專利名稱：通過熱處理降低因子Ⅶ多肽組合物中的二聚體含量的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及降低因子VII多肽組合物特別是包含因子VII變異體的組合物中二聚 體含量的方法。
背景技術：
參與凝血級聯(lián)的因子VII已證明為治療各種病理狀態(tài)的可用治療劑。因此，對包 含藥學可接受的并顯示均一和預定臨床功效的活化因子VII多肽的制劑的需求日益增長。在商業(yè)生產因子VII多肽的過程中，避免聚集物例如目標多肽的二聚體和寡聚體 的形成是一大難題。該類產物-相關雜質是不利的因為它們具有潛在的抗原性。通常避免 極端PH和高溫以控制生產過程中聚集物/ 二聚體的形成。WO 2007/026020A1涉及純化包含生產雙產物(biproduct)因子VII和因子VIIa 多肽的組合物并最小化因子VII或因子VIIa自體降解產物同時形成的方法。因此，關于因子VII多肽的生產，需要一種生產步驟藉此降低因子VII多肽二聚體 (包括更高級的寡聚體)的存在而不顯著降低產率。這將可以獲得更安全和更穩(wěn)定的藥物 并最終獲得更安全和更穩(wěn)定的藥品。發(fā)明概述本發(fā)明通過應用熱處理步驟降低二聚體(和更高級的寡聚體)的含量解決了之前 提及的問題。具體而言，本發(fā)明提供了降低包含因子VII多肽的組合物中二聚體含量的方法， 所述方法包括以下步驟(a)必要時將所述組合物的pH調節(jié)至4. 5-10. 0范圍內的值(于5°C測定)；(b)將該組合物加熱至20-50°C范圍內的溫度至少5分鐘；以及(c)接著冷卻組合物至最高為10°C的溫度。附圖簡述

圖1顯示了于37°C熱處理120分鐘的V158D/E296V/M298Q-FVII組合物樣品中二 聚體含量的變化。標度以分鐘計時。圖2顯示了除分別于23°C或37°C加熱或保存于5-8°C (對照)48小時之外三個相 同的V158D/E296V/M298Q-FVII組合物樣品中二聚體含量的變化。標度以小時計時。圖3顯示了本文所述發(fā)明結束后殘留HMWP(多聚體和寡聚體)、單體和鹽的量。圖4顯示了 V158D/E296V/M298Q-FVII組合物樣品中二聚體含量的變化，其中于 37°C熱處理168小時之前已將pH調節(jié)至9. 5。標度以小時計時。發(fā)明詳述如上文所述，本發(fā)明涉及降低包含因子VII多肽的組合物中二聚體含量的方法。 該方法可有利地應用于生產因子VII多肽的總過程的最后階段，因為對組合物的進一步操 作，包括加熱、PH變化、與色譜物質接觸等可能引起二聚體的重新形成。該方法包括以下步驟，其中步驟(a)是非強制性的(a)必要時將所述組合物的pH調節(jié)至4. 5-10. 0范圍內的值(于5°C測定)；
(b)將該組合物加熱至20-50°C范圍內的溫度至少5分鐘；以及(c)接著冷卻該組合物至最高為10°C的溫度。包含因子VII多肽的組合物如本文所使用，用語“組合物”意指液體組合物，優(yōu)選含水液體組合物，即包含小于5%非水溶劑的組合物。用于該方法的組合物包含因子VII多肽以及二聚體形式的某些雜 質。術語“二聚體”包括任何因子VII多肽的真正二聚體以及更高級的寡聚體和聚集物(例如三聚體、四聚體等)。已觀察到一些因子VII多肽變異體與野生型因子VII相比形 成二聚體的趨勢增加。這一增加的二聚體形成可由以下事實解釋，即因子VII多肽變異體 與野生型因子VII具有不同的結構并因此具有不同的性質。該不同性質的一個實例為它們 的展開溫度，即它們的熔點。當因子VII多肽展開時，它們的表面變得更加疏水并且它們因 此傾向于和其他未展開的疏水因子VII多肽相互作用，藉此形成二聚體。由于這一原因，本 發(fā)明可尤其，盡管不是專有地，應用于該類因子VII多肽變異體的組合物。本發(fā)明方法尤其可用于具有相對高含量二聚體的組合物，即未處理組合物(即步 驟(b)之前)中的二聚體含量至少為3%，例如至少4%、例如至少5%、例如至少6%、例如 至少8%或甚至至少10%。術語“因子VII多肽”更詳細地描述于下文。基于初步觀察，我們認為本發(fā)明尤其 適用于非天然形式的因子VII，例如因子VII變異體，因為這一組內的多肽顯示出形成二聚 體的更高傾向。因此在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法的因子VII多肽為非野生型人因 子Vila，例如因子VII變異體。組合物中因子VIIa濃度方便地表示為mg/mL或IU/mL，Img通常表示 43000-56000IU或更多。組合物中因子VII多肽的濃度通常為至少0. 01mg/mL或至少 0. lmg/mL。在不同的實施方案中，組合物中存在的因子VII多肽的濃度為0. l-90mg/mL ； 0. 5-80mg/mL ；1. 0_80mg/mL ；1. 5_70mg/mL ； 2_60mg/mL ；3_50mg/mL ；或 5_50mg/mLo組合物在步驟(a)之前，并且特別是在步驟(a)的任何應用之后，可包括可保持pH 在特定范圍之內即4. 5-10. O的緩沖劑(應理解為單一試劑或試劑的組合)。在一個實施方案中，該緩沖劑為至少一種選自以下的組分MES、PIPES、ACES、BES、 TES、HEPES、TRIS、組氨酸、咪唑、甘氨酸、雙甘氨肽、甘氨酰胺、磷酸、醋酸(例如醋酸鈉或醋 酸鈣)、乳酸、戊二酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸和琥珀酸的酸和鹽。應理解的是緩沖 劑可包含兩種或更多種組分的混合物，其中所述混合物可提供在特定范圍內的PH值。醋酸 和醋酸鈉等可作為實例提及。選擇緩沖劑的濃度使可以維持組合物優(yōu)選的pH。在各個實施方案中，緩沖劑的濃 度為 I-IOOmM ； l-50mM ;l-25mM ；或 2_20mM。