專利名稱：：Ace2多肽的制作方法ACE2多肽本發(fā)明涉及重組蛋白質生產(chǎn)的領域。血管緊張素轉化酶(ACE2)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關鍵酶。它作為羧肽酶錨固于膜上，作為受體主要在肺細胞、腎細胞和心臟細胞以及內(nèi)皮細胞上表達并裂解各種肽底物。知名的代表底物是血管緊張素-II(Angn)，其被裂解為血管緊張素l-7(Ang1-7);血管緊張素-I，其被裂解為血管緊張素l-9;同樣地，還有即elin和緩激肽。AngII和Ang1-7是腎素_血管緊張素系統(tǒng)的拮抗劑。ACE2通過控制肽比例而決定性地負責血管厚度的調整以及內(nèi)皮細胞的通透性并因此影響有機體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。ACE2的表達尤其受細胞因子調節(jié)并且在各種炎癥中降低，這繼而導致Angn(ACE2最重要的底物之一)的病理性增加。ACE2用于治療急性肺病的兩種形式ARDS或ALI，隨這兩種病在肺中出現(xiàn)下調的ACE2表達。對于該種治療使用重組的可溶性人ACE2，其被全身性給予從而在最短的時間內(nèi)供整個有機體使用，以便降低增加的AngII濃度并與此同時產(chǎn)生Ang1_7。這補償了增加的AngII濃度的負性作用。為此，很希望擁有一種產(chǎn)物，其具有合適的藥學特征相應地，其具有在有機體內(nèi)良好的分布、藥學上有意義的半衰期以及具有低免疫原性的適宜的物質。特別是該產(chǎn)物必須是有酶活性的、可良好溶解的以及在溶液中穩(wěn)定的，并且可以以高純度可重復地和經(jīng)濟地進行制備。Tipnis等人(JBiolChem.275(43)(2000):33238-43)描述了ACE2(在此文中還被稱為ACEH)的分離和其cDNA的分離。通過在CH0細胞中進行生產(chǎn)獲得了具有120kDa摩爾質量的糖基化的蛋白質單體。去糖基化后該蛋白質具有85kDa的質量。Donoghue(CircRes.87(5)(2000):1-9)描述了可溶性ACE2在CH0細胞中的表達，它沒有完全被糖基化，并且表征為約90kDa的摩爾質量。此外，該文獻還涉及各種ACE2序列的序列對比和抗ACE2抗體。W02004/023270A2涉及ACE2單體在昆蟲細胞Sf9中表達后ACE2的結晶。在此情況下，該蛋白質的摩爾質量在質譜分析后給出89.6kDa。有效的酶替代療法的治療型轉變需要這樣的制備方法，其經(jīng)濟地和可重復地制備高純度的藥學上有效的產(chǎn)物。ACE2的可溶的、細胞外截段包含7個N-糖基化位點。非糖基化的ACE2是不溶的，傾向于聚集，是增強的免疫原并且具有縮短的半衰期。此外，它具有小的流體力學直徑，其主要地不會負面地影響純化。因此，本發(fā)明的目的是提供具有好的體內(nèi)半衰期的高活性ACE2。該目的通過權利要求的具體內(nèi)容來實現(xiàn)。本發(fā)明涉及重組ACE2多肽，其以二聚體存在。優(yōu)選的是糖基化的重組ACE2多肽，其中ACE2多肽單體的糖基基團具有總計至少10、11、12、13、14、15或至少16個唾液酸殘基，優(yōu)選14個唾液酸殘基，并且其中ACE2多肽以二聚體存在。同樣地，本發(fā)明包含具有本文所述的糖基化的、摩爾加權平均的和進一步詳細說明的ACE2單體。優(yōu)選所述二聚體是同二聚體，其單體單位特別地具有相同的序列和糖基化。通常，所述單體單位是非共價結合的二聚體。單體可以通過變性步驟毫無困難地從二聚體獲得。優(yōu)選所有本文所述的糖基化不但涉及二聚體而且也涉及單體，包括二聚體復合物的一個或兩個單體。特別優(yōu)選所述二聚體包含兩個鋅離子。6"唾液酸殘基"，特別地理解為N-乙酰神經(jīng)氨酸類型(Neu5Ac)的殘基，特別是在N-或O-糖基化。原則上，對于其半衰期從而其效應而言，治療劑的穩(wěn)定性是非常重要的標準。迄今為止，重組人ACE2僅鑒定為單體，并且在關于其功能、其晶體結構以及關于其與高特異性抑制劑相互作用的文獻中也被描述為如此。因此，例如在參考Vickers等人(JBiolChem277(17)，2002:14838-14843)的情況下，Towler等人(JBiolChem279(17)，2004:17996-18007)描述了ACE2在昆蟲細胞Sf9中的表達，其在作為最后純化步驟的小心的大小排阻色譜法之后以單體獲得。單體的摩爾質量為89.6kDa。商購可得的ACE2同樣以單體形式存在(來自R&DSystems,編錄號933-ZN,批號FIU035071)，其根據(jù)Tipnis等人(2000，同上)中的所述方法而制備，所不同的是，使用NSO代替CHO細胞作為表達系統(tǒng)。它被描述為單體，其不但在還原條件下而且在非還原條件下具有120kDa的摩爾重量。根據(jù)Donoghue等人(CircRes87，2000:el-e9)，ACE2單體在CHO細胞中表達，其分泌后顯示90kDa的分子量。所有本文列出的文獻和出版物通過弓|用而合并入本文。根據(jù)本發(fā)明，為了使根據(jù)本發(fā)明的治療劑穩(wěn)定，發(fā)展了一種方法，其僅導致穩(wěn)定的ACE2二聚體，所述二聚體相比于ACE2單體不但具有生產(chǎn)技術上的而且具有藥學上的優(yōu)點。所述二聚體化帶來下列的優(yōu)點在生理溶液中更好的溶解度和生物利用率該二聚體顯示高的溶解度和更長的體內(nèi)半衰期和利用率。無聚集體形成該ACE2二聚體了形成穩(wěn)定的復合物，而不會附加更多的ACE2分子以形成二聚體。減少的蛋白酶攻擊因為單次蛋白質切割后，在此所有的可能性都表明C-末端部分在二聚體內(nèi)部，該c-末端不被降解。增加的半衰期由于低免疫原性、更好的溶解度和降低的對蛋白水解的易感性，所述蛋白質的半衰期增加了。簡單的蛋白質純化ACE2二聚體的流體力學直徑基于其結構和大于計算直徑的突出的溶劑化外殼。因此，ACE2二聚體能夠通過大小分離柱從來自蛋白質表達的常規(guī)雜質，例如血清白蛋白(67kDa)中出色地被分離。優(yōu)選重組ACE2多肽在可能的N-糖基化位置的至少80%處被糖基化并且具有大于10%(總ACE2的質量％)或11%、12%、13%、14%，優(yōu)選大于15%或16%、17%、18%、19%，特別地大于20%或21%、22%、23%、24%或25%的糖部分。發(fā)展了一種制備方法，其可重復地制備高純度的且有酶活性的、高度復雜的糖基化ACE2。該產(chǎn)物表征為其高的糖部分(>20質量％)和復雜的、高度支化的、部分帶負電荷的糖結構。這對產(chǎn)物的溶解度、生物利用率、酶活性以及藥學性質產(chǎn)生積極作用。通過選擇合適的表達構建體、合適的表達宿主、優(yōu)化的篩選策略，通過針對細胞代謝經(jīng)調整的培養(yǎng)基以及通過細致的伴隨克隆分析和篩選，可以制備分泌所希望產(chǎn)物的細胞系。ACE2已經(jīng)在昆蟲細胞Sf9和小鼠細胞NS0中進行了表達。該物質主要在體外試驗中使用。ACE2在CH0細胞中的瞬時表達也有結果。至今還沒有產(chǎn)生具有方法適宜的生產(chǎn)率的細胞系。此外，還沒有進行關于產(chǎn)物性質(特別是關于N-糖基化)的相應的克隆篩選。蛋白質的溶解度不僅由其氨基酸序列而且由其折疊以及由翻譯后修飾所決定。主要是所負載的糖結構，其決定性地增加蛋白質的溶解度并影響其藥學特征。