專利名稱：人胚胎干細(xì)胞的分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本專利申請是2007年4月18日提交的美國專利申請No. 11/736,908的部分 繼續(xù)申請，其要求2006年4月28日提交的美國臨時申請No. 60/745，899、2006年9月 30日提交的美國臨時申請No. 60/827,695以及2006年12月29日提交的美國臨時申請 No. 60/882，670的優(yōu)先權(quán)，這些臨時申請的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文。本發(fā)明提供促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供形成胰腺內(nèi)胚層、 胰腺激素表達(dá)細(xì)胞和胰腺激素分泌細(xì)胞的改進(jìn)方法。本發(fā)明還提供在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞層的 情況下促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的方法。
背景技術(shù)：
由于I型糖尿病細(xì)胞替代療法的進(jìn)步和可移植胰島數(shù)量的不足，人們已重點關(guān)注 于開發(fā)適于移植的胰島素生成細(xì)胞或β細(xì)胞來源。一種方法是從多能干細(xì)胞(例如為胚 胎干細(xì)胞)產(chǎn)生功能性β細(xì)胞。在脊椎動物胚胎發(fā)育中，多能細(xì)胞在已知為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生一群包括三 胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細(xì)胞。例如為甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟組織將由內(nèi) 胚層經(jīng)過中間階段發(fā)育而成。這一過程中的中間階段是定形內(nèi)胚層的形成。定形內(nèi)胚層細(xì) 胞表達(dá)多種標(biāo)志物,例如HNF-3 3、GATA4、Mixll、CXCR4和Sox-17。由定形內(nèi)胚層分化成的胰腺內(nèi)胚層形成胰腺。胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)胰十二指腸同 源盒基因Pdxl。在不存在Pdxl的情況下，胰腺不能超越腹胰芽和背胰芽的形成而發(fā)育。因 此，Pdxl的表達(dá)標(biāo)志著胰腺器官形成中的關(guān)鍵步驟。除了其他類型的細(xì)胞以外，成熟胰腺 還包含外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌組織和內(nèi)分泌組織由胰腺內(nèi)胚層分化形成。據(jù)報道，具有胰島細(xì)胞特征的細(xì)胞衍生自小鼠胚胎細(xì)胞。例如，Lumelsky等人 (Science 292:1389,2001)記錄了小鼠胚胎干細(xì)胞分化出類似于胰島細(xì)胞的胰島素分泌 結(jié)構(gòu)。Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)記錄了衍生自小鼠胚胎干細(xì)胞的胰島素分泌 細(xì)胞使鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖正?；Ｔ谝粋€實例中，Hori等人(PNAS 99 16105，2002)公開了用磷脂酰肌醇3-激酶 (LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細(xì)胞得到類似b細(xì)胞的細(xì)胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 =998,2003)記錄了從組成性表達(dá)Pax4的小鼠胚 胎干細(xì)胞產(chǎn)生胰島素生成細(xì)胞。Micallef等人記錄了視黃酸可以調(diào)控胚胎干細(xì)胞的定型以形成Pdxl陽性胰腺內(nèi) 胚層細(xì)胞。在胚胎干細(xì)胞分化的第4天(對應(yīng)于胚胎中的原腸胚形成末期)將視黃酸添加 到培養(yǎng)基中，此時視黃酸誘導(dǎo)Pdxl表達(dá)最有效(Diabetes 54 =301,2005)。Miyazaki等人記錄了過量表達(dá)Pdxl的小鼠胚胎干細(xì)胞系。他們的結(jié)果表明外 源Pdxl的表達(dá)明顯增強(qiáng)了所得分化細(xì)胞中胰島素、生長抑素、葡糖激酶、神經(jīng)元素3、P48、 Pax6 和 HNF6 基因的表達(dá)(Diabetes 53 1030, 2004)。Skoudy等人記錄了激活素A(TGFβ超家族的成員)上調(diào)了小鼠胚胎干細(xì)胞中的外分泌胰腺基因(P48和淀粉酶基因)和內(nèi)分泌基因(Pdxl、胰島素和高血糖素)的表達(dá)。使 用InM激活素A時觀察到最大效應(yīng)。他們也觀察到胰島素和Pdxl mRNA的表達(dá)水平不受視 黃酸影響；然而，3nMFGF7處理導(dǎo)致Pdxl的轉(zhuǎn)錄水平提高(Biochem. J. 379 =749,2004)。Shiraki等人研究了特別地增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞分化為Pdxl陽性細(xì)胞的生長因子的 效應(yīng)。他們觀察到TGF β 2可再現(xiàn)地得出較高比例的Pdxl陽性細(xì)胞(Genes Cells. 2005-6 ； 10(6) 503-16.) οGordon等人證實了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同Wnt信號抑制劑的情況下，從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)braChyury+/HNF-3 β +內(nèi)胚層細(xì)胞(US 2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS, Vol 103，page 16806, 2006 (國家科學(xué)院院刊，第 103 卷，第 16806頁，2006年))提出“前原條的形成需要同時伴有Wnt和TGF- β /nodal/激活素信號”。然而，小鼠胚胎干細(xì)胞發(fā)育模型未必能準(zhǔn)確模擬高等哺乳動物(例如為人類)的
發(fā)育程序。Thomson等人從人囊胚中分離出胚胎干細(xì)胞(Science 282:114,1998)。同時， Gearhart及其同事從胎兒性腺組織衍生人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 =13726,1998)。與小鼠胚胎干細(xì)胞不同(其只是通過采用白血病抑 制因子(LIF)進(jìn)行培養(yǎng)便可抑制分化)，人胚胎干細(xì)胞必須在十分特殊的條件下培養(yǎng)(美國 專利 No. 6，200，806 ；WO 99/20741 ；WO 01/51616)。D’ Amour等人描述了在存在高濃度激活素和低血清的情況下，制備由人胚胎干 細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的增菌培養(yǎng)基(D’ Amour KA等人，2005年)。將這些細(xì)胞移 植到小鼠腎被膜下導(dǎo)致了分化為具有某些內(nèi)胚層器官特征的更為成熟的細(xì)胞。在添加 FGF-10之后，人胚胎干細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞可以進(jìn)一步分化成Pdxl陽性細(xì)胞(US 2005/0266554A1)。D，Amour 等人(Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)_24，I392-HOl (2OO6)) 聲稱“我們已開發(fā)出將人胚胎干細(xì)胞(hES)轉(zhuǎn)化成能合成胰腺激素胰島素、高血糖素、生 長抑素、胰多肽和生長激素釋放肽的內(nèi)分泌細(xì)胞的分化方法。該方法通過引導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)過類 似于定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體的階段轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)內(nèi)分泌激素的 細(xì)胞來模擬體內(nèi)胰腺器官發(fā)生?！庇秩纾現(xiàn)isk等人記錄了用于從人胚胎干細(xì)胞制備胰島細(xì)胞的體系 (US2006/0040387A1)。在這種情況下，分化途徑劃分為三個階段。首先，使用正丁酸鹽和激 活素A的組合，使人胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)胚層。然后，與EGF或β細(xì)胞素結(jié)合采用TGFi3 拮抗劑(例如Noggin)培養(yǎng)細(xì)胞，以生成Pdxl陽性細(xì)胞。通過煙酰胺誘導(dǎo)終末分化。在一個實例中，Benvenistry等人聲稱“我們得出如下結(jié)論P(yáng)dxl的過量表 達(dá)增強(qiáng)了胰富集基因的表達(dá)，胰島素表達(dá)的誘導(dǎo)可能需要僅存在于體內(nèi)的額外的信 號?！?Benvenistry 等人，Stem Cells 2006;24:1923-1930)。因此，仍然非常需要開發(fā)用于建立可被擴(kuò)增以滿足當(dāng)前臨床需要的多能干細(xì)胞系 的條件，同時保持分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞或胰腺激素分泌細(xì)胞的潛能。 我們已采用替代方法，以提高使人胚胎干細(xì)胞朝胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的效率。

發(fā)明內(nèi)容
在一個實施例中，本發(fā)明提供了用于分化多能干細(xì)胞的方法，該方法包括如下步 驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞；以及b.使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞；c.使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)所述胰腺內(nèi)胚層譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞；以及d.使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征 性標(biāo)志物的細(xì)胞。在一個實施例中，通過如下方法中的任何一種處理多能干細(xì)胞，使表達(dá)定 形內(nèi)胚 層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化而成a.在不存在血清的情況下，在含有激活素A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，然后用 激活素A和血清培養(yǎng)細(xì)胞，再用激活素A和不同濃度的血清培養(yǎng)細(xì)胞；或b.在不存在血清的情況下，在含有激活素A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，然后用 激活素A和另一個濃度的血清培養(yǎng)細(xì)胞；或c.在不存在血清的情況下，在含有激活素A和Wnt配體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì) 胞，然后清除Wnt配體，再用激活素A和血清培養(yǎng)細(xì)胞；或d.在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，并用激活素A和Wnt 配體培養(yǎng)多能干細(xì)胞；或e.在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，然后在具有激活素A 和Wnt配體的含有血清的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，再在具有激活素A的含有血清的 第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞；或f.在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，然后在具有激活素A 和Wnt配體的含有血清的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，再在具有激活素A和Wnt配體的 含有不同濃度血清的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞；或g.在補(bǔ)充有B27并含有Wnt配體和激活素A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞；或h.在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，培養(yǎng)基補(bǔ)充有B27， 并含有激活素A。在一個實施例中，通過如下方法中的任何一種處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞，使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞特征性標(biāo)志物的細(xì)胞由表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞分化而成a.用成纖維細(xì)胞生長因子和刺猬蛋白信號通道抑制劑處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后清除含有成纖維細(xì)胞生長因子和刺猬蛋白信號通道抑制劑的培 養(yǎng)基，隨后在含有視黃酸、成纖維細(xì)胞生長因子和刺猬蛋白信號通道抑制劑的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)細(xì)胞；或b.用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞；或c.用視黃酸處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后清除視黃酸，隨 后用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理細(xì)胞。
在一個實施例中，通過如下方法中的任何一種處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞，使表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞由表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞分化而成a.在含有DAPT和exendin 4(腸促胰島素類似物)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺 內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后清除含有DAPT和exendiM的培養(yǎng)基，隨后在含有 exendin 1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞；或b.在含有exendin 4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞， 然后清除含有exendin4的培養(yǎng)基，隨后在含有exendin 1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細(xì)胞；或c.在含有DAPT和exendin 4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物 的細(xì)胞；或d.在含有exendin 4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞； 或e.用抑制Notch信號通道的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在一個實施例中，本發(fā)明提供了治療糖尿病患者的方法，該方法包括如下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞；b.使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞；c.使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征 性標(biāo)志物的細(xì)胞；d.使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化為β細(xì)胞譜系的細(xì)胞；以及e.將β細(xì)胞譜系的細(xì)胞移植到患者體內(nèi)。


圖1中，屏面a示出在用lOOng/ml激活素A進(jìn)行處理兩天、五天和八天后，定形內(nèi) 胚層標(biāo)志物〔乂0 4、641々4、!1順-3 0、1^111、5( -17在人胚胎干細(xì)胞系!19中的表達(dá)。定形內(nèi) 胚層標(biāo)志物的表達(dá)在mRNA水平上被分析，并歸一化到未處理的人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)水 平。屏面b示出在用lOOng/ml激活素A進(jìn)行處理三天和五天后，前內(nèi)胚層標(biāo)志物Cerberus、 Otx-I和Hex基因在人胚胎干細(xì)胞系H9中的表達(dá)。圖2示出在用lOOng/ml激活素A進(jìn)行處理五天后，定形內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干 細(xì)胞系H9中的表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)方法檢測定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。屏面(a)示 出Sox-17的表達(dá)。屏面(b)示出HNF-3 0的表達(dá)。屏面(c)示出0ct3/4的表達(dá)。圖3示出在執(zhí)行步進(jìn)式分化方案后，定形內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的 表達(dá)。定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)在mRNA水平上被分析，并歸一化到未處理的人胚胎干細(xì)胞 中的表達(dá)水平。屏面(a)示出GATA4的表達(dá)。屏面(b)示出Sox_17的表達(dá)。屏面(c)示 出HNF-3i3的表達(dá)。屏面(d)示出Mixll的表達(dá)。標(biāo)記為“AA”的數(shù)據(jù)點表示激活素A處 理時間為一天(Id)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。標(biāo)記為“UT”的數(shù)據(jù)點表示培養(yǎng)了 一天(Id)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的空白對照。圖4示出在執(zhí)行步進(jìn)式分化方案后，胚外內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中 的表達(dá)。胚外內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)在mRNA水平上被分析，并歸一化到未處理的人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)水平。屏面(a)示出lOOng/ml激活素A對AFP表達(dá)的影響。屏面(b)示出 100ng/ml激活素A對Sox7表達(dá)的影響。標(biāo)記為“AA”的數(shù)據(jù)點表示激活素A處理時間為一 天(Id)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)。標(biāo)記為“UT”的數(shù)據(jù)點表示培養(yǎng)了一天(Id)、 三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的空白對照。圖5示出在執(zhí)行步進(jìn)式分化方案后，中胚層和外胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9 中的表達(dá)。中胚層和外胚層標(biāo)志物的表達(dá)在mRNA水平上被分析，并歸一化到未處理的人胚 胎干細(xì)胞中的表達(dá)水平。屏面(a)示出lOOng/ml激活素A對Brachyury表達(dá)的影響。屏 面(b)示出lOOng/ml激活素A對Zicl表達(dá)的影響。標(biāo)記為“AA”的數(shù)據(jù)點表示激活素A 處理時間為一天(Id)、三天(3d)、五天(5d)或七 天(7d)。標(biāo)記為“UT”的數(shù)據(jù)點表示培養(yǎng) 了一天(Id)、三天(3d)、五天(5d)或七天(7d)的空白對照。圖6示出在用lOOng/ml激活素A處理一天、三天、五天和七天后，定形內(nèi)胚層標(biāo)志 物 Brachyury (屏面 a)、CXCR4(屏面 b)、Mixll (屏面 c)、Soxl7(屏面 d)、HNF-3 3 (屏面 e)、0ct4(屏面f)在人胚胎干細(xì)胞系H7中的表達(dá)。定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)在mRNA水平 被分析，并歸一化到未處理的人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)水平。圖7示出在應(yīng)用分化方案后，定形內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的表達(dá)。 通過免疫組織化學(xué)方法檢測定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。屏面(a)和屏面(b)示出Sox-17 的表達(dá)。屏面(c)和屏面(d)示出HNF-3 3的表達(dá)。屏面(e)和屏面(f)示出GATA4的表 達(dá)。屏面(b)、屏面(d)和屏面(f)示出采用DAPI進(jìn)行的細(xì)胞核復(fù)染法。標(biāo)記為“處理過” 的柱形圖表示激活素A(100ng/ml)處理時間為五天。標(biāo)記為“未處理”的柱形圖表示空白 對照。圖8示出在應(yīng)用第二種分化方案后，胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的 表達(dá)。胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)通過PCR分析，并歸一化到用激活素A處理的人胚胎干細(xì) 胞中的表達(dá)水平。屏面(a)示出Pdxl的表達(dá)。屏面(b)示出GLUT-2的表達(dá)。屏面(c)示 出PTFla的表達(dá)。圖9示出在應(yīng)用第二種分化方案后，胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的 表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)方法檢測胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。屏面(a)示出空白對照中 Pdxl的表達(dá)，而屏面(b)示出采用步進(jìn)式分化方案培養(yǎng)的細(xì)胞中Pdxl的表達(dá)。圖10示出在應(yīng)用第三種分化方案后，胰腺內(nèi)分泌標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中 的表達(dá)。胰腺內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)通過PCR分析，并歸一化到用激活素A處理的人胚胎干 細(xì)胞中的表達(dá)水平。屏面(a)示出NeuroDl的表達(dá)。屏面(b)示出Ngn3的表達(dá)。屏面(c) 示出胰島素的表達(dá)。屏面(d)示出Hes-1的表達(dá)，表達(dá)水平歸一化到胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的表 達(dá)水平。圖11示出在應(yīng)用分化方案后，胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的表達(dá)。 胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)通過PCR分析，并歸一化到用激活素A處理的人胚胎干細(xì)胞中的 表達(dá)水平。屏面(a)示出Nkx2. 2的表達(dá)。屏面(b)示出Pdxl的表達(dá)。圖12示出培養(yǎng)基中每一傳代(P0、P1和P2)細(xì)胞的PDX-1表達(dá)。PDX-1的表達(dá)通 過PCR分析，并歸一化到用激活素A處理的人胚胎干細(xì)胞H9中的表達(dá)水平。圖13示出在應(yīng)用第三種分化方案后，肝細(xì)胞標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的表 達(dá)。肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)通過PCR分析，并歸一化到用激活素A處理的人胚胎干細(xì)胞中的表達(dá)水平。屏面(a)示出AFP的表達(dá)。屏面(b)示出白蛋白的表達(dá)。圖14示出多能標(biāo)志物在人胚胎干細(xì)胞系H9中的表達(dá)。通過免疫組織化學(xué)方法分 析多能標(biāo)志物的表達(dá)。屏面(a)示出Oct-4的表達(dá)。屏面(b)示出堿性磷酸酶的表達(dá)。
圖15示出人胚胎細(xì)胞系H9的染色體核型。確定了小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上 培養(yǎng)的、傳代數(shù)為P36的細(xì)胞的染色體核型。圖16描繪本發(fā)明分化方案的概要，其中人胚胎干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層的體系中分化 成定形內(nèi)胚層。圖17描繪傳代數(shù)為44的人胚胎干細(xì)胞系H9的FACS圖，在濃度變化的MATRIGEL 上進(jìn)行培養(yǎng)，并采用低血清(0.5-2% )和高激活素A(100ng/ml)處理5天。定形內(nèi)胚層標(biāo) 志物CXCR4 (⑶184)的表達(dá)在Y軸上示出，胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物⑶9的表達(dá)在X軸上示出。圖18示出定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的實時PCR結(jié)果，標(biāo)志物來自于傳代數(shù)為44的人胚 胎干細(xì)胞系H9的培養(yǎng)物，培養(yǎng)體系分別是稀釋度為1 10的MATRIGEL(·)、稀釋度為 1 20的MATRIGEL ( ■)或稀釋度為1 30的MATRIGEL ( □)，采用實例14中公開的分 化方案進(jìn)行處理。誘導(dǎo)倍數(shù)是相對于傳代數(shù)為44的人胚胎干細(xì)胞系H9的未分化細(xì)胞的誘 導(dǎo)倍數(shù)，該細(xì)胞系在使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞調(diào)節(jié)過的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖19示出未分化多能干細(xì)胞和從分化多能干細(xì)胞獲得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的全基 因表達(dá)散點圖。所示數(shù)據(jù)來自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)的、傳代數(shù)為44的人胚胎干細(xì)胞 系H9的培養(yǎng)物(右屏面)和MATRIGEL上培養(yǎng)的、傳代數(shù)為83的人胚胎干細(xì)胞系H9的培 養(yǎng)物(左屏面)。圖20示出用實例4中公開的定形內(nèi)胚層分化方案進(jìn)行處理并在小鼠胚胎成纖維 細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)至第5天時人胚胎干細(xì)胞系Hl (屏面a)、人胚胎干細(xì)胞系H7 (屏面b)和 人胚胎干細(xì)胞系H9 (屏面c)中CXCR4的表達(dá)，通過FACS進(jìn)行測定。圖21示出小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞系H7 (屏面a)和人 胚胎干細(xì)胞系H9(屏面b)的培養(yǎng)物中，指定定形內(nèi)胚層標(biāo)志物表達(dá)的實時PCR結(jié)果。結(jié)果 以相對于未分化細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。圖22示出用實例4中公開的定形內(nèi)胚層分化方案處理并且在MATRIGELd 30 稀釋度)上培養(yǎng)至第5天時人胚胎干細(xì)胞系Hl (屏面a)、人胚胎干細(xì)胞系H7 (屏面b)和人 胚胎干細(xì)胞系H9 (屏面c)中CXCR4的表達(dá)，通過FACS進(jìn)行測定。圖23示出在人胚胎干細(xì)胞系H7 (屏面a)、人胚胎干細(xì)胞系H9 (屏面b)和人胚胎 干細(xì)胞系Hl (屏面c)的培養(yǎng)物中，指定定形內(nèi)胚層標(biāo)志物表達(dá)的實時PCR結(jié)果。結(jié)果以相 對于未分化細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。根據(jù)實例4中公開的方法處理細(xì)胞。圖24示出在存在100ng/ml激活素A (屏面a)或100ng/ml激活素A+20ng/ml的 Wnt-3a (屏面b)的情況下的培養(yǎng)基中、傳代數(shù)為46的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物的相差圖。 細(xì)胞處理五天。圖25示出在根據(jù)實例4中公開的方法進(jìn)行處理后，通過FACS測定的傳代數(shù)為44 的人胚胎干細(xì)胞系H7 (屏面a和屏面b)和傳代數(shù)為46的人胚胎干細(xì)胞系H9 (屏面c和屏 面d)培養(yǎng)物中CXCR4的表達(dá)。屏面b和屏面d示出20ng/ml的Wnt_3a對CXCR4表達(dá)的影 響。屏面a和屏面c示出在不存在Wnt-3a的情況下CXCR4的表達(dá)。在處理完成5天后獲
得結(jié)果。
圖26示出人胚胎干細(xì)胞系H7(屏面a)和H9(屏面b)培養(yǎng)物中指定基因的表 達(dá)的實時PCR數(shù)據(jù)。培養(yǎng)物用實例4中公開的分化方案處理。另外檢測了 Wnt激動劑 Wnt-3a(20ng/ml)、Wnt-5a(20ng/ml)和 Wnt_7a (20ng/ml)的作用，如屏面所示。細(xì)胞處理 5 天。結(jié)果以相對于未分化細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。圖27示出處理完成五天后，通過FACS測定的傳代數(shù)為46的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中CXCR4的表達(dá)。屏面(a)示出在不存在Wnt-3a的情況下CXCR4的表達(dá)。屏面(b) 示出在用10ng/ml的Wnt-3a處理后CXCR4的表達(dá)。屏面(c)示出在用20ng/ml的Wnt_3a 處理后CXCR4的表達(dá)，而屏面(d)示出在用50ng/ml的Wnt_3a處理后CXCR4的表達(dá)。圖28示出處理5天后，人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中指定定形標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié) 果示出為相對于未處理細(xì)胞表達(dá)水平的增加倍數(shù)，通過實時PCR測定。屏面(a)示出10、20 和50ng/ml的Wnt-3a對指定定形內(nèi)胚層標(biāo)志物基因表達(dá)的影響。屏面(b)示出在處理完成 兩天(2d)和 5 天(5d)后，1、5 或 10ng/ml 的 Wnt-3a(x 軸標(biāo)簽10、5、1)對 goosecoid ( ■) 和CXCR4( □)表達(dá)的影響。屏面(c)示出在兩天(□)或5天(■)后1、5或lOng/ml 的Wnt-3a對細(xì)胞數(shù)量的影響。圖29示出在用實例4中公開的分化方案處理5天后，通過FACS測定的人胚胎干 細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中CXCR4的表達(dá)。細(xì)胞在不存在Wnt-3a或GSK-3B抑制劑(屏面a)的情 況下培養(yǎng)、整個5天使用20ng/ml的Wnt_3a (屏面b)、整個5天使用IOOOnM的GSK-3B抑制 劑IX(屏面c)、整個5天使用500nM的GSK-3B抑制劑IX(屏面d)、整個5天使用IOOnM的 GSK-3B抑制劑IX(屏面e)、整個5天使用IOnM的GSK-3B抑制劑IX(屏面f)、第1-2天使 用IOOnM的GSK-3B抑制劑IX(屏面g)、第1-2天使用IOnM的GSK-3B抑制劑IX(屏面h)。圖30示出通過實時PCR測定的定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)。結(jié)果以相對于未 處理細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。屏面(a)示出得自傳代數(shù)為48的人胚胎干細(xì)胞系H9的數(shù)據(jù)， 根據(jù)實例4中公開的定形內(nèi)胚層方案進(jìn)行處理，包含在指定濃度和時間的條件下的Wnt-3a 或GSK-3B抑制劑。屏面(b)示出得自傳代數(shù)為46的人胚胎干細(xì)胞系H9的數(shù)據(jù)，根據(jù)實例 4中公開的定形內(nèi)胚層方案進(jìn)行處理，包含在指定濃度和時間的條件下的Wnt-3a或GSK-3B 抑制劑。圖31示出通過FACS測定的本發(fā)明所用胚胎干細(xì)胞系中CXCR4的表達(dá)。屏面(a_d) 示出得自傳代數(shù)為49的人胚胎干細(xì)胞系H9的數(shù)據(jù)。屏面(e-f)示出得自傳代數(shù)為46的 人胚胎干細(xì)胞系Hl的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)在處理完成5天后獲取。細(xì)胞處理條件如下屏面(a) 使用lOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt-3a;屏面(b)使 用lOOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt-3a ；屏面(c)使用 lOOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入IOOnM的GSK-3B抑制劑IX ；屏面(d)使 用lOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入IOOnM的GSK-3B抑制劑IX ；屏面(e) 使用lOOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt-3a ；以及屏面(f) 使用lOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt-3a。圖32示出通過實時PCR測定的傳代數(shù)為49的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中定形 內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)；細(xì)胞用10、50、或lOOng/ml激活素A加入20ng/ml的Wnt-3a處 理屏面(a) :AFP、Bry, CXCR4、GSC、HNF-3B 和 P0U5F(0ct_4)的表達(dá)；屏面(b) :S0X-17 禾口 GATA4的表達(dá)。結(jié)果表示為相對于未處理細(xì)胞的增加倍數(shù)。
圖33示出通過FACS測定的傳代數(shù)為53的胚胎干細(xì)胞系H9中CXCR4的表達(dá)。數(shù) 據(jù)在處理完成5天后獲取。細(xì)胞處理條件如下屏面(a)使用lOOng/ml激活素A處理整 個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt_3a，第3-5天加入25ng/ml的BMP-4 ；屏面(b)使 用lOOng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt-3a ；屏面(c)使用 100ng/ml激活素A處理整個五天，在最初兩天加入IOOnM的GSK-3B抑制劑IX ；屏面(d) 使用20ng/ml的Wnt_3a+25ng/ml的BMP-4處理整個五天；屏面(e)使用100ng/ml激活素 A處理整個五天，在最初兩天加入20ng/ml的Wnt_3a+100nM的GSK-3B抑制劑IX ；以及屏面 (f)使用lOOng/ml激活素A+25ng/ml的BMP-4處理整個五天。就所有屏面而言，X軸都表 示⑶9的表達(dá)，Y軸都表示CXCR4 (⑶184)的表達(dá)。圖34示出通過實時PCR測定的傳代數(shù)為46的人胚胎干細(xì)胞系Hl培養(yǎng)物中定形 內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)；細(xì)胞用10或lOOng/ml激活素A和20ng/ml的Wnt-3a或IOOnM 的 GSK-3B 抑制劑處理；屏面(a) :AFP、Bry、CXCR4、GSC*P0U5F(0ct-4)的表達(dá)；屏面(b) SOX-17、HNF-3B和GATA4的表達(dá)。結(jié)果以相對于未處理細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。
圖35示出通過實時PCR測定的傳代數(shù)為49的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中定形 內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)；細(xì)胞用50或lOOng/ml激活素A和10或IOOnM的GSK-3B抑制 劑處理；屏面(a) :AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B 和 P0U5F(0ct-4)的表達(dá)；屏面(b) =SOX-17 和GATA4的表達(dá)。結(jié)果以相對于未處理細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。圖36示出通過實時PCR測定的傳代數(shù)為53的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中定形 內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)；細(xì)胞用激活素A、Wnt-3a、GSK-3抑制劑和BMP-4的組合處理五 天；屏面(a) :AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B 和 S0X7 的表達(dá)；屏面(b) :S0X_17、HNF-3B 禾口 GATA4的表達(dá)。圖37示出通過FACS測定的、用實例22中所列條件處理的人胚胎干細(xì)胞系H9培 養(yǎng)物中CXCR4的表達(dá)百分比。圖38示出通過FACS測定的、纖粘蛋白(屏面a)或MATRIGEL (屏面b)上培養(yǎng)的 人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。圖39示出通過實時PCR測定的、纖粘蛋白(□)或稀釋度為1 10的生長因子 減少的MATRIGEL( ■)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。圖40示出在存在低血清、lOOng/ml激活素A和20ng/ml的Wnt-3a的情況下，多種 濃度的MATRIGEL如何影響人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層的分化。根據(jù)實例4中公開的方法 處理細(xì)胞。所示結(jié)果是通過實時PCR測定的指定基因的表達(dá)水平。圖41示出Wnt-3a在通過人胚胎干細(xì)胞形成定形內(nèi)胚層中的作用，人胚胎干細(xì)胞 在MATRIGEL上培養(yǎng)，但在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上分化。屏面(a_d)示出指定基因的實時 PCR數(shù)據(jù)。屏面(e-g)示出指定條件下的FACS數(shù)據(jù)。圖42示出在用Wnt抑制劑DKK-1處理后，在涂布有MATRIGEL 的組織培養(yǎng)基質(zhì)上 培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層。所示結(jié)果是通過實時PCR測定的H9細(xì)胞中指定 基因的表達(dá)，該細(xì)胞在存在20ng/ml的Wnt_3a和100ng/ml的DKKl (DE+DKK1)的情況下或 在不存在DKKl (DE)的情況下，根據(jù)實例4中公開的方法進(jìn)行處理。圖43示出人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的免疫熒光染色，該細(xì) 胞在涂布有MATRIGEL的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)，并且在沒有(屏面a)或具有(屏面b)20ng/ml的Wnt-3a的條件下，在加入lOOng/ml激活素A的低血清環(huán)境中分化。Ecad =上皮細(xì)胞鈣粘蛋白，NCAM =神經(jīng)性鈣粘蛋白。圖44示出傳代數(shù)為38的人胚胎干細(xì)胞系SA002分化成定形內(nèi)胚層。以指定條件 處理細(xì)胞五天后，通過實時PCR測定屏面中指定基因的表達(dá)。圖45示出在用100ng/ml激活素A (屏面a)、100ng/ml激活素A+20ng/ml的 Wnt-3a (屏面b)、或lOOng/ml激活素A+lOOnM的GSK-3B抑制劑IX(屏面c)進(jìn)行處理后， 通過FACS測定的傳代數(shù)為38的人胚胎干細(xì)胞系SA002中CXCR4的表達(dá)。細(xì)胞處理時間為五天。圖46示出傳代數(shù)為55的人胚胎干細(xì)胞系Hl在涂布有人血清的組織培養(yǎng)基質(zhì)上 分化成定形內(nèi)胚層。細(xì)胞用指定條件處理，通過實時PCR測定屏面中指定基因的表達(dá)。圖47示出在涂布有MATRIGEL 的組織培養(yǎng)基質(zhì)上的傳代數(shù)為54的人胚胎干細(xì) 胞系Hl培養(yǎng)物分化成定形內(nèi)胚層。按照五天DE方案檢測多種GSK-B抑制劑的作用。在最 初兩天的處理中，檢測濃度為IOOnM的下列GSK-3B抑制劑的作用GSK_3B VIII、IX、XI、和 XII。圖48示出傳代數(shù)為49的人胚胎干細(xì)胞系H9培養(yǎng)物中AFP(屏面a)、Pdx-I (屏 面b)、Cdx-2和Glut-2(屏面c)、以及HNF-3 0、HNF-6和生長抑素(屏面d)的表達(dá)，該 細(xì)胞根據(jù)實例4中公開的方法，在處理的最初兩天，在存在20ng/ml的Wnt-3a的情況 下進(jìn)行培養(yǎng)和處理。在該處理后，細(xì)胞用2%胎牛血清加入ImM視黃酸、0. 1至ImM的 TTNPB (4-[(E)-2-(5，6，7，8-四氫_5，5，8，8-四甲基-2-萘基)-1-丙烯基]苯甲酸芳維甲 酸)、或0. 1至IOmM的AM-580 (4_[ (5，6，7，8-四氫-5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基] 苯甲酸)處理額外的三天。下一步，細(xì)胞在2%胎牛血清加入20ng/ml的bFGF中處理額外 的三天。圖49示出人胚胎干細(xì)胞系Hl培養(yǎng)物中屏面a和屏面b中指定的定形內(nèi)胚層標(biāo)志 物表達(dá)的實時PCR結(jié)果，該細(xì)胞用激活素A和Wnt-I在指定時間和濃度條件下進(jìn)行處理。圖50示出將EXPRES01、BGOlV和Hl P50細(xì)胞系暴露于限定分化培養(yǎng)基中或低血 清分化培養(yǎng)基中在第4-5天時通過FACS測定的CXCR4和⑶9的表達(dá)。圖51顯示用低血清或限定培養(yǎng)基+激活素A+WNT3A處理的EXPRES01、BG01V和Hl 培養(yǎng)物在第4-5天時的實時PCR數(shù)據(jù)。圖52描繪用1 %的b27+DM-F12+激活素A+WNT3A+GSK03B抑制劑處理五天后， EXPRES 01 P49細(xì)胞分化成DE的免疫熒光圖。圖53示出暴露于不是低血清+激活素A就是限定培養(yǎng)基+激活素A的Hl細(xì)胞在 第1-5天的實時PCR數(shù)據(jù)。
具體實施例方式為使公開清楚明了、并且并非通過限制的方法，將本發(fā)明的具體實施方式
