專利名稱：改進(jìn)多種蛋白質(zhì)性質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了獲得下述蛋白質(zhì)的高效方法，所述蛋白質(zhì)在工業(yè)、消費(fèi)者或藥物應(yīng)用中具有一種或多種有益屬性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過(guò)篩選候選酶的縮略組(abbreviated set)生產(chǎn)用于給定應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)酶的方法。

背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)在其天然環(huán)境外工作時(shí)，性質(zhì)通常是次佳的。例如，酶(例如，蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶等)通常用于衣物洗滌劑中清潔織物上的污漬，所述衣物洗滌劑一般包括活性成分的復(fù)雜組合。事實(shí)上，大多數(shù)清潔用品包括表面活性劑系統(tǒng)、漂白劑、助洗劑、抑泡劑、污垢懸浮劑、污垢釋放劑、熒光增白劑、軟化劑、分散劑、染料轉(zhuǎn)移抑制化合物、研磨劑、殺細(xì)菌劑和香料，以及用于清潔的酶。因此，盡管目前洗滌劑的復(fù)雜性，但仍存在難以完全去除的許多污漬，部分原因就在于亞最佳的酶性質(zhì)。盡管有許多酶開發(fā)研究，但本領(lǐng)域仍需要改造蛋白質(zhì)以用于特定用途和條件的方法。事實(shí)上，本領(lǐng)域仍需要快速且系統(tǒng)地修改蛋白質(zhì)的靜電性質(zhì)以優(yōu)化其在商業(yè)應(yīng)用中的性質(zhì)的方法。特別地，本領(lǐng)域仍需要改造在工業(yè)上有用的酶的方法，所述酶包括但不限于脂肪酶、淀粉酶、角質(zhì)酶(cutinase)、甘露聚糖酶、氧化還原酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和其他酶，以便在清潔溶液中提供改進(jìn)的活性、穩(wěn)定性和溶解性。此外，本領(lǐng)域還需要對(duì)可以從經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞高水平表達(dá)的重組酶進(jìn)行工程改造的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了獲得下述蛋白質(zhì)的高效方法，所述蛋白質(zhì)在工業(yè)、消費(fèi)者或藥物應(yīng)用中具有一種或多種有益屬性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過(guò)篩選候選酶的縮略組生產(chǎn)用于給定應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)酶的方法。 本發(fā)明提供了提供蛋白質(zhì)變體文庫(kù)的方法，所述方法包括在感興趣的測(cè)試中，對(duì)跨越感興趣的性質(zhì)(例如物理性質(zhì))范圍的多種蛋白質(zhì)變體加以測(cè)試；鑒定感興趣的性質(zhì)范圍內(nèi)的最優(yōu)值，其與感興趣的測(cè)試中的有利結(jié)果相關(guān)；以及提供處于感興趣性質(zhì)范圍的最優(yōu)值內(nèi)的數(shù)種蛋白質(zhì)變體，由此提供下述蛋白質(zhì)變體文庫(kù)，其中富含在感興趣測(cè)試中具有有利結(jié)果的成員。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，有利結(jié)果對(duì)應(yīng)于超過(guò)感興趣測(cè)試中觀察到的最大值的大約50 % ，大約60 % ，大約70 % ，大約80 % ，大約90 %或大約95 % 。在還一些實(shí)施方式中，所述方法還包括下述步驟在感興趣的測(cè)試中，測(cè)試數(shù)種蛋白質(zhì)變體和野生型蛋白質(zhì)。在另一些實(shí)施方式中，所述方法包括下述步驟鑒定具有改進(jìn)的結(jié)果的蛋白質(zhì)變體，其中所述野生型蛋白質(zhì)在感興趣的測(cè)試中實(shí)現(xiàn)1.0的值，而具有改進(jìn)的結(jié)果的蛋白質(zhì)變體實(shí)現(xiàn)高于1.0的值。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，性能指數(shù)=測(cè)試性能/野生型性能。在一
