專利名稱:含有糖結(jié)合模塊以改變植物細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)或者增強降解作用的植物糖基水解酶的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及含有糖結(jié)合模塊以改變植物細胞壁的組成和結(jié)構(gòu)或者增強降解作用 的植物糖基水解酶的用途。
背景技術(shù):
地球上最豐富的生物聚合物(即纖維素)的水解占據(jù)全球碳循環(huán)的中心 位置,并具有寬范圍有機體分泌組的前纖維素水解酶,以分解這種復雜的不可溶的 底物。這些酶中研究得最明確的是內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(也叫作EGase或纖 維素酶;EC3. 2. 1.4),其已經(jīng)在細菌、真菌、植物和動物中被識別和鑒定(Lynd等人 "Microbial Cellulose Utilization !Fundamentals andBiotechnology,,,Microbiol Mol Biol Rev 66:506—577(2002) ;Hilden 等人"Recent Developments on Cellulases and Carbohydrate-binding Moduleswith Cellulose Affinity, "Biotech Lett 26:1683-1693(2004) ;Libertini 等 K,"Phylogenetic Analysis of the Plant Endo-beta-1,4-glucanase GeneFamily"J Mol Evol 58:506-515(2004))。要特別注意的 是微生物EGase,這是因為它們在紡織品改造工業(yè)中的重要性,以及它們在處理木質(zhì)纖維生 物質(zhì)(biomass)中的潛在用途(Lynd 等人‘‘Consolidated Bioprocessing ofCellulosic Biomass :an Update, "Curr Opin Biotech 16 :577_583 (2005)),導致詳細地了解它們的表 達、調(diào)節(jié)和酶的性質(zhì)((Lynd 等人‘‘ConsolidatedBioprocessing of Cellulosic Biomass an Update,,,Curr Opin Biotechl6 :577_583 (2005) ;Rabinovich 等 A "The Structure and Mechanism ofAction of Cellulolytic Enzymes, " Biochemistry(Moscow) 67 850-871 (2002) ;Bayer等人"The Cellulosomes :Multienzyme Machines for Degradation ofPlant Cell Wall Polysaccharides, "Ann Rev Microbiol 58:521-554(2004))。此外, 詳細的結(jié)構(gòu)-功能研究已鑒別出有助于纖維素結(jié)合和水解的重要的結(jié)構(gòu)特征。正如許多的糖基水解酶一樣,微生物EGase通常具有模塊式結(jié)構(gòu),包含至少一種 催化結(jié)構(gòu)域(⑶),通過柔性連接區(qū)以連接到單個或多個糖結(jié)合模塊(CBM)上(Wilson等 人Adv Biochem Eng Biot 65:1-21(1999))。CBM結(jié)構(gòu)上具有多種多樣的非催化結(jié)構(gòu)域, 且一般使蛋白靶向多糖底物,而且它們共同表現(xiàn)出一定范圍的結(jié)合特性(Boraston等人 “Carbohydrate-binding Modules :Fine_tuning Polysaccharide Recognition,”Biochem J 382:769-781 (2004))。CBM使得酶結(jié)合到底物的表面,通過增大局部的酶的濃度來增強催化活性,且有可能破壞表面結(jié)構(gòu)以得到更有效的催化作用((Linder等人“The Roles and Function of Cellulose-bindingDomains,,,J Biotech 57:15-28(1997))。還表明 CBM 能 使酶靶向特異性底物,甚至是微域(Boraston等人J Biol Chem 278:6120-6127(2002); Carrard ^A"Cellulose-binding Domains Promote Hydrolysis of Different Sites onCrystalline Cellulose, ” Proc Natl Acad Sci USA 97 10342-10347 (2000)) EGage 結(jié)合到纖維素被認為是在纖維素水解中的限制的步驟,因此,CBM是這些模塊式的水解 纖維蛋白的重要組分(Jung 等人“Binding andReversibility of Thermobifida fusca Cel5A, Cel6B, and Cel48A and TheirRespective Catalytic Domains to Bacterial Microcrystalline Cellulose, ”Biotech Bioeng 84:151—159(2003))。 與這些微生物酶的詳細的生物化學分析相比,植物EGase的體內(nèi)底物和作用 機理還知道得非常少。已有報道使用可溶的人造纖維素衍生物的大多數(shù)的活性,例如 羧甲基纖維素(CMC),但是只是很少的較詳細的底物特性的研究沒有顯示共同的模型 (Libertini 等 A"Phylogenetic Analysis of thePlant Endo-beta-1,4-glucanase Gene Family,,,J Mol Evol 58:506-515(2004) ; Brumme 11 等人“Plant Endo-beta-1, 4-glucanase !Structure, Properties andPhysiological Function,,,Amer Chem Soc Symp Ser 566 100-129 (1994) ;Molhoj 等 A "Towards Understanding the Role of Membrane-boundendo-β-1,4-glucanases in Cellulose Biosynthesis,,,Plant Cell Physiol43 :1399-1406 (2002) ;Rose 等人 The Plant Cell Wall, Blackwell Publishing, pp. 264-324(2003)),多數(shù)同工酶表明出對不同級的可溶性的葡聚糖有優(yōu)先的活性。然而, 重要且一致的結(jié)論是植物EGase不能降解結(jié)晶纖維素,其特征是已經(jīng)很長一段時間歸因于 植物EGase的不同的結(jié)構(gòu)特征缺少CBM。植物EGase屬于糖基水解酶家族9 (GH9),并包括大的多基因家族(Coutinho, P. Μ.禾口 Henrissat, B. In "Recent Advances in CarbohydrateBioengineering,"H. J.Gilbert, G. Davies, B. Henrissat 禾口 B. Svenssoneditors, The Royal Society of Chemistry, Cambridge, (1999) ;Henrissat 等 人"A Census of Carbohydrate-active Enzymes in the Genome ofArabidopsis thai iana,,,Plant Mo 1 Biol 47: 55-72(2001)),其分成不同的子家族(Libertini 等人“Phylogenetic Analysis of the PlantEndo-beta-1,4-glucanase Gene Family,"J Mol Evol 58:506-515(2004))。 α-和β-EGase都具有預期的向細胞壁分泌的N-末端信號序列,而Y-EGase具有連接 到長的N-末端延伸的GH9催化核心,并具有使蛋白錨定在質(zhì)膜或胞內(nèi)細胞器的膜擴展結(jié) 構(gòu)域(Molhoj 等人"Towards Understanding the Roleof Membrane-bound endo-β-Ι, 4-glucanases in Cellulose Biosynthesis, "PlantCell Physiol 43 1399-1406(2002); Robert 等 人"An Arabidopsisendo-1,4-β -D- glucanases Involved in Cellulose Synthesis UndergoesRegulated Intracellular Cycling. ,,,Plant Cell 17: 3378-3389(2005))。之前已經(jīng)核實了西紅柿EGase,最初叫作TomCel8,(Catala等人Plant Physiol 118 1535 (1998)),現(xiàn)在稱作 Solanum lycopersicum Cel9Cl (SlCel9Cl),其在 α-EGase中代表新的不同的結(jié)構(gòu)亞類,且在多種植物種類中核實了直向同源物(Libertini 等人"Phylogenetic Analysis of the PlantEndo-beta-1,4-glucanase Gene Family J Mol Evol 58:506-515(2004) ;Catala 等人 Plant Physiol 118 1535(1998) ;Trainotti等人"A Novel E-typeendo-β-1,4-glucanase with a putative Cellulose-binding Domain is HighlyExpressed in Ripening Strawberry Fruits. ,,,Plant Mol Biol 40: 323-332(1999) ;Trainotti 等人"PpEG4 is a Peach endo-β -1,4-glucanase gene whoseExpression in Climacteric Peaches does not Follow a Climacteric Pattern,"J Exp Bot 57:589-598(2006) ;Arpat 等人"Functional Genomics of CellElongation in Developing Cotton Fibers, "Plant Mol Biol 54:911-929(2004)))。這些亞類的成員展 現(xiàn)出不同的模塊結(jié)構(gòu),具有常見的N-末端信號肽和GH9催化核心,但還具有另外的不連續(xù) 的C-末端延伸部分,該部分通過富脯氨酸和羥氨酸的連接子區(qū)域與CD連接(圖1A)。這 種C-末端模塊具有記憶微生物CBM的特征,表明這種結(jié)構(gòu)域可能連接到纖維素,盡管不存 在生物化學的證據(jù)來支持這種假設(shè)。產(chǎn)生重組SlCel9Cl的重復嘗試已經(jīng)表明它對水解的易感性,保持全長蛋白的特征。然而,本發(fā)明描述的雙重策略以證明SlCel9Cl的C-末端模塊與結(jié)晶纖維素結(jié)合,其 為植物中的第一個這樣的例子。結(jié)果表明SlCel9Cl及直向同源物包括植物EGase的不 同亞類,其特征在于代表CBM的新家族的不同的C-末端結(jié)構(gòu)域(指CBM49)。數(shù)據(jù)還表明 SlCel9Cl⑶能水解多種纖維的和非纖維的植物細胞壁底物,并且還討論了 EGase的這種新 的結(jié)構(gòu)亞類的潛在作用。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述的這些及其它的缺陷。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及包括核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細胞。所述的核酸構(gòu)建體含有編碼植物 內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶的核酸分子,其中植物內(nèi)切-1, 4_ β _木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶各自具有模塊式的糖結(jié)合模塊和/或編 碼組成型的催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述核酸構(gòu)建體 還包括植物啟動子和植物終止序列,其中植物啟動子和植物終止序列可操作性地與核酸分 子偶聯(lián),且至少植物啟動子或植物終止序列之一與該核酸分子異源。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法。該方法包括提供含有植物內(nèi)切-1, 4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶核酸分子的核酸構(gòu)建體,其中植物內(nèi) 切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶各自具有模塊式的糖結(jié)合模塊和 /或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述核酸構(gòu) 建體還包括植物啟動子和植物終止序列,其中植物啟動子和植物終止序列可操作性地與核 酸分子偶聯(lián),且至少植物啟動子或植物終止序列之一與該核酸分子是異源的。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因 植物的方法還包括用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞以生成轉(zhuǎn)基因植物細胞,以及從轉(zhuǎn)基因植物 細胞繁殖轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的另一方面涉及多糖解聚的方法。該方法包括提供植物酶,其選自植物內(nèi) 切-1,4-β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β -葡聚糖酶及其混合物或催化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 植物內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶各自具有糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該方法還包括 在對生物質(zhì)的多糖解聚有效的條件下,用生物質(zhì)培養(yǎng)植物酶。本發(fā)明的另一方面涉及能夠承受增強的多糖解聚作用的植物的識別方法。該方法包括提供候選植物的集合并測定候選植物集合的生物質(zhì)的量和/或消化能力。在測定的集 合中的生物質(zhì)的量和/或消化能力增加的植物作為能夠承受增強的多糖解聚作用的候選 植物。本發(fā)明還涉及能夠承受增強的多糖解聚作用的植物的生產(chǎn)方法。該方法包括提供植物的集合,并在植物集合中誘導突變以生產(chǎn)突變植物的集合。對突變植物的集合的生物 質(zhì)的量和/或消化能力進行測定。與集合中的其它植物相比,在測定的突變植物集合中,相 對于非突變植物具有增加的生物質(zhì)的量和/或消化能力的植物作為能夠承受增強的多糖 解聚作用的候選植物。許多的微生物內(nèi)切-1,4_β-葡聚糖酶(EGase,或纖維素酶)具有糖結(jié)合模塊 (CBM),其需要有效的結(jié)晶纖維素降解。然而,CBM不存在于目前已經(jīng)用生化鑒定的植物 EGase中,因此,植物EGase通常不認為具有降解結(jié)晶纖維素的能力。本發(fā)明識別了西紅柿 即番茄(Solarium tycopersicum) Cel8 (SlCel9Cl)的EGase的生物化學特征,其具有與代 表之前未鑒定的CBM家族的不同的C-末端非催化模塊。體外結(jié)合研究表明所述的模塊實 質(zhì)上連接到結(jié)晶纖維素上并能夠作為部分的重組嵌合蛋白類似地結(jié)合,該蛋白含有細菌嗜 高溫放線菌(Thermobifida fusca)的EGase催化結(jié)構(gòu)域(⑶)。定點突變研究表明色氨 酸559和573在結(jié)晶纖維素結(jié)合中起作用。代表新CBM家族(CBM49)的SlCel9Cl CBM是 植物EGase的新結(jié)構(gòu)亞系(C系)的限定特征,其成員分布在整個植物界中。此外,也表明 SlCel9Cl CD能水解人造纖維素聚合物、纖維素低聚糖和多種植物細胞壁多糖。
