專(zhuān)利名稱(chēng)：用于改進(jìn)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的嵌合引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及DNA引物和探針中的核糖核苷 酸在減少DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中的非特異性產(chǎn)物的用途。
背景技術(shù)：
在如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)等DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增 反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。此人工產(chǎn)物來(lái)源于由引物之間或者引物與探針(如 TaqMan 及分子信標(biāo)探針)之間的弱相互作用所產(chǎn)生的不恰當(dāng)?shù)碾s交產(chǎn)物，這些雜交產(chǎn)物 命名為引物二聚體(Rychlik，1995)和引物-探針二聚體。反應(yīng)混合物中，引物3’端和非 靶向寡核苷酸鏈中堿基的弱互補(bǔ)性導(dǎo)致這些不希望得到的產(chǎn)物的形成。這將使引物和非靶 向鏈發(fā)生退火，隨之在熱穩(wěn)定性DNA聚合酶的作用下發(fā)生非特異性二聚體的起始和延伸， 從而導(dǎo)致不希望得到的副產(chǎn)物的有效擴(kuò)增。在實(shí)時(shí)PCR中，30個(gè)循環(huán)以后(Watson，1989)在3’末端至少一個(gè)核苷酸存在互補(bǔ) 性、以及40個(gè)循環(huán)以后根本無(wú)3’互補(bǔ)性的情況下，由于掩蓋低濃度靶序列檢測(cè)的非特異性 副產(chǎn)物的出現(xiàn)，從而使此問(wèn)題更加嚴(yán)重。在多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)和qPCR中，由于在反應(yīng)混合 物中多對(duì)引物和探針的存在，導(dǎo)致反應(yīng)的敏感性和質(zhì)量降低，使得此問(wèn)題尤為突出。需要提 前將靶序列擴(kuò)增到高拷貝數(shù)的高分辨率熔解(HRM)分析對(duì)樣品的純度尤為敏感。擴(kuò)增后人 工產(chǎn)物如引物二聚體或者非特異性副產(chǎn)物的存在可能使HRM的結(jié)果難以解釋。Ferrie等(1992)表明在冷啟動(dòng)的條件下，在多重反應(yīng)中，不考慮任何的引物互補(bǔ) 性，兩種不同引物的每一種可能的組合都將形成引物二聚體。通過(guò)仔細(xì)的引物設(shè)計(jì)、嚴(yán)謹(jǐn)PCR規(guī)程的使用(Don等，1991)以及“熱啟動(dòng)”酶的使用 (Chou 等，1992 ；D，Aquila 等，1991 ；TaqMan PCR 試劑盒規(guī)程，P. E. Applied Biosystems) 可以減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。但是，熱啟動(dòng)酶確實(shí)“泄露(leak)”，很明顯沒(méi)有絕對(duì)的熱啟 動(dòng)酶。幾種減少PCR中非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的方法已有描述美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)2003/0175769 批露了聚-羥基-芳基-聚-酸和3-6鄰羥基酸部分作為可以避免引物二聚體形成的核酸 擴(kuò)增反應(yīng)添加劑的用途。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP0866071和PCT申請(qǐng)WO 2006/112818批露了在 引物3’末端或其附近的共價(jià)修飾的核苷酸減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，尤其是引物二聚體的用途。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)EP 1201768批露了減少非特異性擴(kuò)增的方法和試劑，其涉及寡核 苷酸引物的使用，其中引物3’端3個(gè)核苷酸中的至少一個(gè)是選擇自以下所組成的組的修飾 的核苷酸2’ -0-氨基-甲基-核苷酸、2’ -氨基-甲基-核苷酸、2’ -氟-核苷酸和阿拉 伯糖核苷酸。美國(guó)專(zhuān)利第7，205，129號(hào)和PCT申請(qǐng)WO 01/64952批露了在核酸擴(kuò)增過(guò)程中基于 使用模板缺省性寡核苷酸作為引物以減少人工產(chǎn)物的方法的應(yīng)用。這些模板缺省性寡核苷 酸包括模板缺省性核苷酸，優(yōu)選位于5’末端或其附近。這些模板缺省性核苷酸可以是修 飾的核苷酸、衍生的核苷酸、核苷酸類(lèi)似物或者核糖核苷酸，它們并不能充當(dāng)核酸合成的模板，也就是說(shuō)，它們阻止了和包含模板缺省性核苷酸的核酸鏈互補(bǔ)的核酸鏈在模板缺省性 核苷酸位點(diǎn)或所述位點(diǎn)以外的合成。換句話(huà)說(shuō)，US7, 205，129和WO 01/64952中批露的模 板缺省性寡核苷酸引物并不能被完全復(fù)制。和本發(fā)明不同，US 7，205，129和WO 01/64952 教導(dǎo)了在模板缺省性核苷酸位點(diǎn)或所述位點(diǎn)以外阻止DNA延伸。弓I物不經(jīng)過(guò)任何修飾的標(biāo)準(zhǔn)情況限制了依賴(lài)于DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增如qPCR 和HRM等測(cè)定的檢測(cè)敏感性。30個(gè)循環(huán)以后擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)被定義為“黃昏區(qū)(twilight zone)”。該檢測(cè)是有問(wèn)題的，并且進(jìn)一步的檢測(cè)如Tm(解鏈溫度)分析和產(chǎn)物測(cè)序等是必 需的。阻止非特異性模板非依賴(lài)性產(chǎn)物的形成將防止引物的失活以及反應(yīng)向無(wú)信息作 用的副產(chǎn)物方向偏離。在DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中，非特異性模板非依賴(lài)性產(chǎn)物 出現(xiàn)的消除或者任何延后應(yīng)該增強(qiáng)反應(yīng)的有效性、特異性以及敏感性。在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，現(xiàn)存的消除或者減少人工產(chǎn)物的方法包括對(duì)引物進(jìn)行化學(xué)修 飾或者向引物中插入RNA堿基序列(兩個(gè)以上連續(xù)的堿基)，這需要特殊的酶促或者其它復(fù) 雜的化學(xué)反應(yīng)，或者對(duì)引物5’末端的核苷酸進(jìn)行修飾以使反應(yīng)的起始充分。因此，存在未被滿(mǎn)足的對(duì)更簡(jiǎn)單、更有效、且更經(jīng)濟(jì)的改進(jìn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法的需 求，尤其是對(duì)具有改善的特異性和敏感性的實(shí)時(shí)PCR和高分辨率熔解分析應(yīng)用的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了減少或者消除非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和其它人工產(chǎn)物的方法，這些產(chǎn) 物是通過(guò)體外DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)用產(chǎn)生的，諸如但不限于聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和高分辨率熔解(HRM)分析。更具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了在DNA 依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中為減少或消除非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物而設(shè)計(jì)和使用RNA/DNA嵌合 引物和探針的材料、試劑盒和方法。