專利名稱：：早期肝癌檢測的診斷測試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了檢測哺乳動物的早期肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級改變的方法和試劑盒。診斷標(biāo)記物是基于對存在于體液如血清中的診斷性碳水化合物作譜(profiling)和鑒定。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌(HCC)或肝癌是最常見的癌癥之一并且是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)死亡的首要原因之一(1)。HCC通常發(fā)生在乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染后的硬化肝中(2，3)。確實(shí)，肝硬化是重要的死亡原因并且是HCC發(fā)展的主要風(fēng)險因素，60-80%的HCC之前是硬化(4)。因此，篩選硬化人群的早期HCC可減少死亡率。多種成像技術(shù)被用于診斷HCC，例如超聲波檢查術(shù)，計算機(jī)斷層掃描和核磁共振成像(5，6)。但是這些技術(shù)不能區(qū)分良性肝損害如發(fā)育不良結(jié)節(jié)和HCC的硬化大結(jié)節(jié)。長期以來血清腫瘤標(biāo)記物已被用作檢測惡性腫瘤的有效方法(7-9)，它們是超聲波檢查術(shù)和計算機(jī)斷層掃描診斷HCC時的有價值的補(bǔ)充(10-12)。血清AFP(甲胎蛋白)是廣泛用于HCC診斷和隨訪的唯一的血清標(biāo)記物(13，14)。新近的綜合分析顯示AFP敏感性和特異性變化廣泛，這些變化不能完全歸因于使用的不同截斷值水平的閾值作用(15)。其他改良的血清學(xué)標(biāo)記物(無論單獨(dú)使用或聯(lián)合其它的)對于早期HCC診斷是需要的。經(jīng)肝或B淋巴細(xì)胞合成大多數(shù)的血清N-聯(lián)糖蛋白。血清總N-聚糖的任何改變可以反應(yīng)肝或B淋巴細(xì)胞生理學(xué)的改變。因?yàn)樘堑鞍椎奶擎湆τ谠诙嗉?xì)胞生物體中維持分化細(xì)胞的有序"社會行為"是重要的，糖鏈的改變導(dǎo)致異常的分子基礎(chǔ)例如腫瘤細(xì)胞侵入周圍組織及其轉(zhuǎn)移。在多種腫瘤中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了N-聯(lián)糖鏈的改變(6,16-18)。最近由于缺少適當(dāng)?shù)姆治黾夹g(shù)限制了糖組學(xué)在診斷上的應(yīng)用，但是至少在血清N-糖組的情況下這已被克服了(19,20)。在本發(fā)明中我們評價了使用血清N-聚糖指紋作為工具診斷由乙肝病毒誘導(dǎo)的硬化病人的肝細(xì)胞癌(HCC)。特別地，我們發(fā)現(xiàn)分枝a(1，3)_巖藻糖基化聚糖在HCC病人中比硬化病人，纖維化病人和健康血供者中豐度更高，但是平分型(bisecting)GlcNac(N-乙酰葡糖胺)-核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖在硬化病人中升高。這2種聚糖形式的濃度和其對數(shù)比率(命名為GlycoHCCTest)與肝癌腫瘤分期相關(guān)。圖1:上圖顯示麥芽糖寡糖作為糖質(zhì)量參照。指示這些結(jié)構(gòu)中的糖單位數(shù)(DP，聚合度)?？傃宓鞍踪|(zhì)中典型的去唾液酸化N-聚糖譜示于下圖。N-聚糖峰的結(jié)構(gòu)示于圖下。峰1是無半乳糖，核心-a_1，6-巖藻糖基化雙觸角聚糖(agalacto，core-a-1，6-fucosylatedbiantennaryglycan)(NGA2F)，峰2是無半乳糖，核心-a-1，6-巖藻糖基化平分型雙觸角(NGA2FB)，峰3和峰4是單無半乳糖，核心-a_1，6_巖藻糖基化雙觸角(NG1A2F)，峰5是雙半乳糖，雙觸角聚糖(NA2)，峰6是雙半乳糖，核心-a-1，6-巖藻糖基化雙觸角(NA2F)，峰7是雙半乳糖，核心-a-1，6-巖藻糖基化平分型雙觸角(NA2FB)，峰8是三觸角(NA3)，峰9是分枝型a-1，3-巖藻糖基化三觸角(NA3Fb)，峰10是核心-a_1，6-巖藻糖基化三觸角(NA3Fc)，峰ll是四半乳糖，四觸角(NA4)，峰12是分枝型a-l，3-巖藻糖基化四觸角(NA4Fb)。用于結(jié)構(gòu)式的符號是BP-連接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc);IP-連接的半乳糖；Ka-l，3/6-連接的巖藻糖；參a/p-連接的甘露糖。圖2:在硬化病人中檢測HCC的衍生診斷變量的趨勢。縱軸表示峰9，峰7和GlycoHCCTest的聚糖值。在HCC病人中峰9的聚糖值增加(A)，但是在硬化病人中峰7增加(B)。HCC組與硬化，纖維化和對照組比較，GlycoHCCTest顯著增高(C)。誤差線代表均數(shù)的95%置信區(qū)間。圖3:接受者操作特征(R0C)曲線預(yù)測在硬化組使用GlycoHCCTest和AFP值檢測HCC的臨床意義。曲線下面積(AUC)顯示GlycoHCCTest(0.81±0.03)的診斷能力類似AFP(0.78±0.03)。圖4:腫瘤分期和聚糖值，AFT，GGT和AST/ALT比率之間的關(guān)系。分析具有限定腫瘤分期的98個HCC病人。與硬化組比較，HCC組中的峰9、GlycoHCCTest、AFP和GGT的水平顯著增加，但是峰7和AST/ALT比率顯著減少。峰9，GlycoHCCTest,AFP和GGT顯示與腫瘤分期正相關(guān)，而峰7負(fù)相關(guān)。發(fā)現(xiàn)AST/ALT比率與腫瘤分期不相關(guān)。縱軸表示峰9(A)和峰7(B)的峰高，GlycoHCCTest(C)，AFP水平(D)，GGT水平(E)和AST/ALT比率(F)。誤差線代表均數(shù)的95%置信區(qū)間。圖5:GlycoHCCTest標(biāo)記物和肝纖維化的相關(guān)性。