圖1所示為在植物家族9糖基水解酶中的結(jié)構(gòu)和序列變化;圖IA所示為模塊結(jié) 構(gòu)的示意性的展示圖細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(深灰色)、跨膜結(jié)構(gòu)域(白色)、信號序列(黑色)、 GH9催化結(jié)構(gòu)域(淺灰色)、連接子區(qū)域(粗黑線)、糖結(jié)合模塊(六邊形);結(jié)構(gòu)亞類由 TomCe 13 (A 類,U78526)、TomCell (B 類,U13054)和 SlCel9Cl/TomCel8 (C 類,AAD08699) 表示;圖IB所示為SlCel9Cl的C-末端110氨基酸的SlCel9Cl氨基酸序列對比,所述的 SlCel9Cl含有從其它植物物種選擇的直向同源物和從C. fimi木聚糖酶IOA選擇的家族 2CBM ;三個保守的表面暴露的Trp殘基(對應(yīng)于C. fimi的CBM2a中的W17、W54和W72) 用星號標記;CBMs 包含S1 (SlCel9Cl, AAD08699)、At (擬南芥(Arabidopsis thaliana)、 Atlg64390) > Os ( 7jC 禾g (Orzya sativa)、NM_188491)、Pp ( /]、 AL % W- (Physcomitrella patens)、BJ591253)、Cf (糞堿纖維素單胞菌(Cellumonas fimi) ;Cex、XynlOA、AAA56791)。圖2所示為純化的Cel6/Cel9Cl融合蛋白與纖維素底物的結(jié)合。圖2A表示用 不同濃度的 BMCC 培養(yǎng)的 Cel6/Cel9Cl 融合蛋白(FP,A ) > T. fuscaCel6A(TfCel6A, O ) 和Τ. fusca Cel6A⑶(TfCel6A⑶,■);誤差條表示三次反應(yīng)的標準偏差;圖2B表示用 不同濃度的微晶纖維素培養(yǎng)的Cel6/Cel9Cl融合蛋白(FP)、T. fusca Cel6A(TfCel6A)和 Τ. fusca Cel6A⑶(TfCel6A⑶),培養(yǎng)后的結(jié)合或未結(jié)合的蛋白用SDS-PAGE分離;顯示分子 量標記(KDa)。圖3所示為SlCel9Cl糖結(jié)合模塊的定點突變;圖3A表示SlCel9ClCBM的分子模 型,突出了提議的突變形成的功能上重要的殘基;影像包括在NMR模板、IEXG上(紅色)的 最好的SlCel9Cl CBM模型(藍綠色)的Ca-原子的重疊;圖3B表示GST-CBM與BMCC的結(jié)合;在25°C下,GST-CBM( )與0_3mg/ml的BMCC在3小時內(nèi)的結(jié)合效率與單獨使用 GST( A )進行對比;誤差條表示三次反應(yīng)的標準偏差;圖3C表示與GST-CBM(WT)相比,在 25°C時,含有單個氨基酸置換的突變體與2mg/mlBMCC在3小時內(nèi)的相對結(jié)合效率。
圖4所示為反應(yīng)溫度和pH對SlCel9Cl活性的影響。重組SlCel9Cl⑶用(w/ ν)的CMC培養(yǎng)4小時,通過測定還原的糖的產(chǎn)量來測量其活性。圖4A表示在緩沖液A中, 在指定的溫度下測得的SlCel9Cl⑶的最適溫度;圖4B表示在緩沖液A中,在pH4_8的范 圍內(nèi)測得的最適PH ;誤差條表示三次反應(yīng)的標準偏差。圖5所示為在聚合的多糖底物上的SlCel9Cl⑶的底物特性;用ABN,阿拉伯聚糖; XG,木葡聚糖;低粘度的CMC,LVC ;中粘度的CMC,MVC ;AX阿拉伯木聚糖;MLG大麥(1,3) (1, 4)-3-0-葡聚糖來培養(yǎng)重組的51&19(1 CD,4小時后,在37°C和pH 6.0下,測量還原的糖; 誤差條表示3次試驗的標準偏差。圖6所示為纖維低聚糖的SlCel9Cl⑶消化產(chǎn)物的薄層色譜(TLC);通道1,標準 糖葡萄糖(Gl)、纖維二糖(G2)、纖維三糖(G3)、纖維四糖(G4)和纖維五糖(G5);通道2_6, 在37°C時,用SlCel9Cl⑶處理2小時后的1. 5mM G2-G6 ;G6和G7分別為纖維六糖酶和纖 維七糖酶。圖7A-B表示源自野生型(圖7A)和轉(zhuǎn)基因植物(圖7B)的擬南芥莖的X射線寬角 衍射;用20 μ m, IOKeV的光束([λ ] = 1. 35Α)得到衍射模型,樣品與探測器的距離為86mm ; 使用程序Fit2D分析峰值積分;樣品表明赤道衍射峰值,200、110、1-10 (某種程度上重疊) 和用于計算的經(jīng)線峰值002。
具體實施例方式本發(fā)明涉及包括核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細胞。所述核酸構(gòu)建體含有編碼植物內(nèi) 切-1,4-β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β -葡聚糖酶的核酸分子,其中植物內(nèi)切-1, 4_ β _木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶各自具有模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域,或編 碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述核酸構(gòu)建體還包括植物 啟動子和植物終止序列,其中植物啟動子和植物終止序列可操作性地與核酸分子偶聯(lián),且 至少所述植物啟動子或植物終止序列之一與該核酸分子是異源的。啟動子可以是組成型啟動子、組織特異性啟動子(如植物的莖特異性)或者誘導 型啟動子。編碼植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶的核酸分子可以是At 1 g48930、At 1 g64390、 At4gll050、TomCe18,SlCel9Cl、SIGH9C1、0s04g0674800、0sGlu6、0s01g0220100、0sCel9A、 0sGlu5、0s01g0219600、0sCel9B或者0sGlu7。這些葡聚糖酶的更詳細的名單如下含糖結(jié)合模塊家族49的糖基水解酶家族9編碼植物內(nèi)切-β -1,4-木聚糖酶的核酸分子可以是At 1 g 10050、At 1 g58370、At4g08160、At2gl4690、At4g33860、At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、 0s03g0672900或者PttXynlOA。這些木聚糖酶的更詳細的名單如下
含有糖結(jié)合模塊家族22的糖基水解酶家族10描述有機體 GI 登錄號#PubMed克隆Pcpl"85E10,5^ 白楊 109627682 AC182710.2 DCEK^基因組ff^f的序列和其施福人類基因組中心73624748推定的木聚糖酶Xynl 煙草DQ152919. 1mRNA,完整的 cds推定的木聚糖酶Xyn273624750 DQ152920煙草mRNA,完整的 cds14778587518094749鄰接的VV78X067077. 4,葡萄AM479759. 2全部的基因組鳥槍序列克隆pFL8341,4-3-D 木1486120811389760大麥AF287731. 1聚糖木聚糖水解酶mRNA,完整的 cds.(HordeumvuIgaresubsp.Vulgare)克隆pFL699 1,4-β -D14861198大麥AF287726. 111389760聚糖木聚糖水解酶基因,完整的cds.內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶的71142587大麥AJ 49365.1 Van Canpenhout, S 和
X-II基因,外顯子1-3,等位基因 HiroX-II.Volckaert, G. D 在 _大麥研究中的不同階段的內(nèi)切i-l,4- M糖酶同工酶X-I和X-II的不同^ii Plant Sci.169 (3),512-522(2005),其全部內(nèi)容在 _內(nèi)ΛΦ文中作為#%。大麥 1486119211389760克隆pFL400 1,4-β -DAF287723. 1木聚糖木聚糖水解酶mRNA,部分的 cds.大麥 71142585Van Caipenhout, S Plant內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶AJ849364. 1Sci. 169 ⑶,512"522的χ-Ι基因,外顯子(2005),其_內(nèi)Mlft納A^文中作為參考。1-3,等位基因BetzesX-I.(1,4)-β-木聚糖內(nèi)切水大麥 1718235U59312. 18914532解酶同工酶X-I mRNA,完整的 cds.木聚糖內(nèi)切水解酶同工酶大麥 18135949065693U73749. 1X-I基因,完整的cds.內(nèi)切-1,4-β_^^ 8|的 大麥 71142589Van Caipatout,SPlantAJ849366. 1x-II基因,外顯子1-3,Sci. Iffl(3),512-522BetzesK-IL_,其織內(nèi)納ΛΦ文中作為#%?!鲶w3上的來自克隆 蒺藜苜蓿 166788357Msen, CCU468275. 4ΜΤΗ2-119023 的 DNA 序列,(Medicago 158935745.完整的序列truncatula)內(nèi)切木聚糖酶番木瓜 23429644AANlO 199. 1(Caricapapaya)糖苷水解酶家族10;類似蒺藜苜蓿92868656ABE78655. 1半乳糖結(jié)合的
糖苷水解酶,家族10;蒺藜苜蓿92891089ABE90631. 1類似半乳糖結(jié)合的推定的1,4-β-D 木聚糖水稻(Oryza 38175736BAC57375. 2木聚糖水解酶sativaJaponicaGroup)0s07g04567007_K 稻11361109716100779BAF21475. 1'推定的 1,4-β-D 木聚水稻55168219AAV44085. 1糖木聚糖水解酶''推定的 1,4-β-D 木聚水稻55168259AAV44125. 1糖木聚糖水解酶'[水稻0s05g0319900水稻11357873816100779BAF17101. 10s05g0304900^K稻11357869616100779BAF17059. 1推定的內(nèi)切-1,4_β-木7jC稻1552860412447438BAB64626. 1聚糖酶X-I推定的(1,4)-β-^^糖7jC稻5379217512447438BAD52808. 1內(nèi)切水解酶0s01g0134900/K 稻11353147816100779BAF03861. 1推定的1,4-β-木聚糖酶19920133水稻ΑΑΜ08565. 1推定的1,4-β-木聚糖酶水稻20087079ΑΑΜ10752. 1推定的1,4-β-減糖酶 7ΥΜ31431438Buell, GR , et al.AAP53219. 1Sciaice 300,156^-1569_,其麵內(nèi) W 納ΛΦ文中作為#%。1,4-β-^^ 糖酶, 推定 7jC 稻7870832112791992ABB47296. 1
的0sl0g0351600水稻11363902316100779BAF26328. 1 推定的1,4-β-木聚糖酶水稻19920134ΑΑΜ08566. 1假設(shè)的蛋白水稻 20087080 ΑΑΜ10753. 11,4-β _ 木聚糖酶,推定 水稻11028894212791992ΑΑΡ53220. 2的,表達的0sl0g0351700水稻11363902416100779BAF26329. 1s03g02018007_K 稻11354777116100779BAFl 1214. 1推定的內(nèi)切-1,4-β-木水稻1552860212447438ΒΑΒ64624. 1聚糖酶X-I推定的(1,4)-β-木聚糖水稻5379217412447438BAD52807. 1內(nèi)切水解酶0s01g0134800水稻11353147716100779BAF03860. 1推定的1,4-β-木聚糖酶小麥40363757BAD06323. 1(Triticumaestivum)本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法。該方法包括提供含有編碼植物內(nèi)切-1, 4_ β-木聚糖酶(糖基水解酶家族10)和/或植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶(糖基水解酶 家族9)的核酸分子的核酸構(gòu)建體,其中植物內(nèi)切-1,4-β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1, 4- β -葡聚糖酶各自具有模塊式的糖結(jié)合模塊,和/或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或 單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述核酸構(gòu)建體還包括植物啟動子和植物終止序列, 其中植物啟動子和植物終止序列可操作性地與核酸分子偶聯(lián),且至少所述植物啟動子或植 物終止序列之一與核酸分子是異源的。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法還包括用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植 物細胞以生成轉(zhuǎn)基因植物細胞,以及從轉(zhuǎn)基因植物細胞繁殖轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明的核苷酸序列可以插入許多可利用的表達載體和使用本領(lǐng)域熟知的試劑 的細胞系統(tǒng)中的任何一個。合適的載體包括但不限于以下的病毒載體,例如λ載體系統(tǒng) gtll、gt WES. tB,Charon 4,以及質(zhì)粒載體,如 pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、 pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKClOl、SV 40、pBluescript II SK+/-或者 KS+/-(參見‘‘Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) from Stratagene, La Jolla, CA,其整體并入本文中作為參考)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(參見F. W. Studier等人"Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression ofCloned Genes,”Gene Expression Technology第185卷(1990),其整體并入本文中作為參考),及其任意的衍生物。重組分子 可通過轉(zhuǎn)化而導入細胞中,尤其是經(jīng)過傳導、結(jié)合、移動或電穿孔。使用現(xiàn)有技術(shù)中的標準 的克隆程序?qū)NA序列克隆進載體中,這些技術(shù)見于Sambrook等人MolecularCloning =A Laboratory Manual,第 2 版,Cold Spring Harbor Press,NY(1989),禾口 Ausubel,F(xiàn). Μ·等人 (1989)Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 其全部內(nèi)容并入本文中作為參考。在制備表達的核酸載體中,各種核酸序列可正常地插入或置換進入細菌質(zhì)粒中。 可采用任何方便的質(zhì)粒,其將通過具有細菌復制系統(tǒng)、允許在細菌中選擇的標記以及通常 一個或多個獨特的方便定位的限制性位點進行鑒定。提及的作為轉(zhuǎn)化載體的多種質(zhì)???用于植物的轉(zhuǎn)化。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化的靶向物種。使用導致冠癭病 的土壤傳播的細菌根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens),很多載體可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。 冠癭病的特征是受感染植物的下莖和主根上發(fā)展的腫瘤或癭。這些腫瘤是由于部分細菌質(zhì) 粒DNA轉(zhuǎn)移或并入植物染色體的DNA中。這種移轉(zhuǎn)的DNA(T-DNA)與植物細胞的正?;?一起表達?!澳[瘤誘導質(zhì)?!钡馁|(zhì)粒DNA、pTi或Ti-DNA含 有將T-DNA移入植物中的必要的 病毒(vir)基因。