本發(fā)明通過(guò)在引物和探針的DNA序列中以非隨機(jī)性的方式，優(yōu)選不在5’末端并避 免RNA連續(xù)序列，沿著引物或探針的長(zhǎng)度散在嵌入核糖核苷酸來(lái)減少非特異性模板非依賴(lài) 性副產(chǎn)物的形成。本發(fā)明的方法阻礙了 DNA在RNA修飾位點(diǎn)合成的起始，但是允許在引物 的RNA修飾位點(diǎn)以外的DNA延伸?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，另人吃驚的是，在DNA引物和/或探針(即，RNA/DNA嵌合分子)中僅并 入一些核糖核苷酸，即可對(duì)減少體外DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的不期望的人 工產(chǎn)物的生成具有有益的影響，條件是所述核糖核苷酸是不相鄰的。只向DNA引物和/或 探針中嵌入一些RNA堿基是簡(jiǎn)單的并且不需要任何特殊的酶促添加劑或者化學(xué)操作。不希望被任何特殊的理論或者作用機(jī)制所約束，本發(fā)明部分基于這個(gè)發(fā)現(xiàn)，即在 模板鏈中處于起始區(qū)附近的RNA堿基的存在顯著降低DNA合成的起始效率，但模板鏈中所 嵌入的RNA堿基對(duì)于引物鏈DNA的延伸影響沒(méi)有這么顯著，條件是RNA堿基不相鄰。在本 發(fā)明的上下文中，起始區(qū)被定義為DNA合成在引物-模板雙鏈體上開(kāi)始的點(diǎn)?，F(xiàn)批露，在DNA引物和探針中預(yù)先設(shè)計(jì)的位置嵌入RNA堿基顯著減少了 DNA依賴(lài) 性DNA擴(kuò)增反應(yīng)中非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。在標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增反應(yīng)條件下(即當(dāng)引物和探針 只包含DNA時(shí))，由于反應(yīng)混合物中存在大量的過(guò)剩引物，引物和探針除了為希望的靶序列 的擴(kuò)增外，也為導(dǎo)致引物擴(kuò)增的不希望的非特異性反應(yīng)提供了一個(gè)功能性的起始區(qū)。相對(duì) 比之下，本發(fā)明中RNA/DNA嵌合引物和探針被設(shè)計(jì)為在形成非特異性雙鏈體時(shí)提供了一個(gè)非功能性的起始區(qū)，從而在反應(yīng)混合物中使RNA/DNA嵌合體-靶模板雙鏈體成為唯一可用 的起始區(qū)。但是，因?yàn)樵跊](méi)有和本發(fā)明的RNA/DNA嵌合引物中一樣的RNA連續(xù)序列存在的 條件下，即使模板中只嵌入了若干核糖核苷酸時(shí)，DNA的延伸也是可能的，所以靶序列的擴(kuò) 增將會(huì)進(jìn)行下去，即使效率稍有降低。因此，本發(fā)明提供了用于通過(guò)使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物而減少或消除DNA 依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增中非特異性模板非依賴(lài)性產(chǎn)物的方法，因此提高了用PCR檢測(cè)和定 量靶序列的特異性和敏感性。根據(jù)可選的實(shí)施方案，使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物和探 針進(jìn)行擴(kuò)增。 本發(fā)明還提供了用于減少或消除DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中非特異性模板 非依賴(lài)性產(chǎn)物的試劑盒，其包括用于DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的RNA/DNA嵌合引物 和必需的化學(xué)成分以及酶。根據(jù)可選的實(shí)施方案，使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物和探針 進(jìn)行擴(kuò)增。一方面，本發(fā)明提供了減少或消除DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中人工產(chǎn)物和 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物形成的方法。本方法包括使用至少一個(gè)RNA/DNA嵌合寡核苷酸作為正向 引物或者作為反向引物以及DNA依賴(lài)性DNA聚合酶來(lái)擴(kuò)增靶序列，和使用任選地一個(gè)或多 個(gè)寡核苷酸探針，其中嵌合寡核苷酸包含至少一個(gè)核糖核苷酸；且其中位于嵌合寡核苷酸 的3’末端或位于嵌合寡核苷酸的3’末端的10個(gè)核苷酸以?xún)?nèi)的核糖核苷酸的數(shù)目將允許 當(dāng)引物和預(yù)期的靶序列形成雙鏈體時(shí)的DNA合成的起始而不會(huì)阻止DNA的延伸，并且將阻 礙從引物_引物二聚體或引物_探針二聚體起始的DNA合成；并且其中引物中沒(méi)有兩個(gè)核 糖核苷酸彼此相鄰。在一些實(shí)施方案中，正向引物和反向引物都是RNA/DNA嵌合寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增反應(yīng)的所有的引物和探針均具有與3’末端堿基相同 的堿基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸相同的3’末端堿基選自A或T。在某些實(shí)施 方案中，和至少一個(gè)嵌合引物3’末端的所述堿基“互補(bǔ)”的堿基或者和所述“互補(bǔ)”堿基相 鄰的堿基是核糖核苷酸。舉例來(lái)說(shuō)，如果末端堿基是T，則引物里的每個(gè)A可被替換為核糖 核苷酸，或者核糖核苷酸可被置于與引物中的每個(gè)A相鄰，以阻礙任何假設(shè)的可能形成的 引物-引物二聚體擴(kuò)增的起始。在不同的實(shí)施方案中，在反應(yīng)混合物中，每個(gè)嵌合引物或探針包含至少一個(gè)核糖 核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互補(bǔ)的 至少一個(gè)核苷酸處，或位于該核苷酸上游或下游1至5個(gè)核苷酸內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 在反應(yīng)混合物中，每個(gè)嵌合引物或探針包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’ 末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸處或者與該核苷酸相鄰。本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方 法中。在一些實(shí)施方案中，DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增選自由以下所組成的組指數(shù)滾環(huán)擴(kuò) 增(ERCA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增 (NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR (qPCR)、自主序列復(fù)制 (3SR)、使用Qi3復(fù)制酶的擴(kuò)增、和循環(huán)測(cè)序。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，DNA依賴(lài)性DNA聚合酶 擴(kuò)增是實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)。另一方面，本發(fā)明提供了實(shí)施DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒。該試劑盒利用上述方法和材料，可用于減少或消除DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中的非特異性 擴(kuò)增產(chǎn)物。