，每摩爾葡萄糖形成1摩爾丁醇會(huì) 導(dǎo)致形成2摩爾ATP。還有另一種途徑包括通過(guò)替代性酶或酶組合，例如通過(guò)使用乙酸CoA 連接酶(ADP-形成，E. C. 6. 2. 1. 13)，或通過(guò)使用ATP:乙酸磷酸轉(zhuǎn)移酶(E. C. 2. 7. 2. 1)與 乙酰-CoA:Pi乙酰基轉(zhuǎn)移酶(E.C. 2. 3. 1.8)組合，將乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰_CoA，形成每個(gè)乙 酰-CoA消耗1個(gè)ATP。在該途徑中，每摩爾葡萄糖形成1摩爾丁醇是ATP-平衡的，即不會(huì) 形成ATP。本發(fā)明人目前發(fā)現(xiàn)，PDH旁路的這一替代方式可以在酵母的胞質(zhì)溶膠中導(dǎo)致乙 酰-CoA合成，并且這樣的乙酰-CoA可以在生物合成中用于產(chǎn)生更高量的想要的發(fā)酵產(chǎn)物， 例如丁醇。在第一方面，本發(fā)明提供了鑒定下述異源多肽的方法，所述多肽具有在酵母細(xì)胞 (的胞質(zhì)溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性，所述方法包括-提供突變的酵母細(xì)胞，其中所述突變包括至少一種(PDH)旁路基因的失活，所述 基因選自編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因；
-用包含至少一種異源核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述突變的酵母細(xì)胞，所述異 源核苷酸序列與在酵母中有功能的啟動(dòng)子可操作地連接，并且所述異源核苷酸序列編碼至 少一種具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的潛在酶活性的候選多肽；-針對(duì)在含葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，測(cè)試所述重組突變 的酵母細(xì)胞，和-當(dāng)觀察到所述細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)，將所述候選多肽鑒定為具有在所述酵母細(xì)胞(的 胞質(zhì)溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的異源多肽。 在所述方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞是Saccharomycescerevisiae細(xì) 胞，針對(duì)在Saccharomyces cerevisiae中的表達(dá)，對(duì)所述異源核苷酸序列進(jìn)行了密碼子 (對(duì))優(yōu)化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述突變包括乙酰-CoA合成酶同種型2 (acs2)基因 的失活。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述具有將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的至少 一種候選多肽是(推定的)乙酰基化乙醛脫氫酶。或者，所述在酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙 酰-CoA的酶活性的至少一種異源多肽可以由兩種或更多酶組成，所述兩種或更多酶一起 發(fā)揮作用，達(dá)到想要的從丙酮酸、乙醛或乙酸到乙酰-CoA的轉(zhuǎn)化。在另一方面，本發(fā)明提供了用于在酵母細(xì)胞基因組中整合異源核苷酸序列并隨后 從中表達(dá)異源多肽的整合載體，所述異源核苷酸序列編碼具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化 為乙酰-CoA的酶活性的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了在酵母中表達(dá)異源多肽的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包 含異源核苷酸序列，所述異源核苷酸序列與在酵母中有功能的啟動(dòng)子可操作地連接并且編 碼下述多肽，所述多肽在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為 乙酰-CoA的酶活性。在所述載體的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)上文所述的根據(jù)本發(fā)明的方法，鑒定 具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽選自SEQ ID NO 19、22、25、28和52及其功 能性同源物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體用于在Saccharomycescerevisiae中 的表達(dá)，其中針對(duì)在Saccharomyces cerevisiae中的表達(dá)，對(duì)所述異源核苷酸序列進(jìn)行了 密碼子(對(duì))優(yōu)化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異源核苷酸序列選自SEQ ID N0:20、23、26和 29。在另一方面中，本發(fā)明提供了包含如上所述本發(fā)明的表達(dá)載體的重組酵母細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組酵母細(xì)胞還包含至少一個(gè)(PDH)旁路基因的失 活，所述基因選自編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞包含編碼乙酰-CoA合酶的基因的失活。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組酵母細(xì)胞還包含下述基因(核苷酸序列)的失活，所述基因編碼能夠催化乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇的酶，所述基因優(yōu)選是編碼醇脫氫酶的基因。在本文中使用時(shí)，可以通過(guò)編碼酶的基因或核苷酸序列(的部分)的突變、缺失或 斷裂，實(shí)現(xiàn)編碼酶的基因(核苷酸序列)的失活。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞顯示在含有葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上 生長(zhǎng)。在本發(fā)明酵母細(xì)胞的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酵母細(xì)胞還包含一個(gè)或多 個(gè)引入的基因，所述基因編碼從胞質(zhì)乙酰-CoA形成1-丁醇的重組通路。從乙酰-CoA到 1-丁醇的合適的重組通路是本領(lǐng)域已知的。這類通路例如從WO 2007/041269中已知。優(yōu) 選地，所述一個(gè)或多個(gè)引入的基因編碼生產(chǎn)乙酰乙酰基-CoA、3-羥基丁?；?CoA、丁烯酰 基-CoA、丁?；?CoA、丁醛和/或1- 丁 醇的酶。所述酶可以是-乙酰-CoA 乙?；D(zhuǎn)移酶(E. C. 2. 3. 1. 9 [Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press, San Diego]；盡管具有更寬泛的底物范圍的酶(E. C. 2. 3. 1. 16)也同樣有作用)，所 述酶將2摩爾乙酰-Coa轉(zhuǎn)化為乙酰乙?；?CoA ；-NADH-依賴性或NADPH-依賴性3_羥基丁?；?CoA脫氫酶(E. C. 1. 1. 1. 35或 E. C. 1. 1. 1.30，分別為E. C. 1. 1. 1. 157或E. C. 1. 1. 1. 36)，所述酶將乙酰乙酰基-CoA轉(zhuǎn)化為 3-羥基丁?；?CoA ；-3-羥基丁?；?CoA脫氫酶(也稱作巴豆酸酶；E. C. 4. 2. 1. 17或E. C. 4. 2. 1. 55)， 其將3-羥基丁酰基-CoA轉(zhuǎn)化為丁烯?；?CoA ；-NADH-依賴性或NADPH-依賴性丁?；?CoA脫氫酶(E. C. 1. 3. 1. 44，分別為 E. C. 1. 3. 1. 38或E. C. 1. 3. 99. 2)，所述酶將丁烯?；?CoA轉(zhuǎn)化為丁?；?CoA ；-單功能的NADH-依賴性或NADPH-依賴性醛脫氫酶(E.C. 1. 2. 1. 10或1. 2. 1. 57)， 所述酶將丁?；?CoA轉(zhuǎn)化為丁醛，和-NADH-依賴性或NADPH-依賴性丁醇脫氫酶(E. C. 1. 1. 1.-)，所述酶將丁醛轉(zhuǎn)化為 1-丁醇，或-雙功能NADH-依賴性或NADPH-依賴性醛/醇脫氫酶(E.C. 1. 1. 1. 1. /1. 2. 1. 10)， 所述酶將丁?；?CoA通過(guò)丁醛轉(zhuǎn)化為1- 丁醇。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞是Saccharomycescerevisiae。在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)丁醇的方法，包括步驟用根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞 發(fā)酵合適的碳底物，和回收所述發(fā)酵期間生產(chǎn)的丁醇。附圖概述