T-DNA運載編碼涉及植物調(diào)節(jié)因子和細菌的營養(yǎng)(冠癭氨基酸)的生物 合成中的蛋白的基因。T-DNA由兩個25bp不完整的稱作“邊界序列”的同向重復序列限定。 通過移除致癌基因和冠癭氨基酸基因,并用目的基因?qū)⑺鼈內(nèi)〈?,有可能將外源DNA轉(zhuǎn)入 植物中,而元需腫瘤的形成或根癌農(nóng)桿菌的增殖。Fraley等人“Expression of Bacterial Genes in Plant Cells, "Pro. Nat' IAcad Sci USA 80 :4803_4807 (1983),其全部內(nèi)容并入 本文中作為參考。該技術(shù)的進一步的改進引起雙元載體系統(tǒng)的發(fā)展(Bevan,Μ., "BinaryAgrobacterium Vectors for Plant Transformation,,,Nucleic Acids Res. 12 8711-8721 (1984),其全部內(nèi)容并入本文中作為參考)。在這個系統(tǒng)中,所有的T-DNA序列 (包括邊界)都從PTi移除,且含有T-DNA的第二載體的被引入根癌農(nóng)桿菌中。這種第二 載體的優(yōu)點是可在E. coli和A. tumefaciens中復制,并含有促進轉(zhuǎn)基因克隆的多克隆位 點。經(jīng)常使用的載體的例子是pBinl9。Frisch等人“Complete Sequence of the Binary VectorBinl9, ” Plant Molec. Biol. 27 :405_409 (1995),其全部內(nèi)容并入本文中作為參考。 任何現(xiàn)在知悉的或以后描述用于遺傳轉(zhuǎn)化的合適的載體都適合于用于本發(fā)明中。Cohen和Boyer的美國專利4237224描述了使用限制酶裂解和使用DNA連接酶連 接以生產(chǎn)重組質(zhì)粒形式的表達系統(tǒng),其全部內(nèi)容并入本文中作為參考。接著,通過在包括在 組織培養(yǎng)中生長的原核生物和真核細胞的單細胞培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化和復制以引入這些重組的 質(zhì)粒。某些“控制元件”和“調(diào)節(jié)序列”也并入載體構(gòu)建體中。這些包括載體的非翻譯區(qū)、 啟動子、5'和3'未翻譯區(qū),該5'和3'未翻譯區(qū)與宿主細胞蛋白相互作用以進行轉(zhuǎn)錄和 翻譯。這些元件的強度和特異性是可以改變的。視使用的載體系統(tǒng)和宿主而定,可以使用 任何數(shù)量的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件,包括組成型或誘導型的啟動子。組成型啟動子是在生物體的發(fā)展和生命周期中引導基因表達的啟動子。一些廣泛 用于誘導轉(zhuǎn)基因表達的組成型啟動子的例子包括來自于根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶(NOS)基因啟動子(Rogers等人的美國專利5,034,322,其全部內(nèi)容并入本文中作為參考)、花椰 菜花葉病毒(CaMV) 35S和19S啟動子(Fraley等人的美國專利5,352,605,其全部內(nèi)容并入 本文中作為參考)、源自幾個肌動蛋白基因中的任意一個的那些,已知它們在多數(shù)細胞類型 中表達(Privalle等人的美國專利6,002, 068,其全部內(nèi)容并入本文中作為參考)、以及泛 素啟動子,其是已知的聚集在許多細胞類型中的基因產(chǎn)物。
誘導型啟動子是響應(yīng)誘導劑能夠直接地或間接地激活一個或多個DNA序列或基 因的轉(zhuǎn)錄的啟動子。在沒有誘導劑的情況下,DNA序列和基因?qū)⒉粫晦D(zhuǎn)錄。誘導劑可以 是化學劑,如代謝物、生長調(diào)節(jié)劑、除草劑或酚類化合物,或者是直接施加在植物上的生理 應(yīng)激反應(yīng),如冷、熱、鹽、毒素或通過病原體或致病劑(如病毒或真菌類)的作用。含有誘 導型啟動子的植物細胞可通過將誘導劑外部施用于細胞或植物上以暴露給誘導劑,例如通 過噴灑、澆水、加熱或通過暴露給可操控的病原體。用于本發(fā)明的合適的誘導型啟動子的 例子是糖皮質(zhì)激素-誘導的啟動子(Schena等人“ASteroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells, "Proc Natl AcadSci USA 88 :10421-5 (1991),其全部內(nèi)容 并入本文中作為參考)。當使轉(zhuǎn)基因植物與納摩爾濃度的糖皮質(zhì)激素接觸或通過與地 塞米松,一種糖皮質(zhì)激素類似物接觸時,在轉(zhuǎn)化的植物中誘導轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白的表達。 Schena 等人 “A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells,,,Proc NatlAcad Sci USA 88 10421-5 (1991) ;Aoyama ^A "A Glucocorticoid-MediatedTransc riptional Induction System in Transgenic Plants,”Plant J. 11 605-612(1997), VX 及 McNellis 等人“Glucocorticoid-Inducible Expressionof a Bacterial Avirulence Gene in Transgenic Arabidopsis InducesHypersensitive Cell DeathiPlant J. 14(2) 247-57(1998),其全部內(nèi)容并入本文中作為參考。此外,誘導型啟動子包括那些啟動子,即 其具有在選定的植物組織內(nèi)以組織特異性的方式來調(diào)節(jié)目的基因的作用。這種組織特異性 或可發(fā)展地調(diào)節(jié)的啟動子的例子包括種子、花、水果或根特異性的為本領(lǐng)域熟知的啟動子 (Shewmaker等人的美國專利5,750,385,其全部內(nèi)容并入本文中作為參考)。在本發(fā)明的優(yōu) 選的實施方式中,異源的啟動子連接到構(gòu)建體的核酸上,其中“異源啟動子”限定為構(gòu)建體 的核酸本質(zhì)上不與之連接的啟動子。發(fā)明的核酸構(gòu)建體還包括可操作的3’調(diào)節(jié)區(qū),其選自那些能夠提供mRNA的正 確的轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化以在選擇的宿主細胞中表達并可操作性地連接到本發(fā)明的 改造的特征核酸分子上。業(yè)已知道3’調(diào)節(jié)區(qū)的數(shù)量在植物中是可操控的。例示性的3’ 調(diào)節(jié)區(qū)包括但不限于胭脂堿合成酶(“職,,)3,調(diào)節(jié)區(qū)(Fraley等人“Expression of Bacterial Genes in PlantCells,"Proc. Nat' 1 Acad. Sci· USA 80 :4803_4807(1983),其 全部內(nèi)容在此并入本文中作為參考)和花椰菜花葉病毒(“CaMV”)3’調(diào)節(jié)區(qū)(Odell,等人 “Identification of DNA Sequences Required for Activity of theCauliflower Mosaic Virus 35S Promoter, "Nature 313(6005) :810_812 (1985),其全部內(nèi)容在此并入本文中作 為參考)。事實上,在植物中已知的可操控的任意的3’調(diào)節(jié)區(qū)會滿足本發(fā)明的核酸的編碼 序列的正確表達。使用熟知的分子克隆法可將上述不同的組分連接在一起以生成含有本發(fā)明的核 酸構(gòu)建體的表達系統(tǒng),這些方法記述于Sambrook等人MolecularCloning =A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor 出版社,NY(1989),和 Ausubel 等人(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y.,巾,胃i胃內(nèi)· 在此并入本文中作為參考。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體設(shè)定成編碼可翻譯的RNA分子。其結(jié)果是,那些RNA分子 將在核糖體處翻譯以生成由核酸構(gòu)建體編碼的蛋白??赏ㄟ^連接克隆的基因增加以這種 方式生成的蛋白,其中所述的基因用代表病毒調(diào)節(jié)序列(即a 5’未翻譯的序列)的合成 雙鏈寡核苷酸編碼目的核酸構(gòu)建體Gehrke的美國專利4,820,639,和Wilson的美國專利 5,849,527,其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。一旦制備了本發(fā)明的核酸構(gòu)建體,就要準備并入宿主細 胞中。因此,本發(fā)明的另一 方面涉及含有核酸構(gòu)建體的重組宿主細胞,其中所述的核酸構(gòu)建體具有一個或多個本發(fā)明 的優(yōu)化的植物核酸分子?;旧?,在有效地產(chǎn)生宿主細胞中的核酸分子的轉(zhuǎn)錄的條件下,通 過用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞來實現(xiàn)該方法,其使用的是本領(lǐng)域已知的標準克隆 方法,例如 Sambrook 等人記述的 Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringsLaboratory, Cold Springs Harbor, New York(1989) ,^^^ ^ Λ^Λ^ Φ 作為參考。合適的宿主細胞包括但不限于細菌、病毒、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲、植物等 等。優(yōu)選宿主細胞是細菌細胞或植物細胞。轉(zhuǎn)化方法可導致核酸在啟動子的控制下進行暫 時或穩(wěn)定的表達。作為轉(zhuǎn)化結(jié)果優(yōu)選本發(fā)明的核酸構(gòu)建體穩(wěn)定地插入重組植物細胞的基因 組中,盡管暫時表達可用于重要的目的,尤其是調(diào)研中的植物正在緩慢生長中。適合于轉(zhuǎn)化的植物組織包括葉組織、根組織、分生組織、合子和體細胞胚、愈傷組 織、原生質(zhì)體、雄穗、花粉、胚芽、花藥,等等。選擇的轉(zhuǎn)化方式是最適合于待轉(zhuǎn)化的組織的方 式。植物組織中的暫時表達通常通過粒子轟擊實現(xiàn)(Klein等人,“High-Velocity Microprojectiles for Delivering Nucleic Acids Into Living Cells,,,Nature 327 70-73(1987),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。在該方法中,將鎢或金的微粒(直 徑1-2μπι)涂在目標NDA上,接著在組織處使用高壓氣體轟擊。采用這種方式有可能將外 源DNA輸送入到細胞核中,并在組織的當前條件下得到基因的短暫表達。也可將生物活性 的粒子(如含有載體和異源DNA的干的細菌細胞)推入植物細胞中。也可以使用現(xiàn)在已知 的或以后新開發(fā)的粒子轟擊的其它變型。穩(wěn)定地將核酸構(gòu)建體引入植物細胞的合適的方法是使用之前用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化 的根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)以感染植物細胞。如前所述, 農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的Ti (或RI)質(zhì)粒能夠很成功地將外源核酸分子轉(zhuǎn)移到植物細胞 中。使用將耐受性賦予病原體的基因以轉(zhuǎn)化植物細胞的另一方法是宿主細胞的粒子轟擊 (也稱作生物射彈轉(zhuǎn)化),其描述于美國專利4,945,050,5, 036,006和5,100,792中,這些 者β屬于Sanfor等人,且在Emerschad等人“Somatic Embryogenesis and PlantDevelopment from Immature Zygotic Embryos of Seedless Grapes (Vitisvinifera)" Plant Cell Reports 14:6-12(1995)中有描述,所有的這些文獻都并入本文中作為參考。然而,其它的 引入方法是用其它實體(如微細胞、細胞、溶酶體或其它了融合的脂質(zhì)體表面的實體)來融 合原生質(zhì)體(Fraley等人Proc Natl Acad Sci USA 79 :1859_63 (1982),其全部內(nèi)容納入本 文中作為參考)。核酸分子也能通過電穿孔的方式而被引入植物細胞中(Fromm等人Proc Natl Acad Sci USA 82 :5824(1985),其全部內(nèi)容納入本文中作為參考)。在這種技術(shù)中,在含有表達盒的質(zhì)粒的存在下使植物原生質(zhì)體電穿孔。高場強度的電脈沖可逆地透化生物 膜,使得質(zhì)粒引入。電穿孔的植物原生質(zhì)體使細胞壁重組,分開并再生。轉(zhuǎn)化的精確方法對 本發(fā)明的實現(xiàn)并不重要。任何能導致選擇的宿主細胞的高效轉(zhuǎn)化的方法都可用于本發(fā)明 中。
轉(zhuǎn)化之后,必須再生轉(zhuǎn)化的植物細胞。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生記載于Evans 等人的 Handbook of Plant Cell Cultures,卷 1 : (MacMillanPublishing Co. , New York, 1983) ;Vasil LR.(編輯),Cell Culture andSomatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press,Orlando,卷 I,1984,和 Vol. 111(1986),以及 Fitch 等人〃 Somatic Embryogenesis and PlantRegeneration from Immature Zygotic Embryos of Papaya (Carica papayaL.),“ Plant Cell Rep. 9 :320 (1990),其全部內(nèi)容納入本文中作為參考。再生的方式因植物的種類不同而變化,但是通常首先提供的是轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體的 懸浮物或含有外植體的皮氏培養(yǎng)皿。形成愈傷組織,且從愈傷組織誘導出幼苗,繼而生出 根。或者,在愈傷組織中可誘導胚芽的形成。這些胚芽像自然的胚芽般發(fā)育成植物。培養(yǎng) 基通常含有各種氨基酸和激素,如茁長素和細胞分裂素。高效的再生取決于培養(yǎng)基、基因型 以及培養(yǎng)的歷史。如果控制了這三個變量,那么再生是可再現(xiàn)和可重復的。較佳地,轉(zhuǎn)化的細胞首先用選擇標記識別,同時將標記隨本發(fā)明的核酸構(gòu)建體一 起引入宿主細胞中。合適的選擇標記包括但不限于編碼以耐受抗生素的標記,如對卡那霉 素有耐受性的 nptll 基因,(Fraley 等人 Proc NatlAcad Sci USA 80:4803-4807(1983), 其全部內(nèi)容納入本文中作為參考),和耐受慶大霉素、G418、潮霉素(hygromycin)、鏈霉素、 奇霉素(spectinomycin)、四環(huán)素、氯霉素等的基因。細胞或組織在含有合適的抗生素的選 擇的培養(yǎng)基上生長,其中通常僅僅是表達抗生素耐受性標記的那些轉(zhuǎn)化物繼續(xù)生長。其它 類的標記物也適合于包含在本發(fā)明的表達盒中。例如,編碼以耐受滅草劑(如耐受磺脲) 的基因是有用的,或者dhfr基因,其對甲氨喋呤具有耐受性(Bourouis等人EMBO J 2 1099-1104(1983),其全部內(nèi)容納入本文中作為參考)。類似地,編碼酶類以提供生成可識 別的化合物的“報告子基因”也是適合的。基因融合實驗中最廣泛地使用的報告子基因已 經(jīng)是UidA,其是一種來自編碼β葡萄糖苷酸酶蛋白的大腸桿菌(Escherichia coli)的基 因,也禾爾作 GUS0 Jefferson 等人"GUS Fusions [beta]Glucuronidase as aSensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants,”EMB0 J6 :3901_3907 (1987),其全部 內(nèi)容納入本文中作為參考。