5些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是酶。在還一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是蛋白酶、淀粉酶、 纖維素酶、聚酯酶、酷酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶或氧化酶。在另一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是
抗體或激素或細(xì)胞因子(例如生長(zhǎng)因子)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白酶是中性金屬 蛋白酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，親本蛋白酶是中性金屬蛋白酶的野生型成熟形式。 在還一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，變體源于芽孢桿菌科(Bacillaceae)的中性金屬蛋白酶。在 又一些實(shí)施方式中，變體源于芽胞桿菌屬(Bacillus)的中性金屬蛋白酶。在其它一些實(shí)施 方式中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，親本蛋白酶是絲氨酸蛋白 酶的野生型成熟形式。在還一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，變體源于微球菌亞目(Micrococcinea) 的絲氨酸蛋白酶。在另一些實(shí)施方式中，變體源于纖維單胞菌屬(Cellulomonas)的絲氨酸 蛋白酶。在還一些實(shí)施方式中，感興趣的性質(zhì)是相對(duì)于野生型酶而言的電荷。在一些特別 優(yōu)選的實(shí)施方式中，感興趣的性質(zhì)是^-電勢(shì)。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，感興趣的測(cè)試 包括洗滌性能。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，洗滌性能包括洗滌劑中的血奶墨汁(blood milk ink， BMI)洗滌性能。在一些實(shí)施方式中，在配制成具有5至12. 0之間的pH的粉末 或液體洗滌劑的洗滌劑組合物中測(cè)試洗滌性能。在另一些實(shí)施方式中，在具有堿性pH的冷 水液體洗滌劑中測(cè)試洗滌性能。在一些備選實(shí)施方式中，感興趣的測(cè)試包括測(cè)量底物結(jié)合， 和/或測(cè)量酶抑制，和/或測(cè)量表達(dá)水平，和/或測(cè)量洗滌劑穩(wěn)定性，和/或測(cè)量熱穩(wěn)定性； 和/或測(cè)量反應(yīng)速率；和/或測(cè)量反應(yīng)程度；和/或測(cè)量熱活性。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)測(cè)試蛋白質(zhì)折疊的改進(jìn)變體的方法，所述方法包括在感興 趣的測(cè)定中，測(cè)定跨越感興趣的性質(zhì)范圍的探針蛋白質(zhì)折疊的多種變體；鑒定出感興趣的 性質(zhì)范圍內(nèi)的最優(yōu)值，其與感興趣的測(cè)定中的有利結(jié)果相關(guān)；在感興趣的測(cè)定中，測(cè)定測(cè)試 蛋白質(zhì)折疊的親本蛋白質(zhì)；以及，通過(guò)在親本蛋白質(zhì)中引入氨基酸取代，產(chǎn)生測(cè)試蛋白質(zhì)折 疊的改進(jìn)變體，使得改進(jìn)變體處于感興趣的性質(zhì)范圍的最優(yōu)值中。在一些實(shí)施方式中，測(cè)試 蛋白質(zhì)折疊和探針蛋白質(zhì)折疊是不同的。在一些其它實(shí)施方式中，測(cè)試蛋白質(zhì)折疊是絲氨 酸蛋白酶，探針蛋白質(zhì)折疊是中性金屬蛋白酶。