圖1是PDH旁路的圖示，其展示了丙酮酸脫羧酶(PDC;E.C.4. 1. 1. 1)、乙醛 脫氫酶(ALD ；E. C. 1. 2. 1. 3、E. C. 1. 2. 1. 4 和 E. C. 1. 2. 1. 5)和乙酰-CoA 合成酶(ACS ； E. C. 6. 2. 1. 1)。圖2展示了 Saccharomyces cerevisiae中丁醇生產(chǎn)的圖示代謝途徑。反應(yīng)1-6 是引入酵母中的來(lái)自Clostridium acetobutylicum的丁醇生物合成步驟。A、B和C表示 胞質(zhì)溶膠中乙酰-CoA生物合成的替代性反應(yīng)。B表示丙酮酸脫氫酶旁路的部分(pdc、ald 和acs)，這是酵母中胞質(zhì)乙酰-CoA的天然來(lái)源。Glc，葡萄糖；EtOH，乙醇；Pyr，丙酮酸；AA， 乙醛；ACT，乙酸-MCoA,乙酰-CoA ；AACoA,乙酰乙?；?CoA ；BuCoA, 丁?；?CoA ；Bual，丁 醛出110!1，丁醇；離0( (H)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(還原形式)；ATP，三磷酸腺苷；AMP，單磷酸腺苷；TCA循環(huán)，三羧酸循環(huán)；PDH，丙酮酸脫氫酶；pdc，丙酮酸脫羧酶；adh， 醇脫氫酶；acdh，乙?；胰┟摎涿?；aid，乙醛脫氫酶；acs，乙酰-CoA合成酶；pno，丙酮 酸NADP氧化還原酶。反應(yīng)1-6表示的酶轉(zhuǎn)化指出了來(lái)自Clostridium acetobutylicum 的異源丁醇通路thlB (或ThL)，編碼乙酰-CoA乙?；D(zhuǎn)移酶或硫解酶[E. C. 2. 3. 1. 9] (SEQ ID NO 30) ；hbd, 3-羥基丁酰基-CoA 脫氫酶[E. C. 1. 1. 1. 157] (SEQ ID NO 31) ；crt, 3-羥 基丁?；?CoA 脫氫酶[E. C. 4. 2. 1. 55] (SEQ ID NO 32) ；ter，轉(zhuǎn)-烯?；?CoA 還原酶；bed, 丁?；?CoA脫氫酶[E. C. 1. 3. 99. 2] (SEQ ID NO 33) ；etf α β，異二聚體電子傳遞黃素蛋 白(etf α 和 etf β，分別為 SEQ ID NO 38 禾口 SEQID NO 39) ；adhE/adhEl，醛 / 醇脫氫酶 E 和 El [E. C. 1. 1. 1. 1/1. 2. 1. 10](分別為 SEQ ID NO 34 和 35) ；bdhA/bdhB, NAD(P)H-依賴 性丁醇脫氫酶 A 和 B[E. C. :1. 1. 1. _](分別為 SEQ ID NO 36 和 37)。圖3顯示了質(zhì)粒YEplacl 12PtdhTadh的圖譜。該質(zhì)粒的序列在SEQ IDNO 40中提 {共。圖4顯示了以實(shí)施例2中所述1到4型蛋白質(zhì)的氨基酸序列為基礎(chǔ)的相似性樹(shù)形 圖的例子，并且顯示了分支。發(fā)明詳述定義術(shù)語(yǔ)“丁醇”指正丁醇，或1- 丁醇。術(shù)語(yǔ)“酵母”指在種系發(fā)生上不同的一類單細(xì)胞真菌，其中大部分屬于子囊菌亞門 (Ascomycota)和擔(dān)子菌亞門(Basidiomycota)。出芽酵母(“真酵母”)被歸類于酵母菌目 (Saccharomycetales)，其中 Saccharomycescerevisiae 是最公知的物禾中。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組酵母”被定義為含有核苷酸序列和/或蛋白質(zhì)的細(xì)
胞，或者用酵母中天然不存在的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或遺傳修飾的細(xì)胞，或者其含有內(nèi)源核酸
序列(或蛋白質(zhì))的額外的一個(gè)或多個(gè)拷貝，或者其含有內(nèi)源核酸序列的突變、缺失或斷 裂。
在本文中關(guān)于蛋白質(zhì)或多肽使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變的”表示野生型或天然存在的蛋白 質(zhì)或多肽序列中的至少一種氨基酸通過(guò)編碼這些氨基酸的核酸的誘變而被不同的氨基酸 替代，或者從序列中缺失。誘變是本領(lǐng)域公知的方法，并且包括例如借助于PCR或通過(guò)寡核 昔酸介導(dǎo)的誘變進(jìn)行的定點(diǎn)誘變，如Sambrook et al. ,Molecular Cloning—A Laboratory Manual, 2nd cd. ,Vol. 1-3(1989)中所述。在本文中提到基因使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“突變的”表示基 因或其調(diào)節(jié)序列的核苷酸序列中至少一個(gè)核苷酸被不同的核苷酸代替，或者通過(guò)誘變從序 列中缺失，導(dǎo)致非功能性蛋白質(zhì)序列的轉(zhuǎn)錄或者基因的敲除。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中為RNA聚合酶 II)的模板的核酸序列。基因被轉(zhuǎn)錄為mRNA，隨后被翻譯為蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)丙酮酸脫氫酶(PDH)旁路指酵母的胞質(zhì)溶膠中從丙酮酸到乙酰-CoA的酶促 級(jí)聯(lián)放大，其由以下酶組成將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醛的丙酮酸脫羧酶(PDC ；E. C. 4. 1. 1. 1)；將 乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸的乙醛脫氫酶(ALD ；E. C. 1. 2. 1. 3、E. C. 1. 2. 1. 4和E. C. 1. 2. 1. 5)；和將乙 酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的乙酰-CoA合成酶(ACS ；Ε. C. 6. 2. 1. 1)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸多聚體，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知類似物，因?yàn)樗鼈兡軌蛞灶愃朴谔烊淮嬖诘暮塑账岬姆绞脚c單鏈核酸雜交(例如肽核酸)。多核苷酸 可以是天然或異源的結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的全長(zhǎng)或亞序列。除非另有說(shuō)明，該術(shù)語(yǔ)包括特 定的序列及其互補(bǔ)序列。因此，主鏈為了穩(wěn)定性或其它原因而被修飾的DNA或RNA是該術(shù) 語(yǔ)在本文中所指的“多核苷酸”。另外，包含稀有堿基(例如肌苷)或經(jīng)修飾的堿基(例如 三苯甲基化的堿基)的DNA或RNA是本文所用的術(shù)語(yǔ)多核苷酸。應(yīng)當(dāng)理解，已對(duì)DNA和RNA 進(jìn)行了大量不同的修飾，所述修飾發(fā)揮了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多有用目的。在本文中 使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)多核苷酸包括這些經(jīng)化學(xué)、酶促或代謝修飾的多核苷酸形式，以及病毒和細(xì)胞 的特征性DNA和RNA化學(xué)形式，所述細(xì)胞尤其包括簡(jiǎn)單細(xì)胞和復(fù)雜細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，表示氨基酸殘基的多聚體。 該術(shù)語(yǔ)適用于下述氨基酸多聚體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸 的人工化學(xué)類似物，還適用于天然存在的氨基酸多聚體。天然存在的氨基酸的這類類似物 的關(guān)鍵特征是，當(dāng)摻入蛋白質(zhì)中時(shí)，蛋白質(zhì)與下述抗體特異反應(yīng)，所述抗體針對(duì)相同但是完 全由天然存在的氨基酸組成的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”也包括修飾， 所述修飾包括但不限于糖基化、脂質(zhì)結(jié)合、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y "羧基化、羥基化和 ADP-核糖基 化。序列同一性在本文中被定義為通過(guò)比較序列測(cè)定的兩條或更多氨基酸(多肽或 蛋白質(zhì))序列或兩條或更多核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系。通常，在所比較的序列的 全長(zhǎng)上比較序列同一性。在本領(lǐng)域中，“同性”也表示氨基酸或核酸虛禮之間的序列相關(guān)性 程度，其根據(jù)情況通過(guò)這類序列的字符串之間的匹配測(cè)定。對(duì)測(cè)定同一性的優(yōu)選方法加以設(shè)計(jì)，以在所測(cè)試的序列之間得到最大匹配。測(cè) 定同一性的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼。測(cè)定兩條序列之間同一性和相似 性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序包括 BLASTP、BLASTN(Altschul，S. F. et al.