類似地,提供生成可發(fā)光識別的化合物的酶類(如熒光酶素) 也是有用的。這些選擇標記物的使用取決于目標物種,對于某些目標物種,最好使用不同的 抗生素、滅草劑或生物合成選擇標記物。然后,使用包含在用于轉(zhuǎn)化的給定盒的病毒基因的特異性探針,通過Southern blot雜交分析來測試根據(jù)抑制劑或其它選擇的標記物選擇的植物細胞及組織的病毒基因 的獲得(Sambrook 等人"Molecular Cloning ALaboratory Manual "Cold Spring Harbor, New York =Cold Spring HarborPress (1989),其全部內(nèi)容納入本文中作為參考)。在含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的融合基因穩(wěn)定地并入轉(zhuǎn)基因植物后,所述轉(zhuǎn)基因可 通過有性雜交轉(zhuǎn)移到其它的植物中??墒褂萌我獾囊恍藴实姆敝臣夹g(shù),這取決于雜交的 物種。一旦產(chǎn)生了這種類型的轉(zhuǎn)基因植物,就可以根據(jù)常用的方法栽培植物本身,以至于核 酸構(gòu)建體存在于得到的植物中。或者,從轉(zhuǎn)基因植物回收轉(zhuǎn)基因種子。然后這些種子可種植在土壤中,再使用常用的方法栽培,最后得到轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明可與多種植物或其種子聯(lián)合使用。合適的植物包括雙子葉植物和單子葉植 物??捎玫那f家類植物包括苜蓿、谷物、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、土豆、 甘薯、豆類、豌豆、菊苣、萵苣、菊苣、卷心菜、抱子甘藍(brussel sprout)、甜菜、歐洲防風 草、蕪青、花椰菜、西蘭花、蕪青、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、筍瓜、 南瓜、綠皮密生胡瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、山酶、菠蘿、黃豆、煙草、西紅 柿、高粱、木瓜、楊樹、柳樹、甘蔗、芒草和多年生草如柳枝稷、東方Y(jié)草、藍色粗莖桿的草、 蘆葦草和印度草。生物質(zhì)包括含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)和碳水化合物(如淀粉和糖) 的材料。通常形式的生物質(zhì)包括樹、灌木和草、玉米和玉米殼以及城市固體廢物、廢紙和庭 院廢物。淀粉、糖和蛋白質(zhì)含量高的生物質(zhì)如玉米、谷物、水果和蔬菜通常用作食物消耗。相 反,纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量高的生物質(zhì)不容易消化,因此主要用于木和紙品、燃料 或處理掉。乙醇和其它的化學發(fā)酵產(chǎn)物通常由糖制備而來,所述的糖源自淀粉和糖含量高 的原料,如玉米。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括植物枝條、矮樹叢、莖、玉米和玉米殼、能源植物、森林、水果、花、 谷物、草、草本植物、葉子、樹皮、針葉、圓木、根、樹苗、短期輪作木本作物(short rotation woody crops)、灌木、輪換草、樹、蔬菜、蔓藤以及硬和軟木(不包括含有有害材料的木頭)。 此外,農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中(包括農(nóng)耕和造林活動)產(chǎn)生的有機廢物,尤其包括森 林木頭廢料。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是任意前述的單獨物或組合物或其混合物。生物質(zhì)包括原始生物質(zhì)和/或非原始生物質(zhì),如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)、商業(yè)生物質(zhì)、建造及拆卸廢料、城市固體廢物、廢紙和庭院廢物。本發(fā)明涉及破碎或打碎的植物材料。術(shù)語糖化作用是指將復合的碳水化合物(如淀粉或纖維素)分解成它的單糖組分 的過程。術(shù)語多糖是指含有重復的糖單元的聚合物,包括淀粉、聚葡萄糖、木質(zhì)纖維素、纖 維素及這些物質(zhì)的衍生物(如甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、醋 酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸丙酸纖維素、淀粉和淀粉酶衍生物、膠淀粉及其衍生物以 及其它的化學和物理改造的淀粉)等等。解聚可通過化學或物理技術(shù)來實現(xiàn),包括Y射線輻射、臭氧和UV射線的組合、超 聲波降解、機械壓力、加熱或酸水解。多糖解聚可以是將高分子量的多糖到較低分子量的改造??墒褂靡幌盗械募夹g(shù)來解聚植物細胞壁的多糖(包括纖維素和半纖維素)。這 些技術(shù)揭不于 Lynd 等人的 “Consolidated Bioprocessing of CellulosicBiomass An Update, ” Curr Opin Biotechnol 16 577-583 (2005) ;Himmel 等人 ^"Biomass Recalcitrance-Engineering Plants and Enzymes for BiofuelsProduction,,,Science 315 :804-807(2007),其全部內(nèi)容納入本文中作為參考。本發(fā)明的焦點是通過在解聚之前 改造植物細胞壁的組合物和/或通過將本文所述的蛋白質(zhì)加入到細胞壁中來增強多糖的 解聚。解聚方法(通常也稱作糖化作用)一般是酶解的,包括單獨的糖基水解酶或其混合 物。一般來自微生物,但是本發(fā)明將等同地適應(yīng)于任何現(xiàn)有的或者將來的可用于解聚多糖 的非-酶技術(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的多糖解聚,可以進行發(fā)酵。發(fā)酵材料包括能夠產(chǎn)生乙醇的任意的材 料或有機物。乙醇包括乙醇或乙醇與水的混合物。通常,發(fā)酵是天然的乙醇產(chǎn)生者的細菌、 酵母和真菌起作用的過程,其中,細菌如運動發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌,酵母如釀酒酵母或木 糖發(fā)酵酵母?;蛘?,可使用引入的工程有機物來發(fā)酵,其中所述的有機物以通過引入外源遺 傳材料(如來自天然乙醇產(chǎn)生者的丙酮酸脫羧酶和/或脫氫酶基因)來產(chǎn)生乙醇。進一步, 產(chǎn)生乙醇的有機物的突變體和衍生物,如通過已知的遺傳和/或重組技術(shù)產(chǎn)生的那些突變 體和衍生物,在增強和/或改變乙醇產(chǎn)量的基礎(chǔ)上已經(jīng)生產(chǎn)和/或選擇突變體和衍生物。糖到乙醇或其它化學物質(zhì)的發(fā)酵可使用生物催化劑在流化床生物反應(yīng)器中完成, 如使用高濃度的固定的微生物。流化床生物反應(yīng)器與反滲透過濾器以液體導通。微生物運 動發(fā)酵單胞菌的固定的濃度超過IOltl細胞/ml。然而,其它合適的微生物也可以用來產(chǎn)生 乙酉享,例如酉良酒酵母 (Saccharomycescedvisiae)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis) > ^flli'ff^fij (Saccharomyces uvarum,)禾口)feIif^fiJ (Saccharomyces bayginEis)。 "SJiMf 同的水狀膠體凝膠形成固定材料,例如使用交聯(lián)的角叉膠或直徑為1. 0-1. 5mm凝膠球的改 造的骨凝膠。根據(jù)以下的參數(shù)操作流化床生物反應(yīng)器溫度約為25°C -約40°C,糖的濃度 范圍為10% -20%,液體的流速范圍約為0. 05-0. 5cm/秒。一旦發(fā)酵過程完成,就形成稀釋的終產(chǎn)物(如乙醇)。合并隨后的基于吸收的濃縮 步驟可用于濃縮稀釋的終產(chǎn)物。在吸收的情況下,可使用與終產(chǎn)物有高親和性的兼容的固 體吸收劑。這可通過使用雙組分顆粒的流化床生物反應(yīng)器完成,其使得同向或逆向流經(jīng)生 物催化劑粒子的流化床的吸收劑粒子能將發(fā)酵和產(chǎn)品回收兩個過程組合起來。雙組分粒子 流化床生物反應(yīng)器具有至少一個入口和至少一個出口。該方法的完整描述見于Scott等人 的美國專利5,270,189,其全部內(nèi)容在此并入本文中作為參考。本發(fā)明的另一方面涉及生物質(zhì)的一般的多糖解聚的方法。該方法包括提供植物 酶,其選自植物內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶及其混合物。 所述植物內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶各自具有糖結(jié)合結(jié)構(gòu) 域,或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該方法還 包括在對生物質(zhì)的多糖解聚有效的條件下用生物質(zhì)培養(yǎng)植物酶。與上述大體相同的方式轉(zhuǎn) 基因生成的酶可用于多糖的解聚?;蛘撸@些酶可從植物中分離而來。本發(fā)明的另一方面涉及能夠承受增強的多糖解聚的植物的識別方法。該方法包括 提供候選植物的集合并測定該植物集合的生物質(zhì)的量和/或消化能力。在生物質(zhì)的量和/ 或消化能力增加的測定的集合中的植物被認為是能夠承受增強的多糖解聚的候選植物。在上述的方法中,識別植物的步驟是通過雜交或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進行的。根 據(jù)本發(fā)明,這些方法用來分析植物是否具有含糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū) 域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域的內(nèi)切-1,4- β _木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1, 4-β-葡聚糖酶。原位雜交測定用來測量正常細胞和從組織樣品得到的假想細胞的表達水平。標記 核酸序列能夠檢測和測量相對表達水平。通過比較正常細胞和從組織樣品中得到的假想細 胞之間的表達水平,可通過基因產(chǎn)物降低的表達水平來識別適合于多糖解聚的植物。檢測在多核苷酸樣品中的給定序列的方法包括通過聚合酶鏈反應(yīng)選擇性的序 列擴增。PCR描述于Mullis等人的美國專利4,683,202和Saiki等人的“EnzymaticAmplification of Beta-globin Genomic Sequences andRestriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia,” Science230 :1350_1354(1985),其全部內(nèi)容在此并 入本文中作為參考。在此方法中,與選擇的序列的相對端部分互補的引物與熱循環(huán)聯(lián)合用 于啟動引物啟動的復制的連續(xù)循環(huán)。擴增的序列可容易地通過多種技術(shù)識別。這種方法尤 其適于檢測適于多糖解聚的植物。本發(fā)明還涉及能夠承受增強的多糖解聚的植物的生產(chǎn)方法。該方法包括提供植物的集合,并在植物集合中誘導突變,以生成誘變植物的集合。測定誘變植物的集合的生物質(zhì) 的量和/或消化能力。與集合中的其它植物相比,在測定的誘變植物的集合中具有相對于 非突變植物增加的生物質(zhì)的量和/或消化能力的植物(具有編碼模塊家族10植物內(nèi)切-1, 4- β -木聚糖酶和/或模塊家族9植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶的核酸分子)作為是能夠承 受增強多糖解聚的候選植物識別。如上所述,本發(fā)明涉及在植物集合中誘導突變以生成誘變植物的集合的方 法。突變相關(guān)的方法使用稱為TILLING的方法(定向誘導基因組局部突變),其依賴在 基因序列(基于PCR)水平篩選較大集合的突變體,然后評價隨后從突變種子庫中長大 的選擇的突變植物。這個方法產(chǎn)生了大范圍的突變等位基因,該方法快速且是自動化 的,且該方法適合于任何能被化學誘變的有機物(McCallum等人“Targeted Screening for Induced Mutations,” Nat Biotechnol 18(4) :455_457 (2000),其全部內(nèi)容在此 并入本文中作為參考)。TILLING也在McCallum等人的“Targeting Induced Local Lesions INGenomes(TILLING)for Plant Functional Genomics,,,Plant Physioll23 439-442(2000) ;Dillon ^ 人 ^"Domestication to Crop Improvement :Genetic Resources for Sorghum and Saccharum (Andropogoneae) ,,,Annalsof Botany 100 975-989(2007)中有記述,其全部內(nèi)容在此并入本文中作為參考。實施例以下的實施例僅是用作闡述本發(fā)明的具體實施方式
,并不以任何方式限制本發(fā)明 的范圍。實施例1-5的材料和方法TfCel6A CD :SlCel9Cl CBM 融合蛋白的表達E. coli 中的(Cel6/Cel9Cl FP)—為了形成 Τ. fusca TfCel6A CD :SlCel9Cl CBM 融合蛋白構(gòu)建體,用PCR擴增SlCel9Cl CBM46 DNA序列(氨基酸500-607)(表1),接著 用 Pstl 和 Xhol 消化。編碼 TfCel6A CD (氨基酸 1-312)的 cDNA 記述于(Salminen,0· PhD Thesis, CornellUniversity, Ithaca, New York(2002),其全部內(nèi)容在此并入本文中)中, 其在pET 26b+載體(Novagen ;Madison, WI)中含有TfCel6A,所述載體經(jīng)PCR(表1)擴增 并用EcoRl和Pstl消化。得到的cDNA片段連接到已經(jīng)用EcoRl和Xhol消化的pET載體 中。表1克隆用的引物序列克隆用的引物序列 在30°C時,根據(jù)pET表達手冊(Novagen ;Madison,WI)的規(guī)定,在含有60 μ g/ml卡 那霉素和0. 5%葡萄糖的M9基本培養(yǎng)基(6L)中用0. 5mMIPTG進行4小時誘導在BL21(DE3) 細胞中的Cel6/Cel8 FP的表達和分離外周胞質(zhì)液體。將液體的最終濃度調(diào)到50mM MES,pH 6. 5 (緩沖液B),應(yīng)用到SP-S印harose柱中(GE衛(wèi)生保健,Piscataway, NJ),用線性梯度的 NaCl (在緩沖液B中的0-1. OM NaCl)洗脫蛋白。合并有EGase活性的片段,應(yīng)用到HiTrap Butyl FF柱(GE衛(wèi)生保健)中,且用線性梯度的硫酸銨(在緩沖液B中0. 9-0M)對融合蛋 白進行洗脫。SlCel9Cl CBM的分子蛋白建模使用MODELLER來構(gòu)建SlCel9Cl CBM的所有原子結(jié)構(gòu)模型(Sali等人 “Comparative Protein Modelling by Satisfaction of Spatial Restraints,"J Mol Biol 234 779-815(1993) ;Sali ^AWEvaluation of ComparativeProtein Modeling by MODELLER, "Proteins 23 :318_326 (1995),其全部內(nèi)容并入本文中作為參考)。從SPMS 的BLAST搜索中獲得SlCel9Cl CBM的對比。從PDB中得到模板結(jié)構(gòu)。通過移動在初始序列 對比中的缺失和插入以進行微小的手調(diào),該初始序列對比落入鄰近的環(huán)區(qū)的模板的α -螺 旋線和β-鏈中。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-SlCel9Cl CBM融合蛋白的構(gòu)建體以及定點突變pGEX表達系統(tǒng)用作SlCel9Cl CBM的定點。含有CBM(氨基酸526-625)的SlCel9Cl DNA序列的區(qū)域經(jīng)PCR(表1)擴增,并與EcoRI/Sall-消化的pGEX_5X_l (GE衛(wèi)生保健)相 連以生成 GST-S1 Ce 19C1 CBM (GST-CBM)。使用QuikChange定點突變試劑盒(Stratagene)進行GST-CBM的定點突變。相關(guān) PCR引物列于表2中。通過DNA測序(Cornell BRC ;Ithaca,NY)核實單個突變的存在,陽 性克隆進一步指定為 GST-CBM W522A、GST-CBM Y529A、GST-CBM W559A 和 GST-CBM W573A, 指定數(shù)表示在成熟的SelCel9Cl蛋白中的氨基酸。表2定點突變的引物序列定點突變用的引物序列 mm^ sr-CAAAGGGGAACTASTTCAiSSOCWrcTiSAATaKSA^^ CSEQiO NO 0} mmM ^cTTcocATOMaASc^reAAcmsrreascTrms* (SEQioNaio)VWW^鉻 CmSTOAGTATCTOTAS^MSrCtTCCWrCASAOC^r {SCO ID NO 12) mmM鈐(mQ ID 13) WWM銣 {SEO ID MO 14) mmMsVcrcorrcAircTOiCAsciro^aWiiCTCTrrAccAO^ (βεοιθΝθ: δ)
