專利名稱：：用于癌癥治療的RNAi介導(dǎo)的NuMA敲減的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能夠下調(diào)NuMA基因表達(dá)的小干擾核糖核酸(SiRNA)分子領(lǐng)域及其在癌癥治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：核有絲分裂器蛋白(NuMA)是具有球狀頭和尾的236kDa的大卷曲螺旋蛋白，其是存在于間期細(xì)胞核中的主要核蛋白，并集中在有絲分裂細(xì)胞的紡錘體極。NuMA還被稱為親中心體蛋白(centrophilin)、SPN、SP-H、1H1/1F1和Wl(Tangetal."Nuclearmitoticapparatusprotein(NuMA):spindleassociation,nucleartargetinganddifferentialsubcellularlocalizationofvariousNuMAisoforms.”JournalofCellScience1071389-1402(1994))。NuMA會(huì)聚在微管的負(fù)極，此處功能對(duì)于紡錘體的組裝至關(guān)重要。在分裂細(xì)胞中，NuMA在磷酸化后分散到細(xì)胞質(zhì)中，與細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白/動(dòng)力蛋白激活蛋白(dynactin)結(jié)合形成復(fù)合體，并沿微管轉(zhuǎn)移至紡錘體極，在此組裝微管并將其束縛至紡錘體極。在分裂后期起始(onset)后，NuMA發(fā)生脫磷酸化，失去與動(dòng)力蛋白/動(dòng)力蛋白激活蛋白的結(jié)合，并從紡錘體極釋放，從而使紡錘體解裝配并重新形成間期子細(xì)胞核。NuMA的細(xì)胞周期依賴性磷酸化受蛋白激酶和磷酸酶的平衡活性的調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明，細(xì)胞周期蛋白B/cdc2激酶對(duì)NuMA的磷酸化使NuMA從細(xì)胞核釋放并與中心體和/或紡錘體極的微管結(jié)合，而分裂后期起始后由細(xì)胞周期蛋白B降解引起的NuMA脫磷酸化使NuMA與紡錘體極分離。NuMA的過(guò)表達(dá)干擾與紡錘體相關(guān)的動(dòng)力蛋白定位，并促進(jìn)多極紡錘體的形成和癌癥的發(fā)生。另一方面，很多非增殖細(xì)胞和高度分化的細(xì)胞中缺失NuMA。NuMA還在雄性生殖細(xì)胞和雌性生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂紡錘體的組裝過(guò)程中發(fā)揮作用。NuMA的降解導(dǎo)致正常細(xì)胞核結(jié)構(gòu)瓦解，并已經(jīng)被用作細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。NuMA功能的任何異常都將導(dǎo)致向紡錘體極集中的微管遭到破壞，從而引起微管末端的外張。NuMA在細(xì)胞間期停留在細(xì)胞核中，并在多步磷酸化后與有絲分裂的中心體暫時(shí)結(jié)合。NuMA對(duì)諸如誘導(dǎo)細(xì)胞分裂的激素或誘導(dǎo)凋亡的熱休克等外部信號(hào)做出響應(yīng)。在分裂前期，NuMA分散在細(xì)胞質(zhì)中，并與微管結(jié)合。在分裂中期或分裂后期，NuMA與染色質(zhì)結(jié)合并最終與重新組成的細(xì)胞核結(jié)合。NuMA是對(duì)正常有絲分裂至關(guān)重要的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其在凋亡早期發(fā)生降解。NuMA與細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白和動(dòng)力蛋白激活蛋白形成復(fù)合體。所述復(fù)合體的損耗導(dǎo)致有絲分裂紡錘體正常組裝的失敗。在有絲分裂中，NuMA通過(guò)端錨聚合酶-1(tankyrase-Ι)被聚ADP核糖化(PARsylated)。Comptom和Cleveland(1993)進(jìn)行的研究表明，有絲分裂過(guò)程中染色體分離和/或細(xì)胞核組裝的適當(dāng)終止時(shí)期需要NuMA。Yangetal."Anunusuallylongcoiled-coilrelatedproteininthemammaliannucleus."JCellBiol.116(6):1303-1317(1992)發(fā)現(xiàn)，向有絲分裂早期或分裂中期細(xì)胞中顯微注射抗-NuMA抗體可以抑制有絲分裂紡錘體的形成或引起有絲分裂紡錘體的瓦解，由此證明NuMA可能在有絲分裂期間發(fā)揮重要作用。一些研究已經(jīng)描述了NuMA和癌癥之間的關(guān)系，但還沒(méi)有證明抑制NuMA能夠治療癌癥。凋亡中的細(xì)胞釋放NuMA(Milleretal.，Biotechniques，151042，1993)，并且已經(jīng)在各種癌癥患者的血清中檢測(cè)到NuMA(Milleretal.，CancerRes.，52:422，1992)，特別是在膀胱癌患者的尿液中檢測(cè)到NuMA(Stampferetal.，J.Urol.，159:394，1998)。在W0/2005/014846中，NuMA被認(rèn)為是用于鑒定受試者患乳癌風(fēng)險(xiǎn)和/或具有患乳癌風(fēng)險(xiǎn)的受試者的方法中的相關(guān)靶標(biāo)，用于實(shí)施所述方法的試劑和試劑盒中的相關(guān)靶標(biāo)，用于鑒定用于乳癌治療的候選治療劑的方法中的相關(guān)靶標(biāo)，和用于治療受試者乳癌的治療方法中的相關(guān)靶標(biāo)。NuMA基因的變異與家族性乳癌風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。美國(guó)專利第6，287，790號(hào)公開(kāi)了通過(guò)利用NuMA特異性抗體的細(xì)胞免疫染色和NuMA在各細(xì)胞核內(nèi)的分布的顯微分析來(lái)區(qū)分惡性細(xì)胞和增殖性非惡性細(xì)胞的方法。美國(guó)專利第6，864，238號(hào)公開(kāi)了用于使微管失穩(wěn)的多肽和編碼此多肽的多核苷酸。由于微管在細(xì)胞分裂中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，而細(xì)胞分裂在癌細(xì)胞中發(fā)生的更為頻繁，所以，所述多肽和多核苷酸可用于制備用于抑制細(xì)胞增殖的癌癥治療用組合物。US20030125290公開(kāi)了包含用于誘導(dǎo)在細(xì)胞中響應(yīng)的三乙二醇膽甾醇基寡核苷酸的組合物以及利用所述組合物治療疾病的方法，所述在細(xì)胞中響應(yīng)包括但不限于在癌細(xì)胞或滑膜細(xì)胞中抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)caspase活化、切割聚(ADP-核糖)聚合酶、誘導(dǎo)凋亡或調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)-細(xì)胞相互作用，或其組合。NuMA的釋放用作凋亡的量度。W09640917A公開(kāi)了用于鑒別細(xì)胞中與NuMA非共價(jià)地相互作用的蛋白的方法和組合物，通過(guò)所述方法鑒定的新蛋白，以及在體內(nèi)干擾該相互作用的方法和組合物。ElBashiretal."Duplexesof21-nucleotideRNAsmediateRNAinterferenceinculturedmammaliancells，，Nature411:494_498(2001),公開(kāi)了在體夕卜下調(diào)NuMA蛋白表達(dá)的針對(duì)NuMA的21個(gè)核苷酸的siRNA。Changetal.,"NuMAisamajoracceptorofpoly(ADP-ribosyl)ationbytankyrase1inmitosis”Biochem.J.:391:117_184(2005)，公開(kāi)了針對(duì)NuMA的siRNA在研究NuMA在體外人細(xì)胞中功能中的應(yīng)用。截至目前，以往的研究多集中于將NuMA作為用于易患乳癌的個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的診斷標(biāo)記物，和用于了解癌癥預(yù)后的生物標(biāo)記物。本發(fā)明集中于通過(guò)小干擾核酸(siRNA)調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)，目的在于提供治療性干預(yù)。發(fā)明目的本發(fā)明的基本目的是通過(guò)小干擾核酸(siRNA)分子調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)。本發(fā)明的目的是提供用于調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)的21mer、23mer和27mer小核酸分子。本發(fā)明的目的是提供用于治療不同類型的癌癥(更具體地，是乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌(colorectalcancer)、宮頸癌、表皮樣癌和口腔癌)的具有21mer、23mer或27mer小核酸分子的化合物。本發(fā)明的目的是提供用于定點(diǎn)靶向所述靶標(biāo)的21mer、23mer和27mer小核酸分子。本發(fā)明的目的是提供SNP特異性SiRNA分子，從而為具有NuMA疾患的患者提供個(gè)體化治療。本發(fā)明的目的是提供能夠單獨(dú)使用或者與其它療法組合使用以有效控制癌癥治療的21mer、23mer和27mer小核酸分子。本發(fā)明的目的是提供能夠與不限于脂質(zhì)、聚合物和單克隆抗體的結(jié)合物組合的21mer、23mer和27mer小干擾核酸分子。本發(fā)明的目的是測(cè)定與模擬物處理的對(duì)照組相比，共定位至其作用位點(diǎn)的NuMA的量。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及通過(guò)小干擾核酸(SiRNA)分子調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)。特別地，本發(fā)明涉及靶向NuMA的21mer、23mer或27mer小干擾核酸(siRNA)分子的化合物、組合物及其在調(diào)節(jié)NuMA表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物可單獨(dú)或與其它治療或療法組合用于癌癥治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的小核酸分子的特征還在于其為小干擾核酸(SIRNA)、小干擾RNA(SiRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、小RNA(mRNA)、脫氧核糖核酸干擾(DNAi)和小發(fā)夾RNA(shRNA)分子。