，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)，公眾可從NCBI 和其它來(lái)源獲得(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)。使用BLASTP進(jìn)行氨基酸序列比較的優(yōu)選的參數(shù)為缺口開(kāi) 放11. 0，缺口延伸1，Blosum 62矩陣。本文中編碼多肽的每條核酸序列還通過(guò)遺傳密碼子描述了核酸的每種可能的沉 默變異。術(shù)語(yǔ)“經(jīng)保守修飾的變體”適用于氨基酸和核酸兩種序列。涉及具體的核酸序列時(shí)， 經(jīng)保守修飾的變體表示下述核酸，所述核酸由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性而編碼相同的氨基酸 序列或其經(jīng)保守修飾的變體。術(shù)語(yǔ)“遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性”是指大量功能相同的核酸編碼 任何給定的蛋白質(zhì)的事實(shí)。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此， 在密碼子指定了丙氨酸的每個(gè)位置上，可以將密碼子改變?yōu)樗鋈魏蜗鄳?yīng)的密碼子而不改 變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，其代表一類經(jīng)保守修飾的變異?！氨磉_(dá)”是指基因轉(zhuǎn)錄成為結(jié)構(gòu)RNA (rRNA、tRNA)或信使RNA (mRNA)并隨后翻譯成 為蛋白質(zhì)。在本文中關(guān)于核酸或蛋白質(zhì)使用時(shí)，“異源的”是下述核酸或蛋白質(zhì)，其來(lái)自于外 源物種，或者如果來(lái)自于相同物種時(shí)，通過(guò)有意的人工干預(yù)在組成和/或基因組基因座上 與其天然形式相比被大幅修飾。例如，與異源結(jié)構(gòu)基因可操作地連接的啟動(dòng)子來(lái)自與結(jié)構(gòu) 基因所來(lái)源的物種不同的物種，或者如果來(lái)自于相同物種時(shí)，啟動(dòng)子或異源結(jié)構(gòu)基因之一 或二者與其原始形式相比被大幅修飾。異源蛋白質(zhì)可來(lái)自于外來(lái)物種，或者如果來(lái)自相同物種時(shí)，通過(guò)有意的人工干預(yù)與其原始形式相比被大幅修飾。
在本文中使用時(shí)，“啟動(dòng)子”是指導(dǎo)(結(jié)構(gòu))基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。典型地，啟動(dòng)子 位于基因的5'-區(qū)，接近(結(jié)構(gòu))基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)。啟動(dòng)子序列可以是組成型、誘導(dǎo)型或 阻抑型的。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄速率應(yīng)答誘導(dǎo)劑而提高。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“載體”包括常染色體表達(dá)載體，和用于整合進(jìn)染色體中的 整合載體。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”是指線性或環(huán)形的DNA分子，其包含編碼感興趣的多肽的區(qū)段， 所述區(qū)段位于支持其轉(zhuǎn)錄的額外的核酸區(qū)段的控制下(即與之可操作地連接)。這類額外 的區(qū)段可包括啟動(dòng)子和終止子序列，并可任選地包括一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)可 選擇標(biāo)記物、增強(qiáng)子、多聚腺苷酸化信號(hào)等等。表達(dá)載體一般來(lái)自于質(zhì)?；虿《綝NA，或者可 含有二者的元件。具體地，表達(dá)載體包含以5'到3'方向包含并且可操作地連接的核苷酸 序列(a)酵母識(shí)別的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)，(b)感興趣的多肽的編碼序列，和(c)酵母識(shí)別的 轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)?！百|(zhì)?！笔侵缸灾鲝?fù)制的染色體外DNA，其不被整合進(jìn)微生物的基因組 中，并且通常天然是環(huán)狀的。 “整合載體”是指線性或環(huán)狀的DNA分子，其能夠被摻入微生物的基因組中，并且提 供編碼感興趣的多肽的基因的穩(wěn)定遺傳。整合載體一般包含一個(gè)或多個(gè)區(qū)段(segments)， 所述區(qū)段包括編碼感興趣的多肽的基因序列，所述基因序列位于支持其轉(zhuǎn)錄的額外的核酸 區(qū)段的控制下(與之可操作地連接)。這類額外的區(qū)段可包括啟動(dòng)子和終止子序列，和驅(qū)動(dòng) 感興趣的基因摻入靶細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段，所述摻入通常通過(guò)同源重組過(guò)程實(shí) 現(xiàn)。典型地，整合載體會(huì)是能夠被轉(zhuǎn)移進(jìn)靶細(xì)胞的載體，但是其具有在所述生物中無(wú)功能的 復(fù)制子。當(dāng)區(qū)段中包含適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物時(shí)，可以選擇包含感興趣的基因的區(qū)段的整合。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指一種并置(juxtaposition)，其中所 述組分處于允許它們以期望的方式發(fā)揮作用的關(guān)系中。與另一控制序列和/或與編碼序列 “可操作地連接”的控制序列以下述方式放置，所述方式使得在與控制序列相容的條件下達(dá) 成編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。一般地，可操作地連接表示相連的核酸序列是鄰接的，并且 在需要接合兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)是鄰接的，并處于相同的讀碼框中?！八拗骷?xì)胞”表示含有載體并支持載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以 是原核細(xì)胞例如E. coli,或真核細(xì)胞例如酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選 地，宿主細(xì)胞是放線菌目(Actinomycetales)的細(xì)胞，更優(yōu)選地是酵母細(xì)胞，最優(yōu)選地是 Saccharomyces cerevicsiae 細(xì)胞。在本文中使用時(shí)，轉(zhuǎn)化(〃 Transformation"和〃 transforming")表示將外源 多核苷酸插入宿主細(xì)胞中，而無(wú)論采用什么插入方法，例如直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f_交配或電穿 孔。外源多核苷酸可作為不整合的載體例如質(zhì)粒被維持，或者可以被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因 組中。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指通過(guò)含磷鍵(例如磷酸二酯、烷基和芳基磷酸酯、硫代磷酸 酯、phosphotliester)或無(wú)磷鍵(例如肽、氨基磺酸鹽和其它)接合的核苷酸單體的短序 列(通常為6到100個(gè)核苷酸)。寡核苷酸可含有經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸 具有經(jīng)修飾的堿基(例如5-甲基胞嘧啶)和經(jīng)修飾的糖基(例如2' -0-甲基核糖基、 2' -0-甲氧乙基核糖基、2'-氟核糖基、2'-氨基核糖基等等)。寡核苷酸可以是天然存在的或者合成的雙鏈和單鏈DNA和雙鏈和單鏈RNA分子，其具有環(huán)狀、分支或線性的形狀， 并任選地包含能夠形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域(例如莖_環(huán)和環(huán)-莖-環(huán)結(jié)構(gòu))。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的多聚體形式，無(wú)論是 核糖核苷酸或是脫氧核糖核苷酸。因此，該術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈的DNA和RNA。 在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組多核苷酸”是指基因組、cDNA、半合成或合成起源的多 核苷酸，所述多核苷酸由于其起源或操作而(1)與其天然結(jié)合的多核苷酸的全部或部分 不結(jié)合；或(2)與除了其天然連接的多核苷酸之外的其它多核苷酸連接；或(3)天然不存 在。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“最小培養(yǎng)基”是指化學(xué)上確定的下述培養(yǎng)基，其僅包含所 培養(yǎng)的細(xì)胞存活和增殖所需的營(yíng)養(yǎng)素。