在一些實(shí)施方案中，此試劑盒包括(i)至少一個(gè)作為正向引物或者作為反向引 物的RNA/DNA嵌合寡核苷酸，以及任選地一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針，其中嵌合寡核苷酸包 含至少一個(gè)核糖核苷酸，其中位于嵌合寡核苷酸的3’末端或位于嵌合寡核苷酸的3’末端 的10個(gè)核苷酸以?xún)?nèi)的核糖核苷酸的數(shù)目及組成將允許當(dāng)引物和預(yù)期的靶序列形成雙鏈體 時(shí)的DNA合成的起始而不會(huì)阻止DNA的延伸，并且將阻礙從引物-引物二聚體或者引物-探 針二聚體起始的DNA合成，其中引物中沒(méi)有兩個(gè)核糖核苷酸彼此相鄰；(ii)DNA依賴(lài)性DNA 聚合酶；和(iii)實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)的必需試劑和緩沖劑。在一些實(shí)施方案中，正向引物和反向引物都是RNA/DNA嵌合寡核苷酸。 在一些實(shí)施方案中，試劑盒中的所有的引物和探針均具有與3’末端堿基相同的堿 基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸相同的3’末端堿基選自A或T。在某些實(shí)施方案 中，和至少一個(gè)嵌合引物3’末端的所述堿基“互補(bǔ)”的堿基或者和所述“互補(bǔ)”堿基相鄰的 堿基是核糖核苷酸。在不同的實(shí)施方案中，在試劑盒中，每個(gè)嵌合引物或探針包含至少一個(gè)核糖核苷 酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互補(bǔ)的至少 一個(gè)核苷酸處或位于該核苷酸上游或下游1至5個(gè)核苷酸內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在試 劑盒中，每個(gè)嵌合引物或探針包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者 另外一個(gè)引物或探針的3’末端互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸處或者與該核苷酸相鄰。本試劑盒可用于進(jìn)行任何種類(lèi)的DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)不同的實(shí) 施方案，DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增選自由以下所組成的組指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增(ERCA)、滾環(huán)擴(kuò) 增(RCA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo) 的擴(kuò)增(TMA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)、自主序列復(fù)制(3SR)、使用Q3復(fù) 制酶的擴(kuò)增、和循環(huán)測(cè)序。在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包含檢測(cè)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的工具，舉例來(lái)說(shuō)，可檢測(cè)的 標(biāo)記、熒光性探針或者小溝結(jié)合物熒光染料。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和隨后的實(shí)施例可以更加充分的理解本發(fā)明。附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示利用RNA/DNA嵌合引物，模板依賴(lài)的擴(kuò)增的第一個(gè)循環(huán)是如何進(jìn)行的 圖解。起始區(qū)(IN)和延伸區(qū)(EL)沒(méi)有嵌入的RNA堿基。模板序列(SEQ ID NO=D是一個(gè) 假想的序列，并且和NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列沒(méi)有顯著相似性。RNA堿基為黑體。圖2是顯示利用RNA/DNA嵌合引物，模板依賴(lài)的擴(kuò)增的第二個(gè)循環(huán)是如何進(jìn)行的 圖解。延伸區(qū)(EL)包含RNA堿基。RNA堿基為黑體。圖3是顯示利用RNA/DNA嵌合引物，模板依賴(lài)的擴(kuò)增的第三個(gè)循環(huán)是如何進(jìn)行的 圖解。延伸區(qū)(EL)包含RNA堿基。RNA堿基為黑體。圖4是顯示DNA合成的起始是如何在RNA/DNA嵌合引物二聚體中被阻斷的圖解。 DNA合成的起始是無(wú)效率或者是不可能的，因?yàn)閮蓷l鏈上的起始區(qū)(IN)都包含RNA堿基。 嵌入的RNA堿基為黑體。圖5代表了使用RNA/DNA嵌合引物和常規(guī)DNA引物的菌株犬埃里希氏體(Ehrlichia canis，EC) 16s RNA基因的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定結(jié)果。圖6顯示了使用RNA/DNA嵌合引物和常規(guī)DNA引物的菌株犬埃里希氏體(EC) 16s RNA基因的檢測(cè)產(chǎn)物之間AC(t)值的差異。這里將AC(t)計(jì)算為模板樣品的C(t)值和非 靶對(duì)照(NTC)的C(t)值之間的差異。圖7顯示了相比常規(guī)DNA引物(圖7B)，使用RNA/DNA嵌合引物(圖7A)的菌株犬 埃里希氏體(EC) 16s RNA基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)測(cè)定的更高敏感性。 圖8顯示了相比常規(guī)DNA引物(圖8B)，使用RNA/DNA嵌合引物(圖8A)的菌株犬 巴倍氏菌(Babesia canis，BC)hsp70基因的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)測(cè)定的更高敏感性。圖9代表使用DNA引物(圖9A)和嵌合引物(圖9B)的犬ACTB基因的Tm(解鏈溫 度)分析。圖9A顯示使用DNA引物的高稀釋度非特異性產(chǎn)物峰，而在嵌合引物的情況下， 唯一顯著的峰則是ACTB峰。一個(gè)顯著的峰是進(jìn)行后續(xù)PCR HRM分析的先決條件。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于減少或消除在體外DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)期間產(chǎn)生的 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和其它人工產(chǎn)物的方法和試劑盒。本方法應(yīng)用了 RNA/DNA嵌合寡核苷酸 引物，以及任選地，應(yīng)用RNA/DNA嵌合寡核苷酸探針。它們簡(jiǎn)單、不昂貴而且對(duì)任何DNA依 賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增方法都適用。為幫助對(duì)于本發(fā)明的理解，下面定義幾個(gè)術(shù)語(yǔ)。如本文所用，“引物二聚體”或者“引物_探針二聚體”是擴(kuò)增反應(yīng)的雙鏈模板非依 賴(lài)性人工產(chǎn)物，長(zhǎng)度通常接近兩個(gè)引物長(zhǎng)度或者引物和探針長(zhǎng)度的總和減去重疊區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“探針”、“分子信標(biāo)探針”、“TaqMan探針”和“雙標(biāo)記探針”指一種和特定核 酸雜交的核酸探針。對(duì)于分子信標(biāo)來(lái)說(shuō)，探針是發(fā)夾形狀的序列，中間為和靶序列互補(bǔ)的 一段核苷酸，末端則包含短互補(bǔ)序列，其中一端共價(jià)結(jié)合熒光團(tuán)(報(bào)告染料)，另一端則結(jié) 合淬滅染料。在初始狀態(tài)下，兩個(gè)末端雜交，報(bào)告染料和淬滅染料距離足夠靠近，以便報(bào)告 染料的熒光被淬滅染料充分的淬滅掉。相反，雜交探針導(dǎo)致形成其中淬滅程度降低的線(xiàn)性 構(gòu)象。對(duì)于TaqMan探針和雙重標(biāo)記探針來(lái)說(shuō)，探針則不必要為發(fā)夾形狀，并且反應(yīng)應(yīng)包括 5’ - > 3’的水解酶，該水解酶水解5’的標(biāo)記堿基，從而使探針和淬滅劑分離。因此，通過(guò) 監(jiān)測(cè)熒光染料的發(fā)射光變化，間接地監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的形成是可能的(參見(jiàn)，例如，Tyagi, S.禾口 Kramer，F(xiàn). R. ，NatureBiotechnology 14 :303_308 (1996)；以及 Tyagi，S.等，Nat. Biotechnol. 16 :49_53 (1998))。因此，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量增加，熒光也隨之 增加。擴(kuò)增曲線(xiàn)被描述為代表作為循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光變化，其中設(shè)置一個(gè)任意的閾值，通 常是從起始循環(huán)計(jì)算的基線(xiàn)發(fā)射平均值以上的10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。一旦閾值被選定，擴(kuò)增曲線(xiàn)和 閾值交叉的點(diǎn)就被定義為閾值循環(huán)(C(t))或者交叉點(diǎn)(CP)。閾值循環(huán)預(yù)知序列的數(shù)量。
