專利名稱：：提高植物脅迫抗性的方法和材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物中的脅迫抗性，比如抗旱性、抗鹽性、抗熱或抗旱性、抗光性和抗PH性，以及用于提高植物中脅迫抗性和用于篩選植物中與提高脅迫抗性提高相關(guān)的突變的方法和材料。本發(fā)明還涉及用于延遲植物中開始開花和改變植物葉片形狀的方法和材料。
背景技術(shù)：
：全世界作物產(chǎn)量最大的限制因素是非生物脅迫，導(dǎo)致平均有超過50%的潛在產(chǎn)量損失(Boyer,J.S.(1982),"PlantProductivityandEnvironment"Science218(4571)443-448)。非生物脅迫包括極端溫度、鹽度、酸性土壤、高光強(qiáng)、干旱及其組合。因為植物是固定的，不能逃離這些脅迫條件，所以它們通過改變蛋白質(zhì)和代謝物組成、形狀和生理而作出響應(yīng)。這些改變允許植物通過適應(yīng)脅迫條件而使所受損傷受到限制，還可以修復(fù)由脅迫引起的損傷。這些改變由過程介導(dǎo)，所述過程可感知脅迫和/或其對植物的影響，并激活多個復(fù)雜的信號傳導(dǎo)通路。依賴于經(jīng)歷的脅迫條件的類型，由植物激活不同的通路，但是通路間經(jīng)常重疊并且相互作用。這種重疊能引起交叉抗性，即盡管只接觸一種脅迫條件，卻對多種類型脅迫產(chǎn)生抗性。這很重要，因為脅迫很少單獨(dú)發(fā)生。例如低溫脅迫還會導(dǎo)致高光脅迫，因為盡管低溫會引起植物代謝變慢，但如果光能和從前一樣多，植物還是能豐收。同樣地，干旱能引起高溫脅迫，因為要關(guān)閉氣孔保持水分，但是因此犧牲了蒸發(fā)的冷卻作用，導(dǎo)致高溫脅迫。此外，在自然中，脅迫條件很少單獨(dú)存在。在澳大利亞，作物同時經(jīng)歷干旱和高光脅迫是可以理解的。盡管已經(jīng)研究了脅迫信號傳導(dǎo)通路的一些組分，但是由于脅迫響應(yīng)通路的復(fù)雜性，對這些組分在通路中的位置和它們與其它組分的相互作用知之甚少，并且因此現(xiàn)有的改善植物脅迫抗性的方法有限。因此，需要新方法生產(chǎn)脅迫抗性提高的植物。
發(fā)明內(nèi)容本研究令人驚訝地顯示了SALl基因中的突變，所述突變可導(dǎo)致與SALl蛋白質(zhì)有關(guān)的活性降低或消失，使突變體植物的脅迫抗性提高。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供用于獲得相對于野生型植物的脅迫抗性提高的植物的方法，方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組，所述至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)致在所述一個或多個植物細(xì)胞中與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一個或多個植物；和(c)選擇一個或多個相對于野生型植物的脅迫抗性提高的植物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入。例如，可以通過化學(xué)或物理誘變技術(shù)，或使用插入突變方法如轉(zhuǎn)座子或T-DNA，導(dǎo)入突變，并且可以通過重組方法，使用例如化學(xué)輔助細(xì)胞滲透(使用，例如鈣、鋰、PEG)、電穿孔、微注射、月旨質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊(生物彈道)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒感染、原生質(zhì)體融合或本領(lǐng)域已知的任何其它合適的方法導(dǎo)入外源性核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述方法包括將至少一個突變導(dǎo)入SALl基因或其同源物，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表達(dá)?？梢詫⒅辽僖粋€突變導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞中編碼SALl或其同源物的核苷酸序列中，并且可以包含一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括位于SEQIDNO:1的核苷酸731至745、1226、1518、1519和1690區(qū)域中，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處的一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置1226處，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。產(chǎn)生的突變可以導(dǎo)致SEQIDNO:2的位置217處由甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸變化。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置731處，或SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由胞嘧啶至胸腺嘧啶的突變。產(chǎn)生的突變可以導(dǎo)致SEQIDNO2的位置124處由丙氨酸至纈氨酸的氨基酸變化。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括在SEQIDNO1的位置736處，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。產(chǎn)生的突變可以導(dǎo)致SEQIDNO:2的位置217處由谷氨酸至賴氨酸的氨基酸變化。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置1690處，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括在SEQIDNO:1的位置734和735之間，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處一個或多個核苷酸的插入，或者突變可以包括用一個或多個核苷酸替代SEQIDNO1的核苷酸734-735，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同的核苷酸。根據(jù)另一個實(shí)施方式，突變可以包括在SEQIDNO1的位置1518和1519之間或包含位置1518和1519，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處插入一個或多個核苷酸。根據(jù)一個實(shí)施方式，突變可以是SALl無效突變。根據(jù)另一個實(shí)施方式，本發(fā)明的方法可以包含向所述一個或多個植物細(xì)胞導(dǎo)入外源性核酸，所述外源性核酸能抑制內(nèi)源性SALl或其同源物的表達(dá)，或者用外源性蛋白質(zhì)的表達(dá)替代內(nèi)源性SALl或其同源物的表達(dá)。外源性蛋白質(zhì)可以是外源性突變SALl或其同源物，或者任何其它合適的蛋白質(zhì)，比如提供可篩選的表型的蛋白質(zhì)。由根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物對很多非生物脅迫的抗性相對于野生型植物提高，所述脅迫包括，但不限于，干旱、鹽、溫度脅迫、光脅迫、土壤PH和礦物質(zhì)毒性、或它們的任何組合。相對于野生型植物，所述植物對生物脅迫的抗性提高，所述脅迫由動物(包括食草動物和寵物或寄生生物體)、細(xì)菌、真菌和病毒或它們的任何組合誘導(dǎo)，但不限于此。根據(jù)一個實(shí)施方式，產(chǎn)生的植物相對于野生型植物至少抗旱性提高。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實(shí)施方式，產(chǎn)生的植物的開花時間延遲。根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個實(shí)施方式，產(chǎn)生的植物的葉片表型改變。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供用于獲得相對于野生型植物的開花時間改變的植物的方法，方法包含(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一種或多種植物；和(c)選擇相對于野生型植物的開花時間改變的一種或多種植物。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供用于獲得相對于野生型植物葉片表型改變的植物的方法，方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一種或多種植物；和(c)選擇相對于野生型植物的葉片表型改變的一種或多種植物。還提供通過本發(fā)明的方法獲得的植物，和植物部位(包括葉、莖、根、塊莖、花、果實(shí)及其部分)和來自植物的突變體/轉(zhuǎn)基因種子。根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方式，提供篩選存在核苷酸序列的至少一個突變等位基因的植物的方法，所述核苷酸序列編碼SALl或其同源物，所述方法包括使用至少一個適合作為探針或引物的核酸分子分析植物的DNA，所述探針或引物能在嚴(yán)格條件下與SALl基因或其同源物雜交。根據(jù)更具體的實(shí)施方式，篩選方法可以包括使用適于擴(kuò)增SALl基因或其同源物區(qū)域的至少一個寡核苷酸引物對，所述引物對包括正向引物和反向引物，檢測所述區(qū)域中是否存在突變。所述區(qū)域包含完整的SALl基因或其同源物，或者可以僅包含其中一部分，比如，例如(參照圖10)，核苷酸區(qū)域，其包含外顯子3、外顯子3和4之間的內(nèi)含子、外顯子5、外顯子5和6之間的內(nèi)含子、和外顯子6和7之間的內(nèi)含子、或它們的任何組合。核酸分子，或寡核苷酸引物對的成員，可以是適于在嚴(yán)格條件下與靶標(biāo)核苷酸序列特異性雜交的任意長短，并且包含從約15個核苷酸到約100個核苷酸，但是長度更通常地從約15至約30個核苷酸。圖l-alx8中SAL基因中點(diǎn)突變的鑒定A.色譜圖譜，表示Col-O野生型和由逆代雜交得到的多個alx8個體以及包含APX2-LUC構(gòu)建體的Col-O野生型中點(diǎn)突變區(qū)域的序列。下劃線表示由ContigExpress(Invitrogen,Carslbad，CA,USA)計算得到的一致性序列。第二個下劃線表示來自ArabidopsisInformationResource(TAIR;www.arabidopsis.orR)的SALl基因序列。點(diǎn)劃線框表示點(diǎn)突變的位點(diǎn)，并且實(shí)線框表示為dCAPS引物導(dǎo)入的突變。除APX2-LUC之外的所有序列為反向，即3’到5’。B.來自TAIR的所有alx8個體和SALl基因+3kb啟動子的所有序列的比對。箭頭表示基因序列5’到3’的方向。圖2-alx8中SALl基因中點(diǎn)突變的驗證將來自擬南芥信息資源(TAIR)的T8H11BAC的SALl基因和約1.07kb的啟動子消化并連接進(jìn)PCAM2300文庫載體(CAMBIA，Canberra,Australia)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)化Col-O野生型和alx8植物。分離得到用基因的野生型拷貝回補(bǔ)的alx8的兩系。還分離得到七個系的包含構(gòu)建體的Col-O野生型，并且所述野生型未表現(xiàn)出可見的表型。圖3-alx8SALl基因組序列(TAIR登錄序列4010730406；名稱AT5G63980.1；序列長度(bp):2122；最后修正日期2007-04-17)。這個序列在序列表中鑒定為SEQIDN0:1。這個基因組序列是此前的TAIR登錄號2160829的更新版本，并且其位于TAIR登錄號2160829中預(yù)測的起始密碼子上游162個核苷酸處。alx8中的點(diǎn)突變(gl226a)、起始密碼子(atg)和終止密碼子(tga)高亮顯示。圖4-alx8氨基酸序列(TAIR登錄號:AA序列4010745380；名稱AT5G63980.1；長度407aa；最后修訂日期2007-08_16)。這個序列在序列表中鑒定為SEQIDNO:2。alx8中的氨基酸變化(G217D)高亮顯示。圖5-與SALl同源的蛋白質(zhì)的比對使用blastp工具，在國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(NCBI;www.ncbi.nlm.nih.gov)鑒定與SALl同源的蛋白質(zhì)。然后使用ClustalW，在歐洲生物信息研究所(EMBL-EBI；www,ebi.ac.uk)比對這些蛋白質(zhì)。登錄號如下SALl，AY03894/Q42546(SEQIDNO46)；水稻(Oryzasativa),NP_001066326/NM_001072858(SEQIDNO44)；玉米(Zeamays),AAK57915/AF288075(SEQIDNO:45)?！?”表示列中的殘基在所有序列中都一樣，“”表示觀察到保守替代，并且“.”表示觀察到半保守替代。圖6-EST與SALlmRNA的同源性A.在基因索引軟件網(wǎng)站(TGI；www.compbio.dfci.harvard,edu)使用blastn，發(fā)現(xiàn)EST與SALlmRNA具有同源性。通過同樣的軟件計算得到百分比同一性。B.A中列出的EST的序列比對，在EMBLjBI網(wǎng)站使用ClustalW比對序列。“*”表示列中的核苷酸在比對的所有序列中相同。鑒定了序列表中的下述序列云杉(SEQIDN047)；松樹(SEQIDNO48)；苜蓿(SEQIDNO49)；蓮花(SEQIDNO50)；大豆(SEQIDNO51)；SALl(SEQIDNO52)；油籽(油菜籽)(SEQIDNO53)；白楊(SEQIDNO54)；棉花(SEQIDNO55)；西紅柿(SEQIDNO56)；馬鈴薯(SEQIDNO57)；洋蔥(SEQIDNO58)；小麥(SEQIDNO59)；大麥(SEQIDNO60)；稻米(SEQIDNO61)；和玉米(SEQIDNO62)。C.進(jìn)化分支圖，顯示根據(jù)B中的比對對共同祖先的估計。由EMBL-EBI網(wǎng)站計算。圖7-干旱條件對Col-O野生型、fryl-Ι和alx8的影響。在21°C，150微摩爾光子mY1，16小時白晝/8小時黑夜，保持水分13天。對于每種生態(tài)型，由5個生物復(fù)制樣本作為代表。所有植物都是大概相同的發(fā)育年齡，并且在干旱時期開始時尚未開花野生型植物4周齡，而alx8和fryl-Ι植物為8周齡。圖8-fryl-l和alx8耐旱。4周齡植物接觸干旱條件25天，條件為21°C，150微摩爾光子JiT2iT1,12小時白晝/12小時黑夜。A)0、10、17、21和25天后，fryl_l、C24野生型、alx8和Col-O野生型植物接觸干旱條件。在兩個單獨(dú)的實(shí)驗中，每個基因型由五株植物作為代表。B)由盆重量隨時間的變化估計土壤的水流失。給出了A)中植物的盆重量和平均盆重量。誤差條為五個生物副本之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9-來自耐干旱擬南芥突變體SALK—020882的SALl基因組序列(突出顯示起始密碼子(atg)和終止密碼子(tga))。從擬南芥生物資源中心(ABRC)獲得Col-O生態(tài)型中的T-DNA插入系。突變與alx8等位。A)TAIR給出的插入位點(diǎn)。通過從T-DNA插入的LB單次測序而建立。這給出了互補(bǔ)序列，即朝向基因的5，末端。(SEQIDNO3)B)為了確認(rèn)插入的位置，從來自一個植物的DNA上的插入的左邊界開始進(jìn)行熱不對稱交錯PCR(TAIL-PCR)。由兩側(cè)獲得序列，表明出現(xiàn)雙插入的可能性。獲得的序列還表明在插入位點(diǎn)附近缺失llbp。(SEQIDNO4)圖10-SAL1基因的大規(guī)模描述。外顯子用方框表示，內(nèi)含子用線表示，箭頭代表設(shè)計用于擴(kuò)增的引物(參見表1)，還給出了salk和fryl-3插入的位置，和fryl-l,fryl_2、hos2和鑒別的alx8點(diǎn)突變的位置。圖Il-SALl的western印跡。使用抗SALl抗體和來自Col-O和alx8的全葉蛋白質(zhì)，將來自Col-0、C24、alX8和fryl-Ι的體內(nèi)全可溶葉蛋白質(zhì)提取物中的SALl蛋白質(zhì)粉豐度與5ng重組SALl蛋白質(zhì)比較(圖11B)。使用由Ponceau染色檢測的二磷酸核酮糖羧化酶的大亞基作為上樣對照(loadingcontrol)。分析每個基因型的兩株植物，并標(biāo)明蛋白質(zhì)標(biāo)記的分子量。圖12-從左至右為下述照片alx8突變體、fryl-Ι突變體、Col-O野生型、C24野生型和salk_020882突變體擬南芥植物，表示與對應(yīng)于C24野生型的葉形改變相比，salk_020882突變體和alx8突變體葉形的改變和fryl_l突變體葉形的改變相似。圖13-表示植物無水存活平均天數(shù)的條形圖。突變體salk_020882表現(xiàn)出最大的耐干旱性，平均存活18.4天，alx8突變體為16.3天，野生型為12.0天(樣品大小三株野生型和alx8植物和六株salk_020882植物)圖14-照片表示最下面一行_干旱測試；最上面一行_對照；從左至右野生型植物(11天，干旱脅迫植物即將死亡前)，salk_020882突變體和alx8突變體(兩種突變體在14天干旱處理后仍然存活)。圖15A和15B-圖15A顯示下述照片，從左至右為，在接觸干旱條件0、14、16和18天后(從上至下)，然后重新澆灌后三天的Col-O野生型、alX8、salk_020882、fryl-l和C24野生型植物。重新澆灌三天后，alx8和fryl-Ι突變植物表現(xiàn)出較強(qiáng)的恢復(fù)，包括葉片綠色并膨脹，同時野生型植物如果有任何恢復(fù)的跡象，也是表現(xiàn)為大多數(shù)葉子變黃和枯萎。所示植物是三次重復(fù)實(shí)驗的代表，實(shí)驗涉及每個基因型的五株植物。圖15B顯示干旱處理過程中的土壤水含量(SWC)。圖16A和16B-圖16A顯示葉片相對水含量(RWC)，并且圖16B顯示在非脅迫條件下和干旱12天后Col-O和alx8的葉片中的葉片水勢。柱為至少四株植物的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)。圖17-顯示下述照片2、3、5和8周齡Col-O野生型植物(上圖)和alx8植物(下圖)，表明alx8植物中存在發(fā)育延遲。還證明8周齡Col-O野生型植物正在開花(花籽為證)，同時alx8植物還沒有開花。圖18-A顯示Col-O野生型葉片和alx8葉片的葉片厚度的條形圖；B顯示典型的Col-O野生型葉片和alx8葉片的橫截面。圖19-表示早晨(上圖)和晚上(下圖)fryl_l、C24野生型、alx8和Col-O野生型植物葉片碘染色的結(jié)果，表明這些SALl突變體葉綠體中的淀粉含量顯著降低。圖20-SAL1突變體及其野生型的代謝物譜的主成份分析(PCA)。使用每個生態(tài)型的至少四株生物副本中的超過150個代謝物的豐度計算PCA。繪制出由主成份1和2(PCl和PC2)考查的總方差百分比。圖21-顯示大小、發(fā)育和形態(tài)對抗旱性的影響。㈧在相同發(fā)育階段(開始開花)時Col-0,alx8和salk_020882的抗旱性；顯示了27株alx8和5株fryl-Ι植物在干旱的第O天和第9天的代表圖像。植物每天生長12小時。(B)在發(fā)育的相同生長階段(成熟綠色)植物的抗旱性，alx8和fryl-Ι為四周齡，Col-O為八周齡。植物為每個生態(tài)型的五株生物副本的代表，生長條件為每天16小時。(C)測量(A)的盆重量，并繪制成初始重量的百分比；繪制了五個家系中每個的平均值+S.D.。(D)針對干旱活力，繪制在兩個單獨(dú)實(shí)驗中生長的一些30日齡Col-O植物的蓮座區(qū)域。生長條件為每天8小時。(E)分離的蓮座的脫水。數(shù)據(jù)為四個生物副本的平均值+SD。實(shí)驗重復(fù)三次。(F)在相同年齡的Col-O(每盆一株植物)和alx8(每盆兩株植物)進(jìn)行9天保水。生長條件為每天16小時。縮寫ABA-脫落酸IP3-I,4，5三磷酸肌醇I(1，4)P2-I，4二磷酸肌醇1(4,5)P2-4，5二磷酸肌醇PAP-3’多腺苷5’磷酸酯ROS-活性氧部分WT-野生型定義如本文所使用的，術(shù)語“包含”表示“主要包括，但不一定僅包括”。單詞“包含”的變化形式，具有相對應(yīng)的相似含義。如本文所使用的，術(shù)語“基因”，指位于基因組中的確定區(qū)域，并且可以包含負(fù)責(zé)控制表達(dá)，即編碼部分的轉(zhuǎn)錄和翻譯的控制性核苷酸序列?；蜻€可以包含其它5’和3’未翻譯序列和終止序列?？梢源嬖诘钠渌槔鐑?nèi)含子。如本文所使用的，在描述蛋白質(zhì)時，術(shù)語“同源”表示在不同部分基本具有相同功能和相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)，并且其在至少部分區(qū)域中，共享至少50%氨基酸同一性。這種同源蛋白質(zhì)可以在完整的氨基酸序列中共享至少約30%氨基酸同一性，至少約40%氨基酸同一性，至少約50%氨基酸同一性，至少約60%氨基酸同一性，至少約70%氨基酸同一性，至少約80%氨基酸同一性，至少約90%氨基酸同一性或至少約95%氨基酸同一性。相似地，核苷酸分子的同源性是編碼在不同部分基本具有相同功能和相似性質(zhì)的蛋白質(zhì)的核酸分子，其中所述編碼的蛋白質(zhì)在至少部分區(qū)域中，共享至少50%氨基酸同一性(這種核酸同源性由于基因編碼的簡并性和不同植物種屬之間優(yōu)選密碼子用途之間的差異而共享顯著少于50%的同一性)，可以在完整的氨基酸序列中共享至少約30%氨基酸同一性，至少約40%氨基酸同一性，至少約50%氨基酸同一性，至少約60%氨基酸同一性，至少約70%氨基酸同一性，至少約80%氨基酸同一性，至少約90%氨基酸同一性或至少約95%氨基酸同一性。如本文所使用的，術(shù)語“突變”表示相對于野生型多肽或核酸分子，多肽或核酸分子中的任何變化，由這種變化產(chǎn)生“突變體”，并且“突變體”可以例如包含單個或多個氨基酸或核苷酸變化，或者同時包含核苷酸和氨基酸變化，包括點(diǎn)突變、無效突變、移框突變，并且可以包含一個或多個核苷酸或氨基酸的缺失、插入或替代，其可以包含天然或非天然發(fā)生的核苷酸或氨基酸或其類似物?！昂怂帷?，如本文所表示的，指脫氧核糖核酸或核糖核酸及其單鏈、雙鏈或三重形式的聚合物。該術(shù)語可以包括包含天然核苷酸的類似物的核酸，所述天然核酸與參照核酸具有相似的結(jié)合活性。特定的核酸序列還可以包含其經(jīng)過保守修飾的變體(例如簡并密碼子替代物)和互補(bǔ)序列。術(shù)語“核酸”、“核酸序列”或“多核苷酸”也可以與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA交替使用。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以交替使用，指氨基酸殘基的聚合物。