所述小核酸分子可以為未經(jīng)修飾的或者經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及21mer、23mer或27mer小干擾RNA。在本發(fā)明中，通過(guò)降低靶蛋白的量(從而削弱與該蛋白相關(guān)的功能特性)的能力來(lái)測(cè)定SIRNA的功效。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以化學(xué)合成或酶促合成21mer、23mer或27merSIRNA或通過(guò)載體表達(dá)21mer、23mer或27merSIRNA。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及長(zhǎng)度為21mer、23mer或27mer的化學(xué)合成的SIRNA，該SIRNA單獨(dú)或者與其它SIRNA(所述其它SIRNA靶向負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)多種癌癥的基因)組合來(lái)降低NuMA的表達(dá)水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療多種類型的癌癥的小核酸分子，所述多種類型的癌癥包括乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤(glioma)禾口白血病。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用腫瘤生物標(biāo)記物驗(yàn)證21mer、23mer或27mersiRNA的功效的技術(shù)。本發(fā)明提供利用特定的腫瘤生物標(biāo)記物諸如PCNA、KI-67和BCL-2抗原表達(dá)來(lái)進(jìn)行功效檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療多種類型的癌癥的靶向NuMA的SIRNA的組合及其組合，所述多種類型的癌癥包括乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤和白血病。本發(fā)明涉及靶向NuMAmRNA的siRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括靶向Genbank登錄號(hào)NM_006185的NuMA的第20_40、578_598或905-928位核苷酸的siRNA。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述siRNA包括靶向NuMA分子的SNP的那些siRNA。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述siRNA靶向選自由SEQIDNO=USEQIDNO:2和SEQIDNO3組成的組的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明siRNA的至少一條鏈的長(zhǎng)度在19至30個(gè)核苷酸之間。在相關(guān)實(shí)施方案中，siRNA具有選自由以下組成的組的結(jié)構(gòu)SEQIDNO4和SEQIDNO5；SEQIDNO6和SEQIDNO7；SEQIDNO8和SEQIDNO9；和SEQIDNO10和SEQIDNO:11。本發(fā)明還涉及通過(guò)施用siRNA(包括本發(fā)明的siRNA)降低靶細(xì)胞中NuMA表達(dá)的方法。本發(fā)明還包括通過(guò)施用針對(duì)NuMA的siRNA治療癌癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA靴向Genbank登錄號(hào)NM_006185的第20_40、578_598或905-928位核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA靶向其相當(dāng)?shù)腟NP(equivalentSNP)。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述siRNA靶向選自由SEQIDNO=USEQIDNO:2和SEQIDNO:3組成的組的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于治療癌癥的方法使用其中至少一條核苷酸鏈在19-30個(gè)核苷酸之間的siRNA。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述siRNA具有選自由以下組成的組的結(jié)構(gòu)SEQIDNO4和SEQIDNO5；SEQIDNO6和SEQIDNO7；SEQIDNO8和SEQIDNO9；和SEQIDNO10和SEQIDNO:11。所述治療癌癥的方法可以用于任何癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自由以下組成的組宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤、白血病、腦癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、頭頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤和多藥耐藥癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自由結(jié)腸直腸癌、乳癌、肺癌和前列腺癌組成的組。本發(fā)明還包括適合用于治療癌癥的藥物組合物，其包含本發(fā)明的siRNA和藥學(xué)上可接受的賦形劑。以下附圖構(gòu)成本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的一部分，并用于進(jìn)一步證明本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的某些方面，通過(guò)參考這些附圖中的一幅或多幅并結(jié)合本發(fā)明公開(kāi)的具體實(shí)施方案的描述，可以更好地理解本發(fā)明的這些公開(kāi)內(nèi)容。圖1用RINA25和RINA10轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞CCL-247，并通過(guò)免疫熒光測(cè)定法檢測(cè)NuMA在紡錘體極的定位。比例200X。圖IA顯示在用RINA10轉(zhuǎn)染的CCL-247細(xì)胞中NuMA在紡錘體極的定位以及細(xì)胞質(zhì)中的特異染色。箭頭表示定位于紡錘體極的NuMA。圖IB顯示用RINA25轉(zhuǎn)染的CCL-247細(xì)胞中缺失定位在紡錘體極的NuMA以及細(xì)胞質(zhì)中的特異染色。箭頭表示定位于紡錘體極的NuMA的缺失以及細(xì)胞質(zhì)中NuMA特異染色的缺失。圖2A顯示在siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后NuMA蛋白敲減的Western印跡，其中236KDa表示NuMA蛋白。50KDa蛋白條帶表示微管蛋白內(nèi)源對(duì)照。泳道M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。泳道1-4分別表示用RINA1、9、25和10轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549。與模擬物(mock)處理的細(xì)胞相比，在所有siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都存在非常弱的NuMA條帶。泳道5_8表示用RINA1、9、25和10轉(zhuǎn)染的正常成纖維細(xì)胞系MCF-7。與模擬物處理的細(xì)胞相比，在所有siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都存在非常弱的NuMA條帶。圖2B顯示在siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后NuMA蛋白敲減的Western印跡，其中236KDa表示NuMA蛋白。50KDa蛋白條帶表示微管蛋白內(nèi)源對(duì)照。泳道M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。泳道1-4表示用RINA1、9、25和10轉(zhuǎn)染的表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431。與模擬物處理的細(xì)胞相比，在所有siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都存在非常弱的NuMA條帶。泳道5和4表示用RINA1、9、25和10轉(zhuǎn)染的前列腺癌細(xì)胞系PC3。與模擬物處理的細(xì)胞相比，在所有siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都存在非常弱的NuMA條帶。圖2C顯示在siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后NuMA蛋白敲減的Western印跡，其中236KDa表示NuMA蛋白。50KDa蛋白條帶表示微管蛋白內(nèi)源對(duì)照。泳道M表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。泳道1-4表示用RINA1、9、25和10轉(zhuǎn)染的宮頸癌細(xì)胞系HeLa。與模擬物處理的細(xì)胞相比，在所有siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中都存在非常弱的NuMA條帶。圖3通過(guò)在6孔板的每個(gè)孔內(nèi)接種300個(gè)細(xì)胞檢測(cè)siRNA的集落形成效率，試驗(yàn)一式三份。在溫育10天結(jié)束時(shí)，在結(jié)晶紫染色后計(jì)算集落的數(shù)量。計(jì)算集落數(shù)量相對(duì)于陰性siRNA處理對(duì)照的平均百分?jǐn)?shù)。圖4在用RINA25,RINA10轉(zhuǎn)染72小時(shí)后的結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247或未經(jīng)處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247在培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞周期分析。