使用Scheuer記分系統(tǒng)評估針對纖維化分期作圖的GlycoHCCTest值。在GlycoHCCTest和纖維化分期之間無統(tǒng)計學(xué)顯著相關(guān)性。上下擬合線代表均數(shù)值(中間擬合線)的95%置信區(qū)間。圖6:峰9(b)和9'(a)的外切糖苷酶測序。使用NP-HPLC分離總血清N_聚糖和如指示使用單獨(dú)或聯(lián)合的外切糖苷酶陣列處理分離的級分。峰如圖l所示編號。gal二半乳糖；fuc=巖藻糖；hex=N-乙酰葡糖胺。圖7:外切糖苷酶處理總血清N-聚糖。使用a-l，3/4-巖藻糖苷酶處理總血清N-聚糖，顯示峰9和12是GlycoHCCTest中定量的。這個酶分別轉(zhuǎn)變這些結(jié)構(gòu)為峰8和11，但是它們的異構(gòu)結(jié)構(gòu)9'和12'保持不變。峰如圖1所示編號。gal=半乳糖；fuc=巖藻糖；hex二N-乙酰葡糖胺。圖8:聚糖轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)圖示。在HCC硬化病人中NA3Fb(峰9)濃度增加和NA2FB(峰7)水平降低可以由與GnT-111競爭底物的GnT-V活性增加并導(dǎo)致N-聚糖的Pl-6分枝來解釋。這依次導(dǎo)致產(chǎn)生LexisX聚糖的a-l，3-FuT表達(dá)增加。也顯示GlcNAcT-III表達(dá)增加的結(jié)果。虛線框顯示Lewis結(jié)構(gòu)的實(shí)例。圖9:在硬化病人中用于診斷HCC的GlycoHCCTest和LogAFP之間的關(guān)系。使用針對LogAFP作圖的GlycoHCCTest來分析針對80個硬化病人作圖的227個HCC病人。2條垂直線代表在lng/ml和400ng/ml的AFP截斷線，一條垂直線代表在AFP灰色區(qū)中(l-400ng/ml)在-0.34處的GlycoHCCTest的ROC確定的截斷值。如果未檢測到AFP，我們指定它的值為0.001ng/ml。圖10:使用GlycoHCCTest和AFP值，接受者操作特征(ROC)曲線預(yù)測在AFP灰色區(qū)(l-400ng/ml)檢測HCC的臨床意義。在AFP灰色區(qū)glycoHCCTest可從硬化病人中區(qū)分HCC病人，正確性是83±3%。聚糖標(biāo)記物的診斷能力比通常使用的AFP標(biāo)記物高很多，在相同的病人組內(nèi)AFP標(biāo)記物具有更低的診斷正確性(53±3%)。圖11:腫瘤分期和與AFP結(jié)合的聚糖值之間的關(guān)系。分析具有限定腫瘤分期的44個病人和AFP灰色區(qū)(l-400ng/ml)中的54個硬化病人。峰9單獨(dú)和GlycoHCCTest顯示與腫瘤分期的正相關(guān)，而單獨(dú)的峰7負(fù)相關(guān)。未發(fā)現(xiàn)AFP值與腫瘤分期之間存在相關(guān)性?？v軸代表峰9(A)和峰7(B)的峰高，GlycoHCCTest(C)，AFP水平(D)，平分型GlcNac(峰2+峰7)(E)和峰9與GlcNac平分型的對數(shù)比率(F)。誤差線代表均數(shù)的95%置信區(qū)間。發(fā)明目的和詳細(xì)描述因?yàn)楦谓M織活檢對于病人具有明顯的不適和具有并發(fā)癥風(fēng)險，因此它不適合于并入慢性肝病病人的常規(guī)(通常是每年)的隨診中。因此臨床上需要可以常規(guī)評估肝病進(jìn)程和能夠可靠地檢測早期肝細(xì)胞癌的標(biāo)記物。在本發(fā)明中，我們滿足了這個需要并且我們已經(jīng)發(fā)展了能夠檢測早期肝細(xì)胞癌的診斷劑。"早期"指肝細(xì)胞癌的T1和T2期(如本文材料和方法中的進(jìn)一步描述)。在本發(fā)明中，我們已經(jīng)鑒定了衍生自存在于血清中的糖蛋白的碳水化合物結(jié)構(gòu)之間的比率并已鑒定衍生自這些參數(shù)的定量參數(shù)和研究的病人的組織學(xué)早期肝細(xì)胞癌分期之間的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。換言之，在本發(fā)明中已令人驚奇地鑒定了診斷性碳水化合物的量或所述碳水化合物之間的相關(guān)量，這與早期肝細(xì)胞癌相關(guān)。本發(fā)明的第一個實(shí)施方案提供了檢測哺乳動物早期肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級改變的方法，包括a)從哺乳動物獲得血清或血漿樣品，b)在所述樣品中測量分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖之間的比率和c)將所述比率歸因于在所述哺乳動物中早期肝細(xì)胞癌的存在。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測哺乳動物早期肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級改變的方法，包括a)從哺乳動物獲得血清或血漿樣品，所述樣品表示血清或血液N-聯(lián)糖蛋白的總混合物，b)產(chǎn)生N-聯(lián)碳水化合物或其衍生片段、或所述N-聯(lián)碳水化合物或所述N-聯(lián)碳水化合物片段的標(biāo)記的衍生物、或由所述N-聯(lián)碳水化合物或所述N-聯(lián)碳水化合物片段的結(jié)構(gòu)確定的所述N-聯(lián)碳水化合物或所述N-聯(lián)碳水化合物片段的特征的第一個譜；所述N-聯(lián)碳水化合物或所述N-聯(lián)片段得自血清或血漿樣品中存在的血清或血漿蛋白質(zhì)的總混合物，其中所述第一個譜代表所述樣品中血清或血漿蛋白質(zhì)總混合物的N-聯(lián)碳水化合物部分的多樣性和濃度，c)在所述第一個譜中測量分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖的比率，d)比較在步驟c)獲得的測量比率和獲得自衍生自無肝細(xì)胞癌哺乳動物的譜的所述相同的分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖的比率以檢測肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級的改變，比較在步驟c)獲得的數(shù)據(jù)和在所述相同哺乳動物中的比率以檢測肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級的改變，其中所述比率代表所述哺乳動物的血清或血漿蛋白質(zhì)的總混合物的分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖的多樣性和濃度，和e)將在步驟d)獲得的比較結(jié)果歸因于在哺乳動物中檢測肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級的改變。