mmM y.f漲O 鍆 ^ 詢*變化的殘基加下劃線標識根據(jù)pGEX系統(tǒng)手冊(GE衛(wèi)生保健),在28 °C下,使用0. 2mM IPTG誘導在 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL細胞(Stratagene)中的GST-CBM及其突變體的蛋白表達,持續(xù) 4 小時。將細胞團塊重懸在 20mM Tris pH 8、20mM Tris pH 8、5mM DTT 和 ImM PMSF 中,再 使用法式壓濾壺(French press)溶解細胞,接著進行高速離心和過濾以除去細胞碎片。將 無細胞的提取物加載在GSTrap FF柱上(GE衛(wèi)生保健),用50mM MES pH6. 5UOOmM NaCl、 5mM DTT、25mM還原的谷胱甘肽洗脫結(jié)合的蛋白。多糖底物根據(jù)(Irwin等人,Biotechnol Bioeng 42 1002-1013 (1993),其全部內(nèi)容在 此納入本文中作為參考),制備細菌微晶纖維素(BMCC ;MonsantoCellulon, Monsanto 公司)和磷酸溶脹纖維素(PASC)的儲備懸液。根據(jù)(Kim等人,Purification and Characterization of Thermobifida fusca xylanaselOB,” Can J Microbiol 50: 835-843(2004),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)制備不可溶的燕麥-斯佩耳特小 麥木聚糖,并從Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)購買低粘度的(取代度=0. 65-0. 9,聚合 度=400)和中粘度的(取代度=0.7,聚合度=1100)羧甲基纖維素(CMC)。以下的多糖 底物從Megazyme International (Wicklow,Ireland)獲得低粘度的長豆角半乳甘露聚糖 (Gal Man = 22 78)、糖用甜菜阿拉伯樹膠酸(arabinan) (Ara Gal Rha GalUA =88 3 2 7)、含淀粉的木葡聚糖(Ara Gal Xyl Glc = 3 16 36 45)、 低粘度的小麥阿拉伯糖基木聚糖(Ara Xyl = 41 59 ;Glc, Gal和Man < 1% )和中粘 度的大麥β-葡聚糖(純度>97%,具有<0.3%的阿拉伯糖基木聚糖污染物)。結(jié)合試驗從(Irwin等人的“Roles of the Catalytic Domain and Two CelluloseBinding Domains of Thermomonospora fusca E4 in Cellulose Hydrolysis, " JBacteriol 180 1709-1714(1998),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)調(diào)整方法,并根據(jù)(Irwin等人的 Biotechnol Bioeng 42 1002-1013 (1993),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)制備含 纖維素底物。在室溫下,在裝有緩沖液B的2. Oml離心管中對Cel6/Cel9Cl FP、TfCel6A和 Cel6A CD 進行結(jié)合試驗、以及在裝有 50mM MES (pH 6. 5)、50mM NaCl、5mM CaCl2,2. 5mMDTT 和12. 5mM還原的谷胱甘肽的2. Oml離心管中對GST-CBM進行結(jié)合試驗,以及在含0_3mg/ml BMCC和2nmol每種蛋白的2. Oml離心管中對突變體進行結(jié)合試驗。室溫下翻滾轉(zhuǎn)動反應(yīng)1 或3小時。通過離心分離除去未結(jié)合的蛋白。通過測量蛋白濃度(A28tl)來測定未結(jié)合的蛋白片段。也使用SDS-PAGE確定蛋白與微晶纖維素(Avicel纖維素)、BMCC和木聚糖的 結(jié)合。試驗物在0.5ml的最終反應(yīng)物體積中含有0-50mg微晶纖維素和50yg蛋白,且根 據(jù)上述的方法進行測定。使用緩沖液將含有結(jié)合蛋白的多糖塊清洗三次,并重懸于2. 5X Laemmli緩沖液,再煮沸10分鐘。分別使用10%或15% (w/v)的聚丙烯酰胺凝膠通過 SDS-PAGE分析結(jié)合和未結(jié)合的片段。對于比較CBM-GST和突變體與BMCC (2mg/mL)結(jié)合的 實驗,使用 Typhoon 9400 Variable Mode Imager (GE 衛(wèi)生保健)和 ImageQuant 軟件(GE 衛(wèi) 生保健),通過與不含纖維素的對照物進行比較以確定每種結(jié)合和未結(jié)合的片段的相對量。 每個實驗重復三次。在巴斯德畢赤酵母中的SlCel9Cl⑶的表達在巴斯德畢赤酵母(Invitrogen,Carlsbad CA)中生成重組SlCel9ClCD。通 過PCR(表1)將對應(yīng)于CD (氨基酸22-505)的cDNA擴增,并克隆進入pPIC9K載體 (Invitrogen)中。根據(jù)生產(chǎn)商(Invitrogen)的用戶指南生長并誘導(4d,16°C,250rpm)培 養(yǎng)物。培養(yǎng)物上清液調(diào)節(jié)到85%的硫酸銨中,將沉淀物重新懸于2. 5ml緩沖液A(50mM MES pH 6. 0,5mM CaCl2)中,接著用 PD-10 柱(Amersham Biosciences)除去鹽分。將洗脫液應(yīng) 用到HiTrapSP FF柱(GE衛(wèi)生保健)上,并用0-0. 6M NaCl的梯度進行洗脫。酶活性的鑒定根據(jù)(Irwin等人的 Biotechnol Bioeng 42 :1002_1013 (1993) ;Ghose 等人的 Pure Appl Chem 59 :257_268 (1987),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),在30°C下, 使用在0. 4ml緩沖液B中的細菌微晶纖維素(BMCC,2. 5mg/ml)、低粘度甲羧基纖維素(CMC, 1% w/v)和磷酸溶脹纖維素(ASC,0. 2% w/v)測定 Cel6/Cel9Cl FP、TfCel6A 和 the Cel6A CD的水解活性,試驗分別進行20、4和2小時,每個BMCC的實驗使用0. 4nmol蛋白,每個 CMC和ASC的試驗使用0. 067nmol蛋白。除非另有說明,在37°C下,根據(jù)(Lever等人的“A New Reaction for Colorimetric Determination ofCarbohydrates, "Anal Biochem 47: 273-279(1972),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)的記述,在總體積為100 μ 1的含有 每個多糖底物的最終濃度為0.2% (w/v)的緩沖液A中對SlCel9Cl CD的水解活性進行定 量,持續(xù)4小時。在25-72°C內(nèi),使用在緩沖液A中的1 % (w/v)低粘度CMC (Sigma)來確定 SlCel9Cl⑶活性的最適溫度,持續(xù)4小時。在37°C下,使用在緩沖液A (pH 4-8)中的 (w/v)低粘度CMC(Sigma)來確定SlCel9Cl⑶活性的pH曲線,持續(xù)進行4小時。為研究 鈣對活性的影響,在37°C下,4小時內(nèi)在反應(yīng)混合物中加入5mM CaCl2±10mM EDTA。除非 另有說明,在37°C下,在含有緩沖液A中的0.2% (w/v)多糖底物的100 μ 1反應(yīng)物中,對 SlCel9Cl CD的底物特異性進行試驗(圖6中列出的底物),持續(xù)進行4小時。
t艮據(jù)(Jung 等人的"DNA Sequences and Expression in Streptomyceslividans of an Exoglucanase Gene and an Endoglucanase Gene fromThermomonospora fusca, "Appl Environ Microbiol 59 :3032_3043 (1993),其全部內(nèi)容在此納入本文中作 為參考),在Whatman LK5D 150-A硅膠板上使用薄層色譜法(TLC)分析SlCel9Cl CD降解 纖維低聚糖(纖維二糖,G2 ;纖維三糖,G3 ;纖維四糖,G4 ;纖維五糖,G5和纖維六糖,G6 ; SeikagakuAmerica, Falmouth, MA)的能力以及得到的反應(yīng)產(chǎn)物,但是,使用兩種混合比例增 加的乙酸乙酯-水-甲醇(40 15 20,體積/體積)以分離低聚糖例外。
實施例1-植物EGase的模塊結(jié)構(gòu)
來自西紅柿的EGase在歷史上認為是TomCel 1_8 ;然而,根據(jù)作為Solanum Iycopersicum的西紅柿的名稱,將TomCel8重新命名為SlCel9Cl,以符合用于細菌EGase 的標準命名法(Henrissat 等人的"A Scheme forDesignating Enzymes that Hydrolyse the Polysaccharides in the Cell Wallsof Plants, "FEBS Lett 425 352-354(1998), 其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。該命名法提供了重要的信息,由于SlCel9Cl的 名字表明這種蛋白是來自GH家族9的西紅柿(Si)纖維素酶(Cel) (Linder等人的“The Roles andFunction of Cellulose-binding Domains,,,J Biotech 57 :15-28 (1997),其 全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),其含有C類(C)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(圖1A)。在植物EGase 總科中,A-C類分別對應(yīng)于單獨的膜錨定的分泌的GH9催化模塊,和在含有其它的C-末 端結(jié)構(gòu)域的組(圖 1A). Libertini 等人(Libertini 等人的 “Phylogenetic Analysis of the Plant Endo-beta-l,4-glucanase Gene Family,,,J Mol Evol 58:506-515(2004), 其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)提出,含有推定的CBM(C類,圖1A)的類是嵌套 在僅含有CD (B類,圖1A)的較大組內(nèi)的亞組。然而,考慮到內(nèi)含子/外顯子組織,它們 的系統(tǒng)發(fā)育研究主要集中在DNA序列,并提供了進一步進化的前景。同源的蛋白序列清 楚地表明植物GH9 EGase家族具有模塊式的組織,該組織含有3個不同的亞組(圖1A)。 EGases可能源于古代真核生物始祖,所述始祖先于真核生物王國的趨異演變(Davison等 人的“Ancient Origin ofGlycosyl Hydrolase Family 9 Cellulase Genes, "Mol Biol Evol 22 =1273-1284 (2005),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),因此是普遍存在的。 因此,包括A和B類的成員的GH9基因已經(jīng)在很多原始植物分類中確認,例如苔蘚、蕨類 植物和蘇鐵類(Libertini 等人的 “Phylogenetic Analysis of thePlant Endo-beta-l, 4-glucanase Gene Family, "J Mol Evol 58 :506_515 (2004),其全部內(nèi)容在此納入本文 中作為參考)。在苔蘚小立碗蘚中額外地存在用類似的推定的CBM編碼預期的EGase的 EST (登錄號BJ591253),這進一步表明所有的三個亞類都存在于整個植物界中。C類EGase的推定的CBM結(jié)構(gòu)域通常具有100-110個氨基酸,數(shù)據(jù)庫的BLAST 檢索表明這些結(jié)構(gòu)域與微生物家族2CBM最為類似。SlCel9Cl和選擇的植物直向同源 物的推定的CBM的氨基酸與糞堿纖維單胞菌木聚糖IOA的家族2a CBM對比(圖1B), 表明特定的殘基保守,該殘基已經(jīng)通過實驗測定對家族2a CBM與纖維素(在CBM2a中 的 W17、W54 禾口 W72)的結(jié)合很重要,(McLean 等人的 “Analysis of Binding of the Family 2aCarbohydrate-binding Module from Cellulomonas fimi xylanase IOA toCellulose :Specificity and Identification of Functionally Important AminoAcid Residues, "Protein Eng 13 :801_809 (2000),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),如圖 IB中的星號所示。然而,較低整體程度的氨基酸序列一致性(約18% )低于閾值,所述閾 值估計為至少 35% (Sanchez 等人的"Large-scale Protein Structure Modeling of the Saccharomyces cerevisiaeGenome,nProc Natl Acad Sci USA 95 :13597_13602(1998),其 全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),有必要得出關(guān)于它的結(jié)構(gòu)或潛在功能的結(jié)論。因此, 采用生物化學方法測定推定的CBM結(jié)構(gòu)域是否在碳水化合物結(jié)合中起作用。實施例2- SlCel9Cl CBM底物結(jié)合研究在E. coli或巴斯德畢赤酵母中多次嘗試表達全長SlCel9Cl蛋白都一直產(chǎn)生兩種含有預期大小的CD和CBM的多肽,但是其不含有預期大小的天然蛋白。這可能反映 連接子區(qū)域?qū)Φ鞍姿獾母呙舾行?,其普遍存在于細胞培養(yǎng)中(Irwin等人的Biotechnol Bioeng 42 :1002-1013(1993),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。做了很多嘗試來解 決這個問題,例如改變培養(yǎng)物的PH、溫度、培養(yǎng)基組分以及加入各種蛋白酶抑制劑雞尾酒, 但都沒有成功。因此,采用兩種可替代的策略來確定C-末端的域是否是功能CBM。
