專利名稱：治療腎功能衰竭的選擇性細(xì)胞療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明在用于恢復(fù)器官功能的選擇性細(xì)胞療法的領(lǐng)域內(nèi)。
背景技術(shù)：
慢性腎功能衰竭的特征在于腎功能的漸進(jìn)喪失，并且最終可進(jìn)行至終末期腎功能 衰竭，此時(shí)腎不再以維持身體的水平發(fā)揮功能作用。終末期腎功能衰竭是牽涉受累者的多 個(gè)器官的破壞性疾病。在美國終末期腎病的最常見病因是糖尿病。由腎臟進(jìn)行的功能之一是產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素(EP0)。當(dāng)腎正常發(fā)揮功能時(shí)， 腎間質(zhì)中的低組織氧合作用(tissue oxygenation)刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生EP0。分泌的EP0 接著刺激骨髓中紅細(xì)胞產(chǎn)生，這使組織氧壓恢復(fù)至正常水平。由無效造血(ineffective hematopoiesis)所致的貧血是由于腎減小的產(chǎn)生EP0的能力引起的慢性腎功能衰竭的不 可避免的一個(gè)結(jié)果。也已報(bào)導(dǎo)EP0具有抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。腎是身體中EP0的主要產(chǎn)生者，從而是治療腎功能衰竭誘導(dǎo)的貧血的主要靶。雖 然透析可延長許多終末期腎病患者的存活，但目前只有腎移植才可恢復(fù)正常功能。然而，腎 臟移植嚴(yán)重受限于臨床供體不足。多年來用于緩解與腎功能衰竭相關(guān)的貧血的治療包括反復(fù)地輸入紅細(xì)胞以及施 用睪酮和其他促蛋白合成類固醇(anabolic steroid)。然而，此類治療方法一直以來沒有 一個(gè)是完全令人滿意的。接受反復(fù)輸血的患者遭受鐵超負(fù)荷(iron overload)，并且可產(chǎn)生 抗主要組織相容性抗原的抗體。睪酮對骨髓中紅細(xì)胞生成作用最小，并且其與不期望的男 性化副作用相關(guān)。之前減輕與腎功能衰竭相關(guān)的貧血的努力包括施用純化的重組EP0(參見，授予 例如Cheung等人的美國專利6，747，002，授予ffestenfelde等人的6，784，154)。然而，重 組EP0的施用只是暫時(shí)提高了血液中的EP0水平，并且可導(dǎo)致缺鐵癥。也一直在尋求其中 使用轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞產(chǎn)生EP0的基因治療方法(參見，例如，授予Selden等人的美國專利 5，994，127，授予 Aebischer 等人的 5，952，226，授予 Carcagno 等人的 6，777，205 ；Rinsch 等 人(2002)Kidney International 62 1395-1401)。然而，這些方法牽涉非腎細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，并 且需要在移植后防止抗原識(shí)別和免疫排斥的技術(shù)例如細(xì)胞包囊化(cell encapsulation)。 此外，使用外源DNA的轉(zhuǎn)染可能是不穩(wěn)定的，隨著時(shí)間的過去，細(xì)胞可喪失它們表達(dá)EP0的 能力。基于腎細(xì)胞的替換腎組織的方法受到對鑒定腎細(xì)胞和以足夠的數(shù)量擴(kuò)增其的需 要的限制。此外，用于腎組織工程目的的腎細(xì)胞的培養(yǎng)因腎的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和細(xì)胞異質(zhì)性而特 別困難。腎臟是具有多種功能(包括廢物排泄、身體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(body homeostasis)、電解 質(zhì)平衡、溶質(zhì)運(yùn)輸以及激素產(chǎn)生)的復(fù)雜器官。