術(shù)語(yǔ)“雙鏈DNA結(jié)合染料”或者“非特異性探針”指的是不和單鏈DNA相互作用但 是積極摻入雙鏈DNA并且在此狀態(tài)下一旦激發(fā)則發(fā)光的化學(xué)成分。熒光染料的例子包括但 不限于 SYBR Green I、SYTO 9, LC Green、Eva Green 等。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”或者指脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)或 者指核糖核苷酸(包括D-核糖)。術(shù)語(yǔ)“核糖核苷酸”和“RNA堿基”以及術(shù)語(yǔ)“脫氧核糖 核苷酸”和“DNA堿基”可以交互使用。
術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”定義為包含兩個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的 分子，優(yōu)選是6個(gè)以上。它的精確大小將取決于很多因素，而這些因素則取決于寡核苷酸最 后的功能和用途。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“引物”指的是寡核苷酸，它可以充當(dāng)引物延伸產(chǎn)物的寡核苷酸 合成的起始點(diǎn)，引物延伸產(chǎn)物和充當(dāng)模板的核酸鏈互補(bǔ)。在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶 的存在下，在合適的溫度和PH中，引物延伸得以起始。術(shù)語(yǔ)“靶標(biāo)”和“靶序列”指的是待擴(kuò)增的核酸區(qū)域或序列。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“非 特異性擴(kuò)增”和“模板非依賴(lài)性擴(kuò)增”可以交互使用，指的是非靶序列的核酸序列的擴(kuò)增，來(lái) 源于引物和非靶序列的序列的雜交然后充當(dāng)?shù)孜镉糜谝镅由臁Ｐg(shù)語(yǔ)“RNA/DNA嵌合體”和“RNA/DNA嵌合寡核苷酸”可以交互使用，定義為包含脫 氧核糖核苷酸和至少一個(gè)核糖核苷酸的寡核苷酸，其可以在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中充當(dāng)引物或者 探針。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“起始區(qū)”指的是引物延伸產(chǎn)物的DNA合成起始發(fā)生的區(qū)域。它 包括在DNA合成的方向上，DNA合成起始和延伸幾個(gè)核苷酸的點(diǎn)。本文使用術(shù)語(yǔ)“上游”和“下游”來(lái)定義在寡核苷酸序列內(nèi)一個(gè)核苷酸相對(duì)于另外 一個(gè)核苷酸的位置。一個(gè)核苷酸位于另外一個(gè)核苷酸的上游指的是第一個(gè)核苷酸位于另外 一個(gè)核苷酸的5’端。一個(gè)核苷酸位于另外一個(gè)核苷酸的下游指的是第一個(gè)核苷酸位于另 外一個(gè)核苷酸的3’端。優(yōu)選實(shí)施方案的描述已發(fā)現(xiàn)RNA/DNA嵌合體引物的使用可以減少或者甚至消除非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。在 已批露的方法中，這種非特異性擴(kuò)增人工產(chǎn)物包含起始區(qū)域的RNA，且其擴(kuò)增很差。由于非 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的減少或甚至消除，在寡核苷酸引物和探針選定位置里核糖核苷酸的存在 增強(qiáng)了實(shí)時(shí)PCR測(cè)定的敏感性。該選擇過(guò)程并非隨機(jī)而是可能需要仔細(xì)的設(shè)計(jì)以得到最佳 結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)，RNA堿基可以沿著引物從3’末端直至最后一個(gè)5’堿基散在分布。因?yàn)橐?物二聚體是最普遍的人工產(chǎn)物，所以RNA嵌入的最重要的候選堿基位于引物的中部周?chē)?引物5’末端是修飾列表中最不重要的堿基。在設(shè)計(jì)嵌合體時(shí)，首要避免的是會(huì)阻止DNA延 伸的RNA鏈。不希望被任何理論或者作用機(jī)制所約縛，似乎非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物主要是當(dāng)引物3’ 末端和另一條引物或探針上互補(bǔ)的堿基產(chǎn)生堿基配對(duì)時(shí)，或者甚至是當(dāng)引物3’末端和相同 引物上互補(bǔ)的堿基自配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的。因此，在DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中，如果靠近與另外一個(gè)引物或探針的3’ 端或者其本身3’端互補(bǔ)的堿基處存在核糖核苷酸，那么由于起始區(qū)核糖核苷酸的存在，弓丨 物二聚體或引物-探針二聚體的延伸將會(huì)受到阻礙，并且非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生將會(huì)減 少甚至消除。因此，本發(fā)明提供了減少或消除DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中非特異性擴(kuò)增 產(chǎn)物的方法，所述方法包括進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，使用了至少一個(gè)RNA/DNA嵌合寡核苷酸作 為正向引物或者作為反向引物以及DNA依賴(lài)性DNA聚合酶來(lái)擴(kuò)增靶序列，和使用任選地一 個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針，其中嵌合寡核苷酸包含至少一個(gè)核糖核苷酸；且其中位于嵌合寡 核苷酸的3’末端或者位于嵌合寡核苷酸的3’末端的10個(gè)核苷酸以?xún)?nèi)的核糖核苷酸的數(shù)目將允許當(dāng)引物和預(yù)期的靶序列形成雙鏈體時(shí)的DNA合成的起始而不阻止DNA的延伸，并 且將阻礙從引物-引物二聚體或引物-探針二聚體起始的DNA合成；且其中引物中沒(méi)有兩 個(gè)核糖核苷酸彼此相鄰。當(dāng)正向引物和反向引物都是RNA/DNA嵌合體時(shí)，得到較好的減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn) 物的效率。在一些實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增反應(yīng)的所有引物和探針在3’末端都有相同的堿基。 期望所有的引物都含有相同的3’末端以最小化需要修飾的堿基數(shù)目。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，用于擴(kuò)增反應(yīng)的所有引物的3’末端都是A或T。在一些實(shí)施方案中，在反應(yīng)混合物中，至少一個(gè)嵌合引物或探針包含核糖核苷酸， 此核糖核苷酸位于和其自身3’端或者另外一個(gè)引物或探針3’端互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸 處，或者與該核苷酸相鄰。在不同的實(shí)施方案中，在反應(yīng)混合物中，每個(gè)嵌合引物或探針包含至少一個(gè)核糖 核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互補(bǔ)的 至少一個(gè)核苷酸處，或位于該核苷酸1至5個(gè)核苷酸內(nèi)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在反應(yīng)混合 物中，每個(gè)嵌合引物或探針包含核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’端或者另外 一個(gè)引物或探針的3’端互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸處或者與該核苷酸相鄰。