這些術(shù)語的范圍中包括聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基可以包含相應(yīng)天然發(fā)生的氨基酸的人工化學(xué)類似物，以及，或者替代天然發(fā)生的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”還可以包括包括修飾的聚合物，比如，但不限于，糖基化、脂質(zhì)吸附、硫酸化、谷氨酸殘基的、羧化作用、羥基化和ADP-核糖基化。術(shù)語SALl和FRYl如本文所使用的，可互換，術(shù)語SALl和FRYl亦然，這些術(shù)語指相同的蛋白質(zhì)和編碼核苷酸序列。具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于下述發(fā)現(xiàn)在SALl編碼基因中具有突變的植物對脅迫的耐受性提高，包括提高抗旱性。SALl蛋白質(zhì)是雙功能的，具有肌醇多磷酸酯1-磷酸酶活性和3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶活性，并且參與IP3的分解代謝，IP3是涉及壓力信號傳導(dǎo)的小分子。有多種肌醇磷酸酶或Ptase，其都從IP3分子上的不同位置剪切磷酸酯。這些不同的活性，除了全部導(dǎo)致IP3降低外，經(jīng)常產(chǎn)生不同表型，可能是由于水解產(chǎn)物的功能功能，比如I(1，4)P2和1(4，5)P2。表型差異還可能由于這些已經(jīng)被極大削弱的酶的第二種活性，比如SALl的核苷酸酶活性。此外，酶的定位和表達(dá)水平的差異可能影響表型。令人驚訝的是，SALl對IP3的體外活性相對較低(特別是和它的核苷酸酶比較)。已經(jīng)分離了SALl中的多個突變體，并稱為fryl突變體(fieryl；Ishitani,M.,L.M.Xiong等(1997),"GeneticahalysisofosmoticandcoldstresssignaltransductioninArabidopsisInteractionsandconvergenceofabscisicacid-dependentandabscisicacid-independentpathwaysPlantCell9(11)1935-1949；Xiong,L.Μ.,B.H.Lee^(2001),"FIERY1encodinganinositolphlyphosphate1-phosphataseisanegativeregulatorofabscisicacidandstresssignalinginArabidopsis，，，Genes&Development15(15):1971-1984)或hos2突變體("highexpressionofosmoticstressregulatedgeneexpression2，，；Lee,H.,L.Xiong等(1999),‘‘Cold-regulatedgeneexpressionandfreezingtoleranceinanArabidopsisthalianamutant，，，ThePlantJournal17(3)301-308；Xiong,L.,H.Lee,等(2004),‘‘AsingleaminoacidsubstitutionintheArabidopsisFIERYl/H0S2proteinconferscoldsignalingspecificityandlithiumtolerance",ThePlantJournal40=536-545)。如先前所報道的，在選擇脅迫響應(yīng)基因RD29A的表達(dá)變化中分離這些突變體。在正常條件下fry1-1突變體的RD29A表達(dá)增加，在低溫、鹽和滲透脅迫和ABA處理后也是如此。據(jù)報道這是由于點(diǎn)突變產(chǎn)生SALl蛋白質(zhì)(At5g63980)的第六個外顯子中的終止密碼子，產(chǎn)生截短型蛋白質(zhì)，其不包含保守的α-螺旋，α-螺旋包含WD-X11-GG基序，是金屬離子和磷酸鹽的協(xié)調(diào)以及親核水活化所需的。結(jié)果是蛋白質(zhì)對IP3或PAP無活性。據(jù)報道fryl-Ι突變體對鹽、低溫和滲透壓的脅迫敏感性增加(Xiong等，2001)。脅迫響應(yīng)基因表達(dá)，比如HSP70(Atlgl6030)、C0R15A(At2g42540),KINl(At5gl5960)和ADH(Atlg77120)，與野生型相比，在對脅迫響應(yīng)時在突變體中也增加(Xiong等，2001)，使人們相信SALl作為壓力脅迫途徑的負(fù)調(diào)節(jié)子。也報道了其它fryl突變體，fryl-2和fryl_3，，是具有相似性質(zhì)的無效突變(Xiong等，2001)。hos2-l突變體是溫度敏感突變體，其中脅迫響應(yīng)基因表達(dá)在低溫改變，并且是低溫脅迫敏感型(Xiong等，2004)。與野生型植物相比，這個突變體的基因表達(dá)在正常條件下或通過滲透或ABA脅迫不會改變(Lee等，1999)。在fryl或hos2突變體中未報道干旱、鹽、光、冷或熱耐受性。本發(fā)明人先前在正常條件和高光脅迫后篩選抗氧化酶抗壞血酸過氧化物酶2(APX2)誘導(dǎo)變化的突變體中，已經(jīng)分離了擬南芥突變體，alx8。在兩種條件下alx8突變體的APX2表達(dá)均增加，并且葉形變化，抗旱性增加(Rossel,J.B.，P.B.Walter等.(2006),"AmutationaffectingASC0RBATEPER0XIDASE2geneexpressionrevealsalinkbetweenresponsestohighlightanddroughttolerance",Plant,CellandEnvironment29(2)=269-281)發(fā)現(xiàn)這些性質(zhì)共分離(co-segregating)，表明它們是單點(diǎn)突變的結(jié)果。還發(fā)現(xiàn)alx8改變了多個脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，表明參與擬南芥中干旱脅迫響應(yīng)信號傳導(dǎo)的多個途徑的差異調(diào)節(jié)。然而，這個突變體的本質(zhì)至今為止尚未確定。在突變體的定位克隆后，發(fā)現(xiàn)突變位于先前鑒別的SALl基因中。對這個基因的無效突變體fry1-1的研究，現(xiàn)在表明還增加了抗旱性。另一個擬南芥突變體，命名為salk_020882，其在SALl基因中包含約IOkbT-DNA插入，對其已經(jīng)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)相對于野生型植物增加了抗旱性。因此，通過修飾這個基因的表達(dá)可能改善農(nóng)業(yè)上具有重要意義的植物品種的抗旱性。因此，本發(fā)明提供用于獲得相對于野生型植物的脅迫抗性提高的植物，包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組中，使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對于野生型植物的脅迫抗性提高的一個或多個植物。根據(jù)實(shí)施方式，方法包括向SALl基因或其同源物導(dǎo)入至少一個突變，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表達(dá)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何合適的方法，將導(dǎo)致一個或多個植物細(xì)胞與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低的突變導(dǎo)入所述一個或多個植物細(xì)胞中，例如，合適的方法可以包括使一個或多個植物細(xì)胞(其可以是植物種子細(xì)胞，或植物部位的細(xì)胞，以及分離的植物細(xì)胞)接觸化學(xué)或物理突變手段，或插入突變手段如轉(zhuǎn)座子、還原轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)錄病毒或T-DNA。合適的用于將突變導(dǎo)入植物基因組的材料和方法也在例如國際專利公開W098/26082,"ArabidopsisProtocoIs，，(2ndEdition,Salinas,J.禾口Sanchez—Serrano，J.，eds,MethodsinMolecularBiology323(2006),HumanaPress)，禾口“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel等(eds)，JohnWiley&Sons(2000))中描述，其通過引用并入本文。還通過用野生型植物與包含突變的植物(如先前通過基因篩選和/或分析所確定的-包含期望突變的植物可以已經(jīng)存在于提供的植物種質(zhì)/培養(yǎng)物/種子收集物/變體中)雜交而將突變導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞，并且植物可以由得到的種子產(chǎn)生，然后篩選突變繼承。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，將突變導(dǎo)入所述一個或多個植物細(xì)胞中編碼SALl的核苷酸序列或其同源物，并且突變可以包括編碼SALl的核苷酸序列或其同源物中一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。在一個實(shí)施方式中，突變是SALl無效突變。或者，突變可以產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物，然而其與SALl或其同源物有關(guān)的活性至少降低。在本研究過程中鑒別的SALl突變導(dǎo)致相對于野生型植物，包括fryl-1、alx8和salk_02882突變體，擬南芥植物的抗旱性至少提高。fryl-Ι突變導(dǎo)致從色氨酸到終止密碼子的第341個氨基酸的變化，產(chǎn)生缺失α5螺旋的截短型蛋白質(zhì)，所述螺旋是酶活性所需要的(At5g63980)。alx8突變體具有點(diǎn)突變，包括在At5g63980.1基因組序列中第1226個堿基對上鳥嘌呤到腺嘌呤的變化(TAIR序列4010730406(2007年4月17日)，登錄號NM_125794.4:SEQIDNO1的1226位置)。alx8突變體表達(dá)突變的SALl蛋白質(zhì)，包含氨基酸序列的第217個氨基酸上甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸變化(TAIR序列4010745380(2007年8月16日)，登錄號NP_201203.2:SEQIDNO:2)，并且salk_02882突變體在SEQIDNO1的位置734和735之間包含約IOkbT-DNA插入或替代SEQIDNO1的核苷酸735至745。期望具有更高脅迫抗性的其它突變體，包括抗旱性更高的突變體，是fryl-2、fryl-3和hos2突變體。fryl_2突變體包括在At5g63980.1基因組序列中第736個堿基對上鳥嘌呤到腺嘌呤的變化(TAIR序列4010730406，登錄號:NM_125794.4=SEQIDNO:1的736位置)，導(dǎo)致位置126(SEQIDNO2)的谷氨酸殘基替代成賴氨酸，產(chǎn)生無活性蛋白質(zhì)。fryl-3突變體在At5g63980.1基因組序列中第1518個堿基對上第五個和第六個外顯子之間包含6.7kbT-DNA插入(TAIR序列4010730406，登錄號NM_125794.4=SEQIDNO1的1518位置)，導(dǎo)致沒有RNA轉(zhuǎn)錄本。hos2-l突變體在At5g63980.1基因組序列中第731個堿基對上包含胞嘧啶到胸腺嘧啶的突變(TAIR序列:4010730406，登錄號:NM_125794.4=SEQIDNO1的731位置)，導(dǎo)致位置124(SEQIDNO2)的丙氨酸殘基由纈氨酸替代，產(chǎn)生具有溫度敏感活性的表達(dá)蛋白質(zhì)。根據(jù)本文提供的教導(dǎo)，僅通過常規(guī)實(shí)驗，可以獲得或產(chǎn)生SALl的其它突變體，或其同源物，并且，例如，這種核苷酸序列(和編碼蛋白質(zhì))表現(xiàn)出高保守程度-參見，例如，圖5和6。本發(fā)明的方法能應(yīng)用本領(lǐng)域已知的任何誘變劑(使用本領(lǐng)域同樣已知的方法)，包括，但不限于紫外光、X-射線輻射、Y輻射或快中子突變、N-乙基-N-亞硝基脲(ENU)、甲基亞硝基脲(MNU)、甲芐胼(PRC)、三乙撐蜜胺(TEM)、丙烯酰胺單體(AA)、苯丁酸氮芥(CHL)、美法侖(MLP)、環(huán)磷酰胺(CPP)、二乙基磺酸(DES)、乙基甲磺酸(EMS)、甲基甲磺酸0MS)、6_巰基嘌呤(6-MP)、絲裂霉素C(MMC)、N-甲基-N，-亞硝基-N-亞硝基胍(MNNG)、3H2O和尿烷(UR)。接觸一種或多種誘變劑的基因修飾率可以通過改變處理劑量和/或重復(fù)次數(shù)而調(diào)節(jié)，并且能為具體應(yīng)用定制。在一個實(shí)施方式中，處理劑量和方案基本不誘導(dǎo)對于一個或多個細(xì)胞的細(xì)胞毒性。SALl或其同源物中的突變，可以檢測，然后(在后面幾代中)通過使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，用已知的SALlDNA序列，和根據(jù)編碼SALl或其同源物的基因或核苷酸序列的合適探針或引物檢測。如果突變在SALl以外的基因中，在植物傳代中跟蹤/追蹤之前需要鑒別、定位和/或識別突變。用于鑒別、定位和識別未知突變的合適方法對于本領(lǐng)域人員已知，并且在很多公知的標(biāo)準(zhǔn)文本中描述，比如Sambrook，J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.和Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，，3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,和本文弓|用的文獻(xiàn)，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。還參見Rossel，J.B.，Cuttriss,Α.禾口Pogson,BlJ."IdentifyingPhotoprotectionMutantsinArabidopsisthaliana"inMethodsinMolecularBiology274287-299(Carpentier,R.Ed,HumanaPress)。鑒別突變等位基因的更新的方法包括“Tilling”和高分辨熔融(HRM)。ILLING(基因組中的靶向誘導(dǎo)局部損傷)是分子生物學(xué)中的方法，允許特定基因中突變的定向鑒別。方法將標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如，用化學(xué)誘變劑如乙基甲磺酸(EMS)誘變)與可以鑒別靶基因中單堿基突變(也稱作點(diǎn)突變)的敏感的DNA篩選技術(shù)相結(jié)合。第一篇描述擬南芥中TILLING的論文(McCallumCM,ComaiL,GreeneEA,HenikoffS,"Targetedscreeningforinducedmutations，，，NatBiotechnol.(2000)Apr；18(4):455_7,通過交叉引用并入本文)使用dHPLCHPLC鑒別突變。所述方法通過使用限制性酶Cel-I結(jié)合基于凝膠的系統(tǒng)鑒別突變而獲得更高的通量(ColbertΤ,TillBJ,TompaR，ReynoldsS，SteineMN,YeungAT,McCallumCM,ComaiL,HenikoffS,"High-throughputscreeningforinducedpointmutations，，，PlantPhysiol.(2001)Jun；126(2):480_4，也通過交叉引用并入本文)。其它突變檢測，比如重測序DNA，已經(jīng)與TILLING結(jié)合。已經(jīng)使用TILLING作為其它生物體如斑馬魚、玉米、小麥、稻米、大豆、馬鈴薯和萵筍中的反向基因方法。還參見McCallumCM，ComaiL，GreeneEA,HenikoffS.“Targetinginducedlocallesionsingenomes(TILLING)forplantfunctionalgenomics，，PlantPhysiol.(2000)Jun；123(2)439-42；ColbertT，TillBJ，TompaRiReynoldsSiSteineMN，YeungATjMcCallumCM，ComaiL，HenikoffS.High-throughputscreeningforinducedpointmutations”，PlantPhysiol.(2001)Jun；126(2)480-4；DraperBff,McCalIumCM,StoutJL,SladeAJ,MoensCB,"Ahigh-throughputmethodforidentifyingN-ethyl-N-nitrosourea(ENU)-inducedpointmutationsinzebrafish，，，MethodaCellBiol.(2004)；77:91_112；禾口SladeAJ,FuerstenbergSi,LoefflerD,SteineMN,FacciottiD,"Areversegenetic,nontransgenicapproachtowheatcropimprovementbyTILLING，，，NatBiotechnol.(2005)Jan；23(1):75_81，也通過交叉引用并入本文。HRM(高分辨熔融)是近來的進(jìn)展，其能通過利用高分辨熔融設(shè)備最近的進(jìn)展和雙鏈特異性DNA(dsDNA)結(jié)合染料的進(jìn)展的優(yōu)勢，極大地擴(kuò)展傳統(tǒng)DNA熔融分析的用途，其中所述染料能以足夠高的濃度使用，使PCR過程中產(chǎn)生的所有雙鏈位點(diǎn)飽和(參見http//www,corbettlifescience.com/control,cfm？page=Introduction4&bhcp=1)，以及DufresneSD，BelloniDR，WellsWA,TsongalisGJ,"BRCAlandBRCA2MutationScreeningusingSmartCyclerIIhigh-resolutionmeltcurveanalysis”，ArchPatholLabMed(2006)130185-187；GrahamR，LiewM,MeadowsC,LyonE,WittwerCT，"DistinguishingdifferentDNAheterozygotesbyhighresolutionmelting，，，ClinicalChemistry(2005)511295-1298；HermannMG,DurtschlJD,BromleyK，WittwerCT,VoelkerdingKV,"AmpIiconDNAmeltinganalysisformutationscanningandgenotypingcross-platformcomparisonofinstrumentsanddyes，，，ClinicalChemistry(2006)52494-503；LiewM，PryorR，PalaisR,MeadowsC，EraliM，LyonE，WittwerC，“GenotypingofsinglenucleotidepolymorphismsbyhighresolutionmeltingofsmallampIicons",ClinicalChemistry(2004)501156-1164；MargrafRL,MaoR，HighsmithWE,HoltegaardLM,WittwerCT，“MutationScanningoftheRETprotooncogeneusinghighresolutionmeltinganalysis，，，ClinicalChemistry(2006)52138-141；NGRL(Wessex)ReferenceReagentReportJanuary2006，“Plasmidbasedgenericmutationdetectionreferencereagents；productionandperformanceindicatorfieldtrial，，(www.nRrl.orR.uk/ffessex/downloads,htm)；NGRL(Wessex)ReferenceReagentReportJanuary2006，"ProductionandfieldtrialevaluationofreferencereagentsformutationscreeningofBRCAl，BRCA2，hMLHlandMHS2”(www.nRrl.orR.uk/ffessex/downloads.htm)；NGRL(Wessex)ReferenceReagentReportJanuary2006，"MutationScanningbyHighResolutionMelts-EvaluationofRotor-Gene6000(CorbettLifeScience)，HR-1and384wellLightScanner(IdahoTechnology)”(www.nRrl.orR.uk/ffessex/downloads,htm)；ReedGH,WittwerCT，"Sensitivityandspecificityofsingle-nucleotidepolymorphismscanningbyhighresolutionmeltinganalysis，，，ClinicalChemistry(2004)501748-1754；Willmore-PayneC，HoldenJA,TrippS，LayfieldLJ,"HumanmalignantmelanomadetectionofBRAF—andc-kit-activatingmutationsbyhigh-resolutionampliconmeltinganalysis”，HumanPathology(2005)36486-493；WittwerCT，ReedGH,GundryCN,VandersteenJG,PryorRJ,“High-resolutiongenotypingbyampliconmeltinganalysisusingLCGreen，，ClinicalChemiatry(2003)49:853_860；WormJ，AggerholmA，GuldbergP，“In_tubeDNAmethylationprofilingbyfluorescencemeltingcurveanalysis”ClinicalChemistry(2001)471183-1189；ZhouL,MyersAN,VandersteenJG,WangL,WittwerCT,"Closed-tubegenotypingwithunlabeledoligonucleotideprobesandasaturatingDNAdye，，ClinicalChemistry(2004)501328-1335；禾口ZhouL,WangL,PalaisR,PryorR,WittwerCT,"High-resolutionDNAmeltinganalysisforsimultaneousmutationscanningandgenotypinginsolution，，ClinicalChemistry(2005)51:1770-1777?？梢栽O(shè)計寡核苷酸引物或用其它技術(shù)選擇SALl基因或其同源物中突變/插入的家系。通過培養(yǎng)，然后開發(fā)植物家系，其中SALl基因或其同源物的突變拷貝同源。