在另一個實(shí)施方案中，分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，e)-巖藻糖基化雙觸角聚糖之間的比率是從血液蛋白質(zhì)的分離血清計算(測量)的。術(shù)語"分離"指比率的計算不是根據(jù)存在于樣品中的血清或血液蛋白質(zhì)的總量而是根據(jù)與血液或血清樣品分開(或分離)的特殊蛋白質(zhì)(例如已知分泌自肝的N-糖基化蛋白)測量的。本領(lǐng)域已知分離蛋白質(zhì)的方法(例如抗體_捕獲技術(shù))。分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖示于圖1并可以使用峰9或峰12或組合峰9和峰12。平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖示于圖1并可以使用峰7或峰2或組合峰7和峰2。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用存在于血液或血清中的分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖制備診斷檢驗(yàn)以檢測早期肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級的改變。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了利用存在于血液或血清中的分枝a(1，3)-巖藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-巖藻糖基化聚糖聯(lián)合檢測血清中的甲胎蛋白濃度制備診斷檢驗(yàn)以檢測早期肝細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌分級的改變。文字"檢測肝癌或肝細(xì)胞癌的方法"可被廣泛理解為篩選、診斷或預(yù)后(監(jiān)控)肝癌的方法。文字"肝癌或肝細(xì)胞癌分級的改變"指肝癌隨時間的進(jìn)展，其可以表示肝癌分期的進(jìn)展或肝癌分期的穩(wěn)定或肝癌分期的惡化。換言之，檢測肝癌分級的方法是監(jiān)控手段，其可用于預(yù)后預(yù)先診斷患有肝癌的病人(病人群體)和可用作生物標(biāo)記物作為肝癌治療劑的共同開發(fā)的輔助。文字"將比較結(jié)果歸因于"指可以獲得的結(jié)果的不同形式。"結(jié)果"可包括數(shù)值的增加，數(shù)值的減少，數(shù)值的穩(wěn)定?；蛘?結(jié)果"可落入得自例如分析具有組織學(xué)確定的肝癌特異分期的一組病人的值的范圍(例如95%置信區(qū)間，標(biāo)準(zhǔn)差)。在一個實(shí)施方案中，對于N-聯(lián)糖蛋白檢測本文所述碳水化合物的比率而沒有任何所述碳水化合物的分離步驟；因此樣品可以被這樣使用和不意味著碳水化合物的任何分離步驟，但是文字"從體液樣品分離"指的是碳水化合物分離自樣品中存在的糖綴合物。在一個特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于監(jiān)控給予患有肝癌的哺乳動物的治療的作用。在另一個特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法特異性檢測早期肝癌。術(shù)語"特異性"指的是肝癌可與其他肝病不同地被診斷，所述其他肝病包括肝硬化或甚至晚期肝硬化或肝纖維化或還有其他肝病。文字"聚糖"和"碳水化合物"可互換。"糖綴合物"表示含碳水化合物部分的任意化合物(例如蛋白質(zhì)或脂質(zhì))。文字"碳水化合物或其衍生片段"表示碳水化合物可被片段化以在片段化過程的產(chǎn)物之中產(chǎn)生至少一個寡糖或其衍生物。這個片段化過程的其他產(chǎn)物可包括單糖和寡糖或其衍生物。寡糖是化學(xué)結(jié)構(gòu)由本領(lǐng)域已知為單糖的至少2個化學(xué)連接的單位組成的碳水化合物。所述片段化過程可包括酶的、化學(xué)的和物理的處理。例如，使用糖苷酶(例如唾液酸酶從碳水化合物去除唾液酸殘基)處理(或消化)碳水化合物和因此獲得的譜由碳水化合物片段組成。例如，可以進(jìn)行糖苷酶消化以獲得更簡單的碳水化合物譜。采用化學(xué)方法通過柔和的酸解碳水化合物也可以去除唾液酸。在質(zhì)譜分析方法中，文字"片段"指碳水化合物在分析過程中經(jīng)常被片段化(例如碰撞誘導(dǎo)解離)，其中片段化產(chǎn)物也可以產(chǎn)生寡糖衍生物，其由化學(xué)連接到片段化發(fā)生之前是碳水化合物部分結(jié)構(gòu)的殘余的一或多個單糖的寡糖組成。本領(lǐng)域已知是質(zhì)譜片段化過程的產(chǎn)物的這樣的寡糖衍生物的實(shí)例是十字架切割(crossringcleavage)產(chǎn)物離子。"所述碳水化合物的特征"指其性質(zhì)和/或數(shù)量由碳水化合物的結(jié)構(gòu)確定的任意可測量參數(shù)。例如，這種可測量參數(shù)的實(shí)例是核磁共振參數(shù)如化學(xué)位移，同核和異核耦合常數(shù)，核歐沃豪斯效應(yīng)和殘留偶極耦合?；蛘?，這種可測量參數(shù)可以是所述碳水化合物結(jié)合其他分子例如血凝素和識別特異性結(jié)構(gòu)決6定簇或其組合的抗體的程度?