專利名稱：經(jīng)由定型內(nèi)胚層(DE-hep)衍生自人胚泡衍生干細(xì)胞的新肝細(xì)胞群體的制作方法
經(jīng)由定型內(nèi)胚層(DE-hep)衍生自人胚泡衍生干細(xì)胞的新
肝細(xì)胞群體
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生自人胚泡衍生干(hBQ細(xì)胞的新肝細(xì)胞樣細(xì)胞 群體，用于制備此種細(xì)胞的方法，以及此種細(xì)胞在例如藥學(xué)藥物開發(fā)和發(fā)展、毒性測試、細(xì) 胞療法和醫(yī)學(xué)治療中的潛在用途。細(xì)胞在本文中命名為DE-hep細(xì)胞。此外，DE-Hep細(xì)胞顯示功能人肝細(xì)胞的性質(zhì)，這使得它們對于在肝生成的體外研 究中的使用非常有吸引力，例如早期肝臟發(fā)育過程或肝臟再生障礙或畸形。
背景技術(shù)：
多能人干細(xì)胞預(yù)期將改革各種人細(xì)胞類型的可及性。繁殖多能人胚泡衍生干 (hBS)細(xì)胞和后續(xù)使它們分化成所需靶細(xì)胞類型的可能性將提供穩(wěn)定和基本上無限的細(xì)胞 供應(yīng)，用于在體內(nèi)和在體外的一系列應(yīng)用。肝臟衰竭和末期肝病負(fù)責(zé)全世界的大量死亡，并且是衛(wèi)生保健系統(tǒng)的重大負(fù)擔(dān)。 肝臟移植仍是最成功的治療。然而，這個操作的功效是有限的，并且與許多并發(fā)癥如感染或 排斥相關(guān)。肝臟移植還具有可用供體器官的短缺，并且治療患者將非常經(jīng)常涉及終生免疫 抑制。通過減少對于器官的需求，基于細(xì)胞的治療將對社會和患有這些嚴(yán)重疾病的個體具 有極大重要性。此外，肝臟是人體中的代謝和解毒中心，并且因此已付出巨大努力以便鑒定用于 體外測試的功能細(xì)胞類型的可靠來源。不幸的是，肝臟的復(fù)雜性和功能未由目前可用的任 何細(xì)胞類型反映。原代人肝臟細(xì)胞的可用性是非常有限的，并且也已知當(dāng)用于體外應(yīng)用時， 細(xì)胞快速喪失其正常表型和功能性質(zhì)(即，在M小時內(nèi))。原代細(xì)胞的一種常用替代物是 肝細(xì)胞系，其依次包含極低水平的代謝酶，并且具有與體內(nèi)天然肝細(xì)胞基本上不同的其他 重要蛋白質(zhì)的分布。因此，許多測試仍使用動物材料來進(jìn)行，即使已知肝臟代謝是物種特異 性的，并且因此產(chǎn)生在預(yù)測除測試那種外的另一個物種中的肝臟代謝和毒性中的困難。在藥學(xué)開發(fā)中，不利肝臟反應(yīng)仍是最突出的副作用。因此，當(dāng)選擇化合物進(jìn)入臨床 試驗時，人肝臟毒性傾向的早期預(yù)測是極其重要的。改善這個領(lǐng)域中的能力的努力必須解 決可用性問題和模型開發(fā)，這提供針對復(fù)雜生物學(xué)過程的更大覆蓋，所述復(fù)雜生物學(xué)過程 與在人中誘導(dǎo)不利肝臟損傷一致。在2個領(lǐng)域中，衍生自hBS細(xì)胞的分化細(xì)胞的使用提供 有希望的機(jī)會。因此，存在關(guān)于模型系統(tǒng)的迫切需要，所述模型系統(tǒng)模擬人肝臟細(xì)胞，并且能夠預(yù) 測候選物分子在新藥或化學(xué)制品開發(fā)中的效應(yīng)。關(guān)于可用性和生理學(xué)相關(guān)性，人多能干細(xì) 胞可以充當(dāng)功能人肝細(xì)胞的理想再生來源。當(dāng)hBS細(xì)胞以置于合適環(huán)境中時，在分化2-4 周后已觀察到特定肝特征。本發(fā)明基于下述事實定型內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)胚層器官且因此產(chǎn)生肝細(xì)胞 類型。早期內(nèi)胚層發(fā)育并未充分了解。培養(yǎng)的小鼠胚胎的定向研究(Lawson等人，1986， 1991 ；Lawson和Pedersen, 1987)已揭示DE在胚胎日期6-6. 5 (E6-6. 5)時開始形成，并且 到原腸胚形成結(jié)束時(E7. 5)，某些標(biāo)記細(xì)胞僅產(chǎn)生內(nèi)胚層衍生物。未知起始DE細(xì)胞是否是多潛能的。原基分布圖研究(Laws on等人，1991 ；Tremblay和Zaret，2005)暗示在E6. 5 時通過胚線(PQ移動的第一個內(nèi)胚層細(xì)胞命運(yùn)是成為肝臟、腹胰、肺和胃。共培養(yǎng)實驗顯 示這個階段時的內(nèi)胚層在早期胚胎階段時并未完全定型(Wells和Melton，2000)。內(nèi)胚層研究中的復(fù)雜情況是哺乳動物具有胚外內(nèi)胚層。胚外內(nèi)胚層在胚泡期出 現(xiàn)，并且最終形成2個亞群內(nèi)臟內(nèi)胚層和壁內(nèi)胚層。胚外內(nèi)胚層細(xì)胞與DE(產(chǎn)生內(nèi)胚層 器官的細(xì)胞)共享許多基因的表達(dá)，包括經(jīng)常分析的轉(zhuǎn)錄因子Soxl7 (Kanai-Azuma等人， 2002) ,FoxAl 和 HNF3b(Belo 等人，1997 ；Sasaki 和 Hogan，1993)。D' Amour 等人已開發(fā)了 用于從hBS細(xì)胞衍生定型內(nèi)胚層的方案(D' Amour等人，2005 Amour等人，2006)。在本發(fā)明中呈現(xiàn)了 hBS細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞群體，其用于在藥物開發(fā)和再生 醫(yī)學(xué)中使用，且具有至少M(fèi)小時的重要肝臟表達(dá)的標(biāo)記基因例如白蛋白、CYP3A4和UGT2B7 及重要的代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及衍生自定型內(nèi)胚層、DE-Hep祖先和DE-Ifep細(xì)胞的成肝細(xì)胞樣細(xì)胞和 肝細(xì)胞樣細(xì)胞。如由下文描述顯而易見的，本發(fā)明還涉及用于制備這些細(xì)胞的分階段方法，i) DE-Hep祖先和ii)DE-H印細(xì)胞。如在圖IA和B中描述的，這種方法涉及通過培養(yǎng)hBS細(xì)胞 (階段I)的DE細(xì)胞的形成，其后從DE細(xì)胞獲得DE-H印祖細(xì)胞(階段II)，和最終從DE_h印 祖細(xì)胞形成DE-H印細(xì)胞(階段III)。本發(fā)明的一個方面涉及用于制備經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生自人胚泡衍生干(hBS)細(xì) 胞的DE-Hep細(xì)胞的方法，該方法包括對hBS細(xì)胞實施培養(yǎng)條件，所述培養(yǎng)條件包括i)階段I，其中誘導(dǎo)hBS細(xì)胞以發(fā)育成定型內(nèi)胚層細(xì)胞，階段I包括在包括活化素 的第一種階段I培養(yǎng)基中培養(yǎng)hBS細(xì)胞2-6天，其中在培養(yǎng)1天后培養(yǎng)基由第二種階段I 培養(yǎng)基替換，所述第二種階段I培養(yǎng)基包括活化素、一種或多種生長因子和任選地血清，ii)階段II，其中繁殖得自階段I的細(xì)胞，并且階段II包括在階段II培養(yǎng)基中培 養(yǎng)來自階段I的細(xì)胞，所述階段II培養(yǎng)基包括一種或多種生長因子和任選地成骨蛋白，iii)階段III，其中使得自階段II的細(xì)胞成熟為肝細(xì)胞樣細(xì)胞(DE-IfeP細(xì)胞)，階 段III包括在階段III培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自階段II的細(xì)胞，所述階段III培養(yǎng)基包括一種或 多種成熟因子和任選地分化誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的另一個方面涉及通過上述方法獲得的DE-h印祖細(xì)胞。得自階段I I的細(xì) 胞顯示 HNF1、HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、結(jié)蛋白、CD133、ICAMl (CD54)、CK8、CK18 和 CK19 中 的一種或多種的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。DE-h印祖細(xì)胞顯示CK8、CK18和CK19、ICAM的基 因表達(dá)。如本文例子中證實的，DE-hep祖細(xì)胞通常還顯示EpCAM，以及HNF1、HNF3b、HNF4a 中的一種或多種優(yōu)選全部的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。包括DE-h印祖細(xì)胞且根據(jù)本發(fā)明獲 得的細(xì)胞群體通常包含至少25%的DE-h印祖細(xì)胞，優(yōu)選50%的細(xì)胞是DE-h印祖細(xì)胞。依 賴于細(xì)胞群體中的DE-hep祖細(xì)胞百分比，特定百分比細(xì)胞可顯示所需蛋白質(zhì)和/或基因表 達(dá)。因此，百分比非常依賴于細(xì)胞群體的“純度”(即，相同細(xì)胞同一性)。然而，可以對具 有低百分比DE-hep祖細(xì)胞的細(xì)胞群體實施細(xì)胞選擇和此種細(xì)胞的繁殖，并且這將反過來 導(dǎo)致更高的百分比。特別地，DE-h印祖細(xì)胞顯示CK8、CK18和CK19的蛋白質(zhì)和/或基因表 達(dá)(通常如本文所述獲得的DE-h印祖細(xì)胞群體中至少50%細(xì)胞或細(xì)胞顯示CK8、CK18和/或CK19的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá))。本發(fā)明涉及具有上述特征的DE-h印祖細(xì)胞以及包括DE-h印祖細(xì)胞的細(xì)胞群體。本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面涉及可通過本文描述的方法獲得的DE-h印細(xì)胞。 DE-hep細(xì)胞顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的一種或多種標(biāo)記，尤其是BSEP、MRP2、0ATP-2( = OATP-C, 0ATP1B1)、0ATP-8(0ATP1B3)、OATP-A ( = 0ATP1A2)、NTCP、MDR1、MDR3、0CT-1 的蛋白質(zhì)和 / 或基因表達(dá)。特別地，DE-hep細(xì)胞顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的下述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá) MRP2、0ATP-2( = OATP-C、0ATP1B1)、OATP-A( = 0ATP1A2) ,NTCP 和 0CT-1。此外，在本文描 述的至少某些方案中，獲得的DE-h印細(xì)胞還顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的下述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或 基因表達(dá):MDR1和/或MDR3。