分為以 下幾個小節(jié)描述或圖解本發(fā)明的某些特征、實施例或應(yīng)用。^X干細(xì)胞是由它們在單細(xì)胞水平上自我更新和分化以產(chǎn)生后代細(xì)胞的能力定義的 未分化細(xì)胞，這些后代細(xì)胞包括自我更新的祖細(xì)胞、非更新的祖細(xì)胞以及終末分化的細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于它們能夠在體外分化成多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的多種 細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞，以及在移植后產(chǎn)生多種胚層組織，并在注射進(jìn)囊胚后形成基本上大 部分(如果不是全部)組織。干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為(1)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類 型；(2)多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類型；(3)多能，指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的亞群，但 在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生所有的細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞(HSC)可產(chǎn)生的后代 細(xì)胞包括HSC(自我更新)、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞以及作為血液正常組分的所有細(xì) 胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產(chǎn)生比多能干細(xì)胞更具限制性的細(xì)胞譜系亞 群；以及(5)單能，指能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(如生精干細(xì)胞)。分化是非特化(“未定型的”)或較少特化的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(例如為神經(jīng)細(xì)胞 或肌肉細(xì)胞)特征的過程。分化的或分化誘導(dǎo)的細(xì)胞是在細(xì)胞譜系內(nèi)占據(jù)更特化(“定型 的”)位置的細(xì)胞。當(dāng)用于分化過程時，術(shù)語“定型的”是指如下所述的細(xì)胞該細(xì)胞在分化 途徑中進(jìn)行到某個點，它在正常環(huán)境下會繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型的亞群， 并且在正常環(huán)境下不能分化成不同的細(xì)胞類型或者退回到少分化的細(xì)胞類型。去分化是指 細(xì)胞返回到細(xì)胞譜系中較少特化的(或定型的)位置的過程。如本文所用，細(xì)胞譜系定義 細(xì)胞的遺傳性，即源于何種細(xì)胞以及會產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞置于發(fā)育和分化的 遺傳圖內(nèi)。譜系特異性標(biāo)志物是指與關(guān)注的譜系細(xì)胞的表型特異性相關(guān)的特征，其可用于 評估未定型的細(xì)胞向關(guān)注的譜系的分化。如本文所用，“AFP”或“ a -甲胎蛋白”是指在肝臟發(fā)育開始時產(chǎn)生的抗原。AFP另 外可以在胚胎外細(xì)胞中表達(dá)?！鞍椎鞍住笔强扇苄詥误w蛋白，其構(gòu)成成人中所有血清蛋白的約一半。“日-細(xì)胞譜系”是指具有用于轉(zhuǎn)錄因子PDX-1和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種的陽 性基因表達(dá)的細(xì)胞NGN-3、Nkx2. 2、Nkx6. 1、NeuroD、Isl_l、HNF-3 3、MAFA、Pax4 和 Pax6。 表達(dá)0細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括0細(xì)胞。如本文所用，“Brachyury”是T-box基因家族成員。它是原條和中胚層細(xì)胞的標(biāo) 志物。如本文所用，“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中 的至少一種的細(xì)胞S0X-17、GATA-4、HNF-3 3、GSC、Cerl, Nodal, FGF8、Brachyury, Mix 樣 同源盒蛋白、FGF4、CD48、脫中胚蛋白(E0MES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C_Kit、CD99 或 0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì) 胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。“c-Kit”和“CD117”均指具有Genbank登錄號X06182中所公開的序列或其天然存 在的變體序列(如等位變體)的細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶。如本文所用，“⑶99”是指由登錄號為NM_002414的基因編碼的蛋白。如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中 的至少一種的細(xì)胞PDX-1、HNF-1 0、PTF-1 a、HNF-6或HB9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性 標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中 的至少一種的細(xì)胞NGN-3、NeuroD、Islet-1、PDX-1、NKX6. 1、Pax_4、Ngn_3 或 PTF-1 a。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞、胰腺激 素分泌細(xì)胞和細(xì)胞譜系的細(xì)胞。如本文所用，“Cerl”或“Cerebrus”是半胱氨酸結(jié)蛋白質(zhì)超家族的成員。如本文所用，“CXCR4”是指基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 (SDF-1)受體，也稱為“LESTR”或 “融合素”。在形成原腸胚的小鼠胚胎中，CXCR4在定形內(nèi)胚層和中胚層中表達(dá)，但不在胚外 內(nèi)胚層中表達(dá)。如本文所用，“定形內(nèi)胚層”是指下述細(xì)胞在原腸胚形成期間具有來源于上胚 層的細(xì)胞的特征，并形成胃腸道及其衍生物。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)志物HNF-3 3、 GATA-4、S0X-17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C_Kit、CD99 和 Mixll。如本文所用，“胚外內(nèi)胚層”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞群S0X-7、 AFP 禾口 SPARC。如本文所用，“reF-2”、“reF-4”、“reF-8”、“reF-10”和 “FGF-17” 是成纖維細(xì)胞生 長因子家族的成員?！癎ATA-4”和“GATA-6”是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。該轉(zhuǎn)錄因子家族由TGF-3 信號誘導(dǎo)，并有助于早期內(nèi)胚層標(biāo)志物的維護(hù)。如本文所用，“GLUT-2”是指葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子，其在許多胎兒組織和成人組織(包 括胰腺、肝臟、腸、腦和腎)中表達(dá)。如本文所用，“Goosecoid”或“GSC”是指在胚孔背唇中表達(dá)的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子。如本文所用，“HB9”是指同源盒基因9。"HNF-1 a ”、‘‘HNF_1 ^ ”、‘‘HNF_3 ^ ”和‘‘HNF-6”屬于轉(zhuǎn)錄因子的肝臟核因子家族，
其特征在于高度保守的DNA結(jié)合域和兩個短羧基端結(jié)構(gòu)域。如本文所用，‘‘Islet-1”或‘‘Isl-1”是轉(zhuǎn)錄因子的LIM/同源結(jié)構(gòu)域家族的成員， 并在發(fā)育中的胰腺中表達(dá)。如本文所用，“MafA”是在胰腺中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，并控制胰島素生物合成和分泌 中涉及的基因的表達(dá)。如本文所用，“標(biāo)志物”是在關(guān)注的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸分子或多肽分子。在上 下文中，差異表達(dá)意指對于陽性標(biāo)志物來說水平增加，對于陰性標(biāo)志物來說水平降低。與其 他細(xì)胞相比，在關(guān)注的細(xì)胞中核酸或多肽標(biāo)志物的可測水平充分地較高或較低，使得可使 用本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何一種辨別關(guān)注的細(xì)胞并將其與其他細(xì)胞區(qū)分開。如本文所用，“中內(nèi)胚層細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞⑶48、脫 中胚蛋白(E0MES)、S0X-17、DKK4、HNF-3 3、GSC、FGF17、GATA-6。如本文所用，“Mixll”是指同源盒基因，其為原條、中胚層和內(nèi)胚層中的細(xì)胞的標(biāo) 志物。如本文所用，“NeuroD”是神經(jīng)形成中牽涉的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子。如本文所用，“NGN-3”是堿性環(huán)-螺旋-環(huán)轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)元素家族的成員。如本文所用，“Nkx-2. 2”和“Nkx-6. 1 ”是Nkx轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。如本文所用，“Nodal”是TGF0蛋白質(zhì)超家族的成員。
“Oct-4”是P0U結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的成員，并被廣泛認(rèn)為是多能干細(xì)胞的標(biāo)志。 Oct-4與多能干細(xì)胞的關(guān)系由其對未分化的多能干細(xì)胞的嚴(yán)格局限的表達(dá)所指出。分化到 體細(xì)胞譜系時，Oct-4的表達(dá)很快消失。如本文所用，“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”是指能夠表達(dá)下列激素中 的至少一種的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰腺多肽。如本文所用，“胰腺激素分泌細(xì)胞”是指能夠分泌下列激素中的至少一種的細(xì)胞 胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰腺多肽。如本文所用，“Pax-4”和“Pax-6”是胰島發(fā)育中牽涉的胰腺b細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子。如本文所用，“PDX-1”是指胰腺發(fā)育中牽涉的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子。如本文所用，“前原條細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞Nodal或 FGF8如本文所用，“原條細(xì)胞”是指表達(dá)下列標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞BraChyUry、 Mix樣同源盒蛋白或FGF4。如本文所用，“PTF-1 a，，是指48kD的堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白質(zhì)，其為三聚胰腺 轉(zhuǎn)錄因子-l(PTFl)的序列特異性DNA結(jié)合亞基。如本文所用，“ SOX-1 ”、“ S0X-2 ”、“ S0X-7 ”和“ SOX-17 ”是S0X轉(zhuǎn)錄因子家族的成
員，并在胚胎形成中被牽涉。如本文所用，“SPARC”也稱為“富含半胱氨酸酸性分泌蛋白”?！癝SEA-1” (階段特異性胚胎抗原-1)是在鼠畸胎癌干細(xì)胞(EC)、鼠和人胚胎生殖 細(xì)胞(EG)和鼠胚胎干細(xì)胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原?！癝SEA-3” (階段特異性胚胎抗原_3)是在人畸胎癌干細(xì)胞(EC)、人胚胎生殖細(xì)胞 (EG)和人胚胎干細(xì)胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原?！癝SEA-4” (階段特異性胚胎抗原_4)是在人畸胎癌干細(xì)胞(EC)、人胚胎生殖細(xì)胞 (EG)和人胚胎干細(xì)胞(ES)的表面上存在的糖脂表面抗原。“TRA1-60”是在人畸胎癌干細(xì)胞(EC)、人胚胎生殖細(xì)胞(EG)和人胚胎干細(xì)胞(ES) 的表面上表達(dá)的硫酸角蛋白相關(guān)抗原?！癟RA1-81”是在人畸胎癌干細(xì)胞(EC)、人胚胎生殖細(xì)胞(EG)和人胚胎干細(xì)胞(ES) 的表面上表達(dá)的硫酸角蛋白相關(guān)抗原。“TRA2-49”是在人畸胎癌干細(xì)胞(EC)和人胚胎干細(xì)胞(ES)的表面上表達(dá)的堿性 磷酸酶同工酶。如本文所用，“UTF-1”是指在多能胚胎干細(xì)胞和胚胎外細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄輔激活 因子。如本文所用，“Zicl”是Zic轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。Zicl調(diào)控神經(jīng)基因和神經(jīng)嵴特 異性基因的表達(dá)，其在背神經(jīng)管和遷移前(premigratory)神經(jīng)嵴的細(xì)胞中表達(dá)。多能干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)多能干細(xì)胞的表征多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4中的一種或多種和可使 用稱為 Tra-1-60 和 Tra-1-81 (Thomson 等人，Science 282:1145,1998)的抗體檢測的
15標(biāo)志物。多能干細(xì)胞的體外分化導(dǎo)致SSEA-4、Tra-l-60和Tra-1-81(如果存在)的 缺失以及SSEA-1表達(dá)的增加。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，其可通 過用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞然后用Vector Red作為基質(zhì)進(jìn)行顯影來檢測，如制造商 (VectorLaboratories (Burlingame Calif.))所述。未分化的多能干細(xì)胞通常還表達(dá)0ct_4 和TER，如通過RT-PCR所檢測。增殖的多能干細(xì)胞的另一種可取表型是分化成以下所有三種胚層細(xì)胞的潛能內(nèi) 胚層、中胚層和外胚層?？赏ㄟ^(例如)以下方法來確認(rèn)多能干細(xì)胞的多能性將細(xì)胞注入 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的體內(nèi)，使用4%的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后用 組織學(xué)方法檢查來自三種胚層的細(xì)胞類型的證據(jù)?；蛘?，可以通過形成胚狀體并評估胚狀 體是否存在與三種胚層相關(guān)的標(biāo)志物來確定多能性。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的G顯帶技術(shù)對增殖的多能干細(xì)胞系進(jìn)行核型分析，并與公布的相 應(yīng)靈長類物種的核型進(jìn)行比較。希望獲得具有“正常核型”(指細(xì)胞是整倍體的)的細(xì)胞， 其中所有人染色體都存在并且無明顯的改變。多能干細(xì)胞的來源可以使用的多能干細(xì)胞的類型包括衍生自妊娠后形成的組織的已建立的多能細(xì) 胞系，這些組織包括在妊娠期任意時間采集的胚胎前期組織(例如為囊胚)、胚胎組織或胎 兒組織，所述時間通常(但不必須)在妊娠的前大約10-12周。非限制性實例為已建立的 人胚胎干細(xì)胞系或人胚胎生殖細(xì)胞系，例如為人胚胎干細(xì)胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外 還設(shè)想了本公開的組合在這種細(xì)胞的初步建立或穩(wěn)定期間的用途，在此情況下，源細(xì)胞可 以為直接取自源組織的原代多能細(xì)胞。取自在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下已經(jīng)培養(yǎng)的多能 干細(xì)胞群的細(xì)胞也是合適的。突變?nèi)伺咛ジ杉?xì)胞系也是合適的，例如為BG01v(BreSaGen， Athens, GA)。在一個實施例中，人胚胎干細(xì)胞如Thomson等人(美國專利No. 5，843，780 ； Science 282 1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 :133ff. ，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92 =7844,1995)所述進(jìn)行制備。多能干細(xì)胞的培養(yǎng)在一個實施例中，多能干細(xì)胞通常在以多種方式支持多能干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上 培養(yǎng)?；蛘?，多能干細(xì)胞在下述培養(yǎng)體系中培養(yǎng)其基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞，但仍支持多能干 細(xì)胞在不發(fā)生明顯分化的情況下增殖。使用此前培養(yǎng)了另一種細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，來支持 多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中不分化的生長?；蛘?，使用化學(xué)成分確知培養(yǎng)基來支持 多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中不分化的生長。在一個實施例中，使用由補(bǔ)充有B27的 培養(yǎng)基組成的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基支持多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中不分化的生長。例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)18 399-404(2000))和 Thompson 等人(Science 6 November 1998 :Vol.282.no. 5391, pp. 1145-1147 (《科學(xué)》，1998年11月6日，第282卷，第5391號，第1145-1147頁))公開 了使用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層培養(yǎng)來自人囊胚的多能干細(xì)胞系。Richards 等人(Stem Cells 21 :546_556，2003)評價了一組 11 種不同的人成體、 胎兒和新生兒飼養(yǎng)細(xì)胞層在支持人多能干細(xì)胞培養(yǎng)方面的能力。Richards等人指出“在 成人皮膚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞系可保持人胚胎干細(xì)胞形態(tài)并保留多能性”。US20020072117公開了可產(chǎn)生支持靈長類多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中生長 的培養(yǎng)基的細(xì)胞系。所用的細(xì)胞系為間充質(zhì)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系，它們得自胚胎組織或 者從胚胎干細(xì)胞分化而來。US20020072117還公開了所述細(xì)胞系作為原代飼養(yǎng)細(xì)胞層的用途。又如，Wang等人(Stem Cells 23 1221-1227，2005)公開了使人多能干細(xì)胞在衍 生自人胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上長期生長的方法。又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23 :306_314，2005)公開了衍生自人胚 胎干細(xì)胞自發(fā)分化的飼養(yǎng)細(xì)胞體系。在其它實例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22 =433-440,2004)公開了得自人胎 盤的飼養(yǎng)細(xì)胞來源。Amit等人(Biol. R印rod 68 :2150_2156，2003)公開了衍生自人包皮的飼養(yǎng)細(xì)胞層。又如，Inzunza等人(Stem Cells 23 =544-549,2005)公開了來自人出生后包皮成 纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層。US6642048公開了支持靈長類多能干細(xì)胞(pPS)在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中生長的培 養(yǎng)基，以及可用于產(chǎn)生此類培養(yǎng)基的細(xì)胞系。US6642048指出“本發(fā)明包括得自胚胎組織 或由胚胎干細(xì)胞分化而來的間充質(zhì)和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。本公開將描述和說明衍生此類 細(xì)胞系、處理培養(yǎng)基以及使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞的方法?！庇秩?，W02005014799公開了用于維持、增殖和分化哺乳動物細(xì)胞的條件培養(yǎng)基。 W02005014799指出“根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的培養(yǎng)基通過小鼠細(xì)胞的細(xì)胞分泌活性進(jìn)行調(diào)整， 特別是那些分化的和無限增殖化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞，稱為MMH(Me t小鼠肝細(xì)胞)。”又如，Xu等人(Stem Cells 22 =972-980,2004)公開了得自人胚胎干細(xì)胞衍生物 (經(jīng)過遺傳修飾以過表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)的條件培養(yǎng)基。又如，US20070010011公開了用于維持多能干細(xì)胞的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。一種替代性培養(yǎng)體系采用補(bǔ)充有能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的生長因子的無血清 培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioR印rodDOI 10. 1095/biolr印rod. 105. 046870,2005 年 10 月19日)公開了無飼養(yǎng)層、無血清的培養(yǎng)體系，其中胚胎干細(xì)胞在使用血清替代品(SR)的 非條件培養(yǎng)基(補(bǔ)充有能夠觸發(fā)胚胎干細(xì)胞自我更新的不同生長因子)中維持。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 =568-574,2006)公開了在無成纖維細(xì)胞 或條件培養(yǎng)基的情況下使用補(bǔ)充有bFGF的培養(yǎng)基長期培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法。又如，US20050148070公開了在無血清、無成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層的限定培養(yǎng)基中培養(yǎng) 人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵 蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物、至少一種胰島素或胰島素替代物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，所述培 養(yǎng)基基本上不含哺乳動物胎兒血清，并含有至少約lOOng/ml的能夠活化成纖維細(xì)胞生長 因子信號受體的成纖維細(xì)胞生長因子，其中所述生長因子并非僅來自成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層， 所述培養(yǎng)基支持在無飼養(yǎng)細(xì)胞或條件培養(yǎng)基的情況下干細(xì)胞在不分化的狀態(tài)下增殖。又如，US20050233446公開了可用于培養(yǎng)干細(xì)胞(包括未分化的靈長類原始干細(xì) 胞)的限定培養(yǎng)基。在溶液中，與被培養(yǎng)的干細(xì)胞相比，所述培養(yǎng)基基本上為等滲的。在給
17定的培養(yǎng)中，具體的培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和支持原始干細(xì)胞基本上不分化生長必需的一 定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸中的每一個。
又如，US6800480指出“在一個實施例中，提供了用于在基本上不分化的狀態(tài)下 培養(yǎng)靈長類來源的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含有效支持靈長類來源的原始干細(xì)胞生 長的低滲透壓、低內(nèi)毒素基礎(chǔ)培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基與營養(yǎng)血清和基質(zhì)相結(jié)合，所述營養(yǎng)血清 有效支持靈長類來源的原始干細(xì)胞的生長，所述基質(zhì)選自由飼養(yǎng)細(xì)胞和衍生自飼養(yǎng)細(xì)胞的 細(xì)胞外基質(zhì)成分組成的組。所述培養(yǎng)基還包含非必需氨基酸、抗氧化劑和選自由核苷和丙 酮酸鹽組成的組的第一生長因子?！庇秩?，US20050244962指出“在一個方面，本發(fā)明提供培養(yǎng)靈長類胚胎干細(xì)胞的 方法。一種方法在基本上不含哺乳動物胎兒血清(還優(yōu)選地基本上不含任何動物血清)、存 在成纖維細(xì)胞生長因子(并非僅來自成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層)的培養(yǎng)體系中培養(yǎng)干細(xì)胞。在一 個優(yōu)選的形式中，通過加入足夠的成纖維細(xì)胞生長因子，使得此前支持干細(xì)胞培養(yǎng)所需的 成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層不再是必需的?！痹谄渌鼘嵗校琖02005065354公開了限定、等滲培養(yǎng)基，其基本上不含飼養(yǎng)層和 血清，而含a.基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b. —定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的 bFGF ；c. 一定量的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的胰島素；以及d. —定量 的足以支持基本上未分化的哺乳動物干細(xì)胞生長的抗壞血酸。又如，W02005086845公開了維持未分化干細(xì)胞的方法，所述方法包括使干細(xì)胞暴 露于足量的以將細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF β)蛋白質(zhì)家族成員、成纖 維細(xì)胞生長因子(FGF)蛋白質(zhì)家族成員或煙酰胺(NIC)，并維持足夠的時間以實現(xiàn)所需的結(jié)果?？梢詫⒍嗄芨杉?xì)胞平鋪到合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個實施例中，合適的培養(yǎng)基 質(zhì)為細(xì)胞外基質(zhì)成分，例如為衍生自基底膜或可以形成粘附分子受體-配體偶聯(lián)之部分 的那些。在一個實施例中，所述合適的培養(yǎng)基質(zhì)為MATRIGEL (Becton Dickenson)。 MATRIGEL 是來自于Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細(xì)胞的可溶性制劑，其在室溫下會發(fā)生 膠化從而形成重組基底膜。其他細(xì)胞外基質(zhì)組分和組分混合物適于用作替代物。根據(jù)待增殖的細(xì)胞類型，這 可以包括層粘連蛋白、纖粘蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等等，它們可以單獨使用 或多種組合使用。在存在促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和保持所需特性的培養(yǎng)基的情況下，可以將多能干細(xì) 胞以合適的分布平鋪到基質(zhì)上。所有這些特征得益于密切注意接種分布，并可由本領(lǐng)域的 技術(shù)人員輕易地確定。合適的培養(yǎng)基可以由下列組分制成，例如為達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)， Gibco#11965-092 ；Knockout 達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(K0 DMEM)，Gibco#10829-018 ； Ham' s F12/50% DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mM的L-谷氨酰胺，Gibco#15039_027 ；非必需氨基 酸溶液，Gibco 11140-050 ； β -巰基乙醇，Sigma#M7522 ；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF)，Gibco#13256-029。多能干細(xì)胞向表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的分化適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞包括(例如)人胚胎干細(xì)胞系H9 (NIH代碼WA09)、人胚胎干細(xì)胞系HI (NIH代碼WA01)、人胚胎干細(xì)胞系H7(NIH代碼WA07)和人胚胎干細(xì)胞系 SA002(Cellartis, Sweden)。表達(dá)下列多能細(xì)胞特征性標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞也適用 明:ABCG2>cripto>CD9>FoxD3>Connexin43>Connexin45>0ct4>Sox2>Nanog>hTERT> UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自由下列組成的組S0X_17、GATA4、Hnf_3 3、 GSC、Cerl, Nodal, FGF8、Brachyury, Mix 樣同源盒蛋白、FGF4、CD48、脫中胚蛋白(E0MES)、 DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C_Kit、CD99和0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物中的 至少一種的細(xì)胞適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物 的細(xì)胞為原條前體細(xì)胞。在一個替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為中 內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì) 胞。胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自由下列組成的組Pdxl、HNF-10、PTFla、 HNF-6、HB9和PR0X1。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞適用于本發(fā) 明。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物選自由下列組成的組NGN_3、NeuroD、Islet-1、 Pdx-1、NKX6. l、Pax-4、Ngn-3和PTF-1 a。在一個實施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)下列 激素中的至少一種胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰腺多肽。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征 性標(biāo)志物中的至少一種的細(xì)胞適用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰腺激素表達(dá)細(xì)胞?；蛘撸?胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰腺激素分泌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)0細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。 表達(dá)0細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)Pdxl和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種NGN-3、 Nkx2.2、Nkx6. 1、NeuroD、Isl_l、HNF-3 3、MAFA、Pax4 和 Pax6。在本發(fā)明的一個方面，表達(dá) 3細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是0細(xì)胞。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可以通過本領(lǐng)域的任何方法或本發(fā)明中提出的任何方法，將多能干細(xì)胞分化成表 達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可以根據(jù)D，Amour等人在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)23， 1534-1541(2005)中公開的方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物 的細(xì)胞。例如，可以根據(jù)Shinozaki 等人在 Development 131，1651-1662 (2004)中公開的 方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可以根據(jù)McLean等人在Stem Cells 25，29-38(2007)中公開的方法，將多 能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可以根據(jù)D，Amour等人在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)24， 1392-1401(2006)中公開的方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物 的細(xì)胞。例如，可以通過以下方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志 物的細(xì)胞在不存在血清的情況下，在含激活素A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，然后將細(xì)胞與激活素A和血清一起培養(yǎng)，隨后將細(xì)胞與激活素A和不同濃度的血清一起培養(yǎng)。此方法 的一個實例在NatureBiotechnology(《自然生物技術(shù)》)23，1534-1541 (2005)中有所公開。例如，可以通過以下方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志 物的細(xì)胞在不存在血清的情況下，在含激活素A的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，然后將細(xì) 胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)。此方法的一個實例在D’ Amour等人的Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)，2005中有所公開。例如，可以通過以下方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志 物的細(xì)胞在不存在血清的情況下，在含激活素A和Wnt配體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞， 然后移除Wnt配體，再將細(xì)胞與激活素A和血清一起培養(yǎng)。此方法的一個實例在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)24，1392-1401 (2006)中有所公開。在本發(fā)明的一個方面，可以通過如下方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層 譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞將多能干細(xì)胞平鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上，然 后在含血清的第一培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)一段時間，然后 在含更高濃度血清的第二培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞與激活素A —起培養(yǎng)約另一段時間。上文公開的第一培養(yǎng)基中的血清濃度可以為約0至約0. 5%，培養(yǎng)時間可以從約 一天至約三天。上文公開的第二培養(yǎng)基中的血清濃度可以為約0.5%至約2%，培養(yǎng)時間可 以從約一天至約四天。在本發(fā)明的一個替代實施例中，可以通過如下方法，將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定 形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞將多能干細(xì)胞鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì) 上，然后在含血清的第一培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)約一段時 間，然后在含更高濃度血清的第二培養(yǎng)基中將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng) 另一段時間。上文公開的第一培養(yǎng)基中的血清濃度可以為約0至約0. 5%，培養(yǎng)時間可以從約 一天至約三天。上文公開的第二培養(yǎng)基中的血清濃度可以為約0.5%至約2%，培養(yǎng)時間可 以從約一天至約四天。在一個實施例中，本發(fā)明提供了分化表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的多能干 細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.將多能干細(xì)胞平鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上，以及b.將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)。將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)可以在單一培養(yǎng)基中進(jìn)行。單一培 養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基?；蛘撸瑔我慌囵B(yǎng)基可以是化學(xué)成分確知培養(yǎng)基，包括補(bǔ)充 有B27的培養(yǎng)基?；蛘?，將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)可以在不止一種培 養(yǎng)基中獨立地或一起進(jìn)行。在一個實施例中，將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培 養(yǎng)在兩種培養(yǎng)基中進(jìn)行。所述不止一種培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基。或者，所述不 止一種培養(yǎng)基可以是化學(xué)成分確知培養(yǎng)基，包括補(bǔ)充有B27的培養(yǎng)基。細(xì)胞外基質(zhì)在本發(fā)明的一個方面，多能干細(xì)胞在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)和 分化。細(xì)胞外基質(zhì)可以是從小鼠惡性毒瘤細(xì)胞提取的可溶性基質(zhì)膜制備物(其以商品名 MATRIGEL由BD Biosciences出售)。或者，細(xì)胞外基質(zhì)可以是生長因子減少的MATRIGEL。
20或者，細(xì)胞外基質(zhì)可以是纖粘蛋白。在替代實施例中，在用人血清涂布的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培 養(yǎng)和分化多能干細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)可以在涂布到組織培養(yǎng)基質(zhì)之前進(jìn)行稀釋。稀釋細(xì)胞外基質(zhì)以及 涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)的合適方法的實例可見于Kleinman，H. K. etal.，Biochemistry 25 312(1986)和 Hadley，M. A.等人.，J. Cell. Biol. 101 :1511(1985)。在一個實施例中，細(xì)胞外基質(zhì)為MATRIGEL。在一個實施例中，使用按1 10進(jìn)行稀 釋的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。在替代實施例中，使用按1 15進(jìn)行稀釋的MATRIGEL 涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。在替代實施例中，使用按1 30進(jìn)行稀釋的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng) 基質(zhì)。在替代實施例中，使用按1 60進(jìn)行稀釋的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。在一個實施例中，細(xì)胞外基質(zhì)為生長因子減少的MATRIGEL。在一個實施例中，使用 按1 10進(jìn)行稀釋的生長因子減少的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。在替代實施例中，使用 按1 15進(jìn)行稀釋的生長因子減少的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。在替代實施例中，使 用按1 30進(jìn)行稀釋的生長因子減少的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。在替代實施例中， 使用按1 60進(jìn)行稀釋的生長因子減少的MATRIGEL涂布組織培養(yǎng)基質(zhì)。使用單一培養(yǎng)基在細(xì)胞外基質(zhì)上將多能干細(xì)胞分化成表汰定形內(nèi)胚層譜系特征 件標(biāo)志物的細(xì)胞當(dāng)使用單一培養(yǎng)基時，其應(yīng)含有足夠低濃度的某些因子以允許多能干細(xì)胞分化 成定形內(nèi)胚層，這些因子例如為胰島素和IGF(如W02006020919中所公開)。這可以通過 降低血清濃度來實現(xiàn)，或作為另外一種選擇，可以通過使用無胰島素和IGF的化學(xué)成分確 知培養(yǎng)基來實現(xiàn)?；瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基的實例在Wiles等人(Exp Cell Res. 2/25/1999 ； 247(1) 241-8.)中有所公開。所述培養(yǎng)基可以具有在約0%至約10%范圍內(nèi)的血清濃度。在替代實施例中，該 濃度可以在約0 %至約5 %的范圍內(nèi)。在替代實施例中，該濃度可以在約0 %至約2 %的范 圍內(nèi)。在替代實施例中，該濃度可以為約2%。或者，培養(yǎng)基可以添加約0. 5%至約的B27。與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)的時間可以在約1天至約7天的范圍內(nèi)。在替代 實施例中，所述培養(yǎng)時間可以在約1天至約3天的范圍內(nèi)。在替代實施例中，所述培養(yǎng)時間 可以為約3天。激活素A可以任何適于引起多能干細(xì)胞分化的濃度使用。該濃度可以從約lpg/ml 至約lOOii g/ml。在替代實施例中，該濃度可以為約lpg/ml至約1 ii g/ml。在另一個替代 實施例中，該濃度可以為約lpg/ml至約lOOng/ml。在另一個替代實施例中，該濃度可以為 約50ng/ml至約lOOng/ml。在另一個替代實施例中，該濃度可以為約lOOng/ml?？蓛?yōu)化Wnt配體的選擇以提高分化過程的效率。Wnt配體可選自由下列組成的組 Wnt-l、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一個實施例中，Wnt配體為Wnt_l。在替代實施例中， Wnt 配體為 Wnt-3a。Wnt配體的濃度可以為約lng/ml至約lOOOng/ml。在替代實施例中，所述濃度可 以為約 10ng/ml 至約 100ng/ml。單一培養(yǎng)基也可以包含GSK-3B抑制劑。GSK-3B抑制劑可選自由下列組成的組 GSK-3B抑制劑IX和GSK-3B抑制劑XI。在一個實施例中，GSK-3B抑制劑為GSK-3B抑制劑IX。本人沒有看到IX和XI抑制劑的定義，本人在原來的WNT專利申請中確實有這些。當(dāng)使用GSK-3B抑制劑培養(yǎng)多能干細(xì)胞時，GSK-3B抑制劑的濃度可以從約InM至 約lOOOnM。在替代實施例中，使用濃度為約lOnM至約lOOnM的GSK-3B抑制劑培養(yǎng)多能干 細(xì)胞。單一培養(yǎng)基也可以包含至少一種其他額外的因子，其可以增強(qiáng)從多能干細(xì)胞形成 表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。或者，所述至少一種其他額外的因子可以增強(qiáng) 通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增殖。所述至少一種其 他額外的因子還可以增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì) 胞形成其他類型細(xì)胞的能力，或提高任何其他額外的分化步驟的效率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺，TGF-0家族的成員，包括 TGF-0 1、2和3，血清白蛋白，成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，血小板衍生生長因子-AA 和-BB，富血小板血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)，生長分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、 11)，胰高血糖素樣肽-I和II (GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2擬似體，Exendin_4，視黃酸，甲 狀旁腺素，胰島素，孕酮，抑酶肽，氫化可的松，膽胺，0巰基乙醇，表皮生長因子(EGF)，胃 泌素I和II，銅螯合劑(例如為三亞乙基五胺)，毛喉素，丁酸鈉，激活素，0細(xì)胞素，ITS， noggin，神經(jīng)突生長因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸鈉，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，鞘氨 醇1，VEGF，MG132 _，CA)，N2和B27添加劑(Gibco，CA)，甾體類生物堿(例如為環(huán)巴胺 (EMD，CA))，角化細(xì)胞生長因子(KGF)，Dickkopf蛋白質(zhì)家族，牛垂體提取物，胰島再生相關(guān) 蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶體抑制劑，notch通道抑制劑，音猬因子抑 制劑，或其組合。所述至少一種其他額外的因子可以由條件培養(yǎng)基提供，所述培養(yǎng)基得自胰腺細(xì) 胞系，例如為 PANC-1 (ATCC No :CRL_1469)、CAPAN-1 (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3 (ATCC No CRL-1687)、HPAF-II (ATCC No :CRL_1997)；肝細(xì)胞系，例如為 HepG2 (ATCC No :HTB_8065)； 腸細(xì)胞系，例如為His 74(ATCC No :CCL_241)，以及原代或轉(zhuǎn)化的內(nèi)皮細(xì)胞。#用兩種i吝養(yǎng)基在細(xì)朐,夕卜基J1!上將多能干細(xì)朐/zHt,成表達(dá).定形^iKHIi普系特征 性標(biāo)志物的細(xì)胞可以通過兩種培養(yǎng)基將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)來實現(xiàn)多能干 細(xì)胞向定形內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞分化。因此，可以按照如下方法完成多能干細(xì)胞的分化a.將多能干細(xì)胞平鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上，b.將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體在第一培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)，以及c.將多能干細(xì)胞與激活素A在第二培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)。第一培養(yǎng)基可以包含低濃度的血清，第二培養(yǎng)基可以包含比第一培養(yǎng)基濃度更高 的血清。第二培養(yǎng)基可以包含Wnt配體。第一培養(yǎng)基第一培養(yǎng)基應(yīng)含有足夠低濃度的某㈣因子以允許多能干細(xì)胞 分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，這些因子例如為胰島素和IGF(如 W02006020919中所公開)。這可以通過降低血清濃度來實現(xiàn)，或作為另外一種選擇，可以 通過使用無胰島素和IGF的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基來實現(xiàn)?；瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基的實例在 Wiles 等人(Exp Cell Res. 2/25/1999 ；247(1) :241_8.)中有所公開。