為建立SlCel9Cl CBM作為模塊EGase酶的一部分能夠加強纖維素結(jié)合,生成了嵌 合蛋白(Cel6/Cel9Cl FP),其包括 TfCel6A 的 CD、從 T. fusca 明確鑒定的 EGase (Bujnicki 等人的“Structure Prediction Meta Server, "Bioinformatics 17 :750_751 (2001),其全 部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),該嵌合蛋白經(jīng)設(shè)計以用來取代它自己的含有SlCel9Cl CBM的家族2的CBM。Cel6/Cel9Cl FP與兩種結(jié)晶纖維素底物,BMCC和Avicel的結(jié)合與完 好的TfCel6A和TfCel6A⑶的結(jié)合進行單獨的比較。TfCel6A表明與BMCC有最大的結(jié)合, 大約80%的蛋白結(jié)合到底物(圖2A)中。TfCel6A CD在該實驗中用作陰性對照,如預期那 樣,其沒有結(jié)合到BMCC,因其缺少CBM,而在高的底物濃度時,Cel6/Cel9Cl FP結(jié)合到幾乎 全部的BMCC以及TfCel6A上。因此,在這些條件下,SlCel9Cl CBM具有與TfCel6A CBM2 相同的結(jié)合度,且其功能是用作不連續(xù)的纖維素結(jié)合模塊,這是來自植物EGases的第一個 報道的例子。使用Avicel作為結(jié)合底物進行基于凝膠的定性試驗也得到類似的結(jié)果(圖 2B)。實施例3 SlCel9Cl CBM對溶纖活性的影響相信EGase CBM的重要功能是,通過增加⑶與它的底物之間的局部聯(lián)系的持續(xù)時 間和程度來增強纖維素水解。為了測定這是否適用于SlCel9Cl CBM,將在三種纖維底物上 的Cel6/Cel9Cl FP的水解活性與TfCel6A和TfCel6A CD的水解活性進行單獨的對比(表 3)。所有的三種蛋白都水解結(jié)晶BMCC,但是單獨的Cel6/Cel9Cl FP和TfCel6A CD僅分別 具有29%和56%的TfCel6A活性。相反,TfCel6A和TfCel6A CD對酸溶脹纖維素(ASC)、 不能溶解的、非結(jié)晶纖維素底物具有相同的活性。盡管非結(jié)晶底物上的活性不需要CBMJfi 是Cel6/Cel9Cl FP仍然僅僅具有其它酶的特異性活性的一半。對于這種減少的活性,一種 可能的解釋是Cel6/Cel9Cl FP的兩個結(jié)構(gòu)域之間的電荷差,因為TfCel6A⑶和CBM的預 期Pl分別為5. 9和4. 2,而SlCel9Cl⑶和CBM結(jié)構(gòu)域的預期pi則分別為8. 1和10. 1。在 由柔性連接子區(qū)域連接的FP的兩個結(jié)構(gòu)域之間的這種較大的電荷差(4. 2pl單位)可促進 內(nèi)域聯(lián)系,其可能阻礙底物進入活性部位裂口。表3在細菌微晶-(BMCC)、羧甲基-(CMC)和酸性溶脹纖維素(ASC)上的Cel6A/ Cel9Cl融合蛋白(FP)的活性( μ摩爾的纖維二糖/分鐘/ μ摩爾蛋白)BMCCASCCMCΤ. Fusca Cel6A0. 34 士 0. 0123.79 士 1.96 52. 70 士 4. 18T. Fusca Cel6A CD 0.19士0.0123. 52士2. 77 42. 90士2. 89Cel6A/ Cel9Cl FP 0.11 士0.0112. 68士2. 90 35. 14士0. 04因為推論這個單鏈的可溶的多糖可更容易進入活性部位,得到比含有BMCC或ASC 更大的活性,通過測試含有CMC、可溶的、非結(jié)晶纖維素聚合物的三種蛋白的活性進行研究 (表3)。這證明了所有的三種蛋白的情況確實如此(表3),但是Cel6/Cel9Cl FP的活性仍然小于TfCel6A或TfCel6A CD的活性,其支持以下觀點即在活性部位的位阻是造成活性減少的原因。然而,基于與Cel6/Cel9Cl FP的結(jié)合數(shù)據(jù)的結(jié)果,纖維素底物看來完全可到 達CBM。另一解釋是兩個模塊的構(gòu)造是催化結(jié)構(gòu)域與底物在空間上隔開,導致底物可達性減 少,繼而其活性減少。 實施例4_SlCel9Cl CBM的定位突變 為進一步檢測SlCel9ClCBM的性質(zhì)和得到重要的結(jié)構(gòu)-功能信息,使用可計 算的建模來識別可能對纖維素的結(jié)合有幫助的殘基。結(jié)構(gòu)預測群體服務(wù)器(Structure Prediction Meta Server) (SPMS)的“3-D Jury”評分函數(shù)用來識別 SlCel9Cl CBM 的可能的 折疊結(jié)構(gòu)(Ginalski 等人的“3D-Jury :ASimple Approach to Improve Protein Structure Predictions, "Bioinformaticsl9 1015-1018 (2003) ;Xu 等人的“Solution Structure of a Cellulose—bindingDomain from Cellulomonas fimi by Nuclear Magnetic Resonanc eSpectroscopy, ”Biochemistry 34 :6993_7009 (1995),其全部內(nèi)容在此引入本文中作為參 考)。這種方法識別兩種可替代的類似免疫球蛋白的β三明治折疊體,且評分等級為最“重 要”的結(jié)構(gòu)是來自糞堿纖維單胞菌(PDB,1EXG)的外一1,4- β -D葡聚糖酶家族2 CBM和人 類ADP-核糖基化因子結(jié)合蛋白GGAl (PDB, 1ΝΑ8)。這些結(jié)果表明SlCel9Cl CBM的結(jié)構(gòu)與已 知的微生物CBM的結(jié)構(gòu)不同,但是與IEXG微生物CBM的相似度允許預測這個結(jié)構(gòu)域的通常 的拓撲機構(gòu)并生成三維模型。 基于C. f imi木聚糖酶IOA (IEXG)的CBM2模板的SlCel9Cl CBM結(jié)構(gòu)域的精 制模型(圖3A)與母結(jié)構(gòu)的桶裝折疊特征(即在最終對比中只有少數(shù)幾個短的插 入/缺失)緊密相配。來自C.fimi的CBM2是稱為A類的CBM的較大組的成員,其通 過與在平的結(jié)合平面上的芳香殘基介導的配體的疏水堆積作用與結(jié)晶底物的表面連 接(Boraston 等人 StJ"Carbohydrate-binding Modules :Fine-tuning Polysaccharide Recognition, "Biochem J 382 769-781 (2004) ;McLean ^AWAnalysis of Binding of theFamily 2a Carbohydrate-binding Module from Cellulomonas fimi xylanaselOA to Cellulose :Specificity and Identification of Functionally ImportantAmino Acid Residues,”Protein Eng 13 :801_809 (2000),其全部內(nèi)容在此并入本文中作為參 考))。接下來,在確定的定點突變研究之前,使用可計算的模型引導識別在纖維素結(jié)合中 具有可能的重要作用的殘基。正如使用IEXG模板那樣,含有明確限定的疏水核的模型由 多于五個芳香殘基組成。這些包括SlCel9Cl的W522,圖IB的序列對比最初表明其可能表 示一種C. fimiCBM2 (IEXG)的結(jié)合纖維素的殘基(W17);然而,在可預測的模型中,它對應(yīng) 于在C. fimi CBM2中的疏水核中的W12。推斷的功能重要的SlCel9ClW559和W573的殘基 被提出在模板中與W54和WI2對比(圖3A),其與已知的CBM的特征一致(Brummell等人 的"Cell Wall Metabolism inFruit Softening and Quality and its Manipulation in Transgenic Plants,”Plant Mol Biol 47 :311_3401 (2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中 作為參考)。所述模型進一步表明SlCel9Cl的W529可能在空間上與IEXG的W17類似,從 而表示第三個潛在的結(jié)合位點(圖3A)。之前使用C. fimi CBM2a也表明這個結(jié)合位點可 由Trp或Tyr殘基占據(jù),而無需纖維素的結(jié)合(McLean等人的“Analysis of Binding of the Family 2a Carbohydrate-binding Modulefrom Cellulomonas fimi xylanase IOA to Cellulose :Specificity andldentification of Functionally Important Amino AcidResidues,”ProteinEng 13 :801_809 (2000),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考))。有 趣的是,W529在來自在C類中的其它植物EGase的CBM之間是保守的,進一步表明了其重 要的功能作用(圖1B)。
為促進定位突變體的蛋白表達和純化,SlCelQA的CBM和相關(guān)突變的變體表達為 C-末端的融合蛋白,該融合蛋白通過10個氨基酸連接子(GST-CBM)連接到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn) 移酶上。在使用親和純化蛋白的共同培養(yǎng)試驗中,GST-CBM結(jié)合到BMCC,而GST作為陰性對 照單獨測定,表明沒有結(jié)合圖3B),這證明當SlCel9Cl CBM融合到GST和在E. coli中表達 時,其也用作功能性纖維素結(jié)合模塊。為了確定以上討論的任何保守的芳香殘基(圖3A)是否有助于在SlCel9Cl CBM 與纖維素之間的相互作用,以下的殘基都單獨地突變成丙氨酸W522、Y529、W559和W573。 通過模型預測后面的3個殘基是表面暴露的,因此有可能介導與結(jié)晶纖維素的堆積相互作 用,而預測W522附在模塊的疏水核上(圖3A)。選擇的芳香殘基的非保守置換為丙氨酸支持一些但不是所有的基于結(jié)構(gòu)模型的 預言。W573A突變體對結(jié)合(圖3C)的影響最大,導致未突變的GST-CBM(WT)的結(jié)合能力小 于10%。類似地,W522A和W559A突變體分別表現(xiàn)出結(jié)合減少25%和30%。然而,當與WT 比較時,Y529A突變對結(jié)合沒有明顯影響(圖3C),這表明它對與纖維素的相互作用沒有起 作用。因此,W559A和W573A突變體的結(jié)果支持源自模型的預測。在W522的情況下,觀察 到的結(jié)合的減少可能是由于疏水核的打斷而引起結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性喪失,或者它的建模錯誤 而實際上表面暴露在外。實施例5_SlCel9Cl CD的特征仍然沒有建立植物EGase的體內(nèi)底物,少數(shù)幾個使用各種純化的天然的或重 組的同工酶的體外研究仍沒有顯示底物特異性的一致性模型。大部分以生物化學鑒定 的植物EGase屬于B類,包括分泌的GH9⑶,且通常它們?nèi)慷季哂蠧MC酶活性,而沒 有對抗結(jié)晶纖維素的活性,已經(jīng)報道了對抗含有內(nèi)i3_l,4-Glc連接的潛在的細胞壁底 物的不同活性,包括混合連接的(1,3),(l,4)-i3-D-葡聚糖(MLG)、葡甘露聚糖和木葡 聚糖(Rose 等人的 ThePlant Cell Wall, Blackwell Publishing, pp. 264-324(2003); Master 等 人 的"Recombinant Expression and Enzymatic Characterization of PttCel9A, aKOR Homologue from Populus tremula χ tremuloides,,,Biochemistry43 : 10080-10089(2004);其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。也已經(jīng)使用不同的底物測 試兩種A類EGase (甘藍型油菜BnCel 16和白楊PttCel9A)的活性,并且還核實了其不同 點(Molho j 等人的"Characterization of aFunctional Soluble Form of a Brassica napus Membrane-anchoredEndo-1,4-beta-glucanase Heterologously Expressed in Pichia pastoris,”Plant Physiol 127:674-684(2001) ;Woolley 等人的"Purification andProperties of an Endo-beta-1,4-glucanase from Strawberry andDown-regulation of the Corresponding Gene,Cell, "Planta 214 :11_21 (2001),其全部內(nèi)容在此納入本文 中作為參考)。兩者都表明對非結(jié)晶纖維素CMC和ASC具有高度活性,但是對結(jié)晶纖維素、 木葡聚糖、MLG或木聚糖顯示很少活性甚至沒有活性(Molhoj等人的“Characterization of aFunctional Soluble Form of a Brassica napus Membrane-anchoredEndo-1, 4-beta-glucanase Heterologously Expressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol127 674-684(2001) ;Woolley等人的“Purification andProperties of an Endo-beta-l, 4-glucanase from Strawberry andDown—regulation of the Corresponding Gene, Cell," Planta 214 :11_21 (2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),且僅僅是 PttCel9A水解纖維-低聚糖。至今,還沒有關(guān)于植物C類EGase的底物特異性的報道,因此,在檢測對各種細 胞壁多糖和纖維素底物的活性之前,對重組SlCel9Cl CD活性的最適溫度和pH進行試 驗。在37°C,經(jīng)SlCel9Cl⑶進行的對低粘度CMC的水解是最佳的(圖4A),因此這個 溫度將用于以后所有的試驗。許多公開的報道描述了在25-30°C的試驗條件下測定植 ^ W EGase ^ (Molho j ^AW "Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassica napusMembrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanase Heterologously Expressed inPichia pastoris, "Plant Physiol 127:674-684(2001) ;Maclachlan φ 人的Method Enzymol 160 :382_391 (1988),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),但需 要注意的是,SlCel9Cl⑶在這些溫度下的活性少于一半。也鑒定了 SlCel9Cl WpH曲 線,在該曲線上可以觀察到最適活性在PH 4. 5與6. O之間(圖4B),其與之前鑒定的A 類植物 EGases 得到的結(jié)果相似(Molhoj 等人的 “Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassicanapus Membrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanase HeterologouslyExpressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127 674-684(2001); Woolley 等 人 ^"Purification and Properties of an Endo-beta-l,4-glucanase fromStrawberry and Down-regulation of the Corresponding Gene, Cel 1,,,Planta214 : 11-21 (2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。還進一步觀察到活性需要鈣,以及, 相反地,也觀察到鈣螯合劑抑制活性。當在最適PH和溫度下測定底物特異性時,用大麥MLG 觀察到最高的活性,然后是使用阿拉伯糖基木聚糖、中等粘度的CMC、低粘度的CMC,然而也 存在使用阿拉伯樹膠酸和羅望子木葡聚糖觀察到的可以忽略的活性(圖5)。用西紅柿水果 或西紅柿懸液培養(yǎng)的細胞的BMCC或木葡聚糖沒有檢測到活性。通過SlCel9Cl⑶對纖維低聚糖(G2-G6)進行的水解用TLC來評估圖6)。用纖維 六糖(G6)觀察到最高活性,然后在纖維五糖(G5)和纖維四糖(G4)上觀察到顯著減少的活 性。