因此，就EPO而言，可以表明，復雜的支化糖結構的存在積極影響這些蛋白質的半衰期。原則上，為了進行ACE2的重組表達，考慮各種表達系統(tǒng)，其中基于缺失的N-糖基化位點加工(Prozessierung)的原核生物宿主細胞不再進行測試。優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點具有選自式1-8的相互獨立的結構(式5)(式6)(式7)(式8)其中，GlcNAc圖Fuc么M<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>優(yōu)選所有可能的N-糖基化位點都被糖基化。優(yōu)選至少80%，優(yōu)選至少90%，特別地100%的糖基化的N-糖基化位點具有式1-8的結構。優(yōu)選二聚體的ACE2單體單位具有至少90kDa，優(yōu)選至少92kDa，尤其優(yōu)選至少94kDa，特別是至少96kDa，特別優(yōu)選至少98kDa，最優(yōu)選至少100kDa、100.5kDa、101kDa、101.5kDa或者至少102kDa的分子量。絕對摩爾質量_即肽本身而沒有水合物外殼_可以通過肽圖譜來測定。更高的糖基化形式還可以具有至少103kDa、104kDa、105kDa、106kDa、107kDa或至少108kDa的摩爾質量。由另外的因素例如水合物外殼所影響的摩爾質量測定(例如在含水系統(tǒng)中的色譜法或凝膠電泳)還可以導致更高的結果。在進一步的實施方案中，二聚體的ACE2單體(式l)(式2)(式3)(式4)單位具有至少101kDa或至少102kDa，優(yōu)選至少105kDa，尤其優(yōu)選至少109kDa，特別是至少113kDa，特別優(yōu)選至少117kDa，最優(yōu)選至少119kDa的表觀分子量，如通過凝膠電泳所測定的。在另一個實施方案中，單體的分子量(表觀的或絕對的)最大為102kDa、103kDa、104kDa、108kDa、110kDa、112kDa、116kDa、120kDa、125kDa、130kDa、135kDa或140kDa。更高的分子量是由于可能的ACE2的修飾，例如PEG化。優(yōu)選所述單體(其沒有形成二聚體)具有至少82kDa，優(yōu)選至少86kDa，尤其優(yōu)選至少90kDa，特別是至少94kDa，特別優(yōu)選至少98kDa，最優(yōu)選至少101kDa或者最大102kDa、103kDa、104kDa、108kDa、110kDa或最大112kDa的分子量。這些分子量可以例如根據(jù)肽圖譜方法進行測定。優(yōu)選ACE2多肽不具有跨膜結構域。因此，它是可溶性的ACE2。在這種情況下，特別優(yōu)選的實施方案包含ACE2-多肽，其多肽鏈由其中的氨基酸18-740或具有酶活性的片段組成。另外的多肽由SEQIDNO:1的氨基酸18-615組成。雖然對于大多數(shù)的治療性應用人的ACE2(SEQIDNO:1)是優(yōu)選的，但是也可以使用其他哺乳動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、豬、靈長類或牛的ACE2。ACE2是在所有哺乳動物中普遍存在的酶，具有在不同物種中相同的底物Ang11。因此原則上，它也是在異種生物中可使用的。因此，可以與ACE2的來源(例如人、小鼠、大鼠、倉鼠、豬、靈長類或牛)無關地用根據(jù)本發(fā)明的蛋白質進行治療。然而，在優(yōu)選的實施方案中，ACE2的來源和被治療的生物是相同的。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Ser740(例如，C-末端)相應的ACE2多肽的絲氨酸(或c-末端氨基酸)被O-糖基化。優(yōu)選至少70%，優(yōu)選至少80%，特別是至少90%，最優(yōu)選100%的糖基化的N-糖基化位點具有唾液酸，優(yōu)選相應于SEQIDN0:1的N-糖基化位點的Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690被唾液酸化。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asn53相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asn90相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asnl03相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asn322相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asn432相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。9在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asn546相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Asn690相應的天門冬酰胺被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在特別的實施方案中，與SEQIDNO:1的Ser740相應的絲氨酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸被唾液酸化一次、兩次、三次或四次。優(yōu)選至少30%，優(yōu)選至少40%，特別是至少55%，最優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點具有至少兩個唾液酸。在ACE2制劑中，優(yōu)選至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的這些氨基酸如此被唾液酸化。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn53相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn90相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asnl03相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn322相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn432相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn546相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn690相應的天門冬酰胺被N_糖基化，優(yōu)選用根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。在另一個方面，本發(fā)明涉及重組ACE2多肽的制備，所述重組ACE2多肽包含如本文所定義的多肽(ACE2單體或二聚體或者二聚體的單體單位)，其中具有表觀分子量(如通過凝膠電泳測定的)低于100kDa或低于101kDa，優(yōu)選低于104kDa，特別優(yōu)選低于108kDa，特別是低于112kDa，尤其優(yōu)選低于117kDa，最優(yōu)選低于119kDa的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%，以及所有上述的組合而存在。