在第一培養(yǎng)基中，可存在比第二培養(yǎng)基中濃度更低的血清。增加第二培養(yǎng)基中的 血清濃度可增加細(xì)胞存活率，或作為另外一種選擇，可增強(qiáng)細(xì)胞的增殖。第一培養(yǎng)基的血清 濃度可以在約0%至約10%的范圍內(nèi)。或者，第一培養(yǎng)基的血清濃度可以在約0%至約2% 的范圍內(nèi)?；蛘?，第一培養(yǎng)基的血清濃度可以在約0%至約的范圍內(nèi)?；蛘?，第一培養(yǎng) 基的血清濃度可以為約0. 5%。當(dāng)使用至少兩種培養(yǎng)基將多能干細(xì)胞與激活素A和Wnt配體一起培養(yǎng)時，在第一 培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間可以在約1天至約3天的范圍內(nèi)。可使用適于引起多能干細(xì)胞分化的任何濃度的激活素A。該濃度可以從約lpg/ml 至約lOOii g/ml。在替代實施例中，該濃度可以為約lpg/ml至約1 ii g/ml。在另一個替代 實施例中，該濃度可以為約lpg/ml至約lOOng/ml。在另一個替代實施例中，該濃度可以為 約50ng/ml至約lOOng/ml。在另一個替代實施例中，該濃度可以為約lOOng/ml?？蓛?yōu)化Wnt配體的選擇以提高分化過程的效率。Wnt配體可選自由下列組成的組 Wnt-l、Wnt-3a、Wnt-5a和Wnt-7a。在一個實施例中，Wnt配體為Wnt_l。在替代實施例中， Wnt 配體為 Wnt-3a。Wnt配體的濃度可以為約lng/ml至約lOOOng/ml。在替代實施例中，該濃度可以 為約 10ng/ml 至約 100ng/ml。第一培養(yǎng)基也可以含有GSK-3B抑制劑?？蓪SK-3B抑制劑添加到第一培養(yǎng)基中， 添加到第二培養(yǎng)基中，或既添加到第一培養(yǎng)基中、又添加到第二培養(yǎng)基中。GSK-3B抑制劑可選自由下列組成的組GSK_3B抑制劑IX和GSK-3B抑制劑XI。在 一個實施例中，GSK-3B抑制劑為GSK-3B抑制劑IX。當(dāng)將多能干細(xì)胞與GSK-3B抑制劑一起培養(yǎng)時，GSK-3B抑制劑的濃度可以為從約 InM至約1000nM。在替代實施例中，將多能干細(xì)胞與約10nM至約100nM濃度的GSK-3B抑
制劑一起培養(yǎng)。第一培養(yǎng)基也可以含有至少一種其他額外的因子，其可增強(qiáng)從多能干細(xì)胞形成表 達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘?，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過 本發(fā)明方法形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增殖。另外，所述至少一種 其他額外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞 形成其他類型細(xì)胞的能力，或提高任何其他額外的分化步驟的效率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺，TGF-0家族的成員，包括 TGF-0 1、2和3，血清白蛋白，成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，血小板衍生生長因子-AA 和-BB，富血小板血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)，生長分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、 11)，胰高血糖素樣肽-I和II (GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2擬似體，Exendin_4，視黃酸，甲 狀旁腺素，胰島素，孕酮，抑酶肽，氫化可的松，膽胺，0巰基乙醇，表皮生長因子(EGF)，胃 泌素I和II，銅螯合劑(例如為三亞乙基五胺)，毛喉素，丁酸鈉，激活素，0細(xì)胞素，ITS， noggin，神經(jīng)突生長因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸鈉，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，鞘氨 醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加劑(Gibco，CA)，甾體類生物堿(例如為環(huán)巴胺 (EMD，CA))，角化細(xì)胞生長因子(KGF)，Dickkopf蛋白質(zhì)家族，牛垂體提取物，胰島再生相關(guān) 蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶體抑制劑，notch通道抑制劑，音猬因子抑 制劑，或其組合。
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所述至少一種其他額外的因子可以由條件培養(yǎng)基提供，所述培養(yǎng)基得自胰腺細(xì) 胞系，例如為 PANC-1 (ATCC No :CRL_1469)、CAPAN-1 (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3 (ATCC No CRL-1687)、HPAF-II (ATCC No :CRL_1997)；肝細(xì)胞系，例如為 HepG2 (ATCC No :HTB_8065)； 以及腸細(xì)胞系，例如為FHs 74 (ATCC No :CCL_241)。第二培養(yǎng)基第二培養(yǎng)基應(yīng)含有某些因子，例如為胰島素和IGF (如W02006020919 中所公開)，其濃度足以促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的存活。這可以通過增加血清濃度來實現(xiàn)，或作為另 外一種選擇，可以通過使用其中胰島素和IGF的濃度相對第一培養(yǎng)基有所增加的化學(xué)成分 確知培養(yǎng)基來實現(xiàn)?；瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基的實例在Wiles等人(Exp Cell Res. 2/25/1999 ； 247(1) 241-8.)中有所公開。在具有更高濃度血清的第二培養(yǎng)基中，第二培養(yǎng)基的血清濃度可以在約0. 5%至 約10%的范圍內(nèi)。或者，第二培養(yǎng)基的血清濃度可以在約0.5%至約5%的范圍內(nèi)?；蛘?， 第二培養(yǎng)基的血清濃度可以在約0.5%至約2%的范圍內(nèi)?；蛘撸诙囵B(yǎng)基的血清濃度可 以為約2%。當(dāng)將多能干細(xì)胞與第二培養(yǎng)基一起培養(yǎng)時，培養(yǎng)時間可以為約1天至約4天。與第一培養(yǎng)基類似，可使用適于引起多能干細(xì)胞分化的任何濃度的激活素A。該濃 度可以為約lpg/ml至約100ii g/ml。在替代實施例中，該濃度可以為約lpg/ml至約1 y g/ ml。在另一個替代實施例中，該濃度可以為約lpg/ml至約lOOng/ml。在另一個替代實施 例中，該濃度可以為約50ng/ml至約lOOng/ml。在另一個替代實施例中，該濃度可以為約 100ng/mloffnt配體的濃度可以為約lng/ml至約lOOOng/ml。在替代實施例中，所述濃度可 以為約 10ng/ml 至約 100ng/ml。ffnt配體可選自由下列組成的組Wnt_l、Wnt_3a、Wnt_5a和Wnt_7a。在一個實施 例中，Wnt配體為Wnt-1。在替代實施例中，Wnt配體為Wnt_3a。第二培養(yǎng)基也可以包含GSK-3B抑制劑。可將GSK-3B抑制劑添加到第一培養(yǎng)基中， 添加到第二培養(yǎng)基中，或既添加到第一培養(yǎng)基中、又添加到第二培養(yǎng)基中。GSK-3B抑制劑可選自由下列組成的組GSK_3B抑制劑IX和GSK-3B抑制劑XI。在 一個實施例中，GSK-3B抑制劑為GSK-3B抑制劑IX。當(dāng)將多能干細(xì)胞與GSK-3B抑制劑一起培養(yǎng)時，GSK-3B抑制劑的濃度可以為從約 InM至約1000nM。在替代實施例中，將多能干細(xì)胞與濃度為約10nM至約100nM的GSK-3B 抑制劑一起培養(yǎng)。與第一培養(yǎng)基類似，第二培養(yǎng)基也可以包含至少一種其他額外的因子，其可以增 強(qiáng)從多能干細(xì)胞形成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘撸鲋辽僖环N其他 額外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增 殖。另外，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)定形內(nèi)胚層譜 系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞形成其他類型細(xì)胞的能力，或提高任何其他額外的分化步驟的效 率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺，TGF-0家族的成員，包括 TGF-0 1、2和3，血清白蛋白，成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，血小板衍生生長因子-AA 和-BB，富血小板血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)，生長分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、 11)，胰高血糖素樣肽-I和II (GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2擬似體，Exendin_4，視黃酸，甲
24狀旁腺素，胰島素，孕酮，抑酶肽，氫化可的松，膽胺，0巰基乙醇，表皮生長因子(EGF)，胃 泌素I和II，銅螯合劑(例如為三亞乙基五胺)，毛喉素，丁酸鈉，激活素，0細(xì)胞素，ITS， noggin，神經(jīng)突生長因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸鈉，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，鞘氨 醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加劑(Gibco，CA)，甾體類生物堿(例如為環(huán)巴胺 (EMD，CA))，角化細(xì)胞生長因子(KGF)，Dickkopf蛋白質(zhì)家族，牛垂體提取物，胰島再生相關(guān) 蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶體抑制劑，notch通道抑制劑，音猬因子抑 制劑，或其組合。所述至少一種其他額外的因子可以由條件培養(yǎng)基提供，所述培養(yǎng)基得自胰腺細(xì) 胞系，例如為 PANC-1 (ATCC No :CRL_1469)、CAPAN-1 (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3(ATCC No CRL-1687)、HPAF-II (ATCC No :CRL_1997)；肝細(xì)胞系，例如為 IfepG2 (ATCC No :HTB_8065)； 和腸細(xì)胞系，例如為FHs 74(ATCC No :CCL_241)。表汰普細(xì)鍾示;泖丨表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可以通過在特定方案前后檢測 標(biāo)志物的存在情況來確定。多能干細(xì)胞通常不表達(dá)這些標(biāo)志物。因此，多能細(xì)胞的分化在 細(xì)胞開始表達(dá)這些標(biāo)志物時被檢測?？梢酝ㄟ^以下方法測定分化效率將處理過的細(xì)胞群暴露于特別地識別蛋白質(zhì)標(biāo) 志物的試劑(例如抗體)中，所述蛋白質(zhì)標(biāo)志物由表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì) 胞表達(dá)。評估培養(yǎng)或分離細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸標(biāo)志物表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。這些方 法包括定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Northern印跡、原位雜交(參見如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelet al. , eds. 2001 supplement)(《最新分子生 物學(xué)實驗方法匯編》，Ausubel等人編輯，2001補(bǔ)遺本))、免疫分析(例如切片材料的免疫 組化分析)Western印跡，以及對于完好細(xì)胞中可觸及的標(biāo)志物的流式細(xì)胞計量術(shù)(FACS) (參見如 Harlow and Lane, Using Antibodies :ALaboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998) (Harlow 禾口 Lane,《使用抗體實驗室手冊》，New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press,1998))?？捎糜跈z測某些蛋白質(zhì)標(biāo)志物的抗體的實例列于表IA中。應(yīng)該指出的是，涉及由 表IA所列抗體識別的相同標(biāo)志物的替代抗體是可用、或易于開發(fā)的。這種替代抗體也可用 于評估根據(jù)本發(fā)明分離的細(xì)胞中的標(biāo)志物的表達(dá)。例如，多能干細(xì)胞的特征是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且其他特征有待繼續(xù)辨 別。多能干細(xì)胞標(biāo)志物包括(例如)下列中的一種或多種的表達(dá)ABCG2、cripto、FoxD3、 Connexin43, Connexin45, 0ct4、 Sox2, Nanog, hTERT, UTF_1、 ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tral-60、Tral-81o在用本發(fā)明的方法處理多能干細(xì)胞后，可以通過以下方法純化分化的細(xì)胞將處 理過的細(xì)胞群暴露于特別地識別蛋白質(zhì)標(biāo)志物(例如CXCR4)的試劑(例如抗體)中，所述 蛋白質(zhì)標(biāo)志物由表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可以通過本領(lǐng)域的任何方法或本發(fā)明提出的任何方法，將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特 征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
例如，可以根據(jù)D，Amour等人在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)24， 1392-1401(2006)中公開的方法，將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá) 胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，還通過下述方法，將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá) 胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞用成纖維細(xì)胞生長因子和刺猬蛋白信號通道抑制 劑KAAD-環(huán)巴胺處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后移除含有成纖維細(xì) 胞生長因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，隨后將細(xì)胞在含有視黃酸、成纖維細(xì)胞生長因子和 KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。此方法的一個實例在Nature Biotechnology (《自然 生物技術(shù)》)24，1392-1401 (2006)中有所公開。在本發(fā)明的一個方面，還通過下述方法，將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的 細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生 長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞一段時間。這段時間可以為約一天至 約六天。在本發(fā)明的替代方面，還通過下述方法，將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的 細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞用視黃酸處理細(xì)胞一段時間。該段 時間可以為約一天至約三天。隨后移除視黃酸，并且用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理 細(xì)胞另一段時間。該段時間可以為約一天至約三天。在一個實施例中，本發(fā)明提供了將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化 成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以及b.用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞。任何表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞均適用于使用本方法分化成表達(dá) 胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？梢栽诨瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基中處理細(xì)胞，包括補(bǔ)充 有B27的培養(yǎng)基?；蛘?，可以在無血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞?；蛘?，可以在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng) 基中處理細(xì)胞。在一個實施例中，用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約一天至約六天。在一個實施例中，用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞 生長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約六天。所述至少一種成纖維細(xì)胞生長因子選自由FGF-2、FGF-4和FGF-10組成的組。任何表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞均適于使用本方法分化成表達(dá)胰 腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。可以在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中處理細(xì)胞，包括補(bǔ)充有 B27的培養(yǎng)基?；蛘?，可以在無血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞?；蛘?，可以在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基 中處理細(xì)胞。在替代實施例中，本發(fā)明提供了將表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化 成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，b.用視黃酸處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以及c.移除視黃酸，隨后用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理細(xì)胞。
任何表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞均適于使用本方法分化成表達(dá)胰 腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？梢栽诨瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基中處理細(xì)胞，包括補(bǔ)充有 B27的培養(yǎng)基?；蛘?，可以在無血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞?；蛘?，可以在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基 中處理細(xì)胞。在一個實施例中，用視黃酸處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約一天 至約三天。在一個實施例中，用視黃酸處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約三 天。在一個實施例中，用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞約一天至約三天。在一個實施例中，用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理表達(dá) 定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約三天。所述至少一種成纖維細(xì)胞生長因子選自由FGF-2、FGF-4和FGF-10組成的組。任何表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞均適于使用本方法分化成表達(dá)胰 腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？梢栽诨瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基中處理細(xì)胞，包括補(bǔ)充有 B27的培養(yǎng)基?；蛘撸梢栽跓o血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞?；蛘?，可以在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基 中處理細(xì)胞。在一個實施例中，用視黃酸處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘?， 用FGF-2或FGF-4或FGF-10處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在替代實施 例中，用下列因子中的至少一種處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞視黃酸、 FGF-2、FGF-4或FGF-10。在替代實施例中，用視黃酸和下列成纖維細(xì)胞生長因子中的至少 一種處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞FGF-2、FGF-4或FGF-10。在一個實施 例中，用視黃酸和FGF-2處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在另一個實施例 中，用視黃酸和FGF-4處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在另一個實施例中， 用視黃酸和FGF-10處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。視黃酸可以約InM至約ImM的濃度使用。在一個實施例中，視黃酸以1 P M的濃度 使用。FGF-2可以約50pg/ml至約50 y g/ml的濃度使用。在一個實施例中，F(xiàn)GF-2以 50ng/ml的濃度使用。FGF-4可以約50pg/ml至約50 ii g/ml的濃度使用。在一個實施例中，F(xiàn)GF-4以 50ng/ml的濃度使用。FGF-10可以約50pg/ml至約50 u g/ml的濃度使用。在一個實施例中，F(xiàn)GF-10以 50ng/ml的濃度使用。可用至少一種其他額外的因子處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，該 因子可增強(qiáng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成?；蛘?，所述至少一種其他額 外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增殖。 另外，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特 征性標(biāo)志物的細(xì)胞形成其他類型細(xì)胞的能力，或提高任何其他額外的分化步驟的效率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺，TGF-0家族的成員，包括 TGF-0 1、2和3，血清白蛋白，成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，血小板衍生生長因子-AA 和-BB，富血小板血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)，生長分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、 11)，胰高血糖素樣肽-I和II (GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2擬似體，Exendin-4，視黃酸，甲狀旁腺素，胰島素，孕酮，抑酶肽，氫化可的松，膽胺，0巰基乙醇，表皮生長因子(EGF)，胃 泌素I和II，銅螯合劑(例如為三亞乙基五胺)，毛喉素，丁酸鈉，激活素，0細(xì)胞素，ITS， noggin，神經(jīng)突生長因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸鈉，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，鞘氨 醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加劑(Gibco，CA)，甾體類生物堿(例如為環(huán)巴胺 (EMD，CA))，角化細(xì)胞生長因子(KGF)，Dickkopf蛋白質(zhì)家族，牛垂體提取物，胰島再生相關(guān) 蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶體抑制劑，notch通道抑制劑，音猬因子抑 制劑，或其組合。所述至少一種其他額外的因子可以由條件培養(yǎng)基提供，所述培養(yǎng)基得自胰腺細(xì) 胞系，例如為 PANC-1 (ATCC No :CRL_1469)、CAPAN-1 (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3(ATCC No CRL-1687)、HPAF-II (ATCC No :CRL_1997)；肝細(xì)胞系，例如為 IfepG2 (ATCC No :HTB_8065)； 和腸細(xì)胞系，例如為FHs 74(ATCC No :CCL_241)。表汰fl夷■陽普細(xì)鍾示;M勿_胞』白徹丨丨胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且其他的胰腺內(nèi)胚層 譜系特征性標(biāo)志物有待繼續(xù)辨別。這些標(biāo)志物可用于確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明處理的細(xì)胞已分化， 以獲得胰腺內(nèi)胚層譜系的特征性的性質(zhì)。胰腺內(nèi)胚層譜系特異性標(biāo)志物包括一種或多種轉(zhuǎn) 錄因子的表達(dá)，這些因子例如為Hlxb9、PTF-la、PDX-l、HNF-6、HNF-13?？梢酝ㄟ^將處理過的細(xì)胞群暴露于特別地識別蛋白質(zhì)標(biāo)志物(由表達(dá)胰腺內(nèi)胚 層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá))的試劑(例如抗體)來測定分化效率。評估培養(yǎng)或分離細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸標(biāo)志物表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。這些方 法包括定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Northern印跡、原位雜交(參見如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelet al. , eds. 2001 supplement)(《最新分子生 物學(xué)實驗方法匯編》，Ausubel等人編輯，2001補(bǔ)遺本))、免疫分析(例如切片材料的免疫 組化分析)Western印跡，以及對于完好細(xì)胞中可觸及的標(biāo)志物的流式細(xì)胞計量術(shù)(FACS) (參見如 Harlow and Lane, Using Antibodies :ALaboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998) (Harlow 禾口 Lane，〈〈使用抗體實驗室手冊》，New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press,1998))?？捎糜跈z測某些蛋白質(zhì)標(biāo)志物的抗體的實例列于表IA中。應(yīng)該指出的是，涉及由 表IA所列抗體識別的相同標(biāo)志物的替代抗體是可用、或易于開發(fā)的。這種替代抗體也可用 于評估根據(jù)本發(fā)明分離的細(xì)胞中的標(biāo)志物的表達(dá)。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可以通過本領(lǐng)域的任何方法或本發(fā)明公開的任何方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特 征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，根據(jù)D，Amour等人在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)24， 1392-1401(2006)中公開的方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá) 胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，還通過下述方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表 達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有DAPT和exendiM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表 達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后移除含有DAPT和exendin 4的培養(yǎng)基，隨 后在含有exendin 1、IGF-1和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。此方法的一個實例在Nature
28Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)24，1392-1401 (2006)中有所公開。例如，還通過下述方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表 達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有exendin 4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi) 胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后移除含有exendin 4的培養(yǎng)基，隨后在含有exendin 1、IGF-1和HGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。此方法的一個實例在D’ Amour等人的Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》，2006年)中有所公開。例如，還通過下述方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表 達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有DAPT和exendiM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表 達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。此方法的一個實例在D’ Amour等人的Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》，2006年)中有所公開。例如，還通過下述方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成 表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有exendin 4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá) 胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。此方法的一個實例在D’ Amour等人的Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》，2006年)中有所公開。在本發(fā)明的一個方面，還通過下述方法，將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的 細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞用抑制Notch信號通道的因子處理 表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。抑制Notch信號通道的因子可以是Notch細(xì)胞 外受體的拮抗劑?；蛘?，所述因子可抑制Notch受體的生物活性?；蛘?，所述因子可在細(xì)胞 內(nèi)抑制Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道中的元件或者是其拮抗劑。可以在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中處理 細(xì)胞，包括補(bǔ)充有B27的培養(yǎng)基。或者，可以在無血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞?；蛘撸稍谘a(bǔ)充 有血清的培養(yǎng)基中處理細(xì)胞。在一個實施例中，抑制Notch信號通道的因子是分泌酶抑制劑。在一個實施例 中，分泌酶抑制劑為1S芐基-4R-[1-(1S-氨基甲?；?2-苯乙基氨基甲?；?-lS-3-甲 基丁基氨基甲酰基]-5 2R羥基-5苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也稱為L-685，458。L-685，458可以約0. liiM至約100iiM的濃度使用。在一個實施例中，L-685, 458 以約90 ii M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約80 y M的濃度使用。在一個實施 例中，L-685，458以約70 y M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約60 y M的濃度 使用。在一個實施例中，L-685，458以約50 y M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458 以約40 ii M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約30 y M的濃度使用。在一個實 施例中，L-685, 458以約20 y M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約10 y M的濃 度使用。在一個實施例中，本發(fā)明提供了將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化 成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟a.培養(yǎng)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以及b.用抑制Notch信號通道的因子處理細(xì)胞。任何表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞均適于使用本方法分化成表達(dá)胰 腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？梢栽诨瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基中處理細(xì)胞，包括補(bǔ)充有 B27的培養(yǎng)基?；蛘撸梢栽跓o血清培養(yǎng)基中處理細(xì)胞。或者，可以在補(bǔ)充有血清的培養(yǎng)基 中處理細(xì)胞。
在一個實施例中，抑制Notch信號通道的因子是分泌酶抑制劑。在一個 實施例中，分泌酶抑制劑為1S-芐基-4R-[1-(1S-氨基甲?；?2-苯乙基氨基甲酰 基)-lS-3-甲基丁基氨基甲酰基]-2R-羥基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也稱為 L-685, 458。用抑制Notch信號通道的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約 一天至約五天?；蛘撸靡种芅otch信號通道的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志 物的細(xì)胞約三天至約五天。或者，用抑制Notch信號通道的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞約五天。在一個實施例中，抑制Notch信號通道的因子是分泌酶抑制劑。在一個 實施例中，分泌酶抑制劑為1S-芐基-4R-[1-(1S-氨基甲酰基-2-苯乙基氨基甲酰 基)-lS-3-甲基丁基氨基甲?；鵠-2R-羥基-5-苯基戊基]氨基甲酸叔丁酯，也稱為 L-685, 458。L-685，458可以約0. liiM至約100iiM的濃度使用。在一個實施例中，L-685, 458 以約90 ii M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約80 y M的濃度使用。在一個實施 例中，L-685，458以約70 y M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約60 y M的濃度 使用。在一個實施例中，L-685，458以約50 y M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458 以約40 ii M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約30 y M的濃度使用。在一個實 施例中，L-685, 458以約20 y M的濃度使用。在一個實施例中，L-685，458以約10 y M的濃 度使用?？捎弥辽僖环N其他額外的因子處理表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，該 因子可增強(qiáng)表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成?；蛘?，所述至少一種其他額 外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的增殖。 另外，所述至少一種其他額外的因子可增強(qiáng)通過本發(fā)明方法形成的表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特 征性標(biāo)志物的細(xì)胞形成其他類型細(xì)胞的能力，或提高任何其他額外的分化步驟的效率。所述至少一種額外的因子可以是(例如)煙酰胺，TGF-0家族的成員，包括 TGF-0 1、2和3，血清白蛋白，成纖維細(xì)胞生長因子家族的成員，血小板衍生生長因子-AA 和-BB，富血小板血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)，生長分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、 11)，胰高血糖素樣肽-I和II (GLP-I和II)，GLP-1和GLP-2擬似體，Exendin_4，視黃酸，甲 狀旁腺素，胰島素，孕酮，抑酶肽，氫化可的松，膽胺，0巰基乙醇，表皮生長因子(EGF)，胃 泌素I和II，銅螯合劑(例如為三亞乙基五胺)，毛喉素，丁酸鈉，激活素，0細(xì)胞素，ITS， noggin，神經(jīng)突生長因子，nodal，丙戊酸，曲古霉素A，丁酸鈉，肝細(xì)胞生長因子(HGF)，鞘氨 醇1，VEGF，MG132(EMD，CA)，N2和B27添加劑(Gibco，CA)，甾體類生物堿(例如為環(huán)巴胺 (EMD，CA))，角化細(xì)胞生長因子(KGF)，Dickkopf蛋白質(zhì)家族，牛垂體提取物，胰島再生相關(guān) 蛋白(INGAP)，印度刺猬因子，音猬因子，蛋白酶體抑制劑，notch通道抑制劑，音猬因子抑 制劑，或其組合。所述至少一種其他額外的因子可以由條件培養(yǎng)基提供，所述培養(yǎng)基得自胰腺細(xì) 胞系，例如為 PANC-1 (ATCC No :CRL_1469)、CAPAN-1 (ATCC No :HTB_79)、BxPC-3 (ATCC No CRL-1687)、HPAF-II (ATCC No :CRL_1997)；肝細(xì)胞系，例如為 HepG2 (ATCC No :HTB_8065)； 以及腸細(xì)胞系，例如為His 74(ATCC No:CCL-241)。
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表汰胰腺內(nèi)公泌譜系特征件標(biāo)志物的細(xì)胞的檢測胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且其他的胰腺內(nèi)分泌 譜系特征性標(biāo)志物有待繼續(xù)辨別。這些標(biāo)志物可用于確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明處理的細(xì)胞已分化， 以獲得胰腺內(nèi)分泌譜系的特征性的性質(zhì)。胰腺內(nèi)分泌譜系特異性標(biāo)志物包括一種或多種轉(zhuǎn) 錄因子的表達(dá)，這些因子例如為NGN-3、NeuroD、Islet_l。0細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且其他的0細(xì)胞譜系 特征性標(biāo)志物有待繼續(xù)辨別。這些標(biāo)志物可用于確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明處理的細(xì)胞已分化，以 獲得細(xì)胞譜系特征性的性質(zhì)。除了別的以外，0細(xì)胞譜系特異性特征包括一種或 多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些因子例如為Pdxl (胰腺和十二指腸同源盒基因-1)、Nkx2. 2、 Nkx6. 1、Isll、Pax6、Pax4、NeuroD、Hnflb、Hnf_6、Hnf-3 ^ 禾口 MafA。這些轉(zhuǎn)錄因子用于 鑒定內(nèi)分泌細(xì)胞在本領(lǐng)域中已被廣為接受。參見如Edlund(Nature ReviewsGenetics 3 524-632(2002))?？赏ㄟ^將處理過的細(xì)胞群暴露于特別地識別蛋白質(zhì)標(biāo)志物(由表達(dá)胰腺內(nèi)分泌 譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá))的試劑(例如抗體)來測定分化效率?；蛘撸梢酝ㄟ^將處 理過的細(xì)胞群暴露于特別地識別以下蛋白質(zhì)標(biāo)志物的試劑(例如抗體)來測定分化效率， 該標(biāo)志物由表達(dá)0細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)。評估培養(yǎng)或分離細(xì)胞中蛋白質(zhì)和核酸標(biāo)志物表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。這些方 法包括定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、Northern印跡、原位雜交(參見如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelet al. , eds. 2001 supplement)(《最新分子生 物學(xué)實驗方法匯編》，Ausubel等人編輯，2001補(bǔ)遺本))、免疫分析(例如切片材料的免疫 組化分析)^Western印跡，以及對于完好細(xì)胞中可觸及的標(biāo)志物的流式細(xì)胞計量術(shù)(FACS) (參見如 Harlow and Lane, Using Antibodies :ALaboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998) (Harlow 禾口 Lane，〈〈使用抗體實驗室手冊》，New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press,1998))?？捎糜跈z測某些蛋白質(zhì)標(biāo)志物的抗體的實例列于表IA中。應(yīng)該指出的是，涉及由 表IA所列抗體識別的相同標(biāo)志物的替代抗體是可用、或易于開發(fā)的。這種替代抗體也可用 于評估根據(jù)本發(fā)明分離的細(xì)胞中的標(biāo)志物的表達(dá)。i^X在一個方面，本發(fā)明提供了一種治療患有1型糖尿病或具有發(fā)生1型糖尿病風(fēng)險 的患者的方法。此方法涉及培養(yǎng)多能干細(xì)胞，在體外將多能干細(xì)胞分化成細(xì)胞譜系， 以及將細(xì)胞譜系的細(xì)胞植入患者體內(nèi)。在另一個方面，本發(fā)明提供了治療患有2型糖尿病或具有發(fā)生2型糖尿病風(fēng)險的 患者的方法。此方法涉及培養(yǎng)多能干細(xì)胞，在體外將多能干細(xì)胞分化成細(xì)胞譜系，以 及將細(xì)胞譜系的細(xì)胞植入患者體內(nèi)。在適當(dāng)時，還可使用促進(jìn)移植細(xì)胞存活和發(fā)揮功能的藥劑或生物活性劑治療患 者。除了別的以外，這些藥劑可以包括(例如)胰島素，TGF-0家族的成員(包括TGF-3 1、 2和3)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)，成纖維細(xì)胞生長因 子-1和-2，血小板衍生生長因子-AA和-BB，富血小板血漿，胰島素生長因子(IGF-I、II)， 生長分化因子(0^-5、-6、-7、-8、-10、-15)，血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子(VEGF)，多效生長