為此可以設(shè)計PCR引物，使大部分SALl基因(或其同源物)的編碼序列使用來自待檢測種屬的SALl基因或其同源物的序列特異性擴(kuò)增(參見，例如，Baumann等(1998)，"SuccessfulPCR-basedreversegeneticscreensusinganEn-l-mutagenisedArabidopsisthalianapopulationgeneratedviasingle-seeddescent，，，Theor.Appl.Genet.97:729_734)?？梢詮耐蛔凅w群落或現(xiàn)有種質(zhì)，使用按照本發(fā)明表征的不同基因型(比如抗旱性、SALl相關(guān)活性降低，或與野生型植物相比基因表達(dá)的變化)，分離其它SALl-類突變體。在合適的生長時期并施加合適的非生物脅迫如保水后，可以選擇SALl突變體的基因型。然后由SALl基因或其同源物中的突變引起的基因型可以通過本領(lǐng)域公知的分子手段構(gòu)建。SALl-類突變體，包括等位基因雜合的突變體，并且其可以表達(dá)脅迫抗性基因型，也可以如后所述篩選，并且篩選用于培養(yǎng)過程將突變滲入同源系的突變體或為產(chǎn)生突變體植物而在重組技術(shù)中分離并使用的突變體基因。本發(fā)明的突變體可以通過隨機(jī)誘變產(chǎn)生(或者已經(jīng)存在)，任何植物都可以重組改造，使其表現(xiàn)出相似的基因型，例如一旦確定了突變?nèi)缤蛔兊腟ALl基因的基因基礎(chǔ)。對于植物轉(zhuǎn)化和再生的常規(guī)描述可參見，例如，Walbot等(1983)in"GeneticEngineeringofPlants，，,Kosug等(eds)PlenumPublishingCorporation,1983禾口‘‘PlantCell,TissueandOrganCulture:FundamentalMethods，，,Gambor禾口Phillips(Eds.),Springer-Verlag,Berlin(1995)ο還可參見SambrookJ.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),SambrookJ.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻(xiàn)，禾口Ausubel的(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。例如，本發(fā)明的方法包含向所述一個或多個植物細(xì)胞插入外源性核酸，所述核酸抑制內(nèi)源SALl或其同源物的活性的表達(dá)(例如，通過調(diào)節(jié)區(qū)域，其調(diào)控SALl或其同源物、SALl-編碼序列或其同源物，或由SALl-編碼序列或其同源物翻譯的mRNA的表達(dá))，或者用外源蛋白質(zhì)的表達(dá)替代內(nèi)源SALl或其同源物的表達(dá)。外源蛋白質(zhì)可以是外源的突變SALl或其同源物，或者任何合適的蛋白質(zhì)，比如提供可篩選基因型的蛋白質(zhì)。在一個實(shí)施方式中，外源性核酸可以包含寡核苷酸或多核苷酸，其向編碼SALl或其同源物的內(nèi)源核苷酸序列中，通過同源重組導(dǎo)入包含單個或多個核苷酸插入、缺失或替代的突變?？梢酝ㄟ^用導(dǎo)入的靶向核苷酸序列與靶突變位點(diǎn)重組而導(dǎo)入單個或多個核苷酸插入、缺失或替代。例如，這樣的導(dǎo)入核苷酸序列可以包含待導(dǎo)入的核苷酸序列，其任一側(cè)為與靶序列同源的連續(xù)序列所側(cè)翼包圍，或者其位于期望的突變插入位點(diǎn)任一側(cè)。按照本發(fā)明的方法，待導(dǎo)入基因組的核苷酸序列還可以包括與期望的調(diào)節(jié)域可操作連接的選擇性標(biāo)記(其可以包括，例如，脅迫誘導(dǎo)啟動子)。與靶序列同源的核苷酸序列可以與靶序列同基因，從而提高同源重組的效率。還可以使用并非嚴(yán)格與靶序列同基因的同源核苷酸序列。盡管同源核苷酸序列和靶序列之間的錯配能降低同源重組效率，但是不嚴(yán)格要求同基因，基本同源即足夠。就本發(fā)明而言，同源序列和靶序列之間同源水平可以是至少約90%同一性，至少約95%同一性，至少約99%同一性或100%同一性。靶核苷酸序列可以包含于載體中。代表性載體包括質(zhì)粒、粘粒和病毒載體。載體還可以包含包括表達(dá)調(diào)控元件的核酸，比如轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控信號、復(fù)制起點(diǎn)、多腺苷化信號、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、啟動子、增強(qiáng)子等，其中調(diào)控元件與編碼基因產(chǎn)物的核苷酸可操作地相關(guān)。這些和其它常用載體元件的篩選是常規(guī)的，并且很多這樣的序列源自商業(yè)提供載體。參見，例如，Sambrook,J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻(xiàn)禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的方法，將靶向載體導(dǎo)入靶向細(xì)胞，包括但不限于微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的傳遞、病毒感染、原生質(zhì)體融合和顆粒介導(dǎo)的攝入。可選地，用重組酶例如recA，將靶向DNA共施用與靶細(xì)胞，從而增強(qiáng)同源重組的效率。必要時，靶細(xì)胞可以已經(jīng)包含，或已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化而包含合適的靶序列。例如，可以如美國專利6，255，113所述將重組酶蛋白質(zhì)載于靶向DNA上。為了增強(qiáng)載入過程，靶向DNA可以包含一個或多個同源核酸序列。靶向DNA還可以通過將靶向多核苷酸與重組酶一起孵育而包被重組酶蛋白質(zhì)，其中重組酶與多核苷酸是非共價結(jié)合。參見，例如，A.Vergunst等(1998)，NucleicAcidsRes.262729和A.Vergunst和P.Hooykaas(1998)，PlantMolec.Biol.38:393-406，國際專利公開WO99/25821，WO99/25840，WO99/25855，和WO99/25854和美國專利5，780，296，6，255，113，和6，686，515。根據(jù)進(jìn)行本發(fā)明方法的另一個實(shí)施方式，可以通過由RNA干擾(RNAi)、反義或翻譯后基因沉默技術(shù)抑制SALlmRNA(或其同源物)的翻譯而產(chǎn)生相對于野生型植物的脅迫抗性提高的植物?？梢允褂脕碜晕锓N的靶向下調(diào)SALl基因或其同源物，或其片段，調(diào)控編碼蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。為此可使用全長反義分子。或者，可以使用雙鏈寡核苷酸、正義和/或反義寡核苷酸，或它們的組合靶向SALl編碼RNA特定區(qū)域。使用寡核苷酸分子降低預(yù)定基因的表達(dá)水平在本領(lǐng)域中已知(參見，例如，Hamilton，A.J.和Baulcombe，D.C.(1999)，"AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants",Science286950-952；WaterhouseP.Μ.等(1998),"VirusresistanceandgenesilencinginplantscanbeinducedbysimultaneousexpressionofsenseandantisenseRNA”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513959-13964；和國際專禾丨」公開WO99/53050，WO99/49029，WO99/32619)?？梢酝ㄟ^用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而原位提供寡核苷酸分子，其一旦轉(zhuǎn)錄，可產(chǎn)生雙鏈和/或反義RNA序列，所述序列可以是全長或部分序列?；虺聊夹g(shù)可以通過過量產(chǎn)生正義和/或反義序列(可以是全長或部分)而增強(qiáng)，從而產(chǎn)生大量dsRNA?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)植物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生具有上述轉(zhuǎn)基因之一的轉(zhuǎn)基因植物，例如，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體的陽離子或聚乙二醇處理、電穿孔、微粒轟擊、用包被轉(zhuǎn)化DNA的微球或微粒攪拌溶液中的細(xì)胞懸浮液、直接DNA攝入、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝入等，如很多公開文本中所述，比如“MethodSforPlantMolecularBiology，，(ffeissbach&Weissbach,eds.,1988)；Clough,S.J.禾口Bent,A.F.(1998)"Floradip-.asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana"PlantJ.16,735-743；"MethodsinPlantMolecularBiology，，(Schuler&Zielinski,eds.,1989)；"PlantMolecularBiologyManual，，(Gelvin,Schilperoort,Verma,eds.,1993)；和”MethodsinPlantMolecularBiology-ΑLaboratoryManual，，(Maliga,Klessig,Cashmore,Gruissem&Varuer,eds.，1994)。還參見Sambrook,J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),SambrookJ.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻(xiàn)禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonS(2000)，這些文獻(xiàn)通過交叉弓I用并入本文。轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法依賴于待轉(zhuǎn)化的植物。經(jīng)常使用農(nóng)桿菌載體轉(zhuǎn)化雙子葉物種。對于單子葉物種的轉(zhuǎn)化，經(jīng)常使用基因槍轟炸包被轉(zhuǎn)化DNA的顆粒和包被轉(zhuǎn)化DNA的硅纖維，用于核轉(zhuǎn)化。然而，現(xiàn)在已知農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化單子葉植物包括小麥的方法(參見，例如，國際專利公開WO97/48814；還參見Hiei，Y等(1994),PlantJ.6(2):271_282和國際專利公開WO92/06205)。用于轉(zhuǎn)化選擇的植物的DNA構(gòu)建體可以包含與合適的5’調(diào)節(jié)序列(例如，啟動子和翻譯調(diào)節(jié)序列)和3’調(diào)節(jié)序列(例如，終止子)可操作連接的目的編碼序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼域位于有效的組成型啟動子之下，比如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子或玄參花葉病毒35S啟動子。期望用于本發(fā)明的其它組成型啟動子包括，但不限于T-DNA甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶(NOS)和章魚堿合成酶(OCS)啟動子。在本發(fā)明的范圍中也期望在誘導(dǎo)型啟動子下表達(dá)正義或反義SALl-編碼序列的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明特別期望脅迫誘導(dǎo)型啟動子，比如高光、干旱、鹽度或溫度誘導(dǎo)型啟動子。根據(jù)本發(fā)明可以使用的啟動子包括，例如，用于在光合作用組織中表達(dá)的二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)小亞基基因啟動子或葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)(CAB)基因啟動子；用于在種子中表達(dá)的各種種子儲存蛋白質(zhì)基因啟動子；或者用于在轉(zhuǎn)化植物的根系統(tǒng)中表達(dá)的根_特異性谷氨酰胺合成酶基因啟動子。編碼域還與合適的3’調(diào)節(jié)序列可操作地連接。例如，可以使用胭脂氨酸合成酶(NOS)多腺苷化域或章魚堿合成酶(OCS)多腺苷化域。使用農(nóng)桿菌二元載體系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在如上所述的組成型或誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下的選擇的編碼域，可以與核藥物抗性標(biāo)記連接，比如卡那霉素抗性。其它選擇性標(biāo)記系統(tǒng)包括，但不限于攜帶抗生素抗性(例如，對潮霉素或雙丙氨磷抗性)或殺蟲劑抗性(例如，對磺酰脲、草丁膦或草甘膦的抗性)的其它基因?？梢允褂帽景l(fā)明的方法轉(zhuǎn)化任何植物細(xì)胞。用這種方式，可以獲得基因修飾的植物、植物細(xì)胞、植物組織、種子等。根據(jù)一個實(shí)施方式，待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以選自經(jīng)濟(jì)和/或農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)上重要的植物家族，包括傘形科(Apiaceae)、紫菀科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、薬禾斗(Chenopodiaceae)/覽禾斗(Amaranthaceae)、菊禾斗(Compositae)、葫聲禾斗(Cucurbitaceae)、蝶形花禾斗(Fabaceae)、禾本禾斗(Gramineae)、豆禾斗(Leguminosae)、早熟禾禾斗(Poaceae)、薔薇禾斗(Rosaceae)或爺禾斗(Solanaceae)0已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法在植物中生長(參見，例如，McCormick,S.等(1986)，PlantCellReports5:81-84)。得到的植物可以使自花授粉，用同樣的轉(zhuǎn)化株或不同轉(zhuǎn)化株或混合株授粉，并且鑒別與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低或失活的植物?？梢陨L兩代或多代，確保這種基因型特性能穩(wěn)定保持?；蛘撸谏L繁殖的作物中，通過剪切或通過組織培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生相同的植物，可以繁殖成熟突變體/轉(zhuǎn)基因植物。可以進(jìn)行突變體/轉(zhuǎn)基因植物的選擇，并且可以獲得并繁殖新品種用于商業(yè)用途?？梢愿鶕?jù)缺少SALl蛋白質(zhì)或其同源物或其活性，或通過增加脅迫(比如干旱)抗性，使用特異性寡核苷酸探針和/或靶基因的擴(kuò)增，篩選通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化/突變的植物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，得到的植物相對于野生型植物，對干旱、溫度脅迫、光脅迫或任何其它非生物或生物脅迫，或它們的任何組合的抗性提高。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，得到的植物至少相對于野生型植物的抗旱性提高。在本研究的過程中，還發(fā)現(xiàn)影響植物中SALl活性的突變可以以特有的方式影響開花時間，以及葉形，并且與野生型相比，顯著影響突變植物的代謝。具體地，研究的所有SALl突變體中的開花時間都顯著延遲，研究的植物延遲約4-5周(從而使開花時間延遲約100%)。依賴于引起開花時間延遲的突變或內(nèi)源核酸，和突變或外源性核酸導(dǎo)入的植物，可以期望開花時間延遲不同時間，例如開花時間可以延遲從約7天至約100天，比如約14天至約80天，約21天至約60天，約25天至約50天，約30天至約40天，約10天，約20天，約25天，約30天，約35天，約40天，約45天，約50天，約60他，約80天或約100天。SALl活性改變，其包括但不限于過表達(dá)，也可以以近似的時間推遲開花時間。葉形也受到顯著影響，導(dǎo)致葉片厚度比野生型植物厚，并且還更短、更圓，淺裂葉緣更多。觀察到的葉片表面有起伏，并且葉柄長度減小，使葉蓮座變成卷心菜樣外觀。葉片表明的起伏增加能增加邊界層效應(yīng)，減少蒸發(fā)。代謝組學(xué)分析表明，兩種突變體都表現(xiàn)出相似的明顯代謝重建，包括暗示脅迫抗性的多胺、腐胺的水平增加，和很多未知的可能的滲透保護(hù)劑糖衍生物的積累。還提供由本發(fā)明的方法獲得的植物部位，包括但不限于獲得自植物的葉、莖、根、塊莖、花、果實(shí)和種子。檢測SALl或其同源物中突變的方法篩選存在編碼SALl或其同源序列至少一個突變等位基因的植物，可以包含使用至少一個適合作為探針或引物的核酸分子分析植物的DNA，所述探針或引物能與SALl基因或其同源物在嚴(yán)緊條件下雜交。在更具體的方法中，篩選方法可以包括使用至少一個適合擴(kuò)增SALl基因或其同源物的寡核苷酸引物對，其中包含正向引物和反向引物，檢測在所述區(qū)域中是否存在突變。區(qū)域可以包括完整的SALl基因或其同源物，或者可以僅包括其中部分，比如，例如(并參照圖10)，包含下述的核苷酸區(qū)域外顯子3，外顯子3和4之間的內(nèi)含子，外顯子5，外顯子5和6之間的內(nèi)含子，外顯子6，和外顯子6和7之間的內(nèi)含子，或它們的任何組合。來自待評價客體的DNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的很多合適的方法提取，比如很多公知文本所述，包括(但不限于)Sambrook，J.等，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloningALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻(xiàn)，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)，其通過交叉引用并入本文。還參見Lukowitz，W.，Gillmor，C.S.和Scheble，ff-R.(2000)"PositionalCloninginArabidopsis:ffhyItFeelsGoodtoHaveaGenomeInitiativefforkingforYou"PlantPhyiology123，795-805中所述方法，和其中引用的文獻(xiàn)。一旦已分離合適的DNA，可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法分析是否存在突變，并且使用何種方法/策略依賴于期望的特異性，和是否可用合適的序列和/或酶進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析。合適的方法可以涉及在突變特異性探針和至少部分SALl基因或其同源物之間標(biāo)記的雜交產(chǎn)物，或者更通常地，通過使用引物和合適的探針，或使用用于SALl基因或其同源物的特異性部分?jǐn)U增的一對引物(正向和反向引物)擴(kuò)增至少部分SALl基因或其同源物，然后進(jìn)行擴(kuò)增DNA的直接部分和/或完全測序，或其RFLP分析。用于擴(kuò)增SALl基因的部分的合適引物對提供于表1中(還參見圖10)-可以根據(jù)SEQIDNO:1設(shè)計其它合適的引物或引物對用于分析SALl基因或其同源物，所述序列以At5g63980(TAIR序列4010730406，登錄號NM_125794.4)或其同源物(參見，例如，圖6B)提供。用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)中的方法和試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。合適的規(guī)程和試劑在很大程度上依賴于個體環(huán)境。可以從多種來源獲得指南，比如例如Sambrook，J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文獻(xiàn)，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)，其通過交叉引用并入本文。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易理解的是，可以改變PCR反應(yīng)的各種參數(shù)而不影響擴(kuò)增期望產(chǎn)物的能力。例如Mg2+濃度和使用的溫度可以改變。類似地，用作模板的基因組DNA的量還可以依賴于提供的DNA的量而改變。分析擴(kuò)增的DNA以確定是否存在突變的其它方法為本領(lǐng)域中技術(shù)人員所公知。例如，在用合適的限制性酶消化擴(kuò)增的DNA以檢測SALl基因或其同源物中的突變后，可以通過多種合適的方法包括電泳分析DNA。特別是瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的技術(shù)，用來根據(jù)大小分離DNA片段。凝膠中瓊脂糖或聚丙烯酰胺的濃度在很大程度上決定了凝膠的解析能力，并且因此瓊脂糖或聚丙烯酰胺的合適的濃度將依賴于待識別的DNA片段的大小。SALl基因或其同源物中突變存在的檢測和/或確定可以使用任何合適的軟件由計算機(jī)分析輔助進(jìn)行。合適的用于比較已確定核苷酸序列的軟件包在本領(lǐng)域中公知，并且容易獲得?，F(xiàn)在描述本發(fā)明的優(yōu)選形式，僅通過實(shí)施例的方式，參照下述實(shí)施例，包括可比數(shù)據(jù)，并且其不應(yīng)視為以任何方式對本發(fā)明的范圍或精神的限制。實(shí)施例實(shí)施例I-材料與方法植物和生長條件用甲磺酸乙酯(EMS)誘變已經(jīng)用APX2啟動子-熒光素酶報告子基因(APX2=LUC)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的擬南芥種子(Karpinski,S.等(1999)，Science284:654_657)，并且從源自500M1親本的植物池中篩選M2植物(參見Ball，L.等(2004)，PlantCell16:2448-2462)。如Rossel，J.B.等(2004),MethodsinMolecularBiology274:287_300所述，使用發(fā)光計數(shù)器為96孔微孔板中每株幼苗發(fā)射的光子計數(shù)，進(jìn)行突變體篩選。