例如，低于100kD的ACE2多肽可以以0%存在，低于100kDa的ACE2多肽可以以低于20%存在。所述部分與所有所涉及的ACE2形式有關并對此例如通過非變性凝膠電泳進行在此類似地，可以使用絕對摩爾質量作為摩爾質量范圍，所述絕對摩爾質量可以通過肽圖譜進行測定。因此，優(yōu)選具有表觀分子量(如通過凝膠電泳測定的)低于86kDa或低于89kDa，優(yōu)選低于92kDa，特別優(yōu)選低于94kDa，特別是低于97kDa，尤其優(yōu)選低于100kDa，最優(yōu)選低于101kDa的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%，以及所有上述的組合而存在。例如，低于86kD的ACE2多肽可以以0%存在，低于97kDa的ACE2多肽可以以低于20%存在。優(yōu)選具有跨膜結構域的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。優(yōu)選ACE2多聚體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，特別優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。"ACE2多聚體"理解為具有3個或更多個ACE2多肽的復合物。在一個ACE2二聚體制劑中，此外優(yōu)選ACE2單體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。在一個ACE2單體制劑中，此外優(yōu)選ACE2二聚體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是約0%存在。優(yōu)選ACE2分子的ACE2二聚體部分總計至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%。在進一步的實施方案中，為此組合地或獨立地，ACE2分子的ACE2單體部分可以為至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或至少99%。優(yōu)選具有相應于SEQIDN0:1的Asn53的N_糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Asn90的N_糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Asnl03的N_糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Asn322的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Asn432的N_糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Asn546的N_糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Asn690的N_糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，并優(yōu)選地具有根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。優(yōu)選具有相應于SEQIDNO:1的Ser740的0_糖基化的絲氨酸的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別地100%，基于Angl-7(血管緊張素l-7)轉化物，優(yōu)選ACE2多肽或制劑的催化活性kkat為至少4/s，優(yōu)選至少5/s，尤其優(yōu)選至少6/s，特別優(yōu)選至少7/s，最優(yōu)選至少7.6/s。Ang1_7由ACE2從AngII(血管緊張素II)形成。該轉化物可以如實施例中描述的那樣以簡單的方法進行測定。該轉化物或ACE2的催化活性還可以從其他分析數(shù)據(jù)進行外推。所述活性可以例如如W02008/046125A中描述的那樣進行測量。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于制備重組ACE2多肽或重組ACE2的制劑的方法，其包含這樣的步驟將編碼ACE2的多核苷酸，優(yōu)選編碼沒有跨膜結構域的ACE2的多核苷酸，引入真核細胞中；表達ACE2多肽并收集經(jīng)表達的ACE2，尤其是以二聚體形式的。然后，可以選擇這樣的細胞，其產(chǎn)生如本文所描述的、尤其是具有高分子量的根據(jù)本發(fā)明的ACE2多肽。優(yōu)選將所述編碼ACE2的多核苷酸設計在載體上。優(yōu)選選擇具有標記(優(yōu)選DHFR)的ACE2表達。優(yōu)選所述標記位于載體上。優(yōu)選所述載體具有用于被表達的ACE2mRNA的IRES(或對此編碼的)。優(yōu)選所述真核細胞是CH0細胞。本發(fā)明還涉及通過如此方法獲得的重組ACE2多肽或重組ACE2多肽的制劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了穩(wěn)定的、用編碼ACE2的多核苷酸轉染的真核細胞系(或細胞)，優(yōu)選地CHO細胞系(或細胞)，其表達特別是如上文定義的ACE2?？梢愿鶕?jù)如上文指出的所希望的性質，例如從具有分子量至少102kDa的單體單位產(chǎn)生二聚體，來選擇所述細胞系。所述細胞優(yōu)選地具有至少10pg/細胞/天，優(yōu)選至少15pg/細胞/天，尤其優(yōu)選至少20pg/細胞/天的ACE2生產(chǎn)率。優(yōu)選ACE2的表達在足夠的Zn2+離子存在下進行。優(yōu)選使用至少0.5微摩爾，尤其直至5微摩爾的Zn2+，尤其是發(fā)酵可以在2.5-3.5微摩爾Zn2+的情況下進行。例如，表達細胞的培養(yǎng)基中的Zn2+濃度可以是至少0.5iiM、0.75iiM、1.0iiM、1.25iiM、1.5iiM、1.75iiM、2.0iiM、2.25iiM或至少2.5iiM或3.0iiM。優(yōu)選其他操作步驟同樣在Zn2+離子存在下進行。在另一個方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的ACE2產(chǎn)物的藥物的或藥學制劑。尤其是用于治療或預防高血壓、心功能不全(例如，充血性、急性或慢性心功能不全)、心肌梗死或動脈硬化、腎病或腎功能不全、多囊腎病(Zystennieren)(多囊腎病，PKD)或肺病(例如慢性阻塞性肺病)、肺炎、哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、囊性纖維化、間質性肺病、肺循環(huán)低壓(pulmonaleHypertonie)、肺栓塞、肺結節(jié)病、結核病、肺水腫、ALI、ARDS或肺癌。ACE2的通常治療適應征在例如WO2004/000367A中提及，其也適合于根據(jù)本發(fā)明的ACE2產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明，可以提供包含ACE2蛋白質的藥學組合物或藥物。