對(duì)于RNA堿基的取代來(lái)說(shuō)，無(wú)數(shù)的構(gòu)型可用于本發(fā)明公開(kāi)的RNA/DNA嵌合體中，從 修飾任何一個(gè)和其自身或者其它引物3’端互補(bǔ)的核苷酸或修飾其相鄰物(neighbor)到修 飾所有這樣的核苷酸，只要在修飾的寡核苷酸中沒(méi)有RNA鏈的產(chǎn)生。但是修飾所有和其自 身以及其它引物3’端互補(bǔ)的核苷酸或所有這樣的核苷酸的相鄰物并無(wú)必要，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生 RNA較多的區(qū)域并阻斷延伸。RNA堿基可沿著引物從3’末端直至最后一個(gè)5’堿基散在分布。因?yàn)橐锒垠w 是最普遍的人工產(chǎn)物，所以需要修飾的最重要的堿基位于引物的中部周?chē)?。引?’端是修 飾列表中最不重要的堿基。在設(shè)計(jì)嵌合體時(shí)，首要避免的是會(huì)阻止DNA延伸的RNA鏈。一般來(lái)說(shuō)，擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和應(yīng)用在本領(lǐng)域中眾所周知。本發(fā)明的引物的特征在 于將RNA堿基包含在引物序列中。引物的其它方面，比如全長(zhǎng)和序列，是按照標(biāo)準(zhǔn)的引物設(shè) 計(jì)規(guī)范挑選出來(lái)的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道，通過(guò)仔細(xì)的設(shè)計(jì)，用于特定應(yīng)用的RNA/DNA 嵌合體引物或探針的最佳序列將需要最少的實(shí)驗(yàn)。所批露的方法可與任何核酸擴(kuò)增反應(yīng)一起使用，如單重和多重反應(yīng)以及需要核 酸擴(kuò)增反應(yīng)作為在前步驟的檢測(cè)，例如HRM分析。使用所批露的RNA/DNA嵌合體的核酸 擴(kuò)增的形式包括涉及指數(shù)擴(kuò)增的恒溫或熱循環(huán)核酸擴(kuò)增反應(yīng)、需要指數(shù)擴(kuò)增的恒溫或熱 循環(huán)核酸擴(kuò)增反應(yīng)、涉及恒溫線(xiàn)性擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反應(yīng)、需要恒溫線(xiàn)性擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反 應(yīng)、涉及滾環(huán)擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反應(yīng)、涉及聚合酶鏈反應(yīng)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)和不涉及熱循環(huán)的 核酸擴(kuò)增反應(yīng)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)的例子是指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增(ERCA)(在PCT申請(qǐng)第WO 97/19193 號(hào)中稱(chēng)為鏈置換級(jí)聯(lián)擴(kuò)增，以及在Lizardi等，NatureGenetics 19(3) =225232(1998) 中稱(chēng)為超分支滾環(huán)擴(kuò)增)和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)(美國(guó)專(zhuān)利第5，854，033號(hào)；PCT申請(qǐng)第WO 97/19193 號(hào)；Lizardi 等，NatureGenetics 19(3) 225232 (1998))；多重置換擴(kuò)增(MDA) (PCT 申請(qǐng) W0"/l8241)；鏈置換擴(kuò)增(SDA) (Walker 等，Nucleic Acids Research 20 16911696(1992)，Walker 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392396(1992))；基于核酸序 列的擴(kuò)增(NASBA) (Compton, Nature 350 9192(1991))；轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA) (Nelson,Crit Rev Clin Lab Sci 35 =369414 (1998))；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，實(shí)時(shí) PCR，以及其它涉 及熱循環(huán)的指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)，自主序列復(fù)制(3SR)和使用Qi3復(fù)制酶的擴(kuò)增(Birkenmeyer 禾口 Mushahwar，J.Virological Methods 35:117 126(1991) ；Landegren，Trends Genetics 9 199202(1993))；多種涉及熱循環(huán)的線(xiàn)性擴(kuò)增技術(shù)比如循環(huán)測(cè)序(Craxton等，Methods Companion Methods in Enzymology 3:20 26(1991))。使用所批露的RNA/DNA嵌合體的核酸擴(kuò)增測(cè)定的優(yōu)選形式包括“實(shí)時(shí)PCR”測(cè)定， 在這里也指“定量PCR(qPCR)”，和“高分辨率熔解(HRM)”分析。在qPCR方法中，PCR反應(yīng) 的進(jìn)行是邊發(fā)生邊檢測(cè)的(也就是實(shí)時(shí)的)。在這些方法中，熒光雙鏈DNA結(jié)合染料，(如 SYBR Green I)，或者雙重標(biāo)記探針(如分子信標(biāo)或者Taqman探針)被用于實(shí)時(shí)測(cè)量擴(kuò)增 產(chǎn)物的量。雙重標(biāo)記探針和非特異性熒光染料之間的最重要的區(qū)別在于非特異性熒光染料 檢測(cè)所有的雙鏈DNA，包括非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。另一方面，雙重標(biāo)記探針?lè)椒ň哂袑?duì)于不同 的序列需要合成不同探針的缺點(diǎn)，這樣就增加了測(cè)定建立和運(yùn)行的費(fèi)用。另外，特異性探針 不能進(jìn)行后續(xù)的PCR分析如Tm(解鏈溫度)和HRM，而非特異性染料則是可能的。在高分辨率熔解(HRM)測(cè)定中，在封閉管中進(jìn)行的PCR后續(xù)方法使PCR擴(kuò)增子中 的遺傳變異(SNP，突變，甲基化)分析成為可能。它通過(guò)允許對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行更為詳細(xì)的熱 變性研究，并且獲得比以往更多的信息，從而比經(jīng)典的熔解曲線(xiàn)分析更為強(qiáng)大。HRM基于核 酸的解離(熔解)行為表征核酸樣品。樣品可以根據(jù)它們的序列、長(zhǎng)度、GC含量或鏈互補(bǔ) 性而被分辨出來(lái)。即使單個(gè)堿基的改變比如SNP(單核苷酸多態(tài)性)也可以很容易的被鑒 別出來(lái)。