典型地，最小培養(yǎng)基不含有支持所培養(yǎng)的細(xì)胞種群 存活和增殖不必需的生物學(xué)提取物，例如生長(zhǎng)因子、血清、垂體提取物或其它物質(zhì)。例如， 最小培養(yǎng)基一般含有以下作為必需物質(zhì)至少一種碳源，例如葡萄糖；至少一種氮源，例如 銨、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨或尿素；無(wú)機(jī)鹽，例如磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和硫酸鎂；和其 它營(yíng)養(yǎng)素，例如生物素和維生素。優(yōu)選的實(shí)施方案的描述本發(fā)明的一種方法提供了鑒定能夠在酵母細(xì)胞的胞質(zhì)溶膠中生產(chǎn)乙酰-CoA的異 源酶的方法。異源酶能夠使用丙酮酸、乙醛或乙酸作為底物生產(chǎn)乙酰-CoA，優(yōu)選地在單一的 轉(zhuǎn)化步驟中進(jìn)行。優(yōu)選地，異源酶從乙醛生產(chǎn)乙酰-CoA。能夠催化所述反應(yīng)的一種酶是乙酰 基化乙醛脫氫酶(acdh ；E. C. 1. 2. 1. 10)，也稱作乙醛NAD+氧化還原酶(CoA-乙?；?。 乙醛通過(guò)乙?；胰┟摎涿赋蔀橐阴?CoA的轉(zhuǎn)化是可逆的，并且當(dāng)乙醛在胞質(zhì)溶膠中 累積時(shí)朝乙酰-CoA的方向進(jìn)行。這樣的累積可以例如通過(guò)醇脫氫酶(adh ;E. C. 1. 1. 1. 1) 的缺失來(lái)實(shí)現(xiàn)。異源酶也可以從丙酮酸生產(chǎn)乙酰-CoA。能夠催化所述反應(yīng)的一種酶是丙酮 酸NADP氧化還原酶(pn0 ；E. C. 1. 2. 1. 51)。該反應(yīng)在化學(xué)計(jì)量上與線粒體丙酮酸脫氫酶 相同，不同之處在于與使用NADH的PDH相比，pno使用NADPH作為輔因子。與acdh相比， pno酶體系的一個(gè)重要缺點(diǎn)是pno是氧敏感的，并且其為大的多體酶，因此其成功的遺傳摻 入(5_6kb基因)比acdh的遺傳摻入難得多。為此，在本發(fā)明的實(shí)施方案中優(yōu)選使用acdh。能夠顯示想要的測(cè)試多肽酶活性的測(cè)試細(xì)胞的一個(gè)重要特性是，所述細(xì)胞由于引 入的多肽而是原營(yíng)養(yǎng)型的。這表示細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求不超過(guò)相應(yīng)的野生型菌株，并且其會(huì)在 最小培養(yǎng)基上增殖(與營(yíng)養(yǎng)缺陷型相反)。事實(shí)上，測(cè)試多肽所支持的乙酰-CoA的生產(chǎn)會(huì)取 消所述至少一個(gè)PDH旁路基因缺失的影響，所述缺失由丙酮酸脫羧酶(pdc ；E. C. 4. 1. 1. 1)、 乙醛脫氫酶(aid ；Ε. C. 1. 2. 1. 3、Ε. C. 1. 2. 1. 4 或 Ε. C. 1. 2. 1. 5)或乙酰-CoA 合成酶(acs ； E.C.6.2. 1. 1)的缺失引起。這樣的補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域公知的。在本發(fā)明的方面中，使用所 述實(shí)驗(yàn)鑒定能夠在酵母細(xì)胞中維持胞質(zhì)乙酰-CoA生產(chǎn)的異源酶的合適來(lái)源。補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)以提供替代性途徑以克服缺失的PDH旁路酶活性為基礎(chǔ)。用于在酵母 中達(dá)成基因缺失的方法是本領(lǐng)域公知的，并且可以例如通過(guò)寡核苷酸介導(dǎo)的誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)。 使用帶有l(wèi)oxP-kanMX-loxP基因斷裂盒的質(zhì)粒pUG6可以獲得良好的結(jié)果(Gilldener et al. [1996]Nucleic Acids Res. 24(13) :2519_24 ；GenP印t 登錄號(hào) P30114)。因此，技術(shù)人員 會(huì)能夠提供下述酵母菌株，所述菌株缺失了乙醛脫氫酶和/或乙酰-CoA合成酶，從而阻斷其中的PDH旁路。Saccharomyces cerevisiae 包含兩種乙酷一CoA 合成醇同種型Acslp 禾口Acs2p。 二者均為用于組蛋白乙酰化的乙酰-CoA核來(lái)源。胞質(zhì)乙酰-CoA的生產(chǎn)也是脂質(zhì)生產(chǎn)所需 要的。Acs活性是必需的，因?yàn)閍csl acs2雙無(wú)效突變體是不能存活的。在乙醇作為唯一碳 源時(shí)，acsl無(wú)效突變體能夠生長(zhǎng)。在本發(fā)明方面中使用的突變的酵母細(xì)胞優(yōu)選地具有acs2 基因失活。帶有acs2基因失活的Saccharomyces cerevisiae突變體不能在葡萄糖作為唯一 碳源時(shí)生長(zhǎng)，因?yàn)锳CSl被阻抑并且蛋白質(zhì)被有效降解。用基于質(zhì)粒的acs基因補(bǔ)足這樣的 Aacs2突變體會(huì)重建細(xì)胞在葡萄糖作為單一碳源時(shí)生長(zhǎng)的能力。另外，通過(guò)表達(dá)下述基因 補(bǔ)足了這樣的突變體的生長(zhǎng)，所述基因支持用于生產(chǎn)足量胞質(zhì)乙酰-CoA的替代性途徑。因 此，用下述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Aacd突變體會(huì)重建突變體在葡萄糖作為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)的能力，從 所述質(zhì)粒能夠表達(dá)功能性(異源)acdh或pno。應(yīng)當(dāng)理解，除了去除ACS2基因座以外，也 可以去除ACSl基因座，盡管相信這在一些情況下可以防止回復(fù)體的產(chǎn)生(ACS1基因座中的 突變導(dǎo)致AaCS2表型的回復(fù))，但是發(fā)現(xiàn)這不是必需的。雙重突變體(aCSl/aCS2A菌株) 應(yīng)當(dāng)完全依賴于引入的用于生產(chǎn)胞質(zhì)乙酰-CoA的acdh或pno基因。本發(fā)明的補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是其可以作為平板篩選實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，其中成功的 補(bǔ)足作為菌落生長(zhǎng)被觀察到。這比需要分析想要的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)快得多。為了對(duì)突變加以補(bǔ)足，用合適的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化aid和/或acs基因失活的酵母細(xì) 胞，所述表達(dá)載體包含異源測(cè)試多肽的核苷酸序列。酵母表達(dá)載體可廣泛得自多種供應(yīng)商。迄今為止，通過(guò)外來(lái)同源物對(duì)酵母突變的 功能性補(bǔ)足已經(jīng)成為Saccharomyces cerevisiae改造中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。用于異源基因的合 適表達(dá)載體可基于人工的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如GAL啟動(dòng)子，但是優(yōu)選地基于組成型啟動(dòng)子， 例如TDH3啟動(dòng)子。合適的體系在下文實(shí)施例中舉例。在某些生產(chǎn)體系中，可優(yōu)選誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子的使用，因?yàn)檫@會(huì)允許在時(shí)間上分開(kāi)用于生物質(zhì)生產(chǎn)(啟動(dòng)子未被誘導(dǎo))和發(fā)酵產(chǎn)物 生產(chǎn)(啟動(dòng)子被誘導(dǎo))的階段。在另一高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，在某些生產(chǎn)體系中，載體是 用于將異源基因穩(wěn)定整合進(jìn)酵母生產(chǎn)菌株基因組中的整合載體。為了實(shí)現(xiàn)在酵母中的最優(yōu)表達(dá)，可以通過(guò)使用多種合成基因設(shè)計(jì)軟件包之任一來(lái) 優(yōu)化異源基因的密碼子(對(duì))選擇，所述軟件包例如W02008/000632中所述用于密碼子選 擇優(yōu)化或密碼子對(duì)選擇優(yōu)化的來(lái)自Geneart AG(Regensburg，德國(guó))的GeneOptimizer 。 密碼子選擇的這適應(yīng)確保(例如細(xì)菌起源的)異源基因被酵母轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制有效地加 工。密碼子對(duì)選擇的優(yōu)化會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞中增強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)。經(jīng)優(yōu)化的序列可以例如被克隆進(jìn)高拷貝酵母表達(dá)質(zhì)粒中，與在酵母中有功能的 (優(yōu)選地組成型)啟動(dòng)子可操作地連接。使用質(zhì)粒YEplacll2(2yTRPl)獲得了良好的結(jié)果 (Gietz & Sugino[1988]Gene 74(2) :527_34)?？梢栽谛酒翔b定編碼下述候選多肽的異源基因，所述候選多肽具有將丙酮酸、 乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的潛在酶活性。被描述為具有將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的能力 的合適酶是乙?；胰┟摎涿?E. C. 1. 2. 1. 10)。來(lái)自多種微生物起源的超過(guò)200種這些 酶的核苷酸和氨基酸序列描述于多種數(shù)據(jù)庫(kù)中(例如KEGG(Kyotc) Encyclopedia of Genes andGenomes)數(shù)據(jù)庫(kù))。