這樣的組合物可以包含相同的藥學上適宜的鹽、額外的緩沖液、張度組分(Tonizitatskomponenten)或藥學上適宜的載體。藥學載體物質用于所述組合物的更好的相容性并允許所述活性物質更好的溶解度以及更好的生物利用率。對此的實例是乳化劑、增稠劑、氧化還原組分、淀粉、醇溶液、聚乙二醇或脂質。適宜的藥學載體的選擇極其依賴于施用的方法。對于口服施用可以使用液體或固體的載體，對于注射則必需是液態(tài)的最終組合物。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的ACE2組合物包含緩沖液物質或張度物質。借助于緩沖液可以調節(jié)藥物的pH值至生理條件，此外可以減弱或緩沖pH波動。對此的實例是磷酸鹽緩沖液。張度物質用于調節(jié)滲透性并且可以包含離子物質，例如無機鹽(例如，NaCl或KC1)，或非離子物質(例如，甘氨酸或碳水化合物)。12優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明使用的組合物或藥物適合用于全身性、局部地、口服或鼻內(nèi)施用或以吸入施用。本發(fā)明的組合物的這些施用方式使快速和簡單的攝取成為可能。如果確定了ACE2組合物用于口服施用，則優(yōu)選考慮耐胃液的配制劑或者膠囊劑。為了進行口服施用，可以例如將固體或液體的藥物直接或者經(jīng)溶解或經(jīng)稀釋地攝入。根據(jù)本發(fā)明使用的藥物優(yōu)選地適合用于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、血管內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下施用。因此，適合于例如注射或輸液。血管系統(tǒng)(Blutbahn)的直接施用具有優(yōu)點，即藥物的活性物質分布于整個機體并迅速到達靶組織。通過下面的附圖和實施例進一步闡明而非限制本發(fā)明。附圖圖1:ACE2表達和篩選盒圖2:制備克隆歷史的ACE2特異的蛋白質印跡分析圖3:ACE2單體的SDS-PAGE分析圖4:克隆選擇圖5:LC-MS糖基化分析圖6:ACE2的制備型大小分離圖7:ACE2在3個物種中的藥物代謝動力學圖8:用于Angl-7禾PAngII定量的校準曲線。在WatersC18BondapakRP，2.lx300mm，10iim，125人柱上借助于RP-HPLC在所引用的濃度范圍內(nèi)分離肽。圖9:N-末端肽的MS/MS-譜。注Q和K具有相同的質量。圖10:ACE2序列和N-糖基化預測圖11:糖基化位點103(A)、位點432(B)、位點546(C)、位點690(D)、位點90(E)的經(jīng)解譜的譜圖。圖12:C-末端0-糖基化肽的譜圖。結構歸類應當探試性地進行分類。圖13:LC-MS釋放的聚糖圖14:ACE2二聚體結構的測定，借助于非變性PAGE(左側，蛋白質條帶借助于銀染進行可視化)和SEC(右側，ZorbaxG-450柱上，在220mM磷酸鈉存在下，在pH7.0下10%乙腈中進行分離，該色譜在214nm處進行)。圖15:ACE2二聚體的大小排阻色譜法的色譜(滯留8.55分鐘，8.93分鐘)。標準甲狀腺球蛋白(670kDa，7.43分鐘)、y-球蛋白(158kDa)、卵白蛋白(43kDa，10.08分鐘)、肌球蛋白(17kDa，11.08分鐘)、維生素B_12(l.3kDa，12.71分鐘)。圖16:來自皮質(A)、腦(B)和ACE2-二聚體表達克隆(C)的細胞提取物的ACE2特異的蛋白質印跡分析。在D中，加載了純的ACE2二聚體。圖17:ACE2單體形式的分析型SEC-HPLC色譜。運行條件柱ZorbaxGF250，緩沖液220mMNa2HP04+10%CH3CN，pH8.0在lml/分鐘情況下。圖18:ACE2二聚體(A)和ACE2單體(B)的PAGE分析，蛋白質借助于銀染(a)和ACE2特異的蛋白質印跡(b)進行檢測。圖19:ACE2單體相比于ACE2二聚體的酶活性的確定。在恒定的熒光標記底物香豆素-APK-DNP的初始濃度和四種不同的酶濃度下進行，并對比各個熒光曲線。圖20:ACE2二聚體形式給藥(2.5mg/kg，藍色柱)或ACE2單體形式給藥(2.5mg/kg，灰色柱)24和48小時后所測量的ACE2血清活性。實施例實施例1:高度糖基化的ACE二聚體的表達在表達載體中克隆人ACE2序列(SEQIDNO:1)的可溶性片段，在所述表達載體中首先插入可擴增的選擇標記DHFR，以便導致增加的ACE2基因表達。為此在編碼ACE2和DHFR的基因之間引入衰減性IRES，其使得在同一mRNA上的ACE2和DHFR的雙順反子讀碼成為可能。在圖1中圖解說明了ACE2表達盒和篩選盒。這兩個蛋白質在同一啟動子調控下表達之后，可以通過使用拮抗劑MTX進行DHFR篩選針對性地提高ACE2的表達。通過這些策略可能獲得特別穩(wěn)定的表達細胞系，其提供高產(chǎn)率的恒定質量的產(chǎn)物。還可能在細胞系中獲得合理的產(chǎn)物滴度，其可能對于某些目標蛋白質的重組表達是較不適宜的。將該載體轉化入CH0dhfr細胞并在持續(xù)增加的MTX壓力下擴增ACE2基因的拷貝數(shù)。經(jīng)過多輪篩選和亞克隆，借助于細胞內(nèi)FACS分析和蛋白質化學以及酶學分析根據(jù)最佳產(chǎn)物性質來篩選最好的產(chǎn)物。為了選擇最適合的克隆，首先考慮特定的酶活性(其用3種不同的底物的測定)、產(chǎn)物同質性、細胞生產(chǎn)率以及糖復雜性。在圖2中，顯示了單個克隆的相續(xù)的培養(yǎng)上清液的總結性重現(xiàn)的蛋白質印跡，其被用于建立生產(chǎn)細胞系。單個克隆的產(chǎn)物性質區(qū)別于從右到左增加的表達產(chǎn)物的糖部分，其通過明顯的質量增加而可辨認。這些通過高度糖基化的克隆的特定篩選而實現(xiàn)。最終，具有最高分子量表達產(chǎn)物的克隆(克隆5B9)被用于建立生產(chǎn)細胞系(1B4)。決定繼續(xù)進行6個克隆，其表達高酶活性的和復雜的N-糖基化ACE2。當可溶性ACE2具有83kDa的分子量時，選擇這樣的克隆，其在變性SDS-PAGE中表現(xiàn)為范圍直至120kDa的分子量(取決于其糖結構)。圖3顯示了通過本生產(chǎn)方法制備的ACE2(泳道B)，對比于在NS0中制備的標準ACE2(泳道A)。當根據(jù)本發(fā)明的ACE2多肽(此處作為單體進行分析)是同質的、高度糖基化的，并且因此表現(xiàn)為約120kDa的單一條帶時，參考物質條帶顯示83kDa至120kDa，這暗示非常異質的糖基化。將初始克隆移置于無蛋白質的生長培養(yǎng)基(Polym皿)中。這種商購可得的培養(yǎng)基是化學物質確定的、無血清、沒有動物蛋白質并且在CHO中就糖蛋白的重組表達進行了優(yōu)化。發(fā)酵在2.5-3.5yMZn2+下進行。在培養(yǎng)基中維持所有6個克隆并且就其生產(chǎn)方法適宜性進行檢查。特別是記錄生長速率以及研究關于產(chǎn)物進程和代謝物的上清液(圖4)。再次精確分析表達產(chǎn)物以及克隆。所有的克隆都表達高活性的ACE2并且具有20-30pg/細胞/天的生產(chǎn)率。此外，還分析糖結構和其異質性。最終選擇克隆1B4。它在整個生產(chǎn)進程中具有同質的糖結構。在所有7個N-糖基化位點進行了糖基化，其中這些糖基化具有至少一個具有末端唾液酸的二-天線，有些甚至三天線的復雜的糖基化?