已觀察到當pH升高時因子VII多肽易于自體活化和降解。另一方面，當pH降低 時因子VII多肽更可能二聚體化和聚集。選擇因子VII多肽組合物的PH范圍這樣可在解 決這兩個PH-相關問題之間找到最好的折衷方案。該pH范圍預期在化學和因此結構特性 互不相同的不同因子VII多肽之間不同。在本發(fā)明的一個實施方案中，組合物的pH保持在 4. 5-10的范圍內，例如5-10的范圍內，例如9-10的范圍內。在本發(fā)明的另一實施方案中， 組合物的PH保持在4. 5-9. 5的范圍內；例如在4. 5-8. 5的范圍內；例如在4. 5-7. 5的范圍內，例如在4. 5-6. 5的范圍內；例如在4. 5-6. O的范圍內；例如在5. 0-6. 5的范圍內；例如 在5. 0-6. 0的范圍內；例如在5. 2至約5. 9的范圍內。當提及pH值時，采用在約5°C測量的值。組合物在應用熱處理(步驟(b))之前優(yōu)選保持于最高為10°C，特別是最高為5°C 的溫度。在優(yōu)選的實施方案中，組合物包含鈣鹽或鎂鹽，例如氯化鈣或醋酸鈣。鈣離子結合因子VII多肽并對于因子VII多肽Gla結構域的正確折疊是必需的，這樣因子VII多肽特 別是其Gla結構域可避免自體蛋白水解降解。預期鎂離子可以與鈣離子相同的方式保護因 子VII多肽。組合物也可包括其他組分，例如可調節(jié)溶液重量摩爾滲透壓濃度的張力調節(jié)劑。 該張力調節(jié)劑通常包括至少一種選自以下的物質中性鹽、氨基酸、2-5個氨基酸殘基的 肽、單糖、雙糖、多糖和糖醇。在一些優(yōu)選的實施方案中，該組合物包含兩種或更多種該類物 質的組合?！爸行喳}”指當溶于水溶液中不是酸也不是堿的鹽。在一個實施方案中，至少一種張力調節(jié)劑為選自以下的中性鹽鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽 和鎂鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、醋酸鈣、葡糖酸鈣、乙酰丙酸鈣、氯化鎂、醋酸鎂、葡糖 酸鎂和乙酰丙酸鎂。在一個優(yōu)選的實施方案中，該張力調節(jié)劑包括氯化鈉與選自氯化鈣、醋酸鈣、氯化 鎂和醋酸鎂的至少之一的組合。在另一優(yōu)選的實施方案中，該張力調節(jié)劑為選自氯化鈉、氯化鈣、蔗糖、葡萄糖和 甘露醇的至少之一。通常，該張力調節(jié)劑的濃度為至少ImM、至少5mM、至少10mM、至少20mM、至少50mM、 至少lOOmM、至少200mM、至少400mM、至少800mM、至少lOOOmM、至少1200mM、至少1500mM、至 少 1800mM、至少 2000mM 或至少 2200mM。在一系列的實施方案中，該張力調節(jié)劑的濃度為5_2200mM，例如25-2200mM,50_2200mM，100_2200mM，200_2200mM，400_2200mM，600_2200mM， 800-2200mM,1000_2200mM，1200_2200mM，1400_2200mM，1600_2200mM，1800_2200mM，或 2000-2200mM ；5_1800mM，25_1800mM，50_1800mM，100_1800mM，200_1800mM，400_1800mM， 600-1800mM,800-1800mM,1000-1800mM,1200-1800mM,1400-1800mM,1600-1800mM ； 5-1500mM,25_1400mM，50_1500mM，100_1500mM，200_1500mM，400_1500mM，600_1500mM， 800-1500mM,1000-1500mM,1200-1500mM ；5-1200mM,25-1200mM,50-1200mM,100-1200mM, 200-1200mM, 400-1200mM, 600-1200mM,或 800-1200mM。通常，包含因子VII多肽的組合物獲自之前的純化步驟。在尤其相關的實施方案 中，步驟(a)之前有陰離子交換色譜法步驟。已觀察到在這一陰離子交換步驟中產生高濃 度的因子VII多肽二聚體。因此，將這一步驟置于可一起降低剩余二聚體數(shù)量的本發(fā)明調 節(jié)PH、加熱和冷卻步驟之前尤其有用。因子VII多肽如本文所使用，術語“因子VII多肽”或“FVII多肽”指包含野生型人因子VIIa的 氨基酸序列1-406 (即具有美國專利號4，784，950公開的氨基酸序列的多肽)的任何蛋白 質、其變異體以及因子VII-相關多肽、因子VII衍生物和因子VII綴合物。這包括相對于野生型人因子Vila顯示出實質(substantially)相同或提高的生物學活性的因子VII變 異體、因子VII衍生物和因子VII綴合物。術語“因子VII”涵蓋未裂解(酶原)形式的因子VII多肽以及經蛋白水解加工 形成它們各自生物學活性形式的那些，其可命名為因子Vila。通常因子VII在殘基152和 153之間裂解形成因子Vila，即因子VII的活化形式。該因子VII的變異體可顯示相對于 人因子VII不同的性質，包括穩(wěn)定性、磷脂結合、改變的特異活性等。上述定義內的“因子VII”或“因子Vila”還包括從一個個體到另一個可能存在和 發(fā)生的天然等位基因變異。而且，糖基化或其他翻譯后修飾的程度和位置可隨所選宿主細 胞和該宿主細胞環(huán)境的性質變化。如本文所使用，“野生型人FVIIa”為具有美國專利號4，784，950中公開的氨基酸 序列的多肽。如本文所使用，“因子VII-相關多肽”包括相對于野生型因子VIIa的活性其中的 因子VIIa生物學活性被實質性修飾例如降低的多肽，包括變異體。