本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面涉及可通過本文描述的方法獲得的DE-h印細(xì) 胞。DE-h印細(xì)胞顯示關(guān)于藥物代謝酶的一種或多種標(biāo)記，尤其是GSTA1-1、GSTM1-1、 CYPs (CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、 CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1、UGT1A6、UGTlA和/或UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。特別 地，DE-hep細(xì)胞顯示下述藥物代謝酶的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)CYP 2C9、CYP2C19、CYP2D6。 此外，如本文例子中證實的，DE-hep細(xì)胞還顯示CYP1A1、CYP1A2、CYPlBU CYP2A6、CYP2B6、 CYP2C8、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1 以及 UGT1A6、UGT1A、UGT2B7 的蛋白質(zhì)和 / 或基因 表達(dá)。本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面涉及可通過本文描述的方法獲得的DE-h印細(xì)胞。 DE-h印細(xì)胞顯示關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的一種或多種標(biāo)記，尤其是FXR、RXRa、RXR^、RXR γ、 HNFl a、HNF3 a、HNF3 β、HNF4 a、HNF6、C/EBP A、C/EBP B 的蛋白質(zhì)和 / 或基因表達(dá)。特別 地，DE-h印細(xì)胞顯示關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的下述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)RXRy。此外，如本 文例子中證實的，DE-hep 細(xì)胞還顯示 FXR、RXR a、RXR β、HNFl a、HNF3 a、HNF3 β、HNF4 a、 HNF6、C/EBP A、C/EBP B的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。在一個具體實施方案中，DE-hep細(xì)胞顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和藥物代謝酶的一種 或多種標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，DE-h印細(xì)胞顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的一 種或多種標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，DE-h印細(xì)胞顯示關(guān)于藥物代謝酶和轉(zhuǎn)錄因子的一 種或多種標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，并且DE-h印細(xì)胞顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、藥物代 謝酶和轉(zhuǎn)錄因子的一種或多種標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)(參考在上文段落中具體提及 的標(biāo)記)。此外，與使用相同種類的細(xì)胞但對細(xì)胞實施固有分化比較，通過上述方法獲得的 DE-h印細(xì)胞可能顯示下述增加的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)白蛋白、UGT2B7、CYP3A4。如本 文例子中顯示的，基于根據(jù)本發(fā)明的DE-hep細(xì)胞的白蛋白表達(dá)增加至少5倍，但使用特定 方案(方案2或4)可以高至約140。平均起來，白蛋白表達(dá)增加約80或90倍。如本文例 子中顯示的，基于根據(jù)本發(fā)明的DE-hep細(xì)胞的UGT2B7表達(dá)增加至少3倍，但使用特定方案 (方案2、可以高至約85。平均而言，UGT2B7表達(dá)增加約30或40倍。如本文例子中顯示 的，基于根據(jù)本發(fā)明的DE-hep細(xì)胞的CYP 3A4表達(dá)增加至少20倍，但使用特定方案(方案 3)可以高至約200。平均而言，白蛋白表達(dá)增加約100或110倍。本發(fā)明的DE-hep細(xì)胞特別良好地適合于在藥物開發(fā)和毒性測試中使用，因為它 們表達(dá)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和/或代謝酶。此外，通過本發(fā)明的獲得的DE-h印細(xì)胞顯示對于成熟肝臟細(xì)胞重要的標(biāo)記基因的表達(dá)，例如白蛋白、CYP3A4和UGT2B7。包括DE-h印細(xì)胞且根據(jù)本發(fā)明獲得的細(xì)胞群體通常包含至少25%的DE_h印細(xì) 胞，優(yōu)選50%的細(xì)胞是DE-h印細(xì)胞。依賴于細(xì)胞群體中的DE-h印細(xì)胞百分比，特定百分 比細(xì)胞可能顯示所需蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。因此，所述百分比非常依賴于細(xì)胞群體的“純 度”(即，相同細(xì)胞同一性)。然而，可以對具有低百分比DE-hep細(xì)胞的細(xì)胞群體實施細(xì)胞 選擇和此種細(xì)胞的繁殖，并且這將反過來導(dǎo)致更高的百分比。本發(fā)明涉及具有上述特征的DE-h印細(xì)胞以及包括DE-h印細(xì)胞的細(xì)胞群體。在本發(fā)明的一個方面，DE-hep細(xì)胞或細(xì)胞核顯示下述特征中的至少一種，例如至 少4種、至少6種、至少8種、至少10種或全部葡萄糖6磷酸酶、載脂蛋白E、CYP7A1 (膽固 醇7 α羥化酶)、醇脫氫酶1、細(xì)胞色素Ρ450還原酶、HNMa、α -1-抗胰蛋白酶、CK18、HNF 3b (HNF 3B)、白蛋白或肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白和下述11種特征中的至少2種，例如至少4種、 至少6種、至少8種、至少10種或全部A.藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白i)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示BSEP的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，ii)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示MRP2的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，iii)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示0ATP_2( = OATP-C, 0ATP1B1)和/或 0ATP-8 (0ATP1 B3)的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，iv)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示OATP-A ( = 0ATP1A2)的蛋白質(zhì)和/或基 因表達(dá)，ν)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示NTCP的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，vi)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示MDRl的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，vii)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示MDR3的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，viii)至少的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示0CT-1的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)B.藥物代謝酶ix)至少20%的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示GST Al-I和GSTMl-I的蛋白質(zhì)和/或 基因表達(dá)，χ)至少5%的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示下述CYPs-IAl、-1Α2、_1Β1、-2Α6、-2Β6、_2 C8、-2C9、-2C19、-2D6、-2E1、-3A4、-3A7和-7A1中的至少2種的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，xi)至少5%的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或
