專利名稱：用人飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的多能干細(xì)胞分化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞分化領(lǐng)域。本發(fā)明提供在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上分化多能干細(xì)胞的方法。具體地講，本發(fā)明提供用人飼養(yǎng)細(xì)胞層將多能干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的改進(jìn)方法。
背景技術(shù)：
多能干細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞具有分化成所有成人細(xì)胞類型的能力。因此，胚胎干細(xì)胞對(duì)于已因疾病、感染或者先天異常受損的器官來(lái)說(shuō)可能是替代細(xì)胞和組織的來(lái)源。在將胚胎干細(xì)胞有效分化成特選的細(xì)胞類型方面的困難，妨礙了胚胎干細(xì)胞用作替代細(xì)胞來(lái)源的潛力。在一個(gè)實(shí)例中，Hori等人(PNAS 99 =16105,2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶 (LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細(xì)胞，產(chǎn)生了類似β細(xì)胞的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，Blyszczuk等人(PNAS 100 :998，2003)報(bào)道從組成型表達(dá)1^x4 的小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生產(chǎn)胰島素的細(xì)胞。Micallef等人報(bào)道說(shuō)，視黃酸能調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞定向形成Pdxl陽(yáng)性胰腺內(nèi)胚層 (Diabetes 54 :301,2005)。Skoudy等人報(bào)道說(shuō)，激活蛋白A(TGFi3超家族的成員)能上調(diào)小鼠胚胎干細(xì)胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和內(nèi)分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達(dá) (Biochem. J. 379 :749,2004)。Shiraki等人研究了能特異性增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞分化成Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的作用。他們觀察到TGFii 2可再現(xiàn)地產(chǎn)生更高比例的Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞(Genes Cells. 2005 Jun ； 10 (6) :503-16.)。Gordon等人證明了在血清不存在下和在激活蛋白連同Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的存在下從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)brachyury+/HNF-3beta+內(nèi)胚層細(xì)胞(US 2006/0003446A1) Gordon 等人(PNAS 103 :16806,2006)說(shuō)道“Wnt 和 TGF-beta/nodal/ 激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)為前原條的產(chǎn)生所必需”。Thomson等人從人胚泡分離了胚胎干細(xì)胞(Science 282 :114，1998)。同時(shí)， Gearhart及其同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott等人、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡(jiǎn)單通過(guò)與白血病抑制因子(LIF) — 起培養(yǎng)來(lái)防止分化的小鼠胚胎干細(xì)胞不一樣，人胚胎干細(xì)胞必須維持在非常特殊的條件下 (美國(guó)專利 No. 6，2OO,洲6、WO 99/20741, WO ΟΙ/δΙΘΙ6)。D'Amour等人描述了在高濃度激活蛋白和低血清的存在下產(chǎn)生人胚胎干細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)物(Nature Biotechnology 2005)。將這些細(xì)胞移植到小鼠的腎囊下，導(dǎo)致了分化成具有一些內(nèi)胚層器官的特性的更成熟細(xì)胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞可進(jìn)一步分化成Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞(US 2005/0266554A1)。D，Amour 等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401 (2006))說(shuō)道“我們已開(kāi)發(fā)出一種將人胚胎干(hEQ細(xì)胞轉(zhuǎn)化成能夠合成胰腺激素即胰島素、胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、胰多肽和生長(zhǎng)素釋放肽的內(nèi)分泌細(xì)胞的分化方法。這個(gè)方法通過(guò)引導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)過(guò)通向能表達(dá)內(nèi)分泌激素的細(xì)胞的類似定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體的各階段，來(lái)模擬體內(nèi)胰腺器官發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)例中，F(xiàn)isk等人報(bào)道了用于從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生胰島細(xì)胞的系統(tǒng) (US2006/0040387A1)。在這個(gè)情況中，分化途徑分成三個(gè)階段。首先用丁酸鈉和激活蛋白 A的組合將人胚胎干細(xì)胞分化成內(nèi)胚層。然后將細(xì)胞與TGF β拮抗劑如Noggin并結(jié)合EGF 或β細(xì)胞素(betacellulin) —起進(jìn)行培養(yǎng)，以產(chǎn)生Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)煙酰胺誘導(dǎo)終末分化。在一個(gè)實(shí)例中，Benvenistry等人說(shuō)道“我們得出結(jié)論認(rèn)為，Pdxl的過(guò)量表達(dá)增強(qiáng)了胰腺富集基因(pancreatic enriched genes)的表達(dá)，胰島素表達(dá)的誘導(dǎo)可能需要另外的僅存在于體內(nèi)的信號(hào)(Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 :1923-1930)，，。