；谶@些克隆制備了主細胞庫并進行了測試，以及建立了GMP適用的純化方法和進而GMP生產(chǎn)方法。SEQIDN0:1(ACE2蛋白質序列，為了排出，由宿主細胞切除自體信號序列(加下劃線)):MSSSSWLLLSLVAVTAAQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQST-PAHLLGD麗GRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMT-PFLLRNGANEGFHEAVGE頂SLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQAL-TIVGTLPFT預LEKWR麗VFKGEIPKDQ麗KK麗EMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLF-HVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGD-DIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS由于ACE2的二聚體化，全部疏水蛋白質單位朝向復合體內(nèi)部，其中帶電荷的殘基，例如N-聯(lián)糖鏈朝外突出并且該結構溶解于同樣帶電荷的生理介質中。在Zn"存在下確認通過完整的N-糖基化ACE2的表達的所述二聚體化。在這種情況下，所述二聚體復合物由2個相同的亞基組成，其彼此靜電結合并且在生理溶液中也不再分離。在這種情況下，能夠分泌每個ACE2分子上各具14個強帶電的唾液酸結構以及在二聚體中28個唾液酸結構的糖蛋白。每種情況下有2個Zn2+離子嵌入復合物中并穩(wěn)定其結構。糖鏈的強帶電使該分子溶解于生理水溶液并迫使所屬的帶電荷的蛋白質結構域朝向外面。這樣來建立生產(chǎn)方法，使得終產(chǎn)物中僅存在ACE2二聚體。這些是可能的，由于在產(chǎn)生ACE2時存在足夠的Zn2+離子(優(yōu)選地使用1.5_5微摩爾Zn"，尤其是發(fā)酵可以在2.5-3.5uMZn2+下進行)并且后來進一步的處理步驟在Zn2+離子存在下來進行。純化通過使用陰離子交換步驟、硫酸銨沉淀以及HIC步驟、陽離子交換步驟以及其他高溶解性陰離子交換步驟來進行。過程中的所有介質都是經(jīng)磷酸鹽緩沖的并含有氯化鈉。最后的試樣緩沖液是用于注射的生理甘氨酸溶液。實施例2:產(chǎn)物性質基于共價結合的糖結構，復雜的、高度糖基化的ACE2單體或二聚體的單體單位具有比其相應的氨基酸序列明顯高的分子量。因此借助于肽圖譜測得102kDa的摩爾質量，而非糖基化的ACE2只有83kDa。與此相應地，糖部分占約23%并且對于下文所描述的產(chǎn)物性質具有實質性意義。由于強烈的水合作用，相比于參照標準，在SDS-PAGE中約120kDa處顯現(xiàn)單體單位(圖3)。不表達天然的、膜結合的ACE2，而僅表達ACE2的可溶性部分。由于膜結構域的缺失而被完全糖基化。由于復雜的、高度糖基化的和因此帶強負電的糖結構，ACE2具有相比于非糖基化的或未完全糖基化的ACE2而言明顯高的溶解度。因此，可以毫無問題地制備直至15mg/ml、經(jīng)生理學緩沖的蛋白質配制劑。除穩(wěn)定的二聚體化之外，該產(chǎn)物在溶液中還進一步表現(xiàn)穩(wěn)定并且經(jīng)過較長貯存時間既不失去活性，也不傾向于降解或聚集。與此相反，去糖基化的ACE2在低濃度范圍下就已經(jīng)沉淀。其可借助于PNG酶F在制備型去糖基化起始物中顯示。針對ACE2計算出的理論穩(wěn)定指數(shù)為41.2，并且將該蛋白質歸類為不穩(wěn)定的，其中在該計算中，允許大于八的糖結構。然而，因為所述配制劑在溶液中表現(xiàn)穩(wěn)定達數(shù)月之久，這明顯歸因于高的糖部分。此外，ACE2的更好的溶解導致這種配制劑僅由ACE2二聚體(或者在人工分離后僅從單體產(chǎn)生單體)組成，而非糖基化的ACE2傾向于多聚化和聚集。此外，由于高的帶電糖鏈部分，所述ACE2制劑的流體力學直徑、溶劑化外殼大大增加。這種情況可以用于通過大小分離柱進行ACE2的制備型純化，其中，在此僅作為二聚體存在的蛋白質具有相比于計算出的83kDa而言約250kDa的表觀分子量。制備型ACE2純化的色譜反映在圖6中。ACE2(第一幅圖)用69分鐘的滯留時間進行洗脫。這相應于在甲狀腺球蛋白(第一幅圖，在58分鐘時，670kDa)和Y-球蛋白(第一幅圖，在74分鐘時，158kDa)之間的表觀分子量。在該高分子量范圍內(nèi)在培養(yǎng)上清液中不具有雜質，從而可以以非常簡單的分離步驟分離高純度的產(chǎn)物。實施例3:產(chǎn)物的藥學性質根據(jù)本發(fā)明的ACE2制劑作為穩(wěn)定的、高純度和濃縮的蛋白質溶液存在于生理緩沖中，并且可以不需進一步穩(wěn)定化地存放和施用。例如，可以使用磷酸鹽緩沖液。ACE2作為穩(wěn)定的單體或二聚體在溶液中是穩(wěn)定的，并且由于高的糖部分而不顯示出聚集。此外，ACE2制劑具有完全的酶活性。由于其溶解度，ACE2可以以靜脈內(nèi)推注(Bolus)進行施用。出于同一原因，全身性地，生物利用率在給藥后很快就得到保證。由于高的、強烈支化的和復雜的糖部分，ACE2只緩慢地降解。由此導致至少10.5小時長的半衰期，其是在各種物種，尤其是恒河猴(RhesusMakaken)中測得的。圖7展示了在3種物種中靜脈內(nèi)給予的ACE2的所測得的半衰期。此外，高的唾液酸部分造成沒有建立針對ACE2的中和性免疫應答。該免疫應答不但可能對于ACE2的外源施用產(chǎn)生不良后果，而且還可能中和自體的、細胞固有的ACE2。因此，所描述的ACE2配制劑連同全部所涉及的產(chǎn)物性質首次使得用rhACE2進行有效的治療成為可能。實施例4:特定ACE2活性的測定通過測量AngII(Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)的轉化物來測定ACE2制劑的特定活性。在lOOiU的初始體積中以三次測定來進行全部測量。通過向在pH6.5下的50mMMES、300mMNaCl、10iiMZnCl2和0.01%Brij_30中的80iiMAngII溶液加入250ng/ml的ACE2啟動酶促反應。小心地混合樣品并在37。C下精確溫育18分鐘。通過加入100mMEDTA來終止酶促反應。為了進行分析，借助于RP-HPLC(WatersC18iiBond即ak，2.lx300mm，10iim，125人)在0.08%H3P04中的10至60%CH3CN線性梯度的使用下，流速為lml/分鐘下分離該溶液20分鐘。接著，辨認并對色譜圖中的AngII和Ang1_7峰進行積分。按照各自在圖8中所展示的校準曲線來求得肽濃度。接著，測定酶促轉化物以及特定的酶活性。如前所述地測定ACE2產(chǎn)物的活性。在表1中展示了各自的峰積分(Peakintegration)結果以及計算出的酶數(shù)據(jù)。表l:酶數(shù)據(jù)和反應條件。給出了三次測定的平均值<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>ACE2制劑具有根據(jù)AngII轉化物所測得的8.0±0.3/skkat和鑒于Ang1-7轉化物的8.8±0.2/skkat的催化活性。這兩個值很好地相符并且明顯高于Vickers等人(JBiolChem.277(17)(2002):14838-43)的結果，其中公開了3.5/s的ACE2催化活性。