最重要的高分辨率熔解應(yīng)用是基因掃描，是在測(cè)序前或者作為測(cè)序的替代方法尋 找PCR擴(kuò)增子中未知變異的存在。PCR產(chǎn)物中的突變通過(guò)高分辨率熔解是可檢測(cè)的，因?yàn)樗?們改變了 DNA熔解曲線(xiàn)的形狀。新一代的DNA染料、高端儀器和復(fù)雜分析軟件的結(jié)合允許 檢測(cè)這些改變，并得出關(guān)于潛在的序列群集的信息。試劑盒本發(fā)明還提供試劑盒，通常是包括用于實(shí)施本方法的組分的多容器單元。在一些 實(shí)施方案中，試劑盒包括一個(gè)引物或一組引物，其中至少一個(gè)是如本文所公開(kāi)的RNA/DNA 嵌合體。試劑盒的其它組分包括實(shí)施本擴(kuò)增反應(yīng)所必需的試劑和酶，例如底物核苷三磷酸、 二價(jià)陽(yáng)離子、反應(yīng)緩沖劑、合適的DNA聚合酶、操作規(guī)程以及實(shí)施反應(yīng)的說(shuō)明書(shū)。本試劑盒可用于涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)的任何應(yīng)用，比如傳染原的診斷試劑盒、染色 體異常產(chǎn)前診斷的試劑盒、遺傳病診斷試劑盒、性別確定試劑盒等。在一些實(shí)施方案中，試 劑盒還包括檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的工具。擴(kuò)增產(chǎn)物形成時(shí)的測(cè)量有很多選擇。一種方法應(yīng) 用標(biāo)記，例如僅結(jié)合雙鏈DNA的染料。在這類(lèi)方法中，擴(kuò)增產(chǎn)物(為雙鏈)在溶液中結(jié)合 染料分子形成復(fù)合體，利用合適的染料，區(qū)別溶液中游離的染料分子和結(jié)合在擴(kuò)增產(chǎn)物上 的染料分子是可能的。例如，某些染料只有在結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)才會(huì)發(fā)熒光?？捎糜诖朔N 普通類(lèi)方法的染料的實(shí)例包括但不限于Molecular Probes, Inc.的Syber Green 和Pico Green 、Idaho technology.的LCGreen、溴化乙錠、碘化丙錠、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、Toto-I、Yoyo-I、DAPI (4，，6- 二脒基 _2_ 苯基吲哚鹽酸鹽)。另外，擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)量和檢測(cè)也可以通過(guò)例如監(jiān)測(cè)放射性、比色法、吸收、熒光共 振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、磁性參數(shù)或者酶促活性得以實(shí)現(xiàn)。因此，可以采用的引物和/或探針的標(biāo)記包括但不限于熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素、電子密集試劑、酶和具有特異結(jié)合配偶 體的配體(如生物素-親和素)。RNA/DNA嵌合引物的合成RNA/DNA嵌合引物的合成使用本領(lǐng)域中眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)手段實(shí)施，例如 Beaucage等1981，Tetrahedron Lett. 22 1859-1862的二乙基亞磷酰胺方法；以及美國(guó)專(zhuān) 利第4，458，066號(hào)的固相支持方法。優(yōu)選地，使用商購(gòu)獲得的核苷酸亞磷酰胺在商購(gòu)獲得 的自動(dòng)DNA合成儀中進(jìn)行合成反應(yīng)。如這里所用的適用于合成含修飾核苷酸的寡核苷酸的 核苷酸亞磷酰胺和支持物是商購(gòu)獲得的。RNA/DNA嵌合寡核苷酸的合成通過(guò)向正在增長(zhǎng)的 鏈上逐步加入脫氧核苷和核糖核苷單體而得以實(shí)施。每次的添加包括將核苷單體的反應(yīng) 性3’亞磷基偶聯(lián)至結(jié)合到固相支持物上的另外一個(gè)核苷的5’羥基上。最后一個(gè)核苷加完 后，寡核苷酸從支持物上被切下來(lái)，保護(hù)基團(tuán)從堿基上被移除，且RNA/DNA嵌合寡核苷酸經(jīng) 純化后使用。效率盡管并不希望被任何理論或者任何特別的機(jī)制所約縛，但是據(jù)信在DNA依賴(lài)性 DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中，當(dāng)RNA被嵌入到起始區(qū)時(shí)，DNA合成的起始效率受到妨礙，但當(dāng)RNA 嵌入到模板序列中時(shí)，DNA延伸的效率受到更低強(qiáng)度的影響。 但是，當(dāng)產(chǎn)生并不想要的非模板性雜交如RNA/DNA嵌合體引物二聚體時(shí)，起始區(qū) 包含RNA堿基。再一次不希望被任何理論或者任何特別的機(jī)制所約縛，認(rèn)為這會(huì)導(dǎo)致擴(kuò) 增循環(huán)在動(dòng)力學(xué)上和/或熱力學(xué)上的無(wú)效率。將RNA堿基并入到DNA引物上可能會(huì)使堿 基配對(duì)不穩(wěn)定。但是，引物二聚體不穩(wěn)定可能要比引物-靶DNA雜交體的不穩(wěn)定更為復(fù) 雜。Nakano等研究了 DNA嵌合接點(diǎn)的熱力學(xué)，且表明嵌合接點(diǎn)(rd/dd和dr/dd)的最近鄰 AG37°C和 DNA 雜交體(dd/dd)并不同(Nakano 等(2004) J Am ChemSoc，126，1088-1095)。 其并不總是增加但是發(fā)生的更頻繁。因此，使用RNA/DNA嵌合引物在低模板DNA擴(kuò)增反應(yīng)中減少引物-二聚體人工產(chǎn) 物，導(dǎo)致任何DNA依賴(lài)的DNA-聚合反應(yīng)中的檢測(cè)敏感性的增加。下面的實(shí)施例用一個(gè)假想的靶序列進(jìn)行更為詳細(xì)的闡述。參考圖1，靶模板SEQ ID NO 1所設(shè)定的序列將用RNA/DNA嵌合體引物進(jìn)行擴(kuò)增(正向引物SEQ ID NO 2 ；反向 引物SEQ ID NO :3)。在第一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中，擴(kuò)增子全長(zhǎng)的起始和合成包括只用DNA堿基作 為模板?，F(xiàn)在參考圖2和圖3，可以看到熔解和退火后，因?yàn)榍度隦NA的引物現(xiàn)在是延伸區(qū) 的一部分，第二個(gè)和第三個(gè)擴(kuò)增循環(huán)效率較低，但仍可擴(kuò)增。在模板依賴(lài)的擴(kuò)增中，RNA堿 基總是僅位于延伸區(qū)。另一方面，當(dāng)不希望得到的非模板雜交發(fā)生時(shí)，如圖4中的RNA/DNA嵌合體引物二 聚體，起始區(qū)包括RNA堿基。這將引起第一次擴(kuò)增循環(huán)以及所有后續(xù)循環(huán)的無(wú)效率。因此， 使用RNA/DNA嵌合體引物在低模板DNA擴(kuò)增反應(yīng)中減少引物-二聚體人工產(chǎn)物，且導(dǎo)致任 何DNA依賴(lài)性DNA-聚合反應(yīng)中檢測(cè)敏感性的增加。本發(fā)明呈現(xiàn)了 RNA/DNA嵌合體引物對(duì)于減少DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中不 希望得到的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物具有有利效果的證據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)表明RNA/DNA嵌合體引物 消除了非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，并增加了在實(shí)時(shí)PCR測(cè)定中檢測(cè)低濃度基因拷貝的敏感性及能力。現(xiàn)在將通過(guò)下面的實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例預(yù)期以非限制性形式進(jìn)行解釋。