仍然存在對用于緩解腎細(xì)胞的衰竭所致的貧血以產(chǎn)生足夠量的促紅細(xì)胞生成素 的備選治療選擇的巨大需要。發(fā)明概述在本發(fā)明的實(shí)施方案中本文提供了從已進(jìn)行了傳代和/或體外擴(kuò)增的腎的分化 細(xì)胞收獲的分離的腎細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，腎細(xì)胞包括腎臟的腎小管周圍間質(zhì)細(xì) 胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腎細(xì)胞由或基本上由獲自腎組織的并且體外傳代 的腎的腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)生促紅細(xì)胞 生成素(EP0)。在另外的實(shí)施方案中，選擇腎細(xì)胞來進(jìn)行EP0產(chǎn)生。還提供了產(chǎn)生分離的產(chǎn)生EP0的細(xì)胞群體的方法，該方法包括步驟1)收獲分化 腎細(xì)胞；和2)將分化腎細(xì)胞傳代，其中細(xì)胞在所述傳代后產(chǎn)生EP0 ；從而產(chǎn)生分離的產(chǎn)生 EP0的細(xì)胞群體。在一些實(shí)施方案中，方法還包括選擇分化腎細(xì)胞來進(jìn)行EP0產(chǎn)生的的步 驟。在一些實(shí)施方案中，傳代步驟包括在包含胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒(ITS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)分 化腎細(xì)胞。還提供了治療有此需要的受試者(例如，患者)中導(dǎo)致減少的EP0產(chǎn)量的腎病或 其他不適(ailment)的方法，該方法包括步驟1)提供分離的產(chǎn)生EP0的細(xì)胞群體；和2)對 受試者施用所述群體(例如，以有效治療腎病和/或減少的EP0產(chǎn)量的量)，從而產(chǎn)生EP0 的細(xì)胞體可在體內(nèi)產(chǎn)生EP0。在一些實(shí)施方案中，通過收獲腎的分化腎細(xì)胞并且在體外傳代 細(xì)胞來進(jìn)行提供步驟。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生EP0的細(xì)胞群體包括，由或基本上由獲自腎 的分化細(xì)胞的并且體外傳代的腎小管周圍內(nèi)皮細(xì)胞和/或間質(zhì)細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案 中，在適當(dāng)?shù)妮d體(例如，膠原凝膠)中提供所述群體以便施用。在一些實(shí)施方案中，通過 將細(xì)胞群體植入患者的腎來進(jìn)行施用步驟。在一些實(shí)施方案中，施用步驟通過皮下注射或 植入所述組合物來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生EP0的細(xì)胞是人細(xì)胞。還提供了分離的細(xì)胞群體，其包括獲自人腎組織并且已進(jìn)行體外傳代的分化人腎 細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腎細(xì)胞由或基本上由獲自腎組織的并且已進(jìn)行體外傳代的腎的 腎小管外周間質(zhì)細(xì)胞和/或內(nèi)皮細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案中，分化人腎細(xì)胞產(chǎn)生促紅細(xì) 胞生成素(EP0)。在一些實(shí)施方案中，人腎細(xì)胞已傳代1至20次。在一些實(shí)施方案中，人腎 細(xì)胞已傳代至少3次。在一些實(shí)施方案中，群體已被選擇用于EP0產(chǎn)生。一些實(shí)施方案以 不使用編碼多肽的外源DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞為條件。還提供了包含如本文所述的人腎細(xì)胞群體和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。在一 些實(shí)施方案中，載體包括膠原。本發(fā)明的另一個(gè)方面是如本文所述的方法用于制備組合物或藥劑或用于制造如 本文所述的制品的用途，所述組合物或藥劑用于治療或用于進(jìn)行如本文所述的治療方法 (例如，用于治療導(dǎo)致減少的EP0產(chǎn)量的腎病或其他不適)。附圖概述

圖1.促紅細(xì)胞生成素(EP0)產(chǎn)生的機(jī)制。腎的腎間質(zhì)管周細(xì)胞(Renal interstitial peritubular cell)檢測到低血氧水平，然后將EPO分泌入血液。EP0刺激 紅系祖細(xì)胞(erythroid progenitor)的增殖和至網(wǎng)織紅細(xì)胞的分化，并且阻止細(xì)胞凋亡， 從而引起更多的網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)血液。網(wǎng)織紅細(xì)胞分化成紅細(xì)胞，從而增加了紅細(xì)胞 系的數(shù)量。從而增加了氧至組織的輸送。