為了確認(rèn)改變的APX2表達(dá)的重復(fù)性，使用冷卻CCD照相機(jī)(ModelDV435，AndorTechnology，Tokyo，Japan)，將包含APX2=LUC的四周齡擬南芥植物成像。在成像前，用包含幾滴Tween80的ImMD-熒光素(BI0SYNTH,Staad,Switzerland)溶液噴灑植物，并保持生長光條件5分鐘。使用Image-Pro軟件(MediaCybernetics；Carlsbad,CA,USA)分析用CCD照相機(jī)獲得的圖像。鑒別了幾株APX2:LUC表達(dá)改變的突變體，包括突變體alx8，其中APX2:LUC表達(dá)增加，并且還表現(xiàn)出抗旱性提高，以及葉形改變。對于fryl-Ι無效突變的種子保存液，由擬南芥生物資源中心(Columbus，Ohio)獲得salk020882插入突變體和野生型(WT)哥倫比亞植物。此處的WT所有參照請參照哥倫比亞生態(tài)型；salkl和salk2指來自salk_020882家系種子保存液的T3代的兩株相同植物。fryl-Ι突變是在C24野生型背景中發(fā)生的，并且是第三次逆代雜交。對于在土壤中的生長，在早期實(shí)驗中，將一些擬南芥種子灑在盆(4CmX4CmX6Cm)中的無菌土壤(1份蛭石對4份土壤)上，并且在后期實(shí)驗中，植物在metromix土壤(35%加拿大泥煤苔，19%珍珠巖500，40%蛭石，1.5gL—1石灰)上生長。在4°C，黑暗中保持72至96小時，人工促進(jìn)種子開花結(jié)果。然后將幼苗轉(zhuǎn)移至生長室，在約21+/-2，以100-160微摩爾光子HT2s-1進(jìn)行12小時光照/12小時黑暗的循環(huán)。選擇光照較短的循環(huán)以促進(jìn)生長。為了促進(jìn)開花，在同樣的條件下生長植物，但是用16小時光照。使用保鮮膜保持環(huán)境濕度，直至幼苗生成。使幼苗稀疏至每盆一株，定位群體除外，其每盆兩株生長。用0.5X荷格蘭特(Hoaglands)培養(yǎng)基每十四個晚上為植物殺菌一次(Hoaglands和Arnon，1950)。還將底盤從邊緣旋轉(zhuǎn)至光源的中心，保持所有植物都具有相似的生長條件。而且，在可能時，將進(jìn)行相同實(shí)驗的植物緊挨著在相同的底盤中生長，使它們經(jīng)歷相同的生長條件。對于在組織培養(yǎng)基上發(fā)芽的種子，在層流中完成表面殺菌。將種子置于1.5mLEppendorf管中，并用ImL70%乙醇洗滌3分鐘。將種子在臺式離心機(jī)(14，OOOrpm)中旋轉(zhuǎn)30秒，并去除乙醇。在ImL漂白溶液(3%次氯酸鈉，75%壓0+1滴1^擾11-20清潔劑)中重新懸浮并洗滌種子5分鐘。如前旋轉(zhuǎn)種子。進(jìn)行5個洗滌和離心步驟，每次洗滌使用ImL無菌水，每次旋轉(zhuǎn)后棄去水。在涂布在Murashige和Skoog(MS)(GibcoBRL,USA)植物應(yīng)用瓊脂上之前將種子重新懸浮于無菌水中。MS瓊脂由下述組成4.3g/LMS鹽、20g/L蔗糖、lmL/L維生素、7g/L植物凝膠，用KOH將pH調(diào)至5.8，溶于Mi11iQ處理后的水中。當(dāng)需要進(jìn)行篩選時，瓊脂中包含抗生素30-50μg/mL卡那霉素(MPBiomedical，Solon，0H，USA)，或30yg/mL潮霉素(GibcoBRL)。用鋁箔包被平板，并將平板置于4°C72小時以促進(jìn)開花，然后放置在21°C的生長柜中，24小時光照，100微摩爾光子HT2iT1,或者在與土壤中植物相同的條件下生長。脅迫條件對于干旱脅迫實(shí)驗，在正常條件下放置底盤，并在底盤上隨機(jī)分布生物副本，每兩天輪換一次，以控制光密度、溫度和空氣接觸的差異。在處理前一天和t=O天澆灌植物，將過量的水倒出底盤，表明植物在干旱實(shí)驗開始時相對土壤水含量為100%。每天為每個盆稱重，如下計算得到相對水損失％<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>對于低溫脅迫，土壤中生長的植物接觸24小時低溫脅迫(4°C)，使用1微摩爾光子mY1的光照。對于鹽脅迫，土壤中生長的植物從下用NaCl溶液澆灌，每兩天澆灌一次。培養(yǎng)基上生長的植物的脅迫處理在涂布在包含適當(dāng)濃度的蔗糖、甘露醇、LiCl,NaCl或甲基紫羅堿的培養(yǎng)基上之前，如常將種子殺菌。然后如常人工促進(jìn)平板發(fā)育和生長。觀察對于發(fā)芽和幼苗生長的影響。DNA操作擬南芥DNA提取DNA粗提向小量植物組織中加入40μL0.25ΜNaOH。使用黃色P20槍尖研磨樣品，直至色素溶入溶液。加熱樣品至100°C30秒鐘，然后加入20μL0.5MTriS-HCl、ρΗ8和0.25%TritonX-100。通過倒置混合樣品，然后加熱至100°C2分鐘。DNA的提取方法本提取方法改編自Weigel禾口Glazebrook,Arabidopsis:alaboratorymanual,(ColdSpringHarborPress,2002)0使用油漆攪拌器和兩個玻璃珠，在2mL管中震蕩組織和提取緩沖液(220mMTris-HClpH7.5,250mMNaCl，25mMEDTA，0.5%SDS)。如此研磨并裂解組織。然后在微型離心機(jī)中用最大速度離心5分鐘，并將300μ1上清液轉(zhuǎn)移至1.5mLEppendorf管中。加入300μ1異丙醇沉淀DNA，然后通過以最大速度(Eppendorf離心機(jī))離心5分鐘而使DNA成球。棄去上清液，并用70%乙醇洗滌DNA球。然后將DNA溶于100μ1TEdOmMTris-HClpH8.0、ImMEDTA)中。DNA的CTAB提取從每株植物富集少量植物組織，所述組織為葉或花。向每個樣品加入300μ1CTAB緩沖液(2%(w/v)溴化十六烷基三甲胺(CTAB)U.4MNaClUOOmMTrisHClpH8.0、20mMEDTA)，伴隨使用1/8”滾珠。然后在TissueLyser(Qiagen，Hilden，Germany)以30/秒的頻率裂解樣品2分鐘。然后在65°C培育樣品，時間在30分鐘和幾小時之間。使樣品冷卻，然后加入300μ1氯仿并劇烈漩渦震蕩。在14，OOOrpm旋轉(zhuǎn)樣品1分鐘，并將上面的水層轉(zhuǎn)移至新的Eppendorf管中。向每個樣品加入300μ1異丙醇，并通過倒置幾次而混合。以14，OOOrpm將樣品旋轉(zhuǎn)5分鐘，以成球。倒去上清液，并用500μ170%乙醇洗滌小球。將樣品風(fēng)干，然后溶于100μ1TE緩沖液(IOmMTrisHClρΗ8.0,ImMEDTA)中。針對96孔模式的適應(yīng)如下改編CTAB提取方法，用于96孔板使用板底座(Qiagen，Hilden，Germany)通過臺式4-15°C離心機(jī)離心沉淀的DNA，并使用多通道多次分配移液器。PCR擴(kuò)增和凝膠電泳引物設(shè)計除了參照論文之外，可以佳用在TAIR網(wǎng)站(www,arabidopsis.org)上公開的序列禾口Primer3禾呈序(www,frodo.wi.mit.edu/cRi-bin/primer3/primer3www,cri)設(shè)計弓I物。使用下述條件設(shè)計引物50mM鹽濃度；GC含量約50%;最大自互補(bǔ)為8；并且最大3’自互補(bǔ)為3。通常，引物的Tm為55-60°C，并且長約20bp。在NCBI網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上通過使用BLASTn的“短，接近完全匹配”測試引物結(jié)合并擴(kuò)增其它產(chǎn)物的可能性。用于擴(kuò)增和測序的引物的實(shí)例(正向-F-和反向-R)提供于表1中，并且圖10中提供了對SALl基因的大規(guī)模描述，其中表示了內(nèi)含子、外顯子、引物雜交位置，以及fryl-3和salk_020882T-DNA插入、fryl-1、fry1-2和alx8突變的位置。表1-用于部分SALl基因擴(kuò)增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>對于SSLP繪制，如MonsantoSNP和LerCollections在TAIR網(wǎng)站上公布的，圍繞InDels設(shè)計引物。在TAIR多態(tài)性數(shù)據(jù)庫中還發(fā)現(xiàn)了一些多態(tài)性。設(shè)計引物以產(chǎn)生200-300bp的產(chǎn)物，Tm為57°C。所述區(qū)域的序列取自合適的BAC。對于SNP，使用在線程序dCAPSFinder2.0(www,helix,wustl.edu/dcaps/dcaps.html:Neff等，2002)、合適的BAC序列和Primer3設(shè)計dCAPS引物。對于alx8突變體特異性的dCAPS引物(其在alx8突變體產(chǎn)物中產(chǎn)生限制性位點(diǎn)，但在野生型中則沒有，并且其通過XbaI限制性酶表征)如下F5，-GAGGAAGGGAAAGTAGTTCTAG-3，(SEQIDNO21)；R:5，-TGCACTTTTACAGGAGAAGA-3，(SEQIDNO22)。然后在NraCutterV2.0(www,tools,neb.com/NEBcutter2/index.php；Vinzce等，2003)中模擬測試消化結(jié)果。對于重組載體構(gòu)建，如上設(shè)計引物，但是向引物的5’末端加入合適的間隔段和重組位點(diǎn)。弓I—自Proligo(Lismore,Australia)Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR條件使用標(biāo)準(zhǔn)PCR條件進(jìn)行構(gòu)建體的繪制、確認(rèn)和聚集群落的篩選。所有PCR反應(yīng)在PeltierThermalCycler(MJResearch,BI0RAD,ffaltham,MA,USA)或Palm-Cycler(CorbettResearch,Sydney,Australia)中進(jìn)行。在陽性克隆的PCR不產(chǎn)生任何產(chǎn)物或多個產(chǎn)物時，優(yōu)化擴(kuò)增條件。在Palm-Cycler上運(yùn)行有12個不同溫度的溫度梯度，MgCl2含量從1-2.5mM不等，并且測試了不同Taq聚合酶的優(yōu)先性。反應(yīng)液通常包含下述成分0.2mMdNTPUXTaq緩沖液(酌情)、0.5μM每條引物、2mMMgCl2(FisherBiotech,WA,Australia)、1-2μ1樣品DNA和0.25UTaq(酌情)。典型的循環(huán)條件為94°C2分鐘；940C30秒鐘，Tm-2°C30秒鐘和72°C30秒鐘的40個循環(huán)；72°C2分鐘。高保真PCR條件對于測序和構(gòu)建體產(chǎn)生，需要非常精確和/或長的PCR產(chǎn)物。在這些情況下，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用校對聚合酶。這些酶是PfuDNA聚合酶(Promega，Madison，WI)，PlatinumPfxTaq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)和Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzyme,Espoo,Finland)。電泳對于核酸分離和定量，用精確分子量標(biāo)準(zhǔn)梯度(BioRad，USA)和IkbDNA梯度(Promega,USA)，在瓊脂糖凝膠上跑樣。還使用了用HindIII和EcoRI消化的自制λDNA梯度。對于標(biāo)準(zhǔn)PCR，電泳在0.5-2%(w/v)瓊脂糖凝膠(FisherBiotech,WA,Australia)中進(jìn)行，凝膠中包括0.5ng/mL溴化乙啶(Biorad)用于成像。當(dāng)需要高分辨率時，比如dCAPS分離，用瓊脂糖-1000(GibcoBRL，Invitrogen，Rockville，MD，USA)制成3-4%(w/v)凝膠。用IXTBE緩沖液(89mMTris堿、89mM硼酸、2mMEDTA,pH8.0)或IXTAE緩沖液(40mMTris-乙酸、20mMNa2EDTA,pH8.5)制膠并跑樣。在傳統(tǒng)的電泳設(shè)備或超級120高效凝膠系統(tǒng)(6mgel,Biokeystone,EIMonte,CA,USA)中跑膠。對于質(zhì)粒消化物的分離，將0.7-1.0%凝膠在4°CIOOV跑樣6小時。在上樣前向PCR產(chǎn)物加入上樣緩沖液(70%甘油、30%H20、溴酚藍(lán))。通過UV光源使凝膠成像。DNA片段的純化和凝膠提取在用于連接或測序前，從瓊脂糖凝膠或PCR混合物中純化DNA片段。這個過程可去除引物、核苷酸、酶、礦物油、鹽、瓊脂糖、溴化乙啶和其它雜質(zhì)。對于70-i0kp的小片段，按照生產(chǎn)商的說明使用Wizardsv凝膠和PCRClean-Up系統(tǒng)或QIAquick凝膠提取試劑盒或PCRClean-Up試劑盒(Qiagen)?？偠灾瑥哪z上切下合適的條帶，并將其溶于包含異硫氰酸胍的緩沖液中。然后使溶解的凝膠或PCR產(chǎn)物在存在高離液鹽的情況下通過包含硅膜的柱。然后洗滌結(jié)合DNA的膜，之后將DNA洗脫在無菌dH20中。對于IOObp-IOkbp的DNA片段的凝膠提取，也按照生產(chǎn)商的說明使用Ultrafree-DA離心過濾單元(Millipore)。這個試劑盒與凝膠噴霧器不同，使用凝膠壓縮來從瓊脂糖提取DNA。然后通過加入1/10體積的3M乙酸鈉，加入2.5體積的100%乙醇并在-20°C沉淀DNA3小時而純化DNA。通過在臺式離心機(jī)中以最大速度離心15分鐘而使DNA成球。用70%乙醇洗滌小球。然后將DNA溶于無菌dH20中。使用QIAEXII試劑盒進(jìn)行已知大于IOkb的條帶的凝膠提取，并且按照生產(chǎn)商的說明使用。這個試劑盒使用硅珠結(jié)合DNA，而不是使用硅膜，當(dāng)較大的DNA片段通過膜時可防止片段發(fā)生剪切。MMiSfflnanodrop^jfeT^iSif(GenomicSolutions,Melbourne,Australia)產(chǎn)量定量。定位克隆和互補(bǔ)從alx8(Col-0背景)和野生型Landsbergerecta之間雜交的F2群落提取基因組DNA。使用F2的葉片表型，或野生型F2的后代，確定它們在alx8突變位點(diǎn)的表型。使用由Lukowitz等(Lukowitz,W.，C.S.Gillmor,等(2000)，“PositionalcloninginArabidopsis.Whyitfeelsgoodtohaveagenomeinitiativeworkingforyou，，,PlantPhysiology123(3):795_805)。在Cereon數(shù)據(jù)庫(www,arabidopsis.org)中發(fā)現(xiàn)的SSLP和SNP附近設(shè)計標(biāo)記。在dCAPSFinder2.O(http//helix,wustl.edu/dcaps/dcaps.html；Neff等，2002)的幫助下設(shè)計dCAPS引物。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行PCR、消化和凝膠電泳。載體操作限制性消化所有酶都來自Promega，并且按照生產(chǎn)商的說明使用，只做了一些修正。為了精細(xì)的繪制而使用dCAPS標(biāo)志進(jìn)行限制性消化。在這個情況下，用1單位合適的酶在37°C將10μ1消化一小時到過夜。質(zhì)粒如BACS的限制性消化，在1μgDNA和5單位酶上進(jìn)行。通過在65°C加熱15分鐘或在_20°C冷凍而停止消化。去磷酸化按照生產(chǎn)商的說明，使用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP；Promega)將消化的片段去磷酸化。反應(yīng)重復(fù)兩次，然后使用提供的終止緩沖液停止。然后通過苯酚氯仿異戊醇(25241)提取液和乙酸鈉和100%乙醇沉淀而凈化溶液。在70%乙醇中洗滌小球，然后風(fēng)干，并重新懸浮于無菌水中。載體連接按照生產(chǎn)商的說明，使用T4連接酶連接制備的插入片段和質(zhì)粒。主要使用插入片段載體DNA為31的比例，其優(yōu)于11或13比例，并且在4°C過夜進(jìn)行連接。載體重組對于需要重組的載體，使用高保真條件和包含attB重組序列的引物擴(kuò)增插入片段。按照生產(chǎn)商的說明，使用Gateway系統(tǒng)(Invitrogen)進(jìn)行重組反應(yīng)。總而言之，使用10μ1反應(yīng)液中的2μ1BP克隆酶，將50fmol合適的插入片段與50fmol載體pDONR/Zeo(Invitrogen)重組，所述載體包含相應(yīng)的attP重組序列。這可以參照BP反應(yīng)，并產(chǎn)生attL重組序列。反應(yīng)在25°C過夜，然后通過與1-2μg蛋白酶K在37°C孵育10分鐘而停止。在轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)大腸桿菌并在篩選條件系孵育后，純化質(zhì)粒并確認(rèn)插入片段。然后在LR反應(yīng)中使分離的質(zhì)粒與目的載體重組。目的載體，比如pHellsGate8(pHG8；由PeterWaterhouse和ChrisHelliwell,PI,CSIRO捐贈)，包含attR重組序列。然后將這些與包含插入片段的供體質(zhì)粒中的attL位點(diǎn)重組，再次得到SttB序列。LR反應(yīng)與BP反應(yīng)相同，但是需要LR克隆酶。再次將相同摩爾數(shù)的pDONR-插入片段和pHG8過夜重組，得到pHG8_插入片段。然后使用這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在篩選條件下擴(kuò)增，分離并確認(rèn)。感受態(tài)大腸桿菌為了產(chǎn)生感受態(tài)大腸桿菌，用5μ1DH5a細(xì)胞接種5mLLB，并在37°C以適度的震蕩(200rpm)過夜培養(yǎng)。然后使用這個起始培養(yǎng)物接種200mLLB，其于37°C以適度震蕩培養(yǎng)3-4小時，直至培養(yǎng)物的0D600為0.6。然后在冰上孵育培養(yǎng)物30分鐘，之后以約3，OOOg在4°C離心20分鐘使其成球。將小球重新懸浮于200mL冰冷的水中，然后再次以相同的條件成球。這個循環(huán)再重復(fù)兩次，其中最后一次重新懸浮于20mL冰冷的10%甘油中。再次在4°C將細(xì)胞成球，但是為2，OOOg10分鐘，并且重新懸浮于ImL冰冷的10%甘油中。然后將這個重新懸浮液稀釋于50μL等分試樣中，其在液氮中急速冷凍，并保存于-80°C。大腸桿菌轉(zhuǎn)化對于較難的轉(zhuǎn)化，使用商業(yè)感受態(tài)細(xì)胞，OneShotOmniMAXTM-TlR化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌(Invitrogen)。將100μ1細(xì)胞在冰上解凍，并加入IOOng連接混合物。然后將細(xì)胞置于冰上30分鐘，之后在42°C熱擊30秒鐘。然后將細(xì)胞放回冰上2分鐘，之后加入提供的250μ1SOC培養(yǎng)基。然后在37°C震蕩回收細(xì)胞1-2小時。對于大多數(shù)轉(zhuǎn)化，使用自制的感受態(tài)細(xì)胞。將100μL感受態(tài)細(xì)胞在冰上解凍，并加入IOOng質(zhì)粒DNA，用移液器槍尖混合。然后在液氮中將細(xì)胞急凍，之后在37°C水浴中培育五分鐘。然后向細(xì)胞中加入ImLLB，并在37°C震蕩培養(yǎng)1-2分鐘。然后將兩個不同體積的細(xì)胞涂布在合適的選擇性培養(yǎng)基上并在37°C過夜培養(yǎng)。細(xì)菌生長和甘油儲備(glycerolstock)所有細(xì)菌液體培養(yǎng)物都在Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基由下述組成10g/L細(xì)菌用胰蛋白胨(BactoLaboratories，Australia)，5g/L酵母提取物(BactoLaboratories)和5g/LNaCl的MilliQ處理的水溶液。如果需要LB瓊脂，向肉湯中加入15g/L瓊脂(LenerDavisGelatin，Australia)。所有培養(yǎng)基在使用前通過高壓而滅菌。以下述濃度使用抗生素100μg/mL壯觀霉素(Sigma)，100μg/mL氨芐青霉素(Sigma)和150μg/mL利福平(Sigma)，30-50μg/mL卡那霉素(MPBiomedical,Solon,OH,USA),50g/mL§iMM(zeomycin)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。)(寸f霉素篩選，使用低鹽LB:10g/L細(xì)菌用胰蛋白胨(BactoLaboratories，Australia)，5g/L酵母提取物(BactoLaboratories)和5g/LNaCl的MilliQ處理的水溶液。對于藍(lán)-白篩選，平板還包含0.5mMIPTG(異丙基-b-硫代半乳糖苷；FisherBiotech)和80μg/mLX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷；ProgenBioscience,QLD,Australia)。大腸桿菌的液體培養(yǎng)物在37°C震蕩過夜培養(yǎng)，大腸桿菌的平板在37°C過夜培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的平板在28°C培養(yǎng)幾天，并且農(nóng)桿菌的液體培養(yǎng)物在28°C震蕩培養(yǎng)16-20小時。細(xì)菌培養(yǎng)物的甘油儲備通過將700μL的培養(yǎng)物與700μL甘油溶液(65%甘油ν/v、0.IMMgS04、0.025MTris-Cl,ρΗ8)相混合而得到。隨后將儲備保存在-800C0菌落PCR進(jìn)行菌落PCR，篩選存在質(zhì)粒和插入片段的菌落。PCR條件與平常一樣，但是每個反應(yīng)的體積為20μ1，并且使用移液器槍尖將少量細(xì)胞從菌落轉(zhuǎn)移至PCR。質(zhì)粒分離對于大多數(shù)應(yīng)用，使用GeneEluteTM質(zhì)粒小提試劑盒(Sigma)從3_5mL液體培養(yǎng)物分離質(zhì)粒，所述培養(yǎng)物來自單菌落或甘油儲備的過夜生長?？偠灾辜?xì)胞成球并使用修正的堿-SDS裂解方法裂解。然后在存在高鹽的情況下將質(zhì)粒DNA吸附至硅膜上。然后洗滌膜，之后用無菌dH20洗脫質(zhì)粒DNA。對于需要大量質(zhì)粒的應(yīng)用，比如BACDNA的制備，使用大規(guī)模堿裂解規(guī)程。這個操作規(guī)程基于獲得自NIH細(xì)胞和分子調(diào)控實(shí)驗室(Bethesda，MA,USA)的規(guī)程。將包含篩選物的500mL培養(yǎng)物在37°C和200rpm過夜生長。然后在4°C6000g離心15分鐘使250mL細(xì)胞成球，棄去上清液，將瓶置于冰上。然后將細(xì)胞懸浮于20mL室溫的IOmMEDTA，pH8.0中，并置于室溫5分鐘。然后加入40mL裂解溶液(0.2MNaOH,1%SDS)，并將瓶置于室溫5分鐘。然后加入30mL冰冷的中和溶液(11.5%(體積比)乙酸，1.9M乙酸鉀)，，并將瓶置于冰上15分鐘。然后在4°C30，OOOg離心20分鐘使細(xì)胞碎片成球。將上清液移至新瓶并重復(fù)上述過程。