在另一個(gè)實(shí)例中，Condie等人公開(kāi)道“飼養(yǎng)層含有或表達(dá)能抑制Y-分泌酶或 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以增強(qiáng)多能細(xì)胞維持在多能狀態(tài)的配體或其他化合物，飼養(yǎng)層含有或表達(dá)能抑制Y -分泌酶或Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以增強(qiáng)多能細(xì)胞維持在多能狀態(tài)的配體或其他化合物” (W02004090110)。在另一個(gè)實(shí)例中，Mitalipova等人公開(kāi)道“將人胚胎干細(xì)胞與人粒層飼養(yǎng)細(xì)胞、 肌肉細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞一起培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞能維持它們的多能表型”(US20050037488)。在另一個(gè)實(shí)例中，Xu等人公開(kāi)了從胚胎組織獲得或者從胚胎干細(xì)胞分化出間葉細(xì)胞樣和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。衍生這種細(xì)胞系、處理培養(yǎng)基和用飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基 (conditioned media)培育干細(xì)胞的方法已有描述(US20020072117)。因此，仍明顯需要開(kāi)發(fā)用于建立能擴(kuò)增以滿足目前臨床需要，同時(shí)又保持分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞或胰腺激素分泌細(xì)胞的潛力的多能干細(xì)胞系的條件。 我們采取了替代性方法來(lái)改進(jìn)將多能干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞分化的領(lǐng)域。本發(fā)明提供在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上分化多能干細(xì)胞的方法。具體地講，本發(fā)明提供用人飼養(yǎng)細(xì)胞層將多能干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的改進(jìn)方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供分化多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞，b.將多能干細(xì)胞接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上，和c.用至少一種能促進(jìn)多能干細(xì)胞的分化的因子處理多能干細(xì)胞。


圖1顯示與分化相關(guān)的標(biāo)志即CXCR4、Sox-17、FoxA2、HNF_4a、HNF6和AFP在人胚胎干細(xì)胞系H9的群體中的表達(dá)，所述細(xì)胞系是在第46次傳代，是在MATRIGEL上與MEF 調(diào)理培養(yǎng)基一起培養(yǎng)，并與轉(zhuǎn)移到小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞 (HP)的細(xì)胞進(jìn)行比較。圖2顯示人飼養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)人胚胎干細(xì)胞向表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的分化的作用。圖中顯示CXCR4、Sox-17和R)xA2在人胚胎干細(xì)胞系Hl的群體中的表達(dá)(由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定)，所述細(xì)胞系是在第48次傳代分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞(HP)上培養(yǎng)。圖3顯示人飼養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成的作用。圖中顯示R)xA2、HNF-4a、HNF-6和PDX-I在人胚胎干細(xì)胞系Hl的群體中的表達(dá)(由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定)，所述細(xì)胞系是在第48次傳代分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞(HP)上培養(yǎng)。圖4顯示人飼養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成的作用。圖中顯示 FoxA2、HNF-4a、HNF-6、NeuroDl、Nkx 2. 2、Pax_4、Nkx 6. 1、PDX-1、胰高血糖素(GCG)和胰島素(INS)在人胚胎干細(xì)胞系Hl的群體中的表達(dá)(由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定)，所述細(xì)胞系是在第48次傳代分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞(HP)上培養(yǎng)。圖5顯示人飼養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)人胚胎干細(xì)胞向表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的分化的作用。圖中顯示CXCR4、Sox-17和R)xA2在人胚胎干細(xì)胞系H9的群體中的表達(dá)(由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定)，所述細(xì)胞系是在第46次傳代分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞(HP)上培養(yǎng)。圖6顯示人飼養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成的作用。圖中顯示R)xA2、HNF-4a、HNF-6和PDX-I在人胚胎干細(xì)胞系H9的群體中的表達(dá)(由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定)，所述細(xì)胞系是在第46次傳代分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞(HP)上培養(yǎng)。圖7顯示人飼養(yǎng)細(xì)胞層對(duì)表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成的作用。圖中顯示 FoxA2、HNF-4a、HNF-6、NeuroDl、Nkx 2. 2、Pax_4、Nkx 6. 1、PDX-1、胰高血糖素(GCG)和胰島素(INS)在人胚胎干細(xì)胞系H9的群體中的表達(dá)(由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定)，所述細(xì)胞系是在第46次傳代分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，是在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)、人真皮成纖維細(xì)胞(D551)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27)和人胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞(HP)上培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式