圖2.與陰性對照(X400)相比較，在第一代1 (P1)、第2代(P2)和第3代(P3)于 腎細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中確認(rèn)了細(xì)胞內(nèi)促紅細(xì)胞生成素的免疫反應(yīng)性。圖3.腎組織(左圖)和培養(yǎng)腎細(xì)胞(右圖)中促紅細(xì)胞生成素表達(dá)細(xì)胞的顯微 鏡圖像。圖4.產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素(EP0)的細(xì)胞的定量。表達(dá)EP0的細(xì)胞數(shù)目隨著后續(xù) 傳代而減少(*P < 0. 05)。圖5.去污劑溶解的細(xì)胞提取物的Western印跡分析檢測到早期代原代培養(yǎng)的腎 細(xì)胞(P0-P3)的 EP0 蛋白(34kDa)。圖6.使用FACS進(jìn)行的EP0表達(dá)分析。頂行小鼠細(xì)胞，第0至3代。底行大鼠 細(xì)胞，第0至3代。圖7A-7B.小鼠腎細(xì)胞的表征。通過免疫熒光(圖7A)確認(rèn)EP0表達(dá)(KNRK細(xì)胞 用作正對照)。也檢測到GLEPP1和Tamm Horsfall腎標(biāo)記(圖7B)。圖8.大鼠腎細(xì)胞的表征。培養(yǎng)大鼠腎細(xì)胞具有不同細(xì)胞形態(tài)學(xué)，如由相差顯微鏡 (左圖)所顯示的，并且表達(dá)GLEPP1和Tamm Horsfall腎標(biāo)記(右圖)。圖9.通過western印跡顯示EP0在IfepG2細(xì)胞中的表達(dá)，將其與腎細(xì)胞中的EP0 表達(dá)相比較。圖10.在低氧條件下的培養(yǎng)細(xì)胞的EP0蛋白的表達(dá)。在正常和低氧條件下培養(yǎng) Lewis大鼠腎細(xì)胞和H印G2細(xì)胞，通過細(xì)胞的western印跡估量EP0產(chǎn)量。34kDa = EP0 ； 43kDa = 肌動(dòng)蛋白。圖11.在低氧條件下培養(yǎng)基中EP0蛋白質(zhì)的表達(dá)。通過western印跡法估量Lewis 大鼠腎細(xì)胞和H印G2細(xì)胞的培養(yǎng)基中的EPO。34kDa = EP0 ；43kDa = 0 -肌動(dòng)蛋白。圖12.從第1和2代大鼠腎原代細(xì)胞制備總蛋白裂解物。處理來自含氧量正常的 樣品(NC)、3% 02和7% 02中的樣品的培養(yǎng)皿，在10% SDS-PAGE上進(jìn)行電泳。KNRK細(xì)胞系 用作正對照。圖13.通過western印跡測量培養(yǎng)基濃縮物中的EP0。在各代將來自Lewis大鼠 的原代培養(yǎng)細(xì)胞在10cm培養(yǎng)皿上培養(yǎng)至接近匯合。用KSFM饑餓細(xì)胞24小時(shí)，然后置于 低氧箱(1%02)中進(jìn)行24、48或72小時(shí)。在低氧溫育后，收集培養(yǎng)基，用10K分子量篩截 amicon超離心裝置(Millipore)進(jìn)行濃縮。然后將40ug總蛋白上樣在10%聚丙烯酰胺凝 膠上。KNRK細(xì)胞用作正對照。圖14.取回的植入物的組織學(xué)分析顯示腎細(xì)胞在體內(nèi)存活并且形成組織。使用 EP0特異性抗體在組織免疫學(xué)上確認(rèn)了 EP0產(chǎn)生細(xì)胞的存在(X400)。左圖lxl06個(gè)細(xì)胞/ 注射的初始細(xì)胞密度。右圖lxl06個(gè)細(xì)胞/注射的初始細(xì)胞密度。每一個(gè)圖的頂行2周。 每一個(gè)圖的底行4周。圖15.通過實(shí)時(shí)PCR測量的培養(yǎng)基和低氧對腎原代細(xì)胞的作用。將腎原代細(xì)胞 (p0)在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%的匯合。然后用無血清KSFM或DMEM培養(yǎng)3個(gè)培養(yǎng)皿的 細(xì)胞并且置于3% 02的低氧箱中。在24小時(shí)后，處理樣品以進(jìn)行RNA和cDNA合成。以一 式三份重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，相對于含氧量正常的樣品定量樣品。圖16.通過實(shí)時(shí)PCR測量的低氧對腎原代細(xì)胞的作用。將腎原代細(xì)胞(第0代和 第2代)在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%的匯合。然后將細(xì)胞培養(yǎng)在無血清KSFM中并且置于1%02的低氧箱中。在24、48或72小時(shí)后，然后處理樣品以進(jìn)行RNA和cDNA合成。以 一式三份重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，相對于含氧量正常的樣品定量樣品。圖17.通過實(shí)時(shí)PCR測量的低氧對腎原代細(xì)胞的作用。