；蛘撸渌@種可測量參數(shù)可以是碳水化合物起酶的底物作用的能力的程度，所述酶特異性修飾某些碳水化合物如糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶。使用肽N-糖苷酶F或其他本領(lǐng)域已知的內(nèi)切糖苷酶酶促消化可以從血清或血液混合物中的糖蛋白釋放N-聚糖。在另一個實(shí)施方案中，使用包括肼的本領(lǐng)域已知的方法釋放N-聚糖。在譜是得自仍化學(xué)連接到混合物中糖綴合物的碳水化合物的情況中，一個實(shí)施方案包括在獲得譜之前使用酶或化學(xué)過程修飾糖綴合物的非聚糖部分，例如修飾糖脂的脂質(zhì)部分的蛋白酶或酶。文字"碳水化合物的譜"表示包含所述碳水化合物的定性和/或定量信息的任意實(shí)體。例如，這可以表示所述碳水化合物的電泳或?qū)游鲎V。在一個特殊情況中，所述譜是所述碳水化合物的質(zhì)譜?；蛘撸鲎V可以是通過核磁共振分析獲得的信息。在另一個實(shí)例中，所述譜可以是描述凝集素結(jié)合碳水化合物的定性或定量方面的信息?；蛘?，所述譜可以是描述碳水化合物是特殊酶例如糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶底物程度的信息。這樣的信息可包括這種酶反應(yīng)的副產(chǎn)物的讀出檢測，如在糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中核苷酸以等摩爾量釋放。在特殊的實(shí)施方案中，文字"產(chǎn)生碳水化合物的譜"或"對碳水化合物作譜"也可暗示聚糖結(jié)構(gòu)被分離和隨后被檢測。通常在碳水化合物譜中可鑒定大量的碳水化合物。通常碳水化合物存在于復(fù)雜的混合物中并且需要分離才能進(jìn)行有效的檢測。使用包含電泳和層析的方法進(jìn)行分離。使用包含抗體檢測，凝集素檢測，NMR，質(zhì)譜和熒光的方法進(jìn)行檢測。在特殊的實(shí)施方案中，在產(chǎn)生聚糖譜之前需要從糖蛋白化學(xué)和/或酶促去除N-聚糖。本領(lǐng)域已知從糖蛋白制備N-聚糖的方法。在另一個特殊的實(shí)施方案中，在分離和檢測之前需要衍生N-聚糖。在一個方案中，可聯(lián)合DNA測序儀進(jìn)行本發(fā)明的方法以對N-聚糖作譜(包括分離和檢測)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這種方法也可應(yīng)用于適于激光誘導(dǎo)熒光檢測器的任何電泳系統(tǒng)。例如這樣的系統(tǒng)包括PACE系列毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Beckmanlnstruments，Inc.，F(xiàn)ullerton，Calif.)。本發(fā)明也可以用于適合激光誘導(dǎo)熒光檢測器的任意電泳系統(tǒng)。在另一個實(shí)施方案中也可以使用質(zhì)譜檢測方法如MALDI-TOF-MS檢測至少一種碳水化合物或其衍生片段的量。在質(zhì)譜方法中，碳水化合物經(jīng)常被片段化并因此在所述方法中檢測碳水化合物的片段。在另一個實(shí)施方案中也可以使用微流體學(xué)方法作譜。微流體學(xué)是一個快速成長的領(lǐng)域，其基于通過經(jīng)借鑒自微芯片工業(yè)(光蝕刻和化學(xué)濕蝕刻)的技術(shù)在固體介質(zhì)(主要是硅晶片或高純度玻璃板)中產(chǎn)生的窄孔通道的流體遷移。通過毛細(xì)管作用或活性泵，液體可流經(jīng)這些通道，通過電泳(Schmalzingetal(2001)MethodsMol.Biol.163，163-173)分析物在充滿液體的通道中遷移。在另一個實(shí)施方案中，使用包括薄層層析(TLC)，高效液相層析或氣相層析的方法通過層析分離進(jìn)行碳水化合物的分離。術(shù)語"所述N-聯(lián)碳水化合物或所述片段的標(biāo)記的衍生物"指標(biāo)記有導(dǎo)致有效檢測碳水化合物的物質(zhì)的N-聯(lián)碳水化合物。所述標(biāo)記的碳水化合物也被稱為衍生的碳水化合物。例如，發(fā)熒光化合物可被用于標(biāo)記碳水化合物。所述發(fā)熒光化合物優(yōu)選也帶有電荷以便于衍生的化合物在電泳條件下可以遷移。當(dāng)熒光團(tuán)標(biāo)簽未帶有電荷時，其可與可產(chǎn)生電荷的物質(zhì)偶聯(lián)。所述熒光團(tuán)標(biāo)記也允許通過熒光定量測量衍生的碳水化合物。發(fā)熒光化合物如9-氨基芘-l，4，6-三磺酸(APTS)和8-氨基萘-l，3，6-三磺酸(ANTS)特別適于電泳分離衍生的碳水化合物。用于熒光標(biāo)記碳水化合物的其他化合物包括2-氨基吡啶(AP)，5-氨基萘-2-磺酸鹽/酯(ANA)，l-氨基-4-萘磺酸(ANSA)，l-氨基-6，8-二磺酸(ANDA)，3-(4-羧苯甲?；?-2-喹啉甲醛7(CBQCA)，熒光黃，2-氨基吖啶酮和4-氨基芐腈(ABN)。在一個特殊的實(shí)施方案中，關(guān)于熒光標(biāo)記的碳水化合物的檢測，可使用本領(lǐng)域已知的任意檢測方法，但是優(yōu)選檢測使用激光器如二極管激光器、He/Cd激光器或氬離子激光器進(jìn)行。在一個特殊的實(shí)施方案中，使用基于電荷耦合裝置(CCD)照相機(jī)的成像系統(tǒng)觀測由電泳分離產(chǎn)生的標(biāo)記的碳水化合物條帶的譜。來自CCD照相機(jī)的信息隨后以數(shù)字形式儲存和經(jīng)多種計算機(jī)程序分析比較個體之間與參照標(biāo)準(zhǔn)之間診斷性碳水化合物模式。在另一個特殊實(shí)施方案中，凝膠分離的診斷性碳水化合物可被轉(zhuǎn)移到固定膜上，即印跡和然后用多種診斷性碳水化合物_特異性試劑如凝集素或所述診斷性碳水化合物的特異性單克隆或多克隆抗體探查。在一個特殊的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在哺乳動物中檢測肝纖維化的方法，包括通過使用特異性結(jié)合至少一種聚糖結(jié)構(gòu)和/或糖綴合物的配體測量和檢測衍生自患有或未患有纖維化的個體的樣品中具有不同豐度的所述至少一種聚糖結(jié)構(gòu)和/或糖綴合物。