Ml表示處于細(xì)胞周期的GO/Gl期的細(xì)胞數(shù)，M2表示處于細(xì)胞周期的S期的細(xì)胞數(shù)，M3表示處于細(xì)胞周期的G2期的細(xì)胞數(shù)，M4表示凋亡中的細(xì)胞。圖4A分析未經(jīng)處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247在培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞周期。圖4B分析經(jīng)RINA10處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247在培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞周期。圖4C:分析經(jīng)RINA25處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247在培養(yǎng)72小時(shí)后的細(xì)胞周期。圖5通過(guò)微陣列分析RINA25在HTB26乳癌細(xì)胞中對(duì)NuMA的抑制作用。微陣列分析鑒定出與經(jīng)RINA10處理的細(xì)胞相比，共有350個(gè)基因被上調(diào)，300個(gè)基因被下調(diào)。圖6腫瘤的Western印跡。泳道1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。泳道2、3和4分別表示安慰劑處理的動(dòng)物A-l、A4和A-10。泳道5、6和7分別表示用RINA25處理的動(dòng)物B_2、B-9和B-11。箭頭表示236KDaNuMA和50KDa微管蛋白。與泳道2、3和4中的相應(yīng)條帶相比，泳道4、5和6的NuMA條帶的確較弱。這表明與安慰劑處理的動(dòng)物相比，用RINA25處理的動(dòng)物的蛋白水平降低。發(fā)明詳述定義本文使用的術(shù)語(yǔ)“小干擾核酸”、“siNA或SINA”分子、“小干擾RNA”、“siRNA”、“小干擾核酸分子”、“小干擾寡核苷酸分子”表示能夠通過(guò)RNA干擾機(jī)制抑制或下調(diào)基因表達(dá)的任何核酸分子。本文使用的術(shù)語(yǔ)“RNA”表示包含至少一個(gè)核糖核苷酸殘基的分子，其包括雙鏈RNA,單鏈RNA，分離的RNA，部分純化的、純的或合成的RNA、重組產(chǎn)生的RNA以及變化的RNA或天然產(chǎn)生的RNA的類似物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”表示基因的表達(dá)、或編碼一個(gè)或多個(gè)蛋白或蛋白亞基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一個(gè)或多個(gè)蛋白亞基的活性被上調(diào)或下調(diào)，從而使得所述表達(dá)、水平或活性大于或小于調(diào)節(jié)子不存在時(shí)的觀察結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”涵蓋“抑制”，但該術(shù)語(yǔ)的使用不限于此定義。本文使用的術(shù)語(yǔ)“基因”表示編碼RNA序列的核酸，其包括但不限于編碼多肽的結(jié)構(gòu)基因。本文使用的術(shù)語(yǔ)“核相關(guān)有絲分裂蛋白”或“NuMA”表示具有NuMA活性或親中心體蛋白活性的任何NuMA蛋白、肽或多肽，例如由Genbank登錄號(hào)NM_006185編碼的那些。此術(shù)語(yǔ)還表示編碼NuMA蛋白、肽或多肽的核酸序列，包括具有亞型(isoform)、突變基因、剪接變體和多態(tài)性的序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”表示其表達(dá)或活性將被調(diào)節(jié)的任何核酸序列。所述靶核酸可以為DNA或RNA。本文使用的術(shù)語(yǔ)“正義區(qū)”表示SiNA分子中具有與靶核酸序列相同的序列的核苷酸序列。此外，SiRNA分子的正義區(qū)可以包含與SiNA分子的反義區(qū)互補(bǔ)的核酸序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“反義區(qū)”表示SiRNA分子中與靶核酸序列具有互補(bǔ)性的核苷酸序列。所述術(shù)語(yǔ)還涵蓋與siRNA分子的正義區(qū)具有互補(bǔ)性的核酸序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)”表示可以所述核酸可以與另一個(gè)核酸分子形成氫鍵(例如A-T,A-U,G-C)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“癌(癌癥)”或“增殖性疾病”表示本領(lǐng)域已知的特點(diǎn)為細(xì)胞生長(zhǎng)或復(fù)制失控的任何疾病、病癥、特征、基因型或表型。該術(shù)語(yǔ)可以包含可以對(duì)細(xì)胞或組織中疾病相關(guān)的NuMA基因表達(dá)的單獨(dú)調(diào)節(jié)或與其它療法的組合作出響應(yīng)的任何類型的癌癥、腫瘤、淋巴瘤、惡性瘤。除非特別指出，否則“一”表示“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”。本發(fā)明涉及通過(guò)小干擾核酸(siRNA)分子調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)。特別地，本發(fā)明涉及靶向NuMA的21mer、23mer或27mer小干擾核酸(siRNA)分子的化合物、組合物及其在調(diào)節(jié)NuMA表達(dá)中的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物可單獨(dú)或與其它治療或療法組合用于癌癥治療。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明通過(guò)小干擾核酸(siRNA)分子調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)，所述小干擾核酸(siRNA)分子包括靶向NuMA的19_30mersiRNA，尤其包括21mer、23mer和27mersiRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供SNP特異性siRNA分子，從而為患者提供個(gè)體化治療。與癌癥相關(guān)的SNP是已知的。參見(jiàn)，例如WO2005/014846A2，特別是第145-150頁(yè)。示例性SNP包括以下(其中與乳癌相關(guān)的SNP用下劃線表示)A_2315bp(T/A)、G-2337bp(A/G)、C_2381bp(G/C)、G_2617bp(A/G)、G_2932bp(T/C)、G_3369bp(A/G)、G-4422bp(G/A)、G_5896bp(C/T)、C-5981(C/A)、G_5473bp(T/C)、G_5516bp(G/T)、C-6034bp(C/T)、C-6048bp(C/A)、G-6145(C/T)、C_6288bp(G/A)、T_5288bp(C/T)。在相關(guān)實(shí)施方案中，此19-31mer(包括21mer、23mer或27mer)siRNA分子可用于治療不同類型的癌癥，包括乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、表皮樣癌和口腔癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA分子可單獨(dú)使用或者與其它療法組合使用以有效控制癌癥的治療。本發(fā)明還包括19-31mer(包括21mer、23mer和27mer)siRNA的組合物，其可以與不限于脂質(zhì)、聚合物和單克隆抗體的結(jié)合物組合。盡管本發(fā)明的一些實(shí)施方案重點(diǎn)闡述siRNA，但本文公開(kāi)的內(nèi)容并不解釋為限于siRNA,而是還涵蓋了利用小核酸分子、雙鏈RNA(dsRNA)、小RNA(mRNA)、脫氧核糖核酸干擾(DNAi)和小發(fā)夾RNA(shRNA)分子、酶核酸分子(enzymaticnucleicacid)或反義核酸分子實(shí)施的相關(guān)組合物和方法。所述小核酸分子可以為未經(jīng)修飾的或者經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及19-3Imer(包括21mer、23mer和27mer)siRNA。在本發(fā)明中，通過(guò)降低靶蛋白的量(從而削弱與該蛋白相關(guān)的功能特性)的能力來(lái)測(cè)定siRNA的功效。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以化學(xué)合成或酶促合成或由載體表達(dá)19-31mer(包括21mer,23mer和27mer)siRNA分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供化學(xué)合成的siRNA，其能夠單獨(dú)或者與其它siRNA(所述其它SIRNA靶向負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)多種癌癥的基因)組合用于降低NuMA的表達(dá)水平。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療包括乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤和白血病在內(nèi)的多種類型的癌癥的siRNA分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供利用癌癥生物標(biāo)記物驗(yàn)證19-3Imer(包括21mer、23mer或27mer)siRNA分子的功效的技術(shù)。本發(fā)明提供利用特定的腫瘤生物標(biāo)記物諸如PCNA,Ki-67和BCL-2抗原表達(dá)來(lái)進(jìn)行功效檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療包括乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤和白血病在內(nèi)的多種類型的癌癥的靶向NuMA的siRNA的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可以單獨(dú)使用或與其它siRNA或小分子組合使用的siRNA分子，其中所述其它siRNA或小分子能夠抑制NuMA表達(dá)以及與對(duì)細(xì)胞或組織中NuMA水平做出響應(yīng)的癌癥或其它病癥或疾病相關(guān)的蛋白。