將腎原代細(xì)胞(第0代) 在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至80%的匯合。然后將細(xì)胞置于02的低氧箱中進(jìn)行達(dá)到24小 時(shí)。然后處理樣品以進(jìn)行RNA和cDNA合成。以一式三份重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，相對于含氧量 正常的樣品定量樣品。圖18.擴(kuò)增原代人腎細(xì)胞。顯示了第2、4、7和9代的細(xì)胞。圖19.人原代腎細(xì)胞被保持通過20次倍增。圖20.人腎細(xì)胞的表征。GLEPP1和EP0陽性細(xì)胞存在于群體中。圖21.使用20mg/ml膠原載體進(jìn)行的人腎細(xì)胞體內(nèi)遞送。在取回時(shí)，注射后3周， 注射體積得到保持，并且存在新血管形成。圖22.膠原和培養(yǎng)的人腎細(xì)胞的注射膠原導(dǎo)致表達(dá)EP0的組織在體內(nèi)形成。優(yōu)選實(shí)施方案的詳述可以以兩個(gè)方向總體地和選擇性地進(jìn)行用于腎功能衰竭的基于細(xì)胞的療法。本 文所描述的是用于實(shí)現(xiàn)特定功能器官組分的恢復(fù)的選擇性細(xì)胞療法。本文引用的所有美國專利參考資料的公開內(nèi)容以它們與本文所示的公開內(nèi)容相 一致的程度通過引用合并入本文。如本文所使用的，在本發(fā)明的描述和所附權(quán)利要求中，除 非上下文清楚地指出，否則單數(shù)形式“a”、“an”和“the”旨在也包括復(fù)數(shù)形式。此外，如本 文所使用的，術(shù)語“大約”和“大致”當(dāng)指測量值例如化合物的量、劑量、時(shí)間、溫度等時(shí)，意 指包括指定量的20 %、10%、5 %、1 %、0. 5 %或甚至0. 1 %的變化。同樣，如本文所使用的， “和/或”或“/”是指和包括一個(gè)或更多個(gè)相關(guān)列出項(xiàng)的任何和所有可能組合和，當(dāng)在二者 選一(“或”)情況下解釋時(shí)表示不存在組合?！澳I組織”是從腎分離或收獲的組織，該組織包含腎細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腎細(xì) 胞對于一個(gè)或更多個(gè)已知的腎標(biāo)記例如GLEPPl、Tamm Horsfall等是陽性的?！凹?xì)胞”可以 是任何適當(dāng)?shù)奈锓N的細(xì)胞，在一些實(shí)施方案中是與向其中植入通過本文中的方法產(chǎn)生的組 織的物種相同的物種的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括小鼠、大鼠、狗、猴子和人細(xì)胞)在一些 實(shí)施方案中是特別優(yōu)選的。如本文所使用的，“分離的”表示將細(xì)胞置于除了它們的天然環(huán) 境外的環(huán)境中。當(dāng)最初從受試者分離組織或細(xì)胞例如原代外植體時(shí)，它們就被“收獲”?！笆茉囌摺蓖ǔＪ侨耸茉囌?，包括但不限于“患者”。受試者可以是男性或女性并且 可以是任何種族，包括但不限于高加索人、非洲裔美國、非洲人、亞洲人、西班牙人、印度人 等。受試者可以是任何年齡的人，包括新生兒、新生嬰兒(neonate)、嬰兒、兒童、青少年、成 人和老年人。受試者還可包括用于例如獸醫(yī)學(xué)和/或藥物開發(fā)目的動(dòng)物受試者，特別地哺乳動(dòng) 物受試者例如犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、牛族動(dòng)物、山羊科動(dòng)物(caprines)、馬科動(dòng)物、羊科動(dòng)物 (ovines)、豬、嚙齒類動(dòng)物(例如，大鼠和小鼠)、兔類動(dòng)物、非人靈長類動(dòng)物等。細(xì)胞可以是同基因的(即，遺傳上相同的或密切相關(guān)的，以使組織移植排斥降至 最低)、同種異體的(即，來自相同物種的非遺傳相同的成員)或異種的(即，來自不同物種 的成員)。同基因細(xì)胞包括為自體的(即，來自待治療的患者的)和等基因的(即，遺傳上 相同但不同受試者，例如來自相同雙胞胎的)細(xì)胞。細(xì)胞可獲自例如供體(即活的或尸體的)或來源于已建立的細(xì)胞株或細(xì)胞系。細(xì)胞可以例如使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)活檢技術(shù) 從供體收獲?！霸囵B(yǎng)”是在將分離的細(xì)胞或原代外植體接種入培養(yǎng)容器后建立的首次培養(yǎng)。 如本文所使用的，“擴(kuò)增”是指活細(xì)胞的數(shù)目的增加。