配體包括凝集素和抗體。例如，體液樣品中具有"平分型GlcNAc"殘基的N-聚糖結(jié)構(gòu)(或其綴合物)(GnT-III產(chǎn)物)的增加的豐度可以用特異性識別用平分型GlcNAc修飾的聚糖(或其綴合物)的凝集素如來自紅腰豆(Phaseolusvulgaris)的紅細(xì)胞凝集素(E-PHA)，膜聯(lián)蛋白V(動物凝集素)或其具有例如改良的特異性的突變體或這種修飾聚糖的特異性抗體檢測。因此，E-PHA凝集素可用于檢測平分型GlcNacal-6巖藻糖基化葡聚糖結(jié)構(gòu)(在實(shí)例中還命名為聚糖(或峰)2和7)?；蛘?，通過結(jié)合N-聚糖(或其綴合物)到僅結(jié)合未被平分型GlcNAc殘基替代的N-聚糖(或其綴合物)的凝集素的降低可檢測具有"平分型GlcNAc"殘基的N-聚糖結(jié)構(gòu)(或其綴合物)的增加的豐度。這種凝集素的實(shí)例是來自洋刀豆(Canavaliaensiformis)的凝集素(ConA)。使用來自Lotustetragonolobus的凝集素LotusA和來自鰻鱺(Anguillaanguilla)的凝集素AAA可檢測a1-3巖藻糖基化聚糖結(jié)構(gòu)(在實(shí)例中也命名為聚糖(或峰)9)?；蛘撸褂?1，3)巖藻糖(抗-巖藻糖抗體)和平分型(抗-平分型抗體)的特異性抗體可免疫檢測平分型聚糖和al-3巖藻糖基化聚糖。在本發(fā)明中術(shù)語"平分型"和"平分型GlcNac"可互換使用。在另一個實(shí)施方案中，所述碳水化合物作譜方法可以通過用不同于附著所述碳水化合物分析物的標(biāo)記的生色團(tuán)或熒光團(tuán)標(biāo)記的一或多個內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)電泳補(bǔ)充。通過將衍生的碳水化合物的電泳遷移率與內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)混合物的成分的遷移率參照，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)允許精確和可重復(fù)地確定衍生的碳水化合物的電泳遷移率。例如，羅丹明標(biāo)記的寡核苷酸標(biāo)準(zhǔn)Genescan500(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA，USA)或羅丹明標(biāo)記的6_，18-，30-，和42-具體寡核苷酸的混合物在作譜之前可加入衍生的聚糖中。在標(biāo)記分析樣品之前標(biāo)記診斷標(biāo)準(zhǔn)；但是優(yōu)選診斷標(biāo)準(zhǔn)在標(biāo)記分析標(biāo)準(zhǔn)時伴隨標(biāo)記。而且優(yōu)選定量標(biāo)準(zhǔn)中的診斷性碳水化合物以提供與分析樣品中診斷性碳水化合物的量的定量或定性比較。優(yōu)選用于分析的體液是那些可方便地獲得自病人的體液，特別優(yōu)選體液包括血清和血漿。雖然進(jìn)行本發(fā)明時不需要在(衍生的)聚糖作譜之前預(yù)處理樣品，在一個特殊的實(shí)施方案中，在分離和定量診斷性碳水化合物之前需要處理分析樣品。依據(jù)依賴于樣品液體的選擇和診斷性碳水化合物性質(zhì)的許多因素，處理樣品的預(yù)先方法可不同；這些因素包括診斷性碳水化合物的豐度，背景碳水化合物的濃度，干擾分子例如不利影響診斷性碳水化合物條帶遷移或診斷性碳水化合物的熒光標(biāo)記的分子的存在，和是否熒光標(biāo)簽需要與衍生的診斷性碳水化合物分離。適合這個處理或預(yù)處理樣品的方法包括透析，去除干擾分子(例如用于有效質(zhì)譜檢測的鹽)；超濾，濃縮診斷性碳水化合物和去除干擾分子；離心，去除干擾顆?；驖饪s細(xì)胞；沉淀，去除干擾分子，從血清去除白蛋白以富集糖基化蛋白質(zhì)和因此富集較低豐度的聚糖，使用糖苷酶去糖基化(例如唾液酸酶消化聚糖)以產(chǎn)生更簡單的聚糖譜；層析例如親合層析以從血清去除例如白蛋白。在本發(fā)明另一個實(shí)施方案中，為了能夠測量碳水化合物的相對量，診斷標(biāo)準(zhǔn)包括在凝膠上，用于在對象樣品中分析診斷性碳水化合物；但是，在與分析樣品暴露的條件相似的條件下，也可以通過與從預(yù)先進(jìn)行了熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳的診斷標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生的儲存記錄比較獲得診斷標(biāo)準(zhǔn)體現(xiàn)的信息例如條帶遷移距離和強(qiáng)度。診斷標(biāo)準(zhǔn)可以是陽性的，即相應(yīng)于患病個體中的全部碳水化合物模式，或是陰性的，即相應(yīng)于未患病個體。診斷標(biāo)準(zhǔn)可以與分析樣品具有相似組成，因此它們可以包含組成類似于在實(shí)際樣品中發(fā)現(xiàn)的組成的診斷性碳水化合物和背景碳水化合物二者。診斷標(biāo)準(zhǔn)可衍生自得自患病和未患病個體的樣品?；蛘?，診斷標(biāo)準(zhǔn)可包含一或多個無背景碳水化合物的診斷性碳水化合物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明也包括用于進(jìn)行肝癌診斷或檢測肝癌分級改變的試劑盒。例如診斷試劑盒可以制備為進(jìn)行肝癌的熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳診斷。作為另一個例子，診斷試劑盒被制備用于進(jìn)行肝癌的質(zhì)譜診斷。熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳診斷試劑盒提供了進(jìn)行肝癌診斷所需的試劑集合。適合的試劑盒能夠在實(shí)驗(yàn)室中方便地進(jìn)行熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳診斷。