基因表達(dá)。特別地，本發(fā)明涉及顯示全部下述特征的DE-hep細(xì)胞葡萄糖6磷酸酶、載脂蛋白 E、CYP7A1 (膽固醇7 α羥化酶)、醇脫氫酶1、細(xì)胞色素Ρ450還原酶、HNF4a、α -1-抗胰蛋白 酶、CK18、HNF3b (HNF3B)、白蛋白或肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白。這些特征指示細(xì)胞是肝臟細(xì)胞。此外，如上所述，DE-h印細(xì)胞具有就藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物代謝而言的特征。因此，包括 DE-hep細(xì)胞的細(xì)胞群體通常具有下述特征至少20 %的細(xì)胞顯示0ATP-2、CYP1A2、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4 的蛋白質(zhì)表達(dá)。包括DE-h印細(xì)胞的細(xì)胞群體通常是這樣的群體，其中至少20%的細(xì)胞顯示關(guān)于 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的下述標(biāo)記中的至少5種、優(yōu)選7種、更加優(yōu)選全部的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá) BSEP, MRP2、0ATP-2 ( = OATP-C, 0ATP1B1)、0ATP-8 (0ATP1B3)、OATP-A ( = 0ATP1A2)、NTCP,MDR1、MDR3、OCT-IjP至少20%的細(xì)胞顯示GST Al-I和/或GSTMl-I的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)，和至少20%的細(xì)胞顯示下述 CYPs-1A1、-1A2、-1B1、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19、_ 2D6、-2E1，-3A4、-3A7和-7A1中的至少7種、優(yōu)選9種、更加優(yōu)選全部的蛋白質(zhì)和/或基因 表達(dá)至少5%的細(xì)胞顯示UGT1A6和/或UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。人胚泡衍生干細(xì)胞(hBS細(xì)胞)是多能的，并且可以產(chǎn)生所有3個胚胎胚層(內(nèi)胚 層、外胚層和中胚層)的細(xì)胞，并且進(jìn)一步產(chǎn)生所有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞。因此，在未來，衍生 自具有肝細(xì)胞功能特征的hBS細(xì)胞的分化細(xì)胞不僅具有用于移植或在生物反應(yīng)器中用于 在具有肝衰竭的患者中的額外身體肝臟支持的潛力，以及作為測試系統(tǒng)用于研究藥物靶、 異生物質(zhì)的肝代謝和肝毒性的潛力。hBS衍生的肝細(xì)胞可以需要時潛在提供來自相同的遺 傳供體的功能人肝細(xì)胞的無限來源，并且因此改善體外測試?yán)缍拘詼y試的預(yù)測性，且減 少關(guān)于動物實驗的需要。然而，異生物質(zhì)的毒性通常依賴于其生物轉(zhuǎn)化成毒性和反應(yīng)性代 謝物，并且因此需要生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的存在和分布。目前，原代人肝細(xì)胞構(gòu)成用于體外藥物代 謝和毒性測試的模型。然而，當(dāng)培養(yǎng)原代肝細(xì)胞時，藥物代謝酶的活性和許多轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能 快速喪失和/或改變。此外，用于體外研究的許多肝細(xì)胞瘤細(xì)胞系例如IfepG2，缺乏許多重 要藥物代謝酶的表達(dá)。細(xì)胞色素P450s (CYPs)是混合功能單加氧酶和異生物質(zhì)I期代謝中的主要酶。依 賴于異生物質(zhì)的性質(zhì)，這種氧化代謝導(dǎo)致藥物前體的失活和促進(jìn)的消除、激活或代謝激活。 CYP表達(dá)的主要部位是肝臟，并且CYP3A4是人成年肝臟中最豐富的CYP同工酶。對于藥物 代謝具有最大重要性的酶屬于家族1-3，負(fù)責(zé)臨床使用藥物的70-80%的所有I期依賴性代 謝。由于多態(tài)現(xiàn)象，CYP表達(dá)和活性呈現(xiàn)很大的個體間變異。此外，CYI^s可以由特定藥物誘 導(dǎo)幾倍或抑制，導(dǎo)致另外，盡管暫時的代謝活性的變異性。特別地，在肝細(xì)胞內(nèi)3個主要CYP 家族(1- 基本CYP活性的組成對于藥物代謝具有極大重要性。在本文例子中描述了 hBS 細(xì)胞衍生的DE-H印細(xì)胞，其中檢測出來自所有測試CYP酶的mRNA，包括CYP1A2 (成年肝臟 特異性酶)、CYP2C9和CYP3A4。檢測出主要CYP家族更精確地CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4 的基本CYP活性，并且另外這3種提及的CYPs活性的個體間組成類似于人原代肝細(xì)胞的那 種。此外，CYP1A2也是另一種成年肝臟特異性酶，即CYP7A1 (膽固醇7 α羥化酶)，在DE-Hep 細(xì)胞中表達(dá)，證實它們的成年肝表型。因此，本發(fā)明提供了用于制備表達(dá)功能藥物代謝酶的 DE-Hep細(xì)胞的方法。除I期酶如CYPs外，肝細(xì)胞還表達(dá)II期酶如UGTs。因此，本發(fā)明提供了用于制備 表達(dá)II期酶的DE-H印細(xì)胞的方法。在本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面，DE-h印細(xì)胞表達(dá)I期酶 和 II 期酶，特別是 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 連同 UGT1A6 和 / 或 UGT1A。此外，肝細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞色素P還原酶，這是對于CYPs重要的氧化還原配偶體，并 且因此對于CYP功能性是必需的。因此，本發(fā)明提供了用于制備表達(dá)細(xì)胞色素P還原酶的 DE-Hep細(xì)胞的方法。當(dāng)分析肝臟的藥物代謝和毒性時，在肝細(xì)胞的功能藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如BSEP、MRP2、 OATPs (例如0ATP-2) ,MDRl和3、NTCP和0CT-1是必需的。因此，本發(fā)明提供了用于制備表 達(dá)功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的DE-H印細(xì)胞的方法。
因此，在一個實施方案中，DE-hep可以表達(dá)選自CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、 UGT1A6、UGT1A、0ATP-2、MRD3和/或BSEP的I期酶，II期酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)，連同其他肝臟標(biāo) 記，例如醇脫氫酶Ia(ADHlA)和/或白蛋白。肝臟相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如HNFlα、3α、3β、4α 和 6、PXR、CAR、FXR、RXR、C/raP A和B 的 表達(dá)是獲得成年肝表型必需的。因此，本發(fā)明提供了用于制備表達(dá)此種轉(zhuǎn)錄因子的DE-H印 細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)由定型內(nèi)胚層用于從人胚泡衍生干(hBQ細(xì)胞制備DE-H印祖 細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及像這樣的DE-H印祖細(xì)胞和像這樣的DE-H印細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的DE-H印祖細(xì)胞顯示EpCAM、HNFl、HNF3b、HNF 、AFP、結(jié)蛋白、CD133、 c-kit、Notch2、ICAMl ( = CD54)、CK7、CK8、CK18 和 CK19 中的一種或多種的基因表達(dá)(參 見實施例8、表2和實施例9)。發(fā)明詳述定義和縮寫如本文所使用的，術(shù)語“胚泡衍生干細(xì)胞”指BS細(xì)胞，并且人形式稱為“hBS細(xì)胞”。 在文獻(xiàn)中，該細(xì)胞通常稱為胚胎干細(xì)胞，并且更具體而言人胚胎干細(xì)胞。如本文所使用的；階段I產(chǎn)物定型內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞，階段II產(chǎn)物經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生的DE-H印祖細(xì)胞，例如成肝細(xì)胞樣細(xì)胞。階段III產(chǎn)物經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生的DE-H印細(xì)胞，例如功能肝細(xì)胞樣細(xì)胞。術(shù)語“至少XX%的細(xì)胞或相關(guān)的細(xì)胞核顯示yy的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)”意指 “至少XX%的細(xì)胞顯示yy的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)”或“至少XX%的細(xì)胞核顯示yy的基 因表達(dá)”術(shù)語“固有分化”意指衍生自hBS細(xì)胞的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，所述hBS細(xì)胞已在MEFs上 在無特定補(bǔ)充劑(例如，活化素A)的VitroHES 中進(jìn)行培養(yǎng)，但將bFGF加入培養(yǎng)基中并且 培養(yǎng)基更換很少(參考專利申請W02007/140968A1)。術(shù)語“功能肝細(xì)胞”意指表達(dá)成熟肝細(xì)胞標(biāo)記尤其例如白蛋白、CYP3A4、UGT2B7、 0ATP-2、ADH1A、UGT1A6、CYP2C9、CYP2C19 和 CYP2D6 的細(xì)胞類型。在肝臟中的異生物質(zhì)代謝通常分成3個時期修飾(I期)、綴合(II期)和排泄 (III期)。這些反應(yīng)協(xié)同作用以使異生物質(zhì)解毒且從細(xì)胞中去除它們。在I期中，各種酶作用于將反應(yīng)性和極性基團(tuán)引入其底物內(nèi)。最常見的修飾之一 是由細(xì)胞色素P-450依賴性混合功能氧化酶系統(tǒng)催化的羥化。如本文所使用的，“CYP”意指細(xì)胞色素P，且更具體而言細(xì)胞色素P450，由許多不 同同工酶構(gòu)成的肝臟主要I期代謝酶，例如CYPlAl、CYP1A2、CYPlBl、CYP2A6/2A7/2A13、 CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2EU CYP3A4, CYP3A5、CYP3A7 和 CYP7A1。在肝臟中的II期反應(yīng)由一大群廣泛特異性的轉(zhuǎn)移酶催化，所述轉(zhuǎn)移酶組合可以 代謝包含親核或親電子基團(tuán)的幾乎所有疏水化合物。這些基團(tuán)中最重要的一種是谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)。如本文所使用的，術(shù)語“GST”意指谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，并且其亞型的例子是GST Al-UGST Ml-I 和 GST Pl-I0