擴(kuò)增可以通過例如將細(xì)胞“培養(yǎng)”通過 一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)，其中至少一部分細(xì)胞分裂，從而產(chǎn)生增加的細(xì)胞?！绑w外傳代的”或“傳代的”是指將細(xì)胞培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移或再培養(yǎng)至第二培養(yǎng)容器，通常 牽涉機(jī)械或酶促分離、再接種和取決于增殖速度，通常至兩個(gè)或更多個(gè)子培養(yǎng)物的分配。如 果就特定的基因型或表型選擇群體，培養(yǎng)物在傳代培養(yǎng)后變成“細(xì)胞株”，即，培養(yǎng)物是同質(zhì) 性的并且具有期望的特征(例如，表達(dá)EP0的能力)。EP0的“表達(dá)”或“表現(xiàn)”意指編碼EP0的基因被轉(zhuǎn)錄，和優(yōu)選被翻譯。通常，根據(jù) 本發(fā)明，EP0編碼區(qū)的表達(dá)將導(dǎo)致編碼的多肽產(chǎn)生，這樣細(xì)胞是“產(chǎn)生EP0的細(xì)胞”。在一些 實(shí)施方案中，細(xì)胞產(chǎn)生EP0而無需另外的操作例如外源基因的導(dǎo)入。在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的條件是不通過導(dǎo)入外源基因和/或利用刺激EP0的產(chǎn)生的外源化學(xué)試劑來處理產(chǎn) 生EP0的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，收獲的細(xì)胞不進(jìn)行傳代。在其他實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳代一 次、二次或三次。在其他實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳代3次以上。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳 代0至1次、0至2次或0至3次。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳代1至2次、1至3次或1 至4次或更多次。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳代2至3次、2至4次或更多次。在另外的 實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳代5、8、10、12或15或更多次。在一些實(shí)施方案中，將細(xì)胞傳代0、1、 2、3或4至8、10、15或20或更多次。所用的傳代次數(shù)可根據(jù)例如在每一次傳代后細(xì)胞群體 中測量的相對EP0產(chǎn)量來選擇。腎細(xì)胞的生長和擴(kuò)增逐漸受到明顯挑戰(zhàn)，因?yàn)榇祟惣?xì)胞易于停止生長和早期分 化。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中通過使用包含促進(jìn)它們生長的添加劑的腎細(xì)胞特異性培養(yǎng) 基(kidney cell specific media)來克服該挑戰(zhàn)。因此，在一些實(shí)施方案中，將腎細(xì)胞培 養(yǎng)在包含添加劑例如生長因子和促進(jìn)它們生長的其他補(bǔ)充劑的培養(yǎng)基中。此外，在一些實(shí) 施方案中，將產(chǎn)生EP0的細(xì)胞與其他腎細(xì)胞類型共培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，將腎細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)或fetal calf serum(FCS)和任選地青霉素-鏈霉素(P/S)的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)中。 在其他實(shí)施方案中，將腎細(xì)胞培養(yǎng)在角質(zhì)細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(KSFM)中。在另外的實(shí)施方 案中，將腎細(xì)胞培養(yǎng)在含有一種或更多種下列添加劑的KSFM中牛垂體提取物(BPE)(例 如，50g/mL)、表皮生長因子(EGF)(例如，5ng/mL)、抗生素-抗真菌藥溶液(GIBC0)(例如， 5mL)、胎牛血清(FBS) (Gemini Bio-Product)(例如，12. 5mL 2. 