然后通過加入45mL異丙醇使DNA從上清液沉淀出來，并在6，500g離心15分鐘使其成球。然后將小球溶于9mLIOmMtris/50mMEDTA中并加入4.5mL7.5M乙酸鉀。然后在_70°C冷凍溶液30分鐘，解凍并在4，OOOg離心10分鐘。然后通過加入27mL100%乙醇而沉淀DNA，并在4，OOOg離心10分鐘而使DNA成球。然后將小球溶于700μL50mMTris/50mMEDTA，pH8.0中，并加入10μL的lOng/μLRNAse。然后在37°C培育樣品1小時，使RNA分解。然后通過加入700μ1苯酚氯仿異戊醇(25241)，混合并在微型離心機(jī)中以14，OOOrpm離心5分鐘而凈化樣品。然后再次在700μ1氯仿異戊醇中凈化頂層。然后通過加入700μ1異丙醇而將DNA從頂層沉淀出來，并通過在14，OOOrpm離心20分鐘而使DNA成球。去除上清液并用500μ70%乙醇洗滌小球，并在14，OOOrpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。再次去除上清液，并風(fēng)干小球，然后重新懸浮于100μ1無菌H2O中。消化物判斷為了確認(rèn)質(zhì)粒和是否存在插入片段，過夜消化分離的質(zhì)粒并在瓊脂糖凝膠上跑樣。使用NEBEutterV2.0(www,tools,neb.com/NEBcutter2/index,php；NewEnglandBiolabs)鑒別條帶的期望模式。感受態(tài)農(nóng)桿菌由在28°C過夜生長的500mL培養(yǎng)物產(chǎn)生感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)。然后將250mL培養(yǎng)物在冰上冷藏，并在4°C以3，OOOg離心5分鐘而成球。將小球重新懸浮于ImL冰冷的20mMCaCl2中，并分成0.ImL等分試樣，然后在液氮中冷凍并于-80°C保存。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化用分離的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化自制的感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞。將100μ1感受態(tài)細(xì)胞在冰上解凍，并加入Iyg質(zhì)粒。然后在37°C熱擊細(xì)胞5分鐘，然后加入ImL液體LB。在28°C震蕩回收細(xì)胞2-4小時。包括無任何質(zhì)粒的感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞陰性對照。然后將細(xì)胞涂布在LB瓊脂平板上，平板包含用于篩選質(zhì)粒的卡那霉素(50yg/mL)；和用于篩選農(nóng)桿菌的利福平(100μg/mL)和慶大霉素(25μg/mL)。然后在28°C培養(yǎng)平板2_3天或直至菌落出現(xiàn)。通過菌落PCR，使用插入片段的特異性引物篩選包含插入片段的菌落。這些菌落還用于接種于包含篩選物(50μg/mL卡那霉素，100μg/mL利福平，25μg/mL慶大霉素)的5mL液體LB發(fā)酵劑。培養(yǎng)物在28°C過夜震蕩生長。擬南芥轉(zhuǎn)化待轉(zhuǎn)化的擬南芥在土壤上生長，并修剪第一個開花的花苞，以促進(jìn)多個二次花苞出現(xiàn)。當(dāng)有很多花叢時將植物浸濕并剪去任何已發(fā)育的果實(shí)。然后使用來自Clough和Bent(1998)的規(guī)程的修正規(guī)程轉(zhuǎn)化擬南芥。使用包含篩選物的5mL發(fā)酵劑接種500mL液體LB。然后在28°C震蕩過夜生長。在RC5CPlus離心機(jī)(Sorvall)中使用SLA-3000轉(zhuǎn)頭，以4，OOOrpm在室溫離心20分鐘，使500mL培養(yǎng)物成球。然后將小球重新懸浮于500mL5%(w/v)蔗糖溶液中。然后加入清潔劑SilwetL-77(lehleSeeds,RoundRock,TX,USA)至終濃度0.05%(體積比)。將花浸入溶液中5-10秒鐘，伴有溫和攪拌，然后平放在保鮮膜下的底盤中保濕。第二天靜置植物，并在一周后重復(fù)所述過程。種子放置兩周后，將植物轉(zhuǎn)移至黑暗的干燥柜中干燥種子。將種子置于篩選劑上分離轉(zhuǎn)化體，然后將其轉(zhuǎn)移至土壤上。測序?qū)NA片段或質(zhì)粒與合適的引物一起送至BiomolecularResourceFacility(JCSMR,ANU,Canberra)或AustralianGenomicResourceFacility(UQ,Queensland)測序?；蛘?，在20μL測序反應(yīng)液中制備DNA，所述反應(yīng)液由下述組成0.5μM引物，IX緩沖液，2yLDNA和1.5yLBigDye。如下進(jìn)行反應(yīng)96°C2分鐘和下述共40個循環(huán)96°C5秒鐘，50°C15秒鐘，60°C3.5分鐘。然后使用EDTA純化方法純化PCR產(chǎn)物。加入5μL0.125ΜEDTA和60μL室溫100%乙醇至20μL?；旌蠘悠凡⒏采w錫箔紙在室溫靜置沉淀40分鐘。然后以最大速度離心20分鐘，使標(biāo)記的DNA成球，并用70%乙醇洗滌，之后再次離心5分鐘。去除上清液，并使用Speedi-Vac干燥小球。然后將樣品送給Yang測序。熱不對稱互動式(Tail)-PCR改編了來自(LiuY-G,MitsukawaN,OosumiT和Whittler，RF(1995)“EfficientisolationandmappingofArabidopsisthalianaT-DNAinsertjunctionsbythermalasymmetricinterlacedPCR",ThePlantJournal8:457_463)的操作規(guī)程。如Liu等1995所述，順序使用三個對T-DNA插入片段左邊界特異性的引物(LBal-5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3'(SEQIDNO23)；LBb1-5‘-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3‘(SEQIDNO24)；和LBc1-5'-GGACTCTTGTTCCAAACTGG-3'(SEQIDNO25))和隨機(jī)簡并引物，AD2(5，-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’，128倍簡并，其將結(jié)合至擬南芥序列中)，進(jìn)行了一系列三個PCR反應(yīng)。第一次的反應(yīng)液為2(^1^，包含1\0緩沖液，20(^]每種(1^13，21111MgCl2,0.2μMLBal,3yMAD2,0.8UFlTaq和約20ng基因組DNA。每個樣品進(jìn)行兩次平行反應(yīng)，一個稀釋50倍以進(jìn)行下一次PCR，另一個保留以在最后的凝膠上跑樣。第二次的反應(yīng)液為20μL。包含1父？0緩沖液，20(^]\1每種(1^13，211111%(12，0.2μΜLBcl,2yMAD2,0.6UFlTaq和1μL來自第一次反應(yīng)的稀釋PCR產(chǎn)物。每個樣品進(jìn)行兩次平行反應(yīng)，一個稀釋10倍以進(jìn)行下一次PCR，另一個保留以在最后的凝膠上跑樣。第三次反應(yīng)為100μL，并且除了使用第三條LB特異性引物和AD2之外，條件和第二次反應(yīng)相同。通過瓊脂糖凝膠電泳分析所有擴(kuò)增產(chǎn)物。通過第二次和第三次反應(yīng)中條帶之間的大小差異鑒別插入特異性產(chǎn)物。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)從凝膠上切下合適的條帶并測序(AGRF,Brisbane,Australia)。SALl蛋白質(zhì)分析為了產(chǎn)生重組SALl蛋白質(zhì)，使用PlantRNeasyKit，用柱上DNAse消化步驟(Qiagen，www.qiagen.org)從Col_0和alx8葉片提取總RNA，并按照生產(chǎn)商的說明用于第一鏈cDNA合成(SuperScriptII,Invitrogen,www,invitrogen.com)。從克隆的Col-0禾口alx8SALlcDNA,用弓I物SacII-SALlFl(5，-ctccgcggtggtatggcttacgagaaagagc-3，)(SEQIDNO26)和EcoRI-SALl(5，-gctcgaattctcagagagctgaagctttctc-3，)(SEQIDNO:27)，擴(kuò)增完整的SALl編碼序列，然后克隆進(jìn)pHUE載體(Baker等，2005)。在用ImMIPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen,www,emdbiosciences.com)中表達(dá)重組蛋白質(zhì)，并使用His-結(jié)合樹脂，根據(jù)生產(chǎn)商(Novagen)的說明通過親和色譜純化。通過酶裂解回收無標(biāo)簽的真正SALl蛋白質(zhì)，并測定對于磷酸腺苷5’磷酸酯(PAP)的磷酸酶活性(Murguia等，(1995)，Science267，232-234)，并通過免疫親和純化從接種的兔血清IgG部分分離抗SALl多克隆抗體(IMVS，Adelaide)。對于western印跡，將20μg葉片蛋白質(zhì)提取物溶于梯度凝膠中，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，并用11，000稀釋的針對重組SALl蛋白質(zhì)的純化單克隆抗體進(jìn)行檢測。在用0.05%(體積百分比)TweenPBS洗滌后，用110，000稀釋的HRP-結(jié)合羊抗兔IgG孵育印跡，并使用SuperSignalWestFemtoChemilumiscent檢測試劑盒(Pierce)展開?；虮磉_(dá)分析處理RNA時的注意事項因為環(huán)境中存在大量RNAse酶，所以要注意很多事情以避免RNA發(fā)生降解。在處理RNA時始終戴手套，并且盡可能在干凈的環(huán)境中謹(jǐn)慎操作。樣品保持置于冰上，于-80°C保存，并限制凍融次數(shù)。無RNAse的水可以購買或通過用0.2%(體積百分比)焦磷酸二乙酯(DEPC，Sigma)處理MilliQH20而產(chǎn)生。在使用前，用DEPC處理的水過夜攪拌，然后高壓滅菌，以破環(huán)任何殘余的DEPC。玻璃容器在180°C過夜烘焙，塑料容器在稀釋的H2O2中過夜浸泡，然后用DEPC處理過的水沖洗幾次。RNA提取使用PlantRNeasy試劑盒(Qiagen，Germany)提取RNA?？偠灾?，使用無菌微型杵將不超過IOOmg的冷凍組織研磨成粉末。裂解樣品并在提供的包含異硫氰酸胍(GITC)的緩沖液中變性，所述緩沖液也可使任何RNAse失活。然后將樣品應(yīng)用于QIAshredder，去除不溶材料并剪切基因組DNA。洗脫液與100%乙醇混合，沉淀RNA，并使混合物通過RNeasy微型柱，RNA在其中結(jié)合硅凝膠膜。洗滌膜并用無RNAse的DNAseI(Qiagen)處理約20分鐘，并在用無RNAseH2O洗脫RNA前再次洗滌。RNA沉淀為了濃縮并純化RNA，使用了分子生物學(xué)(Ausubel等，1998)中當(dāng)前的規(guī)程。概述之，向RNA加入1/10體積的乙酸鈉，pH5.2。將樣品短暫漩渦震蕩而混合，然后加入2.5體積的冰冷的100%乙醇。再次通過漩渦震蕩混合樣品，并置于-20°C30分鐘以促進(jìn)RNA沉淀。然后在臺式離心機(jī)中以最大速度離心5分鐘而使RNA成球。去除上清液，并用70%乙醇洗滌小球，然后再次離心。去除上清液，并在Speedi-Vac中以中熱干燥RNA5分鐘，然后溶于無RNAse的H2O中。eDNA合成根據(jù)獲得自ChristianDelessert(PlantIndustry,CSIRO,Canberra,Australia)的規(guī)程進(jìn)行cDNA合成。向IygDNA中加入1μgT23V引物，并在70°C孵育10分鐘，使引物結(jié)合。然后反應(yīng)液由下述組成30yL:lX合適的緩沖液，IOmM二硫蘇糖醇，0.17mM無RNAse的dNTP(Invitrogen)，100單位的SuperScriptII(Invitrogen)和無RNAse的H2O至30μL。然后在45°C孵育反應(yīng)物2小時，并在無菌milliQH2O中稀釋至200μL0然后準(zhǔn)備cDNA進(jìn)行實(shí)時RT-PCR分析。實(shí)時RT-PCR使用實(shí)時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(實(shí)時RT-PCR)測定轉(zhuǎn)錄本豐度。引物設(shè)計使用Primer3禾呈序(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)，用下述條件設(shè)計用于實(shí)時RT-PCR的合適的引物產(chǎn)物大小約250bp熔融溫度(Tm)約60°CGC含量約50%最大自互補(bǔ)為4最大3’自互補(bǔ)為3使用的基因序列為拼接的cDNA序列，獲得自TAIR(www,arabidopsis.org)?？赡軙r，設(shè)計引物使其位于內(nèi)含子的任一邊，以檢測DNA的污染。通過“Blastn”，在國家生物技術(shù)中心網(wǎng)站(NCBI，http//www,ncbi.nlm.nih.gov/)上搜索，檢查引物的特異性。所有引物都訂購自Proligo(Australia)。使用的一些引物的實(shí)例在(Rossel,J.B.，P.B.Walter等(2006),Plant,CellandEnvironment29(2):269_281)中給出。使用的其它引物的實(shí)例包括APX2(At3g09640)，5，-GGCTGGGACATTTGATGTG-3，(SEQIDNO28)禾口5，-AGGGAACAGCTCCTTGATAGG-3’(SEQIDNO29)；APXl(Atlg07890)，5，-CCACTCGCATTTCTCCAGAT-3，(SEQIDNO30)禾口5’-TCGAAAGTTCCAGCAGAGTG-3，(SEQIDNO31)；sHSP(At2g29500)，5，-CCTGGATTGAAGAAGGAGGAAG-3，(SEQIDNO32)和5，-TAGGCACCGTAACAGTCAACAC-3，(SEQIDNO33)；ZAT10(Atlg27730)，5，-AGGCTCTTACATCACCAAGATTAG-3，(SEQIDNO34)和5，-TACACTTGTAGCTCAACTTCTCCA-3’(SEQIDNO35)；親環(huán)蛋白(At2g29960)，5，-TCTTCCTCTTCGGAGCCATA-3，(SEQIDNO36)禾口5’-AAGCTGGGAATGATTCGATG-3’(SEQIDNO37)；DREB2A(At5g05410)，5，-AGACTATGGTTGGCCCAATG-3，(SEQIDNO38)禾口5，-TCGAGCTGAAACGGAGGTAT-3，(SEQIDNO39)；HSP70(At3g09440)，5，-GCTGCTATTGCTTACGGTCTTG-3，(SEQIDNO40)和5，-CTCTCGGGTTTCCACTAATGTC-3‘(SEQIDNO:41)。為了檢查引物的精確度和有效性，用100、25、5和IngcDNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個濃度重復(fù)兩次。通過Rotorgene5程序自動生成R2值、反應(yīng)效率和熔融曲線。對于精確的引物，R2值必須>0.99，反應(yīng)效率必須>95%，并且熔融曲線必須說明只擴(kuò)增一個產(chǎn)物。只有在這些條件都滿足時，這些引物才可用于實(shí)時RT-PCR。實(shí)時RT-PCR過程建立在Rotor-Gene2000或Rotor-Gene3000(CorbettResearch,Australia)中進(jìn)行實(shí)時RT-PCR反應(yīng)。在某些情況下，每個cDNA樣品重復(fù)三次實(shí)驗?；蛘?，重復(fù)兩次反轉(zhuǎn)錄，并且每個反轉(zhuǎn)錄有兩次技術(shù)重復(fù)，所以每個RNA樣品有四個重復(fù)。用針對目的基因和針對“管家”基因的引物測試每個樣品。在相對于管家基因(其表達(dá)不改變)進(jìn)行各種處理后，實(shí)時RT-PCR可以定量具體組織中的mRNA豐度。這可以如下進(jìn)行通過測定轉(zhuǎn)錄本中熒光染料SYBR綠的合并而測定轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過重復(fù)循環(huán)后的擴(kuò)增速率。這種染料可以結(jié)合所有dsDNA分子，并且在結(jié)合時僅發(fā)出熒光信號。為了進(jìn)行反應(yīng)，按照生產(chǎn)商的說明使用SYBRGreenJumpStartTMTaqReadyMixTM(SigmaAldrich)RocheLightCycler4800SYBRMaster(Roche,Basel,Switzerland)。對于Sigma產(chǎn)品，混合物包含IOmMTris-HCl,ρΗ8.3,50mMKC1,3.5mMMgCl2,0.2mM每種dNTP，0.25單位TaqDNA聚合酶，JumpStartTaq抗體和SYBR綠I。對于Roche產(chǎn)品，混合物的內(nèi)容物未公開。通常1(^1^反應(yīng)液包含25叫cDNA，0.2μM每條引物和0.9ΧMaster混合物。典型的循環(huán)條件如下950C2分鐘(TaqDNA聚合酶的初始活化)循環(huán)重復(fù)45次95°C15秒鐘(變性)，55°C30秒鐘(引物結(jié)合)，72°C30秒鐘(延長和熒光讀數(shù))和80°C15秒鐘(熒光讀數(shù))600C2分鐘(最后的延遲步驟)通過升至99°C，每5秒鐘增加1°C，從而進(jìn)行熔融曲線分析。分析使用Rotor-Gene5程序(CorbettResearch)分析實(shí)時RT-PCR結(jié)果。對于每次反應(yīng)，查看熔融曲線，確保每組引物產(chǎn)生單一的產(chǎn)物，并且產(chǎn)物進(jìn)行了有效擴(kuò)增。用于實(shí)時RT-PCR的分析方法如前所述(Rossel,J.B.，P.B.Walter等(2006)，Plant,CellandEnvironment29(2)269-281；Pfaff1,Μ.W.(2001),"Anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timeRT-PCR，，，NucleicAcidsResearch29(9))。對于可比的Ct方法，將擴(kuò)增反應(yīng)的閾值設(shè)定為所有樣品以指數(shù)速率擴(kuò)增的點(diǎn)。閾值循環(huán)(Ct)值是特定樣品達(dá)到閾值而進(jìn)行的循環(huán)數(shù)，其中每個樣品的熒光量相同，并且從而dsRNA量相同。然后將這些Ct值轉(zhuǎn)化成Excel(Microsoft，USA)。刪除每組三個重復(fù)中Ct值相差超過0.5的異常值。然后通過在某個時間點(diǎn)和條件比較目的基因的表達(dá)和相同時間和條件的管家基因的表達(dá)，將得到的數(shù)據(jù)集歸一化。這可以通過從目的基因三個重復(fù)的每個Ct值減去該樣品中管家基因的平均Ct值而得到ACt=Ct(目的基因)_平均Ct(管家基因)然后將這些數(shù)值與對照樣品比較，通常t=0。這可以通過從每個樣品值剪去對照值而得到ΔACt。ΔΔCt=ΔCt(目的基因)-ΔCt(對照)然后使用這些數(shù)值，用公式2-ΔACt計算絕對值。結(jié)果是，對照值成為1，并且所有其它樣品給出相對于對照值的數(shù)值。對于可比定量方法，將程序分析的樣品與用戶確定的對照樣品比較，通常t=0。然后使用下述公式計算可比濃度可比濃度=擴(kuò)增(對照takeoff-本樣品takeoff)使用隨循環(huán)增加的熒光速率而計算takeoff值。最大速率為峰值速率，并且takeoff速率是峰值速率的80%以下。Takeoff值是當(dāng)反應(yīng)到達(dá)takeoff速率時已進(jìn)行的循環(huán)數(shù)。擴(kuò)增是對于特定引物組，所有樣品的評價擴(kuò)增效率?？梢砸缘竭_(dá)take-off點(diǎn)后四個循環(huán)中熒光增加的平均倍數(shù)而計算。理想地，這個數(shù)值在反應(yīng)的指數(shù)期為2。對每個引物組，給出了平均擴(kuò)增效率和置信區(qū)間，并且置信區(qū)間值增加，說明樣品之間波動更大。然后將每個引物源自計算機(jī)的可比濃度輸出至Excel，并針對管家基因歸一化。這導(dǎo)致表達(dá)量相對于對照的百分比或倍數(shù)改變。使用Excel功能計算每組平行實(shí)驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后使用Excel將結(jié)果繪成柱狀圖。適當(dāng)?shù)臅r候，將多個生物副本的結(jié)果平均，并使用STDEVPA功能計算實(shí)驗間的標(biāo)準(zhǔn)偏差，其根據(jù)全群落確定標(biāo)準(zhǔn)偏差作為參數(shù)。Northern印跡使用Northern印跡研究基因表達(dá)的程度和是否出現(xiàn)拼接變體。使用RNeasy試劑盒，如上進(jìn)行RNA提取，每個生物副本僅使用三個QIAShredder柱，并且通過一個RNeasy柱洗脫，使得到的洗脫液濃度最大。然后如上將每個樣品的20μgRNA沉淀，并重新懸浮于5μL無RNAse的水中。用濃縮的RNA在無RNAse的條件中進(jìn)行凝膠電泳。通過在125mLDEPC處理的H2O中使2.25g瓊脂糖熔化而制膠。冷卻混合物，然后加入15mL10XMOPS(0.4MM0PS，0.IM乙酸鈉，0.OlMEDTA)，7.5mL甲醛和2μL溴化乙啶(EtBr)。將凝膠置于正常凝膠電泳槽中，然后用加入1μL/IOOmLEtBr的1XMOPS平衡。向每20μgRNA中加入9yL甲醛、25yL甲酰胺和4.2yL10XM0PSo然后將樣品漩渦震蕩而混合，并在55°C加熱使RNA變性。在向凝膠上樣前，向每個樣品加入0.5μLEtBr和2μL上樣緩沖液(ImMEDTAρΗ8.0，50%甘油，2.5mg/mL溴酚藍(lán)，2.5mg/mL二甲苯藍(lán))。以100V跑膠幾小時，直至染料沿凝膠移動2/3。然后在UV照射下快速給RNA照相，查看RNA的質(zhì)量和數(shù)量。通過用20XSCC過夜重力印跡，將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜(Hybond-N，AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UK)。然后用保鮮膜將尼龍膜包起來，并通過UV以1200V照射而將RNA固定于膜上。然后在黑暗中保存膜備用。通過使用引物Fryl-IF(5，-AACCCATTTTGTAAATCTTCC-3，)(SEQIDNO42)和Fryl-rt2R(5，-CAGAGAAACAAAGAACGTACGAGA-3，)(SEQIDNO43)和40μL反應(yīng)液，從Col-0WTcDNA擴(kuò)增SALl而產(chǎn)生探針。在凝膠上將PCR產(chǎn)物跑樣，并使用凝膠提取試劑盒純化。然后使用Prime-a-gene標(biāo)記系統(tǒng)(Promega)，按照生產(chǎn)商的說明，用放射性α32P_dCTP標(biāo)記探針。如(RosselJ.B.,WilsonI.W禾口PogsonB.J.