31因子，內(nèi)皮素。其他的藥物化合物可以包括(例如)煙酰胺、胰高血糖素樣肽-I(GLP-l)和 II、GLP-1和2擬似體、Exendin-4、視黃酸、甲狀旁腺激素、MAPK抑制劑，例如已公布的美國 專利申請2004/0209901和已公布的美國專利申請2004/0132729中所公開的化合物。在移植到受體中之前，可將多能干細(xì)胞分化成胰島素生成細(xì)胞。在一個具體實施 例中，在移植到受體中之前，將多能干細(xì)胞完全分化成細(xì)胞?；蛘撸梢晕捶只虿糠?分化的狀態(tài)將多能干細(xì)胞移植到受體中。進(jìn)一步的分化可在受體中發(fā)生。定形內(nèi)胚層細(xì)胞或者胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞或者b細(xì)胞可作為分散細(xì)胞或形成集落，通 過輸注到肝門靜脈中植入?；蛘?，可以在生物相容性可降解的聚合物支承體、多孔非降解的 器械中提供細(xì)胞，或者可以包封細(xì)胞以避免宿主免疫應(yīng)答?？蓪⒓?xì)胞植入受體的合適部位。 植入部位包括(例如)肝臟、天然胰腺、腎包膜下空間、網(wǎng)膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮 下袋。為了增強(qiáng)進(jìn)一步的分化，增強(qiáng)移植細(xì)胞的存活或活性，可在給予細(xì)胞之前、與之同 時或者之后給予其他因子，例如生長因子、抗氧化劑或抗炎劑。在某些實施例中，利用生長 因子使給予的細(xì)胞在體內(nèi)分化。這些因子可由內(nèi)源細(xì)胞分泌，并原位暴露于所給予的細(xì)胞。 可通過本領(lǐng)域已知的內(nèi)源性及外源性生長因子的任何組合來誘導(dǎo)移植細(xì)胞的分化。移植中所用的細(xì)胞數(shù)量取決于多種不同的因素(包括患者的癥狀以及對治療的 應(yīng)答)，并可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。在一個方面，本發(fā)明提供了治療患有糖尿病或具有發(fā)生糖尿病風(fēng)險的患者的方 法。本方法涉及培養(yǎng)多能干細(xì)胞，在體外將培養(yǎng)的細(xì)胞分化成細(xì)胞譜系，以及將細(xì)胞 并入三維支承體中。在植入患者體內(nèi)之前，可將細(xì)胞在體外維持在此支承體上?；蛘?，可將 含細(xì)胞的支承體直接植入患者體內(nèi)，而不進(jìn)行另外的體外培養(yǎng)。支承體可任選地含有至少 一種藥劑，該藥劑有助于移植細(xì)胞的存活及發(fā)揮功能。適用于本發(fā)明的支承體材料包括可用于組織修復(fù)的組織模板、導(dǎo)管、屏障和容 器。具體地講，已在體外和體內(nèi)用于重建或再生生物組織以及遞送趨化劑以誘導(dǎo)組織生 長的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、織物和非織造結(jié)構(gòu)形式的合成和天然材料適用于實施本發(fā) 明的方法。參見，例如美國專利5，770，417、美國專利6，022，743、美國專利5，567，612、 美國專利5，759，830、美國專利6，626，950、美國專利6，534，084、美國專利6，306,424、 美國專利6，365，149、美國專利6，599，323、美國專利6，656，488、已公布的美國專利申請 2004/0062753 A1、美國專利4，557，264和美國專利6，333，029中所公開的材料。為了形成含有藥劑的支承體，可在形成支承體前將藥劑與聚合物溶液混合?；蛘?， 可將藥劑涂布在經(jīng)加工的支承體上，優(yōu)選地在存在藥物載體的情況下進(jìn)行。藥劑可以液體、 細(xì)分固體或者任何其他合適的物理形式存在。或者，可將賦形劑添加到支承體上以改變藥 劑的釋放速率。在替代實施例中，支承體含有至少一種為抗炎化合物的藥物化合物，例如美 國專利6，509，369中所公開的化合物。支承體可含有至少一種為抗凋亡化合物的藥物化合物，例如美國專利6，793，945 中所公開的化合物。支承體可含有至少一種為纖維變性抑制劑的藥物化合物，例如美國專利 6，331，298中所公開的化合物。支承體可含有至少一種能夠增強(qiáng)血管生成的藥物化合物，例如已公布的美國專利
32申請2004/0220393和已公布的美國專利申請2004/0209901中所公開的化合物。支承體也可以含有至少一種為免疫抑制化合物的藥物化合物，例如已公布的美國 專利申請2004/0171623中所公開的化合物。除了別的以外，支承體也可以含有至少一種為生長因子的藥物化 合物，例如TGF-0家族的成員(包括TGF-0 1、2和3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纖維細(xì)胞生長因子-1和-2、血小板衍 生生長因子-AA和-BB、富血小板血漿、胰島素生長因子(IGF-I、II)、生長分化因子 0^ -5、-6、-8、-10、-15)、血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生生長因子(VEGF)、多效生長因子、內(nèi)皮素。其他 藥物化合物可包括(例如)煙酰胺、缺氧誘導(dǎo)因子1- a、胰高血糖素樣肽-I (GLP-1)、GLP-1 和2擬似體、和II、Exendin-4、n0dal、n0ggin、NGF、視黃酸、甲狀旁腺激素、肌腱蛋白C、原彈 性蛋白、凝血酶衍生肽、導(dǎo)管素/抗菌肽(Cathelicidin)、防御素、層粘連蛋白、含粘附細(xì)胞 外基質(zhì)蛋白的細(xì)胞結(jié)合域和肝素結(jié)合域的生物肽(例如纖粘蛋白和玻連蛋白)、MAPK抑制 劑(例如為已公布的美國專利申請2004/0209901和已公布的美國專利申請2004/0132729 中公開的化合物)。將本發(fā)明的細(xì)胞并入支架中可只需將細(xì)胞沉積在支架上即可。細(xì)胞可通過單純 擴(kuò)散進(jìn)入支架(J. Pediatr. Surg. 23(1 Pt 2) :3_9(1988))。已經(jīng)開發(fā)了若干其他方法來提 高細(xì)胞接種的效率。例如，已把轉(zhuǎn)瓶用于將軟骨細(xì)胞接種到聚乙醇酸支架上(Biotechnol. Prog. 14(2) 193-202 (1998))。另一種接種細(xì)胞的方法是使用離心作用，其對接種細(xì)胞產(chǎn) 生的應(yīng)力最小，并可提高接種效率。例如，Yang等人開發(fā)了一種細(xì)胞接種方法(J.Biomed. Mater. Res. 55(3) :379_86 (2001))，這種方法稱為離心細(xì)胞固定法(CCI)。本發(fā)明通過下述實例進(jìn)一步說明，但并不受其限制。SM實例1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系H1、H7 和 H9 得自 WiCell Research Institute, Inc.，(Madison, WI)并根據(jù)來源機(jī)構(gòu)提供的說明進(jìn)行培養(yǎng)。簡而言之，在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中，在小鼠胚胎成纖 維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基由補(bǔ)充有20%的Knockout血清替代品、lOOnM 的MEM非必需氨基酸、0. 5mM的0 -巰基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺和4ng/ml人堿性成纖維 細(xì)胞生長因子(bFGF)(全部得自 Invitrogen/GIBCO)的 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO)組 成。衍生自E13至13. 5小鼠胚胎的MEF細(xì)胞購自Charles River。MEF細(xì)胞在補(bǔ)充有10% 的FBS(Hyclone)、2mM谷氨酰胺和100mM的MEM非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中擴(kuò)增。用 10mg/ml絲裂霉素C(Sigma(St. Louis, M0))處理亞融匯態(tài)MEF細(xì)胞培養(yǎng)物3小時，以阻止 細(xì)胞分裂，然后用胰蛋白酶處理并以2X104/cm2的密度平鋪在用0. 牛明膠涂布的培養(yǎng) 皿上。將二至四傳代的MEF細(xì)胞用作飼養(yǎng)層。將鋪在MEF細(xì)胞飼養(yǎng)層上的人胚胎干細(xì)胞在 潤濕的組織培養(yǎng)箱(37°C，含5%的C02的大氣)中培養(yǎng)。當(dāng)融匯時(鋪板后大約5-7天)， 用lmg/ml膠原酶IV型(Invitrogen/GIBCO)處理人胚胎干細(xì)胞5-10分鐘，然后使用5ml 吸量管輕輕刮去表面。以900rpm的轉(zhuǎn)速將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)5分鐘，在新鮮培養(yǎng)基中將粒料重懸并 以1 3至1 4的細(xì)胞比率重新鋪板。實例2
定形內(nèi)胚層的形成檢測激活素A對定形內(nèi)胚層標(biāo)志物表達(dá)的影響。將激活素A(100ng/ml)加到在小 鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞群中。在存在激活素A的情況下連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞， 并在所示時間收獲細(xì)胞。通過PCR(圖1)、FACS(結(jié)果匯總于表II)以及免疫組織化學(xué)(圖 2)檢測定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)水平。激活素A 在 H9 細(xì)胞系中引起 CXCR4、GATA4、HNF-3 3、Mixll 和 Sox_17mRNA 表達(dá) 的時間依賴性增加(圖1，屏面a)。也觀察到前內(nèi)胚層標(biāo)志物Cerberus、Otx-1和Hex基 因的顯著上調(diào)(圖1，屏面b)。在用激活素A處理后，通過FACS分析觀察到了 CXCR4蛋白 的增加。在用激活素A處理后，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白和神經(jīng)性鈣粘蛋白的表達(dá)并未改變(表 IIA)。CXCR4陽性細(xì)胞也為C-kit、EPCAM、⑶99高度陽性，并為⑶9陰性。這些標(biāo)志物的表 達(dá)模式在所檢測的全部三種hES細(xì)胞系中一致(H7結(jié)果見表IIB，H1結(jié)果見表IIC)。對用 激活素A處理了五天的細(xì)胞進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析表明，在經(jīng)處理的培養(yǎng)中，30-40%的 細(xì)胞為Soxl7和HNF-3 0陽性。同時，幾乎100%的分化細(xì)胞仍為0ct4陽性(圖2)。隨著 多能性表面標(biāo)志物表達(dá)的降低，結(jié)合定形內(nèi)胚層標(biāo)志物表達(dá)的增加，這些數(shù)據(jù)表明激活素A 促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化。實例3胰腺內(nèi)胚層的形成將已知可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)胚層的生長因子加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。具 體地講，將已知可誘導(dǎo)胰腺內(nèi)胚層形成的激活素A、bFGF和視黃酸加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。在第一系列實驗中，將激活素A加入人胚胎干細(xì)胞群中，這些干細(xì)胞在補(bǔ)充有0 % 至2%血清和激活素A(100ng/ml)的DMEM/F12中，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)長達(dá)七 天。在圖3所示的時間點收獲細(xì)胞，并通過PCR分析所示基因的表達(dá)(圖3、圖4和圖5)。 在圖3中，PCR分析表明用激活素處理的細(xì)胞表達(dá)了廣譜的與內(nèi)胚層發(fā)育相關(guān)的基因，包括 GATA4 (圖 3，屏面 a)、Sox-17 (圖 3，屏面 b)、HNF-3 3 (圖 3，屏面 c)和 Mixl-1 (圖 3，屏面 d)。然而，未觀察到Pdxl基因的表達(dá)。在用激活素處理的H7細(xì)胞中觀察到了相同的內(nèi)胚 層譜系標(biāo)志物表達(dá)模式(圖6，屏面a至屏面f)。在此階段，0ct4的表達(dá)無明顯降低。激活素A引起了胚外內(nèi)胚層標(biāo)志物Sox7(圖4，屏面a)和AFP (圖4，屏面b)表達(dá) 的時間依賴性降低。激活素A降低了 Brachyury (圖5，屏面a)的表達(dá)，但對神經(jīng)元標(biāo)志物 Zicl (圖5，屏面b)的表達(dá)沒有影響。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，對應(yīng)于響應(yīng)激活素A處理而形成定形內(nèi)胚層，Sox-17、 Mixll、Gata4和HNF_3 ^的表達(dá)增加，連同前內(nèi)胚層標(biāo)志物0txl、Cerl和Hex基因上調(diào)。對 定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)分析表明，這些基因的蛋白質(zhì)表達(dá)也反映了 mRNA表達(dá) 中觀察到的趨勢。HNF-3 0、Sox-17和GATA4的表達(dá)水平在未處理的細(xì)胞中較低，大約占全 部細(xì)胞的10%至20%。而用激活素A(100ng/ml)處理五天，則將HNF-3 0、Sox_17和GATA4 的表達(dá)增加到占所有細(xì)胞的大約50%至90% (圖7)。在第二系列實驗中，根據(jù)實例1所述的方法，將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物在未分化的 培養(yǎng)條件下維持2-3天。在細(xì)胞融匯率達(dá)到70-80%后，將培養(yǎng)基變?yōu)樘砑恿?lOOng/ml激 活素A且含0至2%的FBS的DMEM/F12，并在激活素A存在下培養(yǎng)三天、五天或七天。在此 時間間隔后，用視黃酸和bFGF的組合進(jìn)一步處理細(xì)胞五至六天，如圖8所示。收獲培養(yǎng)物，并收集mRNA樣品用于分析。也包括由單獨地采用激活素A處理五天的細(xì)胞組成的對照培養(yǎng)物?；虮磉_(dá)分析表明，單獨的激活素A或視黃酸沒有誘導(dǎo)Pdx 1的表達(dá)。對于在激 活素A存在下用視黃酸與FGF聯(lián)合處理的細(xì)胞培養(yǎng)物，也觀察到類似結(jié)果(圖8，屏面a)。 然而，在不存在激活素A下用視黃酸和FGF處理細(xì)胞，則更進(jìn)一步增加了 Pdxl的表達(dá)(圖 8，屏面a)。用激活素A處理細(xì)胞三天，然后在不存在激活素A的情況下用1 y M視黃酸和 50ng/ml的bFGF(也稱為FGF-2)處理5天，結(jié)果顯示Pdx 1的表達(dá)水平大約為單獨地采用 激活素A處理5天的樣品中觀察到的表達(dá)水平高3500倍(圖8，屏面a)。免疫細(xì)胞化學(xué)分 析顯示，所有細(xì)胞中的5%至20%表達(dá)了 Pdxl (圖9)。在不存在激活素A的情況下用lyM視黃酸和bFGF處理也導(dǎo)致了 GLUT-2和 PTFla(圖8，屏面c)表達(dá)的增加，這在單獨存在激活素A的情況下處理的細(xì)胞中未觀察到。 在用ImM視黃酸和50ng/ml的bFGF處理的細(xì)胞中觀察到了最大的GLUT-2和PTFla表達(dá)增 加。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，在定形內(nèi)胚層形成之后，從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除激活素A進(jìn)一 步增強(qiáng)了胰腺內(nèi)胚層的形成。實例 4胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的形成根據(jù)實例1所述的方法，將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物在未分化的培養(yǎng)條件下維持3-4 天。在細(xì)胞融匯率達(dá)到50-60%后，將培養(yǎng)基變?yōu)楹琹OOng/ml激活素A無FBS的DMEM/F12， 然后在此培養(yǎng)基中將細(xì)胞培養(yǎng)一天。在此為期一天的培養(yǎng)后，移除培養(yǎng)基，換為含0. 5%的 FBS和lOOng/ml激活素A的培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞培養(yǎng)一天。在此第二個為期一天的培養(yǎng)后， 移除培養(yǎng)基，換為含2%的FBS和lOOng/ml激活素A的培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞培養(yǎng)一天。在此 時間間隔后，如實例2中概述，用視黃酸和FGF的組合處理細(xì)胞六天，然后移除培養(yǎng)基，換為 含2%的FBS和、-分泌酶抑制劑L-685，458 (10mM)的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)三天。收獲培 養(yǎng)物，并收集mRNA樣品用于分析。也包括由單獨地采用激活素A處理五天的細(xì)胞組成的對 照培養(yǎng)物?；虮磉_(dá)分析表明，單獨的激活素A或視黃酸與FGF的組合沒有誘導(dǎo)Ngn3或胰 島素的表達(dá)(圖10，屏面a、屏面c)。在用L-685，458處理后也觀察到了 Hes_l表達(dá)的降 低。處理后第三天觀察到了最大抑制(圖10，屏面d)。然而，用L-685，458處理細(xì)胞誘導(dǎo) 了 Ngn 3的表達(dá)，其水平大約比單獨用激活素A或者用視黃酸和FGF的組合處理的樣品中 觀察到的水平高50倍。在用分泌酶抑制劑處理的樣品中觀察到胰島素表達(dá)增加了 70 倍。L-685，458處理也進(jìn)一步增加了 NeuroDl的表達(dá)(圖10，屏面a)。綜上所述，這些數(shù)據(jù) 表明，在胰腺內(nèi)胚層形成后，從細(xì)胞培養(yǎng)物中移除視黃酸和FGF并加入Y -分泌酶抑制劑進(jìn) 一步增強(qiáng)了內(nèi)分泌細(xì)胞的形成。實例 5表達(dá)Nkx2. 2的胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的形成將根據(jù)實例2中所述的方法獲得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)行如下處理在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中將細(xì)胞培養(yǎng)3到5天，所述培養(yǎng)基包含DMEM/F12、2%的FBS、50ng/ml激活素A、50ng/ml 堿性FGF和1 y M視黃酸。在單獨地含ImM視黃酸或還含有bFGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中將細(xì)胞再 連續(xù)培養(yǎng)3到5天。在此過程的多個時間點從細(xì)胞中收獲RNA樣品，以幫助評價細(xì)胞的定向分化。此外，在整個分化方案中定期移除和補(bǔ)充培養(yǎng)基及因子。加入激活素A顯示，與無 激活素A的樣品相比，Nkx2. 2的表達(dá)增加了約35倍。在培養(yǎng)的前三天，對于用激活素A處 理的樣品，其Pdxl表達(dá)維持在類似于不含激活素A的樣品的水平上(圖11)。綜上所述，這 些數(shù)據(jù)表明，向視黃酸和bFGF處理的前三天添加激活素A進(jìn)一步增強(qiáng)了胰腺內(nèi)分泌標(biāo)志物 Nkx2. 2的表達(dá)。實例6培養(yǎng)中胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的傳代和擴(kuò)增本實例證明，本文衍生自人胚胎干細(xì)胞的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)中維持并 傳代，而不發(fā)生進(jìn)一步分化。胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞在存在lOOng/ml激活素A的情況下的低血 清DMEM/F12中分化。低血清DMEM/F12在第1天含0% (v/v)胎牛血清(FBS)，在第二天含 0.5% (v/v)的FBS，在之后的每天含2% (v/v)的FBS。分化四天后，在含有2% (v/v)的 FBS、lmM視黃酸和50ng/ml的bFGF的低血清DMEM/F12中將細(xì)胞再培養(yǎng)共六天。分化六天 后，將細(xì)胞在存在50ng/ml的FGF10的情況下含2% (v/v)的FBS的低血清DMEM/F12中共 維持6天。在這六天的培養(yǎng)期中，將胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞傳代兩次，在這6天培養(yǎng)中細(xì)胞群體倍 增時間為約36至48小時。在培養(yǎng)的第0天、第3天和第6天，使用Q-PCR測定表征胰腺內(nèi) 胚層的標(biāo)志物基因的表達(dá)。圖12示出在存在50ng/ml的FGF10的情況下，生長的細(xì)胞在其 衍生后的六天培養(yǎng)期內(nèi)維持了胰腺內(nèi)胚層標(biāo)志物Pdxl的表達(dá)。實例7由人胚胎干細(xì)胞衍牛肝細(xì)胞根據(jù)實例1中所述的方法，將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物在未分化的培養(yǎng)條件下維持 2-3天。在細(xì)胞融匯率達(dá)到70-80%后，將培養(yǎng)基變?yōu)楹?%的FBS和lOOng/ml激活素A的 DMEM/F12，在存在激活素A的情況下將細(xì)胞培養(yǎng)七天。用激活素A處理7天后，用圖13所 示的條件將細(xì)胞處理五天。之后，收獲細(xì)胞，并采集mRNA樣品用于分析。在不存在激活素A的情況下培養(yǎng)的細(xì)胞中，觀察到了 a-甲胎蛋白(AFP)和白蛋白 的表達(dá)增加(圖13，屏面a)。視黃酸和FGF-4使其進(jìn)一步增加(圖13，屏面b)。綜上所述， 這些數(shù)據(jù)表明，人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物在經(jīng)過上述處理后能夠表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)志物。此外，人 胚胎干細(xì)胞能夠分化成表達(dá)肝細(xì)胞特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。實例8H9人胚胎干細(xì)胞系的表征通過評價由未分化的ES細(xì)胞表達(dá)的幾種標(biāo)志物的表達(dá)來監(jiān)測H9細(xì)胞隨時間而變 化的品質(zhì)(Carpenter 等人，2001 ；Reubinoff 等人，2000 ;Thomson 等人，1998a)。H9 細(xì)胞 表現(xiàn)出階段特異性胚胎抗原的交互表達(dá)(表III)。H9細(xì)胞對SSEA-3、SSEA-4、Tra-1_60、 Tra-1-81、AP和⑶9抗原具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，所有這些抗原均為未分化的人胚胎干細(xì) 胞的特征性。通過RT-PCR評估了胚胎干細(xì)胞特征性基因的表達(dá)，例如0CT3/4、S0X-2、UTF-1、 REX-1、Cx43、Cx45、ABCG-2和TERT，從而確定本實例中生長的細(xì)胞看起來類似于此前所述 的未分化胚胎干細(xì)胞(表III)。通過免疫染色確定0CT3/4蛋白的表達(dá)和堿性磷酸酶的活 性(Chemicon)。大部分H9細(xì)胞為0CT3/4和AP陽性(圖14)。綜上所述，這些結(jié)果表明 本實例中所用的H9細(xì)胞在形態(tài)、抗原免疫染色或多能標(biāo)志物表達(dá)方面與其他實驗室的記
36錄相比并無明顯差異。實例9熒光激活細(xì)胞分詵(FACS)分析通過與TrypLE Express溶液(Invitrogen，CA) 一起培育五分鐘，將貼壁細(xì)胞從 培養(yǎng)板上移除。將釋放下來的細(xì)胞重懸于人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過離心作用回收，然后 洗滌并將細(xì)胞重懸于染色緩沖液中，該緩沖液由PBS(Sigma，M0)中的2%的BSA、0. 05%疊 氮化鈉組成。根據(jù)需要，使用0. 的球蛋白(Sigma)溶液封閉細(xì)胞的Fc受體15分鐘。 將等分試樣(大約105個細(xì)胞)要么與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的、要么與別藻藍(lán)素(APC)標(biāo)記的 單克隆抗體(5 u 1抗體/106個細(xì)胞)一起培育，如表I所指出的那樣，要么與未標(biāo)記的一抗 一起培育。對照包括相應(yīng)的同型匹配抗體、未染色的細(xì)胞以及僅用標(biāo)記的二抗染色的細(xì)胞。 所有與抗體一起進(jìn)行的培育均在4°C下進(jìn)行30分鐘，之后用染色緩沖液洗滌細(xì)胞。將用未 標(biāo)記的一抗染色的樣品與PE或APC標(biāo)記的二抗在4°C下再培育30分鐘。所用二抗的列表 參見表I。?；礈旌蟮募?xì)胞，并在染色緩沖液中重懸，使用FACSArray(BD Biosciences) 儀器鑒定細(xì)胞表面分子，采集至少10，000個事件。實例10免疫細(xì)胞化學(xué)用4%的多聚甲醛在室溫下將接種在用0. 的Matrigel(BD)涂布的平皿上的細(xì) 胞固定20分鐘。在室溫下用PBS/0. 的BSA/10%正常雞血清/0. 5%的Triton X-100 將固定細(xì)胞封閉1小時，然后在PBS/0. 的BSA/10%正常雞血清中與一抗在4°C下培育 過夜。一抗及其工作稀釋度的列表示于表IB中。在PBS/0. 的BSA中洗滌三次后，將在 PBS中以1 100稀釋的熒光二抗與細(xì)胞在室溫下培育一小時，使之結(jié)合。對照樣品包括 下列反應(yīng)省略一抗，或一抗被相同濃度的對應(yīng)匹配陰性對照免疫球蛋白替代。漂洗染色 后的樣品；向每一個樣品中加入一滴含二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的PROLONG (Invitrogen, CA)以復(fù)染細(xì)胞核并用作抗褪色劑。使用Nikon Confocal Eclipse C-1倒 置顯微鏡(Nikon，Japan)和10-60X物鏡采集圖像。實例11未分化細(xì)胞的PCR分析RNA提取、純化和cDNA合成。RNA樣品通過以下方法純化在存在含乙醇的高鹽緩 沖液的情況下結(jié)合到硅膠膜(Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA)，然后洗滌以移除雜質(zhì)。使用 TURBO DNA-free試劑盒(Ambion，INC)進(jìn)一步純化RNA，然后在水中洗提高質(zhì)量RNA。通過 分光光度計上的A260和A280讀數(shù)評估收率和純度。使用ABI (ABI, CA)大容量cDNA庫試 劑盒由純化的RNA制成cDNA拷貝。實時PCR擴(kuò)增和定量分析。除非另外指明，否則所有試劑均購自Applied Biosystems。使用ABI了900序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。使用TAQMAN UNIVERSAL PCR MASTER MIX (ABI, CA)和 20ng 反轉(zhuǎn)錄 RNA，使反應(yīng)總體積為 20ml。每 一個cDNA樣品以一式兩份運(yùn)行，以修正移液誤差。引物和FAM標(biāo)記的TAQMAN 探針以 200nM的濃度使用。使用此前由Applied Biosystem開發(fā)的人甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)內(nèi)源性對照對每一個目標(biāo)基因的表達(dá)水平進(jìn)行歸一化。引物和探針組列舉如下0ct3/4 (Hs00742896)、S0X-2 (Hs00602736)、UTF-1 (Hs00747497)、Rex-1 (Hs00399279)、 Connexin 43(Hs00748445)、 Connexin 45(Hs00271416)、ABCG2(Hs00184979)、 Tert (Hs 00162669)、HNF 3b (Hs00232764)、GATA-4 (Hs00171403)、Mixl 1 (Hs00430824)、 Sox7(Hs00846731)、AFP (Hs00173490)、Brachyury (Hs00610080)、GSC (Hs00418279_ml)、 Pdx-1 (Hs00426216)、PTFla (Hs00603586)、Ngn3 (Hs00360700)、NeuroDl (Hs00159598)、胰島 素(Hs00355773)和 Glu2 (Hs00165775)。使用 PRMERS 程序(ABI，CA)設(shè)計 Soxl7 引物，序 列如下，Soxl7 :TGGCGCAGCAGATACCA (序列標(biāo)識號 1)、AGCGCCTTCCACGACTTG (序列標(biāo)識號 2) 和CCAGCATCTTGCTCAACTCGGCG(序列標(biāo)識號3)。先在50°C下培育2分鐘，然后在95°C下培 育10分鐘，樣品按以下兩個階段循環(huán)40輪變性步驟，95°C下15秒；退火/延伸步驟，60°C 下1分鐘。使用GENEAMP 7000序列檢測系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對于每一組引物/探 針，Ct值確定為熒光強(qiáng)度達(dá)到擴(kuò)增指數(shù)區(qū)中間特定值時的循環(huán)數(shù)。使用比較性Ct法計算相 對基因表達(dá)水平。簡而言之，對于每一個cDNA樣品，從關(guān)注的基因的Ct值減去內(nèi)源對照的 Ct值，得到ACt值(DCt)。根據(jù)2_吣計算歸一化的目標(biāo)量，假定擴(kuò)增率為100%。最終的數(shù) 據(jù)相對于校準(zhǔn)樣品進(jìn)行表示。實例12核型分析通過標(biāo)準(zhǔn)G顯帶核型分析確定H9細(xì)胞的核型。評價總共100個中期染色體涂片 (Applied Genetics Laboratories，Inc.)。在分析的100個細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)染色體畸變。細(xì) 胞遺傳學(xué)分析表明，細(xì)胞具有正常數(shù)量的常染色體，染色體數(shù)為46。圖15示出得自人胚胎 干細(xì)胞系H9的典型核型。實例13&赫棚胞』夕卜縣咨縣砠卜皿_奸麵絲人胚胎干細(xì)胞系H1、H7 和 H9 得自 WiCell Research Institute, Inc.，(Madison, WI)，并根據(jù)來源機(jī)構(gòu)所提供的說明進(jìn)行培養(yǎng)。簡而言之，在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中，在小鼠胚胎 成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基由補(bǔ)充有20%的Knockout血清替代品、 lOOnM的MEM非必需氨基酸、0. 5mM的3巰基乙醇、2mM的L-谷氨酰胺以及4ng/ml人堿性成 纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的DMEM/F12(Invitrogen/GIBC0)組成。衍生自E13至13. 5小鼠 胚胎的MEF細(xì)胞購自Charles River。MEF細(xì)胞在補(bǔ)充有10%的FBS (Hyclone)、2mM谷氨酰 胺和lOOmM的MEM非必需氨基酸的DMEM培養(yǎng)基中擴(kuò)增。用10 y g/ml絲裂霉素C (Sigma (St. Louis,M0))處理亞融匯的MEF細(xì)胞培養(yǎng)物3小時，以阻止細(xì)胞分裂，然后用胰蛋白酶處理， 并以2X104/cm2的密度鋪在0. 牛明膠涂布的平皿上。使用二至四傳代的MEF細(xì)胞作為 飼養(yǎng)層。將鋪在MEF細(xì)胞飼養(yǎng)層上的人胚胎干細(xì)胞在潮濕的組織培養(yǎng)箱(37°C，含5 %的C02 的大氣)中培養(yǎng)。當(dāng)融匯時(鋪板后大約5至7天)，用lmg/ml膠原酶IV型(Invitrogen/ GIBC0)處理人胚胎干細(xì)胞5至10分鐘，然后用5ml玻璃吸量管輕輕刮下表面。將細(xì)胞以 900rpm的轉(zhuǎn)速離心處理5分鐘，重懸粒料，以1 3至1 4的細(xì)胞比率重新鋪在涂布有 生長因子減少的MATRIGEL (BD Biosciences) (1 30的稀釋液)的平板上。然后，在補(bǔ) 充有8ng/ml的bFGF的MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，并在MATRI GEL涂布的平板上用膠原 酶傳代至少五傳代。在MATRIGEL 上培養(yǎng)的細(xì)胞用膠原酶IV (Invitrogen/GIBCO)、分散酶 (BDBiosciences)或 Liberase 酶(Roche, IN)進(jìn)行常規(guī)地傳代。
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實例14在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化如此前在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)23，1534-1541 (2005 年 12 月)中所述進(jìn)行胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層的分化。簡而言之，將大約60至70%融匯率的 H9培養(yǎng)物暴露于補(bǔ)充有0. 5 %的FBS和lOOng/ml激活素A的DMEM :/F12培養(yǎng)基兩天，然 后用補(bǔ)充有2%的FBS和lOOng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。H9細(xì) 胞在用生長因子減少的MATRIGELd 30至1 10的稀釋液)涂布的平板上，或在常規(guī) MATRIGELd 30至1 10的稀釋液)上培養(yǎng)。將平板用MATRIGEL在室溫下涂布1小時。在第5天，通過FACS分析培養(yǎng)物的CXCR4、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、⑶9和神經(jīng)性鈣粘 蛋白表達(dá)，通過實時 PCR 分析 S0X-17、S0X-7、α -甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、Brychyury (Bry)、 gooscecoid(GSC)、HNF_3 β和GATA4。AFP和S0X-7被認(rèn)為是內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)志物，而GATA4、 HNF-3 β和S0X-17則代表定形內(nèi)胚層標(biāo)志物，GSC、Bry和CXCR4代表原條標(biāo)志物。圖17示出 FACS檢測的CXCR4表達(dá)。與較低濃度的MATRIGEL相比，對于在用1 10稀釋的MATRIGEL 涂布的平板上培養(yǎng)的細(xì)胞，其CXCR4表達(dá)存在明顯的增加。此外，與常規(guī)MATRIGEL相比，生 長因子減少的MATRIGEL在定形內(nèi)胚層細(xì)胞形成上并非那么有效。圖18示出實時PCR的結(jié)果，其證實了與1 30稀釋的MATRIGEL上培養(yǎng)的細(xì)胞相 比，在用1 10稀釋的MATRIGEL涂布的平板上培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的明
顯上調(diào)。實例15在形成定形內(nèi)胚層后胚胎干細(xì)胞中基因表汰改變的微陣列分析使用RNeasy微量提取試劑盒(Qiagen)從下列人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總RNA H9P83細(xì)胞在MATRIGEL涂布的平板上培養(yǎng)，并且暴露于補(bǔ)充有0. 5 %的FBS和100ng/ml 激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS和lOOng/ml激活素A(AA)的 DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天；H9P44細(xì)胞在MEF上培養(yǎng)，并且暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS和 100ng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2 %的FBS和lOOng/ml激活素 A的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。每一個組的對照包括鋪在MATRIGEL涂布的平皿上并在 MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞，或鋪在MEF上并在ES培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。根據(jù)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2. 0 Array 進(jìn)行樣品制備、雜交和圖 像分析。在歸一化和對數(shù)轉(zhuǎn)換后，使用Omni Viz 軟件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs，WA) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用Pearson相關(guān)系數(shù)比較每一個處理內(nèi)以及不同處理間的差異。在不同 處理之間基因表達(dá)譜的差異連同細(xì)胞系之間的相關(guān)系數(shù)在圖19中示出。使用方差分析和 F檢驗評價樣品之間基因表達(dá)的顯著性差異，其具有彡0. 05的調(diào)整后P值(Benjamini和 Hochberg校正)。分析中僅包括當(dāng)前調(diào)用的基因。表IV列出了多個樣品之間差異至少達(dá) 5倍的差異表達(dá)基因。列出了顯著表達(dá)的基因的歸一化強(qiáng)度值連同每一個基因的均值標(biāo)準(zhǔn) 差(SEM)。實例16在用MATRIGEIa涂布的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層的分 化如此前在Nature Biotechnology (《自然生物技術(shù)》)23，1534-1541 (2005 年 12月)中所述進(jìn)行胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層的分化。簡而言之，將接種于生長因子減少的 MATRIGEL (1 30的稀釋液)培養(yǎng)基上的H9、H7或Hl細(xì)胞在約60%至70%融匯率時暴 露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS和100ng/ml激活素A (R&D Systems,MN)的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天， 然后用補(bǔ)充有2%的FBS和lOOng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。在所 有后續(xù)的實例中，除非另外指明，否則此處理方案均稱為定形內(nèi)胚層(DE)方案。同時，將在 MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的H9、H7或Hl細(xì)胞也暴露于上述同一 DE方案。
在第5天，通過FACS分析培養(yǎng)物的CXCR4、上皮細(xì)胞鈣粘蛋白、⑶9、⑶99和神經(jīng) 性鈣粘蛋白(⑶56)的表達(dá)，通過實時PCR分析S0X-17、S0X-7、α-甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、 Brychyury (Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF_3 β 和 GATA4。AFP 和 S0X-7 被認(rèn)為是內(nèi)臟內(nèi)胚層 標(biāo)志物，而GATA4、HNF-3 β和S0X-17則代表定形內(nèi)胚層標(biāo)志物，GSC、Bry和CXCR4代表原 條標(biāo)志物。將H細(xì)胞系在小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)并暴露于DE方案，通過FACS發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)了 DE標(biāo)志物，并表達(dá)了 CXCR4(圖20)。在用DE方案處理后，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)存在顯著 的降低。最后，CXCR4+細(xì)胞群也為⑶117染色陽性。圖21示出相比于未處理的H7(圖21， 屏面a)和H9細(xì)胞(圖21，屏面b)，定形內(nèi)胚層標(biāo)志物顯著上調(diào)。不同于在MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的H細(xì)胞系，在MATRIGEL (1 30的稀釋液)上培養(yǎng) 并用定形內(nèi)胚層方案處理的H細(xì)胞系未表現(xiàn)出定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的穩(wěn)定表達(dá)。具體地講， 通過FACS和實時PCR分析發(fā)現(xiàn)，與在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在MATRIGEL 上培養(yǎng)的細(xì)胞的CXCR4表達(dá)明顯更低。定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)遵循一般的反應(yīng)模式，即 Hl大于H9大于H7(圖22和圖23)。與H7和H9細(xì)胞系相比，Hl細(xì)胞從圖22示出明顯的 CXCR4表達(dá)增加。應(yīng)注意在所有的情況中，與在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在 MATRIGEL (1 30的稀釋液)上培養(yǎng)的細(xì)胞的CXCR4表達(dá)較低。圖23(屏面a_c)示出實 時PCR結(jié)果，其顯示在H7(圖23，屏面a)和H9(圖23，屏面b)細(xì)胞系中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物 的上調(diào)存在適度的提高。然而，與H7和H9細(xì)胞系相比，Hl (圖23，屏面c)細(xì)胞系示出定形 內(nèi)胚層標(biāo)志物更穩(wěn)定的上調(diào)。實例17^HM(DE)
的分化-Wnt配體的作用將H7P44和H9P46胚胎干細(xì)胞在MATRIGEL (1 10的稀釋液)涂布的平皿上培 養(yǎng)，并暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS和100ng/ml激活素A(R&DSystems，麗)的DMEM/F12培養(yǎng) 基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS和lOOng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三 天。在一些培養(yǎng)中，在整個五天處理期內(nèi)補(bǔ)充有20ng/ml的Wnt-3a(目錄#1324-WN_002， R&DSystems, MN)、20ng/ml 的 Wnt_5a(目錄 #654-WN_010，R&D Systems, MN)、25ng/ml 的 ffnt-7a (目錄 #3008-WN-025，R&D Systems,MN)或 25ng/ml 的 Wnt_5b (目錄 #3006-WN_025， R&D Systems,MN)。圖24示出H9P46定形內(nèi)胚層培養(yǎng)物在高濃度(a) AA或(b) AA+20ng/ml 的Wnt-3a的情況下的相差圖。圖25示出對于在MATRIGEL (1 30的稀釋液)上培養(yǎng)并 暴露于DE方案+Wnt-3a(圖25，屏面b和屏面d)和_Wnt_3a(圖25，屏面a和屏面c)的 H7P44和H9P46細(xì)胞系在第5天通過FACS檢測的CXCR4表達(dá)。與用低血清加高濃度AA處 理的DE培養(yǎng)物相比，DE培養(yǎng)物中存在Wnt-3a導(dǎo)致了 CXCR4(⑶184)的穩(wěn)定表達(dá)。圖26示出用低血清+AA士Wnt配體處理的a)H7和b)H9培養(yǎng)物的實時PCR數(shù)據(jù)。對于兩H細(xì)胞系， 添加WNT-3a導(dǎo)致了定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的顯著上調(diào)。相比之下，Wnt5a、Wnt-5b和Wnt_7a對 定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)影響甚微。實例18
用MATRIGELa凃布的_織培養(yǎng)某質(zhì)卜.培養(yǎng)的人臺干細(xì)胞質(zhì)定形內(nèi)胚層的分 化Wnt-3a的有效劑量將H9P46胚胎干細(xì)胞在MATRIGEL (1 10的稀釋液)涂布的平皿上培養(yǎng)，并暴露 于補(bǔ)充有 0. 5% 的 FBS、100ng/ml 激活素 A(AA)和 10_50ng/ml 的 Wnt_3a(R&D Systems,MN) 的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS、100ng/ml激活素A(AA)和10-50ng/ml 的Wnt-3a的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。對照培養(yǎng)物不用Wnt-3a處理。圖27屏面示出 a)在不存在 Wnt-3a、b)含 10ng/ml 的 Wnt_3a、c)含 20ng/ml 的 Wnt_3a 和 d)含 50ng/ml 的 Wnt-3a的情況下在第5天通過FACS檢測的CXCR4表達(dá)。在不存在Wnt_3a的情況下，CXCR4 的表達(dá)非常低。相比之下，添加10-50ng/ml的Wnt-3a明顯增加了 CXCR4陽性細(xì)胞的數(shù)量。 此外，添加10ng/ml的Wnt-3a與添加50ng/ml的Wnt_3a —樣有效。實時PCR結(jié)果(圖28， 屏面a)也證實了這一發(fā)現(xiàn)。在一項單獨的研究中，將H9p52細(xì)胞平鋪在1 30低生長因子MATRIGEL 上。在 DE方案的最初兩天，使用了一系列的Wnt3A劑量10ng/ml、5ng/ml和lng/ml。圖28屏面b 示出處理5天后DE標(biāo)志物的PCR分析。實驗結(jié)束時的細(xì)胞數(shù)在圖28屏面c中示出。這表 明在使用高劑量Wnt-3a時細(xì)胞發(fā)生增殖。將Wnt3a處理延長到5天(5D)，通過PCR分析發(fā) 現(xiàn)其對DE標(biāo)志物幾乎沒有影響，并且未顯著增加細(xì)胞數(shù)(圖28，屏面C)。這些數(shù)據(jù)表明， 用lOng/ml的Wnt3a處理兩天即足以達(dá)到最優(yōu)的細(xì)胞擴(kuò)增和定形內(nèi)胚層分化。實例19^hM MATRIGEL12涂布的組iRi吝養(yǎng)基Jli上培養(yǎng)的人K胎干細(xì)朐,向定形(DE) 的分化-GSK-3B抑制劑的作用為了確認(rèn)Wnt-3a是通過Wnt通道發(fā)揮作用的，使用GSK-3抑制劑活化Wnt的下游 靶標(biāo)，例如β-連鎖蛋白。將H9P46-P48胚胎干細(xì)胞在MATRIGEL 涂布(1 10的稀釋液)的 平皿上培養(yǎng)，并暴露于補(bǔ)充有0. 5%的？85、100叫/1111激活素4仏4)和IO-IOOOnM的GSK-3B 抑制劑IX(目錄#361550，Calbiochem, CA)的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的 卩85、100叫/1111激活素六(八八)和 O-IOOOnM 的 GSK-3B 抑制劑 IX (目錄 #361550，Calbiochem, CA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。用低血清加高劑量激活素A士Wnt-3a處理對照培養(yǎng)物。 圖29，屏面a示出在以下情況下于第5天通過FACS檢測的CXCR4表達(dá)無Wnt_3a或GSK-3B 抑制劑；b)+20ng/ml 的 Wnt_3a ；c)+IOOOnM 的 GSK-3B 抑制劑 IX ；d)+500nM 的 GSK-3B 抑制 劑 IX ；e) +IOOnM 的 GSK-3B 抑制劑 IX ；f) +IOnM 的 GSK-3B 抑制劑 IX ；g) +IOOnM 的 GSK-3B 抑 制劑IX，第1-2天；以及h) +IOnM的GSK-3B抑制劑IX，第1-2天。在不存在Wnt_3a的情況下或存在IOnM的GSK-3B抑制劑時，CXCR4的表達(dá)極低。 相比之下，添加20ng/ml的Wnt_3a或IOO-IOOOnM的GSK-3B抑制劑明顯增加了 CXCR4陽性 細(xì)胞數(shù)。此外，在第1-2天添加IOOnM的GSK-3B抑制劑與整個五天都添加IOOnM的GSK-3B 抑制劑一樣有效。圖30示出(屏面a)H9P48細(xì)胞和(屏面b)H9P46細(xì)胞的定形內(nèi)胚層標(biāo) 志物基因表達(dá)。