將本發(fā)明的具體實(shí)施方式
部分分成以下幾個(gè)分部分，來(lái)描述或說(shuō)明本發(fā)明的某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用，這是為了使公開(kāi)內(nèi)容清楚起見(jiàn)，并非限制本發(fā)明。
定義
干細(xì)胞是由它們?cè)趩渭?xì)胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細(xì)胞的能力來(lái)定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和末端分化細(xì)胞。干細(xì)胞還由它們的以下能力來(lái)表征從多個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)體外分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞的能力，以及在移植后產(chǎn)生多個(gè)胚層的組織的能力和在注射到胚泡后基本上促成大多數(shù)的組織(如果不是所有的組織的話)的能力。干細(xì)胞按它們的發(fā)育潛力分成以下幾類(1)全能(totipotent)干細(xì)胞，意思是能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類型；( 多能(pluripotent)干細(xì)胞，意思是能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類型；C3)專能(multipotent)干細(xì)胞，意思是能夠產(chǎn)生一部分細(xì)胞譜系，但都在特定的組織、器官或生理系統(tǒng)當(dāng)中(例如，造血干細(xì)胞(HSC)能產(chǎn)生包括HSC(自我更新)、血細(xì)胞局限寡能祖細(xì)胞和所有屬血液的正常組分的細(xì)胞類型和成分(例如血小板))；(4)寡能(oligopotent)干細(xì)胞，意思是能夠產(chǎn)生比專能干細(xì)胞更局限的一部分細(xì)胞譜系；和(5)單能(imipotent)干細(xì)胞，意思是能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(例如精原干細(xì)胞)。分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過(guò)程。分化的或分化誘導(dǎo)的細(xì)胞是在細(xì)胞的譜系當(dāng)中具有較為特化的 (“定向的”)地位的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“定向的”當(dāng)應(yīng)用到分化的過(guò)程時(shí)，指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞在正常環(huán)境下，它會(huì)繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細(xì)胞類型或回復(fù)到分化不足的細(xì)胞類型。去分化指細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞的譜系當(dāng)中特化(或定向)不足的地位的過(guò)程。本文所用的“細(xì)胞的譜系”限定細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來(lái)自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞的譜系將該細(xì)胞置于發(fā)育和分化的遺傳安排(hereditary scheme)當(dāng)中。譜系特異性標(biāo)志指與目的譜系的細(xì)胞的表型明確相關(guān)的特征，可用來(lái)評(píng)估未定向細(xì)胞向目的譜系的分化。有不同的術(shù)語(yǔ)用來(lái)描述培養(yǎng)中的細(xì)胞?！熬S持”通常指將細(xì)胞在有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和 /或分裂的條件下置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，這可能或可能不導(dǎo)致產(chǎn)生更大的細(xì)胞群體?！皞鞔敝笇⒓?xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)容器移取并將它們?cè)谟欣诩?xì)胞生長(zhǎng)和/或分裂的條件下置于第二培養(yǎng)容器中的過(guò)程。細(xì)胞的特定群體或者說(shuō)細(xì)胞系，有時(shí)由它已被傳代的次數(shù)來(lái)指稱或表征。例如， 已被傳代十次的培養(yǎng)細(xì)胞群體可稱為PlO培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)物，即從組織分離細(xì)胞后的第一培養(yǎng)物，稱為P0。在第一亞培養(yǎng)后，將細(xì)胞描述為繼代培養(yǎng)物(Pl或傳代1)。在第二亞培養(yǎng)后，細(xì)胞變成三代培養(yǎng)物(P2或傳代幻，依此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，在傳代期間可能有多次群體倍增；因此培養(yǎng)物的群體倍增數(shù)目大于傳代數(shù)目。細(xì)胞在各次傳代之間的期間中的擴(kuò)增(即群體倍增數(shù)目)取決于許多因素，包括但不限于接種密度、基質(zhì) (substrate)、培養(yǎng)基、生長(zhǎng)條件和各次傳代之間的時(shí)間。“ β -細(xì)胞譜系”指對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子PDX-I和至少一種以下轉(zhuǎn)錄因子具有陽(yáng)性基因表達(dá)的細(xì)胞:NGN-3、Nkx2. 2、Nkx6. l、NeuroD、Isl-l、HNF_3beta、MAFA、Pax4 和 Pax6。表達(dá) β 細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括β細(xì)胞。本文所用的“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少以下標(biāo)志物之一的細(xì)胞S0X-17、GATA-4、HNF-3 beta、GSC、Cerl、Nodal、FGF8、Brachyury、Mixlike 同源盒蛋白、FGF4 CD48、eomesodermin (EOMES)、DKK4、FGF17、GATA-6、CXCR4、C-Kit, CD99 或 0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)
6胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。本文所用的“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少以下標(biāo)志物之一的細(xì)胞PDX-l、HNF-lbeta、HNF-3beta、PTF-lalpha、HNF-6 或 HB9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。本文所用的“表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”指表達(dá)至少以下標(biāo)志物之一的細(xì)胞NGN-3、NeuroD, Islet-U PDX-U NKX6. 1、Pax_4、Ngn-3 或 PTF-lalpha。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞和胰腺激素分泌細(xì)胞以及β-細(xì)胞譜系的細(xì)胞。本文所用的“定形內(nèi)胚層”指帶有在原腸胚形成過(guò)程中從上胚層產(chǎn)生的細(xì)胞的特性并形成胃腸道及其衍生物(derivative)的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)以下標(biāo)志物 CXCR4、HNF-3 beta、GATA-4、S0X-17, Cerberus、0TX2、goosecoid、c_Kit、CD99 和 Mixll。本文所用的“胚胎外內(nèi)胚層”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)志物的細(xì)胞群體S0X_7、AFP 禾口 SPARC。本文所用的“標(biāo)志物”是在目的細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。在這個(gè)情形中，差異表達(dá)意思是陽(yáng)性標(biāo)志物的水平增加，而陰性標(biāo)志物的水平降低。標(biāo)志物核酸或多肽的可檢測(cè)水平，在目的細(xì)胞中充分地高于或低于在其他細(xì)胞中，使得可使用多種本領(lǐng)域公知的方法中的任何一種將目的細(xì)胞與其他細(xì)胞鑒別和區(qū)分開(kāi)來(lái)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“中內(nèi)胚層細(xì)胞”指表達(dá)至少以下標(biāo)志物之一的細(xì)胞⑶48、 eomesodermin (EOMES)、S0X-17、DKK4、HNF-3 beta、GSC、FGF17、GATA-6。本文所用的“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”指能夠表達(dá)至少一種以下激素的細(xì)胞胰島素、胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素、胰多肽和生長(zhǎng)素釋放肽。本文所用的“胰腺激素分泌細(xì)胞”指能夠分泌至少一種以下激素的細(xì)胞胰島素、 胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素和胰多肽。本文所用的“前原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)志物的細(xì)胞=Nodal或FGF8。本文所用的“原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種以下標(biāo)志物的細(xì)胞=Brachyury、Mix_l ike 同源盒蛋白或FGF4。本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞分化的領(lǐng)域。本發(fā)明提供在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上增殖多能干細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上分化多能干細(xì)胞的方法。具體地講，本發(fā)明提供用人飼養(yǎng)細(xì)胞層將多能干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的改進(jìn)方法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供分化多能干細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞，b.將多能干細(xì)胞接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上，和c.用至少一種能促進(jìn)多能干細(xì)胞的分化的因子處理多能干細(xì)胞。本發(fā)明的方法提供分化多能干細(xì)胞的改進(jìn)方法，其中在分化多能干細(xì)胞之前將多能干細(xì)胞接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域的任何合適方法培養(yǎng)多能干細(xì)胞。同樣， 可通過(guò)本領(lǐng)域的任何合適方法將多能干細(xì)胞接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上。可在接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層之后，立即用至少一種能促進(jìn)多能干細(xì)胞的分化的因子處理多能干細(xì)胞?；蛘?，可在多能干細(xì)胞已在人飼養(yǎng)細(xì)胞層的存在下培養(yǎng)一段時(shí)間后，用至少一種能促進(jìn)多能干細(xì)胞的分化的因子處理多能干細(xì)胞。例如，可將多能干細(xì)胞在人飼養(yǎng)細(xì)胞層的存在下培養(yǎng)一段足以讓多能干細(xì)胞形成單層的時(shí)間。多能干細(xì)胞可以以任何密度接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上。但是，最佳密度可取決于諸如以下的因素所用的多能干細(xì)胞、構(gòu)成人飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞、分化的細(xì)胞類型、培養(yǎng)容器的大小等。在一個(gè)實(shí)例中，將多能干細(xì)胞以能使得多能干細(xì)胞在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)5天后達(dá)到約60%至約80%鋪滿的密度進(jìn)行接種。適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞包括例如人胚胎干細(xì)胞系H9(NIH編碼WA09)、人胚胎干細(xì)胞系Hl (NIH編碼WA01)、人胚胎干細(xì)胞系H7(NIH編碼WA07)和人胚胎干細(xì)胞系 SA002 (Cellartisj^W )。能表達(dá)至少一種以下多能細(xì)胞特有標(biāo)志物的細(xì)胞也適用于本發(fā)明ABCG2、cripto、CD9、FoxD3、連接蛋白 43、連接蛋白 45、0ct4、Sox2、Nanog、hTERT、UTF_l、 ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。構(gòu)成人飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞可以是任何能夠促進(jìn)多能干細(xì)胞的分化的人細(xì)胞。構(gòu)成人飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞可以是成人細(xì)胞?；蛘?，構(gòu)成人飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞可以是胎兒細(xì)胞或胚胎細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，人飼養(yǎng)細(xì)胞層由成纖維細(xì)胞構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施例中，成纖維細(xì)胞是真皮成纖維細(xì)胞。真皮成纖維細(xì)胞可以是人真皮成纖維細(xì)胞系Detroit 551(CCL-110 ATCC)。在另一個(gè)實(shí)施例中，成纖維細(xì)胞是包皮成纖維細(xì)胞。人包皮成纖維細(xì)胞可以是人包皮成纖維細(xì)胞系Hs27(CRL-1634 ATCC)?；蛘?