如本文所使用的，術(shù)語“UGT”意指尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶，這是催化葡萄 苷酸化活性的一群肝臟酶。II期反應(yīng)后，肝臟可能進(jìn)一步代謝來自II期反應(yīng)的產(chǎn)物。綴合物及其代謝產(chǎn)物 可以在其代謝III期中從細(xì)胞中排泄，其中陰離子基團(tuán)充當(dāng)親和標(biāo)記用于多藥抗性蛋白質(zhì) (MRP)家族的各種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些蛋白質(zhì)是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員，并且可以 催化大量的各種疏水陰離子的ATP依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)，并且因此作用于去除II期產(chǎn)物至細(xì)胞外介 質(zhì)，在其中它們可以進(jìn)一步代謝或排泄。如本文所使用的，術(shù)語“0ΑΤΡ”意指有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，其在肝臟中介導(dǎo)有機(jī)陰 離子的鈉(Na+)不依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)，例如磺溴酞(BSP)以及綴合(牛磺膽酸鹽)和未綴合(膽 酸鹽)膽酸(通過相似性)。OATP家族的3個重要成員是0ATP-2(有時稱為OATP-C或 0ATP1B1)、0ATP-8 (有時稱為 0ATP1B3)和 OATP-A (有時稱為 0ATP1A2)。如本文所使用的，術(shù)語“細(xì)胞色素P450還原酶”(也稱為CPR)意指這樣的蛋白質(zhì)， 它的生理功能是通過電子轉(zhuǎn)移還原細(xì)胞色素P450酶并且因此是細(xì)胞色素P450酶介導(dǎo)的反 應(yīng)所需的。術(shù)語“功能藥物代謝酶”意指屬于I期和II期酶的功能酶，其執(zhí)行異生物質(zhì)和藥 物的化學(xué)修飾，所謂的藥物或異生物質(zhì)代謝。如本文所使用的，術(shù)語“功能活性”指通常在原代人肝細(xì)胞中檢測出的有效可測量 的肝細(xì)胞功能，例如對于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可測量的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和對于細(xì)胞色素P450s (CYPs)可 測量的酶代謝。如本文所使用的，術(shù)語“胚外內(nèi)胚層(ExE) ”意指分化的內(nèi)胚層細(xì)胞，與定型內(nèi)胚層 相反，它將構(gòu)成人發(fā)育中的胚胎外區(qū)室，例如卵黃囊。如本文所使用的，術(shù)語“AAT”意指肝臟標(biāo)記α-抗胰蛋白酶。如本文所使用的，術(shù)語“載脂蛋白Ε”意指這樣的一類脂蛋白，其攜帶膽固醇和其他 脂肪作為小囊泡通過血流，并且是這些分子的正常分解所需的。載脂蛋白E是稱為極低密 度脂蛋白的特定脂蛋白的主要組分，其具有從血液中去除過量膽固醇并且將其攜帶至肝臟 用于處理的主要功能。如本文所使用的，術(shù)語“醇脫氫酶1”意指這樣的一類脫氫酶，其促進(jìn)醇和醛或酮之 間的互換，伴隨NAD+還原成NADH。醇脫氫酶1作用于分解否則可以是毒性的醇。如本文所使用的，術(shù)語“AFP”意指肝臟標(biāo)記甲胎蛋白。如本文所使用的，術(shù)語“BSEP”意指膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膽汁鹽輸出泵。如本文所使用的，術(shù)語“CK”意指肝臟標(biāo)記細(xì)胞角蛋白(可互換使用)，具有不同 亞型例如細(xì)胞角蛋白18(CK18)、細(xì)胞角蛋白19(CK19)、細(xì)胞角蛋白8(CK8)和細(xì)胞角蛋白 7(CK7)。如本文所使用的，術(shù)語“c-Met”意指肝細(xì)胞生長因子和/或散射因子受體。如本文所使用的，術(shù)語“葡萄糖6磷酸酶”意指在糖質(zhì)新生途徑中使葡萄糖6-磷 酸脫磷酸的酶，從而使得游離葡萄糖可以經(jīng)由葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膜蛋白質(zhì)從細(xì)胞中輸出。葡 萄糖-6-磷酸酶在肝臟和腎臟中發(fā)現(xiàn)，并且涉及器官的葡萄糖動態(tài)平衡作用。如本文所使用的，術(shù)語“ ICAM-I，，意指細(xì)胞間粘附分子1 (有時稱為⑶。如本文所使用的，術(shù)語“LFABP”意指肝臟脂肪酸結(jié)合蛋白(可互換使用)。
如本文所使用的，術(shù)語“EpCAM”意指上皮細(xì)胞粘附分子(可互換使用)。如本文所使用的，術(shù)語“FGF”指成纖維細(xì)胞生長因子，優(yōu)選具有人和/或重組起 源，和屬于其的亞型是例如“bFGF”(指堿性成纖維細(xì)胞生長因子，有時也稱為FGF2)和 FGF4?！癮FGF”指酸性纖維細(xì)胞生長因子(有時也稱為FGF1)。如本文所使用的，術(shù)語“BMP”指成骨蛋白，優(yōu)選具有人和/或重組起源，并且屬于 其的亞型是例如BMP4和BMP2。如本文所使用的，術(shù)語“HGF”指肝細(xì)胞生長因子，優(yōu)選具有人和/或重組起源。如本文所使用的，術(shù)語“Dex”指地塞米松。如本文所使用的，術(shù)語“0SM”指制癌素M。如本文所使用的，術(shù)語“ ITS混合物”指胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒混合物，例如來自 Invitrogen的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-A補(bǔ)充劑(100X)(目錄號-51300-044)。如本文所使用的，術(shù)語“DMS0”指二甲基亞砜。如本文所使用的，可互換使用的“HNF3i3 ”和/或“HNFIBb”意指肝細(xì)胞核因子3，調(diào) 節(jié)內(nèi)胚層衍生組織例如肝臟、胰島和脂肪細(xì)胞中的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。HNF3i3有時也可 以稱為HNFIBb或R)x2A，后面一個名稱源于轉(zhuǎn)錄因子是叉頭框(ForWiead box)轉(zhuǎn)錄因子家 族成員。如本文所使用的，可互換使用的“HNF4 α ”和/或“HNMa”意指肝細(xì)胞核因子4 α， 對于肝臟發(fā)育、肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)和胰臟β細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)節(jié)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。如本文所使用的，術(shù)語“NTCP”意指牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，并且是將膽酸從門靜 脈循環(huán)吸收到肝細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因此，膽酸的這種攝取是膽酸的腸-肝再循環(huán)的重要 組分，并且因此對于足夠的膽汁流動和正常肝臟功能是關(guān)鍵的。如本文所使用的，術(shù)語“0CT-1”意指有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1。0CT-1是主要肝轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白，其介導(dǎo)許多有機(jī)陽離子從血液攝取到肝臟內(nèi)，在其中化合物可以代謝或分泌到膽汁 內(nèi)。如本文所使用的，術(shù)語“MDR”意指多藥抗性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MDR 1和3是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié)合盒(ABC)家族成員，并且兩者都是藥物流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。MDR 1在調(diào)節(jié)藥物、肽和異生物 質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)的運(yùn)輸中以及在保護(hù)機(jī)體不受異生物質(zhì)損傷和藥物毒性中是重要的，而MDR 3 是磷脂分泌到膽汁內(nèi)必需的。如本文所使用的，術(shù)語“Wnt3a”意指wingless相關(guān)的MMTV整合位點(diǎn)3A。如本文所使用的，術(shù)語“活化素”意指TGF-β家族成員，其顯示廣泛范圍的生物 活性，包括細(xì)胞增殖和分化調(diào)節(jié)，例如“活化素A”或“活化素B”?；罨貙儆谂潴w的常見 TGF-β超家族。如本文所使用的，術(shù)語“無異物”意指直接或間接暴露于非人動物組分的完全避
免ο如本文所使用的，術(shù)語“分化誘導(dǎo)劑”意指誘導(dǎo)細(xì)胞分化的任何類型的因子，包括 但不限于在圍繞細(xì)胞的物理微環(huán)境中的化學(xué)制品、生物制品和組分；特別地，該術(shù)語用于外 源性因子，即供應(yīng)給培養(yǎng)物的因子。如本文所使用的，術(shù)語“固有因子方案”指示分化通過暴露于分泌至培養(yǎng)基的固有 因子誘導(dǎo)?？梢圆捎孟率龇桨竓BS細(xì)胞在IVF培養(yǎng)皿(Falcon)中的mEF細(xì)胞層上生長，并且在37°C、5% C02和95%濕度下實施分化直至40天，以獲得肝細(xì)胞樣細(xì)胞。使用的培 養(yǎng)基(具有加入的 4ng/ml 人重組 bFGFUnvitrogen]的 VitroHESTM[Vitrolife AB])每 7 至21天進(jìn)行更換，通常每14天，通過棄去約1至aiil舊培養(yǎng)基并且加入1至2ml新鮮培養(yǎng)基。飼養(yǎng)細(xì)胞如本文所使用的，飼養(yǎng)細(xì)胞意指單獨(dú)或組合使用的支持性細(xì)胞類型。細(xì)胞類型可 以進(jìn)一步具有人或其他物種起源。飼養(yǎng)細(xì)胞可以衍生自其的組織包括胚胎、胎兒、新生兒、 青少年或成人組織，并且它進(jìn)一步包括衍生自皮膚的組織，包括包皮、臍帶、肌肉、肺、上皮、 胎盤、輸卵管、腺、基質(zhì)或乳腺。飼養(yǎng)細(xì)胞可以衍生自屬于由人成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì) 胞、角化細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞組成的群體的細(xì)胞類型。可以用于衍生飼養(yǎng)細(xì)胞的特定 細(xì)胞類型例子包括胚胎成纖維細(xì)胞、胚外內(nèi)胚層細(xì)胞、胚外中胚層細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞和 /或纖維細(xì)胞、胎兒肌細(xì)胞、胎兒皮膚細(xì)胞、胎兒肺細(xì)胞、胎兒內(nèi)皮細(xì)胞、胎兒上皮細(xì)胞、臍 帶間充質(zhì)細(xì)胞、胎盤成纖維細(xì)胞和/或纖維細(xì)胞、胎盤內(nèi)皮細(xì)胞、出生后包皮成纖維細(xì)胞和 /或纖維細(xì)胞、出生后肌細(xì)胞、出生后皮膚細(xì)胞、出生后內(nèi)皮細(xì)胞、成人皮膚成纖維細(xì)胞和/ 或纖維細(xì)胞、成人肌細(xì)胞、成人輸卵管內(nèi)皮細(xì)胞、成人腺子宮內(nèi)膜細(xì)胞、成人基質(zhì)子宮內(nèi)膜 細(xì)胞、成人乳腺癌實質(zhì)細(xì)胞、成人內(nèi)皮細(xì)胞、成人上皮細(xì)胞或成人角化細(xì)胞。