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)底物污漬特異性酶變體的方法，所述方法包括測(cè)定參照緩 沖液中的底物污漬的^ _電勢(shì)；測(cè)定參照緩沖液中親本酶的^ _電勢(shì)；以及通過(guò)在親本酶 中引入氨基酸取代來(lái)生產(chǎn)底物污漬特異性酶變體，使得變體酶的〖-電勢(shì)較之親本酶的 4 _電勢(shì)更接近底物污漬的^ _電勢(shì)。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)用于清潔多種污漬的組合物的方法，所述方法包括測(cè)定參 照緩沖液中多種污漬中的每種的〖-電勢(shì)；選擇在參照緩沖液中具有與多種污漬之一的 4_電勢(shì)基本相等的〖-電勢(shì)的清潔用酶，其中，所述選擇持續(xù)進(jìn)行，直到多種污漬中每種 都與至少一種清潔用酶配對(duì)；以及，通過(guò)將步驟b的清潔用酶加入到具有與參照緩沖液基 本相同的pH和傳導(dǎo)性的洗滌劑溶液中，制備用于清潔多種污漬的組合物。
本發(fā)明提供了提供蛋白質(zhì)變體文庫(kù)的方法，所述方法包括a)在至少一項(xiàng)感興趣 的測(cè)試中，對(duì)跨越至少一種感興趣的性質(zhì)范圍的多種蛋白質(zhì)變體加以測(cè)試；b)鑒定感興趣 的性質(zhì)范圍內(nèi)的最優(yōu)值，其與至少一項(xiàng)感興趣的測(cè)試中的有利結(jié)果相關(guān)；以及c)提供處于 感興趣性質(zhì)范圍的最優(yōu)值內(nèi)的數(shù)種蛋白質(zhì)變體，由此提供下述蛋白質(zhì)變體文庫(kù)，其中富含 在至少一項(xiàng)感興趣測(cè)試中具有有利結(jié)果的成員。在一些實(shí)施方式中，感興趣的性質(zhì)是物理 性質(zhì)。在另一些實(shí)施方式中，有利結(jié)果對(duì)應(yīng)于超過(guò)感興趣測(cè)試中觀察到的最大值的至少大約50%。在還一些實(shí)施方式中，有利結(jié)果對(duì)應(yīng)于超過(guò)感興趣測(cè)試中觀察到的最大值的至少 大約60 % 、大約70 % 、大約80 % 、大約90 %或大約95 % 。在另一些實(shí)施方式中，所述方法 還包括下述步驟d)在至少一項(xiàng)感興趣的測(cè)試中，測(cè)試數(shù)種蛋白質(zhì)變體和至少一種野生型 蛋白質(zhì)。在另一些實(shí)施方式中，所述方法還包括下述步驟鑒定具有改進(jìn)的結(jié)果的蛋白質(zhì)變 體，其中，野生型蛋白質(zhì)在至少一項(xiàng)感興趣的測(cè)試中獲得的性能指數(shù)值為i.o，而具有改進(jìn) 的結(jié)果的蛋白質(zhì)變體獲得高于1.0的值。在一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是抗體、激素或細(xì)胞因 子。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)是酶。在一些特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶是蛋白酶、 淀粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、氧化酶或轉(zhuǎn)移酶。在一些更特別 優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白酶是中性金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶。在還一些優(yōu)選的實(shí)施方式 中，絲氨酸蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在一些備選的優(yōu)選實(shí)施方式中，中性金屬蛋白酶從芽 孢桿菌科的成員獲得。在另一些實(shí)施方式中，絲氨酸蛋白酶從纖維單胞菌屬的成員獲得。在 還一些實(shí)施方式中，酶是纖維素酶，而在其它一些實(shí)施方式中，酶是淀粉酶。在另一些實(shí)施 方式中，感興趣的性質(zhì)是電荷。在還一些實(shí)施方式中，測(cè)定蛋白質(zhì)變體和野生型酶的電荷， 并加以比較。在另一些實(shí)施方式中，感興趣的性質(zhì)是^-電勢(shì)。在還另一些實(shí)施方式中，測(cè) 定蛋白質(zhì)變體和野生型酶的^-電勢(shì)，并加以比較。