這些多肽包括但不限 于已向其中引入的修飾或破壞該多肽生物活性的特異氨基酸序列改變的因子VII或因子 VIIa0如本文所使用術語“因子VII衍生物”意指相對于野生型因子VII顯示出實質相 同或提高的生物學活性的FVII多肽，其中母體肽的一個或更多個氨基酸被遺傳和/或化學 和/或酶促修飾，例如通過烷基化、糖基化、PEG化、?；?、酯形成或酰胺形成等。這包括但 不限于PEG化人因子Vila、半胱氨酸-PEG化人因子VIIa及其變異體。因子VII衍生物的 非限制性實例包括WO 03/31464和美國專利申請US 20040043446， US 20040063911， US 20040142856， US 20040137557， US 20040132640，W02007022512,和 US20070105755 (Neose Technologies, Inc.)中公開的 糖 PEG 化 FVII 衍生物；如 WO 01/04287、美國專利申請 20030165996、WO 01/58935、WO 03/93465 (Maxygen ApS)和W002/02764、美國專利申請20030211094 (明尼蘇達大學)中公 開的FVII綴合物。術語“提高的生物活性”指i)與重組野生型人因子VIIa相比具有實質相同的或 增加的蛋白水解活性的FVII多肽或ii)與重組野生型人因子VIIa相比具有實質相同的或 增加的TF結合活性的FVII多肽或iii)與重組野生型人因子VIIa相比具有實質相同或增 加的血漿半衰期的FVII多肽。術語“PEG化人因子Vila”指具有與人因子VIIa多肽綴合的PEG分子的人因子 Vila。應理解的是該PEG分子可結合至因子VIIa多肽的任何部分，包括因子VIIa多肽的 任何氨基酸殘基或碳水化合物部分。術語“半胱氨酸-PEG化人因子Vila”指具有與引入人因子VIIa的半胱氨酸的巰 基基團綴合的PEG分子的因子Vila。如本文所使用，術語“因子VII變異體”指顯示出與野生型因子VII實質相同或更 好生物活性，或相對于野生型因子VII顯示出被實質性修飾的或降低的生物活性的FVII多 肽，并且是具有通過插入、缺失或替換一個或更多個氨基酸與野生型因子VII序列不同的 氨基酸序列的多肽。與重組野生型人因子VIIa相比具有實質相同或增加的蛋白水解活性的因子 VII 變異體的非限制性實例包括 S52A-FVIIa、S60A_FVIIa(Lino 等，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)；如美國專利號5，580，560公開的顯示出增強的蛋白水解 穩(wěn)定性的FVIIa變異體；在殘基290和291之間或殘基315和316之間被蛋白水解裂解 的因子 Vila(MolIerup 等，Biotechnol. Bioeng. 48 :501_505，1995)；因子 VIIa 的氧化形 式(Kornfelt 等，Arch. Biochem. Biophys. 363 :43_54，1999) ；PCT/DK02/00189 (對應于 WO 02/077218)中公開的FVII變異體；和WO 02/38162中公開的顯示出增強的蛋白水解穩(wěn)定 性的FVII變異體；如以下公開的具有經修飾的Gla-結構域并顯示出增強膜結合的FVII變 異體WO 99/20767，美國專利 US 6017882 和 US 6747003，美國專利申請 20030100506 (明 尼蘇達大學)和 WO 00/66753，美國專利申請 US 20010018414、US 2004220106 和 US 200131005，美國專利US6762286和US 6693075 (明尼蘇達大學)；以及以下公開的FVII變 異體WO 01/58935、美國專利 US 6806063、美國專利申請 20030096338 (Maxygen ApS)、WO 03/93465(Maxygen ApS)、WO 04/029091(Maxygen ApS)、WO 04/083361(Maxygen Ap S)和 WO 04/111242 (Maxygen ApS)以及 WO 04/108763 (加拿大血液服務中心(CanadianBlood Services))。與野生型FVIIa相比具有增強的生物學活性的FVII變異體的非限制性實例包括 如以下公開的 FVII 變異體W0 01/83725、W002/22776、WO 02/077218、WO 03/027147、WO 04/029090、W005/075635 和申請?zhí)枮?05108713. 8 (Novo Nordisk A/S)的歐洲專利申請、WO 02/38162 (Scripps Research Institute)；以及如 JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeut ic Res Inst.)中公開的具有增強活性的FVIIa變異體。因子VII變異體的實例包括但不限于P10Q-FVII,K32E-FVII,P10Q/K32E-FVII,L305V-FVII,L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/ L305V-FVII， V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII， V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII， K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, 禾口 S336G-FVII，L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII, L305V/E296V-FVII, L305V/ M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII, L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII, L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII, L305V/ V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/ M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/ Vl58T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/ M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII， S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/ M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII, K316H/ V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/ L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/ M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/ E296V-FVII, S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/ E296V-FVII， S314E/L305V/E296V/M298Q-FV II， S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII， S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/ L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A-FVII, Κ316Η/ L305V/V158D-FVII, Κ316H/L305V/E296V-FVII, K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/ V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, Κ316H/L305V/K337A/M298Q-FVII, Κ316Η/ L305V/K337A/E296V-FVII, Κ316H/L305V/K337A/V158D-FVII, K316H/L305V/V158D/ M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII, Κ316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, Κ316Η/ L305V/V158T/E296V-FVII，Κ316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/ E296V/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/V158T/ K337A/M298Q-FVII, Κ316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, Κ316H/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/ E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/ L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, Κ316Q/L305V/E296V-FVII, K316Q/L305V/ M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/ K337A/M298Q-FVII， Κ316Q/L305V/K337A/E296V-FVII， K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII， K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/ M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, Κ316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/ L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/ V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/ K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/ M298Q/K337A-FVII， K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII， F374Y/K337A-FVII， F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII, F374Y/M298Q-FVII, F374Y/V158T-FVII, F374Y/ S314E-FVII, F374Y/L305V-FVII, F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/ L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/ M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/ S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/ S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/ S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/ V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/ L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/ E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/ L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/ S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/ M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/ K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/ E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/ V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/ E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII, F374Y/ V158T/M298Q/E296V-FVII， F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII， F374Y/L305V/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/ S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/ S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/ S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/ K337A/S314E-FVII， F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII， F374Y/L305V/E296V/ M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/ E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/ L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/ S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-因子 VII， S60A-因子 VII ；R152E-因子 VII，S344A-因子 VII，T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII, G29IN-FVII, R315N/V317T-FVII, K143N/N145T/R315N/ V317T-FVII ；和在氨基酸序列233Thr至240Asn中具有替換、添加或缺失的FVII ；在氨基酸 序列304Arg至329Cys中具有替換、添加或缺失的FVII ；和在氨基酸序列153Ile至223Arg 中具有替換、添加或缺失的FVII。因此，因子VII多肽中的替換變異體包括但不限于ΡΙΟ, K32, L305, M306, D309, V158, E296, K337, M298, S336, S314, K316, F374, S52, S60, R152, S344, T106, K143, N145, V253, R290, A292, G291, R315, V317 位的替換，以及氨 基酸序列T233至N240或R304至C329 ；或1153至R223中的替換、添加或缺失，或其組合， 特別是變異體例如 P10Q, K32E, L305V, M306D, D309S, L305I, L305T, F374P, V158T, M298Q, V158D, E296V, K337A, M298Q, M298K, S336G, S314E, K316H, K316Q, F374Y, S52A, S60A, R152F, S344A, T106N, K143N, N145T, V253N, R290N, A292T, G291N, R315N, V317T,以及氨基酸序列 T233至N240，或R304至C329，或1153至R223中的替換、添加或缺失，或其組合。
凝血中因子Vila的生物學活性源自其(i)結合至組織因子(TF)和(ii)催化因 子IX或因子X蛋白水解裂解產生活化的因子IX或x(分別為因子IXa或Xa)的能力。