一個(gè)實(shí)施方案是本發(fā)明的siRNA在與Genbank登錄號(hào)NM_006185對(duì)應(yīng)的表1中所示NuMA序列的編碼基因的任何治療中應(yīng)用。雖然本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)NuMA的表達(dá)，但實(shí)施方案包括NuMA以及參與NuMA調(diào)節(jié)通路的其它基因的所有同源物、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和轉(zhuǎn)錄變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子在至少一條鏈上包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)堿基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含與具有NuMA核酸序列的RNA互補(bǔ)的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)堿基對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA分子包括雙鏈RNA，其中所述RNA的一條鏈與NuMA的RNA互補(bǔ)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA分子包括雙鏈RNA，其中所述RNA的一條鏈包含具有NuMA序列的RNA序列的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)載體編碼以表達(dá)本發(fā)明的核酸分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體還包含與NuMA亞基的RNA互補(bǔ)的反義核酸分子。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體包含編碼兩個(gè)或更多個(gè)酶核酸分子(其可以相同或不同)的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的核酸分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞。本發(fā)明提供下調(diào)細(xì)胞中NuMA活性的方法，其包括在適合下調(diào)NuMA活性的條件下使本發(fā)明的核酸分子與所述細(xì)胞接觸。本發(fā)明還提供治療患有與NuMA水平提高相關(guān)的病癥的受試者的方法，其包括在適合此治療的條件下使本發(fā)明的核酸分子與所述受試者的細(xì)胞接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供治療患有與NuMA水平相關(guān)的病癥的受試者的方法，其包括在適合此治療的條件下使本發(fā)明的核酸分子與所述受試者的細(xì)胞接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療方法還包括在適合所述治療的條件下使用一種或多種藥物療法。本發(fā)明涉及的藥物療法包括單克隆抗體、化療或放療或其組合。本發(fā)明還提供癌癥治療方法，所述癌癥包括但不限于乳癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、腦癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、頭頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤或多藥耐藥癌，所述方法包括在適合所述治療的條件下向受試者施用本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明提供組合物，其包含于藥學(xué)上可接受的載體中的本發(fā)明的核酸分子。本發(fā)明還提供向細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人細(xì)胞)施用本發(fā)明的核酸分子的方法，其中所述細(xì)胞可以在培養(yǎng)中，或者在哺乳動(dòng)物(例如人)體中，該方法包括在適合所述施用的條件下使細(xì)胞與所述核酸分子接觸。所述施用方法可以在遞送試劑(例如脂質(zhì)、陽(yáng)離子脂質(zhì)、磷脂或脂質(zhì)體)存在下進(jìn)行。本發(fā)明提供SiRNA化合物其在調(diào)節(jié)NuMA基因表達(dá)中的應(yīng)用。按照以下設(shè)計(jì)并研究所述化合物l.siRNA的設(shè)計(jì)2.siRNA的制備3.檢測(cè)所述化合物的功效4.21mer、23mer和27mersiRNA分子的比較數(shù)據(jù)5.在動(dòng)物模型中的功效評(píng)價(jià)siRNA的設(shè)計(jì)包括設(shè)計(jì)用于調(diào)節(jié)NuMA的21個(gè)核苷酸的分子、23個(gè)核苷酸的分子和27個(gè)核苷酸的分子。對(duì)于所有的siRNA，無(wú)論其長(zhǎng)度如何，都需要考慮以下一般性要求i.不允許有4個(gè)和或更多個(gè)連續(xù)的A、T、G或U核苷酸片段；ii.避免使用誘導(dǎo)干擾素響應(yīng)的以下序列㈧5’-UGU⑶-3，和(B)5，-⑶CCUUCAA-3，；iii.在以下參數(shù)下利用計(jì)算機(jī)(in-silico)通過(guò)BLAST檢索核查各個(gè)siRNA雙鏈從而避免脫靶效應(yīng)的沉默A.除去低復(fù)雜度過(guò)濾從而避免由無(wú)意義的BLAST而引起查詢序列有限或無(wú)查詢j^^lj(limitedornoquerysequencer)0B.詞長(zhǎng)(wordsize)設(shè)定為7個(gè)字母，這是該算法的最小值。C.將期望值的閾值設(shè)定為1000，從而避免出現(xiàn)短序列的可能性。此外，篩選靶基因NuMA的可接近位點(diǎn)，并根據(jù)ORF序列合成siRNA。通過(guò)商業(yè)化方法進(jìn)行siRNA的合成。大多數(shù)情況下，可以通過(guò)Qiagen提供的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)技術(shù)合成這些序列。所述化學(xué)方法包括依次加入被稱為亞磷酰胺(phospharmidite)的受化學(xué)保護(hù)的單體單元，從而產(chǎn)生預(yù)期的寡核苷酸序列。所述合成主要包括四個(gè)步驟，例如偶聯(lián)、加帽、氧化和5'-脫保護(hù)。通過(guò)PAGE、脫鹽或通過(guò)IE-HPLC完成siRNA分子的純化。通過(guò)MALDI-TOF分析各siRNA的質(zhì)量，并通過(guò)綜合分光光度計(jì)測(cè)定其產(chǎn)量。在不同的細(xì)胞系中進(jìn)行siRNA分子的功效測(cè)定。從ATCC獲得以下細(xì)胞系，并根據(jù)ATCC推薦的方式培養(yǎng)MCF-7(乳癌)，SKBR-3(乳癌)，PC3(前列腺癌)，A549(肺癌)，A431(皮膚癌)和HeLa(宮頸癌)。用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，并進(jìn)行溫育。通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)染16小時(shí)后具有Cy3標(biāo)記siRNA的細(xì)胞數(shù)，獲得各細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率。除了轉(zhuǎn)染百分?jǐn)?shù)外，還觀察了與未處理細(xì)胞系相比所述細(xì)胞系的形態(tài)特征。通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞系增殖的抑制效率來(lái)檢測(cè)不同長(zhǎng)度siRNA的功效。轉(zhuǎn)染siRNA72小時(shí)后，根據(jù)Calbiochem的說(shuō)明書(shū)，用5-溴-2脫氧尿嘧啶(BrdU)溫育細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)測(cè)定了向活躍增殖細(xì)胞的DNA中摻入BrdU的能力。通過(guò)吸光度值估測(cè)BrdU的摻入量，并與模擬體處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。已知BrdU的摻入僅在DNA合成時(shí)發(fā)生。在有絲分裂S-期，發(fā)生DNA合成，從而引起染色體的加倍。在癌細(xì)胞中，處于DNA合成過(guò)程中的細(xì)胞數(shù)量表示引起腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)潛能。因此，摻入到細(xì)胞中的BrdU的量與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)潛能直接成正比。另外，還利用實(shí)時(shí)定量PCR分析，對(duì)用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中特定mRNA的敲減效果進(jìn)行分析。測(cè)定用NuMA特異性siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或用錯(cuò)義siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中NuMAmRNA的相對(duì)量，并通過(guò)KennethJLandThomasDS"Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandmethod”Methods25402-408(2001)中記載的方法測(cè)定mRNA水平的變化倍數(shù)。通過(guò)測(cè)定PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)或Ki-67抗原的水平，獲得用siRNA分子處理的癌細(xì)胞系的增殖和轉(zhuǎn)移潛能。通過(guò)Western印跡分析NuMA的蛋白水平。雖然siRNA的轉(zhuǎn)染引起靶mRNA水平的成功敲減，但細(xì)胞具有彌補(bǔ)所述mRNA損失的多種機(jī)制，例如通過(guò)增強(qiáng)基因表達(dá)以滿足細(xì)胞對(duì)所需蛋白的需求。因此，本發(fā)明中siRNA的功效通過(guò)降低靶蛋白的量(從而削弱與該蛋白相關(guān)的功能特性)的能力來(lái)測(cè)定。