(2002),“GlobalchangesingeneexpressioninresponsetohighlightinArabidopsis",PlantPhysiol.130:1109_1120)中所述進(jìn)行過程。微陣列使用RNeasy試劑盒如上提取RNA用于微陣列。然后使用Nanodrop分光光度計測定RNA的濃度和純度。還通過3ygRNA的凝膠電泳檢查RNA的數(shù)量。概述之，通過在1XMOPS緩沖液中融化高保真瓊脂糖-1000而制成1%凝膠。在55°C冷卻混合物，然后加入溫的甲醛至終濃度18%(體積百分比)并倒入凝膠槽中。凝固后用1XM0PS跑樣緩沖液平衡凝膠。將IOyL的RNA與20μL上樣緩沖液(52%甲酰胺，1XM0PS，17%甲醛，7%甘油，0.02mg/mLEtBr,少許溴酚藍(lán))，在70°C加熱5分鐘，然后在冰上冷卻2分鐘。然后在凝膠中在90V跑樣幾小時，直至染料走過凝膠長度的2/3。如果需要更濃的RNA，以中熱在Speedi-Vac中短時間降低體積。也在RNA6000NanoLabChip上，根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用Agilent2100Bioanalyser系統(tǒng)(SantaClara,CA,USA)測試RNA的質(zhì)量和數(shù)量。這個系統(tǒng)由通過毛細(xì)管中凝膠基質(zhì)上電泳的RNA分子大小而分離RNA分子。在不同的管中跑樣之前加熱使每個樣品和梯度變性。凝膠基質(zhì)中的插入染料可以標(biāo)記RNA，并在通過毛細(xì)管時讀出數(shù)量和重量。一旦確認(rèn)了RNA的質(zhì)量，使用生產(chǎn)商試劑盒和說明制備RNA用于AffymetrixGeneChip表達(dá)分析系統(tǒng)(SantaClara,CA,USA)中。概述之，使用T7_01igo(dT)引物和SuperscriptII，將5ygRNA反轉(zhuǎn)錄，稱為第一鏈合成。這使RNA結(jié)合在互補(bǔ)的DNA鏈上。然后合成cDNA的第二鏈，替代第二鏈合成中的RNA。這個合成使用RNAseH去除RNA，然后使用T4DNA聚合酶如DNA—樣重建第二鏈。然后通過使用cDNA結(jié)合柱而從cDNA去除反應(yīng)組分，所述柱經(jīng)過洗滌、干燥并洗脫cDNA。然后使用體外轉(zhuǎn)錄(IVT)過程，從cDNA擴(kuò)增用生物素標(biāo)記的cRNA。這個過程使用生物素化核苷酸類似物/核苷酸混合物和T7RNA聚合酶。然后使用可以結(jié)合cRNA的柱純化cRNA，并允許少量等分試樣通過Bioanalyser，確認(rèn)產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量。也通過nanodrop分光光度計定量用生物素標(biāo)記的cRNA，并確認(rèn)純度。由于初始樣品中使用總RNA，針對存在的未標(biāo)記RNA而調(diào)整產(chǎn)量。使用下述公式進(jìn)行調(diào)整的cRNA產(chǎn)量=RNAm-總RNAi其中RNAm是在IVT反應(yīng)和凈化后測得的cRNA的量(μg)，并且總RNAi是RNA的初始起始量(μg)。然后通過Mg2+離子誘導(dǎo)的水解，將20μgcRNA分解成35_200bp的片段。在Bioanalyser中允許少量等分試樣通過，確認(rèn)發(fā)生了分解。為了確認(rèn)RNA的質(zhì)量，然后將來自一個樣品的少量片段化cRNA與TeStArray3雜交。過程與針對ATHl芯片的過程相同。對于ATHlGeneChipJf15μg片段化cRNA的每個樣品在45°C過夜(16小時)旋轉(zhuǎn)雜交。然后使用FluidicsSatation400，用非嚴(yán)緊洗滌方式洗滌GeneChip。然后用鏈霉親和素藻紅蛋白(SAPE)將GeneChip染色，SAPE可與生物素標(biāo)記的cRNA結(jié)合。然后通過加入可以結(jié)合SAPE的一抗而放大信號。然后加入可以結(jié)合一抗的生物素化二抗，并最后加入可以結(jié)合二抗的SAPE。藻紅蛋白在570nm發(fā)熒光，所以在這個波長掃描GeneChip。然后分析結(jié)果。在上述步驟中加入很多對照。在第一鏈合成過程中加入四個polyARNA對照，以確保有效產(chǎn)生標(biāo)記的cRNA。這些對照來自枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的四個基因，其不存在于真核細(xì)胞中。還以不同濃度加入，以確保過程對于低、中和高豐度轉(zhuǎn)錄本有效。在陣列的最終分析中，這些基因的強(qiáng)度讀數(shù)應(yīng)與它們的初始濃度成線性關(guān)系。在雜交前向片段化cRNA加入一組雜交對照。這些也以一定濃度范圍加入，確保雜交和信號強(qiáng)度成線性關(guān)系。一些對照來自大腸桿菌，并且還有一個對照來自Pi噬菌體。最后，還向雜交混合物中加入生物素化B2寡核苷酸。這些可以以交錯的方式結(jié)合在陣列外部附近，允許自動對其格線來鑒別探針組。如前所述(Rossel等(2007)，ThePlantCell,10.1105/tpc.1106.045898)進(jìn)行分析，包括MAS5歸一化，統(tǒng)計學(xué)分析和錯誤發(fā)現(xiàn)改正率。形態(tài)和生理學(xué)測量葉片測量使用訂制的熱電偶干濕計測量總水勢(Morgan，(1991)，AustralianJournalofPlantPhysiology，18，249-257)。將葉盤在22°C置于平衡室中4小時。將珀爾帖冷卻電流通過熱電偶并在微伏計(HR33DewPoint,Wescor,www.wescor.com/environmental)中根據(jù)指針的偏向讀出電動勢(emf)。通過將emf插入標(biāo)準(zhǔn)曲線而計算葉片水勢(MPa)。使用壓力盤設(shè)備測定土壤水勢(Klute(1986),MethodsofSoilAnalysis,Part!,PhysicalandMineralogicalMethods-AgronomyMonographno.9(Klute,A.，ed.Madison,WI,USAAmericanSocietyofAgronomy-SoilScienceSocietyofAmerica，pp.635-662)0還對葉片樣品進(jìn)行了多種生理學(xué)測量。記錄葉片的厚度和表面積。在早期實(shí)驗中，通過記錄鮮重，在紙袋中在60°C干燥3天，然后記錄干重，從而測量葉片樣品的相對水含量。然后使用下式計算它們的相對水含量(RWC)RffC(%)=(Fff-Dff)/Fff在后期實(shí)驗中，從相同的植物切下蓮座葉，記錄鮮重(Fw)并在4°C在水中黑暗培養(yǎng)至少4小時。印跡葉片并測定膨脹重量(Dw)。如(Jones,(2007),JournalofExperimentalBotany,58,119-130)計算相對水含量RffC=(Fw-Dw)/(Tw-Dw)氣體交換在白晝光照生長12小時的植物上進(jìn)行氣體交換測定，促進(jìn)生長并因此得到較大的葉片。唯一的例外是在干旱實(shí)驗中的植物，其在白晝生長16小時。用Li-6400(Li-Cor，Lincoln,NE,USA)，按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行氣體交換。這個設(shè)備使葉片附著于植物上，植物固定在腔室中，并測定多個參數(shù)。在腔室中，可以控制光強(qiáng)度、波譜、溫度、濕度和C02濃度。通過比較進(jìn)入腔室的和離開腔室的C02和水蒸氣量，可以推斷光合作用的量和氣孔的通透性。通過改變條件如光強(qiáng)度和C02濃度，我們能看到氣孔如何通過安排葉片的平均導(dǎo)度而作出響應(yīng)。腔室為2cm2，所以如果擬南芥葉片不完全覆蓋這個區(qū)域，則導(dǎo)度將針對腔室內(nèi)部的葉片區(qū)域而調(diào)整。高效液相色譜(HPLC)通過HPLC分析葉片材料的類胡蘿卜素譜?？偠灾?，在500yL丙酮/乙酸乙酯的60/40(體積百分比)混合物中研磨葉片材料。用400yLdH20稀釋，并在臺式離心機(jī)中以最大速度離心3分鐘。分級提取類胡蘿卜素，并如(Pogson，B.J.，Niyogi，K.K.，Bjorkman,0.禾口DelIaPerma，D.(1998),"AlteredxanthophyllscompositionsadverselyaffectchlorophyllaccumulationandnonphotochemicalquenchinginArabidopsismutants，，，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9513324-13329)所述使用AgilentHPLC和光電二極管陣列檢測器分析。通過與標(biāo)準(zhǔn)品比較波譜和保留時間而鑒別類胡蘿卜素，并使用極性消光系數(shù)記錄峰面積用于定量。C-13測量葉片組織中13C的量可以指示植物生命過程中的平均氣孔大小，因為當(dāng)氣孔打開時，將更傾向于12C而不是13C。稱重葉片樣品，得到鮮重，并于60°C在紙袋中干燥3天。然后使用研缽和杵研磨干燥樣品，并使用粉末測定樣品中12C對13C的比例。葉綠素含量通過測定光吸收而測量總?cè)~綠素含量，其中在647nm處測量葉綠素a，在663nm處測量葉綠素b。為了提取葉綠素，用滾珠和700μL提取緩沖液(80%丙酮，2.5mM磷酸鈉緩沖液pH7.8)在組織研磨儀中研磨10-20μg葉片組織。然后在臺式離心機(jī)中以最大速度將樣品離心5分鐘。然后在647nm、663nm和750nm處測量提取物的吸收值。在750nm處的吸收是背景吸收，因此從647nm和663nm處的吸收值減去背景吸收值。為了計算總?cè)~綠素含量，使用下述等式總?cè)~綠素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>花青素含量由530nm處的吸收值測定總花青素含量。在組織研磨儀中使用滾珠在300μL酸化的乙醇(1%HC1)中研磨約30mg組織。為了提取花青素，加入250yL氯仿和200yLMilliQH2O并漩渦震蕩。然后在臺式離心機(jī)中以最大速度將混合物離心5分鐘。然后去除200yL水相并在530nm和657nm處的吸收值。使用96孔板在讀板儀中或在單獨(dú)的比色杯中測定吸收值。然后通過從530nm處的吸收值減去樣品霧化產(chǎn)生的吸收值(657nm處)而計算花青素的吸收值。通過下述等式測定花青素的濃度C=A/εLX體積/1000XMWX1/重量XDX106其中C是濃度(μg/g)；A是吸收值；ε為269000，對于最豐富的花青素即矢車菊素-3-葡萄糖苷是常數(shù)；L是比色杯的通路長度；體積是提取物的總體積(mL)；麗是449，矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量；重量是初始的樣品重量(g)；并且D是稀釋因子(如果使用的話)?？箟难釋?shí)驗測定冷凍葉片組織的抗壞血酸含量和抗壞血酸池的氧化還原狀態(tài)。使用研缽和杵在液氮中研磨組織，然后稱出約50mg粉末放在冷凍的1.5mLEppendorf管中。加入四倍體積的提取緩沖液(2%w/v偏磷酸的milliQH2O溶液；SigmaUltra，SigmaAldrich,St.Louis,MT,USA)，并將樣品漩渦震蕩以徹底混合。然后在臺式離心機(jī)中以最大速度(16.Ixg)將樣品在4°C離心4分鐘。然后向485μL實(shí)驗緩沖液(67.5mMKH2PO4,32.9mMK2HPO4,1.27mMEDTA)中加入50μL提取物，并輕拍以混合。然后通過在265nm和415nm處的吸收值測定還原的抗壞血酸含量。然后通過加入33.3U抗壞血酸氧化酶的實(shí)驗緩沖液(5μL6.67υ/μL,CalzymeLaboratories,SanLuisObispo,CA,USA)WMMW^Mi^M.酸池，并測定吸收值。用5yL0.2M二硫蘇糖醇的實(shí)驗緩沖液溶液將另一個樣品還原20分鐘，并測量吸收值。使用合適的空白。還計算了提取物的總體積。為了確定存在的抗壞血酸的量，將265nm處的吸收值針對背景吸收和在415nm處的吸收值歸一化。這樣得到的抗壞血酸濃度能用來計算mg/100gFW組織?？梢杂贸跏紭悠窛舛葴p去氧化的樣品濃度計算還原的抗壞血酸池的量?？梢杂眠€原的樣品濃度減去氧化的樣品濃度測量存在的抗壞血酸的總量。氧自由基吸收能力(ORAC)實(shí)驗ORAC實(shí)驗測量物質(zhì)的抗氧化能力，并且廣泛用于確定食品的抗氧化能力。對于擬南芥，測試植物材料的提取物。這個提取物可以是膜結(jié)合的；來自質(zhì)膜、葉綠體類囊體和其它內(nèi)膜上；或者可溶；來自胞液、液泡、葉綠體氣孔等。實(shí)驗測量抗氧化敏感熒光分子藻紅蛋白(R-PE;Sigma)的熒光。向R-PE加入自由基產(chǎn)生劑AAPH(Sapphire，BioScience)，結(jié)果使熒光緩慢下降。然后加入植物提取物，或者降低下降速率，或者增加下降速率，依賴于是否分別具有更大的抗氧化能力或氧化能力?？寡趸瘎㏕r0I0x(Fluka)用作標(biāo)準(zhǔn)，替代植物提取物。Trolox是維生素E衍生物。然后可以通過比較每條曲線的面積而以微摩爾Trolox當(dāng)量/g鮮重組織將提取物的抗氧化能力定量。為了產(chǎn)生提取物，將20_100mg成熟但未開始衰老的葉片在液氮中冷凍，并在預(yù)先稱重的Eppendorf管中測定它們的鮮重。然后將冷凍的組織研磨成細(xì)粉，并重新懸浮于40(^1^無菌時1110H2O中。在臺式離心機(jī)中以最大速度在4°C離心30分鐘，使不溶于水的材料成球。去除上清液并用PBS(磷酸緩沖鹽；75mM，pH7.0)中稀釋至濃度為IOmg初始鮮重/mL。對于脂溶性提取物，在dH20中洗滌上述小球兩次，然后重新懸浮于400μL丙酮中。然后在臺式離心機(jī)中以最大速度在室溫離心10分鐘使固體材料成球。去除上清液并用PBS稀釋至濃度為IOmg鮮重/mL。對于實(shí)驗本身，使用Eclipse分光光度計(Cary)，其能使用小攪拌棒在比色杯中混合樣品，并且能同時測定四個樣品的熒光。因此可以同時運(yùn)行空白、標(biāo)準(zhǔn)和兩個樣品。這些由下述組成1.空白-2738μL3.38mg/LR-PE+150μLlXPBS+150μL320mMAAPH2.標(biāo)準(zhǔn)-2738μL3.38mg/LR-PE+150yL20μMTrolox+δθμL320mMAAPH3.樣品-2738μL3.38mg/LR-PEPBS+150μL樣品+150μL320mMAAPH首先，向攪拌的比色杯加入R-PE和樣品/Trolox/PBS，并將熒光穩(wěn)定在800超過大約20分鐘。然后向所有比色杯快速加入AAPH并測定熒光強(qiáng)度的下降直至到達(dá)零。將每條曲線下的面積積分，針對稀釋因子調(diào)整并計算抗氧化能力。ABA測量使用基于PhytodetekEliza的實(shí)驗(Agdia，Elkhart,Indiana,USA)測量葉片中的ABA含量。對于ABA提取物，富集約IOOmg葉片組織，并立即在液氮中冷凍。使用Qiagen組織研磨儀和滾珠將組織研磨成細(xì)粉。將冷凍的粉末懸浮于ImL提取溶液(80%HPLC級甲醇，100mg/L丁羥甲苯，500mg/L檸檬酸一水合物)中，然后在暗處在4。C旋轉(zhuǎn)24小時。然后在IOOOXg將樣品離心20分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。將上清液在暗處使用SpeediVac以中熱去除甲醇，干燥至約50μL。然后用TBS緩沖液(3.03g/LTris堿，5.84g/L氯化鈉，0.2g/L七水合硫酸鎂，0.2g/L疊氮化鈉，pH7.5)將剩余的液體稀釋至lmL。使用每個樣品的1100的TBS緩沖液稀釋液進(jìn)行實(shí)驗。按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行實(shí)驗。在讀板儀中在405nm處讀板。試驗了很多不同的提取操作規(guī)程，包括在重新懸浮前徹底干燥樣品，過濾提取物和離心提取物。還試驗了20、100和200mg的組織重量和110和1100的稀釋度。成像掃描電子顯微鏡^tDr.ChengHuang,ANUElectronMicroscopyUnit白勺禾呈。使用冷凍掃描電子顯微鏡將葉側(cè)表面成像。概述之，將小片成熟葉片用組織冷凍培養(yǎng)基和碳糊的混合物固定粘附，幫助導(dǎo)電。然后在真空下將樣品在液氮中冷凍，以快速冷凍并防止形成水晶體。然后在真空中將樣品加熱至-90°C至腐蝕，即除去樣品表面的水晶體。然后使樣品回到_160°C，之后包被金顆粒。然后在CambridgeS360(SEM；1987；Leica/Cambridge,Wetzlar,Germany)中將樣品成像。使用相同的過程查看花苞和成熟葉片的橫截面。然而這些樣品冷凍后斷裂。概述之，一旦固定并在真空中冷凍，敲打樣品頂部，使樣品斷裂并露出橫截面。透射式電子顯微鏡固定葉片樣品將小片成熟葉片嵌入樹脂中，用電子顯微鏡觀察葉片橫截面。首先用由0.IMcacolydehyde,4%甲醛和2.5%戊二醛組成的緩沖液在弱真空中將3mmX3mm的樣品洗滌2小時。然后去除緩沖液并用0.IMcacolydehyde將樣品洗滌三次共15分鐘。然后用0.IMoacicacid和0.05Mcacolydehyde緩沖液將樣品固定90分鐘。然后用水洗滌樣品三次共15分鐘。然后使樣品通過甲醇梯度，開始為70%甲醇，然后通過80%，90%，95%和三批100%甲醇。每次洗滌保持至少15分鐘。然后用100%丙酮洗滌樣品15分鐘以替代甲醇。然后使樣品接觸水平不斷升高的樹脂(環(huán)氧樹脂醛)中，所述樹脂用丙酮稀釋。首先為1/3樹脂2/3丙酮，然后是1/2樹脂1/2丙酮，然后2/3樹脂1/3丙酮。每次至少30分鐘，并且旋轉(zhuǎn)以混合。然后使樣品接觸純樹脂三次，超過2小時，去除任何酮。然后將樣品和新樹脂載于樣品模子中，在60°C過夜烘焙。切片和染色將嵌入的葉片材料切成薄片進(jìn)行TEM并使用UltracutsUltramicrotome(Reichert,Depew,NY,USA)光學(xué)顯微鏡觀察。制作玻璃刀將切片切下放在水上。在挑取至標(biāo)本支撐格上之前用熱使切片變平。然后將樣品過夜放置干燥，然后在暗處用6%(體積百分比)乙酸鈾酰的水溶液染色20分鐘。用dH20沖洗樣品幾次，然后在檸檬酸鉛中染色10分鐘。在干燥前通過用dH20沖洗而去除染料。成像使用附著于SISMegaviewIIIWidefieldCCD照相機(jī)(1300X1024像素，12字節(jié)；SoftImagingSystemsCorporations,Lakewood,CO,USA)的HitachiH7100FA(125kVTEM；1995；Tokyo,Japan)攝取圖像。光學(xué)顯微鏡在LilyShen，ANUElectronMicroscopyUnit的幫助下進(jìn)行過程。用ultramicrotome切開的葉片橫截面在玻片上干燥并用甲苯胺藍(lán)染色，然后用dH20沖洗。使用配備SPOTCCD照相機(jī)(1300X1240,36字節(jié)色彩；SpotImagesCorporation,Chantilly,VA,USA)的ZeissAxioskop(CarlZeisslnc.,Oberkochen,Germany)從下面獲得固定玻片狹縫的圖像。然后用SPOT高級軟件處理圖像。熒光素酶成像使用冷CCD照相機(jī)在體內(nèi)檢測轉(zhuǎn)基因植物的熒光素酶活性。用0.5mM熒光素(Biosynth，Switzerland)噴灌植物，所述熒光素為水溶液，并且包含幾滴Tween-80(LaboratorySupply，Australia)，均處理15分鐘并立即成像。將植物置于暗處幾分鐘直至葉綠體熒光下降，然后曝光2至10秒的不同時間。然后將這些整合，以增加圖像強(qiáng)度。使用冷CCD照相機(jī)(AndorTechnology,Japan)并使用ImageProPlus4.5.1(MediaCybernetics,USA)處理圖像。代謝物/溶質(zhì)的提取和分析提取約50mg鮮重的葉片組織并基本如Roessner-Tunali等(2003)，PlantPhysiology,133:84_99所述通過GC-MS分析。概述之，在液氮中將組織冷凍，然后在Retsch球磨中以15次振動/秒鐘研磨3分鐘。然后在70°C用0.5mL85%(體積百分比)Me0H/H20提取組織粉末(約50mg)15分鐘，所述提取液中包含0.2mg/mL核糖醇作為內(nèi)標(biāo)。然后通過在20，OOOg離心10分鐘而使不溶材料成球。然后在真空下將100μL上清液等分試樣干燥，并通過用20μL20mg/mL鹽酸甲氧胺的無水吡啶溶液通過甲氧化而衍生干燥的代謝物提取物(30°C，90分鐘)。為了將包含活性氫的活性功能團(tuán)轉(zhuǎn)化成它們的三甲基硅炕基(TMS)衍生物，向反應(yīng)混合物加入30μLMSTFA，并在37。C反應(yīng)30分鐘。然后將反應(yīng)平衡至少4小時，之后進(jìn)行GC-MS分析。向GC-MS中注入1μL，并且使用45分鐘溫度程序在配備IOm整合保護(hù)柱的30mVarianFactorFour5msGC柱上分離分析物。用從40至600m/ζ的掃描范圍中，以全掃描模式獲得四極柱-MS數(shù)據(jù)。通過使用免費(fèi)提供的AMDIS軟件自動去卷積和整合峰，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所述軟件可以與真正的質(zhì)譜和保留指數(shù)的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫相競爭。使用定制的PHP腳本自動處理AMDIS批次報告并在MicrosoftExcel中可視化，從而進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實(shí)施例2-結(jié)果在EMS誘變擬南芥種子后，鑒別了APX2=LUC表達(dá)改變的幾株突變體，包括APX2LUC表達(dá)增加的突變體alx8。三株植物表現(xiàn)出抗旱性增加-保水9天后，alx8突變體的葉片保持膨脹、綠色并且有活力，而野生型葉片已枯萎死亡(參見圖7)。發(fā)現(xiàn)ABA水平在alx8中更高，盡管在相同時間，ABA-依賴和ABA-無關(guān)途徑中的組分都上調(diào)了(Rossel，J.B.,P.B.Walterφ(2006),Plant,CellandEnvironment29(2):269_281)。例如高光響應(yīng)基因，ZATlO和APX2，在alx8中均上調(diào)。然而，認(rèn)為ZAT10存在于ABA-無關(guān)途徑中(Zhang,J.Ζ.等(2004),"FromLaboratorytoField.UsingInformationfromArabidopsistoEngineerSalt,Cold,andDroughtToleranceinCrops",PlantPhysiol.135(2):615_621)，而APX2為ABA依賴的(Rossel等，2006)。脅迫抗性基因的上調(diào)與先前的fryl突變體一致，盡管每個突變體中上調(diào)的脅迫抗性基因不同，例如RD29A4在fryl-Ι中上調(diào)(Xiong,L.Μ.等(2001),"FIERY1encodinganinositolpolyphosphate1-phosphataseisanegativeregulatorofabscisicacidandstresssignalinginArabidopsis"Genes&Development15(15):1971_1984)，但是在alx8中則沒有(Rossel等，2006)。