對于本發(fā)明目的，可參考本文描述的測定法4通過檢測制劑促進凝血的能力定量 因子VII多肽的生物學活性。在這一測定法中，生物學活性表示為相對于對照樣品凝血時 間的減少并且通過與包含1單位/mL因子VII活性的混合人血清標準品比較轉化成“因子 VII單位”。或者，可通過以下方式定量因子VIIa的生物學活性(i)檢測因子Vila或因 子VII-相關多肽在包含嵌入脂膜中的TF和因子X的體系中產生活化的因子X(因子Xa) 的能力(Persson 等，J. Biol. Chem. 272 19919-19924，1997) ； (ii)在含水體系中檢測因子 X水解("體外蛋白水解測定法"，見下文測定法2) ； (iii)采用基于表面等離子體共振的 儀器檢測因子VIIa或因子VII-相關多肽與TF的物理結合(Persson，F(xiàn)EBS Letts. 413 359-363,1997) ； (iv)檢測因子Vila和/或因子VII-相關多肽對合成底物的水解(“體外 蛋白水解測定法"，見下文測定法1)；或(ν)在非TF依賴的體外系統(tǒng)中檢測凝血酶的生成 (見下文測定法3)。相對于野生型因子VIIa具有實質相同或提高的生物學活性的因子VII變異體包 括在如上文所述的凝血測定法(測定法4)、蛋白水解測定法(測定法2)或TF結合測定法 之一或更多中測試時顯示出至少約25%、優(yōu)選至少約50%、更優(yōu)選至少約75%并且最優(yōu)選 至少約90%的相同細胞類型產生的因子VIIa特異活性的那些。相對于野生型因子VIIa具 有實質降低的生物學活性的因子VII變異體為在如上文所述的凝血測定法(測定法4)、蛋 白水解測定法(測定法2)或TF結合測定法之一或更多中測試時顯示出小于約25%、優(yōu)選 小于約10%、更優(yōu)選小于約5%并且最優(yōu)選小于約的相同細胞類型產生的野生型因子 VIIa特異活性的那些。相對于野生型因子VII具有實質被修飾的生物學活性的因子VII變 異體包括但不限于顯示出非TF-依賴型因子X蛋白水解活性的因子XII變異體和結合TF 但不裂解因子X的那些。步驟(a)_調節(jié)pH在第一個非強制性步驟(a)中，必要時將組合物的pH調節(jié)至4. 5-10. 0范圍內的 值。如上文所述，這通常通過加入一種或更多種緩沖劑達成。已具有指定范圍內PH的組合 物當然不需要調節(jié)PH，但是例如，考慮到任何后續(xù)活化和制劑步驟，調節(jié)pH可能是有利的。調節(jié)組合物pH的步驟也包括稀釋或濃縮(例如蒸發(fā)溶劑)組合物。在步驟(a)中組合物優(yōu)選保持于最高10°C、特別是最高5°C、更特別是接近0°C的 溫度。步驟(b)_熱處理熱處理是減少組合物中二聚體含量的關鍵步驟。已發(fā)現(xiàn)加熱溫度應至少為20°C以使二聚體含量至少在合理的時間范圍內例如72 小時內減少。另一方面，我們認為高于50°C的加熱溫度將引起因子VII多肽變性(并因此 失活)的風險。可通過將包含組合物的容器置于恒溫浴例如油浴或水浴或烘箱中達到加熱至需 要溫度。達到所需溫度需要的時間將尤其取決于容器相對于環(huán)境介質的熱傳導系數(shù)。通常 需要盡可能快地達到所需溫度或至少盡可能快地達到20°C的溫度或低于設定點約5°C的溫度。
在可選擇的實施方案中，在流通(flow-through)反應器中分批或以持續(xù)方式進行熱處理，其中流通時間對應于熱處理需要的時間。許多可操作的實施方案對本領域技術 人員而言是顯而易見的。熱處理需要的溫度和必需的時間可例如在如本文實施例2描述的模型實例中測 定。熱處理所需時間的最小值通常為約5分鐘，例如10分鐘，而時間的最大值理論上可為 數(shù)天或許多天，例如168小時。因為實際原因，該處理的時間優(yōu)選為10分鐘至72小時。人們認為延長熱處理可引起與熱處理降低的類型不同的二聚體類型的形成。這一 假設受到實施例2中的觀察結果的支持，其中于37°C熱處理超過10小時實際上引起二聚體 的顯著(再)形成。盡管如此，于30_45°C熱處理的優(yōu)選時間通常為10-600分鐘。于20_30°C熱處理 的優(yōu)選時間通常為5-72小時，并且于35-50°C熱處理的優(yōu)選時間通常為10-300分鐘。在目 前最優(yōu)選的實施方案中，熱處理在約37°C進行10-120分鐘。應理解的是本發(fā)明方法的優(yōu)化可導致不必要涉及恒定溫度的熱處理，但是證明了 在整個20-50°C的溫度范圍內逐漸或分段地升高溫度和/或逐漸分段地降低溫度可能是有 利的。熱處理的目的在于降低包含因子VII多肽的組合物中二聚體的含量。特別地期望 顯著的降低以使整個生產過程中的其他步驟合理化。因此，優(yōu)選所述組合物中表示為相對 于總體因子VII多肽百分比的二聚體水平(如通過本文描述的HMWP GPC方法測定)被降 低至少六分之一，例如至少三分之一，特別是至少二分之一或甚至至少三分之二。設想可將二聚體含量降低至低于5%的水平，特別是低于4%的水平，并且更優(yōu)選 低于3%的水平或甚至低于2%的水平或甚至更優(yōu)選低于1. 5%的水平。步驟(C)-冷卻接著將組合物冷卻至最高為10°C，例如最高為5°C的溫度。非常迅速地進行冷卻 是有利的，例如通過在冰浴(約o°c)中冷卻，或通過向組合物中加入冰?；蛘?，如上所述， 可在流通反應器中進行冷卻。通過快速冷卻，可避免二聚體再次形成條件(例如在5-15°C 的溫度)的延長存在。冷卻后，可對組合物進行進一步的加工步驟。應考慮這些加工步驟應優(yōu)選不引起 二聚體的任何顯著再形成。盡管如此，在優(yōu)選的實施方案中，在步驟(b)的后續(xù)步驟中活化 因子VII多肽，即在冷卻組合物之前或之后活化因子VII多肽。優(yōu)選在加熱過程的后續(xù)步 驟中活化因子VII多肽因為在加熱過程中難以控制活化。優(yōu)選實施方案在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及降低包含因子VII變異體的組合物中 二聚體含量的方法，所述方法包括以下步驟(a)必要時將所述組合物的pH調節(jié)至5. 0-6. 5范圍內的值；(b)將該組合物加熱至30_45°C范圍內的溫度20-600分鐘；以及(c)接著冷卻該組合物至最高為5°C的溫度。優(yōu)選實施方案在第二個尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及降低包含因子VII變異體的組合物 中二聚體含量的方法，所述方法包括以下步驟