試劑盒可包括用于進(jìn)行肝癌鑒定實(shí)驗(yàn)的試劑。試劑盒可包括診斷標(biāo)準(zhǔn)，熒光標(biāo)記，免疫印跡和結(jié)合材料，例如膜，碳水化合物特異性結(jié)合試劑，凝集素，抗體，指導(dǎo)，樣品容器，和聚丙烯酰胺凝膠試劑，預(yù)制凝膠，酶緩沖液，還原劑(用于熒光團(tuán)標(biāo)記碳水化合物)，和能夠催化診斷性碳水化合物的結(jié)構(gòu)性改變的糖苷酶(例如唾液酸酶，半乳糖酶，巖藻糖苷酶)。更完全的試劑盒可包括進(jìn)行熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳所需的設(shè)備，例如聚丙烯酰胺凝膠裝置，CCD，激光器，DNA測序儀，計算機(jī)，軟件等。包括在熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳診斷試劑盒中的試劑優(yōu)選以預(yù)先測量的量提供。優(yōu)選試劑盒包括進(jìn)行本發(fā)明熒光團(tuán)輔助碳水化合物電泳方法的指導(dǎo)。診斷測試在實(shí)踐中是有用的，因?yàn)橥ㄟ^正常訓(xùn)練的實(shí)驗(yàn)室人員其足以易于大規(guī)模應(yīng)用。而且因?yàn)橛糜贒NA測序和突變檢測的基于電泳的高分辨率和高敏感性分析儀已經(jīng)在大量快速增加的臨床實(shí)驗(yàn)室中存在或大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室可負(fù)擔(dān)，用于肝癌的新的診斷性糖組學(xué)測試可以用其進(jìn)行。而且，可獲得的DNA分析儀允許每天每臺機(jī)器從幾個到成百上千個樣品規(guī)模的樣品通量，這依賴于每個實(shí)驗(yàn)室的需要。這種DNA分析設(shè)備提供額外的自動化優(yōu)勢，減少全部分析過程的復(fù)雜性。替代使用N-聯(lián)糖蛋白的總混合物，N-糖基化(即在此描述的峰7和9的2個峰譜)也可用純化的糖蛋白進(jìn)行。在另一個實(shí)施方案中，檢測肝癌的方法還包括臨床化學(xué)參數(shù)和/或組織學(xué)數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明也可以聯(lián)合臨床化學(xué)參數(shù)和/或組織學(xué)和/或成像參數(shù)方便地進(jìn)行。臨床化學(xué)參數(shù)的測量包括測量膽紅素和/或白蛋白和/或凝血酶原時間和/或C反應(yīng)蛋白質(zhì)和/或IgA豐度和/或血清透明質(zhì)酸濃度和/或氨基轉(zhuǎn)移酶和/或本領(lǐng)域已知的幾個肝代謝測試。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的glycoHCCtest聯(lián)合甲胎蛋白的檢測。組織學(xué)包括肝活檢。成像包括超聲和/或CT-掃描和/或MRI掃描和/或肝特異性放射性示蹤劑的成像。以下實(shí)施例用于說明某些實(shí)施例。因此本質(zhì)上它們僅僅示例性的而不是限制性的。實(shí)施例1.在HCC和硬化病人中改變的N-聚糖譜使用DSA-FACE，我們檢測肝纖維化(n=143)和具有或不具有HCC并發(fā)癥的肝硬化(HCCn=227;硬化n=80)的中國病人的去唾液酸血清(圖1)的N-糖組譜。我們也分析了健康供者的血液(n=130)。通過將譜中每個峰的高度對其所有峰高的總和進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，我們定量每個峰，然后統(tǒng)計學(xué)比較健康對照組，纖維化病人，硬化病人和HCC病人的峰。為在硬化背景中能特異性檢測HCC，我們主要鑒定聚糖結(jié)構(gòu)，其豐度在硬化病人中不增加，但在HCC病人中升高。我們發(fā)現(xiàn)這種模式的一個峰，命名為峰9(圖2A)。這個峰的豐度與HCC緊密相關(guān)(P<0.OOOl)，潛在地表明其上調(diào)中的一個普遍機(jī)制。而且，與硬化病人比較，峰7和總的平分型(峰7+峰2)在HCC病人中顯著更低(p<0.0001)(圖2B和2D)。與硬化病人，纖維化病人和健康對照組比較，對數(shù)比率(峰9/峰7)和對數(shù)(峰9/平分型)在HCC病人中顯著升高(p<0.0001)(圖2C和2E)。最終，我們重命名1og(峰9/峰7)為GlycoHCCTest，與我們之前研究采取的"GlycoCirrhoTest"命名平行，其中我們使用相同方法但是限定了不同組的峰(19)。2.多糖標(biāo)記如AFP—樣具有相同的HCC診斷功效雖然檢測血清AFP在篩選HCC時是重要的，先前的研究(15)已指出其在肝硬化病人中檢測HCC時由于在硬化中AFP水平常輕微上升而具有有限的應(yīng)用。在我們的硬化病人群體中也發(fā)現(xiàn)低閾值時AFP對于HCC的低特異性，如表2所示，顯示不同AFP截斷值的數(shù)據(jù)。正如ROC曲線分析所確定，glycoHCCTest能從硬化病人中區(qū)分HCC病人，正確性是81±3%(圖3)。聚糖標(biāo)記物的診斷正確性與通常使用的AFP標(biāo)記物非常類似，后者在同樣的病人組中具有78±3%的診斷正確性(圖3)。而且，在截斷值-O.34時，GlycoHCCTest檢測HCC具有88%的特異性和57%的敏感性，其與AFP在截斷值100ng時類似(表2)。3.多糖變化與腫瘤分期相關(guān)為了評估HCC糖組標(biāo)記物和腫瘤分期之間的相關(guān)性，分析具有限定腫瘤大小和分期的HCC亞組(n=98)的糖組學(xué)改變。依據(jù)TNM標(biāo)準(zhǔn)，HCC病人分類為Tl(n=6)，T2(n=28)，T3(n=59)和T4(n=5)。因?yàn)閮H僅有少數(shù)病人被分類為Tl或T4，為了統(tǒng)計分析的目的，我們合并Tl和T2為一組，T3和T4為另一組。峰9的濃度在T3-T4組比Tl-T2組更高(圖4A)，但是顯示峰7與腫瘤分期負(fù)相關(guān)(圖4B)。