本發(fā)明的發(fā)明人選擇了若干種乙?；胰┟摎涿?，并在本發(fā)明的基于Aacs2 突變體的實(shí)驗(yàn)體系中測(cè)試了這些酶。當(dāng)密碼子對(duì)選擇被優(yōu)化時(shí)，其中許多(盡管不是全部) 在S. cerevisiae中有功能。這些蛋白質(zhì)的功能性同源物也可以用于本發(fā)明的方面中。在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ) “功能性同源物”是指包含SEQ ID NO :19、22、25的氨基酸序列或SEQ ID NOs 28和52的 乙醛脫氫酶部分的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替代、缺失、添加和/或插入，并且所 述蛋白質(zhì)具有相同的用于底物轉(zhuǎn)化的酶功能，例如乙?；胰┟摎涿竿次锬軌?qū)⒁胰?轉(zhuǎn)化為乙酰_CoA。該功能可以通過(guò)使用下述實(shí)驗(yàn)體系測(cè)試，并使用所述實(shí)驗(yàn)體系如本文所 述進(jìn)行鑒定在酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶 活性的異源多肽的方法，所述實(shí)驗(yàn)體系包含重組的酵母細(xì)胞，所述重組的酵母細(xì)胞包含用 于在酵母中表達(dá)同源物的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與在酵母中有功能的啟動(dòng)子可操作 地連接的異源核苷酸，并且所述異源核苷酸序列編碼在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具 有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰CoA的酶活性的同源多肽?？梢酝ㄟ^(guò)使用芯片上的相 似性分析鑒定候選同源物。這類分析的一個(gè)詳細(xì)的例子描述于下文實(shí)施例2中。技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)能夠從其中獲知如何尋找合適的同源物，并且任選地在密碼子(對(duì))優(yōu)化后，應(yīng)當(dāng)能夠 如上所述使用本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)體系測(cè)試這類候選同源物的所需要的功能。合適的同源物代表 了下述蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)與乙?；胰┟摎涿妇哂卸嘤?0%，優(yōu)選地多于60%，更優(yōu) 選地多于70%、80%、90%或更多氨基酸序列同一性，例如與SEQ ID NOs :19、22、25或SEQ ID NOs :28和52的乙醛脫氫酶部分具有這樣的氨基酸序列同一性，并具有將乙醛轉(zhuǎn)化為乙 酰-CoA所需的酶功能。類似地，與上文針對(duì)乙酰基化乙醛脫氫酶所述的 相似，也可以使用 被描述為直接將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶及其功能性同源物，以及被描述為將乙酸轉(zhuǎn) 化為乙酰-CoA的酶及其功能性同源物。本發(fā)明的方法還包括下述步驟測(cè)試突變的和用測(cè)試蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在含 葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。如前文所述，這可以在培養(yǎng)皿(平板) 中的固體(瓊脂)培養(yǎng)基上合適地進(jìn)行，其中生長(zhǎng)可以作為菌落的生長(zhǎng)被觀察到，但是液體 培養(yǎng)基也同樣合適，并且可以通過(guò)濁度檢測(cè)生長(zhǎng)。也可以使用用于測(cè)定突變的和用測(cè)試蛋 白質(zhì)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在含葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的其它方法。當(dāng)突變的和用測(cè)試蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞能夠在含葡萄糖的最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 時(shí)，候選多肽被成功地鑒定為在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸 轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的異源多肽。生長(zhǎng)可以合適地被觀察為固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基，尤其是 含葡萄糖的最小培養(yǎng)基上的菌落形成。根據(jù)本發(fā)明，用于在酵母中表達(dá)異源多肽的表達(dá)載體可以是適用于轉(zhuǎn)化酵母的 任何表達(dá)載體。在本領(lǐng)域中可以獲得能夠適當(dāng)?shù)乇挥糜谠诮湍钢斜磉_(dá)異源核苷酸序列 的無(wú)數(shù)例子。一種在本發(fā)明的方面中非常合適的載體是質(zhì)粒。一種高度優(yōu)選的質(zhì)粒是 YEplacl12PtdhTadh(SEQ ID NO :40)。通常，編碼下述多肽的異源核苷酸序列會(huì)被置于在酵母中有功能的啟動(dòng)子的控制 下，所述多肽在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰COA 的酶活性。優(yōu)選地，啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子。質(zhì)粒YEplaC112PtdhTadh上的啟動(dòng)子是TDH3 啟動(dòng)子。
插入本發(fā)明的表達(dá)載體中的異源核苷酸序列可以是任何pno、acdh或在酵母的胞 質(zhì)溶膠中能夠?qū)⒈?、乙醛或乙?分別)轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的其它酶。優(yōu)選的核苷酸序 列是本文中鑒定的核苷酸序列，即編碼以下的核苷酸序列-來(lái)自E.coli HS的乙醇胺利用蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 18)；-來(lái)自L.innocua的與乙醇胺利用蛋白質(zhì)EutE相似的假定蛋白質(zhì)Linll29(SEQ ID NO 21)，
-來(lái)自Clostridium kluyveri DSM 555 的乙酸脫氫酶 EDK33116 (具有 SEQ ID NO: 24的核苷酸序列)；和-編碼 Staphylococcus aureus subsp. aureus N315 中雙功能乙Il / 醇脫S1BI的 S. aureus的adhE同源物(具有SEQ ID NO 27的核苷酸序列)，或其乙醛脫氫酶功能性部 分。-編碼雙功能醛/醇脫氫酶的Piromycessp. E2的adhE同源物(核苷酸序列SEQ ID N0:51)或其乙醛脫氫酶部分。這些核苷酸序列的功能性同源物或它們所編碼的多肽也是合適的。該術(shù)語(yǔ)表示與 編碼上述acdh酶的核苷酸序列具有多于80%、90%或95%序列同一性的核酸序列，或者與 上述acdh酶的氨基酸序列具有多于50 %，優(yōu)選地多于60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的序列 同一性，條件是同源序列編碼的多肽顯示功能性酶acdh活性。如上文所述，可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的密碼子對(duì)選擇優(yōu)化，針對(duì)在Saccharomyces cerevisiae中的表達(dá)來(lái)優(yōu)化這些核苷酸序列。SEQ IDNO :18、21、24和27的經(jīng)密碼子對(duì)優(yōu) 化的序列分別在SEQ ID NO :20、23、26和29中提供。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化方法包括電穿孔、玻璃珠和生 物彈轉(zhuǎn)化，其均為本領(lǐng)域公知的，并且例如描述于Sambrook etal.，Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd ed. , Vol. 1-3(1989)中。根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞包含編碼下述多肽的異源核苷酸序列，所述多肽在所述酵 母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性。