5% )和胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒 (ITS) (Roche)(例如，對于5L培養(yǎng)基50mg)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，在上述培養(yǎng)基的 一些實(shí)施方案中，青霉素-鏈霉素(P/S)與抗生素-抗真菌藥溶液是可互換的。根據(jù)本發(fā)明的腎細(xì)胞的傳代可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來進(jìn)行。例如，可使 用胰蛋白酶/EDTA分解細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至其他培養(yǎng)皿。這是用于許多細(xì)胞類型的標(biāo)準(zhǔn)方 法。簡而言之，在一些實(shí)施方案中，這可使用下列步驟來進(jìn)行1)除去培養(yǎng)基；2)加入10ml PBS/EDTA(0. 5M)進(jìn)行4分鐘，在相關(guān)顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞連接的分離；3)除去PBS/EDTA，加 入胰蛋白酶/EDTA ；4)當(dāng)在顯微鏡下80-90%的細(xì)胞浮起時(shí)加入5ml培養(yǎng)基；5)將細(xì)胞懸浮液抽吸入15ml試管中；6)以lOOOrpm離心細(xì)胞4分鐘；7)除去上清液；8)將細(xì)胞重懸浮于 5ml培養(yǎng)基中；9)用移液管吸出100 yl細(xì)胞懸浮液，然后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色以進(jìn)行存活率測 定；10)在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目；11)在板上等分期望的細(xì)胞數(shù)目，使培養(yǎng)基的 體積為總共10ml ；12)將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中?！斑x擇”可基于將一種細(xì)胞類型與另一種相區(qū)別的任何獨(dú)特性質(zhì)，例如密度、大 小、獨(dú)特的標(biāo)記、獨(dú)特的代謝途徑、營養(yǎng)需求、蛋白質(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)分泌等。例如，可基于密 度和大小使用離心梯度來選擇細(xì)胞?？捎脽晒饣罨?xì)胞分選術(shù)(fluorescent activated cell sorting) (FASC)、免疫磁珠分選術(shù)、磁性活化細(xì)胞分選術(shù)(magnetic activated cell sorting) (MASC)、淘選等來選擇獨(dú)特標(biāo)記。可通過改變在其上(特別地在無血清環(huán)境中) 培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分的組成和/或量來利用獨(dú)特的代謝途徑和營養(yǎng)需求?？捎貌?同的測定法例如ELISA檢測蛋白質(zhì)表達(dá)和/或分泌?！爱a(chǎn)生EP0的細(xì)胞”是指其的至少一部分產(chǎn)生EP0(例如，至少20、30、40或50%或 更多，或更優(yōu)選60、70、80或90%或更多的細(xì)胞產(chǎn)生EP0)的分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中， 細(xì)胞產(chǎn)生EP0而無需另外的處理例如外源基因的導(dǎo)入。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明以不通 過外源基因的導(dǎo)入和/或利用刺激EP0的產(chǎn)生的外源化學(xué)試劑來處理產(chǎn)生EP0的細(xì)胞為條 件。細(xì)胞可獲自例如腎的腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，就它們產(chǎn)生EP0的能 力來選擇細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)例如傳代來在數(shù)量上擴(kuò)增細(xì)胞?？?使用來自腎和來自其他來源的具有產(chǎn)生EP0的特定功能的細(xì)胞。例如，EP0也可在肝中正 常產(chǎn)生。在腎中，通常已知EP0由腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生(圖1)。在一些實(shí)施方案中， 分離的分化腎細(xì)胞群體包括，由或基本上由腎的腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞組成，其由或基本上 由80、90、95或99%或更多腎小管周圍間質(zhì)細(xì)胞和按數(shù)量計(jì)算不超過20、10、5或或更 少的其他細(xì)胞類型組成。