實(shí)施例方法標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸以及RNA/DNA嵌合寡核苷酸由Integrated DNATechnologies, Inc. (USA)合成，使用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺化學(xué)以及使用IDT的專(zhuān)利合成平臺(tái)。通過(guò)SinglePlexer 軟件(GenAphora Ltd)進(jìn)行RNA/DNA嵌合寡核苷酸qPCR測(cè)定的引物設(shè)計(jì)。幾個(gè)單個(gè) RNA堿基被嵌在每個(gè)引物中。20 μ 1反應(yīng)物包含0.5μ M每個(gè)引物，IO4質(zhì)粒DNA和10 μ 1 DyNAmo Flash SYBR Green qPCR 試劑盒(Finnzymes Oy)。擴(kuò)增循環(huán)為95°C，7min (第 一循環(huán))；94 °C，IOs ；61°C，30s ；讀板；76°C，ls ；讀板；39 循環(huán)；然后 61 °C，Imin ； 并在 65°C-95°C進(jìn)行解鏈溫度分析。使用提前克隆到pGMT easy (Promega)的菌株犬埃里希氏 體(EC)的16s RNA基因、菌株犬巴倍氏菌(BC)hsp70基因和犬肌動(dòng)蛋白進(jìn)行測(cè)定。利用 Chromo4 (Bio Rad)，使用雙份樣品，在 1到 IO6拷貝/ μ 1不同稀釋度內(nèi)，實(shí)施實(shí)時(shí)qPCR。 AC(t)值計(jì)算為樣品的C(t)和非模板對(duì)照的C(t)之間的差異。實(shí)施例1對(duì)IO4拷貝的菌株犬埃里希氏體(EC)的16s RNA基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，采用DNA弓丨 物以及RNA/DNA嵌合引物。DNA 引物正向引物5，-TCGCTATTAGATGAGCCTACGT3，(SEQID NO 4)反向引物5，-GAGTCTGGACCGTATCTCAGTT-3，(SEQID NO 5)RNA/DNA 嵌合引物(嵌入的RNA堿基為黑體)正向引物5，-TCGCUATUAGATGAGCCUACGT-3，(SEQID NO 6)反向引物5，-GAGTCTGGACCGUATCTCAGTT-3，(SEQID NO 7)結(jié)果呈現(xiàn)在圖5中。正如所看到的，當(dāng)使用DNA引物時(shí)、在缺乏模板的情況下，在 27個(gè)循環(huán)以后可以檢測(cè)到明顯的人工產(chǎn)物(見(jiàn)非模板性對(duì)照(NTC)曲線(xiàn))，但是當(dāng)使用嵌 合引物時(shí)人工產(chǎn)物仍保持在檢測(cè)閾值以下。實(shí)際上，特異性模板依賴(lài)性產(chǎn)物的C(t)值被延 后了大概3個(gè)循環(huán)，但是非特異性產(chǎn)物的消除使檢測(cè)延長(zhǎng)到比常規(guī)DNA引物反應(yīng)至少多13 個(gè)循環(huán)。RNA/DNA嵌合引物的這一效果在圖6中得到進(jìn)一步展示，其顯示了 6份樣品所計(jì)算 的AC(t)值?？梢钥吹剑逗弦锏臋z測(cè)能力比常規(guī)DNA引物多4個(gè)循環(huán)以上。實(shí)施例2對(duì)一系列稀釋度的菌株犬埃里希氏體(EC)的16s RNA基因進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，采用和 實(shí)施例1中相同的DNA以及嵌合引物。結(jié)果呈現(xiàn)在圖7A和7B中。利用下面的引物對(duì)一系 列稀釋度的菌株犬巴倍氏菌(BC)hsp70基因進(jìn)行另外一個(gè)實(shí)時(shí)PCR，其結(jié)果呈現(xiàn)在圖8A和 8B中。DNA 引物
正向引物5，-GTCATCACTGTGCCTGCGTACT-3，(SEQID NO 8)反向引物5，-GCATGACGTTGAGACCGGCAAT-3，(SEQID NO 9)RNA/DNA 嵌合引物(嵌入的RNA堿基為黑體)正向引物5，-GTCATCACTGTGCCTGCGUACT-3，(SEQID NO 10)反向引物5，-GCATGACGTTGAGACCGGCAAT-3，(SEQID NO 11)此實(shí)施例顯示當(dāng)使用RNA/DNA嵌合引物時(shí)，擴(kuò)增反應(yīng)的敏感性增加。在兩個(gè)例子 中， 使用嵌合引物使得檢測(cè)低濃度的基因拷貝成為可能，可以達(dá)到每管幾個(gè)拷貝。實(shí)施例3在這個(gè)實(shí)施例中，利用DNA和嵌合引物對(duì)系列稀釋度的犬ACTB基因進(jìn)行qPCR，然 后進(jìn)行Tm分析。DNA 引物正向引物5’-GCGCAAGTACTCTGTGTGGAT-3‘ (SEQ ID NO 12)反向引物5，-GTCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3，(SEQID NO 13)RNA/DNA 嵌合引物(嵌入的RNA堿基為黑體)正向引物5，-GCGCAAGUACTCTGTGTGGAT-3，(SEQID NO 14)反向引物5，-GTCGUACTCCTGCTTGCTGAT-3，(SEQID NO 15)本實(shí)施例展示了在低模板濃度下，在進(jìn)行HRM分析前，通過(guò)使用PCR嵌合引物得到 提高的特異性。當(dāng)使用DNA引物時(shí)(圖9A)，在Tm圖中可以看到非特異性產(chǎn)物峰在70°C到 78°C的范圍內(nèi)，而高濃度模板中所預(yù)期的擴(kuò)增子的Tm峰則在8rC到82°C的范圍內(nèi)。圖9B 顯示了當(dāng)使用DNA/RNA嵌合引物時(shí)所得到的Tm圖。這里僅在低濃度和高濃度情況下可以 看到所預(yù)期的峰。通過(guò)用DNA/RNA嵌合引物所得到的Tm圖也使低濃度情況下的PCR后HRM 分析成為可能。雖然對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了特別的描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到可以做很多變 更和修改。所以，本發(fā)明不應(yīng)解釋為僅限于所特別描述的實(shí)施方案，并且通過(guò)參考隨后的權(quán) 利要求將更容易理解本發(fā)明的范圍和概念。參考文獻(xiàn)1. Rychlik, W. (1995)Mol. Biotechnol. 3，129-1342. Watson, R. (1989) Amplifications, 5-63. Ferrie, R. Μ. , Schwarz, Μ. J. , Robertson, N. H. , Vaudin, S. , Super, Μ. , Malone, G.和 Little，S. (1992) Am. J. Hum. Genet. 51,251-2624. Don, R. H. ，Cox, P. T. ，ffainwright, B. J. ，Baker, K.禾口 Mattick，J. S. (1991) Nucleic Acids Res. 19,40085. Chou, Q. ，Russell, M. ，Birch, D. E. ，Raymond, J.禾口 Bloch，W. (1992)Nucleic Acids Res. 20，1717-17236. D，Aquila, R. T. ，Bechtel, L. J. ，Videler, J. A. ，Eron, J. J. ，Gocczyca, P.禾口 Ksplan, J. C. (1991)Nucleic Acids Res. 19,37497. TaqMan PCR Reagent Kit Protocol :Part Number 402823, Revision A, May1996page 18 :Ρ·Ε·Applied Biosystems8. Tyagi, S.禾口 Kramer，F(xiàn). R. (1996)Nature Biotechnology 14 :303_3089. Tyagi, S.等人· (1998) Nat. Biotechnol. 16 :49_5310. Lizardi 等人.(1998) Nature Genetics 19(3) :225_23211. Walker 等人.(1992) Nucleic Acids Research 20:1691-169612. Walker 等人.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392_39613. Compton (1991) Nature 350:91-9214. Nelson(1998)Crit Rev Clin Lab Sci 35:369-41415. Birkenmeyer 禾口 Mushahwar (1991)J. Virological Methods 35:117—12616. Landegren (1993) Trends Genetics 9:199-20217. Craxton 等人· (1991)Methods Companion Methods in Enzymology3 20~2618. Beaucage 等人· (1981) Tetrahedron Lett. 22 :1859_186219. Nakano,S.，Kanzaki，T.禾口 Sugimoto，N. (2004) J Am. Chem. Soc. 126，1088—109權(quán)利要求