反應條件是相同的。我們的制劑240%較高活性的原因可能是翻譯后修飾和在此尤其是N-糖基化，其在Vickers所使用的物質中是明顯較少的。所述物質在昆蟲細胞中表達并具有相同的氨基酸序列，然而在明顯較少的部分和支化程度上被糖基化。此外，還研究了R&DSystems的商購可得的ACE2制劑(目錄編號933_ZN)，其同樣具有明顯較少的2.0±0.1/skkat的活性。根據(jù)本發(fā)明的制劑的一個重要的性質是特別高的酶活性，其主要通過翻譯后修飾而成為可能。實施例5:重組ACE2的糖蛋白組的分析以兩種不同的方法來分析經(jīng)純化的、CHO表達的ACE2樣品首先，產(chǎn)生SDS-PAGE和S-烷基化后的胰蛋白酶肽并借助于LC-ESI-MS(和MS-MS)進行分析。發(fā)現(xiàn)了N-末端肽和多個內(nèi)部肽。在具有聚糖結構的糖基化形式中發(fā)現(xiàn)了七個潛在N-糖基化位點中的五個，其主要包含具有巖藻糖和不同量的唾液酸的二天線聚糖。C-末端肽好像是O-糖基化的。其次，借助于碳-LC-ESI-MS來分析游離的、還原的N-聚糖。對于具有巖藻糖的二天線、二唾液酸聚糖可以顯示，所述巖藻糖與核心a1，6-相結合且唾液酸是a2，3結合的。此外，除單糖基化或二糖基化的、二天線的聚糖發(fā)現(xiàn)有數(shù)量相當大的三天線寡糖。對糖基化ACE2質量的粗略估計得出101-102kDa，即由約17%的碳水化合物組成。借助于SDS-PAGE分離的hBChE的蛋白質水解消化對等份ACE2進行SDS-PAGE、脫色、脲基甲基化，用測序質量的胰蛋白酶進行消化并如所描述的那樣從凝膠塊中提取。將提取物在速度真空濃縮器(SpeedVac-Konzentrator)中進行干燥并在進行隨后的LC-MS-分析前用含有0.1%甲酸的水進行重構。對于寡糖分析，用PNG酶F消化所述肽，并使用C18SPE-微柱(Spitzen)來純化聚糖。胰蛋白酶肽和糖肽的MS分析質譜法分析如最近所描述的[Kolarich2006]，在Q-TOFUltimaGlobal(WatersMicromass)上進行，后者配備有標準電噴霧裝置、C即-LC-系統(tǒng)(WatersMicromass)和10端口溶劑轉換模土央(10-Port-L6SUngSmittel-Wechsel-Modul)(Rheodyne)。首先，使用水作為溶劑在AquasilC18_前柱(30x0.32mm，ThermoElectron)上捕捉樣品。在溶劑轉換前，首先以5X乙腈維持分析柱BiobasicC18-柱(100x0.18mm，ThermoElectron)，然后，施以具有2iU/分鐘的流速的5至50%乙腈的線性梯度。所有洗脫劑均含有0.1%的甲酸。樣品用MS-和MS-MS-方法進行分析。用MassLynx4.0SP4軟件(WatersMicromass)進行數(shù)據(jù)分析。ACE2的游離N-聚糖的分析在多孔石墨化碳柱上分離經(jīng)硼氫化物還原的聚糖并用質譜法進行檢測。實施例6:糖基化分析在此測定了ACE2的肽序列、其分子量、全部糖基化位點的位置以及所結合的糖的結構。借助于胰蛋白酶消化、S-烷基化和LC-ESI-MS分析樣品。糖基化產(chǎn)物的求得的蛋白質質量為102kDa，其中糖部分相當于總質量的23%。*在這種情況下，確認了N-末端肽以及全部序列內(nèi)部肽的存在(參見序列信息)。所有7個推斷的N-糖基化位點(位置53、90、103、322、432、546和690)確實都包含二天線、復雜的含唾液酸的巖藻糖基化的糖結構(圖13)。C-末端肽被0-糖基化。通過碳-LC-ESI-MS根據(jù)其裂解和還原來測定這些糖鏈的結構。所有二天線結構各自都包含兩個a2，3-結合的唾液酸和一個a1，6_結合的巖藻糖。還發(fā)現(xiàn)少量的三天線結構(圖11)。所應用的篩選策略能夠獲得完全糖基化的和包含唾液酸的表達產(chǎn)物。方法樣品制備ACE2借助于SDS-PAGE進行分離、脫色、烷基化并用胰蛋白酶進行消化。(Kolarich等人，Proteomics6(2006):3369-3380)。對凝膠提取物進行干燥并在進行LC-MS分析之前溶解于0.1%甲酸中。對于糖分析，用PNG酶F消化所述肽并經(jīng)過C18SPE微柱進行純化。MS分析所有質譜法分析借助于具有標準電噴霧裝置和C即-LC系統(tǒng)(WatersMicromass)的Q-T0FUltimaGlobal(WatersMicromass)進行(Kolarich2006)。在AquasilC18前柱(30x0.32mm，ThermoElectron)上于水中富集樣品。在乙月青梯度的使用下采用C18柱(100x0.18mm，ThermoElectron)作為分離柱。樣品用MS和MSMS方法進行測量。游離的N-聚體的分析在多孔石墨柱上分離用硼氫化物還原的聚糖并表征其質量。實施例7:rhACE2的二聚體化根據(jù)實施例1制備的ACE2以二聚體獲得，并且在該實施例中也是對此進行分析的，而不用分離二聚體。與變性的分析相反，通過天然處理保留了所獲得的所述二聚體(圖3)。取決于ACE2的二聚體化所有疏水蛋白質單位朝向復合體的內(nèi)部，所述復合體中帶電荷的殘基，例如N-聯(lián)糖鏈朝外突出并且該結構溶解于同樣帶電荷的生理介質中。在Zn"存在下確認通過完整的N-糖基化ACE2的表達的所述二聚體化。在這種情況下，所述二聚體復合物由2個相同的亞基組成，其彼此靜電結合并且在生理溶液中也不再分離。在這種情況18下，能夠分泌每個ACE2分子上各具14個強帶電的唾液酸結構以及在二聚體中28個唾液酸結構的糖蛋白。每種情況下有2個Zn2+原子嵌入復合物中并穩(wěn)定其結構。糖鏈的強帶電使該分子溶解于生理水溶液并迫使所屬的帶電荷的蛋白質結構域朝向外面。這樣來建立生產(chǎn)方法，使得終產(chǎn)物中僅存在ACE2二聚體。這些是可能的，由于在產(chǎn)生rACE2時存在足夠的Zn2+離子(優(yōu)選地使用1.5_5微摩爾Zn"，尤其是發(fā)酵可以在2.5-3.5uMZn2+下進行)并且后來進一步的處理步驟在Zn2+離子存在下來進行。在圖14和15中，用不同的方法來檢測ACE2復合物的二聚體化。在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，在銀染后檢測到蛋白質是約250kDa大小的單一條帶。用大小分離色譜法在ZorbaxG-450柱上，在220mM磷酸鈉鹽緩沖液中10X乙腈存在下于pH7.0，該產(chǎn)物同樣在相應于約250kDa的分子量的滯留時間下顯示單個峰。值得注意的是，在這兩種情況下都僅能檢測到二聚體化的蛋白質。既不能檢測到單體結構，也不能檢測到高分子聚集體。實施例8:ACE2二聚體-與膜固有ACE2的區(qū)別ACE2作為跨膜蛋白質在所有的高等物種中主要在腎臟、心臟、肺和肝的細胞上作為腎素_血管緊張素系統(tǒng)的重要酶被表達。膜錨固的ACE2在脂質雙層膜中自然地被其他膜蛋白質環(huán)繞，所述其他蛋白質使ACE2穩(wěn)定在激活的構象中，并且同樣保護ACE2的細胞外結構域免于蛋白酶水解的降解。為了提高可溶性ACE2的藥學性質和特別是可溶性蛋白質的活性和穩(wěn)定性，選擇僅導致穩(wěn)定的ACE2二聚體結構的表達和生產(chǎn)策略。主要是蛋白質的C-末端結構域和翻譯后修飾，它們決定性地負責二聚體化。為了突出ACE2二聚體結構的特點，用非變性PAGE和ACE2特異的蛋白質印跡來分析膜固有的ACE2的結構(圖16)。