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)變體 的4-電勢(shì)介于大約-40mV至大約+40mV之間，而在其它一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)變體的 4 _電勢(shì)介于大約-2011^至大約+2011^111之間，在還一些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)變體的4 -電勢(shì) 介于大約-10mV至大約+10mV之間。在另一些實(shí)施方式中，感興趣的測(cè)試包括洗滌性能。在 一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，洗滌性能包括血奶墨汁洗滌性能。在另一些實(shí)施方式中，在洗滌劑 組合物中測(cè)試蛋白質(zhì)變體和野生型蛋白質(zhì)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，洗滌劑組合物被配 制為pH介于大約5至大約12.0之間的粉末或液體洗滌劑。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中， 在具有堿性pH的冷水液體洗滌劑中測(cè)試洗滌性能。在一些備選的實(shí)施方式中，在熱水洗滌 劑中測(cè)試洗滌性能。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述至少一項(xiàng)感興趣的測(cè)試包括測(cè)量底物 結(jié)合、酶抑制、表達(dá)水平、洗滌劑穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、反應(yīng)速率、反應(yīng)程度、熱活性、淀粉液化、 生物質(zhì)降解和/或糖化。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)測(cè)試蛋白質(zhì)折疊的至少一種改進(jìn)變體的方法，所述方法包 括a)在至少一項(xiàng)感興趣的測(cè)定中，測(cè)定跨越至少一種感興趣的性質(zhì)范圍的探針蛋白質(zhì)折 疊的多種變體；b)鑒定出至少一種感興趣的性質(zhì)范圍內(nèi)的最優(yōu)值，其與所述至少一項(xiàng)感興 趣的測(cè)定中的有利結(jié)果相關(guān)；c)在所述至少一項(xiàng)感興趣的測(cè)定中，測(cè)定測(cè)試蛋白質(zhì)折疊的 親本蛋白質(zhì)；以及，d)通過(guò)在親本蛋白質(zhì)中引入氨基酸修飾，產(chǎn)生測(cè)試蛋白質(zhì)折疊的至少 一種改進(jìn)變體，使得至少一種改進(jìn)變體處于至少一種感興趣的性質(zhì)最優(yōu)范圍中。在另一些 實(shí)施方式中，修飾包含至少一個(gè)氨基酸取代。在還一些實(shí)施方式中，測(cè)試蛋白質(zhì)折疊和探針 蛋白質(zhì)折疊是不同的。在一些實(shí)施方式中，感興趣的性質(zhì)是^-電勢(shì)。在另一些實(shí)施方式 中，測(cè)試蛋白質(zhì)折疊包含至少一種絲氨酸蛋白酶，探針蛋白質(zhì)折疊包含至少一種中性金屬 蛋白酶。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)底物污漬特異性酶變體的方法，所述方法包括a)測(cè)定參照 緩沖液中底物污漬的^ _電勢(shì)，b)測(cè)定參照緩沖液中親本酶的4 _電勢(shì)，以及c)通過(guò)在親 本酶中引入至少一處氨基酸修飾，產(chǎn)生底物污漬特異性酶變體，使得底物污漬特異性酶變 體的^ _電勢(shì)較之親本酶的^ _電勢(shì)更接近底物污漬的^ _電勢(shì)。在一些實(shí)施方式中，修