，人飼養(yǎng)細(xì)胞層由胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是US20040241761中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是kience 306 :2沈1-2264，2004中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是Nature Biotechnology 22 :1115_1124，2004中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是US20030082155中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是US5834308中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是ftOcNat Acad Sci 97:7999-8004， 2000中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是W02004011621中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是W003102134中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是US2004015805中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是US6458593中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是W02006094286 中公開(kāi)的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞屬已被分配ATCC No.PTA-6974的 H5f3P6細(xì)胞系。飼養(yǎng)細(xì)胞層的產(chǎn)生本申請(qǐng)中描述的人飼養(yǎng)細(xì)胞層可用于分化多能干細(xì)胞。認(rèn)識(shí)到，其他類型的細(xì)胞也可得益于在這些飼養(yǎng)細(xì)胞層上進(jìn)行分化，因此本發(fā)明的組合物可無(wú)限制地用于這些目的。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)基本上涉及以下步驟的方法產(chǎn)生飼養(yǎng)細(xì)胞層a.培養(yǎng)會(huì)形成飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞，和b.使所述細(xì)胞失活?？稍诤线m的培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)會(huì)形成飼養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是胞外基質(zhì)成分，例如衍自基膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是MATRIGEL (Becton Dickenson) 0 MATRIGEL 是得自EngeIbreth-HoIm-Swarm腫瘤細(xì)胞的可溶性制品，其在室溫下膠凝而形成重構(gòu)的基膜。在另一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是明膠(Sigma)。其他的胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴(kuò)增的細(xì)胞類型， 這可包括單獨(dú)的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合。用來(lái)形成喂養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞可通過(guò)例如輻射、用化學(xué)失活劑(如絲裂霉素C)處理或者通過(guò)任何其他有效方法來(lái)失活(也就是使其不能夠大量復(fù)制)。用來(lái)培養(yǎng)用于形成喂養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞的培養(yǎng)基可具有幾種不同配方中的任一種。 培養(yǎng)基必須能夠支持至少用于形成喂養(yǎng)細(xì)胞層的細(xì)胞系的增殖。便利的是，培養(yǎng)基還能支持多能干細(xì)胞的增殖。但是，作為另選方案，培養(yǎng)基可補(bǔ)充有其他的因子或者另作加工以使其適應(yīng)于增殖多能干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺衍生基質(zhì)細(xì)胞是W02006094286中公開(kāi)的細(xì)胞。胰腺衍生細(xì)胞的分離在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)多階段方法分離胰腺細(xì)胞，所述方法基本上涉及a.用酶溶液灌注死胰腺、活供體或自體同源胰腺，b.機(jī)械解離經(jīng)灌注的胰腺，c.將經(jīng)消化的組織層加(layer)在聚蔗糖或Ficoll梯度上，然后離心產(chǎn)生三個(gè)明顯的界面，d.移取每個(gè)界面處的組織和細(xì)胞，e.將組織和細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)板中在含有小于5%血清的富營(yíng)養(yǎng)物選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，f.讓培養(yǎng)物保持不受干擾約2-4周，不進(jìn)行任何培養(yǎng)基更換。死胰腺的灌注可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的酶溶液中的任何一種來(lái)實(shí)現(xiàn)。適用于本發(fā)明的酶溶液的一個(gè)實(shí)例含有 LIBERASE HI (Roche-0. 5mg/ml)和 DNA 酶 I (0. 2mg/ml)?？捎媒M織處理器快速進(jìn)行胰腺組織的機(jī)械解離?；蛘?，可用Ricordi室(Ricordi Chamber)或與其他方法相比能使得組織進(jìn)行破壞性較低的分解的其他等效裝置來(lái)進(jìn)行胰腺組織的機(jī)械解離。然后使經(jīng)消化的胰腺組織進(jìn)行聚蔗糖或Ficoll梯度離心以產(chǎn)生三個(gè)明顯的界面，所述三個(gè)界面分別富集來(lái)自胰島、腺管組織(ductal tissue)和腺泡組織的細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，從每個(gè)界面移取組織和細(xì)胞，分別進(jìn)行培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施例中，將來(lái)自所有界面的組織和細(xì)胞合并和進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明已確知胰腺基質(zhì)細(xì)胞可衍自這三個(gè)界面的任何一個(gè)?；蛘撸刹捎眠B續(xù)梯度并選出特選的細(xì)胞群體，以產(chǎn)生胰腺基質(zhì)細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，將從一個(gè)或多個(gè)界面收集的組織和細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)， 以選擇性富集細(xì)胞群體中的基質(zhì)細(xì)胞。選擇培養(yǎng)基富含營(yíng)養(yǎng)物和含有低水平的葡萄糖和血清。一般來(lái)講，選擇培養(yǎng)基含有小于5%血清，或者1-3%血清，或者約2%血清；和小于30mM 葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇培養(yǎng)基補(bǔ)充有衍自與收獲供體胰腺的哺乳動(dòng)物相同物種的 2%血清。或者，可使用胎牛或小牛血清、來(lái)自其他物種的血清、或者其他血清補(bǔ)充物或替代物來(lái)對(duì)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充有。合適的選擇培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例由以下成分組成DMEM(5mM 葡萄糖)、2%胎牛血清(FBS)、IOOU/ μ g青霉素/鏈霉素、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(ITS)、2mM L-谷氨酰胺、0. 0165mM ZnSO4和0. 38 μ M 2-巰基乙醇。