(a)必要時將所述組合物的pH調節(jié)至9. 0-10. 0范圍內的值；(b)將該組合物加熱至30_45°C范圍內的溫度20-600分鐘；以及(c)接著冷卻該組合物至最高為5°C的溫度。因子VII多肽的制備和純化可應用于本發(fā)明方法的經純化的人因子VIIa優(yōu)選通過DNA重組技術制備，例如，如 Hagen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :2412_2416，1986 所描述，或歐洲專利號 0 200 421(ZymoGenetics, Inc.)中所描述。因子 VII 也可通過 Broze 和 Majerus，J. Biol. Chem. 255(4) 1242-1247，1980 以 及 Hedner 和 Kisiel, J. Clin. Invest. 71 :1836_1841，1983 描述的方法制備。這些方法產 生不含可檢測量的其他凝血因子的因子VII。一種進一步純化的因子VII制劑可通過包括 附加的凝膠過濾作為最終純化步驟獲得。因子VII接著通過已知方法被轉化為活化的因 子Vila，例如通過數(shù)種不同的血漿蛋白，例如因子XIIa、IXa或Xa的作用?；蛘?，如Bjoern 等.(Research Disclosure，2691986年9月，第564-565頁)所述，可通過使其通過離子交 換色譜柱例如Mono Q(Pharmacia fine Chemicals)等或通過在溶液中自體活化將因子
VII活化。本發(fā)明方法步驟優(yōu)選在因子VII多肽活化之前立即應用。因子VII-相關多肽可通過修飾野生型因子VII或通過重組技術產生。與野生型 因子VII相比具有改變的氨基酸序列的因子VII-相關多肽可通過修飾編碼野生型因子VII 的核酸序列產生，其方式為通過已知方法例如定點誘變改變氨基酸密碼子或移除編碼天然 因子VII的核酸中的一些氨基酸密碼子。本領域技術人員顯而易見可在對因子VIIa分子的功能至關重要的區(qū)域之外進行 替換而仍然得到活性多肽。因子VII多肽活性必需的氨基酸殘基(因此優(yōu)選不進行替換) 可根據本領域已知的操作鑒定，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見，例如，Cunningham ^P Wells, 1989, Science 244:1081-1085)。在后一技術中，在該分子的各正電荷殘基處引 入突變并且檢測所得突變分子的凝結、各自交聯(lián)活性以鑒定對該分子活性至關重要的氨基 酸殘基。底物_酶相互作用的位點也可通過分析由例如核磁共振分析、結晶學或光親和標 記的技術測定的三維結構來測定(參見，例如，de Vos等，1992，Science 255:306-312; Smith 等，1992，Journal of Molecular Biology 224 :899_904 ;Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59_64)。向核酸序列中引入突變用一種核苷酸交換另一種核苷酸可通過使用本領域已知 的任何方法進行定點誘變達成。尤其可用的是應用具有目標插入物的超螺旋雙鏈DNA載體 和包含所需突變的兩個合成引物的操作。各自與載體的相反鏈互補的寡核苷酸引物在溫度 循環(huán)中通過Pfu DNA聚合酶的作用延伸。一旦摻入引物便生成包含交錯切口的突變質粒。 溫度循環(huán)之后，用特異于甲基化和半甲基化DNA的Dpnl處理產物以消化親代DNA模板并篩 選包含突變的合成DNA。也可使用本領域已知的用于產生、鑒定和分離變異體的其他操作， 例如基因重排或噬菌體展示技術。從細胞來源分離多肽可通過本領域任何已知的方法達成，包括但不限于從黏附細 胞培養(yǎng)物去除包含所需產物的細胞培養(yǎng)基；離心或過濾以去除非黏附性細胞等。任選可進一步純化因子VII多肽?？墒褂帽绢I域已知的任何方法完成純化，包 括但不限于例如在抗-因子VII抗體柱上的親和色譜法(參見，例如，Wakabayashi等，J. Biol. Chem. 261 :11097，1986 ；和 Thim 等，Biochem. 27 :7785，1988)；疏水相互作用色 譜法；離子交換色譜法；大小排阻色譜法；電泳操作(例如制備型等電聚焦(IEF))；差 異溶解(例如硫酸銨沉淀)或萃取等。一般性參見，Scopes, ProteinPurification, Springer-Verlag, New York, 1982 ；禾口 Protein Purification, J. C. Janson 禾口 Lars Ryden 編輯，VCH出版社，紐約，1989。純化后，制備物優(yōu)選包含少于重量比10%更優(yōu)選少于5%并 且最優(yōu)選少于的來源自宿主細胞的非因子VII多肽。因子VII多肽可通過蛋白水解裂解活化，其方式為使用因子XIIa或其他具有胰蛋 白酶樣特異性的蛋白酶，例如因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa和凝血酶。參見，例如，Osterud 等，Biochem. 11 2853(1972) ； Thomas,美國專利號 4, 456, 591 ；和 Hedner 等，J.Clin· Invest. 71 =1836(1983) 或者可通過使其通過離子交換色譜柱例如Mono Q (Pharmacia) 等或通過在溶液中自體活化將因子VII多肽活化。如上所述，本發(fā)明方法步驟優(yōu)選在因子 VII多肽活化之前立即應用。所得活化的因子VII多肽可接著如本領域所述進行制劑并給藥。以下實施例顯示了本發(fā)明的實施。這些實施例僅用于說明目的并且不以任何方式 限制所要求發(fā)明的范圍。實施例