優(yōu)選地， 本發(fā)明的酵母細(xì)胞包含異源acdh或pno。這樣的酵母細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是其能夠通過(guò)不需要PDH 旁路的代謝途徑生產(chǎn)乙酰_CoA。這在厭氧條件下在能量方面更加有利，并且可以形成其中 乙酰-CoA為中間產(chǎn)物的在厭氧條件下使用酵母細(xì)胞的任何生物學(xué)合成過(guò)程的基礎(chǔ)。除了 包含異源acdh或pno以外，本發(fā)明的酵母細(xì)胞可包含多種基因缺失或基因補(bǔ)充，這取決于 酵母的預(yù)期用途。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞包含編碼下述酶的核苷酸序列(基因)的失活從 而例如優(yōu)化酵母細(xì)胞中的乙醛累積，所述酶能夠催化乙醛轉(zhuǎn)化成為乙醇，優(yōu)選地為醇脫氫酶。如果在根據(jù)本發(fā)明的篩選異源酶的方法中使用，則酵母細(xì)胞包含至少一個(gè)(PDH) 旁路基因的缺失，所述基因選自編碼以下酶的基因丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶 (ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)，優(yōu)選地為乙酰-CoA合成酶，最優(yōu)選地為acs2。如果在生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法中使用，則酵母細(xì)胞可任選地包含支持從乙酰-CoA 到所述丁醇的代謝通路的大量(異源)基因補(bǔ)充。這樣的通路可僅由異源基因產(chǎn)物組成，或 者可利用異源和同源基因產(chǎn)物的混合物。在發(fā)酵產(chǎn)物是丁醇的情況下，可以利用包含下述基因的酵母，所述基因編碼例如Clostridium acetobutylicum的丁醇通路的酶，如本文和 圖2中所述。在根據(jù)本發(fā)明的酵母細(xì)胞包含編碼丁醇生產(chǎn)酶的基因的情況下，酵母優(yōu)選地 包含編碼丁?；?CoA脫氫酶的核苷酸序列，和至少一種編碼異源電子傳遞黃素蛋白(ETF) 的核苷酸序列。發(fā)現(xiàn)除了丁醇通路的基因以外包含ETF的酵母細(xì)胞產(chǎn)生更大量的乙醇。根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞中的異源電子傳遞黃素蛋白可以是單種蛋白質(zhì)，或者 ETF可包含兩個(gè)或更多亞基，例如α亞基和β亞基。優(yōu)選地，ETF包含ETF α (SEQ ID NO: 38)和ETF β (SFQ ID NO :39)。電子傳遞黃素蛋白可來(lái)自于任何合適的起源。優(yōu) 選地，ETF來(lái)自于與丁酰基-CoA脫氫酶相同的起源。優(yōu)選地，ETF來(lái)自于原核生物起 源，優(yōu)選地來(lái)自于 Clostridium sp.,優(yōu)選地來(lái)于 Clostridium acetobutylicum 或 Clostridiumbeijerinckii ο生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法優(yōu)選地包括在厭氧條件下在合適的 碳和能量來(lái)源上培養(yǎng)酵母。合適的碳和能量來(lái)源是C5和06糖(單糖)例如葡萄糖，和多 糖例如淀粉。其它原料例如甘蔗、玉米、小麥、大麥、甜菜、油菜籽和向日葵也是合適的。在 一些情況下，原料可以通過(guò)酶處理被預(yù)消化。最優(yōu)選地，碳源是木質(zhì)纖維素，其主要由纖維 素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素組成。木質(zhì)纖維素存在于例如植物的莖、葉、莢(hull)、外殼 (husk)和穗軸(cob)中。通過(guò)特異的酶處理水解這些多聚體，釋放了中性糖的混合物，所述 中性糖包括葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖利阿拉伯糖?？梢允褂媚举|(zhì)纖維素材料生產(chǎn)丁醇， 所述木質(zhì)纖維素材料例如木材、草本材料、農(nóng)業(yè)殘余物、玉米纖維、廢紙、紙漿和紙粉碎殘余 物(paper mill residue)。水解酶例如是用于水解纖維素的β-連接的葡聚糖(這些酶包 括內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、葡萄糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)；β-葡萄糖苷酶水解 纖維二糖；用于水解半纖維素的、內(nèi)切作用和外切作用的半纖維素酶和纖維二糖酶，和水解 木質(zhì)素糖苷鍵的乙酰脂酶和酯酶。用于水解木質(zhì)纖維素的這些方法和其它方法是本領(lǐng)域公 知的。本文公開(kāi)的實(shí)施方案的變更和修飾是可能的，并且在學(xué)習(xí)本專利義件后，本領(lǐng)域 常規(guī)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解所述實(shí)施方案的實(shí)踐替代方式和多種元素的等同物?？梢詫?duì)本文公 開(kāi)的實(shí)施方案進(jìn)行這些和其它變更和修飾，而不偏離本發(fā)明的范圍和思想。本發(fā)明接著將通過(guò)以下的非限制性實(shí)施例闡述。
實(shí)施例以下的實(shí)施例闡述了 Saccharomyces cerevisiae菌株的提供，所述菌株適用于 本發(fā)明的測(cè)定法和方法，例如適用于鑒定在S. cerevisiae中能夠形成胞質(zhì)乙酰-CoA的 異源酶的方法。這類方法在途徑/酶的鑒定中有用，所述酶/途徑允許在缺氧條件下在 S. cerevisiae中胞質(zhì)提供乙酰-CoA。為了增強(qiáng)我們的丁醇生產(chǎn)菌株中胞質(zhì)乙酰-CoA的形成，我們建立了鑒定在 S. cerevisiae中形成胞質(zhì)乙酰-CoA的異源酶的選擇方法。測(cè)試體系基于在葡萄糖上胞 質(zhì)乙酰-CoA生物合成不足的AaCS2酵母突變體，這類菌株不能在葡萄糖作為唯一碳源 時(shí)生長(zhǎng)，除非補(bǔ)充胞質(zhì)乙酰-CoA。在這類菌株中的補(bǔ)足研究能夠揭示哪些異源酶適用于 Saccharomyces cerevisiae 的丁酉享生產(chǎn)菌株。因?yàn)椴焕速M(fèi)ATP，所以乙酰基化乙醛脫氫酶被鑒定為優(yōu)于同源PDH旁路的胞質(zhì)乙酰-CoA供應(yīng)?；谛蛄型葱澡b定的十二種推定的乙?；胰┟摎涿副缓铣?，并針對(duì) Aacs2酵母的補(bǔ)足進(jìn)行檢驗(yàn)。E. coli、L. innocua 禾口 C. kluyveri 的 eutE 同源物禾口 S. aureus 的 adhE 同源物的密 碼子對(duì)經(jīng)優(yōu)化的基因能夠補(bǔ)充acs2酵母突變體(7個(gè)中的4個(gè))，導(dǎo)致acs2 Δ S. cerevisiae 宿主的生長(zhǎng)。目的是通過(guò)表達(dá)藉此鑒定的一種或多種基因，在酵母中促進(jìn)丁醇生物合成。為了測(cè)試胞質(zhì)乙酰-CoA供應(yīng)的這些異源途徑是否能夠在S. cerevisiae中作用， 以帶有acs2基因缺失的Saccharomyces cerevisiae突變體為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)了篩選體系。這些 細(xì)胞不能在葡萄糖作為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)，除非用基于質(zhì)粒的acs基因補(bǔ)充或者用產(chǎn)生足量 胞質(zhì)乙酰-CoA的任何其它基因補(bǔ)充AaCS2突變體。因此，如果要用導(dǎo)致acdh或pno活性 表達(dá)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，則這樣的突變體應(yīng)當(dāng)能夠再次在葡萄糖作為單一碳源時(shí)生長(zhǎng)。補(bǔ)足研究 在平板上進(jìn)行。進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)建立和評(píng)價(jià)測(cè)試體系。實(shí)施例lAacs2菌株的構(gòu)建 首先用以下寡核苷酸對(duì)質(zhì)粒pUG6 (GUldener et al.，1996，上文)進(jìn)行PCR，產(chǎn)生 S. cerevisiae acs2 缺失的菌株(acs2 Δ 菌株)5' acs2Kanlox 5，—tacacaaacagaatacaggaaagtaaatcaatacaataataaaacagc tgaagcttcgtacgc-3，3' acs2Kanlox 5' -tctcattacgaaatttttctcatttaagttatttctttttttgaggca taggccactagtggatctg-3 ‘。使用得到的1. 4kb 片段轉(zhuǎn)化 S. cerevisiae CEN. PKll3_3C(MATA trpl-289)，所 述片段含有賦予G418抗性的KanMX標(biāo)記物。轉(zhuǎn)化后將菌株涂布于含200mg/ml遺傳霉素 (G418)的 YPD(IOgr1 酵母提取物(BD Difco) JOgl—1 蛋白胨(BD Difco)、lOgl—1 葡萄糖) 上。