7飾包含至少一個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些備選的實(shí)施方式中，修飾包含對(duì)親本 酶的化學(xué)修飾。在另一些實(shí)施方式中，底物污漬特異性酶變體帶正電荷并且是吸熱性的，底 物污漬帶負(fù)電荷。在一些備選實(shí)施方式中，污漬特異性酶變體帶負(fù)電荷并且是放熱性的，底 物污漬帶負(fù)電荷。在另一些實(shí)施方式中，污漬特異性酶變體帶正電荷并且是放熱性的，底物 污漬帶電荷。在另一些實(shí)施方式中，污漬特異性酶變體帶負(fù)電荷并且是吸熱性的，底物污漬 帶正電荷。 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)用于清潔多種污漬的組合物的方法，所述方法包括a)測(cè)定 參照緩沖液中多種污漬中每種的^ _電勢(shì)；b)選擇在參照緩沖液中具有與多種污漬中至少 一種的^-電勢(shì)基本相等的^-電勢(shì)的清潔用酶；以及c)生產(chǎn)用于清潔多種污漬的組合 物，其中所述組合物包含步驟b)中選擇的至少一種清潔用酶。在另一些實(shí)施方式中，組合 物包含pH和傳導(dǎo)性與參照緩沖液基本相等的洗滌劑溶液。在另一些實(shí)施方式中，選擇步驟 鑒定不止一種清潔用酶。在還一些實(shí)施方式中，組合物包含至少兩種清潔用酶，其中所述至 少兩種清潔用酶具有與多種污漬中的至少兩種的^ _電勢(shì)相應(yīng)的^ _電勢(shì)。
本發(fā)明還提供了使用本文所示的方法生產(chǎn)的用于清潔多種污漬的組合物。在一些 優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物包含至少一種清潔用酶。在一些備選實(shí)施方式中，所述至少一種 清潔用酶是變體蛋白質(zhì)。在另一些實(shí)施方式中，變體蛋白質(zhì)比用于生產(chǎn)變體蛋白質(zhì)的野生 型前體蛋白質(zhì)帶更多負(fù)電荷，而在一些備選實(shí)施方式中，變體蛋白質(zhì)比用于生產(chǎn)變體蛋白 質(zhì)的野生型前體蛋白質(zhì)帶更多正電荷。在還一些實(shí)施方式中，變體蛋白質(zhì)比用于生產(chǎn)變體 蛋白質(zhì)的野生型前體蛋白質(zhì)帶更多負(fù)電荷，以增強(qiáng)在含有陰離子表面活性劑的洗滌劑中的 穩(wěn)定性。 附圖簡(jiǎn)述

圖1描述了在匹配的pH和傳導(dǎo)性(5mM HEPES pH 8. 0， 2. 5mMNaCl)的AATCC液體 洗滌劑(實(shí)心三角)和緩沖液(空心圓圈)中測(cè)量的ASP變體的相對(duì)的血、奶、墨汁(BMI) 微布樣(microswatch)活性(相對(duì)最佳性能者歸一化)，其作為相對(duì)野生型ASP的凈電荷變 化的函數(shù)展示。 圖2描述了在AATCC液體洗滌劑(實(shí)心三角)中測(cè)量的ASP電荷組合文庫(kù)的相對(duì) 血、奶、墨汁(BMI)微布樣活性(相對(duì)最佳性能者歸一化)，其作為相對(duì)野生型ASP的凈電荷 變化的函數(shù)展示。 圖3描述了在NaCl濃度不同(2. 5mM(空心圓圈)、16mM(灰色圓圈)禾P 100mM(黑 色圓圈))的5mM HEPES pH 8. 0中測(cè)量的ASP變體的相對(duì)的BMI微布樣活性(相對(duì)最佳性 能者歸一化)，其作為相對(duì)野生型ASP的電荷變化的函數(shù)展示。 圖4描述了在北美液體洗衣條件下測(cè)量的FNA(圖A)和GG36 (圖B)電荷組合文
庫(kù)變體(實(shí)心符號(hào))的相對(duì)的血、奶、墨汁(BMI)微布樣活性(相對(duì)親本分子歸一化)，其作
為相對(duì)親本FNA或野生型GG36 (空心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖5描述了在西歐液體洗衣條件下測(cè)量的FNA(圖A)和GG36 (圖B)電荷組合文
庫(kù)變體(實(shí)心符號(hào))的相對(duì)的血、奶、墨汁(BMI)微布樣活性(相對(duì)親本分子歸一化)，其作
為相對(duì)親本FNA或野生型GG36 (空心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖6描述了在日本洗衣粉條件下測(cè)量的FNA(圖A)和GG36 (圖B)電荷組合文庫(kù)