方法測定二聚體含量-HMWP GPC法將大小排阻色譜法SE-HPLC用于在非解離條件下分析FVIIa樣品。HMWP (高分子 量蛋白)即二聚體、寡聚體和多聚體形式的FVIIa聚集物的含量通過相對于單體目標產物 峰的面積百分比測定。使用的柱子為Waters Protein Pak 300SW(7. 5*300mm，對應于 13，25mL 的柱體 積)或具有相似規(guī)格的柱子。常用分析條件為溫度RT (21-25°C )；檢測在柱子出口處于215nm進行紫外檢測；流速0. 5ml/ min，對應于 2. 25CV/hr。使用具有以下組成的運行緩沖液進行分析運行0. 2M硫酸銨、5%異丙醇，調節(jié)至 ρΗ7· 0。柱平衡之后并使用0. 5CV運行緩沖液，將包含約Img FVIIa/ml的FVIIa樣品融化 并通過注射25微升樣品體積(對應于相對于柱體積0. 2%的樣品體積)進行分析。接著將樣品洗脫1. 5CV。色譜圖通常由兩個主峰和兩個次峰組成，如圖3所示。從左邊開始，觀察到表示 HMWP的兩個次峰(多聚體和二聚體/寡聚體峰)。第一個主峰表示FVIIa單體，第二個主 峰表示鹽峰。實施例1-于37°C熱處理因子VIIa變異體將15mM CaCl2、30mM NaCl、10mM組氨酸、ρΗ 6.0(在 5°C)中的 1.5mg/mL FVIIa變 異體溶液通過0. 22微米濾器過濾至700mlHDPE瓶中。用IM HCl或IM NaOH將pH調節(jié)至 5. 8 (在5°C )。將瓶子置于溫度為37°C的水浴中。將HDPE瓶的溫度升高至37°C約需要20 分鐘。溶液已達到37°C 45分鐘后，通過將瓶子置于冰上終止該反應。起始二聚體含量經GPC測定為7.3%，在熱處理后降低為2.8%。因此于37°C熱處理45分鐘足以將二聚體含量降低多于二分之一。進行了總共120分鐘的相似試驗中二聚體含量降低的變化顯示于圖1。通過頻繁 收集樣品；將樣品迅速冷凍至-80°C ；和后續(xù)分析(見下文)監(jiān)控該試驗。比較實施例1-于5_8°C保存因子VIIa變異體將15mM CaCl2、30mM NaCl、10mM組氨酸、ρΗ 6.0(在 5°C)中的 1.5mg/mL FVIIa變 異體溶液通過0. 22微米濾器過濾至700mlHDPE瓶中。用IM HCl或IM NaOH將pH調節(jié)至 5.8(在5°0。將瓶子置于溫度為5-8°C的水浴中。60分鐘后通過將瓶子置于冰上終止該 反應。 起始二聚體濃度為7.7%，熱處理后為7.9%。實施例2-于23°C和37°C延長熱處理因子VIIa變異體將基本如實施例1(ρΗ 5.7)描述的在37°C的熱處理試驗進行總共48小時并于 23°C將相似的實驗進行總共48小時。通過頻繁收集樣品；將樣品迅速冷凍至-80°C ；和后 續(xù)分析(見下文)監(jiān)控兩個試驗。采用兩個不同溫度的二聚體含量減少的變化顯示于圖2。 在37°C觀察到二聚體含量的快速下降，而23°C樣品的二聚體含量降低較為緩慢，48小時后 二聚體含量可能并未降低至其最小值。這些類型的實驗可用于測定用于其他因子VII多肽 和在其他所選溫度下的最優(yōu)條件(用于熱處理的足夠時間)。為了比較，將一個樣品(與比較實施例1相似；pH5. 7)于5_8°C放置總共48小時。在這一例子中觀察到二聚體含量的輕微增加(見圖2，上曲線)。實施例3-于pH 9. 5延長熱處理因子VIIa變異體將基本如實施例1描述的熱處理試驗進行總共168小時；但是將起始pH調節(jié)從 PH 5. 8增加至pH 9.5。通過頻繁收集樣品；將樣品迅速冷凍至-80°C ；和后續(xù)分析監(jiān)控該 試驗。升高PH時二聚體含量降低的變化顯示于圖4。pH 9. 5時觀察到二聚體含量的相似 快速降低，之后為緩慢的二聚體形成。
權利要求
降低包含因子VII多肽的組合物中二聚體含量的方法，所述方法包括以下步驟(a)必要時將所述組合物的pH值調節(jié)至5.0-10.0范圍內的值(于5℃測定)；(b)將該組合物加熱至20-50℃范圍內的溫度至少5分鐘；以及(c)接著冷卻該組合物至最高為10℃的溫度。
2.權利要求1的方法，其中步驟(b)中的所述溫度在30-45°C的范圍內并且步驟(b) 中的加熱時間在10-600分鐘的范圍內。
3.之前所述權利要求任一項的方法，其中在步驟(a)中將所述pH調節(jié)至5.0-6. 5。
4.之前所述權利要求任一項的方法，其中所述因子VII多肽為因子VII變異體。
5.之前所述權利要求任一項的方法，其中所述組合物包含鈣鹽。
6.之前所述權利要求任一項的方法，其中所述組合物中表示為相對于總體因子VII多 肽百分比的二聚體水平已被降低至少二分之一。
7.之前所述權利要求任一項的方法，其中所述因子VII多肽在步驟(b)的后續(xù)步驟中 活化。
8.之前所述權利要求任一項的方法，其中在步驟(a)之前有陰離子交換色譜步驟。
全文摘要
本申請涉及通過熱處理降低因子VII多肽組合物中二聚體含量的方法。
文檔編號C12N9/64GK101802187SQ200880103945
公開日2010年8月11日 申請日期2008年8月22日 優(yōu)先權日2007年8月24日
發(fā)明者J·克拉魯普 申請人:諾沃-諾迪斯克保健股份有限公司