圖16示出本發(fā)明中分化方案的概要，其中在無飼養(yǎng)層體系中將胚胎干細(xì)胞分化 成定形內(nèi)胚層。實例20 在用MATRIGEI"凃布培養(yǎng)某質(zhì)卜.培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞,向定形內(nèi)胚層(DE) 的分化-在存在GSK-3B抑制劑或ffnt-3A的情況下激活素A的有效劑量將H9P49和H1P46胚胎干細(xì)胞在MATRIGEL 涂布(1 10的稀釋液)的平皿上 培養(yǎng)，并暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)和IOOnM的GSK-3B抑制劑 IX (目錄 #361550，Calbiochem，CA)或 20ng/ml 的 Wnt_3a 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基兩天，然后用 補(bǔ)充有2%的FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。用低血清加 100ng/ml激活素A處理對照培養(yǎng)物。圖31示出在以下處理情況下于第5天通過FACS檢 測的H9P49和H1P46的CXCR4表達(dá)a)在整個五天士 lOng/ml激活素A，以及在最初兩天使 用20ng/ml的Wnt-3a ；b)在整個五天士 lOOng/ml激活素A，以及在最初兩天使用20ng/ml 的Wnt-3a ；c)在整個五天士 lOOng/ml激活素A，以及在最初兩天使用IOOnM的GSK-3B抑 制劑IX ；d)在整個五天士 lOng/ml激活素A，以及在最初兩天使用IOOnM的GSK-3B抑制劑 IX ；e)在整個五天士 lOOng/ml激活素A，以及在最初兩天使用20ng/ml的Wnt-3a ；f)在整 個五天士 lOng/ml激活素A，以及在最初兩天使用20ng/ml的Wnt-3a。圖31的屏面a_d針 對H9P49細(xì)胞，而屏面e-f則針對H1P46細(xì)胞。圖32示出用10、50或100ng/ml激活素A加 20ng/ml的Wnt-3a處理的H9P49培養(yǎng)物的定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)屏面a :AFP、Bry、 CXCR4、GSC、HNF-3B和P0U5F(0ct_4)的表達(dá)；以及屏面b =SOX-17和GATA4的表達(dá)。這并非 合計，可能有附圖數(shù)字問題或為剪切和粘貼問題?？磥砜赏ㄟ^使用50ng/ml的AA+20ng/ml 的Wnt-3a或IOOnM的GSK-3B抑制劑IX獲得定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的穩(wěn)定表達(dá)。較低劑量的 激活素A導(dǎo)致了胚外內(nèi)胚層的形成。實例21^hM MATRIGEL12涂布的組iRi吝養(yǎng)基Jli上培養(yǎng)的人K胎干細(xì)朐,向定形(DE) 的分化-Wnt-3a和GSK-3B抑制劑的組合將H9P53胚胎干細(xì)胞在MATRIGEL 涂布(1 30的稀釋液)的平皿上培養(yǎng)，并 暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBSUOOng/ml激活素A(AA)和IOOnM的GSK-3B抑制劑IX(目錄 #361550，Calbiochem，CA) 士 20ng/ml 的 Wnt_3a 的 DMEM/F12 培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有 2% 的FBS、10-100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。同時，用25ng/ml的 BMP-4 (目錄 #314-BP-010，R&D Systems, MN) 士20ng/ml 的 Wnt_3a± 100ng/ml 激活素 A 處 理H9P53培養(yǎng)物。用低血清加lOOng/ml激活素A處理對照培養(yǎng)物。圖33示出在以下處理 情況下于第五天通過FACS檢測的CXCR4表達(dá)a)在整個五天使用lOOng/ml激活素A，在最 初兩天使用20ng/ml的Wnt-3a，以及在第3-5天使用25ng/ml的BMP-4 ；b)在整個五天使 用lOOng/ml激活素A，以及在最初兩天使用20ng/ml的Wnt-3a ；c)在整個五天使用IOOng/ ml激活素A，以及在最初兩天使用IOOnM的GSK-3B抑制劑IX ；d)在整個五天使用20ng/ ml的Wnt-3a+25ng/ml的BMP-4 ；e)在整個五天使用lOOng/ml激活素A，以及在最初兩天 使用20ng/ml的Wnt-3a+100nM的GSK-3B抑制劑IX ；f)在整個五天使用lOOng/ml激活素 A+25ng/ml的BMP-4。圖34示出，對于用10或100ng/ml激活素A加20ng/ml的Wnt_3a或 IOOnM的GSK-3B抑制劑處理的人胚胎干細(xì)胞系Hl的培養(yǎng)物在第46傳代時，通過實時PCR測定的定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)屏面(a) :AFP、Bry、CXCR4、GS(^nP0U5F(0c t_4)的 表達(dá)；屏面(b) :S0X-17、HNF-3B和GATA4。結(jié)果以相對于未處理的細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。圖 35示出，對于用50或lOOng/ml激活素A加10或IOOnM的GSK-3B抑制劑處理的人胚胎干細(xì) 胞系H9在第49傳代時，通過實時PCR測定的定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)屏面(a) =AFP, Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B 和 P0U5F(0ct-4)的表達(dá)；屏面(b) :S0X_17 禾Π GATA4。結(jié)果以相對 于未處理的細(xì)胞的增加倍數(shù)表示。圖36示出用激活素A、Wnt-3a、GSK-3抑制劑和BMP-4的 組合處理的H9P53培養(yǎng)物的定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)a)AFP、Bry、CXCR4、GSC、HNF-3B 和S0X7的表達(dá)；b) SOX-17, HNF-3B和GATA4。將BMP-4加入DE方案似乎誘導(dǎo)了中胚層標(biāo) 志物BRY的形成，在存在激活素A的情況下，與添加每一種試劑本身相比，Wnt-3A和GSK-4B 抑制劑的組合不導(dǎo)致定形內(nèi)胚層標(biāo)志物顯著上調(diào)。實例22
在MEF卜.培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞,向定形內(nèi)胚層(DE)的分^氏血清中Wnt-3a、激活 素 A、Wnt-5a、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、IL~4 和 SDF-1 的組合將H9P44細(xì)胞平鋪在此前經(jīng)絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)涂布的 6孔板上。在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中讓細(xì)胞生長到70%至80%的融匯率，該培養(yǎng)基由補(bǔ)充有 20%的Knockout血清替代品、IOOnM的MEM非必需氨基酸、0. 5mM的β -巰基乙醇、2mM的 L-谷氨酰胺(均得自Invitrogen/GIBCO)和8ng/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) (R&DSystems)的 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO)組成。對于DE的形成，除了下面詳述的其他生長因子外，還在存在或不存在激活素 A(100ng/ml)的情況下處理細(xì)胞。如下述方案所示，將生長因子加到濃度遞增的FBS中第0 天DMEM/F12 中 0 % 的 FBS第1 天DMEM/F12 中 0. 5%的 FBS第2 天DMEM/F12 中 2 % 的 FBS第3天收獲細(xì)胞以用于FACS和RT-PCR分析。所有生長因子均購自R&D Systems，MN。每一個處理組中生長因子的詳細(xì)說明和 濃度如下所示。1 ·對照-不添加生長因子2.激活素 A(100ng/ml)3.激活素 A (100ng/ml) +ffnt-3a (10ng/ml) +Wnt5a (10ng/ml)4.激活素 A (lOOng/ml) +ffnt-3a (lOng/ml) +Wnt5a (lOng/ml) +BMP2(100ng/ml)5.激活素 A(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)6.激活素 A(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ml)7.激活素 A(100ng/ml)+BMP-7(100ng/ml)8.激活素 A (lOOng/ml) +BMP-4 (lOOng/ml) +BMP-6 (lOOng/ml) +BMP-7 (lOOng/ml)9. IL-4(10ng/ml)10. SDFla (20ng/ml)11.激活素 A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)+SDFla(20ng/ml)12. BMP2(lOOng/ml)+BMP-4(lOOng/ml)+BMP-6(lOOng/ml)+BMP-7(lOOng/ml)
13.激活素 A(100ng/ml)BMP-2(100ng/ml)+BMP-4(100ng/ml)+BMP-6(100ng/ ml)+BMP-7(100ng/ml)14.激活素 A(100ng/ml)+IL-4(10ng/ml)15.激活素 A(100ng/ml) + (SDFla(20ng/ml)16.激活素 A (100ng/ml) +ffnt-3a (10ng/ml) +ffnt-5a (lOng/ml) +ffnt-7a (lOng/ml)17.激活素 A (lOOng/ml) +IL-4 (lOng/ml) +SDFla (20ng/ml) +BMP-4 (lOOng/ml)MM 在DE方案處理的第3天收獲細(xì)胞。為了分析，將經(jīng)處理的細(xì)胞的等分試樣用于制 備RNA以進(jìn)行RT-PCR，剩下的細(xì)胞則用于FACS分析。CXCR4的頻率(％ )在圖37中示出。 添加上述生長因子并未使CXCR4的表達(dá)增加到高于含lOOng/ml的AA的低血清處理。對于RT-PCR分析，分析細(xì)胞的所選組的定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的表達(dá)。所示結(jié)果相對 于在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長、但未用激活素A或其他生長因子中的任何因子處理的細(xì)胞進(jìn)行了 校正。與FACS數(shù)據(jù)相符，表V示出，將生長因子(例如Wnt-3a)加入用低血清、高劑量激活 素A處理的培養(yǎng)物中沒有顯著上調(diào)定形內(nèi)胚層標(biāo)志物。這與此前的實例相比之下，此前的 實例顯示在存在激活素A、WNT3A和低血清的情況下在無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)的ES細(xì)胞的DE 標(biāo)志物顯著增加。實例23用MATRIGELa或人纖粘蛋白凃布的_織培養(yǎng)某質(zhì)卜.培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞,向定形內(nèi)胚層(DE)的分化H9P55細(xì)胞在人纖粘蛋白或常規(guī)生長因子MATRIGEL (BDBiosciences)上生長 和分化。向6孔組織培養(yǎng)處理板中的每一個孔中加入Iml含lug/ml人纖粘蛋白(R&D systems, MN)的 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO)?；蛘?，將常規(guī)生長因子 MATRIGEL 在 DMEM/F12中1 10的稀釋液，向6孔組織培養(yǎng)處理板中的每一個孔中加入Iml經(jīng)稀釋的 MATRIGEL 。用膠原酶進(jìn)行細(xì)胞傳代。在細(xì)胞達(dá)到80%融匯率之后，進(jìn)行如下處理用含有 10ng/ml小鼠重組Wnt3a(R&D)和100ng/ml激活素A (R&D)的0. 5 %的FBS處理兩天。然 后用2%的FBS加lOOng/ml激活素A處理3天。圖38屏面a_b分別示出在纖粘蛋白和 MATRIGEL上培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞的CXCR4表達(dá)。實時PCR結(jié)果(圖39)證實了在纖粘蛋白和 MATRIGEL 涂布的平板上定形內(nèi)胚層的形成相當(dāng)。實例24在用不同濃度的MATRIGEIa涂布的組織培養(yǎng)基質(zhì)上人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層 的分化將大約60%至70%融匯率的H9培養(yǎng)物暴露于補(bǔ)充有0. 5 %的FBS、20ng/ml的 Wnt-3a和lOOng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS、20ng/ ml的Wnt-3a和100ng/ml激活素A (AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。在用常規(guī) MATRIGELd 60至1 10的稀釋液)涂布的平板上培養(yǎng)H9細(xì)胞。用MATRIGEL在室溫下 涂布平板1小時。實時PCR結(jié)果在圖40中示出。用低血清、激活素A和Wnt3a處理人胚胎干細(xì)胞導(dǎo) 致了 CXCR4、GATA4、Goosecoid, HNF-3 β和S0X-17基因的表達(dá)，提示細(xì)胞正在向定形內(nèi)胚 層階段分化。然而，在存在Wnt-3A的情況下，MATRIGEL 涂層的濃度在分化中似乎并不起重要作用。實例25在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞的分化以及隨后在MEF卜.培養(yǎng)并向定形內(nèi)胚層分化作用將得自在MATRIGEL 上培養(yǎng)至少五傳代的人胚胎干細(xì)胞系H9的細(xì)胞接種到ES培 養(yǎng)基中的MEF飼養(yǎng)層上。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到60%至70%融匯率時，將它們暴露于補(bǔ)充有0. 5%的 FBS和lOOng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2 %的FBS和lOOng/ml 激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。附加的處理組包括用20ng/ml的Wnt-3a處 理(整個五天)以及用lO-lOOng/ml的激活素A處理。在第3天和第5天，通過實時PCR分析培養(yǎng)物的S0X-17、S0X_7、α-甲胎蛋白 (AFP)、CXCR4,Brychyury(Bry)、gooscecoid(GSC)、HNF-3 β、GATA4、hTERT 和 0ct4。AFP 禾口 S0X-7被認(rèn)為是內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)志物，而GATA4、HNF-3 β和S0X-17則代表定形內(nèi)胚層標(biāo)志物， GSC、Bry和CXCR4代表原條標(biāo)志物。hTERT和0ct_4分別是自我更新和多能性標(biāo)志物。實 時PCR結(jié)果在圖41屏面a-d中示出。在第3天和第5天還進(jìn)行了 FACS分析。分析CXCR-4 和⑶9的表達(dá)水平，并記錄在圖41屏面e中。在不存在Wnt3a的情況下，在lOOng/ml激活素A中培養(yǎng)的細(xì)胞的AFP表達(dá)水平與 未處理對照中所見相似。然而，向在lOOng/ml激活素A中培養(yǎng)的細(xì)胞添加Wnt3a增加了 AFP 的表達(dá)(隨時間而增加)。當(dāng)使用較低濃度的激活素A時，AFP表達(dá)非常高，不論是否存在 Wnt3a(圖41，屏面a)。這表明高濃度的激活素A是避免細(xì)胞分化成胚胎外組織所必需的。通過FACS分析發(fā)現(xiàn)，在第3天，CXCR4陽性細(xì)胞在用高濃度激活素A處理但不用 Wnt3a處理的樣品中占細(xì)胞群的32-42%，相比之下，在用高濃度的激活素A和Wnt 3a處理 的樣品中則占細(xì)胞群的23-33% (圖41，屏面e)。到處理的第5天，在用高濃度激活素A 處理但不用Wnt3a處理的細(xì)胞中有28-32%表達(dá)CXCR4，相比之下，用高濃度的激活素A和 Wnt3a處理的細(xì)胞則有43-51 %表達(dá)CXCR4 (圖41，屏面f)。在用低濃度激活素A處理的細(xì) 胞中，與Wnt-3a處理組(3%至4% )相比，不用Wnt3a的處理組中存在更多的CXCR4陽性 細(xì)胞(11%至20% )(圖41，屏面g)。綜上所述，對于在MEF上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞向定形 內(nèi)胚層的分化，Wnt-3a似乎并不發(fā)揮重要作用。這表明飼養(yǎng)層可能會分泌足夠的Wnt-3a或 類似配體以增強(qiáng)激活素A誘導(dǎo)的定形內(nèi)胚層形成。實例26M Wnt抑泡丨齊Il DKK-I處理后在涂布有細(xì)朐,夕卜基質(zhì)的組iRi吝養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的人K胎 干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層的分化為了確定加入Wnt-3a是否會造成分化增加，將Wnt_3信號抑制劑加入培養(yǎng)物。將 大約60%至70%融匯率的H9培養(yǎng)物暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS、20ng/ml的Wnt3a、IOOng/ ml的Dikkopf-1 (DKK-I)和lOOng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2% 的FBS和lOOng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。在用生長因子減少的 MATRIGELd 30的稀釋液)涂布的平板上培養(yǎng)H9細(xì)胞。用MATRIGEL在室溫下涂布平板 1小時。在第5天，通過實時PCR分析培養(yǎng)物的S0X-17、S0X_7、α -甲胎蛋白(AFP)、CXCR4、 Brychyury (Bry)、gooscecoid (GSC)、HNF-3 β、GATA4、hTERT 和 0ct4。AFP 和 S0X-7 被認(rèn)為是內(nèi)臟內(nèi)胚層標(biāo)志物，而GATA4、HNF-3 β和S0X-17則代表定形內(nèi)胚層標(biāo)志物，GSC、Bry和 CXCR4代表原條標(biāo)志物。hTERT和Oct-4分別是自我更新和多能性標(biāo)志物。結(jié)果示于圖42中。在存在Wnt3a的情況下，細(xì)胞表達(dá)了 CXCR4、GATA4、HNF-3 β和S0X17,即所有的定 形內(nèi)胚層標(biāo)志物。也測得原條形成的標(biāo)志物(如goosecoid)的水平高于未處理對照中測 得的水平。在加入DKKl的條件下，上述分化標(biāo)志物的表達(dá)水平大大降低到類似于未經(jīng)處理 的細(xì)胞的水平。實例27在MATRIGEL凃布的鉬織培養(yǎng)某質(zhì)卜.培養(yǎng)以及在低,血清加激活素a和+ffnt-3a Φ 分化的Η9胚胎干細(xì)胞的DE標(biāo)志物的免疫熒光染餼在第5天，根據(jù)實例10將Η9細(xì)胞的DE培養(yǎng)物針對S0X-17、HNF-3B、GATA_4、神經(jīng) 性鈣粘蛋白和上皮細(xì)胞鈣粘蛋白進(jìn)行染色。所有細(xì)胞核均用DAPI進(jìn)行復(fù)染。與在不存在 ffnt-3a的情況下分化的培養(yǎng)物相比，20ng/ml的Wnt_3a導(dǎo)致S0X_17、HNF_3 β和GATA-4染 色陽性的細(xì)胞核數(shù)量明顯更高。此外，加入Wnt-3a還導(dǎo)致了上皮細(xì)胞鈣粘蛋白表達(dá)的顯著 缺失，以及神經(jīng)性鈣粘蛋白表達(dá)的提高(圖43屏面a和圖43屏面b)。實例28在MEF h^^MATRIGEL"卜.相比，定形內(nèi)胚層形成后胚胎干細(xì)胞,中某因表汰奪化 的微陣列分析使用RNeasy微量提取試劑盒(Qiagen)從下述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總RNA A)H9P33細(xì)胞，其在MATRIGEL (1 30的稀釋液)涂布的平板上培養(yǎng)并暴露于補(bǔ)充有 0. 5 %的FBS和lOOng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2 %的FBS和 100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天；B)H9P44細(xì)胞，其在MEF上培養(yǎng) 并暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS和lOOng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充 有2%的FBS和100ng/ml激活素A的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天；和C)H9P48細(xì)胞，其在 MATRIGEL (1 30的稀釋液)涂布的平板上培養(yǎng)并暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS和lOOng/ml 激活素A加20ng/ml的Wnt-3a的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2 %的FBS和IOOng/ ml激活素A (AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。每一個組的對照包括鋪在MATRIGEL涂布 的平皿上并培養(yǎng)于MEF條件培養(yǎng)基中的細(xì)胞，或鋪在MEF上并培養(yǎng)于ES培養(yǎng)基中的細(xì)胞。 所有組均含有三個生物學(xué)復(fù)制，每一個生物學(xué)復(fù)制在兩個獨立的基因芯片上重復(fù)。根據(jù)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2. 0 Array 進(jìn)行樣品制備、雜交和圖 像分析。在歸一化和對數(shù)轉(zhuǎn)換之后，使用Omni Vi ζ 軟件(MA)和GENESIFTER(VizXLabs,WA) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用方差分析和F檢驗評價樣品間基因表達(dá)的顯著差異，其具有<0.05的 調(diào)整后P值(Benjamini和Hochberg校正)。分析中僅包括當(dāng)前調(diào)用的基因(在至少一組 中)。表IV列出了 A組、B組和C組之間差異至少5倍的基因的平均歸一化對數(shù)轉(zhuǎn)換信號 強(qiáng)度，以及每一個基因的調(diào)整后P值。實例29在用MATRIGEL 涂布的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的SA002 ES細(xì)胞系向定形內(nèi)胚層 (DE)的分化將此前在補(bǔ)充有8ng/ml的bFGF的MEF-CM中，在MATRIGEL (1 30的稀釋液)涂布的平板上培養(yǎng)了至少三傳代的SA002P38細(xì)胞(Cellartis，Sweden)暴露于補(bǔ)充有0. 5% 的 FBS 禾Π 100ng/ml 激活素 A (R&D Systems, MN) 士20ng/ml 的 Wnt_3a 或 IOOnM 的 GSK-3B IX抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS和lOOng/ml激活素A(AA)的 DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。實時PCR結(jié)果示于圖44，屏面a和屏面b中。類似于H1、H7 和H9細(xì)胞系，SA002細(xì)胞系也需要加入Wnt-3A才能穩(wěn)定表達(dá)DE標(biāo)志物。CXCR4的表達(dá)在 圖 45 中顯示a)AA 處理；b)AA+Wnt-3a ；c)AA+GSK_3B 抑制劑。實例30
卜.士咨(DE) ■ 化使第55傳代人胚胎干細(xì)胞系Hl的培養(yǎng)物在人血清(Sigma，#H1388，MO)涂布的平 板上生長和分化。將0. 5ml人血清加入6孔組織培養(yǎng)處理板中的每一個孔中，室溫培育1小 時，然后在加入人胚胎干細(xì)胞前將其吸出。在細(xì)胞達(dá)到80%融匯率后，進(jìn)行如下處理用含 10ng/ml 小鼠重組 Wnt3a (R&D)或 IOOnM 的 GSK-3B 抑制劑 IX (目錄 #361550，Calbiochem, CA)和lOOng/ml激活素A(R&D)的0. 5%的FBS處理兩天。接下來用2%的FBS加IOOng/ ml激活素A處理3天。然后通過實時PCR分析培養(yǎng)物(圖46屏面a和屏面b)。我們注意 至IJ，用激活素A+GSK-3B抑制劑或Wnt-3A處理的細(xì)胞相比僅用激活素A處理的細(xì)胞穩(wěn)定表 達(dá)了定形內(nèi)胚層標(biāo)志物。這些發(fā)現(xiàn)與我們對在MATRIGEL 或人纖粘蛋白涂布的平板上培養(yǎng) 的人胚胎干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)一致。實例31^hM MATRIGEL12涂布的組iRi吝養(yǎng)基Jli上培養(yǎng)的人K胎干細(xì)朐,向定形(DE) 的分化_評價多種GSK-3B抑制劑評價多種市售GSK-3B抑制劑在人胚胎干細(xì)胞形成DE中的有效性。評價了下列 GSK-3B 抑制劑(IOOnM) :GSK_3B 抑制劑 VIII (目錄 #361549，Calbiochem，CA)、GSK_3B 抑制 劑 IX (目錄 #361550, Calbiochem, CA)、GSK_3B 抑制劑 XI (目錄 #361553, Calbiochem, CA)、 GSK-3B 抑制劑 XII(目錄 #361554，Calbiochem，CA)。將 H1P54ES 細(xì)胞在 MATRIGEL (1 30 的稀釋液)涂布的平皿上培養(yǎng)并暴露于補(bǔ)充有0. 5%的FBS、100ng/ml激活素A(AA)+/-多 種GSK-3B抑制劑的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS、100ng/ml激活素A(AA) 的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。用低血清加高劑量AA處理對照培養(yǎng)物。圖47屏面a和 屏面b示出在第5天時定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的基因表達(dá)。相比GSK-3B抑制劑VIII和XII， GSK-3B抑制劑IX和XI對誘導(dǎo)DE的形成均有效。實例32在無飼養(yǎng)層條件下培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞形成胰腺內(nèi)胚層_評價視黃酸類似物將H9P49胚胎干細(xì)胞在MATRIGEL (1 30的稀釋液)涂布的平皿上培養(yǎng)并暴 露于補(bǔ)充有 0. 5 % 的 FBS、20ng/ml 的 Wnt_3a(目錄 #1324-WN_002，R&D Systems, MN)禾口 100ng/ml激活素A (R&D Systems, MN)的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的FBS 和lOOng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。在第5天，收集細(xì)胞用于通過 FACS和實時PCR進(jìn)行評價。如此前實例所示，此方案導(dǎo)致定形內(nèi)胚層標(biāo)志物(例如CXCR4 和S0X-17)穩(wěn)定上調(diào)。將在第5天所得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于下述培養(yǎng)基條件以誘導(dǎo)胰 腺內(nèi)胚層的形成在補(bǔ)充有2%的FBS和ImM全反視黃酸(RA)(目錄#R2625，Sigma, MO))或0. I-IOmM的AM-580(4-[(5，6，7，8-四氫_5，5，8，8-四甲基-2-萘基)甲酰胺基]苯甲 酸，目錄 #A8843，Sigma, MO)或 0. I-ImM 的 TTNPB (4-[(E) -2-(5,6, 7,8-四氫-5，5，8，8-四 甲基-2-萘基)-1_丙烯基]苯甲酸芳維A酸，目錄#T3757，Sigma，M0)的DMEM/F12培養(yǎng)基 中培養(yǎng)3天。AM-580和TTNPB為視黃酸類似物，其對視黃酸受體具有親和性。RA處理后， 在補(bǔ)充有 2%的 FBS 和 20-50ng/ml 的 bFGF(目錄 #F0291，Sigma, MO)的 DMEM/F12 培養(yǎng)基 中再處理三天。收獲培養(yǎng)物，并采集mRNA樣品用于分析。基因表達(dá)分析表明(圖48屏面a-d)添加ImM RA然后暴露于bFGF顯著上調(diào)了胰 腺內(nèi)胚層標(biāo)志物，例如PDX-I。此外，此方案導(dǎo)致前腸內(nèi)胚層標(biāo)志物(例如CDX-2和AFP)穩(wěn) 定表達(dá)。在ImM的濃度下，添加RA類似物導(dǎo)致相當(dāng)?shù)囊认賰?nèi)胚層和前腸標(biāo)志物。然而，與全 反視黃酸相比，添加ImM的RA類似物導(dǎo)致了更穩(wěn)定的AFP表達(dá)。然而，添加IOmM的AM-580 抑制了 AFP和⑶X-2的表達(dá)，但維持了 PDX-I的高表達(dá)。
實例34ffnt-3a處理對人胚胎干細(xì)朐中細(xì)朐因子表汰的影口向使用蛋白質(zhì)芯片分析Wnt-3a處理對細(xì)胞因子表達(dá)的影響。根據(jù)實例15中所述的 方法培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞系H9的細(xì)胞。在第54傳代，細(xì)胞在存在lOOng/ml激活素A士 IOng/ ml的Wnt3a的情況下，在0. 5%的FBSDMEM/F12中分化兩天。然后在100ng/ml激活素A禾口 2%的FBS DMEM/F12中再培養(yǎng)三天。在第5天結(jié)束時，通過FACS測定每一個處理組的CXCR4 表達(dá)。在僅用激活素A處理的細(xì)胞中，有的細(xì)胞表達(dá)CXCR4。在用激活素A和Wnt3a處 理的細(xì)胞中，有73%的細(xì)胞為CXCR4表達(dá)陽性。使用哺乳動物細(xì)胞裂解試劑盒(Sigma-Aldrich，M0)由每一個處理組的細(xì)胞制備 細(xì)胞溶胞產(chǎn)物。從每一個處理組收集條件培養(yǎng)基并濃縮。使用RayBiotech，GA(http:// www. raybiotech. com/)提供的細(xì)胞因子芯片板完成細(xì)胞因子芯片分析。表VII列出了數(shù)據(jù) 歸一化和背景減除后的細(xì)胞因子、生長因子和受體表達(dá)。對于每一個板，也包括陽性對照和 陰性對照。所示數(shù)據(jù)為每個細(xì)胞處理組的兩個獨立樣品(1、2)。在Wnt3處理的細(xì)胞條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了血管生成素、IGFBP-I和EGF的明顯上調(diào)。 在Wnt3a處理的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中許多蛋白上調(diào)，包括IGFBP-1、TGF β-1和TGF β-3?？蓪?這些上調(diào)的蛋白回加到分化培養(yǎng)基中，以替代或增強(qiáng)Wnt3a對定形內(nèi)胚層形成的作用。實例35在用MATRIGEI"涂布的組iRi吝養(yǎng)基Jli上培養(yǎng)的人K胎干細(xì)朐詢定形的分 化Wntl的作用將H1P55ES細(xì)胞在MATRIGEL (1 30的稀釋液)涂布的平皿上培養(yǎng)并暴露于補(bǔ)充 有 0. 5% 的 FBS 禾Π 100ng/ml 激活素 A±10-20ng/ml 的 Wnt-1 (P印roTech，NJ，目錄 #120-17) 的01^11汗12培養(yǎng)基兩天，然后用補(bǔ)充有2%的？83、100叫/1111激活素4仏幻和士 10或20ng/ ml的Wnt-I的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理三天。測試下列WNT1+AA組合a)第 1-2 天0. 5 % 的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 Wnt l+100ng/ml 的 AA，然后第 三天2%的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA ；b)第 1-2 天0. 5%的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 ffntl+100ng/ml 的 AA，然后第 3-5天的FBS+DM_F12+100ng/ml 的 AA ；c)第 1-2天0. 5% 的 FBS+DM-F12 中 10ng/ml 的 Wntl+100ng/ml 的 AA，然后第三天2% 的 FBS+DM_F12+100ng/ ml 的 AA ；d)第 1-2 天0. 5% 的 FBS+DM-F12 中 10ng/ml 的 Wntl+100ng/ml 的 AA，然后第 3-5天2 % 的 FBS+DM-F12+100ng/ml 的 AA ；e)第 1-2 天0· 5 % 的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 ffntl+100ng/ml 的 AA，然后第三天2% 的 FBS+DM_F12+100ng/ml 的 AA+20ng/ml 的 Wntl ；f) 第 1-2 天0. 5% 的 FBS+DM-F12 中 20ng/ml 的 Wntl+100ng/ml 的 AA，然后第 3-5 天2% 的 FBS+DM-F12+100ng/ml的AA+20ng/ml的Wntl。圖49屏面a和屏面b示出在用低血清、AA 和Wnt-I處理Hl細(xì)胞后定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的實時PCR數(shù)據(jù)。在lOOng/ml的AA存在下添 力口 20ng/ml 的 Wntl 導(dǎo)致了定形內(nèi)胚層標(biāo)志物(Bry、CXCR4、GSC、SOX17、HNF-3B 和 GATA-4) 的明顯上調(diào)。實例36在限定培養(yǎng)基中，在組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞向定性內(nèi)胚層的分化將在缺氧條件下(大約3%的O2)培養(yǎng)并鋪在MATRIGEL (1 30的稀釋液)涂 布的平皿上的Hl胚胎干細(xì)胞在MEF條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)至大約60%至70%的融匯率，然后 暴露于補(bǔ)充有 0. 5%的 FBS、20ng/ml 的 Wnt_3a(目錄 #1324-WN_002，R&D Systems, MN)禾口 100ng/ml激活素A (R&D Systems,MN)的DMEM/F12培養(yǎng)基兩天，接著用補(bǔ)充有2%的FBS和 100ng/ml激活素A(AA)的DMEM/F12培養(yǎng)基再處理3至4天。同時，將在MATRIGEL上培養(yǎng) 的 Hl 細(xì)胞暴露于補(bǔ)充有 0. 5-1% 的 B27(Invitrogen，Ca) +20g/ml 的 WNT_3a+100ng/ml 激 活素 A士GSK-3B 抑制劑 IX (目錄 #361550，Calbiochem，CA)的 DMEM-F12 或 DMEM-LG 中 4-5 天。在一些培養(yǎng)物中，使用的N2添加劑(Invitrogen，Ca)代替的B27。此外，將從稱為“EXPRES”細(xì)胞(可擴(kuò)增的前原條細(xì)胞)的母H9 ES細(xì)胞系分離的 細(xì)胞系也暴露于上述相同的培養(yǎng)基配方中，以誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層(DE)的形成。EXPRES細(xì)胞 的性質(zhì)此前已在美國專利申請60/913，475中有所公開。最后，將從Invitrogen獲得的并 在MATRIGEL涂布的平板上于MEF條件培養(yǎng)基+8ng/ml的bFGF中培養(yǎng)的BG01V系的細(xì)胞暴 露于上述分化培養(yǎng)基中，以誘導(dǎo)DE的形成。圖50示出，對于暴露到限定分化培養(yǎng)基或低血 清分化培養(yǎng)基的EXPRES01、BG01V和Hl P50細(xì)胞系，在第4_5天通過FACS檢測的CXCR4和 CD9表達(dá)。對于所有的供試細(xì)胞系，當(dāng)使用基于的B27添加劑的限定培養(yǎng)基時，與基于 FBS的培養(yǎng)相比，CXCR4的表達(dá)相當(dāng)。此外，的N2添加劑不能誘導(dǎo)DE的形成，可能是由 于N2添加劑中存在高濃度的胰島素(8. 6mM)。圖51示出用低血清或限定培養(yǎng)基+AA+WNT3A 處理的EXPRES01、BG01V和Hl培養(yǎng)物在第4_5天時的實時PCR數(shù)據(jù)。此方案導(dǎo)致了 DE標(biāo) 志物的顯著上調(diào)。圖52示出通過1 %的B27+DM-F12+激活素A+WNT3A+GSK03B抑制劑處理 五天將EXPRES 01 P49細(xì)胞分化成DE的免疫熒光圖像。大多數(shù)細(xì)胞為GATA-4、SOX-17和 HNF-3B染色陽性，少數(shù)細(xì)胞為OCT-4、S0X-2和Nanog染色陽性。實例37在限定培養(yǎng)基中，在MEF上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞向定性內(nèi)胚層的分化將Hl細(xì)胞平鋪在此前用絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)接種的6 孔板上。讓細(xì)胞在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中生長到70-80%的融匯率，ES細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充有 20%的Knockout血清替代品、IOOnM的MEM非必需氨基酸、0. 5mM的β -巰基乙醇、2mM的 L-谷氨酰胺(均得自Invitrogen/GIBCO)和8ng/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF) (R&DSystems)的 DMEM/F12 (Invitrogen/GIBCO)組成。對于DE的形成，除了下面詳述的其他生長因子之外，還在存在或不存在激活素 A(100ng/ml)的情況下處理細(xì)胞。如下列方案所示，將生長因子加入濃度遞增的FBS
第0 天在 DMEM-LG 或 RPMI 中 0% 的 FBS 或 1 % 的 B27第1 天在 DMEM/F12 或 RPMI 中 0. 5%的 FBS 或 1 %的 B27第2-5 天在 DMEM/F12 或 RPMI 中 2% 的 FBS 或 1 % 的 B27或者，在HESGro 培養(yǎng)基(Chemicon，Ca) +IOOnM 的 LY 化合物(EMD，CA) +100ng/ml 的AA中將細(xì)胞處理1-5天。在第1-5天，收獲細(xì)胞用于FACS和RT-PCR分析。所有生長因子均購自R&D SyStemS，MN。圖53示出暴露于低血清+激活素A或限定培養(yǎng)基+激活素A的Hl細(xì)胞在第 1-5天時的實時PCR數(shù)據(jù)。表達(dá)水平的倍數(shù)改變相對于第1天的值進(jìn)行歸一化。本文通篇引用的出版物據(jù)此全文以引用方式并入本文。盡管上文以引用實例和優(yōu) 選實施例的方式闡述了本發(fā)明的多個方面，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍并不由上述說明限 定，而是由根據(jù)專利法的原則正確解釋的以下權(quán)利要求書限定。表IA 用干FACS和免,瘡染盧ZtH斤的一杭歹1丨表
表IB 用干FACS和免,瘡染盧/τΗ斤的標(biāo)iff二杭歹1丨表 表IIA:在激活素A處理后的人胚胎干細(xì)胞蛋白表達(dá)隨時間的變化 表IIB 在激活素A處理后的人胚胎干細(xì)胞蛋白表汰隨時間的變化 表IIC:在激活素A處理后的人胚胎干細(xì)胞蛋白表汰隨時間的變化 表IV:經(jīng)i寸5天的處理少后，在MATRIGEL(TM)或小鼠胚胎成纖維細(xì)朐卜.培養(yǎng)的未 分化胚胎干細(xì)胞和定形內(nèi)胚層期細(xì)胞之間的基因的差異表汰
AI659533 ArgAbl相互作用 S0RBS2 0. 02 0.12 1.12 0.71 2.17 0.05 -1.08 1.48 蛋白ArgBP2
AA531287 表達(dá)序列標(biāo)簽 -2.94 0.27 1.32 0. 72 2. 57 0.04 0.22 0.90
NM-013243 人分泌粒蛋白 SCG3 3.30 0.20 2.13 0. 95 3.67 0. 19 0.87 1.06 III (SCG3), mRNA/PROD=分泌 粒蛋白III /FL=gb: AF07885 1. 1
gb:NM_013243. 1
AI 307586 人mRNA; cDNA C10orf95 0.34 0.22 -1.15 0.24 -0.49 0.16 -3.61 0.99 DKFZp566H0124 (來自克隆 DKFZp566H0124 )
BC032004 克隆號為GRIA3 -0.02 0.23 -0.15 0.33 0.47 0. 04 0.17 0.07
IMAGE:4753474 的人離子型谷氨 酸受體AMPA 3類 似蛋白mRNA。
AW205739 弱類似于ORF TYW3 0.47 0.01 0.81 1.35 3.72 0. 18 2. 46 1. 15 YGL050W (啤酒 酵母)的表達(dá)序 列標(biāo)簽
NM-153262 人假想蛋白 SYT14 -0.01 0.17 -0.84 0.51 0.00 0.18 -3.88 1. 64 FLJ34198 (FLJ34198)， mRNA/FL=gb: NM— 153262. 1
AA156873 白蛋白PELO 0.77 0.12 -0.23 0. 93 0. 65 0.14-2.33 1.01
BC012375 克隆號為ARSG -0.46 0.48 -0.78 0. 42 0. 57 0.22 -0.41 0.55
MGC: 8996 IMAGE: 3882163 的類似于人 KIAA1001 蛋白 mRNA,完整的 cds/PROD=類似 于KIAA1001蛋白 /FL=gb: AB02321 8. 1
gb;剛-014960. 1 gb: BC012375. 1
AA843242 表達(dá)序列標(biāo)簽 BNC2 2.12 0. 37 1. 03 0.47 2. 89 0. 06 0.43 0.80
BF792954 ；^ 達(dá)序列標(biāo)簽 HDLBP -1.53 1.04 -2.75 0.91 0.30 0.16 -0.72 0.26
AA780067 琉酸乙醜肝素 HS3ST3B1 0.41 0.19 0. 30 0. 61 2. 61 0. 18 0.78 0.60 (葡糖胺)3-0磺 基轉(zhuǎn)移酶3B1
AA909330 表達(dá)序列標(biāo)簽 RP1- 0. 98 0.17 -1.67 0.51 0.79 0.02 -0.38 0.12
32F7. 2AF141339 人LYST相互作用 ZNF521 -0.41 0.12 -0.97 0.93 1. 67 0.11 -0.31 0.80 蛋白LIP3 mRNA,部分的 cds/PROd=LYST 相互作用蛋白 LIP3
BF435123 BRPF3-2.28 0.17 1.31 0.51 2.70 0.12 1.30 1. 00
AK056212 克隆號為-1.03 0.14 0.14 0. 27 1. 10 0.07 -1.41 0. 51
NT2RI2004079的 人 cDNA FLJ31650 fis。
NM-001446 人腦脂肪酸結(jié)合 FABP7 2.07 0.15 0.74 0.29 2.20 0.04 1.08 0.16 蛋白7 (FABP7) ’ mRNA/PROD=腦脂 肪酸結(jié)合蛋白7 /FL=gb: U81235. 1 gb: D88648. 1 gb: U51338. 1 gb: NM-001446. 1 gb: D50373. 1
AW051591 中等類似于未命 RNF175 1.41 0.32 0.22 0. 10 2. 60 0.06 0.96 0.20 名蛋白_產(chǎn)物 (人)的表達(dá)序 列標(biāo)簽
BC041970 克隆號為C9orfl22 0. 74 0.03 -0.35 0.49 0.76 0.06 -2.31 1.25
IMAGE: 5302687 ■的人mRNA。
BCOl3077 克隆號為-2. 51 0. 11 0.80 1.15 2.85 0. 06 0. 08 0. 89
IMAGE: 3459334 的人mRNA
AW572379 表達(dá)序列標(biāo)簽-1.80 0. 03 0. 60 0.84 1.45 0. 07 1.88 0.53
BE644917 核受體亞家族 1 XIST -3.88 1.26 -0.54 1.28 1.94 0. 13 -0.20 1.94 組I成員3
NM-171999 人sal樣3 (果 SALL3 2. 97 0.18 2.04 0. 71 3. 79 0.08 1.02 0.74 蠅)(SALL3), mRNA/PROD=sal 樣3
/FL=gb:NM_1719 99. 1
AI654224 表達(dá)序列標(biāo)簽 -0.46 0.36 0.14 0.44 1. 03 0.07 -0.81 0.85
AA167449 核受體亞家族 1 XIST -3.08 0.10 -0.47 2. 59 4. 59 0.07 2.80 1.86 組I成員3
BF977837 KIAA0527蛋白 SUSD5 1.64 0.02 0.50 0.68 1.96 0.16 -1.52 1. 66
BC029425 克隆號為FILIPl -0.83 0.45 -0.03 0. 62 0.76 0.20 -0.29 0.44
IMAGB; 4616553 的人KIAA1275蛋 白類似蛋白 mRNA.AI978754 表達(dá)序列標(biāo)簽- 2,76 0.14 1.540.57 3.570.062.31 0.69
AA628440 核受體亞家族 1XIST 0. 18 0. 13 1.421.52 4.800.023.01 1.50 組I成員3
L36861 L36861- 2.75 0.17 2. 010.82 3.630.093.00 0.97 /FEATURE=expan ded-cds
/definition=hu
MGCAPB人鳥苷酸 環(huán)化酶活化蛋白 (GCAP)基因外顯 子1-4完整的CdS
AW023227 表達(dá)序列標(biāo)簽 MKX -0.91 0.60 -1.31 0.06 0.27 0.13 -2.90 0.52 NM-021614 人鉀中間/小電 KCNN2 3.45 0.13 2.52 0.83 4.40 0.14 1.54 0.80 導(dǎo)鈣活化通道亞 家族N成員2 (KCNN2), raRNA/PROD=鉀中 間/小電導(dǎo)鈣活 化通道亞家族N 成員2
/FL=gb:NM_0216 14. 1
gb: AF239613. 1
NM-000956 53kD人前列腺素 PTGER2 -0. 71 0,71 -0.73 0. 57 0. 63 0.33 -2. 38 0.61 E受體2 (EP2亞 型)(PTGER2), mRNA/PROD=53kD 前列腺素E受體2 (EP2亞型) /FL=gb:U19487. 1
gb:NM-000956.1
NM-013381 人促甲狀腺激素 TRHDE 1.96 0.16 0.25 0.36 1.81 0.03 0.82 0.23 釋放激素降解胞 外酶(TRHDE), mRNA/PROD=促甲 狀腺激素釋放激 素降解胞外酶 /FL=gb:AF12637 2. 1
gb: NM-Ol3381.1
AW138143表達(dá)序列標(biāo)簽 S0RBS2 3. 44 NM-014862 人KIAA0307基因 ARNT2 1. 29 產(chǎn)物
(KIAA0307), mRNA/PR0D=KIAA 0307基因產(chǎn)物 /FL=gb: AB00230 5.1
gb: NM-014862. 1 AI765540表達(dá)序列標(biāo)簽 -1.28
NM-018013 人假想蛋白 FU10159 1. 30 FLJ10159 (FLJ10159)， mRNA7PR0D=假想 蛋白 FLJ10159 /FL=gb: NM.0180 13. 1
BF382322弱類似于未命名-蛋白產(chǎn)物(人) 的表達(dá)序列標(biāo)簽 AV699347核受體亞家族i XIST
組I成員3 BC011 549 克隆號為ATP5S
MCC: 19945 IMAGE: 4554461 的人raRNA,完整 的cds/PR0D=未 知(克隆號為 MGC: 19945 的蛋 白)
/FL=gb:BC01154 9.1
NM.001889人晶狀體蛋白(CRYZ (醌還原酶) (CRYZ),
mRNA/PROD=晶狀 體蛋白《(醌還原 酶)
/FL=gb: NM.0018 89. 1
gb:L13278. 1 gb: S58039. 1
-0. 40
-1. 37
0. 69
0. 16 2. 89 0. 08 -0. 68
0. 22 0. 07 0. 21 0’ 38
0. 09 —2. 09
0. 38 0. 0. 19 0.