當(dāng)飼養(yǎng)細(xì)胞衍 生自hBS細(xì)胞時，細(xì)胞可以是成纖維細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的方法中(即，階段I-III中的任何)，可以使用飼養(yǎng)細(xì)胞例如人或 小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞，或該方法可以沒有任何飼養(yǎng)細(xì)胞的任何使用。在一個具體實施方案中，培養(yǎng) 是無異物的。在另一個具體實施方案中(例如，當(dāng)DE-Hep細(xì)胞用于治療用途時)，細(xì)胞可以 是自體細(xì)胞，即衍生自治療的受試者。如本文所使用的，術(shù)語“MEF細(xì)胞”意指小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。在本發(fā)明中，在本發(fā)明中使用特別考慮支持肝細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)基，例如 HCM(肝細(xì)胞培養(yǎng)基)培養(yǎng)基、Williams E培養(yǎng)基和RPMIAdvanced培養(yǎng)基。如由本文例子顯而易見的，本發(fā)明涉及用于制備i)DE_H印祖先(階段II的結(jié)果) 和ii)DE-H印細(xì)胞(成熟DE-H印祖細(xì)胞和階段III的結(jié)果，還參見圖IA和B)的分階段方 法。DE-H印祖細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的DE-H印祖先和DE-H印細(xì)胞可以有利地用于治療和/或預(yù)防幾種肝 疾病和病癥。因此，根據(jù)本發(fā)明DE-H印祖先和DE-H印細(xì)胞可以在藥劑中使用。DE-H印祖細(xì)胞是DE-H印細(xì)胞的祖細(xì)胞，并且因此，它們適當(dāng)?shù)赜糜诶绔@得衍生 自定型內(nèi)胚層的代謝感受態(tài)肝細(xì)胞樣細(xì)胞，或用于研究針對肝細(xì)胞樣細(xì)胞的成熟。如由下文描述顯而易見的，本發(fā)明還涉及用于制備i) DE-Hep祖先和ii) DE-Hep細(xì) 胞(其為成熟DE-Hep細(xì)胞)的分階段方法。如

圖1中舉例說明的，這種方法涉及DE細(xì)胞 的形成，通過培養(yǎng)hBS細(xì)胞(階段I)，其后從DE細(xì)胞獲得DE-H印祖細(xì)胞(階段II)，和最 終從祖先DE-h印形成成熟DE-H印細(xì)胞(階段III)。階段IDE細(xì)胞通常通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)hBS細(xì)胞來獲得，所述培養(yǎng)基包括活化素A和任 選地一種或多種生長因子例如FGF2和血清尤其是FCS。還可以包括其他合適物質(zhì)，例如Wnt3a。該方法包括對hBS細(xì)胞實施培養(yǎng)條件，其中hBS細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)以發(fā)育成定型內(nèi)胚 層細(xì)胞。階段I包括在包括活化素的第一種階段I培養(yǎng)基中培養(yǎng)hBS細(xì)胞2-6天，其中在 培養(yǎng)1-2天后培養(yǎng)基由第二種階段I培養(yǎng)基替換，所述第二種階段I培養(yǎng)基包括活化素、一 種或多種生長因子和在一個優(yōu)選實施方案中血清。活化素A在某些情況下可以由類似物質(zhì) 例如活化素B或卵泡抑素替換。第一種和/或第二種階段I培養(yǎng)基都可以是RPMI高級培養(yǎng)基(RPMIadvanced medium)或DMEM培養(yǎng)基。這種第一種和/或第二種階段I培養(yǎng)基可以進(jìn)一步補(bǔ)充有一種或 多種生長因子尤其是FGF2和/或Wnt3a，和血清尤其是胎牛血清(縮寫為在本文中可互換 使用的FBS或FCS)，如本發(fā)明的方案1、實施例2中顯示的。如實施例2 (方案1-4)中顯示的，hBS細(xì)胞可以根據(jù)下述方案之一進(jìn)行培養(yǎng)第1天第一種階段I培養(yǎng)基包含活化素(例如，方案1)，第1天第一種階段I培養(yǎng)基包含活化素和生長因子尤其是FGF2 (例如，方案2和 3)，第1天第一種階段I培養(yǎng)基包含活化素(例如，方案4)。第2天第二種培養(yǎng)基包含活化素和血清(例如，方案1)，和任選地FGF2。第2天第二種培養(yǎng)基包含活化素、血清和生長因子尤其是FGF2(例如，方案2、3 和4)。第3和4天第二種培養(yǎng)基包含活化素、FGF2和血清(例如，方案1)。第3和4天第二種培養(yǎng)基包含活化素、血清和生長因子尤其是FGF2 (例如，方案 2、3 禾口 4)。在任何給定的上述培養(yǎng)基時供應(yīng)給hBS細(xì)胞的活化素濃度可以在約80-120ng/ml 范圍中，例如 90-110ng/ml、95-105ng/ml 或 100ng/ml。Wnt3A 濃度將優(yōu)選是約 20ng/ml，例 如25ng/ml、30ng/ml。最優(yōu)選的是25ng/ml的濃度。血清例如FBS的濃度可以在約0%至10%的范圍中，例如0. 1-5%或0.2-3%。如 圖IB中顯示的，血清濃度在階段I過程中可變，例如第一種階段I培養(yǎng)基具有0%血清，例 如隨后為在第二種階段I培養(yǎng)基中0. 2%血清濃度，和在某些情況下甚至進(jìn)一步增至例如 1% FBS，如圖IB中的方案4顯示的。階段II-DE-H印祖先本發(fā)明涉及用于制備經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生自人胚泡衍生干(hBQ細(xì)胞的DE-H印 祖細(xì)胞的方法。在階段II時，繁殖得自階段I的細(xì)胞，并且階段II包括在階段II培養(yǎng)基中培養(yǎng) 來自階段I的細(xì)胞，所述階段II培養(yǎng)基包括一種或多種生長因子和任選地成骨蛋白，和任 選地收獲因此獲得的DE-h印祖細(xì)胞。通常，培養(yǎng)在培養(yǎng)基例如RPMI高級培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基、HCM培養(yǎng)基、基于 William E的培養(yǎng)基或VitroHES 等中進(jìn)行。培養(yǎng)基通常補(bǔ)充有各種因子例如生長因子。 FGF2、PEST和/或GlutaMAX是適當(dāng)?shù)匕ㄔ谂囵B(yǎng)基中的物質(zhì)例子。培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)乩缑刻旎蛎扛粢惶爝M(jìn)行更換。此外，培養(yǎng)基可以包括一種或多種生長因子尤其是aFGF，和成骨蛋白尤其是BMP2。在一個具體實施方案中，培養(yǎng)基進(jìn)一步包括血清替代品或血清例如FBS，和在另一 個具體實施方案中，培養(yǎng)基可以進(jìn)一步包括HGF。在一個具體實施方案中，DE-H印祖先通過下述方法獲得，其中DE細(xì)胞通過如上所 述的方法獲得，根據(jù)下述方案進(jìn)行培養(yǎng)，如實施例2 (方案1-4)中顯示的階段II的第1天至第4天階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2、BMP4、一種或多種進(jìn)一步的 成骨蛋白尤其是BMP2、血清尤其是FBS、PEST和GlutaMAX、和任選地一種或多種進(jìn)一步的生 長因子尤其是aFGF (例如，方案1)，階段II的第1至8天階段II培養(yǎng)基包含HGF(例如，方案2)，階段II的第1至5天階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF4、BMP2 (例如，方案3)，階段II的第1至3天階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2、BMP4、血清尤其是FBS (例如，方 案4)，階段II的第4至10天階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2、BMP4、血清尤其是FBS、和HGF (例 如，方案1)，階段II的第6至10天HGF(例如，方案3)，階段II的第4至8天階段II培養(yǎng)基包含HGF、FGF2、EGF和血清例如FBS (方案 4)階段II中的細(xì)胞優(yōu)選培養(yǎng)8天，血清例如FBS的濃度在第6天時增加，并且生長 因子尤其是EGF的補(bǔ)充劑在第6天時給予，并且從第6天到第8天培養(yǎng)基每天進(jìn)行更換。如實施例中顯示的，濃度和優(yōu)選實施方案可以包括方案1補(bǔ)充有PESTU % Glutamax且另外具有下述的RPMI高級培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng) 基；第5 天aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分另Ij 為 100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ ml)0· 2% FCSo第6 天aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(分另ij 為 100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ ml)0· 2% FCSo第7 天bFGF、BMP4、HGF(分別為 50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0· 2% FCS。第8 天bFGF、BMP4、HGF(分別為 50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0· 2% FCS。第9 天bFGF、BMP4、HGF(分別為 50ng/ml、200ng/ml、50ng/ml)0· 2% FCS。相對高的HGF濃度(100-200ng/ml)可以用于第一天。任選地第6-13天可以是；第6 天:BMP4 (50ng/ml), FGF2 (4ng/ml)、0· 2% FCS,第7 天:BMP4 (50ng/ml), FGF2 (4ng/ml) ,0. 2% FCS