相似地，在alx8中觀察到的脅迫抗性提高是新線索。alx8還具有不尋常的萵筍樣葉形。Fl和F2植物的研究表明，APX2:LUC表達(dá)增加和其它脅迫基因上調(diào)，抗旱性和葉形改變共分離。alx8是SALl中的點(diǎn)突變通過定位克隆和測序鑒別alx8點(diǎn)突變的位置。通過將Col_0背景中的alx8野生型Landsbergerecta雜交，產(chǎn)生定位群體。Fl的葉形、發(fā)育和APX2表達(dá)為野生型(未給出數(shù)據(jù))，證明為隱性突變。Fl個體自體繁殖，并且將分離的F2代播種在土壤上。通過葉形從F2代鑒別alx8突變均一的個體，其表現(xiàn)為與抗旱性分離并且APX2表達(dá)增加(Rossel等，2006)。用400個突變F2個體，用遍布與擬南芥基因組中的22條引物進(jìn)行第一次通過定位。這說明突變與染色體5的下半部相關(guān)。在這個區(qū)域用更多的標(biāo)記進(jìn)行深入的連接分析，得到617kb的目的區(qū)域。用617kb區(qū)域側(cè)翼的兩個標(biāo)記物MUB3和匪19，對約4000個F2個體進(jìn)行精確定位。為了確認(rèn)alx8突變的位置，使用SALl基因和啟動子的野生型拷貝補(bǔ)充突變體表型。兩個確認(rèn)的單獨(dú)alx8轉(zhuǎn)化體均具有野生型葉形和發(fā)育。互補(bǔ)的alx8的后代與alx8突變體表型有明顯區(qū)別，并且表現(xiàn)為正常的野生型葉形(參見圖2)。這確認(rèn)了SALl中的突變的確負(fù)責(zé)突變體表型。還用這個構(gòu)建體轉(zhuǎn)化野生型植物，但是葉形、APX2表達(dá)或發(fā)育沒有變化。alx8基因和2kb啟動子的測序表明在At5g63980.1基因組序列(TAIR序列4010730406(2007年4月17日)，登錄號NM_125794.4；SEQIDNO1；圖3)的第1226個堿基對存在鳥嘌呤到腺嘌呤的單個核苷酸多態(tài)性。這在編碼序列(TAIR登錄號4010745380(2007年8月16日)；SEQIDNO:2，圖4)的第217個氨基酸處產(chǎn)生了甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸變化。通過對多個突變植物的啟動子和基因組序列的進(jìn)一步測序，確認(rèn)這個突變?yōu)镾ALl中的唯一突變。還通過使用衍生的裂解多態(tài)序列(dCAPS)標(biāo)記物，在四代逆交中篩選突變，確認(rèn)突變體繼承葉形(參見圖1A)。即，植物中沒有其它突變導(dǎo)致突變體表型。先前已鑒別了多個SALl中的突變體，包括溫度敏感突變、滲透壓脅迫調(diào)節(jié)基因表達(dá)2的高表達(dá)(hos2；Xiong等，2004)和firey1突變體(fryl；Xiong等，2001)。fryl-1突變導(dǎo)致第341個氨基酸從色氨酸變?yōu)榻K止密碼子，產(chǎn)生缺失α5螺旋的截短蛋白質(zhì)，所述螺旋為酶活性所必需的(Xiong等，2001)。使用針對酵母相似物HAL2的已知結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬蛋白質(zhì)建模，將alx8突變定位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的保守β-折疊。這個域沒有已知的功能。Salk_020882突變體在alx8突變體的基因分型過程中，對重組體的進(jìn)一步基因分型和表型分型使目的區(qū)域縮小至BAC克隆MBM17和七個基因。為了確定alx8表型，針對這些基因訂購了很多T-DNA插入系。一個系，SALK_020882，模擬alx8葉形改變和發(fā)育延遲的表型(參見圖10)。這個系在AT5G63980基因中包含插入，已知為SALl(FRY1/H0S2)。為了確認(rèn)等位性，在alx8和SALK_020882之間雜交。所有后代都具有和兩個親本相同的葉形變化和同樣延遲的發(fā)育，表明兩個突變體為等位的。還發(fā)現(xiàn)SALK_020882植物(本文研究了兩個特定系，稱為salkl和salk2)比Col-O野生型植物更能耐受干旱(圖12和15)。這些突變體在獲得自擬南芥生物資源中心(ABRC)的Col-O生態(tài)型中包含T-DNA插入系。同源植物具有改變的卷心菜樣葉形，如alx8(參見圖10)，并且具有卡那霉素抗性。突變與alx8是等位的，并且這些突變體表現(xiàn)出抗旱性(參見圖11、12和15)。Northern印跡表明與Col-O野生型相比，在SALK_020882系中仍然存在SALlmRNA，但是存在多個拼接變體，并且alx8變體只有一個。由擬南芥信息資源(TAIR)給出的插入位點(diǎn)如圖9A所示。通過從T-DNA插入的LB單次傳遞測序而建立。給出了互補(bǔ)序列，即朝向基因的5’末端。為了確認(rèn)插入的位置，從來自一株植物的DNA上插入的LB進(jìn)行TailPCR。這導(dǎo)致如圖9B所示的插入位點(diǎn)。由兩側(cè)獲得的序列表明可能發(fā)生雙插入。獲得的序列還表明在插入位點(diǎn)附近缺失Ilbp(參見圖9B，與圖9A相比較)。在alx8和fryl-Ι中不存在SALl蛋白質(zhì)由融合至多組氨酸標(biāo)簽泛素而為野生型SALl和突變的ALX8產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。在大腸桿菌中成功地產(chǎn)生兩個融合蛋白質(zhì)，并且它們計算所得質(zhì)量(約52kD)對應(yīng)于氨基酸序列加14kD標(biāo)簽的期望大小(未給出數(shù)據(jù))。盡管嘗試了很多不同的誘導(dǎo)條件，但是只有SALl(野生型)融合基因成功地從可溶組分中純化得到。這個蛋白質(zhì)還表現(xiàn)出與先前報道相似的PAP磷酸酶活性(16.6士SE3.65微摩爾PAPPmg蛋白質(zhì)，η=3)(Xiong等，2001)。進(jìn)行Western印跡分析，確定野生型和突變植物中SALl蛋白質(zhì)的豐度。在裂解使多肽具有基于氨基酸序列的期望分子量(37kD)的標(biāo)簽后，回收真實(shí)的SALl重組蛋白質(zhì)(圖11A，泳道10)。使用這個蛋白質(zhì)增加多克隆抗體，其針對SALl免疫親和純化。單一的37kD條帶，其大小對應(yīng)于重組蛋白質(zhì)，在野生型植物的總可溶蛋白質(zhì)提取物中檢測得到，但是在突變體中則檢測不到(圖11A)。此外，SALl蛋白質(zhì)不存在于alx8的總蛋白質(zhì)提取物中，但是存在于野生型Col-O中(圖11B)。alx8、salk_020882和fryl-1抗干旱fryl-1突變體是突變擬南芥系，其在正常條件下和低溫、鹽和滲透壓和ABA處理后，脅迫抗性基因RD29A的表達(dá)增加。發(fā)現(xiàn)這是由于SALl蛋白質(zhì)(At5g63980)的第六個外顯子中的終止密碼子中產(chǎn)生點(diǎn)突變。這產(chǎn)生了不包含保守α-螺旋的截短型蛋白質(zhì)，其中所述螺旋包含金屬離子和磷酸鹽的協(xié)調(diào)以及親核水活化所需的WD-X11-GG基序。結(jié)果蛋白質(zhì)對于IP3或PAP無活性。已報道fryl-Ι突變體對于鹽、低溫和滲透壓的脅迫敏感增加(XiongL.M.等，(2001)，Genes&Development15(15)1971-1984)。這個突變體還與alx8和salk_020882突變體顯示的葉形變化相似。在本研究中，發(fā)現(xiàn)fryl-Ι植物同alx8和salk_020882突變體相似，在相似的發(fā)育階段(參見圖7)或?qū)嶟g(圖8A)接受干旱處理時，與野生型植物比較，具有相似的抗旱性。圖8A顯示，當(dāng)Col-O和C24野生型植物在脫水21天后表現(xiàn)出萎黃病并且葉片枯萎時，alx8和fryl-Ι植物在25天后僅表現(xiàn)出枯萎的跡象，并且圖15A顯示，alx8、salk_020882和fryl-Ι植物在18天后未出現(xiàn)枯萎或變色跡象，但是野生型植物(Col-O和Col-24植物)在18天后表現(xiàn)出枯萎和變色。如圖15A所示，圖中表示了18天脫水，然后再重新澆灌3天的結(jié)果，alx8、salk_020882和fryl-1植物在3天內(nèi)恢復(fù)活力，同時Col-O和C24野生型即使有恢復(fù)跡象也很少，大多數(shù)葉片變白并枯萎。這種模式在超過10次不同的實(shí)驗中重現(xiàn)，每次實(shí)驗至少有四株植物。alx8、salk_020882和fryl-1和抗旱性除了alx8和fryl_l丟失功能等位基因(并且推測salk_020882丟失功能等位基因)之外，已經(jīng)描述了fryl-Ι的幼苗期對干旱敏感(Xiong等，2001)，同時在土壤上生長的成熟alx8植物可耐受干旱(Rossel等，2006)，如salk_020882植物一樣。對fryl-Ι的描述基于從1周齡幼苗的離子泄漏向包含PEG溶液中浸入增加。然而未見到fryl-Ι和C24野生型的獨(dú)立嫩枝的蒸發(fā)率有差別，表明氣孔控制沒有變化。為了研究fryl-Ι和alx8在這方面的差別，通過水分損失而監(jiān)控alx8、fryl-1、Col-O野生型和C24野生型獨(dú)立蓮座的蒸發(fā)。在初始階段或二級階段，四種類型之間均未看到顯著差異，表明表皮相似。然后通過成熟植物保水28天而測試fryl-Ι突變體基于土壤的抗旱性。在多次實(shí)驗中，fryl-Ι比C24野生型更能耐受干旱(參見，例如，圖7、8A和15A)。為了確保兩組植物都接觸相同的脅迫條件，通過將盆重量計算為初始盆重量的百分比而近似計算土壤的相對水含量。在實(shí)驗過程中，fryl-Ι和C24野生型植物之間土壤水含量沒有顯著差異(圖8B)。將這轉(zhuǎn)化為土壤水勢，并且土壤水勢之間仍然沒有顯著差異。類似地，在多次實(shí)驗中未見到alx8或salk-020882植物和Col-O野生型的土壤水含量之間有顯著差異(圖8B、15B和21C)。為了確保和alx8的耐受結(jié)果不僅僅是發(fā)育延遲或尺寸更小的結(jié)果，測試了在多個發(fā)育階段的alx8的抗旱性。在2、4、6和8周齡，alx8比Col-O野生型更耐干旱。當(dāng)兩種植物類型都具有六片葉子；都是成熟植物時；和當(dāng)兩者處于相同發(fā)育階段，剛剛開始結(jié)花苞時，alx8也比Col-O野生型更耐干旱(圖21)。當(dāng)植物剛剛開始開花時(圖21A)，植物基本具有相同的蓮座區(qū)域和大小，但是在保水9天后，alx8和salk-020882比野生型Col-O更膨脹并呈現(xiàn)綠色，盡管水損失率相似(圖21C)。類似地，生長至發(fā)育的相同成熟綠色階段的alx8和fryl-Ι植物更耐干旱，在這個階段野生型植物為8周齡，alx8植物為4周齡(圖21B)。測定四種基因型的獨(dú)立蓮座水損失，以確定葉片和蓮座形狀是否會改變損失率或水損失，或者它們是否有區(qū)別地調(diào)節(jié)通過氣孔控制的水量(水損失的初始階段)和蒸發(fā)(水損失的第二階段)。在任何階段，四系植物之間未見到顯著差異(圖21E)。因此，葉形和蓮座形狀的改變不影響水從獨(dú)立植物損失的速率。最后，評價相同年齡植物的抗旱性，其中將1株Col-O植物每盆與2株alx8植物每盆比較，使植物大小之間的差異相等，并且alx8比Col-O更耐干旱，可保水。這表明不是alx8的發(fā)育延遲或土壤水含量的差異導(dǎo)致alx8的抗旱性。此外，從切下蓮座蒸發(fā)不總是與土壤中生長的植物的抗旱性相關(guān)。為了將alx8植物的耐干旱程度定量，使用葉綠素?zé)晒鉁y定植物活力。alx8植物表現(xiàn)出的干旱存活時間比Col-O長40-50%(未給出數(shù)據(jù))。在不同的實(shí)驗中，在無脅迫條件下和干旱12天后測定葉片相對水含量(RWC)(圖16A)。如同期望的，alx8的葉片RWC在干旱期間未顯著改變，而野生型的葉片RWC顯著下降。針對相同的植物，使用熱電偶濕度計計算葉片水勢，或者用水的化學(xué)勢除以偏摩爾體積(圖16B)。在干旱條件下生長的psychrometer植物的水勢更高，與保持的膨脹性相對應(yīng)，而水脅迫的野生型植物的葉片水勢顯著降低。最后，針對fryl-Ι和alx8突變體和它們各自野生型(C24和Col-O)測定獨(dú)立蓮座的水損失，以確定是否差異性調(diào)節(jié)通過氣孔控制的水量，即初始階段水損失，或蒸發(fā)，即第二階段水損失。在任何階段均未見到顯著的差異(數(shù)據(jù)未給出)。SALl是高度保守的蛋白質(zhì)SALl在所有生物體之間高度保守。因此同源性存在于所有作物種類中，這些作物種類的基本序列信息可獲得。理想的是，SALl及其同源物存在于所有植物種類中。這可通過植物中已測序的同源蛋白質(zhì)的圖5中的比對而闡釋。搜索其它植物種類的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)，查找SALlmRNA，并且發(fā)現(xiàn)了很多同源序列(圖6A-6C)。擬南芥基因組中也存在幾個同SALl同源的基因。alx8突變的分子效應(yīng)在fryl-Ι和alx8中測定了13個脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)。這些基因中只有有限數(shù)量的基因在正常條件下在突變體中的表達(dá)增加fryl-l中的C0R47；和alx8中的APX2、RAP2.6、ZAT10、ZAT12和DREB2A。RD29A在fryl_l中的表達(dá)增加，但是在alx8中沒有增加。在正常條件下，在fryl-Ι中，脅迫響應(yīng)基因HSP70、KIN1、C0R15A和ADH基本未上調(diào)(Xiong等，2001)。類似地，在正常條件下，在alx8中，脅迫響應(yīng)基因sHSP、GST6和APXl基本未上調(diào)。這令人驚訝地在這些突變體中得到了IP3更高的組成水平，并且表明IP3信號傳導(dǎo)可以僅涉及部分脅迫響應(yīng)途徑。為了進(jìn)一步研究脅迫響應(yīng)途徑的上調(diào)，以及其它非脅迫相關(guān)途徑，通過微陣列測定了全局表達(dá)。在ATHIGeneChip(Affymetrix,SantaClara,Ca,USA)上定量的約24，000個基因產(chǎn)物中，相對于在Col-O野生型中的表達(dá)，1414個基因在alx8葉片組織中顯著上調(diào)超過2倍。1033個基因顯著下調(diào)超過2倍。在正常生長條件系，在fryl-Ι中，相對于C24野生型，1099個基因顯著上調(diào)，并且745個下調(diào)，超過2倍。這種對上調(diào)的偏向性符合SALl作為信號傳導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)節(jié)子的推測目的。alx8和fryl-Ι中表達(dá)變化之間的重疊令人驚訝地限于上調(diào)基因，兩個突變體之間僅有727個基因相同，在下調(diào)基因中，僅有395個相同。調(diào)節(jié)的這些差異不同于C24和Col-O野生型之間的差異。因此，這證明相似突變能在不同生態(tài)型中引起多大程度的不同表達(dá)模式。alx8中很多脅迫響應(yīng)基因上調(diào)，包括ABA-依賴型途徑中涉及的那些基因，例如-液泡膜水通道蛋白(TIP5；1)的上調(diào)，其通常由蔗糖、鹽和H2O2下調(diào)，但是由ABA上調(diào)；和-開花的負(fù)調(diào)節(jié)子C0NSTANS-LIKE9(C0L9)在alx8中高度上調(diào)。C0L9的過量表達(dá)導(dǎo)致CO和FTP的下調(diào)，和延遲開花，而T-DNA敲除使開花較早(Xiao-FeiCheng,Zeng-YuWang(2005),"OverexpressionofC0L9,aCONSTANS-LIKEgene,delaysfloweringbyreducingexpressionofCOandFTinArabidopsisthaiiana，，ThePlantJournal43(5)=758-768)。這個結(jié)果與在這些研究過程中的觀察相對應(yīng)，表明研究的SALl突變體中開花與野生型植物相比延遲了四到五周。圖15表示在2、3、5和8周齡時的alx8和其相應(yīng)的Col-O野生型植物。在&118中六乂2(倍數(shù)變化=9.3，？值=0.003)；ZATlO(倍數(shù)變化=5.00，ρ值=0.028)和RAP2.6(倍數(shù)變化=3.1，但是標(biāo)準(zhǔn)偏差較大)的表達(dá)增加。有趣的是，在alx8或fryl-Ι中，C0R47和RD29A的表達(dá)都沒有顯著增加。通過實(shí)時RT-PCR確認(rèn)了缺乏RD29A的誘導(dǎo)。因此可能是實(shí)驗操作過程中環(huán)境中生長或干擾的差異誘導(dǎo)了fryl-Ι中的這兩個基因。在水分充足條件下alx8中針對NCED3、GST6、APXl、RD29A和DREB2A的陣列中沒有任何變化，這與已發(fā)表的結(jié)果一致(Rossel等，2006)。alx8中很多脅迫響應(yīng)基因上調(diào)，包括轉(zhuǎn)錄因子如ZAT10、ZAT12、MYC2和HB6。上調(diào)的其它脅迫響應(yīng)因子包括幾個早期光誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，ELIP；水通道蛋白TIP5；1；脅迫信號激酶SnRK2.2；脅迫誘導(dǎo)蛋白質(zhì)，VSPl和VSP2；和抗氧化酶CSDl和CSD2。為了進(jìn)一步研究在alx8中組成型上調(diào)的途徑的類型，使用Genevestigator，將表達(dá)量上調(diào)超過25倍的基因與公共數(shù)據(jù)庫中保存的在其它陣列中的表達(dá)比較。除了alx8的ABA含量增加之外，alx8的表達(dá)模式和脅迫ABA之間沒有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。只有10%的基因也由ABA上調(diào)，數(shù)目與通常由ABA下調(diào)的數(shù)目相似。在任何激素處理之間沒有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。在alx8的表達(dá)模式和對非生物脅迫比如滲透、創(chuàng)傷、熱、氧化、低溫和鹽之間有一些關(guān)聯(lián)，但不強(qiáng)。alx8中百分之二十的上調(diào)基因為ABA誘導(dǎo)的，但是數(shù)目和由ABA下調(diào)的基因數(shù)目相似。相似地，其它激素處理之間沒有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，除了與茉莉酸處理之間存在輕微的關(guān)聯(lián)。SALl對氣孔的作用先前，alx8表現(xiàn)出相對于Col-O野生型在不同的光強(qiáng)度范圍具有較低的氣孔導(dǎo)度(Rossel等，2006)。這種降低可能由多個因素導(dǎo)致，包括植物的形態(tài)、生理和分子譜的變化。導(dǎo)度下降可能由于alx8氣孔的密度、大小和/或形態(tài)改變。因此用冷凍掃描電子顯微鏡(SEM)觀察氣孔。氣孔外觀正常，并且不像氣孔發(fā)育出現(xiàn)突變的其它突變體中見到的聚集現(xiàn)象。氣孔不是位于凹陷中，這會由于邊界層效應(yīng)而增加阻力，從而降低導(dǎo)度。alx8的大小與Col-O野生型中相似。使用SEM，計算葉側(cè)表面上的氣孔密度，發(fā)現(xiàn)在alx8中略高于Col-O野生型植物。與突變體如氣孔密度和分布l(ssdl；AT1G04110)相比，這種增加小得多，ssdl葉側(cè)氣孔密度提高2.5倍(Schluter等，2003)。此外，alx8和Col-O野生型中表皮細(xì)胞數(shù)目增加，導(dǎo)致出現(xiàn)相似的氣孔指數(shù)。這進(jìn)一步由不同實(shí)驗中生長的alx8和Col-O野生型植物中氣孔的表皮而確認(rèn)。此時Col-O野生型和alx8之間的氣孔密度沒有顯著差異。再次比較了兩種植物類型之間的氣孔指數(shù)。這里強(qiáng)調(diào)了氣孔指數(shù)作為氣孔數(shù)目的度量值在比較發(fā)育發(fā)生變化的植物組織中的作用。除了葉片具有相似年齡外，它們的擴(kuò)展階段可能不同，導(dǎo)致細(xì)胞密度更高。如果氣孔數(shù)目是alx8耐干旱性的因子，可以期望alx8比Col-O野生型的氣孔指數(shù)低。事實(shí)并非如此，并且因此氣孔的功能可能改變。通過降低氣孔開度也可以降低導(dǎo)度。使用碳-13歧視(discrimination)了解植物生命過程中平均氣孔開度是否有差異。當(dāng)氣孔打開并且氣體自由地在氣孔內(nèi)外交換時，由于RUBISC0的區(qū)別，植物優(yōu)先固定12CO2,而不是13CO2。然而當(dāng)氣孔關(guān)閉時，氣體路徑受限，并且植物被迫使用13CO2。因此可以使用植物中13CO2對12CO2的比例表明植物的平均氣孔導(dǎo)度。在正常生長條件下，發(fā)現(xiàn)在野生型和alx8之間的13CO2利用上沒有差異。這表明在正常生長條件下，野生型和alx8之間的平均氣孔開度可比。通過歷時九小時的葉片表皮剝落而測定氣孔開度，從而確認(rèn)了這一結(jié)果。同樣地，在這個時間段，alx8和Col-O野生型之間未見到開度有顯著差異。為了了解對于干旱的響應(yīng)，氣孔開度是否有任何顯著差異，對于已經(jīng)在干旱脅迫下20天的植物進(jìn)行了13CO2歧視研究。只富集了干旱處理過程中發(fā)育的組織。受干旱影響的植物的S13C高于對照植物，對照植物為Col-O野生型和alx8，表明氣孔開度降低。受干旱影響的alx8的δ13C未高于受干旱影響的Col-O野生型，表明在干旱過程中alx8的氣孔開度未減小。因此可以看出對于alx8，觀察到的導(dǎo)度減小是由于氣孔開度以外的因素引起的。葉形已經(jīng)確認(rèn)，形態(tài)變化，比如多汁、葉毛增加，能改變抗旱性。alx8的葉形改變成Col-O野生型植物的葉形。葉子更短、更圓，并且淺裂葉緣更多。葉片表面經(jīng)常有起伏，并且葉柄長度降低，得到萵筍樣外觀的蓮座。SALK_020882突變體的葉形與fryl_l突變體相似(參見，例如，圖7和8A)。葉片表明起伏度增加能增加邊界層效應(yīng)，減小蒸發(fā)。測量了葉片厚度，發(fā)現(xiàn)alx8中的葉片厚度顯著大于Col_0野生型植物(圖18A和B)。這個厚度意味著水蒸氣到達(dá)氣孔開放處的距離更長，并且可以抑制葉片的水分丟失。葉片厚度的增加還導(dǎo)致表面積對體積的比例下降，這可以降低表皮上的水分丟失。通過光學(xué)顯微鏡觀察的葉片橫截面也表明alx8中葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)有很多變化，包括無序的維管束、細(xì)胞形狀改變和葉綠粒更小(圖18B)。表皮是另一個水分從葉片損失的來源。然而與Col-O野生型相比，alx8中的表皮厚度或結(jié)構(gòu)沒有可見的差異。此外，相對于Col-O野生型，在alx8中的表皮合成基因如WAX2(At5g57800)、CUT1/CER6(Atlg68530)和CERl(Atlg02205)沒有顯著變化。盡管發(fā)育延遲并且由于葉片和蓮座形態(tài)的變化看起來更小，但是alx8植物和野生型通過八周的生長積累了相似的蓮座鮮重和干重(未給出數(shù)據(jù))。細(xì)胞形態(tài)和滲透勢通過透射式電子顯微鏡更近地觀察了Col-O野生型和alx8的葉綠粒，并且發(fā)現(xiàn)alx8葉綠粒缺乏淀粉顆粒。