在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)程中(“選擇期”)，細(xì)胞可在低氧或常氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 在低氧條件下，氧水平低于20 %，或者低于10 %，或者低于5 %，但超過(guò)1 %。優(yōu)選地，應(yīng)讓培養(yǎng)物保持在選擇培養(yǎng)基中不受干擾約2-4周，不進(jìn)行任何培養(yǎng)基更換，到時(shí)間時(shí)細(xì)胞通常已貼附到所用的培養(yǎng)基質(zhì)。當(dāng)貼附細(xì)胞的數(shù)目不再增加時(shí)，認(rèn)為選擇期完成。已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的組織收獲和培養(yǎng)方法能導(dǎo)致產(chǎn)生富集胰腺基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞群體。所謂“富集”是指胰腺基質(zhì)細(xì)胞占群體中所有細(xì)胞的至少約30%，或者約40%，或者約 50%。或者，將從一個(gè)或多個(gè)界面收集的組織和細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，以選擇性富集細(xì)胞群體中的基質(zhì)細(xì)胞。選擇培養(yǎng)基富含營(yíng)養(yǎng)物和含有低水平的葡萄糖。一般來(lái)講，選擇培養(yǎng)基含有小于20%血清，或者10至5%血清，或者約10%血清；和小于30mM葡萄糖。在一個(gè)實(shí)施例中，選擇培養(yǎng)基補(bǔ)充有衍自與收獲供體胰腺的哺乳動(dòng)物相同物種的10% 血清?；蛘?，可使用胎?；蛐∨Ｑ濉?lái)自其他物種的血清、或者其他血清補(bǔ)充物或替代物來(lái)對(duì)選擇培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充有。合適的選擇培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例由以下成分組成DMEM(5mM葡萄糖)、10%胎牛血清(FBS)、100U/μ g青霉素/鏈霉素。在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)程中(“選擇期”)，細(xì)胞可在低氧或常氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 低氧條件下，氧水平低于20 %，或者低于10 %，或者低于5 %，但超過(guò)1 %。在這些培養(yǎng)條件下，每隔2-4天定期更換培養(yǎng)基。已發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的組織收獲和培養(yǎng)方法能導(dǎo)致產(chǎn)生富集胰腺基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞群體。所謂“富集”是指胰腺基質(zhì)細(xì)胞占群體中所有細(xì)胞的至少約30%，或者約40%，或者約 50%。在初期的選擇和細(xì)胞貼附后，將細(xì)胞(富集基質(zhì)細(xì)胞)在下文進(jìn)一步描述的條件下進(jìn)行擴(kuò)增。如果需要，可將富集基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞群體暴露于例如能特異性識(shí)別基質(zhì)細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)志的物質(zhì)(如抗體)，以鑒定和選擇胰腺基質(zhì)細(xì)胞，從而獲得基本上純的胰腺基質(zhì)細(xì)胞群體。分離的胰腺基質(zhì)細(xì)胞的表征評(píng)估蛋白質(zhì)標(biāo)志物和核酸標(biāo)志物在培養(yǎng)的或分離的細(xì)胞中的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法包括定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、RNA 印跡法、雜交法(參見(jiàn)例如 CurrentProtocols in Molecular Biology (Ausubel等人編輯。2001增補(bǔ)版))和免疫測(cè)定法(如對(duì)切片材料的免疫組織化學(xué)分析)、蛋白質(zhì)印跡法，對(duì)于在完整細(xì)胞中可接近的標(biāo)志物而言有流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS) (參見(jiàn)例如 Harlow 禾口 Lane，Using Ant ibodies :A Laboratory Manual, New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press (1998))。按照本發(fā)明分離的胰腺基質(zhì)細(xì)胞主要表征為基本上缺乏至少一種以下蛋白質(zhì)標(biāo)志物⑶117，NCAM, ABCG2，細(xì)胞角蛋白7、8、18或19。在某些具體的實(shí)施例中，按照本發(fā)明分離的胰腺基質(zhì)細(xì)胞表征為對(duì)至少一種以下蛋白質(zhì)標(biāo)志物基本上陽(yáng)性⑶44、⑶73、⑶90 和 CD105。胰腺基質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增在又一方面，本發(fā)明提供擴(kuò)增按照本發(fā)明獲得的胰腺基質(zhì)細(xì)胞的方法。如上所述，將含有胰島、胰管片斷和外分泌組織的非均質(zhì)混合物的胰腺消化物在低血清選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-4周，優(yōu)選不進(jìn)行任何培養(yǎng)基更換，以選擇性富集所需的基質(zhì)細(xì)胞。然后將所得的細(xì)胞群體(現(xiàn)富集了胰腺基質(zhì)細(xì)胞)轉(zhuǎn)到生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以擴(kuò)增細(xì)胞群體中的胰腺基質(zhì)細(xì)胞。適用于本發(fā)明的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可由培養(yǎng)基如含有青霉素/鏈霉素(P/S)的DMEM 和濃度在2%至20%、優(yōu)選約5至10%的血清組成。