變體(實(shí)心符號(hào))的相對(duì)的血、奶、墨汁(BMI)微布樣活性(相對(duì)親本分子歸一化)，其作為相對(duì)親本FNA或野生型GG36 (空心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖7描述了在西歐自動(dòng)餐具清洗條件下測(cè)量的FNA(圖A)和GG36 (圖B)電荷組 合文庫(kù)變體(實(shí)心符號(hào))的相對(duì)的烤蛋微布樣活性(相對(duì)親本分子歸一化)，其作為相對(duì)親 本FNA或野生型GG36 (空心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖8描述了在北美洗衣條件下測(cè)量的S242Q電荷組合文庫(kù)變體(空心符號(hào))的稻 淀粉微布樣活性(相對(duì)親本歸一化)，其作為相對(duì)親本(實(shí)心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展 示。 圖9描述了在西歐洗衣條件下測(cè)量的TS23t電荷組合文庫(kù)變體(空心符號(hào))的稻 淀粉微布樣活性(相對(duì)親本歸一化)，其作為相對(duì)親本(實(shí)心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展 示。 圖10描述了 S242Q電荷組合文庫(kù)變體(空心符號(hào))的相對(duì)特異性B0DIPY淀粉水 解活性(相對(duì)親本歸一化)，其作為相對(duì)親本(實(shí)心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展示。
圖11描述了第一AmyS電荷梯級(jí)的最終粘度，其作為相對(duì)野生型AmyS的凈電荷變 化的函數(shù)展示。 圖12在第一軸描述了在緩沖液(5mM HEPES pH 8. 0，2. 5mM NaCl)中測(cè)量的ASP
變體的BMI微布樣活性對(duì)4 _電勢(shì)。第二軸展示了 ASP變體的BMI微布樣活性(通過(guò)正態(tài)
分布擬合的峰值歸一化，實(shí)線)對(duì)z-分?jǐn)?shù)。底物污漬的4 _電勢(shì)等于_8. 97mV。 圖13描述了在NaCl濃度不同(2. 5mM NaCl (空心)、16mM NaCl (灰色)禾P lOOmM
NaCl (黑色))的5mM HEPES pH 8. 0中測(cè)量的ASP變體的BMI微布樣活性對(duì)結(jié)合的ASP的比例。 圖14描述了在AATCC HDL洗滌劑(三角形)或NaCl濃度不同(2. 5mM NaCl (空
心圓圈)、16mM NaCl (灰色圓圈)禾卩l(xiāng)OOmM NaCl (黑色圓圈))的5mM HEPES pH 8. 0中測(cè)
量的結(jié)合的ASP的比例，其作為相對(duì)野生型ASP的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖15描述了在具有2. 5mM NaCl的5mM HEPES pH 8. 0中測(cè)量的ASP電荷組合變
體(空心符號(hào))的結(jié)合比例，其作為相對(duì)親本ASP-R14I(實(shí)心符號(hào))的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖16描述了在含有2. 5mM NaCl的5mM HEPES pH 8. 0中測(cè)量的結(jié)合的ASP的比 例，其作為^-電勢(shì)的函數(shù)展示。 圖17描述了 ASP變體在枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)中的表達(dá)水平，其作 為相對(duì)野生型ASP的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖18在第一軸描述了 ASP變體(實(shí)心圓圈)和NprE變體(空心圓圈)在枯草芽 孢桿菌中的表達(dá)水平，其作為4 _電勢(shì)的函數(shù)展示(在具有2. 5mM NaCl的參照緩沖液5mM HEPES pH 8. 0中測(cè)量的)。第二軸展示了 ASP變體的表達(dá)水平(通過(guò)正態(tài)分布擬合的峰值 歸一化，實(shí)線)對(duì)z-分?jǐn)?shù)。 圖19描述了 ASP變體的LAS穩(wěn)定性，其作為相對(duì)野生型ASP的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖20描述了 FNA變體的LAS/EDTA穩(wěn)定性，其作為相對(duì)親本FNA的凈電荷變化的 函數(shù)展示。 圖21描述了 TS23t變體的LAS/EDTA穩(wěn)定性，其作為相對(duì)親本TS23t_7mut的凈電