45 96
-1.68 0.26 0.23
0. 88 4. 47 0. 10 1. 88 1. 15 0. 97 2. 00 0. 08 0. 02 0. 24
0. 39 1. 50 0. 07 —0. 11 0. 26 0. 39 2, 89 0. 02 0. 62 0. 21
0.67 -0. 12 0. 08 -1. 73 0. 50
1.69 4. 28 0. 02 2. 25 1. 53 0. 68 2. 57 0. 29 —0. 02 0. 52
1. 38 3. 75 0. 07 1. 78
1. 11
113BC002665 克隆號為PLP1 4. 57 0. 15 2. 95 0. 64 4. 70 0.06 2.32 0. 52
MCC: 3940的人蛋 白脂質(zhì)蛋白 (佩-梅病、痙 攣性截癱2、無 并發(fā)癥)mRNA, 完整的
cds/PROD=蛋白 脂質(zhì)蛋白(佩_ 梅病、痙攣性截 癱無并發(fā) 癥)
/FL=gb: BC00266 5. 1
NM-001243 人腫瘤壞死因子 TNFRSF8 3. 75 0. 03 1. 45 0.35 3.24 0.11 0. 89 0.46 受體超家族成員 8 (TNFRSF8), mRNA/PROD=CD30 抗原(Ki-1抗 原)
/FL=gb:NM_0012 43. 1
gb: D86042. 1 gb: M83554. 1
NM—001195 人串珠狀纖維結(jié) BFSP1 0.57 0.33 -1.65 1.30 0.60 0.14 -0.86 0.73 構(gòu)蛋白1 filens in (BFSP1), mRNA/PROD=file
ns in
/FL=gb: AF03965 5. 1
gb:NM-001195. 2 gb: Y16717. 2 NM-024582人假想蛋白 FLJ23056 (FLJ23056), mRNA/PROD=假想 蛋白 FLJ23056 /FL=gb: NM-0245 82. 1
FAT4 2. 16
0. 27 -0. 49 0. 30
1. 54 0. 28 -1. 35 1. 01
114NM-000767人細(xì)胞色素P450 亞家族IIB (鎮(zhèn) 靜安眠劑誘導(dǎo)) 多肽6 (CYP2B6)， mRNA/PR0D=細(xì)胞 色素P450亞家族 IIB (鎮(zhèn)靜安眠 劑誘導(dǎo))多肽6 /FL=gb: NM-0007 67. 2
gb: AF182277. 1 gb: M29874. 1 AW665509表達(dá)序列標(biāo)簽 NM-001104人輔肌動蛋白a 3 (ACTN3), mRNA/PR0D=骨格 肌特異性輔肌動 蛋白o(hù)c 3 /FL=gb: M86407. 1
gb: NM-001104. 1 NM.021069 人ArgAbl相互作 用蛋白ArgBP2 (ARGBP2)轉(zhuǎn)錄變 體2，
mRNA/PR0D=ArgA bl相互作用蛋白 2，同工型2 /FL=gb: AB01832 0. 1
gb:NM-021069. 1 T65020 表達(dá)序列標(biāo)簽 NM-152647人假想蛋白 FLJ32800 (FLJ32800)， mRM/FL=gb: NM-152647. 1 BC036917克隆號為 MGC: 46457 IMAGE: 5201433 的人mRNA，完整 的cds/PROD=未 知(克隆號為 MGC: 46457的蛋 白)
/FL=gb:BC03691
CYP2B6 2.60 0.18 0.87 0.96 1.47 0.12 -0.69 1.03
MGC42174 -0. 10 0.33 -0.87 0. 72 1.20 0.08 -2.60 1.40 ACTN3 2. 12 0.13 1.64 0.28 3.35 0.03 1.67 0.36
SORBS2 -0.49 0.43 0. 30 1.36 2.03 0.07 -1.13 1. 15
-0. 51 0.16-0.84 0.26 1. 10 0.15 -1.50 0.38
GALK2 0.08 0.56 -1.42 0.52 0.03 0.17 -2.34 0.91
C6orfl41 -0.82 0.30 -1.18 0.40 0. 88 0.11 -2.18 0. 62
115AI969112
AW449813 AW044658 AI694300 NM-017631
SLITRK5 0. 32 - 0. 16 --0. 52
FLJ20035 1.35
AF298547
NM-030631
BF196255 NM.003247
AW004016 AW072790
0. 13 -2. 88
0. 26 -1. 89 0. 16 -1. 47 0. 02 -1. 34 0. 13 0. 05
0. 08 1. 22
0. 25 0. 33
克隆號為PHIP -1. 07
IMAGE: 5260603 的人raRNA，部分 的cds
KIAA0918 蛋白 表達(dá)序列標(biāo)簽 表達(dá)序列標(biāo)簽 人假想蛋白 FLJ20035 (FLJ20035) ’ raRNA/PROD=假想 蛋白 FLJ20035 /FL=gb: NM.0176 31.1
人核苷酸結(jié)合位NALP2 1. 54 點蛋白1 mRNA， 完整的
cds/PROD=核苷 酸結(jié)合位點蛋白 1
/FL=gb: AF29854 7. 1
人氧橋二羧酸載SLC25A21 1. 96 體 WDC1)， mRNA/PROD=氧橋 二羧酸栽體 /FL=gb: NM-0306 31. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽 -■2.94 0.05 1.18
人血小板反應(yīng)素THBS2 2. 62 0.20 1.04 2 (THBS2), mRNA/PROD=血小 板反應(yīng)素2 /FL=gb: NM-0032 47.1
gb:L12350. 1
NM-001446 人腦脂肪酸結(jié)合 FABP7 0. 95 0. 09 -0. 75 蛋白7 (FABP7), mRNA/PROD=腦脂 肪酸結(jié)合蛋白7 /FL=gb: U81235. 1 gb: D88648.1 gb:U51 338. 1 gb: NM-001446. 1 gb: D50373.1
表達(dá)序列標(biāo)簽 ST6GAL2 1.57 0. 14 0.89 接觸蛋白 1CNTN1 0. 50 0. 20 0. 18
0. 91 -0. 37 0. 02 -2. 23 0. 33
0. 500. 460. 10-0. 570. 13
0. 250. 900. 14-0. 890. 16
0. 520. 270. 08-1. 000. 08
0. 191. 510. 170. 320. 15
1. 61 5. 04 0. 05 3. 23
1. 36
0. 81 2. 47 0. 11 -0. 28 0. 63
0. 43 3. 15 0. 08 0. 54 0. 57 0. 28 2. 70 0. 04 0. 27 0. 45
0. 37 0. 20 0. 22 -1. 73 0. 99
0. 32 3. 30 0. 07 1. 48 0. 43 0. 98 1. 84 0. 10 1. 01 1. 39
116AL512686人mRNA; cDNACNA012. 160.50-0. 281.03 1.670.18-1. 120.37DKFZp761I177(來自克隆DKFZp761I177)AI638063i 達(dá)序列標(biāo)簽CBX50. 490.16-0. 340.34 0.980.11-2. 711.22AU157049克隆號為LOC153342. 240.200. 340.47 2.240.09-0. 440.96PLACE1005898的6AcDNAFLJ14284 fisNM.002738人蛋白激醉cpPRKCB10. 990.28-0. 150.45 1.420.08-1. 021.041 (PRKCB1),mRNA/PR0D=蛋白激酶CP 1/FL=gb:NM-002738. 1AI185136表達(dá)序列標(biāo)簽DYDC20. 120.31-0. 800.08 0.720.08-0. 600.09AI928037表達(dá)序列標(biāo)簽RPIB9-0. 550.55-2. 710.74 0.490.12-0. 890.27NM-016179人瞬時受體電位TRPC4-1. 510.85-1. 871.42 1.710.11-0.131.23通道4 (TRPC4),mRNA/PR0D=瞬時受體電位通道4/FL=gb:NM-0l6179. 1gb: AF175406. 1AW138143表達(dá)序列標(biāo)簽S0RBS23. 290.132. 351.05 4.280.101. 321.07NM.001876人肝臟肉毒堿棕CPT1A1. 630.18-0. 150.21 1.320.07-0. 200.33櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(CPT1A),核基因編碼線粒體蛋白raRNA/PR0D=肝臟肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I/FL=gb:L39211. 11 gb: NM-001876. 1AA903862表達(dá)序列標(biāo)簽C20orf541. 610.15-1.170.30 0.680.21-1. 490.23AI670947I型磷脂酰肌醇--3. 910.050. 551.54 3..330.101. 170.684-騎政酯5-激酶 aAV648405P 聚合酶(RNA)--0. 010.110. 230.,52 1..730.14-1. 231.,15III (DIW指導(dǎo)的)(32kD)BF435123BRPF3-1. 800.,13-1. 351.,01 1,.140.,030. 370..24
117NM.016582人肽轉(zhuǎn)運(yùn)體3(LOC51296),mRNA/PROD=肽轉(zhuǎn)運(yùn)體3/FL=gb:NM_016582. 1gb: AB020598. 1AI830490甘油激酶AW134979HSPC156 蛋白AI354636表達(dá)序列標(biāo)簽BE672659表達(dá)序列標(biāo)簽AF284095人oc-2A腎上腺素能受體mRNA,完整的cds/PROD=a-2A腎上腺素能受體/FL=gb: AF28409 C 1J.上 gb:NM_000681.1NM-021136人漿膜蛋白1 (RTN1),mRNA/PROD=漿膜蛋白1/FL=gb: L10333.1 gb: L10334. 1gb: NM-021136. 1NM.014729人KIAA0808基因產(chǎn)物(KIAA0808) ’mRNA/PROD=KIAA0808基因產(chǎn)物/FL=gb: AB01835 1 1丄.i gb:NM-014729. 1BE674118表達(dá)序列標(biāo)簽BC026969克隆號為IMAGE: 5116073的人raRNA,部分的 cds。AF131783克隆號為25181的人mRNA序列。
SLC15A3 1.77
0. 16 -0. 88
1. 35 1. 30 0. 23
1. 23
CK
STXBP6
ADRA2A
0. 61 2. 28
81 20 63
RTN1
-0. 30
TOX
0. 34
WDR67
PAP2D
0. 78 2. 95
0. 01 -0. 65 0. 03 0. 55 0. 11 0. 68 0. 64 -0. 43 0. 21 -0. 74
0. 03 -1. 39
0. 03 -0. 46
0. 07 -1. 32 0. 11 0. 75
-0.42 0.26 -2,00
0. 79 1. 25
0.282. 05
1.173. 02 0. 611. 98 0. 981. 85
0. 73 0. 28 0. 92 3. 08
0.20-0.380. 33
0. 030. 300. 44
0.200. 190.76
0. 12—0. 690. 45
0. 030. 550. 31
0. 35 0.80 0. 07 -1. 23 0. 39
0. 12 0. 90 0. 18 -1. 86 0. 40
0. 19 -0. 96 0. 08 0. 45
0. 74 0. 61
1. 05 0. 31 0. 22 -1. 56 0. 70
118U11058 人大電導(dǎo)鈣與電 KCNMAl 1.56 0,09 -0.16 1. 08 2. 29 0.18 -0.79 0. 86 壓依賴性鉀通道 ex 亞基(MaxiK) mRNA，完整的 cds/PROD=大電 導(dǎo)鈣與電壓依賴 性鉀通道Ol亞基 /FL=gb: U23767. 1
gb: NM-002247. 1 gb:AF025999
BF510715 成纖維細(xì)胞生長-2.67 0. 27 0. 84 0.17 3. 29 0.01 0. 64 0.51
因子4 (肝素分 泌轉(zhuǎn)化蛋白1, 卡波西肉瘤癌基 因)
/FL=gb:M17446.
1
gb: NM-002007. 1
BE897866 表達(dá)序列標(biāo)簽 ACADSB 1.41 0.23 0.08 0. 34 3. 10 0.10 -0,27 0.88 AI735586 i達(dá)序列標(biāo)簽 L0C15257 0. 60 0. 13 0. 00 1.14 2.84 0. 07 1. 12 1.30
3
AL573058 補(bǔ)體成分 1, ! 子 ClR 0.92 0.14-1.67 0.38 0.73 0.02 -0.96 0.77 成分
AF429305 人C23up NCRMS RMST -0.48 0.03 -2.49· 0.51 -0.25 0.20 -1.89 0.27 mRNA部分序列； 選擇性剪接.
BF195118 弱類似于ALU7- ATP5J 0. 09 0.13 -0.92 0.42 1.57 0.16 -0.53 0. 08 人ALU亞家族SQ 序列污染警告條 目(人)的表達(dá) 序列標(biāo)簽
NM—005460 人 α 突觸核蛋白 SNCAIP 1.76 0.16 -0.84 0. 52 1. 61 0.19 -0.92 0.88 相互作用蛋白 (synphi 1 in) (SNCAIP)， mRNA/PROD=a 突 觸核蛋白相互作 用蛋白
/FL=gb: AF07692 9. 1
gb:NM-005460. 1
NM-024893 人假想蛋白 C20orf39 1. 16 0.29 -0.56 0. 42 2. 36 0.15 -0.06 0. 17 FLJ14220 (FLJ14220)， mRNA/PROD=假想 蛋白 FLJ14220 /FL=gb:NM-0248 93. 1
NM-000702 人Na+K+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP ATP1A2 2.12 0. 17 0. 76 0.38 2.93 0.16 0.51 0.12 酶α 2 (+)多肽 (ΑΤΡ1Α2), mRNA/PROD=Na+K +轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶ct 2 (+)多肽 /FL=gb: NM-0007 02, 1
NM-025135 人假想蛋白 FHOD3 1.02 0. 18 0.80 0.40 2. 34 0.10 -0.77 0.72 FLJ22297 (KIAA1695), mRNA/PROD=假想 蛋白 KIAA1695 /FL=gb:NM-0251 35.1
NM-012281 人電壓門控鉀通 KCND2 1. 67 0. 30 0. 05 0.15 2.70 0.09 -0.26 0. 38 道Shal相關(guān)亞家 族成員2 (KCND2)， mRNA/PROD=電壓 門控鉀通道Shal 相關(guān)亞家族成員 2
/FL=gb:NM-0122 81. 1
gb: AB028967. 1 gb: AF121104. 1
BF449063 XIV型股原 α C0L14A1 1.61 0. 15 0. 30 0. 38 2. 68 0.17 -0.33 0.68 (粗纖維調(diào)節(jié) 素)
ΑΑ280904 表達(dá)序列標(biāo)簽 C9o.rf39 0. 23 0.21 -1.58 1.26 1,13 0.14 -0.78 0.42 NM-022467 人N-乙酰半乳糖 CHST8 2. 11 0.20 -0.51 0.30 2.17 0.10 0.48 0.02 胺-4-0-磺基轉(zhuǎn) 移酶(GALNAC-4-STl)，
mRNA/PROD=N-乙 酰半乳糖胺-4-O-橫基轉(zhuǎn)移酶 /FL=gb:NM-0224 67. 1
gb: AF300612. 1
BE468066 表達(dá)序列標(biāo)簽 RMST 3.26 0. 09 1.49 0.10 3.80 0.09 1.63 0.08 AL120674 表達(dá)序列標(biāo)簽-1.00 0.11 -1.35 1. 73 1.55 0.15 -2.20 0.86NM-133329 人電壓門控鉀通 KCNG3 2.18 0.27 0.74 0. 29 3. 67 0.01 0.26 0. 28 道亞家族G成員3 (KCNG3)轉(zhuǎn)錄變 體1,
mRNA/PROD=電壓 門控鉀通道亞家 族G成員3同工型 1 /FL=gb:AF45454 8. 1
gb: AF348982. 1 gb: AB070604. 1 gb: NM-133329. 4
AI742043 表達(dá)序列標(biāo)簽 -0.94 0.34 -0.76 0.37 1.77 0.10 -1.45 0. 52
服_005103 人軸突成束和延 FEZl 2.80 0.11 2.08 0. 25 4. 98 0.06 2.20 0.26 伸蛋白ζ (推骨 蛋白I) (FEZl) 轉(zhuǎn)錄變體1, mRNA/PROD=推骨 蛋白1,同工型1 /FL=gb: U60060. 1 gb:U69139.1 gb:NM-005103. 2
NM-000277 人笨丙氨酸羥化 PAH 0.65 0.11 -1.08 0.08 1.46 0.18 -0.42 0. 12 酶(PAH) ’ mRNA/PROD=苯丙 氨酸羥化酶 /FL=gb:U49897. 1
gb: NM—000277. 1
BF698797 表達(dá)序列標(biāo)簽 -0.93 0.10 -0.74 0.11 2.07 0. 10 -0.40 0.44
BF437747 弱類似于ALU7- C20orfll 4.26 0. 07 1. 99 0. 45 4. 57 0.09 1.75 0.39 人ALU亞家族SQ 8 序列污染警告條 目(人)的表達(dá) 序列標(biāo)簽
NM—003020 人分泌顆粒神經(jīng) SCG5 4. 03 0.14 2.53 0.32 5.01 0. 12 3. 11 0.24 內(nèi)分泌蛋白1 (7B2蛋白) (SGNEl), mRNA/PROD=分泌 顆粒神經(jīng)內(nèi)分泌 蛋白1 (7B2蛋 白)
/FL=gb: BC00534 9. 1
gb:NM.003020. 1NM-002800 人蛋白酵體(蛋 PSMB9 1.38 0.10 0.27 0,34 2.05 0.07 -1.43 1.14 白酶體、巨蛋白 因子)亞基P 型，9 (大的多 功能蛋白酶2) (PSMB9)的 mRNA/PROD=蛋白 酶體(蛋白酶 體、巨蛋白因 子)亞基P型， 9(大的多功能 蛋白酶2) /FL=gb:U01025. 1
gb:NM.002800. 1
BE972639 表達(dá)序列標(biāo)簽 LOC64632 0. 00 0.15 -2.71 0.55 0.33 0.22 -2.24 0. 61
BC044830 克隆號為C10orf96 1. 38 0.12 -0.32 0.82 2. 28 0.06 -1.39 0.90
MCC: 35062 IMAGE: 5166167 的類似于RIKEN cDNA
1700011F14 基因 的mRM，完整的 cds/PROD=類似 于RIKEN cDNA 17000I1F14 基因 的產(chǎn)物
/FL=gb:BC04483 0. 1
AI961231 KIAA0808基因產(chǎn) TOX 1 28 0.13 1.23 0. 06 4, 00 0.01 1.13 0. 37 物
/FL=gb: AB01835 1. 1
gb:NM.014729. 1
U17496 人蛋白醇體亞基 PSMB8 3.43 0.21 0.46 1.17 3.30 0.06 0.09 0. 64 LMP7 (LMP7B等 位基因)mRNA, 完整的
cds/PROD=蛋白 酶體亞基LMP7 /FL=gb:U17497. 1 gb:U17496. 1
N23651 表達(dá)序列標(biāo)簽 SDK2 -1.16 0.31 -2.65 0.42 1.27 0.09 -2.07 0.75
NM-007015 人軟骨調(diào)節(jié)素I LECTl 4.83 0.12 2.27 0. 84 5. 36 0.09 1.83 0.69 前體(CHM-I), raRNA/PROD=軟骨 調(diào)節(jié)素I前體 /FL=gb: NM-0070 15. 1
gb: AB006000. 1
N1/L015474 人DKFZP564A032 SAMHDl 2.63 0.17 0.57 0. 33 2. 89 0.09 0.29 0,22 蛋白 (DKFZP564A032) )
raRNA/PROD=DKFZ P564A032 蛋白 /FL=gb:AF22842 1. 1
gb; AL050267. 1 gb: ABOl 3847. 1 gb: NM-015474. 1
AF147427 克隆號為SAMHDl 1.33 0.03 -0.99 0. 88 1. 35 0.08 -2.30 0.97
YP80A10的人全 長插入cDNA。
NM-004688 人N—rayc (和 NMI3. 54 0.04 0.96 0.07 3.80 0.07 1. 13 0. 34
STAT)相互作用 子(NMI)， mRNA/PROD=N-myc和STAT相互 作用子
/FL=gb: BC00126 8. 1
gb:NM-004688. 1 gb:U32849. 1
AB040812 人蛋白激酶PAK5 PAK7 -1,37 0.60 -3.89 1.62 -0.49 0.07 -4.18 0.12 的rnRNA,完整的 cd s/PROD=蛋白 激酶PAK5 /FL=gb: AB04081 2. 1
AI985987 中等類似于 SCNNlG -0.28 0.31 -0,99 0.35 0.12 0.19 -2.70 0. 59 ALUl-人ALU亞家 族J序列污染警 告條目(人)的 表達(dá)序列標(biāo)簽NM-001877 人補(bǔ)體成分 CR2 1. 50 0.13 -0.43 1.05 2.35 0.14 -1.44 1.51 (3dEpstein Barr病毒)受體 2 (CR2), mRNA/PROD=補(bǔ)體 成分
(3dEpstein Barr病毒)受體 2
/FL=gb: NM-001B 77. 1 gb: M26004.1
NM-001351 人無精子癥缺失 DAZL 1.69 0.24 -0.81 0. 76 1. 93 0.12 -0.73 0.06 基因樣(DAZL)， mRNA/PROD=無精 子癥缺失基因樣 /FL=gb: U66726. 2
gb:NM_001351. 1 gb: U65918. 1 gb:U66078. 1
NM-022168 人黑素瘤分化相 IFIHl -2. 03 1. 08 -2. 76 0. 83 -0. 10 0. 15 -2. 15 0. 40 關(guān)蛋白 5 (MDA 5), mRNA/PROD=黑素 痼分化相關(guān)蛋白 5
/FL=gb: AY01737 8. 1
gb: NM_022168. 1 gb: AF095844. 1
AF052108 克隆號為 23687 LOC15762 1.49 0.33 0.22 1.02 2.26 0.40-1.33 1.19 的人mRNA序列。7
AI056877 人染色體20上克 LOC20023 0. 11 0.30 -2.37 0. 94 1. 15 0.18 -1.35 0. 75 隆號為RP4- 0 530115的DNA序 歹1I,包含蛋白酪 氨酸磷酸酶非受 體型1(EC 3.1. 3. 48)的 PTPNl 基因 3' 端、類似于胎盤 蛋白 DIFF40、 RPL36 ( 60S核糖 體)的新蛋白基 因 表V 在實例10中概沭條件下定形內(nèi)胚層標(biāo)志物的相對表汰。所有倌都相對于第
1組(對照)講行歸一化。
表Vi :Η9胚胎干細(xì)胞衍牛的定形內(nèi)胚層期細(xì)胞(在Matrigelim或MEFS+/-wnt-3A 卜.絲)細(xì)白脾舶一傾碰(mm^M^). 人染色體 6pll. 1-12. 2 上克隆 -3.72313 1. 68755 -0.37308 1. 38E-03
號為RP1-181C24的DNA序列，
包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白5的BMP5
基因的3'端、表達(dá)序列標(biāo)簽、
序列標(biāo)簽位點和基因組勘測序
列/FL=gb:M60314. 1
gb: NM-021073. 1
十四坑基富丙氨酸蛋白激酶C -0. 71724 3. 51728 0.335725 4. 29E-03基質(zhì)(MARCKS，80K-L) /FL=gb:M68956. 1 gb: Dl0522.1 gb: NM-002356.4
脅想蛋白 FLJ23403-1.45618 1. 81423 -2.31327 1. 20E-02
/FL=gb: NM-022068.1
肝細(xì)胞核因子 4 α-4. 26574 1.7879 0.445241 3. 25Ε-02
與 LlCAM 同源的人細(xì)胞粘附分 -0.541188 2.1751 -2.5002 1. 16Ε-03
子(Li的高度同系物)(CHLl)
的mRNA/PROD=與LlCAM同源的
細(xì)胞粘附分子(Li的高度同系
物)/FL=gb: AF002246. 1
gb: NM-006614.1
基質(zhì)金屬蛋白酶 14 (嵌入膜-2. 05734 2.36236 -0.5185 1. 66E-02
內(nèi))/FL=gb: U41078. 1 gb:NM.004995. 2
人血型糖蛋白 B (包括 Ss 血 -0.947308 3. 26089 0. 180293 4. 83E-04 型)(GYPB), mRNA/PROD=血型 糖蛋白 B 前體/FL=gb: J02982.1 gb: NM-002100. 2
WAS 蛋白家族成員 2-2. 18746 1. 99129 -1. 05968 4. 00E-03
/FL=gb: NM-006990. 1 gb: AB026542. 1
人卷曲相關(guān)蛋白(FRZB),0. 56502 5. 7261 3. 67629 1.75E-02
mRNA/PROD=卷曲相關(guān)蛋白 /FL=gb:U24163. 1 gb: U68057. 1 gb: NM.001463. 1 gb: U91903. 1
人谷氛酸脫羧酶 1(腦，-1.68495 2.27067 -0. 96944 S. 02E-03
67kD) (GADl)轉(zhuǎn)錄變體
GAD25, niRNA/PROD=谷氨酸脫羧
酶1，同工型GAD25
/FL=gb: NM-013445.1
gb: AF178853. 1 gb: BC002815. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽0,812766 5. 93144 3.91314 4. 15E-02
克隆號為 23736 的人 mRNA 序列 -0.047182 5. 79006 4.50744 1. 74E-02人血型糖蛋白E (GYPE) ,-2.01601 1.79002 -1. 50134 1. 97Ε-02
mRNA/PROD=血型糖蛋白E /FL=gb: NM-002102. 1 gb: M29610. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽1.06767 5.63319 3. 12487 2. 00E-02
λ達(dá)^列標(biāo)簽-1.41162 2. 5396 -0.57029 1. 29Ε-02
AFritzmRNA,完整的0.436589 5. 69814 3.91514 1.996-02
cds/PROD=Fritz
/FL=gb: U24163. 1 gb: U68057. 1
gb: NM_001463. 1 gb: U91903. 1
克隆號為 MGC: 4655 的人2.3772 5. 9184 2.47596 1. 20E-02
mRNA,完整的cds/PROD=未知 (克隆號為MGC: 4655的蛋白) /FL=gb:BC004908, 1
KIAA0878 蛋白1.1189 6.41747 4. 78882 2. 01E-02
/FL=gb: NM-014899. 1 gb: AB020685. 1
人 sema 域，免疫球蛋白域-0. 785987 3.69668 1.27624 2. 10E-02
(Ig),短堿性域，分泌，(臂 板蛋白)3E (SEMA3E) ’ mRNA/PROD=seraa域，免疫球蛋 白域(Ig)，短堿性域，分泌， (臂板蛋白)3E /FL=gb: NM-012431. 1 gb: AB002329. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽1.48084 6. 59709 4.81 395 1. 36E-02
noggin /FL=gb: NM-005450. 1 —1.63627 3. 28161 1, 32958 2.53E-02 人作i想蛋白 FLJll316-0. 904749 3.35854 0. 755319 1. 12E-04
(FLJ11316), mRNA/PROD=假想 蛋白 FLJ11316 /FL=gb: NM-018388.1
人血管生成素 2 (ANGPT2),-2. 93044 2.23779 0.59685 3.43E-02
mRNA/PROD=血管生成素2
/FL=gb: AB009865.1
gb: AF004327. 1
gb: NM.001147. 1
人基質(zhì)金屬蛋白酶 14 (嵌入膜 -0. 723489 2.97262 -0. 09689 5. 44E-03
內(nèi))(MMP14), mRNA/PROD=基質(zhì)
金屬蛋白酶14前蛋白原
/FL=gb: U41078. 1
gb: NM-004995. 2
G 蛋白偶聯(lián)受體1.50709 6.65228 5. 05327 2. 00E-02IX 型股原 α 21,27026 5.4659 2.93507 3. 19Ε-03 /FL=gb:NM-001852. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽0.521638 3.93176 0.620223 0. OOE+OO
KIAA1462 蛋白-3.84563 1. 65452 0. 437064 3. 27E-02
人軟骨連接蛋白 1 (CRTLl)，-1.31515 2. 27271 -0. 80521 2. 22E-02 mRNA/PROD=軟骨連接蛋白1 /FL=gb:NM-001884.1 gb: U43328. 1
人溶質(zhì)栽體家族21 (前列腺素0.711428 4. 89808 2.43304 6. 84E-03 轉(zhuǎn)運(yùn)體)成員2 (SLC21A2), mRNA/PROD=溶質(zhì)載體家族21 (前列腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體)成員2 /FL=gb: U70867. 1 gb: NM-005630. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽0.307173 4. 78515 2.65653 1. 72E-02
6-碌酸果糖-2-激酶/果糖-2，6--0. 242865 3. 97929 1. 59985 5. 28E-03 二磷酸酯酶4
人雙特異性碟酸醉 4 (DUSP4)，0. 953857 5.82811 4. 12159 4. 00E-03
mRNA/PROD=雙特異性磷酸酶4
/FL=gb: NM-001394. 2
gb: BC002671. 1 gb:U48807.1
gb: U21108. 1
弱類似于 T00331 假想蛋白-1. 57372 2. 70797 0.443622 6. 74E-03 KIAA0555 (A)的表達(dá)序列標(biāo) 簽
表達(dá)序列標(biāo)簽-3.57414 3.15167 3.37198 8. 82E-03
高度類似于 IHH-人印度刺猬蛋-0.653989 3.22059 0. 590533 5. 18E-03 白前體(人)的表達(dá)序列標(biāo)簽
弱類似于 FCE2 小鼠低親和力免0.494192 5.22522 3.48031 1. 97E-02 疫球蛋白ε FC受體(小家 鼠)的表達(dá)序列標(biāo)簽
同源盒 ΗΒ9-1.65563 3.2238 1. 63092 5. 58Ε-03 /FL=gb: NM-005515. 1
人芳基破酸酯酶E (點狀軟骨0.283004 4. 95903 3.18424 9. 22E-03 發(fā)育不良1) (ARSE), mRNA/PROD=芳基疏酸酯酶E前 體/FL=gb:X83573. 1 gb:NM_000047. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽-0.05909 3. 0455 -0.29817 1.47E-02
人假想蛋白 FLJ23403 -1.48452 1. 97473 -1. 00431 5. 72E-03 (FLJ23403)，mRNA/PROD=假想 蛋白 FLJ23403 /FL=gb: NM-02206.8. 1表達(dá)序列標(biāo)簽 -0.182403 3.01548 -0. 18954 3. 72E-03
介支想蛋白 FLJ230910.323388 5. 25192 3.77987 3. 57E-02
人二狀基肽酶 IV (CD26)-3.61145 0.760585 -1.25595 3.07E-02
mRNA,完整的 cds/PROD=二肽 基肽酶 IV /FL=gb:M74777. 1
假想蛋白 FLJ210320. 355672 4.67756 2. 61753 4. 59E-02
人 KelliS(KEL),-2. 20519 1.89439 -0.38393 1.91E-02
mRNA/PROD=ICell 血型抗原 /FL=gb: BC003135.1 gb: NM-000420. 1
絲氨酸精氨酸二肽富含性剪接0.7481 5.68934 4.27169. 2.97E-03
因子5
人前列腺分泌蛋白 57 mRNA,-3. 01313 1. 46338 -0. 40767 1. 97E-02
完整的 cds/PR0D=PSP57 /FL=gb: U22178.1
人 KIAA0878 蛋白(ΠΛΑ0878)，2.0265 7. 00937 5.65368 2. 85E-02
mRNA/PROD=KIAA0878 蛋白 /FL=gb: NM.014899.1 gb: AB020685.1
人隱蔽 niRNA’ 完整的0. 104874 2. 87319 -0. 67353 1. 61E-03
cds/PROD=隱蔽蛋白 /FL=gb:AF312769.1
克隆號為 NT2RP4002075 的人 0.355743 3.98782 1. 30963 1. 38E-03 cDNA FLJ13221 fis
phorbolin 樣蛋白 MDS019-1. 11756 2. 83853 0. 503523 1. 59E-02
人 KIAA1409 蛋白的 mRNA,部 0.368334 2. 8009 -1. 03191 1. 78E-02 分的 cds/PROD=KIAA1409 蛋白
人 mRNA; cDNA DKFZp434D0818 -2. 63427 1. 64513 -0.3056 2. 52E-02 (來自i隆 DKFZp434D0818)
表達(dá)序列標(biāo)簽0.35393 5. 14775 3.74875 3. 16E-02
人 TBX3-iso 蛋白(TBX3-iso), -2.34566 2. 45238 1. 07038 1. 31E-02 mRNA/PR0D=TBX3-iso 蛋白 /FL=gb:NM-016569.1 gb: AF216750. 1
人染色體 19，粘粒 R31181-0. 2588713. 0636 0. 223926 1. 58E-03
人 GATA-6 的 mRNA,完整的2. 218626. 8609 5.34263 4. 29E-02
cds/PR0D=GATA-6
/FL=gb: U66075. 1
gb:NM-005257. 1 gb: D87811. 1
具有跨腹結(jié)構(gòu)域的人錯蛋白樣 -1.10879 3.93484 2. 81939 1. 29E-02 1 (ANKTMl) mRNA
G 蛋白偶聯(lián)受體 490.265509 4.46257 2.50537 2. 19E-02人生長分化因于3 (GDF3), mRNA/PR0D=生長分化因子3前 體/FL=gb: NM-020634. 1 gb: AF263538. 1