如上文所述，NuMA蛋白水平的抑制對(duì)細(xì)胞的代謝活性具有多種可導(dǎo)致細(xì)胞功能受到破壞的作用。這可以通過(guò)集落形成試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，該試驗(yàn)主要鑒定了單個(gè)癌細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞周期過(guò)程從而引起腫瘤發(fā)展(如果細(xì)胞轉(zhuǎn)移)的能力。通過(guò)分析由于細(xì)胞膜完整性受損引起的LDH向培養(yǎng)基中的釋放量，來(lái)研究用siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的細(xì)胞毒性。如上文所述，NuMA的敲減引起紡錘體極不能正確組裝，從而導(dǎo)致細(xì)胞分裂失敗。這引起有絲分裂檢查點(diǎn)的激活，從而引起細(xì)胞周期阻滯。這些細(xì)胞可能喪失了細(xì)胞膜完整性，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性LDH的釋放。發(fā)現(xiàn)NuMA位于紡錘體極，并負(fù)責(zé)微管負(fù)端在紡錘體極的匯集。為了在細(xì)胞分裂過(guò)程中具有功能，要求NuMA以恰當(dāng)?shù)奈恢煤蛿?shù)量進(jìn)行定位。NuMA和紡錘體極共定位的缺失導(dǎo)致缺陷性紡錘體組裝。雖然可以使用諸如mRNA定量和蛋白定量的方法，但這些方法都不能顯示細(xì)胞正常功能所需的NuMA的最小閾值水平。本發(fā)明的目的是測(cè)定與模擬物處理的對(duì)照相比，可以共定位至其作用位點(diǎn)的NuMA的量。評(píng)價(jià)siRNA對(duì)干擾素產(chǎn)生的影響，從而確定是否存在對(duì)外源核酸的引入產(chǎn)生的任何不利響應(yīng)。通過(guò)測(cè)定SiRNA抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力或引起腫瘤消退的能力，對(duì)SiRNA進(jìn)行臨床前評(píng)價(jià)。向6-8周齡裸鼠皮下或靜脈內(nèi)注射密度為10，000,000個(gè)細(xì)胞/100μL體積的結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247(得自于ATCC)。移植瘤的體積(mm3)達(dá)80_100mm尺寸時(shí)，用針對(duì)NuMA的siRNA處理腫瘤。RINA25處理的動(dòng)物顯示NuMA蛋白的敲減，并且在3只經(jīng)處理動(dòng)物中，有1只觀察到了腫瘤消退。以下實(shí)施例用于證明本發(fā)明的某些實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，以下實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)踐中功能良好的技術(shù)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容可以在所公開(kāi)的具體實(shí)施方案中進(jìn)行很多變化并獲得相似或相近的結(jié)果，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例1設(shè)計(jì)用于調(diào)節(jié)NuMA的21mer、23mer和27mersiRNA根據(jù)以下文獻(xiàn)設(shè)計(jì)21mer、23mer或27mersiRNA=Henshel,Aetal.，“DEQORAwebbasedtoolforthedesignandqualitycontrolofsiRNAs,，，NucleicAcidsRes.2004；32:W113-ffl20；Ui-Tei,K,etal.,"GuidelinesfortheselectionofhighlyeffectivesiRNAsequencesformammalianandchickRNAinterference,，，NucleicAcidRes.2004；32(3):936_48；Sui,G.，etal.，"ADNAvectorbasedRNAitechnologytosuppressgeneexpressioninmammaliancells,"Proc.Natl.Acad.SciUSA2002；26(2)199-213；Kim,D.H.,etal.,"SyntheticdsRNAdicer-substratesenhanceRNAiinplasmacytoiddendriticcellsthroughTLR7,"NatureMedicine2005;11:263-270;Judge,A.D.,etal.,"SequencedependentstimulationofthemammalianinnateimmuneresponsebysyntheticsiRNA,"Nat.Biotechnol.2005；23(4):457_62。十siRNA需要滿足以下基本要求對(duì)于21mersiRNA的設(shè)計(jì)1.所有siRNA都具有30-50%的GC含量；2.各siRNA的3，都具有dTdT懸端。對(duì)于23mersiRNA的設(shè)計(jì)1.所有siRNA在5’端都以G/C起始；2.各siRNA的3，都具有dTdT懸端；3.雙鏈的GC含量在40-50%之間。對(duì)于27mersiRNA的設(shè)計(jì)1.雙鏈的GC含量在40-55%之間；2.正義鏈為25個(gè)核苷酸，而反義鏈為27個(gè)核苷酸，從而導(dǎo)致反義鏈的3’具有懸端；3.正義鏈的3’最后2個(gè)核苷酸包含脫氧糖而非核糖骨架。4.正義鏈的5’具有懸端，而3’為平端。利用可從網(wǎng)絡(luò)上獲取的各種算法和其它手工分析法篩選NuMA序列中可以滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的可接近位點(diǎn)。根據(jù)這些標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出以下位點(diǎn)。表1用于合成siRNA的NuMA的靶ORF序列<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例2=SiRNA分子的制備利用諸如AppliedBiosystemsjeckman等多個(gè)公司的可商購(gòu)儀器，通過(guò)化學(xué)方式合成RNAi分子。這些分子可以通過(guò)以下任何標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)法合成或購(gòu)自Qiagen。根據(jù)在核糖2'_碳位引入的保護(hù)基團(tuán)的類型對(duì)化學(xué)法進(jìn)行分類1.2，-叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)2.2，-0-三異丙基甲硅氧基甲基(TOM)3.2，-乙酰氧基乙氧基化學(xué)(ACE)該循環(huán)開(kāi)始于結(jié)合在固相支持物或珠子上的3’_起始核苷。第二核苷偶聯(lián)在第一核苷的5-羥基上。加帽抑制錯(cuò)誤核苷或短核苷的增長(zhǎng)(propagation)。然后，將核苷間磷酸鍵氧化為最終的P(V)態(tài)。最后，除去新核苷酸上的5’-保護(hù)基團(tuán)，將形成的寡核苷酸用于下一個(gè)核苷酸的加入。核酸分子達(dá)到預(yù)期長(zhǎng)度后，還要對(duì)其進(jìn)行脫保護(hù)、從固相支持物上切下并分析其純度和產(chǎn)量。純化通過(guò)脫鹽或PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)或通過(guò)離子交換-高效液相色譜(IE-HPLC)對(duì)siRNA進(jìn)行純化。通過(guò)MALDI-T0F分析各核苷酸鏈的質(zhì)量，并通過(guò)在30nm的積分分光光度吸收值測(cè)定產(chǎn)量。在通過(guò)MALDI-T0F進(jìn)行的質(zhì)量控制過(guò)程中，與預(yù)定值的最大允許差異是4個(gè)原子質(zhì)量單位的差異。獲得各個(gè)鏈的可比較產(chǎn)量后，使正義鏈和反義鏈退火，并真空凍干。使用時(shí)，將凍干粉懸浮在RNA懸浮緩沖液(IOOmMKCl、30mMHEPES緩沖液(pH7.5)和ImMMgCl2)中，在90°C加熱1分鐘，并在37°C溫育1小時(shí)，以溶解凍干粉。通過(guò)這些制備方法，合成以下siRNA(表2)。表2針對(duì)NuMA的siRNA的合成及其末端修飾<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>RINA10是錯(cuò)義序列，表示其不能靶向任何目標(biāo)基因。將該序列作為陰性對(duì)照，在試驗(yàn)中稱為模擬物處理。實(shí)施例3=NuMA在不同癌細(xì)胞系中的表達(dá)分析A)誦i寸實(shí)時(shí)定量PCR的某因表汰分析比較不同癌細(xì)胞系相對(duì)于正常二倍體細(xì)胞(視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE-19)和人成纖維細(xì)胞(HFF-2))的NuMA水平。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR比較基因的表達(dá)水平。在本研究中使用的癌細(xì)胞系包括乳癌細(xì)胞系(HTB-26、MCF-7和SKBR-3)、結(jié)腸癌細(xì)胞(CCL-247和HTB-38)、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(A549)和宮頸癌細(xì)胞系(HeLa)。利用經(jīng)過(guò)略有改動(dòng)的QiagenFastlanecellcDNA試劑盒制備用于實(shí)時(shí)PCR分析的第一鏈cDNA。簡(jiǎn)而言之，沉淀20，000個(gè)細(xì)胞，并用FCW緩沖液(Qiagen，德國(guó))洗滌一次。在室溫下利用緩沖液FCP(Qiagen，德國(guó))裂解細(xì)胞15分鐘。通過(guò)加入gDNAwipeout緩沖液(Qiagen，德國(guó))在42.5°C溫育30分鐘，除去基因組DNA污染。通過(guò)加入Quantiscript反轉(zhuǎn)錄酶在42.5°C溫育45分鐘然后在95°C溫育3分鐘，合成第一鏈cDNA。所制備的第一鏈cDNA或者立即用于實(shí)時(shí)定量PCR，或者在-20°C貯存?zhèn)溆?。?xì)胞系的匯集度維持在60-70%。在收集細(xì)胞前24小時(shí)加入新鮮培養(yǎng)基。如上所述，根據(jù)FastlanecellcDNA試劑盒(Qiagen)的方法，利用實(shí)驗(yàn)細(xì)胞制備第一鏈cDNA。