水解產(chǎn)物為G6消化生成G3、G4和G2 ;G5裂解成G3和G2 ;G4水解生成G2和G3 (圖 6)。這些結(jié)果與之前的A類和B類的植物GH9 EGases的研究一致,所述的植物GH9 EGase 看來具有親和性更高的⑶結(jié)合亞位點,其能結(jié)合至少6個連續(xù)的1,4-β -連接的Glc單 兀(Woolley 等人 "Purification and Properties of anEndo-beta- 1,4-glucanase from Strawberry and Down-regulation of theCorresponding Gene,Cell,,,Planta 214 :11-21(2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。植物A類EGase也顯示僅 僅裂解 G5 和 G6(Molhoj 等人的“Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassica napusMembrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanase Heterologously Expressed inPichia pastoris, ”Plant Physiol 127 :674_684 (2001) ;Eckert 等人的 "GeneCloning,Sequencing,and Characterization of a Family 9 Endoglucanase(CelA) with an Unusual Pattern of Activity from the ThermoacidophileAlicyclobacillus acidocaldarius ATCC27009,” Appl Microbiol Biotechnol60 :428_436 (2002)其全部內(nèi) 容在此納入本文中作為參考)。然而,用C類SlCel9Cl⑶在G4上觀察到的額外的活性,這在之前沒有報道過。這種結(jié)果證實了之前的假設(shè)(Molhoj等人的“Characterization of a FunctionalSoluble Form of a Brassica napus Membrane-anchoredEndo—l, 4-beta-glucanase Heterologously Expressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127 =674-684(2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),即在C類植物EGase的催化 裂口中的W316的存在可促進G4的裂解,其中所述的C類是在這個位置上保留Trp的唯一 類別。為進一步確認TLC數(shù)據(jù),使用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)來鑒定由G5消化得到的產(chǎn)物。這證明產(chǎn)生了 G3和G2,但并沒有產(chǎn)生其它的糖類。還 注意到,市售的G6底物含有少量的G7,因此不會產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖基活性(樣品6,圖6)。
當與之前研究的A或B類植物EGase的那些進行比較時,SlCel9Cl⑶具有寬的底 物特異性。寬的底物范圍對微生物GH9酶是不常見的(Molhoj等人的“Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassicanapus Membrane-anchored Endo-I, 4-beta-glucanase HeterologouslyExpressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127:674-684(2001) ;York 等人的"The Structures of Arabinoxyloglucans Produced by SolanaceousPlants,,,Carbohydr Res 285 :99_128 (1996),其全部內(nèi)容在此納入本文 中作為參考),且以前也在微生物的GH9家族的成員中檢測到木聚糖酶的活性。最初在市 售的長豆角半乳甘露聚糖上檢測到一些水解活性,其通過測量還原基團而測定。然而,通 過隨后的粘度分析沒有觀察到半乳甘露聚糖解聚,且當用純63,64-a-D-半乳糖基-甘露 五糖孵育和經(jīng)MALDI-TOF MS測定時,所述酶并沒有生成反應(yīng)產(chǎn)物。因此,水解活性可能是 由于含有少量未知的多糖的市售半乳甘露聚糖的污染而引起的。將用大麥MLG的高活性 與之前報道的通過在苔蘚上的柏楊A類EGase (另一 MLG底物)所表現(xiàn)出的低活性進行比 較(Molho j 等人的"Characterization of a Functional Soluble Form of aBrassica napus Membrane-anchored Endo-I,4-beta-glucanaseHeterologousIy Expressed in Pichia pastoris, "Plant Physiol 127 :674_684(2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為 參考)。然而,大麥β-葡聚糖MLG在β-1,3-糖苷鍵之間有較長的β-1,4-葡聚糖的一段 序列,這可使它用作更好的底物。也報道了另一 A類酶、即甘藍型油菜Cell6對大麥MLG具 有可以忽略的活性(Woolley 等人的 “Purification and Properties of anEndo-beta-l, 4-glucanase from Strawberry and Down-regulation of theCorresponding Gene, Cell," Planta 214 :11-21 (2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。用葡聚 糖觀察到的最小活性與之前的植物EGase的研究一致(Master等人的“Recombinant Expression and EnzymaticCharacterization of PttCel9A, a KOR Homologue from Populus tremula xtremuloides, "Biochemistry 43 10080-10089(2004); Molhoj 等人的"Characterization of a Functional Soluble Form of a Brassica napusMembrane—anchored Endo-I,4-beta-glucanase Heterologously Expressed inPichia pastoris, "Plant Physiol 127:674-684(2001) ;Woolley等人的“Purification and Properties of an Endo-beta-1,4-glucanase fromStrawberry and Down-regulation of the Corresponding Gene, Cell,”Planta214 :11-21 (2001),其全部內(nèi)容在此納入本 文中作為參考),且可能反映未取代的1,4-β -連接的Glc殘基充分靠近的一段序列較罕 見,盡管令人感興趣的是,羅望子木葡聚糖是比西紅柿木葡聚糖稍微好點的底物,即使前 者表現(xiàn)出更大程度的側(cè)鏈分支(Pauly等人的“Molecular Domains of theCellulose/xyloglucan Network in the Cell Walls of Higher Plants,"Plant J20 :629_639 (1999), 其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。結(jié)構(gòu)類似的TfCel9A也缺少對木葡聚糖的活 性,表明高水平的分支鏈可能妨礙進入催化裂口(Molhoj等人的“Characterization of a Functional Soluble Form of aBrassica napus Membrane-anchored Endo-I, 4-beta-glucanaseHeterologousIy Expressed in Pichia pastoris,"Plant Physiol 127 :674-684(2001),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。
本發(fā)明提供第一個植物EGaSe(SlCel9Cl)的報道,其含有有助于與結(jié)晶纖維素結(jié) 合的功能性的模塊式的CBM。類推微生物的研究,這表明C類植物EGase在促進纖維素降解 中起作用。一個可能性是它們在不可逆的壁分解相關(guān)的過程中起作用,例如水果變軟和器 官切除。在成熟的水果中觀察到SlCel9Cl的轉(zhuǎn)錄豐度增加,其相當于快速的壁降解,這可 以支持前述的觀點。然而,應(yīng)該注意的是,SlCel9Cl的體外底物特異性看來比大多數(shù)已知的 GH9酶要寬。或者,C類EGase可用來在纖維素微纖維周圍水解多糖鏈,所述微纖維包括無定 形或類晶體纖維素鏈和其它相關(guān)的聚合物。事實上,據(jù)報道,木葡聚糖聚合物的子類與微纖 維表面緊密結(jié)合,因此難以接近不具有CBM的木葡聚糖(Harpster等人的“Suppression of a Ripening-relatedEndo—l,4—beta-glucanase in Transgenic Pepper Fruit Does Not PreventDepolymerization of Cell Wall Polysaccharides During Ripening, 'T1IantMol Biol 50 :345-355(2002),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。雖然有足夠的證據(jù) (balance of evidence)表明大多數(shù)GH9 EGase不水解木葡聚糖(Rose等人的The Plant Cell Wall, Blackwell Publishing,pp.264—324(2003) ;Master 等人的“Recombinant Expression and Enzymatic Characterizationof PttCel9A, a KOR Homologue from Populus tremula χ tremuloides, "Biochemistry 43 :10080—10089 (2004),其全部內(nèi)容 在此納入本文中作為參考),這個結(jié)論幾乎只是基于使用非天然的底物的體外試驗。此 夕卜,木葡聚糖可采用更易于攻擊的細胞壁(in muro)構(gòu)象。使用轉(zhuǎn)基因植物的一個研究也 表明植物EGase不會在體內(nèi)水解木葡聚糖;然而,這包含無CBM的B類EGase (Rose等人 的"Cooperative Disassembly of theCellulose-xyloglucan Network of Plant Cell Walls !Parallels Between CellExpansion and Fruit Ripening. ,,,Trends Plant Sci 4 :176-183(1999),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。多糖的構(gòu)象和定位可能通 過它們與纖維素的相互作用而受到較大影響(Rose等人的“Cooperative Disassembly of theCeIlulοse-xyloglucan Network of Plant Cell Walls !Parallels Between CellExpansion and Fruit Ripening. ,,,Trends Plant Sci 4 176-183 (1999) ;Chen 等人 !^"Endoxylanase Expressed During Papaya Fruit Ripening-Purification, Cloning and Characterization, "Funct Plant Biol 30 :433_441 (2003),其全部內(nèi)容在此納入本 文中作為參考),因此體外分析的結(jié)果應(yīng)該謹慎解釋。第三個特定的情形(scenario)是CBM的主要功能是使⑶靶向相關(guān)的底物,以促 進細胞壁微域的修飾,然后CD和CBM模塊的蛋白水解分離。已經(jīng)給模塊式的木聚糖酶提出 過這種水解醇標革巴機制(Downes 等人的 “Expression and Processing of a Hormonally Regulated Beta-Expansinfrom Soybean,"Plant Physiol 126:244—252(2001),胃 全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),翻譯后的蛋白質(zhì)水解已建議另一植物壁的解散 蛋白、β-擴展蛋白的激活機制(Shpigel等人的“Bacterial Cellulose-binding DomainModulates In Vitro Elongation of Different Plant Cells,,,Plant Physiolll7 1185-1194(1998),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)。最后,C類EGase可能包含在壁裝配中,例如通過在生物合成的過程中調(diào)節(jié)纖維素 結(jié)晶度,因此,其在細胞擴增中起作用。業(yè)已顯示,將外源細菌CBM應(yīng)用到植物組織中能導 致生長增加(Shoseyov的美國專利6,184,440,其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),已 報道表達細菌CBM的轉(zhuǎn)基因煙草植物比其同類型的野生植物生長的速度更快,產(chǎn)出的生物 質(zhì)也更多。這種現(xiàn)象歸因于干擾微纖維生物合成和結(jié)晶的CBM。植物C類EGase基因的表達與降解過程(如水果軟化和切斷)有關(guān) (Trainotti 等人的"A Novel Ε-type Endo-beta-1,4-glucanase with a PutativeCellulose-binding Domain is Highly Expressed in Ripening StrawberryFruits. , "Plant Mol Biol 40: 323-332(1999) ;Trainotti ^AW "PpEG4 is aPeach Endo-beta-1,4-glucanase Gene whose Expression in ClimactericPeaches does not Follow a Climacteric Pattern,"J Exp Bot 57 :589-598(2006),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考),以及和細胞延長 (Arpat 等人的"Functional Genomics of Cell Elongation in Developing Cotton Fibers, "Plant Mol Biol 54 :911_929 (2004),其全部內(nèi)容在此納入本文中作為參考)有 關(guān),因此,這些蛋白可具有多種生理機能。實施例6-S1CGH9C1 和 S1GH9C1-CBM49 的過量表達S1GH9C1的組成型過量表達載體是通過插入編碼區(qū)創(chuàng)建的,該編碼區(qū)包括代替在 二元載體 pCAMBIA 1305. 2(CAMBIA, Canberra, Australia)中的 GUS 基因的天然信號肽和 終止密碼子,其由CaMV 35S啟動子驅(qū)動。弓丨物對5 ‘ -GCCCCATCATGAAATGAAGGGTTTTGTTGG-3' (SEQ ID N0:17)/5' -CGCCGGGTGACCTTTAGACTAGAGTGT-3‘ (SEQ ID NO 18)用于擴增 對應(yīng)于氨基酸1-625的完整S1GH9C1編碼區(qū),擴增產(chǎn)物用BspHI/BstEII裂解,載體用NcoI/ BstEII切開。過量表達的S1GH9C1 CBM49的構(gòu)建體是通過插入包括終止密碼子CBM 49編 碼區(qū)來取代GUS基因而創(chuàng)建,所述CBM49位于二元載體pCAMBIA 1305. 