在抗性轉(zhuǎn)化體中，使用以下寡核苷酸通過(guò)PCR驗(yàn)證正確的整合5' ACS2 5' -gatattcggtagccgattcc-3‘3' ACS2 5' _ccgtaaccttctcgtaatgc_3‘ACS2 內(nèi)部5' _cggattcgtcatcagcttca_3‘KanA 5 ‘ -cgcacgtcaagactgtcaag-3‘KanB :5' -tcgtatgtgaatgctggtcg-3‘通過(guò)測(cè)試在含1 %葡萄糖(YPD)或1 %乙醇+1 %甘油(YPEG)作為碳源的YP上的 生長(zhǎng)來(lái)驗(yàn)證表型。挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化體并命名為RWB060(MATA trpl_289acs2 :Kanlox)，所述轉(zhuǎn)化體具 有正確的PCR條帶，并且在含葡萄糖的YP上不生長(zhǎng)但是在含乙醇和甘油作為碳源的YP上 生長(zhǎng)。實(shí)施例2在芯片上針對(duì)乙醛成為乙酰-CoA的IH確轉(zhuǎn)化鑒定推定的乙酰基化乙醛 脫氫酶描述用于將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶是所謂的乙?；胰┟摎涿?ACDH) (E. C. 1.2. 1.10)，其催化以下反應(yīng)乙醛(AA)+NAD++CoA< = > 乙酰-CoA+NADH+H+文獻(xiàn)中描述了具有該活性的四種蛋白質(zhì)1)雙功能蛋白質(zhì)，其催化乙酰-CoA成為乙醛的可逆轉(zhuǎn)化，以及隨后的乙醛成為乙醇的可逆轉(zhuǎn)化。這類蛋白質(zhì)的一個(gè)例子是E. coli中的AdhE蛋白質(zhì)(GenBank No: NP_415757)。AdhE似乎是基因融合的進(jìn)化產(chǎn)物。AdhE蛋白質(zhì)的NH2-末端區(qū)域與乙醛NAD+ 氧化還原酶高度同源，而COOH-末端與Fe2+-依賴性的乙醇NAD+氧化還原酶家族同源 (Membrillo-Hernandez et al. , (2000)J. Biol. Chem. 275 :33869_33875)。 E.coli AdhE 受到金屬催化的氧化，因此其是對(duì)氧敏感的(Tamarit et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 3027-32)。
2)蛋白質(zhì)，其在嚴(yán)格厭氧或兼性厭氧的微生物中催化乙酰-CoA成為乙醛的可 逆轉(zhuǎn)化，但是不具有醇脫氫酶活性。這類蛋白質(zhì)的一個(gè)例子已在Clostridium kluyveri 中報(bào)道(Smith et al. (1980) Arch. Biochem. Biophys. 203 663-675) 在 Clostridium kluyveri DSM 555基因組中已注釋了一種乙?；胰┟摎涿?GenBank No :EDK33116)。 在 Lactobacillus plantarum基因組中鑒定了同源蛋白質(zhì) AcdH(GenBank No :NP_784141)。 這類蛋白質(zhì)的另一個(gè)例子是Clostridium beijerinckii NRRL B593中的aid基因產(chǎn)物 (Toth et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65 4973-4980, GenBank No :AAD31841)。3)涉及乙醇胺分解代謝的蛋白質(zhì)。乙醇胺可以被許多腸道細(xì)菌作為碳源和氮源二 者利用(Stojiljkovic et al. (1995) J. Bacteriol. 177 1357-1366)。乙醇胺首先被乙醇胺 氨裂合酶轉(zhuǎn)化為氨和乙醛，隨后乙醛被乙?；胰┟摎涿皋D(zhuǎn)化為乙酰_CoA。這類乙?；?化乙酸脫氫酶的一個(gè)例子是Salmonellatyphimurium中的EutE蛋白質(zhì)(Stojiljkovic et al. (1995) J. Bacteriol. 177 1357-1366，GenBank No :AAL21357)。Ε. coli 也能夠利用乙醇 胺(Scarlett ctal. (1976) J. Gen. Microbiol. 95 173-176)，并且具有與 S. typhimurium 中 的EutE蛋白質(zhì)同源的EutE蛋白質(zhì)(GenBank No :AAG57564)。4)蛋白質(zhì)，其為涉及4-羥基-2-酮戊酸鹽/酯(4-hydrOXy-2-ketOValerate)代 謝的雙功能醛縮酶_脫氫酶復(fù)合物的部分。這類雙功能酶催化兒茶酚的間位切割通路的最 后兩個(gè)步驟，所述兒茶酚是許多微生物物種中苯酚、甲苯、萘、聯(lián)苯和其它芳香族化合物的 降解中的中間產(chǎn)物(Powlowski andShingler (1994) Biodegradation 5,219-236) 4-羥 基-2-酮戊酸鹽/酯首先通過(guò)4-羥基-2-酮戊酸鹽/酯醛縮酶被轉(zhuǎn)化為丙酮酸和乙醛，隨 后乙醛被乙?；胰┟摎涿皋D(zhuǎn)化為乙酰_CoA。這類乙?；胰┟摎涿傅囊粋€(gè)例子是 Pseudomonas sp CF600 中的DmpF蛋白質(zhì)(GenBank No :CAA43226) (Shingler et al. (1992) J. Bacteriol. 174 :711_24)。Ε. coli 具有與 Pseudomonassp. CF600 中的 DmpF 蛋白質(zhì)同 源的 MphF 蛋白質(zhì)(Ferrcindez et al. (1997) J. Bacteriol. 179 2573-2581, GenBank No: NP_414885)。為了鑒定乙?；胰┟摎涿傅牡鞍踪|(zhì)家族成員，使用默認(rèn)參數(shù)，在針對(duì)GenBank 非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTp搜索中，作為查詢序列運(yùn)行E. coli雙功能AdhE蛋白 質(zhì)(GenBank No :NP_415757)、L. plantarum AcdH 蛋白質(zhì)(乙酰基化)(GenBank No :NP 784141)、Ε. coli EutE 蛋白質(zhì)(GenBank No :AAG57564)和 Ε. coli MhpF 蛋白質(zhì)(GenBank No :NP_414885)的氨基酸序列。提取E-值小于或等于le_20的氨基酸序列。去除冗余序 列，比對(duì)剩余的序列，并使用6. 5. 2版Genedata Physolopher蛋白質(zhì)分析儀軟件建立相似 性樹(shù)形圖。相似性樹(shù)形圖提供了生物序列相似性的信息。該樹(shù)形圖通過(guò)每個(gè)殘基位置上氨 基酸序列的成對(duì)比較創(chuàng)建，與ClustalW算法無(wú)關(guān)。在每個(gè)位置上，相似性被分級(jí)并加和，得 到每個(gè)序列對(duì)的總體評(píng)分。以這些成對(duì)評(píng)分為基礎(chǔ)，進(jìn)行了分級(jí)聚類，所述分級(jí)聚類將序列排列在樹(shù)形圖中。注意，C. beijerinckii的aid基因產(chǎn)物(GenBank no :AAD31841)與來(lái)自 Ε. coli和S. typhimurium的EutE蛋白質(zhì)聚類在一起。從該相似性樹(shù)形圖中可以定義四個(gè) 主要的分支，每個(gè)分支含有被用作BLASTp搜索的查詢序列的一條氨基酸序列。圖4顯示這 類相似性樹(shù)形圖的一個(gè)例子，其含有該實(shí)施例中提到的所有序列。從每個(gè)分支中至少選擇一條氨基酸序列用于S.cerevisiaeAacd的補(bǔ)足測(cè)試 中。優(yōu)選地，所選擇的氨基酸序列具有其作為乙?；胰┟摎涿傅纳锘瘜W(xué)功能的實(shí)驗(yàn) 證據(jù)。這類證據(jù)可存在于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，例如BRENDA、UniProt和NCBI Entrez數(shù)據(jù)庫(kù)中。
實(shí)施例3表汰質(zhì)粒的構(gòu)津和補(bǔ)足測(cè)試為了測(cè)試乙酰基化乙醛脫氫酶(ACDH)是否能夠補(bǔ)足S. cerevisiae中ACS2的缺 失，從如上所述的多種數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇編碼(推定的)ACDH的若干基因。為了在酵母中達(dá)到最優(yōu)表達(dá)，通過(guò)密碼子對(duì)優(yōu)化使所有基因的密碼子選擇適應(yīng)。 這些序列由Geneart AG (Regensburg，德國(guó))合成。將經(jīng)優(yōu)化的序列克隆進(jìn)高拷貝酵母表達(dá)質(zhì)粒YEplacll2PtdhTadh(SEQ ID NO 40 ； 以 YEplacl 12 為基礎(chǔ)(2 μ TRP1) (Gietz & Sugino [1988]Gene 74(2) 527-34)中，允許TDH3 啟動(dòng)子引起的組成型表達(dá)。通過(guò)將來(lái)自p426GPD (Mumberg et al. [1995]Gene. 156(1) 119-22)的 KpnI-SacI 片段克隆進(jìn)用 KpnI-SacI 切割的 YEplacl 12 中，制造 YEplacl 12PtdhTadh，所述 KpnI-SacI 片段含有TDH3啟動(dòng)子和CYCl終止子。用KpnI和SphI切割得到的質(zhì)粒并將末端填平，然 后連接得到 YEplacll2TDH。為 了獲得 YEplacll2PtdhTadh，用 PstI-HindIII 切割 YEplac 112TDH并與含有ADHl終止子(Tadh)的345bp PstI-HindIII PCR片段連接，由此代替CYCl 終止子并改變啟動(dòng)子和終止子之間的多聚接頭。使用以下的寡核苷酸產(chǎn)生Tadh PCR片段MCS-S^Tadh 5' —aaggtacctctagactagtcccgggctgcagtcgactcgagcgaatttcttatg atttatgatt-3‘Tadhl-Hind 5' -aggaagcttaggcctgtgtggaagaacgattacaacagg-3‘根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)，用VentK DNA聚合酶完成PCR。用SpeI-PstI切割含有A⑶H基因的合成構(gòu)建體，并連接進(jìn)用相同酶消化的 YEplacl 12PtdhTadh中，得到pB0L058到pB0L068和pB0L082。最終質(zhì)粒的名稱和它們所含 有的基因在表1中給出。表1 針對(duì)AaCS2 S. cerevisiae菌株的補(bǔ)足所測(cè)試的推定的乙?；胰┟摎?酶的概況。導(dǎo)致補(bǔ)足的基因用黑體給出。提供了野生型基因的DNA序列、由其表達(dá)的蛋白 質(zhì)和經(jīng)密碼子對(duì)優(yōu)化的DNA序列的SEQ IDNOs。表權(quán)利要求