與正常的二倍體細(xì)胞相比，癌細(xì)胞中NuMA的表達(dá)相差數(shù)倍。如表3所示，在所檢測(cè)的癌細(xì)胞中，乳癌細(xì)胞系SKBR-3顯示最高表達(dá)(分別是HFF-2和ARPE-19細(xì)胞的365%和308%)，而在宮頸癌細(xì)胞系Hela中，NuMA處表達(dá)下調(diào)(分別為正常細(xì)胞HFF-2和ARPE-19的61.61%和51.95%)。表3與非癌細(xì)胞系相比，NuMA在不同癌細(xì)胞系中表達(dá)水平的百分?jǐn)?shù)變化<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實(shí)施例4:功效的檢測(cè)A)在不同細(xì)胞系中態(tài)挪碰/siRNA碰:從ATCC獲取HTB-26、MCF-7、HCC-38和SKBR-3(乳癌細(xì)胞)，CCL-247和HTB-38(結(jié)腸癌)，A549(肺癌)，HeLa(宮頸癌)，PC-3(前列腺癌)，A431(表皮樣癌)，HFF-2(正常二倍體纖維細(xì)胞)和ARPE-19(正常二倍體視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)細(xì)胞系，使其在于T-25瓶中保持70-80%的匯集度并在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)更換培養(yǎng)基。用于siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系傳代次數(shù)不超過(guò)10次。轉(zhuǎn)染時(shí)，用胰蛋白酶消化并以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度重新接種在24孔平板或者任何其它用于標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)的一次性塑料皿中。除非另有說(shuō)明，否則所有轉(zhuǎn)染都在24孔板中進(jìn)行，并根據(jù)用于給定試驗(yàn)的細(xì)胞系而改變細(xì)胞密度。在轉(zhuǎn)染前1小時(shí)，以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度對(duì)24孔板的各個(gè)孔進(jìn)行接種(生長(zhǎng)培養(yǎng)基不超過(guò)400μL)，并在含5%CO2的37°C培養(yǎng)箱中溫育。將siRNA稀釋到IOnM的終濃度(向97μLOpti-MEMI中加入0.3μL20μM的siRNA儲(chǔ)備液)，向其中加入3μLHiperfect轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen)，渦旋，并在室溫下溫育10分鐘。在所有試驗(yàn)中都使用RINA10作為陰性對(duì)照。將siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合體充分混合，并輕柔地逐滴加入到含細(xì)胞的各個(gè)孔中，然后在37°C、5%的CO2中溫育。通過(guò)計(jì)算轉(zhuǎn)染16小時(shí)后具有Cy3標(biāo)記的siRNA的細(xì)胞數(shù)，獲得各細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，在PBS中洗滌1次，并懸浮在PBS中。利用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，并計(jì)算15個(gè)不同視野中的熒光細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。Cy3標(biāo)記的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)反映了轉(zhuǎn)染的效率，其在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的70%至乳癌細(xì)胞系MCF-7的99%之間變化。表4通過(guò)Cy3標(biāo)記的siRNA測(cè)定的不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率的百分?jǐn)?shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>B)結(jié)腸癌細(xì)朐系CCL-247ΦNuMA的敲減無(wú)法定位在紡錘體極通過(guò)用RINA25和RINA10轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞CCL-247，研究NuMA敲減對(duì)細(xì)胞形態(tài)以及其分布的影響。轉(zhuǎn)染72小時(shí)結(jié)束時(shí)，將細(xì)胞在乙醇中固定5分鐘，然后根據(jù)GodingJff.,"MonoclonalAntibodies:principlesandpractice,，，3rded.London:AcademicPress,ρ141-191;352-399(1996)的方法進(jìn)行免疫熒光染色。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，并比較未處理的細(xì)胞和用RINA25或RINA10處理的細(xì)胞。NuMA敲減對(duì)細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有影響。由于細(xì)胞質(zhì)或紡錘體極中NuMA蛋白的水平降低，用RINA25處理的細(xì)胞不能染色。如圖1所示，在用RINA10處理或未經(jīng)處理的細(xì)胞中，觀察到NuMA在有絲分裂過(guò)程中位于紡錘體極，以及遍布于細(xì)胞質(zhì)中。所獲得的結(jié)果表明，RINA25可以成功地敲減了NuMA的表達(dá)。C)鄉(xiāng)戸斤Ii十白杯胃SiRNA#__胞名漏輸體用RINA1、9、25或10轉(zhuǎn)染SKBR-3和HCC-38(乳癌)細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，以8000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將細(xì)胞一式三份地鋪在96孔板的各個(gè)孔中。72小時(shí)后，將細(xì)胞與BrdU一起溫育3小時(shí)。通過(guò)加入固定試劑終止BrdU的摻入，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行滲透處理從而允許利用抗BrdU抗體進(jìn)行標(biāo)記。所述抗體與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合，而辣根過(guò)氧化物酶可以將H2O2轉(zhuǎn)化為能夠使用540nm的標(biāo)準(zhǔn)濾光器通過(guò)450nm的吸收值測(cè)定的發(fā)色產(chǎn)物。所述吸收值可用于估測(cè)與用RINA10(陰性對(duì)照siRNA)處理的細(xì)胞相比，用siRNA處理后處于S-期的細(xì)胞比例。所有試驗(yàn)都進(jìn)行一式三份，并得到其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過(guò)配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)(P彡0.05)計(jì)算RINA10處理的細(xì)胞與RINA25處理的細(xì)胞之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。用RINA25轉(zhuǎn)染后，癌細(xì)胞系SKBR-3和HCC-38的BrdU摻入分別為69%和41%。與用RINA10處理的細(xì)胞相比，用RINA1或RINA9對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理也引起B(yǎng)rdU摻入的降低，但降低程度小于用RINA25處理的細(xì)胞(表5)。發(fā)現(xiàn)在RINA10處理的細(xì)胞和所有siRNA處理的細(xì)胞間，在RINA1和RINA25處理的細(xì)胞間，在RINA9和RINA25處理的細(xì)胞間，在RINA1和RINA9處理的細(xì)胞間以及在RINA25和RINA10處理的細(xì)胞間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。這些結(jié)果表明，RINA25比RINA1和RINA9更有效。表5在SiRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，通過(guò)BrdU摻入計(jì)算的處于細(xì)胞周期S-期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)*細(xì)胞系(癌)RINAlRINA9RINA25SKBR-3(乳癌)99+0.191+0.269+0.19HCC-38(乳癌)51+0.0969+0.0141+0.17*相對(duì)于RINA10(陰性siRNA)處理的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。P)實(shí)時(shí)定量PCR分析不受理論的束縛，認(rèn)為用siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞可引起RNAi通路的激活，其中與siRNA互補(bǔ)的mRNA被降解，從而降低mRNA的水平。可以通過(guò)測(cè)定siRNA轉(zhuǎn)染后mRNA的水平，計(jì)算siRNA的功效(不過(guò)應(yīng)當(dāng)通過(guò)蛋白質(zhì)水平確認(rèn)最終確定的功效)。利用實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，利用siRNA轉(zhuǎn)染的不同細(xì)胞系mRNA的水平。表5與未經(jīng)處理的對(duì)照組細(xì)胞，siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后不同細(xì)胞系NuMA的mRNA水平降低的倍數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>總之，當(dāng)用RINA25轉(zhuǎn)染時(shí)，乳癌細(xì)胞系MCF-7和ΗΤΒ-26顯示最大的敲減效率。Ε)NuMA蛋白水平的分析轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，提取用siRNA轉(zhuǎn)染的A549、HFF-2、A431和PC3細(xì)胞的總蛋白。