在印跡A和B中加載細胞提取物(皮質和腦)以及在印跡C中加載根據(jù)實施例1產(chǎn)生的ACE2二聚體生產(chǎn)克隆的細胞提取物。在這種情況下，膜固有的產(chǎn)物具有相比于根據(jù)實施例l(C和D)表達產(chǎn)物而言明顯較小的分子量，雖然前者只由細胞外部分組成。因此，這意味著膜固有的ACE2以單體存在。與此相反，表達產(chǎn)物由二聚體組成，所述二聚體賦予該產(chǎn)物藥學上的優(yōu)點。在印跡D中，分析了經(jīng)純化的終產(chǎn)物。它們僅還具有約240kDa分子量的單一條帶。實施例9:改善的ACE2二聚體的藥學性質APN01是生理性的ACE2蛋白質配制劑的名稱，其僅由ACE2二聚體結構組成。在每種情況下，這兩個ACE2單體形成非共價相互結合的復合體。如此來選擇或設計分子生物學構造、表達細胞系、發(fā)酵方法、純化和用于存放和應用的緩沖液，從而在終產(chǎn)物中僅出現(xiàn)穩(wěn)定的ACE2二聚體。該二聚體既不聚集成更大的復合物也不在生理條件下分解為單體。在圖15中，分析型SEC-HPLC色譜APN01，相比于大小分離標準(Bio-RADGF-Standard，藍色曲線)。運行條件柱ZorbaxGF250，緩沖液220mMNa2HP04+10%CH3CN，pH8.O，在lml/分鐘下。APN01以在8.6分鐘時的單一峰的形式被洗脫，它鑒于滯留時間，位于甲狀腺球蛋白(680kDa，滯留時間7.4分鐘)和牛Y-球蛋白(158kDa，滯留時間8.9分鐘)之間。該復合體的計算出的分子質量約為214kDa。這大約相應于每個102kDa的兩個ACE2單位的預期分子量。出于對比的目的，在CHO細胞中制備ACE2單體作為參照物質，其同樣用SEC-HPLC進行分析。在圖17中展示了與此相關的色譜圖。單體形式在9.0分鐘的滯留時間被洗脫，相當于約110kDa的分子量。此外，用PAGE對比這兩種產(chǎn)物(參見圖18a)。而APN01(A)具有約240kDa分子量的蛋白質條帶，在約100kDa顯現(xiàn)單體形式(B)。借助于ACE2特異的蛋白質印跡來確定這兩種產(chǎn)物的同一性，如在圖18b中顯而易見的那樣。根據(jù)使用熒光標記的底物的活性測試所測，這兩種產(chǎn)物顯示出相同的特定的酶活性。如在圖19中顯而易見的。相同酶濃度的單體和二聚體形式具有相疊的曲線。為了對比這兩種產(chǎn)物的藥學性質，給Bl-6小鼠腹膜內(nèi)以推注注射方式施用2.5mg/kg的這兩種制劑并測量24和48小時后血清樣品中的ACE2酶活性(參見圖20)。如此來調整蛋白質濃度，從而使所有動物分別獲得100i！1生理蛋白質溶液。每次，7個動物用APN01(ACE2-二聚體)和5個動物用ACE2單體進行處理。在給予ACE2之前，在血清樣品中檢測不到ACE2活性，然而在施用后，在所有情況下都測得全身性的ACE2活性。在應用后24小時，兩個組明顯地區(qū)別開來(t檢驗，P<0.001):在用ACE2二聚體處理的動物中，測得相當于0.9iig/mlACE2濃度的活性，而在獲得ACE2單體的組中，僅發(fā)現(xiàn)0.2yg/ml的濃度的相應活性。48小時后，在獲得ACE2同二聚體的組中發(fā)現(xiàn)還有0.2yg/ml的活性，而在獲得單體的組中，不再能檢測到全身性ACE2活性。這些數(shù)據(jù)表明了ACE2二聚體形式的非常明顯的藥學優(yōu)點。20權利要求重組ACE2多肽，其以二聚體存在。2.根據(jù)權利要求1的重組ACE2多肽，其特征在于，它被糖基化，其中ACE2多肽單體的糖基基團具有總共至少14個唾液酸殘基。3.根據(jù)權利要求2的重組ACE2多肽，其特征在于，可能的N-糖基化位點的至少80%被糖基化并且具有大于10%(質量％，相對于整個ACE2分子)，優(yōu)選大于15%，特別地大于20%的糖部分。4.根據(jù)權利要求1、2或3的重組ACE2多肽，其特征在于，糖基化的N-糖基化位點的至少70%相互獨立地選自式1-8的結構上人(式l)(式2)(式3)(式4)(式6)(式7)(式8)Fuc△Xyl&Neu5Ac5.根據(jù)權利要求1至4之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所有可能的N-糖基化位點是都被糖基化的。6.根據(jù)權利要求1至5之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少80%，優(yōu)選至少90%，特別地100%的糖基化的N-糖基化位點具有式1-8的結構。7.根據(jù)權利要求1至6之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所述二聚體的ACE2單體單位具有至少90kDa，優(yōu)選至少92kDa，尤其優(yōu)選至少94kDa，特別是至少96kDa，特別優(yōu)選至少98kDa，最優(yōu)選至少101kDa的分子量。8.根據(jù)權利要求1至7之一的重組ACE2多肽，其特征在于，所述ACE2多肽不具有跨膜結構域，優(yōu)選ACE2多肽鏈由SEQIDNO:1的氨基酸18-740或其酶活性片段組成。9.根據(jù)權利要求1至8之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDNO:1的Ser740相應的絲氨酸是0-糖基化的。10.根據(jù)權利要求1至9之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少70%，優(yōu)選地至少80%，特別是至少90%，最優(yōu)選100%的糖基化的N-糖基化位點具有唾液酸，優(yōu)選與SEQIDNO:1的Asn53、Asn90、Asn103、Asn322、Asn432、Asn546、Asn690對應的N_糖基化位點被唾液酸化。11.根據(jù)權利要求1至10之一的重組ACE2多肽，其特征在于，至少30%，優(yōu)選至少40%，特別是至少55%，最優(yōu)選至少70%的糖基化的N-糖基化位點具有兩個唾液酸。12.根據(jù)權利要求1至11之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDNO:l的Asn53相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。13.根據(jù)權利要求1至12之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn90相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。14.根據(jù)權利要求1至13之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn103相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。15.根據(jù)權利要求1至14之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn322相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。16.