一種在DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)中減少或消除人工產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物形成的方法，所述方法包括使用至少一個(gè)RNA/DNA嵌合寡核苷酸作為正向引物或者作為反向引物以及使用DNA依賴(lài)性DNA聚合酶和任選的一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；其中所述嵌合寡核苷酸包含至少一個(gè)核糖核苷酸；其中位于所述嵌合寡核苷酸的3’末端或位于所述嵌合寡核苷酸的3’末端的10個(gè)核苷酸以?xún)?nèi)的核糖核苷酸的數(shù)目將允許當(dāng)所述引物和預(yù)期的靶序列形成雙鏈體時(shí)的DNA合成的起始而不會(huì)阻止DNA的延伸，并且將阻礙從引物-引物二聚體或者引物-探針二聚體起始的DNA合成；和其中所述引物中沒(méi)有兩個(gè)核糖核苷酸彼此相鄰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物都是RNA/DNA嵌合 寡核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述擴(kuò)增反應(yīng)中使用的所有的引物和探針均具 有與3’末端堿基相同的堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述嵌合寡核苷酸的相同的3’末端堿基選自A或T。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與至少一個(gè)嵌合引物的所述3’末端互補(bǔ)的堿基或 者與所述互補(bǔ)堿基相鄰的堿基是核糖核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在反應(yīng)混合物中，每個(gè)嵌合引物或探針包含至少 一個(gè)核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末 端互補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸處或者位于該核苷酸上游或下游1至5個(gè)核苷酸內(nèi)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中在所述反應(yīng)混合物中，每個(gè)嵌合引物或探針包含 核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互 補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸處或者與該核苷酸相鄰。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的方法，其中所述DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)選自由以 下所組成的組指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增(ERCA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、鏈置換擴(kuò)增 (SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)定 量PCR(qPCR)、自主序列復(fù)制(3SR)、使用Q0復(fù)制酶的擴(kuò)增、和循環(huán)測(cè)序。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)時(shí)定量 PCR(qPCR)。
10.一種實(shí)施DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)的試劑盒，所述試劑盒包括(i)至少一個(gè)作為正向引物或者作為反向引物的RNA/DNA嵌合寡核苷酸，和任選地一 個(gè)或多個(gè)寡核苷酸探針；其中所述嵌合寡核苷酸包含至少一個(gè)核糖核苷酸；其中位于所述嵌合寡核苷酸的3’末端或位于所述嵌合寡核苷酸的3’末端的10個(gè)核苷 酸以?xún)?nèi)的核糖核苷酸的數(shù)目將允許僅當(dāng)所述引物和預(yù)期的靶序列形成雙鏈體時(shí)的DNA合 成的起始而不會(huì)阻止DNA的延伸，并且將阻礙從引物-引物二聚體或者引物-探針二聚體 起始的DNA合成；和其中所述引物中沒(méi)有兩個(gè)核糖核苷酸彼此相鄰；(ii)DNA依賴(lài)性DNA聚合酶；(iii)實(shí)施所述擴(kuò)增反應(yīng)的必需試劑和緩沖劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述正向引物和所述反向引物都是RNA/DNA 嵌合寡核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中在所述試劑盒中使用的所有的引物和探針均 具有與3’末端堿基相同的堿基。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的試劑盒，其中所述嵌合寡核苷酸的相同的3’末端堿基選自 A或T。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中與至少一個(gè)嵌合引物的所述3’末端互補(bǔ)的堿 基或者與所述互補(bǔ)堿基相鄰的堿基是核糖核苷酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中每個(gè)嵌合引物或探針包含至少一個(gè)核糖核苷 酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互補(bǔ)的至少 一個(gè)核苷酸處或位于該核苷酸上游或下游的1至5個(gè)核苷酸內(nèi)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其中在所述試劑盒中，每個(gè)嵌合引物或探針包含 核糖核苷酸，所述核糖核苷酸位于和它本身3’末端或者另外一個(gè)引物或探針的3’末端互 補(bǔ)的至少一個(gè)核苷酸處或者與該核苷酸相鄰。
17.根據(jù)權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增 反應(yīng)選自由以下所組成的組指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增(ERCA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、多重置換擴(kuò)增(MDA)、 鏈置換擴(kuò)增(SDA)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)、自主序列復(fù)制(3SR)、使用Q0復(fù)制酶的擴(kuò)增、和循環(huán)測(cè)序。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的試劑盒，其中所述DNA依賴(lài)性DNA聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)時(shí) 定量 PCR(qPCR)。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其還包括檢測(cè)所述擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的工具。
全文摘要
提供了用于核酸序列擴(kuò)增的方法。本方法使用RNA/DNA嵌合寡核苷酸作為引物。所述引物具有沿其長(zhǎng)度散在分布的RNA殘基，且引物中沒(méi)有兩個(gè)核糖核苷酸是彼此相鄰的。本方法可用于減少如引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了包含用于實(shí)踐本擴(kuò)增方法的RNA/DNA嵌合寡核苷酸引物的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101842494SQ200880105297
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者奧菲爾·皮萊格 申請(qǐng)人:吉納珀萊有限公司