第 8-9 天=FGFl (50ng/ml)、FGF2 (4ng/ml) U % FCS第10 天HGF、FGF2(分別為 50ng/ml、4ng/ml)、1 % FCS第11-13 天HGF、FGF2、EGF (分另Ij為 50ng/ml、4ng/ml、lOng/ml)、1 % FCS其中在第11至13天時可以給予更高的FCS濃度和EGF(10ng/ml)的補(bǔ)充劑。備選地，BMP4、FGF2(分別為50ng/ml3ng/ml)0. 2% FCS可以用于第6-7天，隨后為在第8-9天時的aFGF、FGF2(分別為50ng/ml、4ng/ml) 1 % FCS，和在第9-10天時的HGF、 FGF2、EGF(分別為 50ng/ml,2ng/ml, 10ng/ml) 1 % FCS。在另一個實施方案中，可以使用補(bǔ)充有PEST、1 % Glutamax且另外具有 HGF(20ng/ml)和0% FCS的HCM培養(yǎng)基或基于Williams E的培養(yǎng)基，其中HGF的濃度在第 6-12天時是約20ng/ml。備選地，第6_15天可以通過(方案3)在第6_9天時使用FGF4、 BMP2(分別為 30ng/ml、20ng/ml)0% FCS，和在第 10-15 天時使用 HGF QOng/ml) O % FCS 加 以改變。根據(jù)上文，當(dāng)存在時，可見aFGF的濃度在約50至約200ng/ml的范圍中，bFGF是 約 2-50ng/ml)，BMP2 是約 25-100ng/ml，BMP4 是 25_300ng/ml ( 一般而言，在階段開始時采 用比以后更高的濃度)，HGF是約25-300ng/ml)，F(xiàn)GF2是約1至約10ng/ml，F(xiàn)GFl是約25至 約 100ng/ml，EGF 是約 5_50ng/ml)，F(xiàn)CS 是約 0. 1 % -5%。方案1的另一個實施方案可以包括第1 天活化素 A、bFGF(100ng/ml、5ng/ml)。第2-5 天活化素 A、bFGF(100ng/ml、5ng/ml) ,0. 2% FCS0第5-7天無培養(yǎng)基更換。第8-14 天aFGF、bFGF、BMP2、BMP4(100ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、200ng/ml)、0· 2% FCS。第15-21 天補(bǔ)充有 bFGF、HGF (aig/ml、20ng/ml)的 WME+SQ。其中WME+SQ，補(bǔ)充有 Dex、0SM bFGF、HGF (100nM、10ng/ml、aig/ml、2ng/ml)。其中Wi 11 iams培養(yǎng)基E和SQ是包含谷氨酸、抗壞血酸、牛血清白蛋白、氫化可的 松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素的SingleQuots。DE-H印祖先的表征如本文例子中顯示的，獲得的DE-H印祖細(xì)胞顯示EpCAM、HNFl、HNF;3b、HNF4a、結(jié)蛋 白、CD133、c-kit、CAMl ( = CM4)、CK8、CK18和CK19中的一種或多種，例如2種或更多、4 種或更多、6種或更多、8種或更多、10種或更多、12種或更多或全部的基因表達(dá)(參見實施 例7、表2和實施例8)。就DE-Hep祖先的表征而言的更多細(xì)節(jié)由段落“發(fā)明概述”、本文實施例和附圖可 見。階段III如本文前文描述的，本發(fā)明的方法還提供經(jīng)由hBS細(xì)胞衍生自DE細(xì)胞的DE-H印 細(xì)胞，即肝細(xì)胞樣細(xì)胞。為了獲得此種細(xì)胞，在上文描述的方法中包括進(jìn)一步的階段，即階 段III。階段III涉及在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如階段II (和任選地階段I)中所述獲得的DE-H印 祖細(xì)胞，所述培養(yǎng)基例如基于Williams E的培養(yǎng)基、Leibovitz L_15培養(yǎng)基或HCM Cambrex 培養(yǎng)基或可比較培養(yǎng)基，任選補(bǔ)充有單獨(dú)或組合的分化和/或CYP誘導(dǎo)劑，例如DMS0、地塞 米松、奧美拉唑、利福平、脫氧苯巴比妥、乙醇、異煙胼；ITS 混合物；BMP 禾口 / 或 TGFP, OSM 禾口 / 或 EGF,尤其是 BMP4 禾口 / 或 HGF。在階段III中，培養(yǎng)通常執(zhí)行10-25天或更多天。培養(yǎng)基通常每天更換直至第15天時，并且相關(guān)時，對于其余培養(yǎng)期每隔一天更換。用于制備DE-h印祖細(xì)胞和DE-h印細(xì)胞的方法包括上文描述的合適階段。對于所有實施方案，如本文實施例1中所述的原材料可以適當(dāng)?shù)厥且栽谙率鰧＠?申請中詳細(xì)描述的下述4種不同方法獲得的未分化的人胚泡衍生干細(xì)胞；1. hBS 細(xì)胞系建立和 LOT 制備(W003055992)2. hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無飼養(yǎng)者的培養(yǎng)系統(tǒng)(W02004099394)3.無異物制備(W02007042225)4.酶促傳代的 hBS 細(xì)胞(W007107303)當(dāng)DE-h印細(xì)胞用于治療用途時，無異物制備是特別重要的。特別地，推薦作為原材料的hBS細(xì)胞或細(xì)胞系具有下述特征對于堿性磷酸酶、 SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60, TRA 1-81、0ct_4陽性對于SSEA-1陰性、端粒酶活性、以及在體 外和體內(nèi)的多能性(后者通過在免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤形成顯示)。如上所述，未分化的hBS細(xì)胞因此可以在本發(fā)明提及實施方案的任何中使用，這 進(jìn)一步包括下述具體5個實施方案實施方案權(quán)利要求
階段II-DE-H印祖先
1.用于制備經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生自人胚泡衍生干(hBQ細(xì)胞的DE-H印祖細(xì)胞的方法， 所述方法包括對hBS細(xì)胞實施培養(yǎng)條件，所述培養(yǎng)條件包括i)階段I，其中誘導(dǎo)所述hBS細(xì)胞以發(fā)育成定型內(nèi)胚層細(xì)胞，階段I包括在包括活化素 的第一種階段I培養(yǎng)基中培養(yǎng)hBS細(xì)胞1-7天，優(yōu)選2-6天，其中在培養(yǎng)1-2天后所述培養(yǎng) 基由第二種階段I培養(yǎng)基替換，所述第二種階段I培養(yǎng)基包括活化素、一種或多種生長因子 和任選地血清， )階段II，其中繁殖得自階段I的所述細(xì)胞，并且階段II包括在階段II培養(yǎng)基中 培養(yǎng)來自階段I的所述細(xì)胞，所述階段II培養(yǎng)基包括一種或多種生長因子和任選地成骨蛋 白，任選地收獲因此獲得的DE-h印祖細(xì)胞。 階段I
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述第一種和/或第二種階段I培養(yǎng)基是RPMI高級培 養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述第一種和/或第二種階段I培養(yǎng)基補(bǔ)充有一 種或多種生長因子尤其是FGF2、Wnt3a,以及血清尤其是FBS。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述hBS細(xì)胞根據(jù)下述方案之一進(jìn)行培養(yǎng)第1天所述第一種階段I培養(yǎng)基包含活化素和任選地Wnt3A (例如，方案1)， 第1天所述第一種階段I培養(yǎng)基包含活化素和生長因子，尤其是FGF2(例如，方案2 和3)，第1天所述第一種階段I培養(yǎng)基包含活化素(例如，方案4)。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述hBS細(xì)胞根據(jù)下述方案之一進(jìn)行培養(yǎng)第2天所述第二種培養(yǎng)基包含活化素和血清(例如，方案1)， 第2天所述第二種培養(yǎng)基包含活化素、血清和生長因子尤其是FGF2 (例如，方案2、3 和4)。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述hBS細(xì)胞根據(jù)下述方案進(jìn)行培養(yǎng) 第3至4天所述第二種培養(yǎng)基包含活化素和血清(例如，方案1)，第3至5天所述第二種培養(yǎng)基包含活化素、血清和生長因子尤其是FGF2(例如，方案 2、3 禾口 4)。 階段II
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述第二種階段II培養(yǎng)基包括生長因子 尤其是FGF2，和任選地成骨蛋白尤其是BMP4。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II培養(yǎng)基包括RPMI高級培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、HCM培養(yǎng)基、基于William E的培養(yǎng)基或VitroHes 等。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II培養(yǎng)基補(bǔ)充有FGF2、PEST和/或 GlutaMAX0
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II培養(yǎng)基每天或每隔一天進(jìn)行更換。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II培養(yǎng)基進(jìn)一步包括一種或多種生 長因子尤其是aFGF，和成骨蛋白尤其是BMP2。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II培養(yǎng)基進(jìn)一步包括血清例如FBS。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II培養(yǎng)基進(jìn)一步包括HGF。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述細(xì)胞根據(jù)下述方案之一進(jìn)行培養(yǎng) 階段II的第1天至第4天所述階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2、BMP4、一種或多種進(jìn)一步的成骨蛋白尤其是BMP2、血清尤其是FBS、PEST和GlutaMAX、和任選地一種或多種進(jìn)一步的生 長因子尤其是aFGF (例如，方案1)，階段II的第1至8天所述階段II培養(yǎng)基包含HGF(例如，方案2)， 階段II的第1至5天所述階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF4、BMP2 (例如，方案3)， 階段II的第1和第3天所述階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2、BMP4、血清尤其是FBS (例如， 方案4)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述細(xì)胞根據(jù)下述方案之一進(jìn)行培養(yǎng) 階段II的第4至10天所述階段II培養(yǎng)基包含F(xiàn)GF2、BMP4、血清尤其是FBS、和HGF (例如，方案1)，階段II的第6至10天HGF(例如，方案3)，階段II的第4至8天所述階段II培養(yǎng)基包含HGF、FGF2、EGF和血清例如FBS (方案4)。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中階段II中的所述細(xì)胞培養(yǎng)8天，所述血清 例如FBS的濃度在第6天時增加，并且生長因子尤其是EGF的補(bǔ)充劑在第6天時給予，并且 從第6天到第8天所述培養(yǎng)基每天進(jìn)行更換。DE-Hep祖先的表征