人(克隆HSY3RR)神經(jīng)肽Y受 體(NPYR) mRNA,完整的 cds/PR0D=神經(jīng)肽Y受體 /FL=gb:L06797. 1 gb: NM_003467. 1 gb: AF025375. 1 gb: AF147204. 1 gb:M99293.1 gb: L01639. 1 人VI型膠原a 2鏈前體 (C0L6A2) mRNA,完整的 cds 選 擇性剪接體/PR0D=VI型膠原a 2 鏈前體/FL=gb: AY029208. 1 表達(dá)序列標(biāo)簽 表達(dá)序列標(biāo)簽 人假想蛋白FLJ10718 (FLJ10718) , mRNA/PRODH叚想 蛋白 FLJ10718 /FL=gb: NM-018192. 1 人Rho GTP酶激活蛋白6 (ARHGAP6)轉(zhuǎn)錄變體2， mRNA/PR0D=Rho GTP 酶激活蛋 白6同工型2 /FL=gb:AF022212.2 gb: NM-001174.2 斯鈣素 1 /FL=gb:U25997. 1 gb:NM_003155.1 gb:U46768.1 人血型糖蛋白HeP2 mRNA,部 分的cds/PR0D=血型糖蛋白 HeP2
克隆號為NT2RP3000197的人 cDNA FLJ12993 fis 人早老素穩(wěn)定因子b (PSF) mRNA,完整的cds選擇性剪接 體/PR0D=早老素穩(wěn)定因子b /FL=gb: AY113699. 1 人血型糖蛋白Erik STA (GPErik)基因完整的 cds/PR0D=血型糖蛋白Erik (STA) /FL=gb: U00178. 1 BRPF3
1.67253
1.77461
1. 7011
-0. 349726 -0. 903317 2. 60483
-1.10389
2.41135 -0. 843493
0. 147259 -0. 86173
-1.19362
-2.8472
5. 34944 2.87486 8.62E-05
6.70301 5.47995 3. 00E-02
5.33126 2.84458 5. 91E-03
3. 29119 1.89777 7. 10633
0.824929 -1. 36429 5.55242
1. 83053 -1.28521
4. 11E-03 6. 84E-03 1. 41E-02
1. 28E-02
29563 6.14284 2. 51E-02
2.71108 0.233547 2. 98E-04
4. 12241 2.06949 6. 84E-03
2. 85614 0. 56745 6. 09E-03
2.17108 -0. 45439 1. 45E-04
1.75573 0. 369397 8. 62E-05 人LIM同源盒9的部分LHX9基-2. 24861.64952-0. 134247. 89E-■03因，3UTR。人LYST相互作用蛋白LIP3-0.6821492. 34271-0. 312539. 87E-■03mRNA,部分的 cds/PR0D=LYST相互作用蛋白LIP347kDa假想蛋白-0.1239373. 29141.052473. 72E- 03人蛋白 S (a) (PR0S1),0.5776044.000351. 78837. 89E-■03mRNA/PR0D=蛋白 S (a)/FL=gb: M15036. 1gb: NM-000313. 1表達(dá)序列標(biāo)簽-1..637110. 915477-2.153281. 83E--02原鈣粘蛋白10]..767185. 15032.985692. 52E--02KIAA1511 蛋白0. 6202783. 868861.575431. 86E-■03克隆號為NT2RP4002075的人0.2827853. 441781. 081781. 31E-■03cDM FLJ13221 fis人成纖維細(xì)胞生長因子受體4-]..723852.266740, 7472396. 86E-■03可溶剪接體(FGFR4) mRNA,完整的cds/PR0D=成纖維細(xì)胞生長因子受體4可溶剪接體/FL=gb: NM-022963. 1gb: AF202063. 1X75208 /FEATURE=cds-]..367292.604561. 082041. 58E- 02/DEFINITION蛋白酪氨酸激酶受體 HSPTKR 人 HEK2 mRNA人趨化因子受體CXCR4 mRNA,！. 305576. 729695. 669333. 31E-■02完整的cds/PR0D=趨化因子受體 CXCR4 /FL=gb: AF348491. 1KIAA1415 蛋白0.1858543. 703461.742557. 78E--04表達(dá)序列標(biāo)簽-0.0483353. 117860. 8364481. 29E--02人斯鈣素1 (STC1)，！. 394356. 557375.280072. 19E--02mRNA/PR0D=斯鈣素 1/FL=gb:U25997. 1gb: NM-003155. 1 gb; U46768. 1人髙速泳動族蛋白-R mRNA,完]1. 046953. 27860. 0952862. 11E--02整的cds/raOD=高速泳動族蛋白-R /FL=gb:AF176039. 1中等類似于ALIM-人ALU亞家1. 103581.66331-0.983713. 37E--02族SB2序列污染警告條目
(人)的表達(dá)序列標(biāo)簽
人抑制蛋白P 1 (ARRB1)轉(zhuǎn)錄變-0.1588442.41791-0.409151.12E--02體1，mRNA/PR0D=抑制蛋白P1，同工型A/FL=gb: BC003636.1gb: AF084040. 1gb: NM-004041. 2表達(dá)序列標(biāo)簽-1.343991.80279-0. 445291.60E-■03人ex 1 (II)前膠原3'端C端三0i. 859824. 19352. 156571.09E-■02螺旋和C端非螺旋結(jié)構(gòu)域mRNA/PROD=al(II)前膠原(313AA; AA 975-271c)/FL=gb: NM-001844. 2人假想蛋白DKFZp564B0521.477734.424792. 003261.16E-■03(DKFZp564B052) niRNA. /PR0D=假想蛋白DKFZp564B052/FL=gb: NM-030820.1睪丸增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄物(BAX抑-0.6952282. 993281. 316791.17E--03制因子1)人軸突成束和延伸蛋白《11.864334. 713542. 203158.62E- 05(推骨蛋白I) (FEZ1)轉(zhuǎn)錄變體1, mRNA/PR0D=推骨蛋白1,同工型 1 /FL=gb: U60060. 1gb: U69139. 1 gb: NM-005103. 2人基質(zhì)金屬蛋白酶15 (嵌入膜-0.2985043. 445821. 83364.80E--03內(nèi))(MMP15)，mRNA/PR0D=基質(zhì)金屬蛋白酶15前蛋白原/FL=gb:D86331. 1gb: NM-002428. 1硫酸乙醜肝素蛋白聚糖2 (基-2.533270. 924726-0. 972124.31E--02底膜蛋白聚糖)/FL=gb: M85289. 1gb: NM-005529. 2Adickkopf (非洲蟾蜍)同系0.9814693. 707161.090141.76E--03物 1 (DKK1)’mRNA/PROD=dickkopf (非洲蟾蜍)同系物1/FL=gb: AF177394.1gb: NM-012242.1gb: AF127563. 1表達(dá)序列標(biāo)簽-0.8014873. 373422. 213931.22E--02表達(dá)序列標(biāo)簽-2；.576261. 402310. 0504936.,60E--03表達(dá)序列標(biāo)簽0.4995794. 105412. 399344.,29E--03 人作i想蛋白 FLJ11S60-0. 044112 3.42017 1.80688 3.77E-03
(FLJ11560), mRNA/PROD=假想 蛋白 FLJ11560 /FL=gb: NM-025182. 1
叢蛋白 A20.930527 4.36203 2. 74167 1. 52E-02
AmRNA; cDNA DKFZp547H2361.37193 4. 24502 2.08129 5. 37E-04
(來自 1隆010 2 54711236 ) /PROD=假想蛋白
人胱抑素C (腦淀粉樣血管病2.08601 5. 30525 3.51965 2. 20E-03
與腦出血)(CST3),
mRNA/PROD=胱抑素C (腦淀粉
樣血管病與腦出血)
/FL=gb: NM-000099.1
中等類似于 NFY-C (人)的表 -0.749407 2. 00148 -0.24268 2. 34E-03 達(dá)序列標(biāo)簽
表達(dá)序列標(biāo)簽2. 54243 5. 75201 3. 97307 2. 60E-02
人唾液酸轉(zhuǎn)移酶(STHM),-0.68709 2. 89586 1. 50348 3.70E-02
mRNA/PROD=唾液酸轉(zhuǎn)移酶 /FL=gb: U14550. 1 gb:腿-006456. 1
人 SG2NAP 同工型 mRNA,部分 -1.15566 1.13989 -1.53439 1. 55E-02 的 cds/PR0D=SG2NA β 同工型
人假想蛋白 FLJ128381.49091 4.80138 3. 15205 2. 63Ε-02
(FLJ12838) , mRNA/PROD=假想 蛋白 FU12838 /FL=gb: NM-024641. 1
人溶質(zhì)栽體(SLC25A18) mRNA, 0.403706 2. 12385 -1.10043 1. 78E-02 完整的cds;線粒體產(chǎn)物的核 基因/PROD=溶質(zhì)載體 /FL=gb: AY008285. 1
KIAA0346 蛋白-1.34736 2. 49605 1.41497 3. 90E-03
克隆號為 23826 的人 mRNA 序列 1.80782 4. 07112 1. 44315 2. 28E-04
人受體酪氨酸激酵樣孤兒受體 1.53333 4. 73839 3. 05612 1. 63E-02
2 (R0R2), mRNA/PROD=受體酪
氨酸激酶樣孤兒受體2
/FL=gb:M97639. 1
gb: NM.004560. 1
人 MYC 相關(guān)鋅指蛋白(嘌呤結(jié) -0.055569 2.67075 0.511292 2. 63E-02 合轉(zhuǎn)錄因子)(MAZ), mRNA/PROD=MYC相關(guān)鋅指蛋白 (嘌呤結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子) /FL=gb: D85131.1 gb: NM_002383. 1克隆號為 BGGI12000693 的人 0. 677905 3.33728 1. 12499 1. 12E-04 cDNA FLJ30081 fis,弱類似于 多聚同源異形體近端染色質(zhì)蛋 白。
人極長鏈脂肪酸延長酶0.099979 3.23372 1. 50802 2. 59E-03
(FENlElo2, SUR4Elo3,酵 母)樣 2 (ELOVL2)， mRM/PROD=極長鏈脂肪酸延長 酶(FENlElo2，SUR4Elo3酵-母)樣 2 /FL=gb: NM-017770. 1
人促曱狀腺素釋放激素(TRH) ’ -1.65672 1.46994 -0.25839 3. 02E-02 mRNA/PROD=促曱狀腺+釋放激 素/FL=gb: NM-007117. 1
弱類似于長型 A46302 PTB 相關(guān) 0. 894051 4.21835 2. 69535 1. 57E-02 剪接因子(人)的表達(dá)序列標(biāo) 簽
人胚胎肌球蛋白堿性輕鏈1.3489 5. 11354 4. 03961 1. 61E-02
MLClemb基因的啟動子和外顯 子1
人微精原蛋白 P (MSMB),-2. 379041. 3101 0. 169915 2. 46E-02
mRNA/PROD=微精原蛋白P /FL=gb: NM-002443. 1
克隆號為 HEMBA1000561 的人 -1. 12944 2.02889 0.364373 0. OOE+OO ,cDNA FLJ11390 fis,弱類似于 鋅指蛋白91。
弱類似于 ALU8-人 ALU 亞家族2. 76608 6. 07949 4.57766 1. 93E-02
SX序列污染警告條目(人)的 表達(dá)序列標(biāo)簽
克隆號為 THYR01000279 的人 -2.92389 0. 51764 -0.85322 8. 08E-03 cDNA FLJ13810 fis
克隆號為 MGC: 5057 的人δ-氨1. 3099 4. 44525 2. 76918 7. 69Ε-03
基乙酰丙酸脫水酶mRNA,完整 的cds/PROD= δ -氨基乙酰丙酸 脫水酶/FL=gb: BC000977. 1 gb:M13928. 1 gb: NM—000031. 1
人腎特異性膜蛋白 NX-171. 91929 5. 08917 3.44968 6.91E-03
mRNA,完整的CdsZI5ROD=腎特 異性膜蛋白NX-17 /FL=gb: AF229179.1 人載脂蛋白 C-I (APOCl),3. 24954 6.71073 5.50997 2. 16E-02 mRNA/PROD=載脂蛋白C-I前體 /FL=gb:NM-001645. 2
表達(dá)序列標(biāo)簽1.38635 4. 93112 3. 83641 1. 39E-02
克隆號為 FCBBF2004788 的人-3.58002 -0.48718 -2.00751 1.46E-02 cDNA FLJ34035 fis。
克隆號為 IMAGE: 3509274 的人0.493686 2.94923 0.794513 1. 82E-02 mRNA,部分的cds
人假定甾醇還原酶 SR-1.66857 4.3767 2. 47833 5. 37E-04 1 (TM7SF2) mRNA,完整的 cds/PROD=假定甾醇還原酶SR-1 /FL=gb:AF096304.1
B細(xì)胞κ輕肽基因增強(qiáng)子核因2.91463 6. 48938 5.47812 1. 97E-02
子抑制因子α
/FL=gb: NM-020529. 1
gb: BC002601. 1 gb: BC004983. 1
gb:M69043. 1
假想蛋白 FLJ126660. 215767 3. 10249 1.40459 1.91E-02
人外胚層發(fā)育不良1,止汗 . %6Π 4.22895 3. 07833 1. 01Ε-02
(EDl) , mRNA/PROD=外胚層發(fā)育
不良1，止汗
/FL=gb: AF060999.1
gb: NM-001399.1
gb: AF040628. 1 gb: AF061189. 1
糖蛋白 M6A /FL=gb:D49958. 10.274378 3. 59045 2. 3278 2.64E-02
表達(dá)序列標(biāo)簽1. 04714 3.87608 2.12752 3.75E-02
▲達(dá)^列標(biāo)簽-1.48489 1. 371 -0.35043 1.88E-03
弱類似于 KIAA1330 蛋白(人)-0.925232 2. 41149 1.18187 2. 65E-03 的表達(dá)序列標(biāo)簽
47kDa 假想蛋白0.156484 2. 78771 0. 861726 2.60E-02
人假想蛋白 FLJ32835-0. 595622 4.84785 3.94683 3. 34E-02 (FLJ32835)的 mRNA/FL=gb: NM.152506. 1
人 GS1999 全長 mRNA,完整的0.137029 2.75189 0.849942 0. 00E+00 cds/FL=gb: AB048286. 1
人肌腱抗原(結(jié)合腕蛋白 C，3. 96862 5. 66572 2. 85391 1.39E-02
肌鏈抗原)(HXB)的
mRNA/PROD=肌腱抗原(結(jié)合腕
蛋白C,肌鏈抗原)
/FL=gb: M55618. 1
gb: NM-002160. 1人 PiglO (PIGlO) niRNA,完整 0.129454 2. 86013 1. 09765 1. 16E-03
的 cds/PROD=PiglO
/FL=gb: AF059611. 1
gb:AF010314. 1
gb: NM-003633. 1
gb:BC000418.1 gb: AF005381. 1
人膜聯(lián)蛋白 A6 (ANXA6)轉(zhuǎn)錄變 3.89026 6.43752 4.49981 8. 81E-04 體1, mRNA/PROD=媒聯(lián)蛋白VI 同工型 1 /FL=gb: D00510. 1 gb: J03578. 1 gb: NM-001155. 2
人 c-mer 原癌基因賂氛酸激酶 1.78994 4.92901 3.61665 1. 84E-02
(MERTK)， mRNA/PROD=c-mer 原
癌基因酪氨酸激酶
/FL=gb: NM—006343. 1
gb: U08023. 1
人半胱天冬酵樣細(xì)胞凋亡調(diào)控 0.434199 5. 04863 5.2167 2. 46E-02 蛋白2 (clarp) mRNA選擇性剪 接，完整的cds/PROD=半胱天 冬酶樣細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白2 /FL=gb: AF005775,1
人胚胎肌球蛋白堿性輕鏈1.94171 5.24959 4. 11475 2. 11E-02
(MLCl) mRNA,完整的
cds/FL=gb:M36172. 1
gb: M24121. 1 gb: NM-002476. 1
人碑脂醜肌醇-4-碌酸酯 5-激1.34876 4.12788 2. 46657 3. 66E-03
酶 I 型 β (ΡΙΡ5Κ1Β)， mRNA/PROD=磷脂酰肌醇-4-磷酸 酯5-激酶I型β /FL=gb: NM-003558.1
人 mRNA; cDNA DKFZp434E0821.36443 4.34866 2. 94283 2. 92E-03
(來自 λ隆 DKFZp434E082 )
人肌營養(yǎng)不良蛋白(Duchenne 1. 40427 4.41881 3. 04441 1. 83E-02
型和Becker型肌營養(yǎng)不良)，
包括 DXS142、DXSl 64、
DXS206、 DXS230、 DXS239、
DXS268、 DXS269、 DXS270、
DXS272 (DMD),轉(zhuǎn)錄變體
Dp427p2, mRNA/PROD=肌營養(yǎng) 不
良蛋白Dp427p2同工型
/FL=gb: NM-004010. 1 克隆號為 MGC: 2843 的人類似于 -1.16073 1. 9994 0. 961706 1.89E-02
脂肪酶蛋白的mRNA,完整的
cds/PROD=類似于脂肪酵蛋白
/FL=gb: NM-020676.1
gb: BC001698. 1
基因簇，包括 AB002344:人2. 15679 4.91332 3.47797 7. 39E-03
KIAA0346基因mRNA,部分的
cds/cds=(0,4852)
/gb=AB002344 /gi=2280479
/ug=Hs.103915 /len=6121
基因簇，包括2.12419 4. 48236 2.66555 1. 50Β-02
N80935:zb07g06. si AcDNA 3'
端/clone=IMAGE-301402
/clone_end=3' /gb=N80935
/gi=1243636 /ug=Hs.22483
/len=527
纖維蛋白溶酶α2.99108 5. 46095 3.76442 1. 31E-03
弱類似于 Z132_人辭指蛋白 13 1.04865 3.65906 2. 12166 2. 43Ε-02 (人)的表達(dá)序列標(biāo)簽
人核心組蛋白 macroH2A2. 21.67293 4. 73906 3. 66212 3. 62E-02
(MACROH2A2)，mRNA/PROD=核心
組蛋白 macroH2A2. 2
/FL=gb:AF151534. 1
gb: NM-018649. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽-0.146413 2.69334 1. 39451 1. 02E-02
人 rhoGDImRNA，完整的0.019358 1. 75075 -0. 65155 1. 85E-02
cds/PROD=人 rho GDI
/FL=gb: M97579. 1 gb: D13989. 1
gb: NM-004309.1
90kD 熱休克蛋白 Ια1.69225 4.20576 2.60887 2. 10Ε-02
人含 BTB (ΡΟΖ)結(jié)構(gòu)域蛋白 21. 100853. 7628 2.32464 1. 85Ε-02
(BTBD2), mRNA/PROD=含 BTB (ΡΟΖ)結(jié)構(gòu)域蛋白2 /FL=gb: NM-017797. 1
人長型 mandaselin 的 mRNA， -0. 148053 2. 58361 1.2296 1. 57E-02 完整的cds/PROD=長型 mandaselin /FL=gb: AY048775. 1
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3 -0. 837261 1. 90254 0. 560225 8. 83E-04 (急性期反應(yīng)因子)人淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物基因 0. 866364 4. 91832 4. 92642 2. 78E-02
座 E (LY6E), mRNA/PROD=淋巴
細(xì)胞抗原6復(fù)合物基因座E
/FL=gb: U42376. 1
gb: NM-002346. 1 gb: U56145. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽-1.24632 1.09042 -0.61316 4. 05E-02
克隆號為 IMAGE: 4047715 的人 -2.508161.81 1.52693 2.63E-02
mRNA
基因簇，包括 AB002344:人1.89578 4.61333 3. 31717 1. 12E-02
KIAA0346基因mRNA，部分的
cds/cds=(0, 4852)
/gb=AB002344 /gi=2280479
/ug=Hs. 103915 /len=6121
人焦剛毛(果蠅)樣(海膽肌 4.23317 6.74774 5. 25403 5. 12E-03
動蛋白束蛋白同系物樣)
(SNL), mRNA/PROD=焦剛毛(果
蠅)樣(海膽肌動蛋白束蛋白
同系物樣)/FL=gb: BC000521. 1
gb:NM-003088. 1 gb: U03057. 1
gb:U09873. 1
人 mRNA; cDNA DKFZp586L0120 -2.72593 1. 58998 1. 27994 4. 54E-02 (來自克隆 DKFZp586L0120)
人絲裂原活化蛋白激酶 100. 647994 3.46459 2.28644 6. 65E-03
(MAPKlO), mRNA/PROD=絲裂原
活化蛋白激酶10
/FL=gb: U07620. 1 gb: U34819. 1
gb: U34820. 1 gb: NM-002753. 1
人跨膜賂氛酸激酶mRNA,完整 -0.006089 2. 96035 1. 93237 7. 69E-03 的cd s/PROD=酪氨酸激酶 /FL=gb:L08961. 1
人 mRNA; cDNA DKFZp762H1852. 83663 5. 30784 3. 79206 6. 22E-03
(來自克隆 DKFZp762H185 )
路氨酸3單氧化酶/色氨酸5單 3.48271 6.19368 4. 92556 2. 11E-02 氧化酶激活蛋白η多肽
人 mRNA; cDNA DKFZp434K0621 0.581419 3.38088 2. 21428 3.89E-02 (來自克隆
DKFZp434K0621 )；部分的 cds
弱類似于 ALUF-人！?。?！ ALU F -1.03247 1. 75349 0. 587598 2. 11E-02
類警告條目?。?！(人)的表達(dá)序
列標(biāo)簽
與 PCTAIRE 2 結(jié)合的 tudor 重2.15771 4.69127 3. 27451 2. 63E-02
復(fù)結(jié)合子(Trap) 克隆號為 HB-2 的人mRNA序列-0.503949 2. 27896 1.25171 3. 01E-02
^艮想蛋白 FLJ23091-0. 76092 3. 70916 3. 04154 2.45E-02
表達(dá)序列標(biāo)簽-0.403665 2.01868 0.643615 5. 11E-04
i達(dá);^列標(biāo)簽2.14401 4.70353 3. 47114 3. 15E-03
人 G 蛋白信號調(diào)節(jié)因子 53. 0091 5.37511 3.95 132 1. 29E-03 (RGS5)的mRNA,完整的 cds/PROD=G蛋白信號調(diào)節(jié)因子 5 /FL=gb: AF493929.1
內(nèi)皮素受體 A 型-1.83423 2.54948 1. 95432 1. 51E-02 /FL=gb: NM-001957.1 gb:L06622. 1
人胚胎骨肌球蛋白輕鏈0.690058 3.3896 2.36018 3. 27E-02 1 (MLCl) , OiRNA/PROD=肌球蛋白 輕鏈1
人 Kruppel 樣因子 8 (KLF8),0. 326119 2.825 1. 63929 3. 92E-02 mRNA/PROD=Kruppel 樣因子 8 /FL=gb: U28282. 1 gb: NM-007250. 1
假想蛋白 DKFZp434F23220. 070576 2.58185 1.42121 5. 81E-03
人肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子 2; LF-B3;-1.12537 3.45355 2. 54347 1. 15E-02 肝細(xì)胞核因子變體(TCF2),轉(zhuǎn) 錄變體a, mRNA/PROD=轉(zhuǎn)錄因 子2，同工型a /FL=gb: NM-000458. 1
H2A 組蛋白家族成員 X1.37085 2.48515 -0.04057 1. 34E-02
人 Hl 組蛋白家族成員 X3.21701 5.68105 4. 50969 4. 29E-03 (HlFX)，mRNA/PROD=Hl 組蛋白 家族成員 X /FL=gb: D64142. 1 gb: BC000426. 1 gb: NM-006026.1
弱類似于 KIAA1399 蛋白(人)-0.831241 2. 82364 2.79997 4. 18E-02 的表達(dá)序列標(biāo)簽
人 PNAS-145 mRNA,完整的2.84962 5.38084 4. 2868 8. 61E-03
cds/PROd=PNAS-I45
/FL=gb: U03105. 1
gb: NM-006813. 1
gb: AF279899.1
人紅細(xì)胞嫉蛋白帶 4. 9-0. 306603 2.11391 0. 923806 4. 81E-03
(dematin) (EPB49),
mRNA/PROD=紅細(xì)胞膜蛋白帶
4. 9 (dematin)
/FL=gb: NM-001978.1
gb: U28389. 1表達(dá)序列標(biāo)簽0.783545 3.23146 2.07738 2.13E-02
▲達(dá)^列標(biāo)簽1.17515 3.61815 2.46265 1.56E-03
nudix (核苷二騎酸連接部分2.09472 5.82355 5.68859 3.63E-02
X)型基元4
來源于人染色體 22 的新-0,533665 3. 44679 3.05803 3. 99E-02
mRNA/PROD=假想蛋白
人假定核因子部分 mRNA/PROD= 1. 55224 3. 89366 2.67866 1.53E-03 作i定核因子 /FL=gb: NM-017688.1
人 BCL2 腺病毒 ElB 19kD 相互 4.51142 6.99506 5. 92755 2. 25E-03
作用蛋白3 (BNIP3)、核基因
編碼線粒體蛋白的
mRNA/PR0D=BCL2 腺病毒 ElB
19kD相互作用蛋白3
/FL=gb: AF002697.1
gb: NM.004052. 2 gb: U15174. 1
人骨形態(tài)發(fā)生蛋白 5(BMP5)，-0.6099 1,76351 0.614791 6. 46E-03
mRNA/PROD=骨形態(tài)發(fā)生蛋白5 /FL=gb:M60314. 1 gb: NM-021073. 1
人核受體亞家族 0 組 B 成員-0.213822 4. 14059 3.29782 3. 42E-02
1 (NROBl) ’ mRNA/PROD=腎上腺 發(fā)育不良蛋白 /FL=gb:NM_000475.2
A mRNA; cDNA DKFZp434P2281. 768464.196 3.11284 1. 23E-02
(來自克隆 DKFZp434P228)
人菌毛蛋白樣轉(zhuǎn)錄因子3.14467 5.51066 4.38212 3. 80E-03
(PILB)，mRNA/PROD=菌毛蚤白 樣轉(zhuǎn)錄因子/FL=gb: AF122004. 1 gb:NM-012228.1
人補(bǔ)體成分 5 (C5),-1.89639 1.65637 1.59643 1. 74E-02
mRNA/PROD=補(bǔ)體成分5 /FL=gb: M57729.1 gb: NM一001735. 1
人銜接因子相關(guān)蛋白復(fù)合體3 -0. 208283 2.17404 1.07398 1. 39E-02 β 2 亞基(ΑΡ3Β2) , mRNA/PROD= 街接因子相關(guān)蛋白復(fù)合體3 β2 亞基/FL=gb: AF022152. 1 gb: NM-004644.1 gb:U37673. 1人動力蛋白’軸絲’輕肽0.458271 2.88755 1.8494 3.66E-03
4 (DNAL4) , mRNA/PROD=動力蛋
白，軸絲，輕肽4
/FL=gb: BC002968. 1
gb: NM-005740. 1
人類似于 RIKEN cDNA0.087468 2.45867 1. 42701 3. 35E-03
C330013D18的基因，克隆號 MGC: 11226，mRNA,完整的 cds
克隆號為 HSI15841 的人-2.30948 1.62817 2.24143 4. 15E-02
cDNA: FLJ22731 fis。
表達(dá)序列標(biāo)簽0.532996 4.6172 3.79228 2. 76E-02
編碼受體 CXCR4 的人 CXCR4 基3.11086 7.24917 6.36084 3. 13E-02
因
斯鈣素 12.48686 6. 20245 5.70081 4. 94E-02
KIAA0761 蛋白-2.09591 1.57935 1.05907 1. 86E-02
表達(dá)序列標(biāo)簽-1.16374 2. 24964 2.52108 3. 83E-02
克隆號為 TESTI2022338 的人3.02587 6.7146 6. 15456 3. 88E-02
cDNA FLJ36116 fis。
克隆號為 MGC: 24252-1. 53346 2.53854 1. 59251 3. 91E-03
IMAGE: 3932604 的人 mRNA，完 整的cds/PROD=未知(克隆號 為MGC: 24252的蛋白) /FL=gb: BC014364. 1
克隆號為 PLACE1001280 的人 -1.90184 1.76129 1.16856 1.47E-02 cDNA FLJ13392 fis
類似于 ras 相關(guān)蛋白 RAB17 的1.70617 5. 11419 4.73391 2. 71E-02
人假想蛋白FLJl2538
(FLJ12538)的 mRNA/PROD=類似
于ras相關(guān)蛋白RAB17的假想
蛋白 FLJ12538
/FL=gb: AL136645.1
gb: NM-022449.1
人染色體 10 上克隆號為 RPll- -0. 889422 2.90076 2.11955 3. 52E-02 446H13的DNA序列，包含類似 于KIAAl059的新蛋白基因(小 鼠VPSlO結(jié)構(gòu)域受體蛋白 SORCS的直系同源基因)3' 端、RPL23A (60S核糖體蛋白 2 3A )假基因、表達(dá)序列標(biāo)簽、 序列標(biāo)簽位點 克隆號為 MGC: 5162 的人滑膜肉-1.57209 1. 39869 2. 12662 6.84E-03
瘤X斷裂點1，mRNA,完整的
cds/PROD=滑膜肉瘤X斷裂點1
/FL=gb: BC001003. 2
gb: NM-005635. 1
克隆號為 MGC: 8506 的睪素 3 人-2. 778 0. 563149 1. 66935 1. 87E-02
類似物的mRNA，完整的
cds/PROD=睪素3類似物
/FL=gb: NM-016950. 1
gb: BC000460. 1 gb: BC003017. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽0.502949 3.0682 2.72874 2. 02E-02
克隆號為 TESTI2008405 的人1.49644 3.87336 3.68478 6.89E-03 cDNA FLJ32963 fis。
三合蛋白/FL=gb: U18985. 1-1.61408 0.713083 0.566175 1.87E-02 gb: NM-006073. 1
Aadlican mRNA,完整的0.872786 3. 20404 3.02406 4.21E-02
cds/PROD=adlican
/FL=gb: AF245505. 1.
人肝素結(jié)合細(xì)胞因子 mRNA,完3.55275 5. 93819 5.68363 1. 89E-02 整的cds/PROD=肝素結(jié)合細(xì)胞 因子/FL=gb: NM-002391. 1 gb: M69148. 1
克隆號為 MGC: 12411 的人滑膜-0.806785 1.90972 2. 5215 4. 17E-02 肉瘤X斷裂點4，mRNA,完整 的cds/PROD=滑膜肉瘤X斷裂 點 4 /FL=gb: BC005325.1
表達(dá)序列標(biāo)簽-3.61193 -0. 9408 -1.53439 2.43E-03
表達(dá)序列標(biāo)簽-0.619714 1. 93617 1. 44843 4. 14E-02
表達(dá)序列標(biāo)簽0.446983 3. 14315 2.48676 1. 98E-02
人含黃素單氧化酶 5 (FM05) ,-0. 476203 1.99948 1.55491 3. 73E-02 mRNA/PROD=含黃素單氧化酶5 /FL=gb: L37080. 1 gb: NM-001461. 1
人象肽酶 A mRNA，完整的-0.758987 2.07596 1.20831 3. 00E-02
cds/PROD=氨肽酶 A
/FL=gb:L12468. 1
gb: NM-001977. 1 gb: L14721. 1
人假想蛋白 DKFZp761H1710-0.713164 2. 03145 1.24823 2. 17E-03 (DKFZP761H1710), mRNA/PROD= 假想蛋白 DKFZp761H1710 /FL=gb:NM-031297.1
表達(dá)序列標(biāo)簽-1.94194 0.608912 0. 01 3238 1. 72E-02
人唾液酸轉(zhuǎn)移酶 8 ( α-2，8-多 -1.07243 1. 83889 0.855205 2. 16Ε-02
聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶)D
(SIAT8D)，mRNA/PROD=唾液酸
轉(zhuǎn)移酶8 ( α-2, 8-多聚唾液
酸轉(zhuǎn)移酶)D
/FL=gb: NM-005668. 1
gb: L41680. 1
克隆號為 IMAGE: 5194204 的人 -λ 13256 0. 383746 1.02639 4.55Ε-02 mRNA。
假想蛋白 MGC4342-0.403018 2.01722 1.41263 1. 97E-02
/FL=gb:NM-024329. 1 gb: BC003033. 1
人植物同源結(jié)構(gòu)域指蛋白0.620171 2.95191 2.42296 2. 32E-02
I(PHFl)轉(zhuǎn)錄變體2’
mRNA/PROD=植物同源結(jié)構(gòu)域指
蛋白1，同工型b
/FL=gb: NM.024165. 1
gb: AF052205. 1
α4 輔肌動蛋白0.436893 3.11051 2.23625 5.44Ε-03
人 PCTAIRE 蛋白激酶2.38171 4.87071 4. 16957 2. 90Ε-03
1(PCTKl), mRNA/PROD=PCTAIRE 蛋白激酶1 /FL=gb:NM-006201. 1
人染色體 9 上克隆號為 RPll- 0. 167347 2.56439 1.93736 3. 93E-02 165F24的DNA序列’包含新蛋 白(類似于果蠅CG6630和 CG11376、KIAA1058,大鼠 TRG)的基因3'端、RPLl2 (60S核糖體蛋白Ll 2)假基 因、表達(dá)序列標(biāo)簽、序列標(biāo)簽 位點、基因組勘測序列和C...
胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3 0.921068 3.60279 2.67905 4. 80E-02 /FL=gb: NM-000598. 1
克隆號為 IMAGE: 3840937 的人 3.59778 6.12936 6. 92649 8. 62E-05 mRNA,部分的cds/PROD=未知 (克隆號為IMAGE: 3840937的 蛋白)
人磷酸葡萄糖變位酶4.74364 7.09524 6.43056 2. 21E-02
1 (PGMl) , mRNA/PROD=磷酸葡萄
糖變位酶1
/FL=gb: NM-002633. 1
gb: BC001756. 1 gb: M83088. 1
載脂蛋白 C-I2.77701 5.23054 4.44049 3. 39E-02人胰島素誘導(dǎo)基因2.11462 4.44128 3. 77765 3. 21E-02
1 (INSIGl), mRNA/PROD=胰島素 誘導(dǎo)基因1 /FL=gb: NM-005542.1
人 a6(IV)膠原(C0L4A6)0. 798849 3. 23623 2.41372 1. 38E-03
mRNA,完整的 cds/PROD=IV 型 膠原 /FL=gb: U04845. 1
人 ex-1, 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶1.314793. 6699 2.90742 3. 48E-02
mRNA,完整的 cds/PROD= α ， 6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 /FL=gb: AB049740. 2
中等類似于 Six5 (小家鼠)的 0.434259 2.81512 1.9556 1. 23E-02 表達(dá)序列標(biāo)簽
溶/t載體家族 2 (易化葡萄糖5. 23156 7. 63734 6. 74444 1. 99B-02
運(yùn)栽體)成員3 /FL=gb: NM-006931. 1 gb: M20681. 1
人酸性神經(jīng)鞘磷脂酶(ASM)1. 03965 3.45689 2.52125 2. 62E-02
mRNA,完整的cds/PROD=酸性
神經(jīng)鞘磷脂酶
/FL=gb: NM-000543. 1
gb: M59916. 1
弱類似于未命名蛋白產(chǎn)物3.0131 5. 41021 4.46614 4. 79E-03
(人)的表達(dá)序列標(biāo)簽
克隆號為 ADRGL2002753 的人 0.137476 -1.9718 -4. 73502 2. 23E-03 cDNA FLJ33178 fis。
克隆號為 MGC: 14611 的人曱狀 2.46289 -0. 34647 -1. 96791 3. 05E-02 旁腺激素樣激素mRNA,完整的 cds/PROD=甲狀旁腺激素樣激素 /FL=gb: BC005961.1
人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白2.50614 -0. 01889 -1.04926 2. 52E-02
(LOC51159), mRNA/PROD=結(jié)腸
癌相關(guān)蛋白
/FL=gb:NM-016206.1
gb:AF099505.1
KIAA0036 基因產(chǎn)物3.05174 -0. 66523 -2. 2068 2. 62E-02
克隆號為 PLACE1006521 的人4. 27968 1. 86625 1.70965 1. 11E-02
cDNA FLJ13536 fis
克隆號為 HRC10126 的人3.68063 1.24806 1. 39728 1.42E-02
cDNA FLJ22463 fis人 UDP-N-乙酰葡糖胺a-1, 3- 2. 71164 0. 270906 0.433883 1. 98E-02
D-甘露糖苷-β -1，4-Ν-乙酰葡 糖胺轉(zhuǎn)移酶IV同系物(HGNT-
IV-H) , mRM/PR0D=UDP-N-乙酰
葡糖腰a-1, 3-D-甘露糖苷-
β-1，4-Ν-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶
IV 同系物/FL=gb: AB024729. 1
gb: NM-O
組織因子通道抑制劑 24, 19529 1.63281 1.58393 7. 53E-03
/FL=gb:D29992.1 gb: L27624.1 gb: NM-006528.1 gb: BC005330. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽2.8924 0. 521234 0. 762594 2. 82E-02
假定基因產(chǎn)物-0.518738 -0.66615 1.82038 4. 91E-02
人 KIAA1758 蛋白 mRNA，部分2. 42082 -0. 03923 0. 213473 1. 25E-02
的 cds/PROD=KIAA1758 蛋白
前列腺素 E 受體 4 (EP4 亞型) 2.58497 0. 196846 0.527172 1. 42E-02 /FL=gb:L25124. 1 gb:D28472. 1 gb: NNL000958. 1 gb: L28175. 1
克隆號為 HRC10126 的人2. 85068 0. 473875 0. 830447 1. 97E-02
cDNA FLJ22463 fis
人疏酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0- 3.18462 0.571052 0. 709206 4. 54E-02
橫基轉(zhuǎn)移酶2 (HS3ST2),
mRNA/PROD=疏酸乙酰肝素D-葡
糖胺3-0-磺基轉(zhuǎn)移酶2
/FL=gb:AF105375.1
gb: AF105374. 1
gb: NM.006043. 1
人神經(jīng)鞘瘤素相互作用蛋白5. 5957 3. 21054 3. 57915 2. 11E-02
1 (SCHIP-I)，mRNA/PROD=神經(jīng)
鞘瘤素相互作用蛋白1
/FL=gb: AF145713. 1
gb: NM.014575.1
人賴氨酰氧化酶(LOX)基因外顯 2.11886 -0.24936 0. 138069 2. 55E-03 子7
Anephropontin mRNA,完整7.82555 5.27856 5. 06542 4. 61E-02
的 cds/PROD=nephropontin /FL=gb:M83248. 1
人 KIAA0386 基因 mRNA,完整3.9213 1.56305 1.13663 1. 93E-02
的 cds/FL=gb: AB002384. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽3.22146 0. 851355 0. 404487 3. 41E-03人膠質(zhì)瘤病程有關(guān)的蛋白3.20187 0.502872 0.348681 1. 34E-02 (GliPR) mRNA,完^ 的
cds/PROD=膠質(zhì)瘤病程有關(guān)的蛋 . 白/FL=gb:剛-006851. 1 gb: U16307. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽2.96697 0.440894 0.773495 1. 97E-02
克隆號為 PLACE1001062 的人5.9221 3.48419 3.9531 3. 38E-02 cDNA FLJ13384 fis,高度類似 于人賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵 母氨酸脫氫酶的niRNA。
人 mRNA; cDNA DKFZp761I19126. 06894 3.31919 3.4798 4. 97E-02 (來自克隆 DKFZp761I1912)
表達(dá)^列標(biāo)簽4.12419 1.53997 1. 88239 5. 68E-03
人成纖維細(xì)胞生長因子2 (堿5.49297 2.64534 2.76054 4. 71E-02 性)(FGF2), mRNA/PROD=成纖 維細(xì)胞生長因子2 (堿性) /FL=gb: NM-002006. 1 gb: M27968. 1
核糖體蛋白 L34 假基因 13.45116 2. 78236 5.10812 2. 42E-02
HIV-I rev 結(jié)合蛋白 24. 4245 1.47599 1. 52824 2. 10E-02
人 FGF 基因外顯子 32. 04849 -0. 34703 -0. 95745 3. 33E-02 /FL=gb: NM-000800.1 gb:M13361. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽2.03304 -0. 9164 -0.83676 4. 19E-02
表達(dá)序列標(biāo)簽2.87393 0. 428858 1.02011 9. 72E-04
克隆號為 23700 的人 mRNA 序列4.60148 1.64243 1.72052 4. 74E-02
高度類似于 S21424 巢蛋白3.08579 0. 725853 1. 40345 1. 99E-02 (人)的表達(dá)序列標(biāo)簽
人勵平滑肌肌動蛋白 Y7. 17155 4. 15208 4.18551 4, 72E-02 2 (ACTG2)，mRNA/PROD=肌動蛋 白 γ2 前肽/FL=gb: NM-001615. 2
假想蛋白 FLJ228332.80785 0.480636 1.25154 2. 43E-02
人 LIM 同源盒蛋白 6 (LHX6),2.52571 -0.06036 0.459727 4. 37E-02
mRNA/PROD=LIM同源盒蛋白6
/FL=gb: AB031041.1
gb: NM.014368. 1
gb: AL136570. 1
克隆號為 IMAGE: 5271039 的人3.05576 0.189935 0.452681 4. 05E-02 mRM。人cAMP反應(yīng)元素結(jié)合蛋白 CRE-BPa (H-GS165L15.1)’ mRNA/PR0D=cAMP反應(yīng)元素結(jié)合 蛋白 CRE-BPa /FL=gb: NM-004904.1 gb: L05911.1 G蛋白偶聯(lián)受體1 /FL=gb: NM-005279.1 人神經(jīng)纖毛蛋白(NRP)和 tolloid (TLL)樣 l(NETOl)轉(zhuǎn) 錄變體3，mRNA/PROD-神經(jīng)纖 毛蛋白和tolloid樣1同工型 3 前體/FL=gb: AF448838. 1 gb: NM.138966. 2 人KIAA0559蛋白mRNA,部分 的 cds/PROD=KIAA0559 蛋白 人 65kDA 磷蛋白(p65) raRNA, 完整的cds/PR0D=碌蛋白p65 /FL=gb: M22300. 1 gb: NNL002298. 2 gb: J02923. 1 人染色體9上克隆號為RP11-31K16的DNA序列，包含 snoRNA結(jié)合域假基因、ELAV (胚胎致死，異常視覺，果 蠅)樣2的ELAVL2基因、表達(dá) 序列標(biāo)簽、序列標(biāo)簽位點、基 因組勘測序列和一個CpG島 假想蛋白FLJ11006 AmRNA; cDNA DKFZp566A1046 (來自克隆 DKFZp566A1046) 表達(dá)序列標(biāo)簽 來自PAC 106H8的人基因。 人T細(xì)胞受體重排p鏈V區(qū)(V-D-J) mRNA,完整的 cds/FL=gb:M15564.1 肽耽脯氣酰異構(gòu)酶A (親環(huán)蛋 白A)
人KIAA1597蛋白mRNA,部分 的 cds/PROD=KIAA1597 蛋白 HIV-1 rev結(jié)合蛋白2
2.909710. 487264
1.15804-1, 24345
3.255250. 20233
2.37088-0,29358
3.255220. 620942
4.775222. 18971
1. 75389-0. 66646
3. 973441. 32598
4.133561. 60769 3.05906 -0.08711
3.438620.94127
1.76352 0. 908832
6. 206753. 06104
3. 540010. 617783
1.213344.24E-02
-0. 493522. 28E-03
0. 3013542. 83E-02
0.1990282.81E-02
1.153172. 88E-02
2. 774594. 04E-02
0. 1005917. 78E-04
1.86833. 19E-02
2.274151. 85E-02
-0.138454. 34E-02
1.645145. 31E-03
3.261242. 19E-02
3. 124031. 78E-02
0. 3253163. 52E-02
166
表達(dá)序列標(biāo)簽1. 06738
人肝細(xì)胞癌新基因3蛋白5. 55437
(LOC51339), mRNA/PR0D=肝細(xì) 胞癌新基因3蛋白 /FL=gb: NM.016651. 2 gb: AF251079. 2
克隆號為MGC: 4078的類似于轉(zhuǎn) 4. 82642 化生長因子P1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1 人的mRNA,完整的cds/PR0D= 類似于轉(zhuǎn)化生長因子0 1誘導(dǎo) 轉(zhuǎn)錄因子
l/FL=gb:NM.015927.1
gb: BC001830. 1 gb: AF116343. 1
高度類似于FXD3—人叉頭框蛋3.81523
白D3 (人)的表達(dá)序列標(biāo)簽
表達(dá)序列標(biāo)簽4.52094
人鉀+間/小電導(dǎo)鈣活化通道亞 3.68048
家族N成員2 (KCNN2),
mRNA/PROD=鉀中間/小電導(dǎo)鈣活
化通道亞家族N成員2
/FL=gb: NM-021614.1
gb: AF239613.1
類似于酵母MRS2的人轉(zhuǎn)運(yùn)體5. 68324
(MRS2L)，mRNA/PROD=類似于酵 母MRS2的轉(zhuǎn)運(yùn)體 /FL=gb:AF288288.1 gb: NM-020662.1
含血小板反應(yīng)素1基元5的人 4.54713 解聚素樣金屬蛋白酶 (reprolysin 型)(集桂醉 2 ) (ADAMTS5)的 mRNA/PR0D=含 血小板反應(yīng)素基元5的解聚素 樣金屬蛋白酶的前蛋白原 /FL=gb: NM.007038.1 gb:AF14209
HIV-1 rev 結(jié)合蛋白 23.85003
人曱狀旁腺素樣蛋白(與惡性1.73564
體液性高鈣血癥相關(guān))mRNA,
完整的 cds/FL=gb: J03580. 1
表達(dá)序列標(biāo)簽5.27633
表達(dá)序列標(biāo)簽1.7022
-1.51321 -0.67814
3’ 02649
2. 07249
1.18624
1.70664 0. 897369'
2. 07152
0. 823769 -1.5631
2.76577
3. 91576
2. 74019
1.98102
2. 3196 1. 5433
3. 35483 4. 46553
1. 10726
0. 407316 -1.41799
3. 71542
7. 68E-03 2.22E-02
1.03E-02
4.17E-02
2. 78E-02 1. 32E-02
3. 00E-03
5. 91E-03
-1. 29085 -0.81236
3. 76E-02 4.04E-02
1. 39E-02 1.72E-02
168
人腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子1.71599-0. 794120. 6167333. 09E- 02(BDNF), mRNA/PR0D=腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子/FL=gb: NM-001709.1弱類似于未知蛋白(人)的表2. 33677—0. 040661.52171. 87E-■03達(dá)序列標(biāo)簽表達(dá)序列標(biāo)簽2. 572650. 1777941.748762. 74E-■04表達(dá)序列標(biāo)簽2.68090. 2090951.706241. 21E-■02人DKC1基因外顯子1至114. 183071.702833. 208632. 00E--02人T細(xì)胞受體P鏈(TCRBV13S1-4.452281. 383182. 300313. 27E--03TCRBJ2S1) mRNA,完整的cds/PR0D=T細(xì)胞受體P鏈/FL=gb: AF043179.1人PR00066 mRNA,完整的0. 466715-1.87679-0. 226654. 25E--03cds/PROD=PR00066/FL=gb: AF113007. 1突觸囊泡的軸突運(yùn)栽5. 203852.741244.276483. 33E--03克隆號MGC: 129330. 139313-2. 31405-0. 763331. 46E--02IMAGE: 4308662的類似于細(xì)胞周期蛋白M2的人的mRNA，完整的cds/PR0D=類似于細(xì)胞周期蛋白 M2/FL=gb: BC021222.1克隆號為CDABP0095的人mRNA3. 872012. 79365.739589. 63E--03序列人核糖體蛋白L18a同系物2. 004010. 3546742.730134. 70E--04mRNA/PR0D=核糖體蛋白L18a同系物弱類似于ALU7-人ALU亞家族3. 436390. 8438262.284683. 37E--02SQ序列污染警告條目(人)的表達(dá)序列標(biāo)簽克隆號為IMAGE: 5242616的人-0. 525567-2. 078320. 4069642, 23E--02mRNA。人Clorf24 mRNA,完整的5.179682. 587244,042131. 98E--04cds/PR0D=Clorf24/FL=gb: AF288391. 1gb: AB050477. 1gb: NM.022083. 1克隆號為IMAGE: 451939的人5. 157762.227863. 404382. 60E--02mRNA序列克隆號為PLACE1011185的人0. 682724-2. 08716-0. 740741. 45E--02cDNA FLJ14942 fis,高度類似于插入元件IS1蛋白INSB。
171
表達(dá)序列標(biāo)簽2. 30031-1.01596-0. 089641.46E- 02Kruppel樣因子4 (腸)3. 500411. 099542. 959151.22E- 02人全長插入cDNA YI25A03-1.40946-3. 04877-0. 393783.32E-■02表達(dá)序列標(biāo)簽0. 806666-2.01081-0.530761.91E-■02人 mRNA; cDNA3. 18920. 0127681.135621.35E-■03DKFZp761G02121 (來自克隆DKFZp761G02121 )；部分的cds人TMEFF2 mRNA,完整的2. 28638-0. 895080. 2255461.21E-■03cds/FL=gb: AB017269.1gb: NM-016192. 2gb: AF179274.2 gb:AF242222. 1克隆號為MGC: 3328的人3. 546250. 7724862.301684.16E-■02mRNA,完整的cds/PR0D=未知(克隆號為MGC: 3328的蛋白)/FL=gb: BC001745.1gb: NM-014392. 1表達(dá)序列標(biāo)簽2,18149-0. 583030. 9845222.68E-■02突觸伸蛋白24. 1661. 831433. 841990.00E+00KIAA0367 蛋白1. 5999-1. 50555-0. 262861.58E-■02中等類似于ALU8-人ALU亞家0. 868185-1.468040. 5730781.69E--02族SX序列污染警告條目(人)的表達(dá)序列標(biāo)簽與鋅指結(jié)構(gòu)域相鄰的溴結(jié)構(gòu)域 1 D1.60872-1.125440, 5183612.11E-■02丄D 人補(bǔ)體細(xì)胞溶解抑制因子(CLI)6. 615923. 916655. 5961.66E-■02mRNA,完整的cds/FL=gb: J02908.1gb:NM_001831. 1 gb: M64722. 1gb: M25915. 1叉頭框01A (橫紋肌肉瘤)5. 049752. 598024.535451,,60E--03/FL=gb: NM-002015.2gb: AF032885. 1 gb: U02310. 1克隆號為HSI15054的人4.883912. 090933. 688751.,91E--02cDNA FLJ22727 fis鈣粘蛋白6，2型，K-4弓粘蛋白3. 273710. 2433351.611992.,74E--04(胎兒腎)/FL=gb:D31784.1gb:NM_004932. 1表達(dá)序列標(biāo)簽3. 977490. 7868451.998031,.7 3E--02核酸內(nèi)切酶G樣11. 11519-2. 09018-0. 883241,,69E--02/FL=gb: AB020523. 1gb: NM-005107.1克隆號為NT2RP3001232的人 cDNA FLJ13034 fis 人染色體20qll. 1-12上克隆號 為RP4-61404的DM序列，包 含MMP24 (基質(zhì)金屬蛋白酶24 (嵌入膜內(nèi)))基因的3'部 分、ITGB4BP (整合素P 4結(jié)合 蛋白)基因、新基因的3'端等 人塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白-5; CRMP3 相關(guān)分子，克隆號 MGC: 11247, mRNA,完整的 cds /PR0D=塌陷反應(yīng)介導(dǎo)蛋白-5; CRMP3相關(guān)分子 /FL=gb: BC002874.1 中等類似于ALU7-人ALU亞家 族SQ序列污染警告條目(人) 的表達(dá)序列標(biāo)簽 中等類似于CA1C大鼠股原a l(XII)鏈(褐家鼠)的表達(dá)序 列標(biāo)簽
人a -氨基己二酸半醛合酶 mRNA,完整的 cds/PR0D=a-氨 基己二酸半搭合酶 /FL=gb: AF229180.1 人Wnt抑制因子-l(WIF-l)， mRNA/PR0D=Wnt 抑制因子-1 /FL=gb: AF122922.1 gb:NM-007191.1 核糖體蛋白S11 人鐘瘤壞死因子a -誘導(dǎo)蛋白6 (TNFAIP6) , mRNA/PR0D=腫瘤壞 死因子a-誘導(dǎo)蛋白6 /FL=gb: NM-007115.1 含YRPW基元2的人發(fā)狀分裂相 關(guān)增強(qiáng)子(HEY2)，mRNA/PR0D= 含YRPW基元2的人發(fā)狀分裂相 關(guān)增強(qiáng)子/FL=gb: NM.012259. 1 gb: AF311884.1 gb: AB044755.1 gb: AF232238. 1 gb: AF237949. 1 gb: AF173901.1
4.596410.64328
2.916070.209555
0. 672753-1. 75265
2.915760. 289656
6.26811. 94518
5.26042.72549
1.11211.66E-02
1.926441. 93E-02
0. 2508038. 65E-03
2. 103342. 57E-03
1. 827474. 12E-02
4.66854. 33E-03
1.03265 -1. 51207 0.433159 8. 62E-05
4.95358 2.25158 4.04683 2.98E-04 2.42729 -0. 73843 0. 613222 1.93E-02
2.3848 -0.44154 1. 27956 3. 16E-03人精囊蛋白I (SEMG1)， mRNA/PR0D=精嚢蛋白I /FL=gb: J04440. 1 gb: NM-003007. 1 克隆號為MGC: 1470的類似于鈣 粘蛋白6，2型，K-鉤粘蛋白 (胎兒腎)人的mRNA，完整的 cds/PR0D=類似于鈣粘蛋白6， 2型，K-鈣粘蛋白(胎兒腎) /FL=gb: BC000019.1 人mRNA; cDNA DKFZp434H0350 (來自克隆
DKFZp434H0350 )；部分的 cds/PR0D=假想蛋白 人生長因子受體結(jié)合蛋白 14(GRB14), mRNA/PR0D=生長因 子受體結(jié)合蛋白14 /FL=gb: L76687.1 gb: NM-004490. 1 類似于TAF5樣RNA聚合酶 II，p300/CBP相關(guān)的因子 (PCAF)相關(guān)的因子，65kDa,克 隆號 MGC: 46101 IMAGE: 5551246,人 mRNA,完 整的cds/PR0D=類似于TAF5樣 RNA聚合酶II，P300/CBP相關(guān) 的因子(PCAF)相關(guān)的因子 人 mRNA; cDNA DKFZp761J1324 (來自克隆 DKFZp761J1324) 溶質(zhì)栽體家族30 (辭轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋 白)成員1 抗酶抑制因子
人GR01癌基因(黑素瘤生長刺 激活性，a ) (GR01), mRNA/PR0D=GR01癌基因(黑素 瘤生長剌激活性，a ) /FL=gb:NM-001511. 1 人前蛋白轉(zhuǎn)化薛枯草溶茵素5 型(PCSK5)，mRNA/PROD=前蛋白 轉(zhuǎn)化醉枯草溶菌素5型 /FL=gb:U56387. 2 gb: NM.006200. 1 表達(dá)序列標(biāo)簽
0. 585816 -2.46893 -0. 95223
2.38648 -0. 02212 2. 14359
2. 16899 -0. 56794 1. 27546
4. 2346 1.17569 2.73613
2. 10954 -0.1313 2.24853
1.42404
2.82535
3.65887 2. 51473
-1.99222
0. 288493
0. 37346 0. 107263
-0. 77126
2.38889
1.74912 2. 38874
3. 05E-02 2.59E-03
3. 16E-03 4.80E-03
8.24E-04
3. 21E-02
0. OOE+OO
1.86E-02 7.16E-04
4.90999
0. 871309
0. 254736
-1.96122
52441
1’ 71E-02
0. 51777
2
o
-
o
4-
175G蛋白Y 12亞基3. 936531. 061782.888895.11E--04/FL=gb: NM-018841. 1gb: AF119663. 1血小板^ 生生長因子a多肽3. 503430. 6512462. 502073.99E--03凝聚素(補(bǔ)體溶解抑制劑、SP-2.88196-0. 426770. 97128.48E--0340,40、硫酸化糖蛋白2、睪丸酮阻遏前列腺信息2、栽脂蛋白n表達(dá)序列標(biāo)簽2.82081-1.69816-1.899854.10E--02人胰島素瘤相關(guān)蛋白2.943470. 1204942.022481.43E--031 (INSM1) , mRNA/PROD=胰島素瘤相關(guān)蛋白1/FL=gb:NM-002196.1gb: M93119. 1LBP蛋白322. 68546-0.166781. 706261.87E-■03/FL=gb: NM-014552.1gb: AF198489. 1高度類似于T42654假鵝蛋白2. 845040. 5157032.953797.92E-■04DKFZp434G1115. 1 (人) 的表達(dá)序列標(biāo)簽人弗里德白血病病毒綜合因子1. 7744-2.28064-1.567653.14E--021 (FLI1), mRNA/PR0D=弗里德白血病病毒綜合因子1/FL=gb: BC001670. 1gb:NM_002017. 2 gb:M98833. 3表達(dá)序列標(biāo)簽0. 846429-2.42046-0. 918911.57E--02人氧化3 a羥類固醇脫氫酶、1. 30153-1.642270. 1963943.20E--03視黃醇脫氫酶、3-羥類固醇異構(gòu)酶(R0DH)的 mRNA/PR0D=氧化3 a羥類固醇脫氫酶、視黃醇脫氫酶、3-羥類固醇異構(gòu)酶/FL=gb: AF016509. 1 gb: A次要組織相容性抗原HA-11. 89498-0. 371362. 151574.61E--02尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶4.263270. 9689392. 47766.20E--031 24kD人G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白25. 429523. 055045.497111.,21E--03(RGS2), mRNA/PR0D=24kD G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白/FL=gb:L13463. 1gb:NM.002923. 1表達(dá)序列標(biāo)簽4.499871. 016232. 356591.86E--03表達(dá)序列標(biāo)簽0. 623422-1.949070. 3171388.95E--04表達(dá)序列標(biāo)簽0. 326084-1.694991.135861.,10E--02
176表達(dá)序列標(biāo)簽
克隆號為HEMBA1003545的人 cDM FLJ10160 fis,高度類似 于胰島素基因增強(qiáng)子蛋白ISL-2。
曱狀腺激素受體相關(guān)蛋白 150kDa亞基 /FL=gb:圓-005119.1 gb: AF117756.1 表達(dá)序列標(biāo)簽
人 mRNA; cDNA DKFZp667D095 (來自 1隆 DKFZp667D095 ) 人突觸伸蛋白2 mRNA,完整的 cds/PROD=突觸伸蛋白2 /FL=gb:AF318616.1 人前膠原C內(nèi)肽酶增強(qiáng)子 (PCOLCE) , mRNA/PR0D=前膠原 C內(nèi)肽酶增強(qiáng)子 /FL=gb:BC000574.1 gb: NM-002593. 2 gb: AB008549. 1 gb: L33799. 1 表達(dá)序列標(biāo)簽
人KIAA0930蛋白的mRNA,部 分的 cds/PROD=KIAA0930 蛋白 人叉頭轉(zhuǎn)錄因子FOXL2 (BPES), mRNA/PROD=叉頭轉(zhuǎn)錄 因子FOXL2 /FL=gb: AF301906.1 gb: NM_023067. 1 表達(dá)序列標(biāo)簽
高度類似于AF174600 1 F-box 蛋白Fbx20 (人)的表達(dá)序列 標(biāo)簽
人朗飛結(jié)錨蛋白3 (錨蛋白G) (ANK3)轉(zhuǎn)錄變體2， mRNA/PR0D=錨蛋白3,同工型2 /FL=gb: NM.001149. 1 gb: U43965. 1
人腫瘤壞死因子受體超家族成 員 6 (TNFRSF6)， mRNA/PR0D= 細(xì)胞凋亡(AP0-1)抗原1 /FL=gb:NM_000043. 1 gb:M67454. 1
3
克隆號MGC: 45124 IMAGE: 5578893 的類似于 KIAA0441基因產(chǎn)物的人mRNA, 完整的cds/PR0D=類似于 KIAA0441基因產(chǎn)物 /FL=gb: BC036731.1 克隆號為IMAGE: 4067166的人 mRNA
表達(dá)序列標(biāo)簽
人曱基化CpG結(jié)合蛋白MBD2 (MBD2) mRNA,完整的 cds/PR0D=甲基化CpG結(jié)合蛋白 MBD2 /FL=gb: NM-003927. 2 gb: AF072242.1 KIAA1151 蛋白 人B-HLH DNA結(jié)合蛋白 mRNA/PR0D=B-HLH DNA 結(jié)合蛋 白/FL=gb: NM-000474. 1 克隆號MGC: 39559 IMAGE: 4828136的類似于假想 蛋白FLJ32001的人的mRNA, 完整的cds/PROD=類似于作足想 蛋白
FLJ3200l/FL=gb:BC036200.1 人腎母細(xì)胞瘤1(WT1)轉(zhuǎn)錄變體 D，mRM/PR0D=腎母細(xì)胞瘤1同 工型 D /FL=gb: NM.024424. 1 gb: NM.024426, 1 表達(dá)序列標(biāo)簽
克隆號為MGC: 1470的類似于鈣 粘蛋白6, 2型，K-鶴粘蛋白 (胎兒腎)人的mRNA,完整的 cds/PR0D=類似于鈣粘蛋白6， 2型，K-鉤粘蛋白(胎兒腎) /FL=gb: BC000019. 1 表達(dá)序列標(biāo)簽 父源表達(dá)基因3 人夏科-萊登晶體蛋白(CLC)， mRNA/PROD=夏科-萊登晶體蛋白 /FL=gb:NM-001828. 3 gb:L01664,1 表達(dá)序列標(biāo)簽
1. 38545
-1. 60426
0. 86909
2.33E-03
0. 195869
1. 5857 0. 490598
2. 40462
1. 53104 2.54746
0. 133612 2.87581 3. 30086
3. 26198
-2.50507 0. 276993
-2.61787 -3. 45465
-1. 54553 -0. 69811
-3. 77953 -1. 67669 -0. 41644
-0. 72777
-1. 30022 -1.70163
0.642527 -2. 04288 1.00885 5.43034 1. 56039 3.45122
0. 520711 -1.99011 1.26899
-2. 96375 -2. 43546
1.37309
2.13419
-1.56636 -0. 0118 2. 1096
1. 5682
1.16E-03
1.12E-02 3. 90E-03
4.09E-03 1.12E-04
2.63E-02
41E-02
8.14E-03 1.45E-04
1.40E-02 2.17E-02 2. 08E-02
3. 16E-03
人速激肽前體1 (K物質(zhì)、P物 2.77265 -1. 02081 1.48319 質(zhì)、神經(jīng)激肽1、神經(jīng)激肽2、 神經(jīng)調(diào)節(jié)肽L、神經(jīng)激肽a、 神經(jīng)肽K、神經(jīng)肽Y ) (TAC1) 轉(zhuǎn)錄變體|3 , mRNA/PROD=速激 肽2前體，同工型p/FL=gb:U3 人 PNAS-123 mRNA，完整的 cds 1.59659 人假想蛋白 FLJ20075-0. 359245
(FLJ20075), mRNA/PR0D=假想 蛋白 FLJ20075 /FL=gb:NM-017655.1
人血小板衍生生長因子a受體2.44464
(PDGFRA) mRNA,外顯子 13-16 克隆號為HSI00356的人4. 29365
cDNA: FLJ22547 fis
人 HSPC156 蛋白(HSPC156),0. 786188 -2.32161 1.29619
mRNA/PROD=HSPC156 蛋白 /FL=gb: NM-014178. 1 gb: AF161505.1
人 mRNA; cDNA DKFZp586P1124 0.485642 (來自克隆 DKFZp586P1124 ) 鈣調(diào)素結(jié)合蛋白17.09236
/FL=gb:M64110. 1 gb: NM-004342. 2
克隆號為 MGC: 343051. 69808
IMAGE: 5167647的類似于假想 蛋白FLJ10058的人的mRNA, 完整的cds/PROD=類似于假想 蛋白
FLJ10058/FL=gb: BC034293. 1 克隆號為 IMAGE: 4839343 的類 -0. 062884 似于LIM同源盒蛋白8的人的 mRNAc
人絨毛腹生長素 2 (CSH2)轉(zhuǎn)錄 0.812166 -2.21846 2.21843 變體4，raRNA/PROD=絨毛膜生 長素2，同工型4 /FL=gb:NM_022646. 1
4. 07E-04
-4. 8524 -3.09356
2.67863 5. 63436
-2.74939 0. 215566
-4. 30121 -1.10961
3. 90E-03 2.55E-03
3. 63E-04 1.54E-02 8.62E-05
2.02E-02 7. 47E-03
1.92E-02
1.16E-02
3. 60E-03
180
克隆號為MGC: 12244的人絲氨1.96851-4. 13943-1.565683. 06E-02酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制刑進(jìn)化枝B (卵清蛋白)成員3mRNA,完整的cds/PR0D=絲氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制劑進(jìn)化枝B (卵清蛋白)成員3/FL=gb: NM-006919. 1gb: U19556. 1 gb: BC005224. 1DKFZP566K1924 蛋白2.88225-2. 596321. 390620. 00E+00中等類似于ALU2-人ALU亞家4.24074-0. 697823. 874441.12E-04族SB序列污染警告條目(人)的表達(dá)序列標(biāo)簽喜樹堿誘導(dǎo)的U937細(xì)胞凋亡過0. 494505-4. 62912-0. 189154. 38E-02程中上調(diào)的人mRNA。核受體亞家族1組I成員31.77902-4. 02806-0. 196824.34E-02表達(dá)序列標(biāo)簽-1. 3795-6. 08172-0. 946066.91E-04人絨毛膜生長素2 (CSH2)轉(zhuǎn)錄1. 12437-3. 121382. 616051.12E-04變體1, mRNA/PR0D=絨毛膜生長素2,同工型1前體/FL=gb: NM-020991. 2gb: BC002717. 1人SCCA2b的mRNA,完整的3. 32911-3. 162880. 5680451. 9 3E-02cds/PR0D=SCCA2b/FL=gb: AB046400. 1人KIAA0469基因產(chǎn)物4. 03097-1.948262.565182.49E-04(KIAA0469),mRNA/PROD=KIAA0469 基因產(chǎn)物/FL=gb: AB007938. 1gb: NM-014851. 1表達(dá)序列標(biāo)簽4.45389-2. 406365. 333595. 65E-04表VII :Wnt-3a#理對源干人胚胎干細(xì)胞』系h9的細(xì)胞』群中細(xì)胞』因子表汰的影口向
權(quán)利要求
一種將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟a.培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，b.通過在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞以及用激活素A處理所述多能干細(xì)胞將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27的培養(yǎng)基，c.通過用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子或用視黃酸與至少一種成纖維細(xì)胞生長因子處理所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，將所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以及d.通過用γ-分泌酶抑制劑處理所述表達(dá)所述胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，將所述表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特 征性標(biāo)志物的細(xì)胞的所述步驟通過包括以下步驟的方法來實現(xiàn)a.將所述多能干細(xì)胞平鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上，以及b.在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充 有B27的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特 征性標(biāo)志物的細(xì)胞的所述步驟通過包括以下步驟的方法來實現(xiàn)a.將所述多能干細(xì)胞平鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上，b.在第一培養(yǎng)基中用激活素A和Wnt配體培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，以及c.在第二培養(yǎng)基中用激活素A培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的所述步驟通過還包括將所述多能干細(xì)胞平鋪在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層 上的方法來實現(xiàn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27、Wnt配體和激活素A的DMEM-F12。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27、Wnt配體和激活素A的DMEM-LG。
13.一種將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，所述 方法包括以下步驟a.在包括補(bǔ)充有B27的培養(yǎng)基的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，b.通過用激活素A處理所述多能干細(xì)胞將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，以及c.通過用至少一種成纖維細(xì)胞生長因子或用視黃酸和至少一種成纖維細(xì)胞生長因子 處理所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，將所述表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo) 志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述B27以約1%的濃度使用。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的所述步驟通過還包括將所述多能干細(xì)胞平鋪在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層 上的方法來實現(xiàn)。
17.一種將多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，所述 方法包括以下步驟a.將所述多能干細(xì)胞平鋪在涂布有細(xì)胞外基質(zhì)的組織培養(yǎng)基質(zhì)上，以及b.在包括補(bǔ)充有B27的培養(yǎng)基的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述B27以約1%的濃度使用。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中將所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系 特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的所述步驟通過還包括將所述多能干細(xì)胞平鋪在成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層 上的方法來實現(xiàn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27、Wnt配體和激活素A的DMEM-F12。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
24.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培 養(yǎng)，所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27、Wnt配體和激活素A的DMEM-LG。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
27.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27和激活素A的DMEM-F12。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
30.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞在化學(xué)成分確知培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 所述化學(xué)成分確知培養(yǎng)基包括補(bǔ)充有B27和激活素A的DMEM-F12。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述B27以約0.5%至約的濃度使用。
32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述B27以約的濃度使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的方法。具體地講，本發(fā)明提供了形成胰腺內(nèi)胚層、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞以及胰腺激素分泌細(xì)胞的改進(jìn)方法。本發(fā)明還提供了在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞層的情況下促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的方法。
文檔編號C12N5/074GK101861386SQ200880107548
公開日2010年10月13日 申請日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月18日
發(fā)明者A·雷扎尼亞 申請人:生命掃描有限公司