與陰性siRNA處理樣品相比，siRNA處理使NuMA蛋白水平的表達(dá)降低達(dá)90%(如圖2)。蛋白表達(dá)的下降反映了實(shí)時(shí)PCR中觀察到的mRNA水平的下降。如圖2所示，在不同的RINA中，與可觀察到痕量蛋白的RINA1處理和RINA9處理相比，RINA25使蛋白水平完全敲減。實(shí)施例5抗癌特性的體外檢測(cè)A)集落形成試驗(yàn)使用集落形成試驗(yàn)評(píng)價(jià)經(jīng)siRNA處理的細(xì)胞啟動(dòng)并發(fā)展成腫瘤的能力。對(duì)24-孔板中的細(xì)胞(Hela、A549和CCL-247)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，計(jì)數(shù)并以300個(gè)細(xì)胞/板的濃度重鋪在6孔板中，一式三份。同樣制備了經(jīng)模擬物處理的細(xì)胞系和未經(jīng)處理的細(xì)胞系作為對(duì)照。溫育10天后，用PBS洗滌細(xì)胞一次，并用300yL0.的結(jié)晶紫染色5分鐘，然后用PBS洗滌3次。該染色可以在圖3中觀察到，其中顯示了CCL-247癌細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下對(duì)具有至少60個(gè)細(xì)胞的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。利用下式獲得集落形成的抑制百分?jǐn)?shù)集落形成的抑制率=(對(duì)照的集落形成率_試驗(yàn)的集落形成率)/對(duì)照的集落形成率X100。由三份重復(fù)的平均數(shù)獲得各處理的集落形成單位的平均百分?jǐn)?shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。獲得相對(duì)于模擬物處理的細(xì)胞的集落形成效率/存活率的百分?jǐn)?shù)。表6:siRNA轉(zhuǎn)染10天后，通過(guò)結(jié)晶紫染色計(jì)算相對(duì)于模擬物處理的對(duì)照的集落形成單位(CFU)百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞系Γμ““集落形成的百分?jǐn)?shù)(％)Hela(宮頸癌)RINA2556.00+2.15*RINAlO99.50±6.95未處理100.00±0.2Α549(非小細(xì)胞肺癌)RINA2578.60+2.47*RINAlO105.18±9.73未處理100.01±0.11CCL-247(結(jié)腸癌)RINA2558.65+27.26*RINAlO90.00±0.38未處理100.00±6.0*相對(duì)于未處理的細(xì)胞和模擬物處理的細(xì)胞具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，P<0.05。根據(jù)細(xì)胞系，對(duì)不同細(xì)胞系的處理相對(duì)于未處理組對(duì)集落形成能力的抑制為56%-78%(表6)。HeLa細(xì)胞顯示最小的集落形成(56%)，而Α549顯示最大的集落形成(78%)。B)SiRNA寸翩胞細(xì)胞·禾口/翻胞雕浦白■向利用LDH釋放測(cè)定水平降低的NuMA對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒性。用siRNA轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞系，并以20，000細(xì)胞/孔的濃度鋪在24孔板中，一式三份。72小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)單離心以清除死亡的漂浮細(xì)胞，并將100μL用過(guò)的培養(yǎng)基加入到單個(gè)96孔板中以根據(jù)SigmaLDH檢測(cè)試劑盒(T0X-7)的說(shuō)明書(shū)評(píng)價(jià)LDH。利用690nm的標(biāo)準(zhǔn)濾光器測(cè)量在490nm的吸收值。如表7所示，根據(jù)三個(gè)重復(fù)孔計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并與未處理的細(xì)胞進(jìn)行比較。表7.在各種癌細(xì)胞系中敲減NuMA對(duì)LDH釋放的影響*<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*與陰性對(duì)照RINA10處理相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所得結(jié)果表明，與RINA10處理的細(xì)胞相比，所檢測(cè)的任一細(xì)胞系都沒(méi)有顯著的LDH釋放。這表明，對(duì)NuMA表達(dá)的抑制沒(méi)有細(xì)胞毒性。C)SiRNA轉(zhuǎn)染對(duì)癌細(xì)胞系細(xì)胞周期的影響由于癌細(xì)胞一直處于增殖狀態(tài)，在給定時(shí)間處于細(xì)胞周期的S-期的細(xì)胞數(shù)量決定了腫瘤的生長(zhǎng)潛能。以8000個(gè)細(xì)胞/孔的密度將經(jīng)siRNA處理的細(xì)胞(乳癌細(xì)胞HTB-26、MCF-7、HCC-38，結(jié)腸癌細(xì)胞CCL-247，肺癌細(xì)胞A549，宮頸癌細(xì)胞HeLa和前列腺癌細(xì)胞PC3)鋪在96孔板中，以測(cè)定RINA25對(duì)細(xì)胞周期的影響，并由此測(cè)定其控制癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)指數(shù)的能力。如上所述，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后向細(xì)胞摻入BrdU，以測(cè)定處于細(xì)胞周期的S-期的細(xì)胞數(shù)量。根據(jù)吸收值，獲得處于細(xì)胞周期的S-期的細(xì)胞相對(duì)于模擬物處理的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。所有試驗(yàn)都進(jìn)行一式三份，并獲得其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。表8在SiRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，通過(guò)BrdU摻入計(jì)算處于細(xì)胞周期的S-期的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。細(xì)胞系(癌)RINA25RINAlOHTB-26(乳癌)68.90士6.12*99.56士5.68~MCF-7(乳癌)75.85士3.45*92.90士8.22~HCC-38(乳癌)41.00士0.17*99.44士25.03SKBR-3(乳癌)69.19士0.19*99.78士1.95~CCL-247(結(jié)腸癌)53.53+53.04*84.11+38.72A549(肺癌)82.47士16.5390.09士7.71^HeLa(宮頸癌)85.33+0.93*96.64士17.55PC3(前列腺癌)78.79士5.73*100.34士1.95*通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算相對(duì)于未處理的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P<0.05。在所檢測(cè)的細(xì)胞系中，相對(duì)于模擬物處理的細(xì)胞，乳癌細(xì)胞系HCC-38顯示僅41%的細(xì)胞處于細(xì)胞周期的S-期，而宮頸癌細(xì)胞Hela顯示有85%的細(xì)胞處于S-期。P)NuMA敲減對(duì)細(xì)胞周期的影響72小時(shí)后，收集用RINA25和RINA10轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞系。用PBS洗滌細(xì)胞，并在4°C在70%的冰冷乙醇中固定60分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞，并于4°C用溴化乙錠處理30分鐘。利用FACScaliber(BectonDickinson)對(duì)經(jīng)溴化乙錠染色的細(xì)胞進(jìn)行流式分析。利用Cellquest軟件獲取10，000個(gè)設(shè)門事件(gatedevent)的數(shù)據(jù)，并利用ModfitLT2.0(VeritySoftwareHouse，Topsham，Me)分析。NuMA的敲減誘導(dǎo)凋亡。如表10和11以及圖4所示，(利用RINA25)敲減NuMA導(dǎo)致在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、乳癌細(xì)胞MCF-7和結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL-247中誘導(dǎo)凋亡。另外，NuMA敲減還抑制細(xì)胞周期的S-期，而細(xì)胞周期的S-期表現(xiàn)了癌性細(xì)胞的增殖潛能。表9.NuMA對(duì)癌癥抑制；用RINA25轉(zhuǎn)染72小時(shí)的癌細(xì)胞系的流式細(xì)胞術(shù)分析。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>Ε)^mmm^rnhrna轉(zhuǎn)染對(duì)干擾素π向應(yīng)的i秀導(dǎo)根據(jù)本文其他地方的闡述將RINA25和10轉(zhuǎn)染入不同的癌細(xì)胞系中，并在24孔板中溫育72小時(shí)。72小時(shí)結(jié)束時(shí)，離心平板除去死亡的細(xì)胞，并將100μL上清于4°C在圓底ELISA板內(nèi)溫育。然后，用PBST(含0.l%Tween20的磷酸鹽緩沖液)洗滌細(xì)胞以除去未結(jié)合的抗原，并在室溫下與5%的脫脂奶粉一起溫育30分鐘。然后，如上所述將孔用PBST洗滌三次，并再與結(jié)合有HRP的山羊抗兔抗體在室溫下溫育1小時(shí)。溫育結(jié)束時(shí)，加入HRP底物。由三份重復(fù)計(jì)算吸收值，結(jié)果示于表10和11中。表10.SiRNA轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)干擾素α響應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*表示通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算，與其他處理相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性(P^0.05)。