根據(jù)權利要求1至15之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn432相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。17.根據(jù)權利要求1至16之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn546相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。18.根據(jù)權利要求1至17之一的重組ACE2多肽，其特征在于，與SEQIDN0:l的Asn690相應的天門冬酰胺被N-糖基化，優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。19.重組ACE2多肽的制劑，其包含至少根據(jù)權利要求1至18之一的多肽，其特征在于，具有通過凝膠電泳所測得的低于100kDa，優(yōu)選低于104kDa，特別優(yōu)選低于108kDa，特別是低于112kDa，尤其優(yōu)選低于117kDa，最優(yōu)選低于119kDa的分子量的所述ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。20.根據(jù)權利要求19的制劑，其特征在于，具有跨膜結構域的ACE2多肽部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。21.根據(jù)權利要求19或20的制劑，其特征在于，ACE2的多聚體部分以低于20%，優(yōu)選低于10%，尤其優(yōu)選低于5%，最優(yōu)選低于1%，特別是0%存在。22.根據(jù)權利要求19至21之一的制劑，其特征在于，ACE2分子的ACE2二聚體部分為至少70%，優(yōu)選至少80%，尤其優(yōu)選至少90%，特別優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%。23.根據(jù)權利要求19至22之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDN0:l的Asn53的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別為100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。24.根據(jù)權利要求19至23之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDN0:l的Asn90的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)地大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。25.根據(jù)權利要求19至24之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDN0:1的Asnl03的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。26.根據(jù)權利要求19至25之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDN0:1的Asn322的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。27.根據(jù)權利要求19至26之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDN0:1的Asn432的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。28.根據(jù)權利要求19至27之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO:1的Asn546的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。29.根據(jù)權利要求19至28之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDN0:1的Asn690的N-糖基化天門冬酰胺的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%，并優(yōu)選地具有如在權利要求4中定義的根據(jù)式1、2、3、4、5、6、7或8的結構的聚糖。30.根據(jù)權利要求19至29之一的制劑，其特征在于，具有相應于SEQIDNO:1的Ser740的0-糖基化絲氨酸的ACE2多肽部分大于60%，優(yōu)選大于70%，尤其優(yōu)選大于80%，特別優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于99%，特別是100%。31.根據(jù)權利要求1至30之一的ACE2多肽或制劑，其具有基于從AngII(血管緊張素II)至Ang1_7(血管緊張素1-7)的轉化的至少4/s，優(yōu)選至少5/s，尤其優(yōu)選至少6/s，特別優(yōu)選至少7/s，最優(yōu)選至少7.6/s的催化活性。32.用于制備優(yōu)選地根據(jù)權利要求1至31之一的重組ACE2多肽或重組ACE2的制劑的方法，其包含這樣的步驟將編碼ACE2的多核苷酸，優(yōu)選地沒有跨膜結構域的編碼ACE2的多核苷酸引入真核細胞中；表達ACE2多肽并收集經(jīng)表達的ACE2，尤其是二聚體形式的，其中其中表達時優(yōu)選Zn2+濃度至少為1.5微摩爾。33.根據(jù)權利要求32的方法，其特征在于，所述編碼ACE2的多核苷酸設計在載體上。34.根據(jù)權利要求32或33的方法，其特征在于，所述ACE2表達用標記、優(yōu)選DHFR進行篩選。35.根據(jù)權利要求34的方法，其特征在于，所述標記存在于載體上。36.根據(jù)權利要求35的方法，其特征在于，所述載體具有用于所表達的ACE2mRNA的IRES。37.根據(jù)權利要求32至36之一的方法，其特征在于，所述真核細胞是CH0細胞。38.重組ACE2多肽或重組ACE2多肽的制劑，其通過前述權利要求的方法而獲得。39.穩(wěn)定地用編碼ACE2的多核苷酸轉染的真核細胞系，優(yōu)選CHO細胞系，表達根據(jù)權利要求1至31之一的ACE2。40.根據(jù)權利要求39的細胞，其具有至少10pg/細胞/天，優(yōu)選至少15pg/細胞/天，尤其優(yōu)選至少20pg/細胞/天的ACE2生產(chǎn)率。41.藥物，其包含根據(jù)權利要求1至18之一、31或38的重組ACE2多肽或根據(jù)權利要求19至31之一或38的制劑。全文摘要本發(fā)明涉及重組ACE2多肽，其中所述ACE2多肽以二聚體存在。所述二聚體特別地由糖基化的單體形成并且被用于制備具有延長的半衰期的藥學產(chǎn)品。文檔編號C12N9/64GK101796183SQ200880100650公開日2010年8月4日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權日2007年6月12日發(fā)明者B·佩巴爾,B·瓦格內(nèi),E·揚奇克-哈瓦拉特,H·洛博內(nèi),M·舒斯特,R·維克,S·斯蘭內(nèi)申請人:阿派隆生物制劑股份公司