在其他實(shí)施方案中，分離的分化腎細(xì)胞群體包括其他細(xì)胞類型例 如內(nèi)皮管周細(xì)胞(endothelial peritubular cell)。在一些實(shí)施方案中，分化腎細(xì)胞的分離群體包括，由或基本上由就EP0的產(chǎn)生而 選擇的腎細(xì)胞組成，其由或基本上由80、90、95或99%的或更多的產(chǎn)生EP0的細(xì)胞和按數(shù)目 計(jì)算不超過20、10、5或的不表達(dá)EP0的細(xì)胞組成。選擇可通過使用特異性標(biāo)記選擇表 達(dá)EP0的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可包括不同的腎細(xì)胞類型，只要所述細(xì)胞表 達(dá)EP0。在另外的實(shí)施方案中，可將整個(gè)腎細(xì)胞集落用于擴(kuò)增和治療。在一些實(shí)施方案中，分離的分化腎細(xì)胞群體具有“長壽命”，這樣當(dāng)體外培養(yǎng)時(shí)它 們就能夠生長通過至少5、10、15、20、25或30或更多次的群體倍增。在一些實(shí)施方案中，當(dāng) 在體外培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞能夠通過40、50或60或更多次群體倍增來增殖?！胺只摹笔侵妇哂刑鼗δ芾鏓P0產(chǎn)生和/或已知的分化細(xì)胞的標(biāo)記(例如 GLEPP1和/或Tamm Horsfall腎細(xì)胞標(biāo)記)的表達(dá)的細(xì)胞或包含所述細(xì)胞的群體。在該意 義上，它們不是祖細(xì)胞或干細(xì)胞。本發(fā)明的一些實(shí)施方案以不在產(chǎn)生特化程度不太高的細(xì) 胞群體的條件下對收獲的分化細(xì)胞進(jìn)行傳代為條件。備選地，在其他實(shí)施方案中，培養(yǎng)細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞系，該細(xì)胞系之后可分化產(chǎn)生更 特化的細(xì)胞。與細(xì)胞株相反，“細(xì)胞系”的建立總地來說是未分化的，雖然它們可被定型至 特定譜系。繁殖天然地有利于增殖表型，在一些實(shí)施方案中細(xì)胞可能需要通過例如變更培養(yǎng)條件來重新導(dǎo)入分化。存在許多本領(lǐng)域中已知的可在細(xì)胞系中誘導(dǎo)分化的分化因子(例 如，細(xì)胞因子例如表皮形態(tài)發(fā)生素和HGF、維生素等)。治療方法在一些實(shí)施方案中，可將產(chǎn)生EP0的細(xì)胞施用(例如，通過注射)至有此需要的受 試者的腎(例如，施用入皮質(zhì)和/或髓質(zhì))。在其他實(shí)施方案中，將產(chǎn)生EP0的細(xì)胞施用至 身體的其他部位，例如肝、腹膜等。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)皮下、被膜下(subcapsular)等施 用產(chǎn)生EP0的細(xì)胞。在另外的實(shí)施方案中，可通過植入本文所述的含有所述產(chǎn)生EP0的細(xì) 胞的基質(zhì)(例如，膠原凝膠支架)來施用產(chǎn)生EP0的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，通過血管通 路(vascular access)(例如，全身性或局部地)施用產(chǎn)生EP0的細(xì)胞?？捎帽疚乃_的方法治療的疾病包括但不限于貧血。貧血包括但不限于與腎功 能衰竭或終末期腎病相關(guān)的貧血、由化療或放射治療所致的貧血、慢性障礙例如慢性感染、 自身免疫性疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、AIDS所致貧血、惡性腫瘤所致貧血，早產(chǎn)兒貧血、甲狀腺 功能減退所致貧血、營養(yǎng)不良所致貧血(例如，缺鐵癥)和與血液病相關(guān)的貧血?！爸委煛笔侵笧榛颊呃缭馐芑蛱幱诎l(fā)生疾病(例如，腎病、貧血等)風(fēng)險(xiǎn)中的患者 帶來益處的任何類型的治療。治療包括為了改善患者的狀況(例如，一個(gè)或更多個(gè)癥狀的 緩解)、延遲疾病的發(fā)生或進(jìn)展等目的而采取的行為和克制不要采取的行為。其他內(nèi)分泌系統(tǒng)可受益于本文公開的治療，例如，產(chǎn)生維生素D的細(xì)胞療法或血 管緊張肽系統(tǒng)。參見，例如，授予Atala等人的美國專利申請
發(fā)明者A·阿塔拉, J·尤 申請人:韋克福里斯特大學(xué)健康科學(xué)院