2 (CAMBIA, Canberra, Australia)的過氧化氫酶信號序列的下游,且與其框內(nèi)連接,并由CaMV 35S啟動子驅(qū)動。 引物對 5' -CCAGTCCCAGATCTTGCTCATGTTACTATTC-3' (SEQ ID N0:19)/5' -CGCCGGGTGA CCTTTAGACTAGAGTGT-3 ‘ (SEQ ID NO 18)用于擴增對應(yīng)于 S1GH9C1 的氨基酸 527-615 的 S1CBM49編碼區(qū),擴增產(chǎn)物和載體都用BspHI/BstEII裂解。消化的PCR產(chǎn)物和載體連接并 轉(zhuǎn)化至E. coli XLlO-Gold(Stratagene)??寺〉牟迦胛镌谳d體上測序,所述的載體含有對 35S啟動子有特異性的正向定向的引物和反向定向的引物5' -CGCCGGGTGACCTTTAGACTAGA GTGT-3 ‘ (SEQ ID NO 18)。得到的質(zhì)粒35S: :S1GH9C1和35S: :S1CBM49轉(zhuǎn)化至A. tumefaciens,并隨后轉(zhuǎn)化至 前述的種植阿拉伯芥(Arabidopsis ecotype Columbia)。在前述的1 2 1隔離的潮霉 素平板上篩選T3種子,以識別與用于進一步分析的插入純合的T2植物。轉(zhuǎn)基因植物顯示從種子萌芽后的5天起,根和枝的生物質(zhì)都增加,也表明生長速 率加快。實施例7-擬南芥莖的寬角度X射線衍射(WAXS)分析使用同步加速輻射X射線微光束分析,在Cornell高能同步加速源上進行試驗,以 得到EGase如何影響纖維素微纖維的特性的原子水平的結(jié)構(gòu)信息。將具有C類EGase的突變體的擬南芥植物與設(shè)計成組成性地表達完整S1GH9C1或它的位于植物細胞壁上CBM49 的植物進行比較。在C類EGaSeGH9C2(Atlg64390)中的兩種突變體等位基因在纖維素結(jié)晶 度調(diào)節(jié)中使CBM49的功能清楚地顯示出來。gh9c2-l中的突變導致在GH9催化結(jié)構(gòu)域的活 性位點上有67個氨基酸丟失,使得所述蛋白無水解活性;然而,它保留了它的CBM49。在相 同基因gh9c2-2中的另一獨立的突變是由于導致待翻譯的蛋白僅有106個氨基酸的移碼引 起的,從而使得GH9和CBM49結(jié)構(gòu)域丟失。當在前述的GH9C2突變體中的纖維素的微晶結(jié) 構(gòu)尺寸與野生型植物的尺寸進行比較時,完全丟失兩個結(jié)構(gòu)域(gh9c2-2)的突變體顯示微 晶尺寸增大,其中催化突變體(gh9c2-l)導致尺寸適當增大(表4)?;贑BM49結(jié)構(gòu)域用 作調(diào)節(jié)纖維素結(jié)晶度的模型,可以預期,當除去這個結(jié)構(gòu)域時,正如在gh9c2-l和其它含有 CBM49的突變體中所觀察到的那樣,微晶尺寸因此增大,如下表所示(表4)。
表4.擬南芥突變體的莖組織的纖維素的微晶尺寸Col. 單個的葡聚糖鏈之間的氫鍵結(jié)合的程度是影響結(jié)晶度的主要因素。當因轉(zhuǎn)基因表 達而使得存在于壁上的CBM49的量增加時,觀察到對纖維素結(jié)晶度的相反影響。圖7中所 示為野生型擬南芥的莖的片段上和組成性地表達來自西紅柿S1GH9C1的CBM49的植物的X 射線衍射模型的例子。在35S::CBM49植物中,當與野生型(WT)的未轉(zhuǎn)化的植物相比時,結(jié) 晶材料的質(zhì)量更小。微晶主軸的分布在35S: :CBM49植物中明顯更寬,正如圍繞相當于200 反射的環(huán)的更均勻的強度所示的那樣。因此,所述纖維素在35S: :CBM樣品中顯然沒有很好 地定向,且在35S::CBM49植物中的微晶與野生型的微晶不類似。然而,盡管定向明顯破壞, 微晶尺寸大體上不會改變。
JTs.過量表達植物的莖的組織的纖維素的微晶尺寸
基因型Col. VT_35S: CBM49 35S::S1GH9C1
—微晶尺寸 I27 A 26 A 30 A盡管在此詳細地描述了優(yōu)選的實施方式,但是,在不脫離本發(fā)明的精神的情況下, 本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員顯然可作出很多的改變、增加、替換等等,因此,以上所有的這些都 應(yīng)包含在本發(fā)明所附的權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
轉(zhuǎn)基因植物細胞,其包括核酸構(gòu)建體,所述的核酸構(gòu)建體包括編碼植物內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶的核酸分子,其中植物內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶各自具有模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域,或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域;植物啟動子;以及植物終止序列,其中所述植物啟動子和植物終止序列可操作地與所述核酸分子偶聯(lián),且至少所述植物啟動子或植物終止序列之一與所述核酸分子異源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞,其特征在于,所述的啟動子是組成型啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞,其特征在于,所述的啟動子是組織特異性的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞,其特征在于,所述的啟動子是植物莖特異 性的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞,其特征在于,所述的啟動子是誘導型的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞,其特征在于,所述的核酸分子編碼選自以 下的植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶:Atlg48930、Atlg64390、At4gll050、TomCel8、SlCel9Cl、 SIGH9C1、0s04g0674800、OsGlu6、0s01g0220100、OsCel9A、OsGlu5、0s01g0219600、OsCel9B 和 OsGlu7。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物細胞,其特征在于,所述的核酸分子編碼選自 以下的植物內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶:Atlgl0050、Atlg58370、At4g08160、At2gl4690、 At4g33860、At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、0s03g0672900 和 PttXynlOA。
8.—種轉(zhuǎn)基因植物種子,其特征在于,所述轉(zhuǎn)基因植物種子包含如權(quán)利要求1所述的 轉(zhuǎn)基因植物細胞。
9.一種轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述轉(zhuǎn)基因植物包含如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植 物細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述的啟動子是組成型啟動子。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述的啟動子是組織特異性的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述的啟動子是植物莖特異性的。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述的啟動子是誘導型的。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述的核酸分子編碼選自以下 的植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶:Atlg48930、Atlg64390、At4gll050、TomCe 18, SlCel9Cl、 SIGH9C1、0s04g0674800、0sGlu6、0s01g0220100、0sCel9A、0sGlu5、0s01g0219600、0sCel9B 和 0sGlu7。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物,其特征在于,所述的核酸分子編碼選自以下的 植物內(nèi)切-1,4-β -木聚糖酶:Atlgl0050、Atlg58370、At4g08160、At2gl4690、At4g33860、 At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、0s03g0672900 和 PttXynlOA。
16.一種權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物的組成部分。
17.一種多糖解聚的方法,所述的方法包括提供根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物的生物質(zhì);以及 使所述的生物質(zhì)進行多糖解聚。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法,其進一步包括 使進行多糖解聚的生物質(zhì)發(fā)酵。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其特征在于,所述的發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。
20.一種轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法,所述的方法包括 提供核酸構(gòu)建體,該核酸構(gòu)建體包括編碼植物內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶的核酸分子,其 中所述植物內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚糖酶各自具有糖結(jié)合結(jié) 構(gòu)域,或編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域; 植物啟動子;以及植物終止序列,其中所述植物啟動子和植物終止序列可操作地與核酸分子偶聯(lián),且至 少所述植物啟動子或植物終止序列之一與核酸分子異源; 用核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細胞以生成轉(zhuǎn)基因植物細胞;以及 從轉(zhuǎn)基因植物細胞繁殖轉(zhuǎn)基因植物。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述的啟動子是組成型啟動子。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述的啟動子是組織特異性的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其特征在于,所述的啟動子是植物莖特異性的。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述的啟動子是誘導型的。
25.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述的核酸分子編碼選自以下的植物 內(nèi)切-1,4-β -葡聚糖酶:Atlg48930、Atlg64390、At4gll050、TomCel8、SlCel9Cl、SIGH9Cl、 0s04g0674800、OsGlu6、0s01g0220100、OsCel9A、OsGlu5、0s01g0219600、OsCel9B 和 OsGlu7。
26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法,其特征在于,所述的核酸分子編碼選自以下的植 物內(nèi)切 _1,4-β-木聚糖酶:Atlgl0050、Atlg58370、At4g08160、At2gl4690、At4g33860、 At4g33810、At4g33840、At4g38650、At4g33820、0s03g0672900 和 PttXynlOA。
27.一種多糖解聚的方法,所述的方法包括提供選自以下的植物酶植物內(nèi)切_1,4-β-木聚糖酶、植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶及 其混合物,其特征在于,所述的植物內(nèi)切-1,4- β -木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4- β -葡聚 糖酶各自具有糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域、編碼組成型催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和/或單個或多個模塊式的糖 結(jié)合結(jié)構(gòu)域;以及用生物質(zhì)在對多糖解聚生物質(zhì)有效的條件下培育植物酶。
28.一種識別能夠承受增強的多糖解聚的植物的方法,所述的方法包括 提供候選植物的集合;測定所述植物集合的生物質(zhì)的量和/或消化能力;以及將測定的集合中具有增加的生物質(zhì)的量和/或消化能力的植物標識為能夠承受增強 的多糖解聚的候選植物。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法,進一步包括使所述候選植物進行繁殖程序以生產(chǎn)子代植物。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法,進一步包括 使所述子代植物進行多糖解聚。
31.一種生產(chǎn)能夠承受增強的多糖解聚的植物的方法,所述的方法包括 提供植物的集合;在所述植物的集合中誘導突變,以產(chǎn)生突變的植物集合; 測定突變植物集合中的生物質(zhì)的量和/或消化能力;將測定的突變植物的集合中相對于非突變植物具有增加的生物質(zhì)的量和/或消化能 力的植物標識為與集合中的其它植物相比,能夠承受增強的多糖解聚的候選植物。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法,進一步包括 使所述候選植物進行繁殖程序,以生產(chǎn)子代植物。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法,進一步包括 使所述子代植物進行多糖解聚。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種包括核酸核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細胞。核酸構(gòu)建體包含編碼植物內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶的核酸分子,其中植物內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶和/或植物內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶各自具有模塊式的的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域,或多個模塊式的糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述核酸構(gòu)建體還包括植物啟動子和植物終止序列,其中植物啟動子和植物終止序列可操作地與核酸分子偶聯(lián),且至少植物啟動子或植物終止序列之一與核酸分子異源。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物、多糖解聚轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)移因植物的方法,以及識別能夠承受增強的多糖解聚的植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK101873794SQ200880103692
公開日2010年10月27日 申請日期2008年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者B·R·烏爾巴諾維奇, C·卡塔拉, J·羅斯 申請人:康乃爾研究基金會有限公司