圖22描述了 ASP變體的熱穩(wěn)定性，其作為相對(duì)野生型ASP的凈電荷變化的函數(shù)展示。 圖23描述了第一 AmyS電荷梯級(jí)的熱穩(wěn)定性，其作為相對(duì)野生型AmyS的電荷變化的函數(shù)展示。 圖24描述了分別在不同溫度4(TC、5(TC和6(TC時(shí)ASP(圖A)和NprE(圖B)的熱活性，其作為相對(duì)野生型ASP和NprE的凈電荷變化的函數(shù)展示。熱活性展示為3(TC活性的比例(用升高的溫度下的活性除以3(TC時(shí)的活性)。 圖25描述了在不同溫度4(TC、5(TC和6(rC時(shí)ASP(圖A)和NprE(圖B)的熱活性，其作為4-電勢(shì)的函數(shù)展示。熱活性展示為3(TC活性的比例(用升高的溫度下的活性除以3(TC時(shí)的活性)。 圖26描述了含有2. 5mM NaCl的5mM HEPES pH 8. 0中30°C (空心圓圈)和40°C (實(shí)心圓圈)時(shí)ASP電荷梯級(jí)變體的熱穩(wěn)定性。 圖27提供了電荷變化矩陣，其展示了pH 8.6下氨基酸殘基取代的電荷變化。從該矩陣可以容易地測(cè)定變體酶較之親本酶的凈電荷變化。 圖28提供了氫鍵合能力變化矩陣，其展示了氨基酸殘基取代的氫鍵合能力變化。從該矩陣可以容易地測(cè)定變體酶較之親本酶的凈氫鍵合能力變化。 圖29提供了 Kyte-Doolittle親水性(hydropathicity)變化矩陣，其展示了氨基酸殘基取代的親水性變化。從該矩陣可以容易地測(cè)定變體酶較之親本酶的凈親水性變化。
圖30提供了Eisenberg疏水性變化矩陣，其展示了氨基酸殘基取代的疏水性變化。從該矩陣可以容易地測(cè)定變體酶較之親本酶的凈疏水性變化。 圖31提供了第一 AmyS電荷梯級(jí)的稻淀粉清潔活性，其作為pH的函數(shù)展示。pH3. 0-4. 25是200mM甲酸鈉+0. 01 % Tween-80。 pH 4. 25-5. 5是200mM乙酸鈉+0. 01 %
Tween-80。將數(shù)據(jù)與滴定曲線擬合，每個(gè)有單一的pKa值。 圖32提供了在圖31中測(cè)定的pKa值對(duì)相對(duì)野生型AmyS的電荷變化作圖。
發(fā)明的一般性描述 本發(fā)明提供了獲得下述蛋白質(zhì)的高效方法，所述蛋白質(zhì)在工業(yè)、消費(fèi)者或藥物應(yīng)用中具有一種或多種有益屬性。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過(guò)篩選候選酶的縮略組生產(chǎn)用于給定應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)酶的方法。 蛋白酶枯草桿菌蛋白酶是在衣物洗滌劑中使用的主要酶，并且可能是全世界最廣泛使用的酶。大約20年前，注意到表面靜電效應(yīng)可能調(diào)節(jié)枯草桿菌蛋白酶的催化活性(參見例如，Russell和Fersht， Nature 328 :496-500[1987])。較為近來(lái)，觀察到涉及改變枯草桿菌蛋白酶的凈電荷的突變顯著影響在洗滌劑中的洗滌性能(參見例如，引入本文作為參考的EP專利號(hào)O 479 870 Bl)。這個(gè)有利效應(yīng)被認(rèn)為是使枯草桿菌蛋白酶pl (等電點(diǎn))朝向洗滌液的pH遷移的結(jié)果。然而，隨后的工作證實(shí)這個(gè)結(jié)論并非總是適用(參見例如，引入本文作為參考的美國(guó)專利號(hào)6，673，590 Bl)。如本專利中指出的，枯草桿菌蛋白酶中電荷突變的效應(yīng)顯著地依賴于洗滌劑濃度，其中降低親本枯草桿菌蛋白酶的pl的突變提供在低洗滌劑濃度下更有效的酶，而提高pl的突變提供在高洗滌劑濃度下更有效的酶。這具有極大用途，因?yàn)橄礈煲褐械南礈靹舛仍谌澜绶秶鷥?nèi)變化極大。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)
10人員已經(jīng)顯而易見的是，對(duì)于枯草桿菌蛋白酶的洗滌性能，存在依賴于洗滌液中的pH和洗滌劑濃度的最優(yōu)pl。改進(jìn)枯草桿菌蛋白酶在衣物洗滌劑中的活性的其它努力已經(jīng)描述(參見在本文引用作為參考的美國(guó)專利
發(fā)明者A·J·保羅斯, D·A·埃斯特爾, J·T·小凱爾特斯, L·G·卡斯康-佩雷拉 申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司