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中得自階段II的所述細(xì)胞顯示HNF3b、 HNF4a、EpCAM、結(jié)蛋白、CD133、ICAMl、CK8、CK18和Ckl9中的一種或多種的基因表達(dá)。
18.DE-hep 祖細(xì)胞，其顯示 HNF1、HNF3b、HNF4a、EpCAM、AFP、結(jié)蛋白、CD133、 ICAMl (⑶Μ)、CK8、CK18和CK19中的一種或多種的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的DE-hep祖細(xì)胞，其顯示CK8、CK18和CK19、ICAM的基因表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的DE-h印祖細(xì)胞，其顯示EpCAM，以及HNF1、HNF3b、HNF4a 中的一種或多種優(yōu)選全部的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項的DE-H印祖細(xì)胞，其可通過如權(quán)利要求1_17中任一 項限定的方法獲得。
22.細(xì)胞群體，其包括如權(quán)利要求18-21中任一項限定的DE-h印祖細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的細(xì)胞群體，其中至少25%的所述細(xì)胞是DE-hep祖細(xì)胞。 階段III
24.用于制備經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生自人胚泡衍生干(hBS)細(xì)胞的DE-H印細(xì)胞的方法， 所述方法包括對hBS細(xì)胞實施培養(yǎng)條件，所述培養(yǎng)條件包括 )階段II，其中繁殖DE細(xì)胞，并且階段II包括在階段II培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自階段I 的所述細(xì)胞，所述階段II培養(yǎng)基包括一種或多種生長因子和任選地成骨蛋白，iii)階段III，其中使得自階段II的所述細(xì)胞成熟為DE-Hep細(xì)胞，階段III包括在階 段III培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自階段II的所述細(xì)胞，所述階段III培養(yǎng)基包括一種或多種生長因 子和分化誘導(dǎo)劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其包括i)階段I，其中誘導(dǎo)所述hBS細(xì)胞以發(fā)育成定型內(nèi)胚層細(xì)胞，階段I包括在包括活化素 的第一種階段I培養(yǎng)基中培養(yǎng)hBS細(xì)胞1-7天，優(yōu)選2-6天，其中在培養(yǎng)1天后所述培養(yǎng)基 由第二種階段I培養(yǎng)基替換，所述第二種階段I培養(yǎng)基包括活化素、一種或多種生長因子和 任選地血清，其中步驟i)在步驟ii)前，并且在步驟ii)中采用的所述DE細(xì)胞是得自階段I的細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求M和25的方法，其中階段I和/或階段II如權(quán)利要求1-16中任一 項限定的來執(zhí)行。
27.根據(jù)權(quán)利要求M-26的方法，其中與使用相同種類的細(xì)胞但對所述細(xì)胞實施固有 分化制備的細(xì)胞比較，獲得的所述DE-H印細(xì)胞顯示下述增加的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)白 蛋白、UGT2B7、CYP3A4。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中白蛋白的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所述增加是至少 2倍，例如至少5倍。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或觀的方法，其中UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所述增加 是至少2倍，例如至少3倍。
30.根據(jù)權(quán)利要求27-29中任一項的方法，其中CYP3A4的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所 述增加是至少2倍，例如至少4倍。
31.根據(jù)權(quán)利要求27-30中任一項的方法，其中白蛋白的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所述 增加是至少5倍，并且UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所述增加是至少3倍。
32.根據(jù)權(quán)利要求M-31中任一項的方法，其中所述階段III培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基，例如 基于Williams E的培養(yǎng)基或HCM Cambrex培養(yǎng)基，任選補(bǔ)充有單獨(dú)或組合的誘導(dǎo)劑，例如 地塞米松、奧美拉唑、0SM、利福平、脫氧苯巴比妥、乙醇、異煙胼；ITS混合物；BMP和/或TGFP，尤其是BMP4和/或 HGF。
33.根據(jù)權(quán)利要求M-32中任一項的方法，其中所述階段III培養(yǎng)執(zhí)行10-60天或更多天。
34.根據(jù)權(quán)利要求M-33中任一項的方法，其中所述階段III培養(yǎng)基每2至3天更換直 至第15天時，并且相關(guān)時，對于其余培養(yǎng)期每2或3天更換。得自方法18-27的DE-H印細(xì)胞的表征
35.根據(jù)權(quán)利要求M-34中任一項的方法，其進(jìn)一步包括飼養(yǎng)細(xì)胞例如人或小鼠飼養(yǎng) 細(xì)胞的使用。
36.根據(jù)權(quán)利要求M-35中任一項的方法，其不包括飼養(yǎng)細(xì)胞的任何使用。
37.根據(jù)權(quán)利要求M-36中任一項的方法，相關(guān)時，其包括自體飼養(yǎng)細(xì)胞的使用。
38.根據(jù)權(quán)利要求M-37中任一項的方法，其中所述細(xì)胞的培養(yǎng)涉及塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶的使用，所述塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶在內(nèi)部包被有單獨(dú)或組合的一種或多種蛋白質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述一種或多種蛋白質(zhì)選自膠原、層粘連蛋白及其組合。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39中任一項的方法，其中所述細(xì)胞群體使用3D環(huán)境例如多孔濾器獲得。
41.DE-hep細(xì)胞，其顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)、藥物代謝酶和/或一種或多種轉(zhuǎn)錄因子中的一 種或多種標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的DE-hep細(xì)胞，其顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的一種或多種標(biāo)記，尤其是 BSEP, MRP2、0ATP-2 ( = OATP-C, 0ATP1B1)、0ATP-8 (0ATP1B3)、OATP-A ( = 0ATP1A2)、NTCP, MDR1、MDR3、0CT-1的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的DE-h印細(xì)胞，其顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的下述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或 基因表達(dá)MRP2、0ATP-2 ( = OATP-C, 0ATP1B1)、OATP-A ( = 0ATP1A2)、NTCP 和 0CT-1。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43的DE-h印細(xì)胞，其顯示關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的下述標(biāo)記的蛋白質(zhì) 和/或基因表達(dá)MDR1和/或MDR3。
45.根據(jù)權(quán)利要求41的DE-hep細(xì)胞，其顯示關(guān)于藥物代謝酶的一種或多種標(biāo)記，尤 其是 GSTAl-I、GSTMl-I、CYPs(CYPlAU CYP1A2, CYPlBl、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1、UGT1A6、UGT1A 禾口 / 或 UGT2B7 的蛋白質(zhì) 和/或基因表達(dá)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的DE-hep細(xì)胞，其顯示下述藥物代謝酶的蛋白質(zhì)和/或基因表 達(dá)CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和 CYP 3A4。
47.根據(jù)權(quán)利要求46 的 DE-h印細(xì)胞，其顯示 CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、 CYP2C8、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A7、CYP7A1 以及 UGT1A6、UGT1A、UGT2B7 的蛋白質(zhì)和 / 或基因表達(dá)。