表11.siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)干擾素β響應(yīng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*表示通過(guò)學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算，與其他處理相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著件(P(0.05)。siRNA轉(zhuǎn)染常伴隨IFN-α和IFN-β的產(chǎn)生。然而，在RINA處理細(xì)胞和未處理細(xì)胞中均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的IFN-α或IFN-β釋放，這表明RINA25沒(méi)有引發(fā)任何IFNa響應(yīng)。F)對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響為了檢測(cè)siRNA的特異性，如上所述，使用siRNA轉(zhuǎn)染乳癌細(xì)胞ΗΤΒ-26。在轉(zhuǎn)染72小時(shí)結(jié)束時(shí)，按照Qiagen總RNA提取試劑盒(RNeasyMinikit)的說(shuō)明書(shū)制備總RNA。將2μg總RNA懸浮在10μL水中。利用AgilentTechnologies的納米芯片(nano-chip)在Bioanalyzer上檢測(cè)RNA的質(zhì)量。將1μg總RNA轉(zhuǎn)化為生物素化的擴(kuò)增RNA，用于與IlluminaSentrix陣列雜交。在該方法中涉及的步驟包括利用帶有T7啟動(dòng)子的寡聚(dT)引物，通過(guò)ArrayScript對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用DNA聚合酶和RNase實(shí)現(xiàn)第二鏈的合成。純化雙鏈cDNA，并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以合成生物素化的cRNA。將cRNA雜交(人全基因組的8-樣品芯片)過(guò)夜，并用鏈霉親和素-Cy3探針檢測(cè)。在檢測(cè)結(jié)束時(shí)，干燥IlluminaBead芯片，并用BeadStudio分析儀軟件掃描。對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行分析，以獲得未處理樣品、RINA10處理樣品和RINA25處理樣品間的基因表達(dá)差異。利用Beadstudio分析儀差異表達(dá)軟件，對(duì)平均信號(hào)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以+/_13.6的差異(“diff”)打分進(jìn)行“t檢驗(yàn)”。鑒定了RINA25處理樣品、RINAlO處理樣品和未處理樣品間的所有差異表達(dá)基因。將差異表達(dá)的探針I(yè)D分類，以得到下調(diào)或未調(diào)節(jié)的基因數(shù)。轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平的變化示于圖5，顯示了與陰性siRNA處理對(duì)照相比上調(diào)或下調(diào)的基因數(shù)。G.棵鼠中的功效研究為了檢測(cè)siRNA在體內(nèi)的功效，通過(guò)以10，000，000個(gè)細(xì)胞/100μL體積PBS的密度向一側(cè)肋皮下注射人結(jié)腸癌細(xì)胞系CCL247，從而向6-8周齡的雌性裸鼠中引入結(jié)腸癌腫瘤移植物。在2周結(jié)束時(shí)，小鼠形成大約SO-IOOmm3的腫瘤。將小鼠分為兩組。組B由用RINA25處理的3只動(dòng)物組成，組A由用安慰劑處理的3只動(dòng)物組成。每隔一天以IOmgRINA/kg體重對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理。5次劑量后，取出腫瘤并通過(guò)蛋白印跡分析NuMA敲減。在RINA25處理的動(dòng)物中，NuMA水平相對(duì)于安慰劑處理組降低(圖6)。這表明，RINA25能夠在體內(nèi)條件下敲減結(jié)腸癌中的NuMA。在3只動(dòng)物中，與所有其他動(dòng)物相比，動(dòng)物B-Il在第7天和第11天顯示最少的百分生長(zhǎng)率(表12)。表12.RINA25敲減NuMA對(duì)腫瘤消退的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>*組A-表示安慰劑處理的動(dòng)物，其中向動(dòng)物施用非特異性核酸。組B-表示施用RINA25的動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容，而不需要過(guò)度試驗(yàn)即可制備和實(shí)施本發(fā)明所公開(kāi)和請(qǐng)求保護(hù)的所有組合物和方法。雖然已經(jīng)在某些實(shí)施方案中對(duì)本發(fā)明的組合物和方法進(jìn)行了闡述，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，在不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍的前提下，各種改變可以應(yīng)用于本發(fā)明闡述的組合物和/或方法以及方法的步驟或步驟的順序中。更具體地，顯然，可以使用某些化學(xué)或生理相關(guān)的試劑代替本發(fā)明所闡述的試劑而獲得相同或類似的結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，顯然，所有類似的替代和修改都被視為在本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)。權(quán)利要求siRNA，其靶向Genbank登錄號(hào)為NM_006185的NuMAmRNA。2.如權(quán)利要求1所述的siRNA，其靶向Genbank登錄號(hào)為NM_006185的NuMAmRNA的第20-40、578-598或905-928位核苷酸及其SNP。3.如權(quán)利要求1所述的siRNA，其靶向選自由SEQIDNO:l、SEQIDNO2禾PSEQIDNO3組成的組的序列。4.如權(quán)利要求1所述的siRNA，其中至少一條鏈由長(zhǎng)度為19-30個(gè)核苷酸的核苷酸鏈構(gòu)成。5.如權(quán)利要求1所述的siRNA，其中所述siRNA具有選自由以下組成的組的結(jié)構(gòu)SEQIDNO:4和SEQIDNO5；SEQIDNO6和SEQIDNO7；SEQIDNO8和SEQIDNO9；和SEQIDNO10和SEQIDNO:11。6.降低靶細(xì)胞中NuMA表達(dá)的方法，所述方法通過(guò)施用權(quán)利要求1所述的siRNA來(lái)進(jìn)行。7.降低靶細(xì)胞中NuMA表達(dá)的方法，所述方法通過(guò)施用權(quán)利要求4所述的siRNA來(lái)進(jìn)行。8.治療癌癥的方法，所述方法通過(guò)向有此需要的受試者施用siRNA來(lái)進(jìn)行，所述siRNA為靴向Genbank登錄號(hào)為NM_006185的NuMA的第20_40、578_598或905-928位核苷酸及其SNP的siRNA。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述siRNA靶向選自由SEQIDNO=USEQIDNO2和SEQIDNO3組成的組的序列。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述siRNA由19-30個(gè)核苷酸的核苷酸鏈構(gòu)成。11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述siRNA具有選自由以下組成的組的結(jié)構(gòu)SEQIDNO4和SEQIDNO5；SEQIDNO6和SEQIDNO7；SEQIDNO8和SEQIDNO9；和SEQIDNO10和SEQIDNO:11。12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述癌癥選自由以下組成的組宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤、白血病、腦癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、頭頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤和多藥耐藥癌。13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述癌癥選自由結(jié)腸直腸癌、乳癌、肺癌和前列腺癌組成的組。14.用于治療癌癥的組合物，其包含權(quán)利要求1所述的siRNA和藥學(xué)上可接受的賦形劑。15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述癌癥選自由以下組成的組宮頸癌、表皮樣癌、口腔癌、膠質(zhì)瘤、白血病、腦癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、宮頸癌、頭頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、淋巴瘤和多藥耐藥癌。16.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述癌癥選自由結(jié)腸直腸癌、乳癌、肺癌和前列腺癌組成的組。17.治療癌癥的方法，所述方法包括向有此需要的受試者施用抑制NuMA表達(dá)的siRNA。18.用于治療癌癥的組合物，其包含抑制NuMA表達(dá)的siRNA和藥學(xué)上可接受的賦形劑。19.如上述權(quán)利要求所述的本發(fā)明實(shí)施例和附圖中基本上例證的靶向NuMAmRNA表達(dá)的siRNA、其方法和組合物。全文摘要本發(fā)明涉及小干擾核酸分子(siRNA)在抑制核有絲分裂器蛋白(NuMA)基因表達(dá)中的應(yīng)用及其在治療包括癌癥在內(nèi)的疾病中的應(yīng)用。文檔編號(hào)C12N15/113GK101802196SQ200880103252公開(kāi)日2010年8月11日申請(qǐng)日期2008年6月13日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者克里什那·阿迪帕利·穆拉里,查德拉·韋迪亞達(dá)·瑞迪·古帕瓦萊·艾斯瓦爾,比瑪蘭度·拉伊·克里提申請(qǐng)人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司