GlycoHCCTest與腫瘤分期正相關(guān)(p<0.0001)(圖4C)。在病毒性肝炎中AST/ALT比率被認(rèn)為是硬化進(jìn)展的敏感標(biāo)記物(24)。當(dāng)病毒性肝炎達(dá)到損害結(jié)構(gòu)的階段時，Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)也顯示良好的敏感性(25)。因此我們在這個HCC病人亞組中分析腫瘤分期與AFP，GGT和AST/ALT比率之間的相關(guān)性。如圖4D-E所示，AFP和GGT水平在HCC組中比在硬化組中更高(分別是p<0.001和0.006)并且它們與腫瘤分期正相關(guān)(分別是P<0.023和p<0.016)。AST/ALT比率在在HCC病人中比在硬化病人中顯著更低(P<0.0001)，其與腫瘤分期的相關(guān)性不顯著(p<0.174)(圖4F)。皮爾遜相關(guān)性顯示GlycoHCCTest水平與AFP水平(p=0.5680)和AST/ALT比率(0.351)無相關(guān)性，但是與GGT濃度(p=0.001)相關(guān)。GGT也被成為膽汁淤積性肝酶。因?yàn)榉逝?，酗酒，脂肪肝和對肝有毒性的某些藥物或草藥可升高GGT水平，因此不能排除HCC病人中存在的GlycoHCCTest的高水平與膽汁淤積不相關(guān)。另外，我們在慢性HBV感染病人組(n=143)中評估HCC糖組學(xué)標(biāo)記。在纖維化病人中GlycoHCCTest值在纖維化階段中始終恒定，指示其是HCC特異性的(圖5)。4.聚糖的結(jié)構(gòu)分析可以在硬化病人中診斷HCC。通過對NP-HPLC-純化級分進(jìn)行外切糖苷酶測序證實(shí)N-聚糖結(jié)構(gòu)。在此，我們給出峰9和9'的實(shí)例(圖6)。級分A的主要結(jié)構(gòu)(峰9')(圖6a)中的3個半乳糖可以使用P-l，4-半乳糖苷酶去除。當(dāng)這個酶與N-乙酰己糖胺酶組合，3個額外的N-乙酰葡糖胺殘基被去除。這表明N-聚糖具有3個未修飾的、完全半乳糖基化的分枝。而且，這個結(jié)構(gòu)是巖藻糖基化的，因?yàn)槠鋵τ诘吞禺愋詀-巖藻糖苷酶敏感(未顯示)。這個結(jié)構(gòu)不是a-l，3/4-巖藻糖苷酶的底物，表明這個巖藻糖修飾是a-l，6-結(jié)合到核心N-乙酰葡糖胺。當(dāng)使用半乳糖苷酶處理級分B(峰9)(圖6B)的結(jié)構(gòu)時，僅2個殘基被去除。額外的己糖胺酶消化去除2個其他殘基，表明3個分枝中的一個是修飾的，因此其對于酶活性不敏感。其對于僅當(dāng)結(jié)合分枝N-乙酰葡糖胺殘基時可去除巖藻糖的a-l，3/4-巖藻糖苷酶的敏感性確認(rèn)了這點(diǎn)。當(dāng)所有3個酶聯(lián)合時，在巖藻糖苷酶去除阻礙的巖藻糖后額外的半乳糖和N-乙酰葡糖胺被去除?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)顯示峰9和9'是異構(gòu)體，僅在巖藻糖殘基位置上不同。為了確認(rèn)GlycoHCCTest定量峰9而不是其異構(gòu)體，我們對總血清進(jìn)行了a-l，3/4-巖藻糖苷酶消化(圖7)。這個酶分別轉(zhuǎn)化峰9和12為峰8和11;峰9'和12'未改變。5.通過聯(lián)合GlycoHCCTest和AFP提高HCC診斷的正確性雖然檢測血清AFP在篩選HCC時是重要的，先前的研究(18)已指出其在肝硬化病人中檢測HCC時由于在硬化中AFP水平時常輕微上升而具有有限的應(yīng)用。因此實(shí)際上不得不使用非常高的AFP截斷值(400ng/ml而非10或20ng/ml，其可被用于非硬化病人)來維持高特異性，伴隨HCC檢測敏感性的降低。在我們的硬化病人群體中也發(fā)現(xiàn)低閾值時AFP對于HCC低特異性，如表2所示，顯示不同AFP截斷值的數(shù)據(jù)。AFP截斷值〈lng/ml具有高敏感性，對于HCC檢測直至96%，但是其特異性低(26%)。但是在AFP截斷值400ng/ml時，診斷HCC的特異性增加到95%，敏感性下降到46%。因此當(dāng)AFP水平低于400ng/ml時需要補(bǔ)充標(biāo)記物用于檢測HCC。為了評價是否GlycoHCCTest可幫助解決這個問題，我們針對LogAFP繪制了GlycoHCCTest圖(圖9)。我們注意到在AFP低水平(<lng/ml)時僅有3%真正HCC病例(9/227)和26%硬化病例(21/80)，示于圖9。為了增加檢測HCC的特異性，我們在AFP>lng/ml和AFP<400ng/ml病人(AFP的"灰色區(qū)"，其涵蓋了227個HCC病人中的114個和89個硬化病人中的55個)中應(yīng)用我們的GlycoHCCtest。GlycoHCCTest(在截斷值-O.34)檢測在這個AFP的灰色區(qū)中的HCC，具有95X特異性(3/55假陽性)和57%敏感性(65/114真陽性)(表3;圖9)。正如R0C曲線分析所確定(圖10)，glycoHCCTest可以在AFP灰色區(qū)中從硬化病人中區(qū)分HCC病人，正確性是83士3X。聚糖標(biāo)記物的診斷能力比通常使用的AFP標(biāo)記物高很多，AFP標(biāo)記物在同樣的病人組中具有更低的診斷正確性(53±4%)(圖10)。很顯然GlycoHCCTest可用于AFP值在l-400ng/ml之內(nèi)的HCC病人。因此，在AFP的灰色區(qū)通過聯(lián)合AFP>400ng/ml和GlycoHCCTest截斷值>-0.34，我們可從硬化病人區(qū)分HCC，具有74X敏感性和91X特異性(表3)。換言之，聯(lián)合GlycoHCCTest和AFP診斷HCC比單獨(dú)使用AFP(截斷值>400ng/ml;46%敏感性)增加28%敏感性。6.聯(lián)合GlycoHCC-test和AFP(灰色區(qū))與HCC腫瘤分期正相關(guān)在AFP灰色區(qū)評價HCC糖組標(biāo)記與腫瘤分期之間的相關(guān)性，分析已確定腫瘤大小和分期的落入AFP灰色區(qū)(l-400ng/ml)的HCC亞組(n=44)的糖基化譜的改變。