48.根據(jù)權(quán)利要求41的DE-hep細(xì)胞，其顯示關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的一種或多種標(biāo)記，尤其是 FXR、RXR α、RXR β、RXR γ、HNFl α、HNF3 α、HNF3 β、HNF4 α、HNF6、C/EBP A、C/EBP B 的蛋 白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的DE-h印細(xì)胞，其顯示關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子的下述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或 基因表達(dá):RXRy ο
50.根據(jù)權(quán)利要求48 或 49 的 DE-hep 細(xì)胞，其顯示 FXR,RXR α、RXR^ ,HNFl α、HNF3 α、 HNF3 β、HNF4 α、HNF6、C/EBP A、C/EBP B 的蛋白質(zhì)和 / 或基因表達(dá)。
51.根據(jù)權(quán)利要求42-50中任一項的DE-h印細(xì)胞，其可通過如權(quán)利要求中任一 項的方法獲得。
52.細(xì)胞群體，其包括如權(quán)利要求42-51中任一項中限定的DE-h印細(xì)胞。
53.細(xì)胞群體，其中至少25%的所述細(xì)胞是如權(quán)利要求42-52中任一項中限定的 DE-hep 細(xì)胞。
54.體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中與使用相同種類的細(xì)胞但對所述細(xì)胞實施固有分 化制備的細(xì)胞比較，所述細(xì)胞顯示下述增加的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)白蛋白、UGT2B7、 CYP3A4。
55.根據(jù)權(quán)利要求M的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中白蛋白的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所述增加是至少2倍，例如至少5倍。
56.根據(jù)權(quán)利要求M-55的體外衍生的DE-h印細(xì)胞，其中UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或基因 表達(dá)的所述增加是至少2倍，例如至少3倍。
57.根據(jù)權(quán)利要求M-56的體外衍生的DE-h印細(xì)胞，其中CYP3A4的蛋白質(zhì)和/或基因 表達(dá)的所述增加是至少2倍，例如至少4倍。
58.根據(jù)權(quán)利要求M-57的體外衍生的DE-h印細(xì)胞，其中白蛋白的蛋白質(zhì)和/或基因 表達(dá)的所述增加是至少5倍，并且UGT2B7的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)的所述增加是至少3倍。
59.根據(jù)權(quán)利要求M-58的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞核顯示醇脫 氫酶1 (ADHlA)的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
60.根據(jù)權(quán)利要求M-59的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞核顯示 CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
61.根據(jù)權(quán)利要求M-60的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞核顯示 CYP7A1的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
62.根據(jù)權(quán)利要求M-61的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞核顯示 UGT1A6和UGTlA的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
63.根據(jù)權(quán)利要求M-62的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞核顯示關(guān)于 藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的至少一種標(biāo)記和關(guān)于藥物代謝的一種標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
64.根據(jù)權(quán)利要求63的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中關(guān)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的所述標(biāo)記選 自 0ATs、MDRs、BSEPs、MRPs 禾口 NTCPs。
65.根據(jù)權(quán)利要求63的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中關(guān)于藥物代謝的所述標(biāo)記選自細(xì) 胞色素450和UGTs。
66.根據(jù)權(quán)利要求M-65的體外衍生的DE-hep細(xì)胞，其中所述細(xì)胞或細(xì)胞核顯示在本 文表4、表5A或表5B中列出并且得分不同于0的所述標(biāo)記的蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)。
67.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞用于在藥物開發(fā)過程 中使用的用途。
68.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞在用于研究藥物轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白的體外模型中的用途。
69.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞在用于研究藥物代謝 酶的體外模型中的用途。
70.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞在用于研究肝生成例 如早期肝生成的體外模型中的用途。
71.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-h印細(xì)胞在用于研究人肝再生 障礙的體外模型中的用途。
72.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞用于體外肝毒性測試 的用途。
73.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-h印細(xì)胞在藥劑中的用途。
74.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞在制造用于預(yù)防和/ 或治療由組織退化例如肝臟組織退化引起的病理狀態(tài)和/或疾病的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中的用途。
75.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-h印細(xì)胞在制造用于治療肝臟病癥的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中的用途。
76.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-h印細(xì)胞在制造用于預(yù)防和 /或治療選自下述的肝臟病癥的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中的用途自身免疫病癥，包括原發(fā)性膽汁性肝 硬化；代謝病癥，包括血脂異常；由例如酒精濫用引起的肝臟病癥；由病毒引起的疾病，例 如乙型肝炎、丙型肝炎和甲型肝炎；由針對例如藥學(xué)藥物的急性中毒反應(yīng)引起的肝臟壞死； 和在患有例如肝細(xì)胞癌的患者中的腫瘤摘除。
77.如權(quán)利要求M-66中任一項中限定的體外衍生的DE-h印細(xì)胞在制造用于治療和/ 或預(yù)防代謝病理狀態(tài)和/或疾病的醫(yī)學(xué)產(chǎn)品中的用途。
78.來自如權(quán)利要求討-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞的一種或多種細(xì) 胞用于獲得代謝改善的肝細(xì)胞樣細(xì)胞的用途。
79.來自如權(quán)利要求討-66中任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞的一種或多種細(xì) 胞用于研究朝向肝細(xì)胞樣細(xì)胞成熟的用途。
80.用于就肝細(xì)胞毒性篩選化合物的方法，其包括使如權(quán)利要求M-66中任一項中限 定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞暴露于所述化合物，并且測定所述化合物對所述細(xì)胞是否是 毒性的。
81.用于就調(diào)節(jié)肝細(xì)胞功能的能力篩選化合物的方法，其包括使如權(quán)利要求M-66中 任一項中限定的體外衍生的DE-hep細(xì)胞暴露于所述化合物，測定所述細(xì)胞中起因于與所 述化合物的接觸的任何表型或代謝變化，并且使所述變化與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞功能的能力關(guān)聯(lián)。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)由定型內(nèi)胚層衍生自人胚泡衍生的干(hBS)細(xì)胞的新肝細(xì)胞樣細(xì)胞祖先和/或新肝細(xì)胞樣細(xì)胞，用于制備此種細(xì)胞的方法，以及此種細(xì)胞在例如藥學(xué)藥物開發(fā)和發(fā)展、毒性測試、細(xì)胞療法和醫(yī)學(xué)治療中的潛在用途。特別呈現(xiàn)了具有重要的肝臟表達(dá)標(biāo)記基因和重要的代謝酶以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的定型內(nèi)胚層衍生的肝細(xì)胞樣細(xì)胞。
文檔編號C12N5/071GK102083967SQ200880107913
公開日2011年6月1日 申請日期2008年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日
發(fā)明者B·卡珀斯-芒瑟, G·布洛倫, N·昂斯 申請人:塞拉提斯股份公司