鑒定下述異源多肽的方法，所述異源多肽在酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰 CoA的酶活性，所述方法包括 提供突變的酵母細(xì)胞，其中所述突變包括至少一種(PDH)旁路基因的失活，所述基因選自編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰 CoA合成酶(ACS)的基因； 用下述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述突變的酵母細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含與酵母中有功能的啟動(dòng)子可操作地連接的至少一種異源核苷酸序列，并且所述異源核苷酸序列編碼具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰 CoA的潛在酶活性的候選多肽； 針對(duì)在含葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，測(cè)試所述重組突變的酵母細(xì)胞，和 當(dāng)觀察到所述細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)，將所述候選多肽鑒定為具有在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰 CoA的酶活性的異源多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述酵母細(xì)胞是Saccharomycescerevisiae的細(xì)胞，并 且其中，針對(duì)在Saccharomyces cerevisiae中表達(dá)，對(duì)所述異源核苷酸序列進(jìn)行了密碼子 對(duì)優(yōu)化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述突變包括乙酰-CoA合成酶同利型2(acs2)的基因 的失活。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中所述具有將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活 性的候選多肽是(推定的)乙?；胰┟摎涿?acdh)。
5.用于在酵母中表達(dá)異源多肽的載體，所述載體包含與在酵母中有功能的啟動(dòng)子可操 作地連接的異源核苷酸序列，并且所述異源核苷酸序列編碼具有在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì) 溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的載體，其中通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法鑒定具有將丙 酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的所述多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的載體，其中所述多肽與選自SEQID NO :19、22、25、28和52的 氨基酸序列具有多于50 %，優(yōu)選地多于60 %、70 %、80 %、90 %或95 %的序列同一性。
8.用于在Saccharomycescerevisiae中表達(dá)的、根據(jù)權(quán)利要求5到7中任一項(xiàng)的載 體，其中針對(duì)在Saccharomyces cerevisiae中的表達(dá)，對(duì)所述異源核苷酸序列進(jìn)行了密碼 子對(duì)優(yōu)化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述異源核苷酸序列選自SEQIDN0:20、23、26、29 和51。
10.包含權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的載體的重組酵母細(xì)胞。
11.包含下述異源核苷酸序列的重組酵母細(xì)胞，所述異源核苷酸序列編碼具有在所述 酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的酵母細(xì)胞，其還包含至少一種(PDH)旁路基因的失活，所 述基因選自編碼酶丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基 因。
13.根據(jù)權(quán)利要求10到12中任一項(xiàng)的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞包含編碼乙 酰-CoA合酶的基因的失活。
14.根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一項(xiàng)的酵母細(xì)胞，其中所述細(xì)胞顯示出在含有葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求10到14中任一項(xiàng)的酵母細(xì)胞，其還包含編碼催化乙醛向乙醇的轉(zhuǎn)化 的酶的基因的失活，優(yōu)選地為醇脫氫酶。
16.根據(jù)權(quán)利要求10到15中任一項(xiàng)的酵母細(xì)胞，其還包含一種或多種引入的基因，所 述基因編碼用于從乙酰-CoA形成1- 丁醇的重組通路。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的酵母細(xì)胞，其中所述一種或多種引入的基因編碼生產(chǎn)乙酰乙酰 基-CoA、3-羥基丁?；?CoA、丁烯?；?CoA、丁?；?CoA、丁醛和/或1- 丁醇的酶。
18.根據(jù)權(quán)利要求10到17中任一項(xiàng)的酵母細(xì)胞，其中所述酵母是Saccharomyces cerevisiae。
19.生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟用根據(jù)權(quán)利要求10到16中任一項(xiàng) 的酵母細(xì)胞發(fā)酵合適的碳底物，和回收所述發(fā)酵期間生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)物是丁醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定異源多肽的方法，所述異源多肽具有在酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性，所述方法包括a)提供突變的酵母細(xì)胞，其包含至少一種(PDH)旁路基因的缺失，所述基因選自編碼丙酮酸脫羧酶(PDC)、乙醛脫氫酶(ALD)和乙酰-CoA合成酶(ACS)的基因；b)用包含下述異源核苷酸序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述突變的酵母細(xì)胞，所述異源核苷酸序列編碼具有將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的潛在酶活性的候選多肽；c)針對(duì)在含葡萄糖作為唯一碳源的最小培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力，測(cè)試所述重組突變的酵母細(xì)胞，和d)當(dāng)觀察到所述細(xì)胞的生長(zhǎng)時(shí)，將所述候選多肽鑒定為具有在所述酵母細(xì)胞(的胞質(zhì)溶膠)中將丙酮酸、乙醛或乙酸轉(zhuǎn)化為乙酰-CoA的酶活性的異源多肽。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物例如丁醇的方法。
文檔編號(hào)C12N15/81GK101939433SQ200880100320
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2008年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月23日
發(fā)明者烏爾里克·瑪麗亞·穆勒爾, 亞倫·阿迪瑞安·文科勒, 吳亮, 羅拉納·麥德勒尼·拉姆斯多克 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司