這種淀粉積累的抑制進(jìn)一步通過碘染色在alx8以及fryl_l中得到確認(rèn)(圖19)。植物通常在白晝在葉片中積累暫時性淀粉，并在夜間將其分解。如同期望的，野生型葉片在夜晚比早晨的淀粉多。相似地，alx8和fryl-Ι葉片在夜間比早晨積累更多的淀粉。然而，在水分充足的條件下，野生型植物中存在的量基本較少。淀粉的減少與alx8中β-淀粉酶，BMYl和ΒΜΥ8的表達(dá)增加有關(guān)。這些酶將暫時性淀粉水解成麥芽糖和β-限糊精，其可以增加植物細(xì)胞的胞內(nèi)滲透勢。通過GC-MS分析了alx8、fryl-l和它們各自的野生型在水分充足的生長條件下的代謝譜。所有四個系具有不同的譜，如由主成份分析(PCA)所表明的，C24和Col-O之間有一定程度的重疊(圖20)。兩種突變體由第一主成份(PCl；占總變異的47.2%)而明顯區(qū)別于它們各自的野生型，第一主成份代表由PCA可見的最大分類別。有趣的是，第二主成份(PC2;占總變異的25.1%)清晰地將alx8和fryl-1區(qū)別開來，而兩種野生型則沒有。在SALl突變體中，alx8和fryl-Ι中的多胺、腐胺的水平明顯增加(表2)。這與限速多胺生物合成基因精氨酸羧化酶ADC2表達(dá)增加(6.43倍)和可將亞精胺轉(zhuǎn)化成精胺的酶ACL5的表達(dá)下降(-3.90倍)有關(guān)。相對于Col-Ο，除了脯氨酸生物合成基因，吡咯啉-5-羧化還原酶增加(3.61倍)外，alx8中的脯氨酸豐度沒有顯著差異。在alx8和fryl_l中，大量糖的豐度有變化，包括果糖、半乳糖、葡萄糖纖維二糖和大量未知糖和糖衍生物的水平極大下降；和大量未知糖/糖衍生物的加大積累，所述未知糖/糖衍生物在野生型植物中的水平檢測不到或幾乎檢測不到(表2)。還令人吃驚的是，有機(jī)酸檸檬酸、異檸檬酸、延胡索酸和蘋果酸的極大下降和大量未知類別代謝物的極大增加，其中一些與吲哚相關(guān)化合物有特別的同源性(表2)。表2-SAL1突變體的特色代謝譜<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>給出了alx8和fryl-1共有的主要(最大的)代謝物差異的倍數(shù)差異和p_值(η=5)。根據(jù)質(zhì)譜與MST05質(zhì)譜庫中參照譜的相似性對未知代謝物(方括號中的內(nèi)容)進(jìn)行了注釋。為未知的代謝物給出了保留指數(shù)。RI=“保留指數(shù)”。討論alx8突變體的抗旱性表現(xiàn)出是由于在脅迫條件下蒸發(fā)的減少，導(dǎo)致葉片和土壤中相對水含量更高。然而，蒸發(fā)的減少似乎不是由于干旱誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉引起的。碳歧視和切下蓮座脫水實(shí)驗都表明在干旱條件下，與Col-O野生型相比，alx8中氣孔關(guān)閉較少。因此水分損失的減少是由于alx8中其它形態(tài)、生理或分子變化，或者它們的組合。alx8的結(jié)構(gòu)形態(tài)變化能引起干旱脅迫下水分損失的減少。葉片厚度增加和無序的維管束可以使水在植物中移動和水蒸氣在氣孔下的擴(kuò)散減慢。相似地，alx8的根形態(tài)發(fā)生變化，在水脅迫條件下改變水分?jǐn)z取和移動。除了缺乏對已知脅迫響應(yīng)基因的誘導(dǎo)之外，在alx8的代謝譜中仍然有很多變化，這些變化與脅迫響應(yīng)有關(guān)，包括多胺、海藻糖和甘油的增加。alx8和fryl_l中滲透壓保護(hù)劑的積累可能是導(dǎo)致它們的抗旱性的因素。alx8中的多胺，腐胺的水平比其相應(yīng)的野生型Col-O高15.2倍(ρ-值=0.008)。相應(yīng)地，alx8中多胺生物合成酶ADC2的表達(dá)更高，所述酶通常上調(diào)而響應(yīng)滲透壓脅迫(Perez-Amador，Μ.Α.等(2002),PlantPhysiology，130，1454-1463)。在多種耐干旱小麥和耐氧化脅迫的各種雜草，香絲草中已經(jīng)報道了組成型的高腐胺水平(Ye等，(1997),PlantPysiology,15,1443-1451)。先前，通過過表達(dá)生物合成基因而增加多胺水平已經(jīng)顯示出可誘導(dǎo)對于各種非生物脅迫的耐受性，包括干旱(Kur印a等，(1998),PlantCellPhysiology，39，987-992；Kasukabe等，(2004),PlantandCellPhysiology，45，712-722)。盡管腐胺在耐受性中的確切作用尚不確定，已經(jīng)報道可能的作用是直接或間接的抗氧化防御(Ye等，1997)和作為干旱過程中精胺和亞精胺合成的調(diào)控子，以全植物水平提供抗衰老作用，得到表型正常的才直·(Capellφ,(2004),ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA,101,9909-9914)。在alx8葉片組織中很多糖的水平也發(fā)生了改變，包括很多未鑒別的糖的大幅增加(表2)。這些變化與alx8的葉綠粒中暫時性淀粉的積累下降(圖19)負(fù)相關(guān)。糖在滲透脅迫響應(yīng)中可能具有重要作用，作為滲透壓保護(hù)劑，保護(hù)大分子和防止膜融合(Bartels和Sunkar，(2005),CriticalReviewsinPlantSciences，24，23-58)。因此，alx8葉片組織中糖組分的變化可能與其抗旱性有關(guān)。對干旱條件的預(yù)適應(yīng)和alx8的發(fā)育改變不影響植物在水分充足條件下的水分平衡。然而，這可以解釋alx8的暫時生長延遲，因為資源分配給脅迫抗性機(jī)制，不能進(jìn)入生長。這種影響是暫時性的，因為到發(fā)育后期，alx8和fryl-Ι的蓮座干重與其相應(yīng)的野生型相似。對于alx8和fryl_l突變體，在代謝物中觀察到的差異在正常生長條件下已經(jīng)存在，表明對干旱的預(yù)適應(yīng)。突變體的這種預(yù)適應(yīng)不影響植物在水分充足條件下的水分平衡。在葉片水勢或相對水含量上未見到差異。alx8和Col-O野生型之間在這些條件下還存在相似的氣孔開度，如碳歧視和表皮葉片剝落所示。因為在這些條件下alx8和Col_0野生型之間的光合作用速率相似，所以alx8的發(fā)育延遲可能是由于資源的重新分配和生長抑制途徑的活化，而不是資源匱乏。SALl中喪失功能的突變導(dǎo)致與野生型植物相比，在無脅迫生長條件下，>1000個基因上調(diào)和500-1000個基因下調(diào)。SALl作為脅迫和發(fā)育中的基因表達(dá)調(diào)控子的作用再次由其在翻譯后基因沉默中的負(fù)作用(Gy等，(2007),PlantCell,tpc.107.055319)和SALl突變體的形態(tài)和開花時間變化而得到證實(shí)。事實(shí)上，在alx8中受到差異調(diào)控的2447個基因中只有7.6%劃分為脅迫響應(yīng)基因(未給出數(shù)據(jù))，并且其中大部分都不受ABA的誘導(dǎo)。這表明不是所有的脅迫響應(yīng)途徑在無脅迫生長條件下在alx8中都是組成型活化的。例如，在無脅迫葉片中，APX2、RAP2.6、sHSP和DREB2A誘導(dǎo)倍數(shù)在2和20倍之間，但是高光脅迫(HL)導(dǎo)致相同基因的25至700倍誘導(dǎo)，證明調(diào)控這些基因的其它途徑為脅迫誘導(dǎo)型(Rossel等，2006)。第二，脫水響應(yīng)的RD22的表達(dá)由ABA上調(diào)(Yamaguchi-Shinozaki等，(1992)，PlantandCellPhysiology，33，217-224)，并且這種誘導(dǎo)部分依賴于轉(zhuǎn)錄因子MYC2，其過量表達(dá)時會導(dǎo)致RD22的組成型誘導(dǎo)(Abe等，(1997)，PlantCell，9，1859-1868；Abe等，(2003),PlantCell，15，63-78)。然而在alx8中，除了MYC2表達(dá)增加8.2倍之外，RD22的表達(dá)下調(diào)3.7倍。相似地，沒有ADHl或KIN2/COR6.6的顯著誘導(dǎo)，其已經(jīng)表現(xiàn)為ABA響應(yīng)型和受MYC2調(diào)節(jié)(Abe等，2003)。這表明為完全活化脅迫響應(yīng)，除了alx8和fryl中組成型活化的與ABA無關(guān)的途徑之外，還需要多個途徑之間的互相作用。在已知的脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子中，在無脅迫條件下alx8中一個小子集顯著上調(diào)，包括兩個鋅指轉(zhuǎn)錄因子，ZATlO和ZAT12。ZATlO和ZAT12都參與非生物脅迫響應(yīng)途徑比如干旱和高光(Sakamoto等，(2004)，PlantPhysiology，136，2734-2746;Davletova等，(2005),PlantPhysiology，139，847-856;Rossel等，(2007)，ThePlantCell,10.1105/tpc.1106.045898)。ZAT10的過量表達(dá)誘導(dǎo)的APX2表達(dá)，并且使HL中18%的基因上調(diào)(Rossel等，2007)。相應(yīng)地，alx8中24.6%的基因也由HL誘導(dǎo)上調(diào)，進(jìn)一步突出了干旱和HL脅迫響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)之間存在重疊。SALl在維管組織中的高水平表達(dá)(Xiong等，2001)，表明其在干旱脅迫過程中具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。這種定位和在維管束鞘所見到的H2O2生產(chǎn)與抗氧化酶表達(dá)的增加以應(yīng)對其它非生物脅迫如HL有關(guān)(Karpinski等，(1999),Science,284,654-657；Rossel等，2007)。此外，APX2和ZAT10表達(dá)主要集中在維管，這可以說明SALl在相似的ROS介導(dǎo)的響應(yīng)調(diào)控中的作用。干旱誘導(dǎo)ABA的增加，并且通常限速ABA生物合成酶NCED3和NCEDl表達(dá)相應(yīng)增加(Iuchi等，(2001)，PlantJournal，27，325-333)。然而這些基因在alx8中未上調(diào)，基因的下調(diào)也和ABA分解代謝無關(guān)，事實(shí)上分解代謝酶CYP707A1-4上調(diào)(未給出數(shù)據(jù))。因此，alx8中ABA含量的增加(Rossel等2006)未表現(xiàn)出受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。與野生型相比，fryl-Ι中大多數(shù)上調(diào)(66%)和下調(diào)(53%)基因在alx8中共表達(dá)。然而，alx8和fryl-Ι之間的基因表達(dá)和代謝譜有差異，它們都在相同的基因中發(fā)生功能喪失的突變，因此這個結(jié)果很有趣。C24和Col-O具有獨(dú)特盡管相似的代謝譜，并且因此生態(tài)型差異微妙地改變SALl的作用和其喪失對每個生態(tài)型的影響。在這些研究中另一個有趣的觀察結(jié)果是研究的SALl突變體相對于野生型植物的開花時間延遲，并且這與開花的負(fù)調(diào)控子C0NSTANS-LIKE9(C0L9)的強(qiáng)烈上調(diào)相關(guān)聯(lián)。這可以用于農(nóng)業(yè)的很多方面中，包括牧場植物開花延遲(并且因此，通常衰老)，產(chǎn)生生長期延長的植物，其可以獲得更高產(chǎn)量或者更大的部位(比如花、莖、葉、塊莖等)。增加植物中SALl的表達(dá)可以具有相反的作用。結(jié)論SALl突變體在長時間干旱后的存活率比野生型植物高40-50%，并且雖然發(fā)育發(fā)生了改變，但是完全成熟的植物中葉片和莖的生物量未變。不希望受到理論的束縛，我們假設(shè)SALl蛋白質(zhì)在調(diào)控形態(tài)、生理和分子變化的途徑中有負(fù)調(diào)控作用，其獲得導(dǎo)致脅迫網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)加強(qiáng)。結(jié)果增強(qiáng)了對干旱的耐受性而不是不做響應(yīng)。這可以由一定程度的預(yù)適應(yīng)說明，比如脅迫響應(yīng)基因如抗氧化APX2的組成型上調(diào)，滲透壓保護(hù)劑如多胺和糖的積累，和無脅迫條件下脫落酸的積累。因此，SALl表現(xiàn)出可負(fù)調(diào)節(jié)抗旱性并且因此，突變體在水脅迫下保持完全的膨脹和水勢。應(yīng)理解的是，盡管本文為闡述目的而描述了本發(fā)明的特定實(shí)施方式，但是在不偏離如下述權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出各種修正。權(quán)利要求用于獲得相對于野生型植物脅迫抗性提高的植物的方法，其包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SAL1或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對于野生型植物脅迫抗性提高的一個或多個植物。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過使所述一個或多個植物細(xì)胞受化學(xué)或物理誘變方法或插入突變方法如轉(zhuǎn)座子或T-DNA的作用而導(dǎo)入所述至少一個突變。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中通過重組方法導(dǎo)入所述至少一個突變。4.如權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述方法包括向SALl基因或其同源物中導(dǎo)入至少一個突變，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表達(dá)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其包括向所述一個或多個植物細(xì)胞中編碼SALl或其同源物的核苷酸序列中導(dǎo)入突變。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述突變包括一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO1的核苷酸731至745、1226、1518、1519和1690的區(qū)域中，或在SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處的一個或多個核苷酸的插入、缺失或替代。8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置1226處，或在SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處的由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述突變導(dǎo)致SEQIDNO2的位置217處發(fā)生由甘氨酸至天門冬氨酸的氨基酸變化。10.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO:1的位置734和735之間，或在SEQIDNO=I的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處插入一個或多個核苷酸。11.如權(quán)利要求5或6的方法，其中所述突變包括用一個或多個核苷酸替代SEQIDNO1的核苷酸735-745，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同的核苷酸。12.如權(quán)利要求5或6的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置1518和1519之間或包含位置1518和1519，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處插入一個或多個核苷酸。13.如權(quán)利要求10至12中任一項的方法，其中所述一個或多個插入或替代的核苷酸包括T-DNA插入。14.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置731處，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由胞嘧啶至胸腺嘧啶的突變。15.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO=I的位置736處，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。16.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變包括在SEQIDNO1的位置1690處，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置處由鳥嘌呤至腺嘌呤的突變。17.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述突變是SALl無效突變。18.如權(quán)利要求4所述的方法，其包括向所述一個或多個植物細(xì)胞導(dǎo)入阻抑內(nèi)源性SALl蛋白質(zhì)或其同源物的表達(dá)的外源性核酸。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述外源性核酸包括與內(nèi)源性SALl-編碼序列或其同源物的至少一部分同源或互補(bǔ)的核酸序列。20.如權(quán)利要求18或19的方法，其中所述外源性核酸與脅迫誘導(dǎo)啟動子可操作地連接。21.如權(quán)利要求4所述的方法，其包括向所述一個或多個植物細(xì)胞導(dǎo)入用外源蛋白質(zhì)的表達(dá)替代內(nèi)源性SALl蛋白質(zhì)或其同源物的表達(dá)的外源性核酸。22.如權(quán)利要求1至21中任一項所述的方法，其中所得到的植物相對于野生型植物對干旱、鹽、溫度脅迫或光脅迫、或它們的組合的抗性提高。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所得到的植物相對于野生型植物至少抗旱性提高。24.如權(quán)利要求1至23中任一項所述的方法，其中所述植物選自傘形科、紫菀科、十字花科、藜科/莧科、菊科、葫蘆科、蝶形花科、禾本科、豆科、早熟禾科、薔薇科或茄科。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述植物是十字花科的成員。26.由權(quán)利要求1至25中任一項所述的方法獲得的相對于野生型植物脅迫抗性提高的植物。27.如權(quán)利要求26所述的植物，其相對于野生型植物對干旱、鹽、溫度脅迫或光脅迫、或它們的任何組合的抗性提高。28.如權(quán)利要求27所述的植物，其相對于野生型植物至少抗旱性提高。29.如權(quán)利要求26至28中任一項所述的植物，其中所述植物選自傘形科、紫菀科、十字花科、藜科/莧科、菊科、葫蘆科、蝶形花科、禾本科、豆科、早熟禾科、薔薇科或茄科。30.如權(quán)利要求29所述的植物，其中所述植物是十字花科的成員。31.如權(quán)利要求1至25中任一項所述的方法，其中得到的植物開花時間延遲。32.用于獲得相對于野生型植物開花時間改變的植物的方法，所述方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SALl或其同源物有關(guān)的活性改變；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對于野生型植物開花時間改變的一個或多個植物。33.如權(quán)利要求33的方法，其中所述至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)致與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低，并且所述方法導(dǎo)致植物開花時間延遲。34.如權(quán)利要求31至33中任一項所述的方法，其中所述開花時間延遲約7天至約100天。35.由權(quán)利要求31至34中任一項所述的方法獲得的相對于野生型植物開花時間改變的植物。36.由權(quán)利要求31至34中任一項所述的方法獲得的相對于野生型植物開花時間延遲的植物。37.如權(quán)利要求1至25中任一項所述的方法，其中所得到的植物葉片表型發(fā)生變化。38.用于獲得相對于野生型植物葉片表型變化的植物的方法，所述方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SALl或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對于野生型植物葉片表型改變的一個或多個植物。39.如權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述改變的葉片表型包括更厚葉、更短葉、更圓葉、具有更多淺裂葉緣的葉子，或具有選自下組的兩種或多種改變的表型變化的葉片更厚葉、更短葉、更圓葉和淺裂葉緣葉。40.如根據(jù)權(quán)利要求37至39中任一項所述的方法獲得的相對于野生型植物葉片表型發(fā)生變化的植物。41.如權(quán)利要求26至30、36或40中任一項所述的植物中得到的植物部位或突變/轉(zhuǎn)基因種子。42.用于篩選植物的方法，所述植物中存在編碼SALl或其同源物的核苷酸序列的至少一個突變等位基因，所述方法包括使用至少一個適合作為探針或引物的核酸分子分析植物DNA，所述探針或引物能在嚴(yán)格條件下與SALl基因或其同源物雜交。43.如權(quán)利要求42所述的方法，包括使用適于擴(kuò)增SALl基因或其同源物的區(qū)域的至少一個寡核苷酸引物對，所述引物對包括檢測所述區(qū)域中是否存在突變的正向引物和反向引物。44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述區(qū)域包含完整的SALl基因或其同源物。45.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述區(qū)域包含SALl基因或其同源物的一部分。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述區(qū)域包含外顯子3、外顯子3和4之間的內(nèi)含子、外顯子5、外顯子5和6之間的內(nèi)含子和外顯子6和7之間的內(nèi)含子、或它們的任何組I=Iο全文摘要本發(fā)明提供用于獲得植物的方法，所述植物相對于野生型植物具有更高的脅迫抗性，方法包括(a)將至少一個突變或外源性核酸導(dǎo)入一個或多個植物細(xì)胞的基因組中，所述至少一個突變或外源性核酸使所述一個或多個植物細(xì)胞中與SAL1或其同源物有關(guān)的活性降低；(b)從所述一個或多個植物細(xì)胞再生一個或多個植物；和(c)選擇相對于野生型植物的脅迫抗性提高的一個或多個植物。文檔編號C12N15/00GK101802190SQ200880103295公開日2010年8月11日申請日期2008年6月19日優(yōu)先權(quán)日2007年6月20日發(fā)明者巴里·J·波格森,簡·B·羅塞爾,菲利帕·B·威爾遜申請人:澳大利亞國立大學(xué)