依據(jù)TNM標(biāo)準(zhǔn)，HCC病人被分為Tl(n=3)，T2(n=15)，T3(n=25)和T4(n=1)。AFP水平HOOng/ml的硬化組(n=55)被用作對比參照。峰9的濃度在T3-T4組比Tl-T2組高(圖11A)，但是揭示了峰7和平分型(峰2+峰7)與腫瘤分期的負(fù)相關(guān)性(圖11B和E)。GlycoHCCTest與腫瘤分期明顯正相關(guān)(P<0.0001)(圖11C)。峰9/平分型聚糖(圖11F)的對數(shù)比率與腫瘤分類之間也顯著相關(guān)。但是在灰色區(qū)AFP值與腫瘤分期不相關(guān)(圖IID)。在AFP灰色區(qū)診斷HCC的具有特異性和敏感性的GlycoHCCTest截斷值顯示在表4中。glycoHCCTest顯示在AFP灰色區(qū)檢測HCC的診斷能力在68.2到88.6%的敏感性和81.1到94.3%的特異性之間變化。材料和方法病人選擇石開究已被EthicsCommitteeofPekingUniversityHealthScienceCentre、EthicsCommitteeofRenjiHospital、ShanghaiSecondMedicalUniversity批準(zhǔn)。已獲得每個病人的知情同意。病人征集自4個中國北京的醫(yī)院(佑安醫(yī)院，武警醫(yī)院，地壇醫(yī)院和北大醫(yī)院)，中國南京的南京第二醫(yī)院和中國上海醫(yī)院。總共征集497個HBV感染的慢性肝病病人；由于轉(zhuǎn)移，自體免疫性肝病，藥物相關(guān)性肝炎，酒精性肝炎或阻塞性黃疸，47個病人被排除。所有病人的抗HAV，HCV和HDV(AbbottEIA)，EBV和CMV(EIA，HumanCo.Ltd,Germany)和HEV(EIA，Genelabs，Sing即ore)抗體是陰性的。實(shí)驗(yàn)室測試病人的主要臨床和生物學(xué)數(shù)據(jù)總結(jié)于表1。所有病人具有或者纖維化或者硬化，感染乙肝病毒(HBV)，由血清學(xué)檢測HbsAg，抗-HBsAg(HBsAb)，HBeAg，抗-HBeAg(HbeAb)，抗-HBcAg(HBcAb)和HBVDNA診斷。肝損傷程度通過檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)，總膽紅素，白蛋白，總血清蛋白和y谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)評估。臨床分期和腫瘤分期經(jīng)組織學(xué)檢查，成像方法和一些肝功化驗(yàn)完成肝纖維化和硬化的診斷。使用Scheuer分類確定纖維化分期。由不知道糖組學(xué)結(jié)果的2名富有經(jīng)驗(yàn)的肝病理學(xué)家獨(dú)立評價肝樣品。肝纖維化病人(n=143)已被廣泛研究且他們的臨床數(shù)據(jù)已由Min-DeZeng等先前出版(21)。依據(jù)Child-Pugh分類對肝硬化病人分期。通過活檢，尸檢和手術(shù)標(biāo)本組織學(xué)診斷，和臨床超聲波檢查術(shù)和/或計算機(jī)斷層掃描常規(guī)檢查臨床診斷，和聯(lián)合AFP檢測(截斷值20ng/ml)診斷HCC的硬化病人(n=227)。依據(jù)TNM標(biāo)準(zhǔn)(22)對腫瘤分期分類Tl=單個，無血管侵入；T2=單個，有血管侵入，多個《5cm;T3=多個>5cm，侵入肝門靜脈或肝靜脈主要分枝；T4=除了膽囊穿孔臟層腹膜之外還侵入鄰近器官。在任何處理或操作之前吸出所有血樣。參照組130個通過超聲排除HCC的健康個體的血液得自北京和上海紅十字會。處理血樣品用于蛋白質(zhì)N-糖組分析12在2iU血清中存在于蛋白質(zhì)上的N-聚糖如前所述被釋放，標(biāo)記，和分析(39，23)。使用基于毛細(xì)管電泳的(CE)ABI3130測序儀經(jīng)DNA測序儀輔助熒光輔助碳水化合物電泳(DSA-FACE)技術(shù)分析標(biāo)記的N-聚糖。使用GeneM即perv3.7軟件(AppliedBiosystems，F(xiàn)ostercity，CA)分析數(shù)據(jù)。我們測量了在所有樣品中檢測的峰的高度以獲得譜的數(shù)字描述，并使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件分析這些數(shù)據(jù)。結(jié)構(gòu)特征結(jié)構(gòu)分析APTS-標(biāo)記的血清N-聚糖，其首先如描述經(jīng)正相HPLC分離(23)。然后如上描述使用外切糖苷酶消化適量的多糖，使用以下酶肺炎鏈球菌(Str印tococcuspneumonia)，P-1，4-半乳糖苷酶(0.4mU/消化)，JackBeanP_N_乙酰己糖胺酶(10mU/消化)，牛腎a-巖藻糖苷酶(2mU/消化)和杏仁粉a-1，3/4-巖藻糖苷酶(1yU/消化)(所有酶購自Prozyme，SanLeandro，CA)。使用DSA-FACE分析消化產(chǎn)物。統(tǒng)計分析使用Windows軟件的SPSS完成統(tǒng)計分析(SPSS,Chicago,IL，USA)。結(jié)果表示為平均數(shù)士SD。對于獨(dú)立樣品的所有報告的P-值使用雙尾T檢驗(yàn)。皮爾遜相關(guān)系數(shù)(95%置信區(qū)間和它們的相關(guān)概率(P)被用于評價參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。接受者操作特征(ROC)曲線用作正確性的指數(shù)，接近1.0的值指示高診斷正確性。表表1.HBV感染的中國HCC和硬化病人的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>參考文獻(xiàn)1.BruixJ，BoixL，SalaM，LlovetJM.Focusonhepatocellularcarcinoma.CancerCell2004;5:215-219.2.LiawYF.Preventionandsu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