在一個(gè)實(shí)施例中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基由 DMEM(1000mg/L D-葡萄糖；862mg/L谷氨酰胺)和10%胎牛血清組成。在另一個(gè)實(shí)施例中， 選擇培養(yǎng)基補(bǔ)充有衍自與收獲供體胰腺的哺乳動(dòng)物相同物種的血清?；蛘撸墒褂锰ヅ；蛐∨Ｑ濉⒒蛘咂渌逖a(bǔ)充物或替代物(例如血清白蛋白)來(lái)對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)充有。此外，可通過(guò)在含有能刺激本發(fā)明細(xì)胞的增殖的物質(zhì)的確定成分生長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞。這些因子可包括例如煙酰胺、TGF-β家族的成員(包括TGF-β 1、 2和3)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(ΒΜΡ-2、_4、6、-7、-11、-12和-13)、血清白蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA和-ΒΒ、富含血小板的血漿、胰島素生長(zhǎng)因子(IGF-I、 II)、生長(zhǎng)分化因子(⑶F-5、-6、-8、-10、11)、胰高血糖素樣肽I和II (GLP-I和II)、GLP-I 和GLP-2模擬抗體(mimetobody)、毒蜥外泌肽_4、視黃酸、甲狀旁腺激素、胰島素、孕酮、抑蛋白酶肽(aprotinin)、氫化可的松、乙醇胺、β -巰基乙醇、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胃泌素I 和II、銅螯合劑如三乙烯五胺、TGF-α、毛喉素、丁酸鈉、激活蛋白、β細(xì)胞素、胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒(ITS)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、牛垂體提取物、胰島新生相關(guān)蛋白(INGAP)、蛋白酶體抑制劑、notch途徑抑制劑、sonic hedgehog抑制劑或者它們的組合?；蛘?，可將基質(zhì)細(xì)胞在調(diào)理培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來(lái)擴(kuò)增。所謂“調(diào)理培養(yǎng)基”是指一群細(xì)胞生長(zhǎng)在基本的確定成分細(xì)胞培養(yǎng)基中，給該培養(yǎng)基賦予可溶性因子。在一個(gè)這種應(yīng)用中，將細(xì)胞從培養(yǎng)基移除，而細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性因子保留。這個(gè)培養(yǎng)基然后用來(lái)培育另一群細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，將胰腺基質(zhì)細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)?；蛘撸?可用胞外基質(zhì)蛋白包被培養(yǎng)板，所述胞外基質(zhì)蛋白例如MATRIGEL 、生長(zhǎng)因子減低的 MATRIGEL 、層粘連蛋白、膠原、明膠、生腱蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、胎盤提取物或者它們的組合。此外，胰腺基質(zhì)細(xì)胞可在低氧或常氧條件下進(jìn)行體外擴(kuò)增。多能干細(xì)胞的分化在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將多能干細(xì)胞在培養(yǎng)中進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)保持它們的多能性。然后將多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上以隨后進(jìn)行分化?？赏ㄟ^(guò)檢測(cè)與多能性相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化，來(lái)確定細(xì)胞的多能性隨時(shí)間的變化。或者，可通過(guò)檢測(cè)與分化相關(guān)的標(biāo)志物或者與別的細(xì)胞類型相關(guān)的標(biāo)志物的表達(dá)水平的變化，來(lái)監(jiān)測(cè)多能性的變化。將多能細(xì)胞用至少一種能促進(jìn)它們分化成別的細(xì)胞類型的因子進(jìn)行處理。別的細(xì)胞類型可以是表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。或者，細(xì)胞類型可以是表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。或者，細(xì)胞類型可以是表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞類型可以是表達(dá)β-細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域任何合適的方法，使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成多種別的細(xì)胞類型。例如，可使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞、心臟細(xì)胞、
11肝細(xì)胞等。例如，可按照W02007030870中公開(kāi)的方法，使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成神經(jīng)祖細(xì)胞和心肌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)例中，可按照美國(guó)專利6，458，589中公開(kāi)的方法，使按照本發(fā)明方法處理的多能干細(xì)胞分化成肝細(xì)胞。多能干細(xì)胞向表汰胰腺內(nèi)分泌譜系特征件標(biāo)志物的細(xì)胞的分化在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)多階段方法從多能干細(xì)胞形成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，所述方法包括以下步驟a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞，b.將多能細(xì)胞接種在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上，c.使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，d.使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，e.使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自S0X-17、GATA4、Hnf-3beta, GSC、CerU Nodal、 FGF8、Brachyury, Mix-like 同源盒蛋白、FGF4CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、 GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是原條前體細(xì)胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是中內(nèi)胚層細(xì)胞。在另一方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是定形內(nèi)胚層細(xì)胞。胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自Pdxl、HNF-lbeta、PTFla、HNF-6、HB9和PR0X1。 適用于本發(fā)明的是能表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌譜系的特有標(biāo)志物選自NGN-3、NeuroD, Islet-U Pdx-U NKX6. 1、 Pax-4, Ngn-3和PTF-lalpha。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)以下激素中的至少一種胰島素、胰高血糖素、促生長(zhǎng)素抑制素和胰多肽。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰腺激素表達(dá)細(xì)胞。或者，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰腺激素分泌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞能表達(dá)Pdxl和至少一種以下轉(zhuǎn)錄因子NGN-3、 Nkx2.2、Nkx6. l、NeuroD、Isl-l、HNF_3be ta、MAFA、Pax4 和 Pax6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是β細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)的方法，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法或通過(guò)本發(fā)明提出的任何方法，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開(kāi)的方法，使多能干細(xì)胞可分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)Shinozaki 等人，Development 131,1651-1662(2004)中公開(kāi)的方法，使多能干細(xì)胞可分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)McLean等人，Stem Cells 25,29-38(2007)中公開(kāi)的方法，使多能干細(xì)胞可分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)的方法，使多能干細(xì)胞可分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可通過(guò)將多能干細(xì)胞在含有激活蛋白A的培養(yǎng)基中在血清不存在下進(jìn)行培養(yǎng)，然后將所述細(xì)胞與激活蛋白A和血清一起培養(yǎng)，再然后將所述細(xì)胞與激活蛋白A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在 NatureBiotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將多能干細(xì)胞在含有激活蛋白A的培養(yǎng)基中在血清不存在下進(jìn)行培養(yǎng)，然后將所述細(xì)胞與激活蛋白A和另一濃度的血清一起培養(yǎng)，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2005 中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將多能干細(xì)胞在含有激活蛋白A和Wnt配體的培養(yǎng)基中在血清不存在下進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除Wnt配體并將所述細(xì)胞與激活蛋白A和血清一起培養(yǎng)，使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法或通過(guò)本發(fā)明提出的任何方法，使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)的方法，使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。可通過(guò)用成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑KAAD-環(huán)巴胺處理表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，然后移除含有纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有視黃酸、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和KAAD-環(huán)巴胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在Nature Biotechnology 24， 1392-1401(2006)中公開(kāi)。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系的標(biāo)志物的細(xì)胞的形成可通過(guò)本領(lǐng)域的任何方法或通過(guò)本發(fā)明公開(kāi)的任何方法，使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可根據(jù)D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)的方法，使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在 NatureBiotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后移除含有毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基，并隨后將所述細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4、IGF-I和HGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在 D' Amour 等人，NatureBiotechnology, 2006 中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2006 中公開(kāi)。例如，可通過(guò)將表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞在含有毒蜥外泌肽4 的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞進(jìn)一步分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。這個(gè)方法的一個(gè)實(shí)例在D’ Amour等人，Nature Biotechnology, 2006 中公開(kāi)多能干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)多能干細(xì)胞的表征多能干細(xì)胞可表達(dá)階段特異性胚胎抗原(SSEA) 3和4以及可用稱為Tra-1_60和 Tra-1-81的抗體檢測(cè)的標(biāo)志物中的一種或多種(Thomson等人，Science 282 =1145,1998) 多能干細(xì)胞體外分化導(dǎo)致喪失SSEA-4、Tra-1-60和Tra-l_81的表達(dá)(如果存在的話)， 并增加SSEA-I的表達(dá)。未分化的多能干細(xì)胞通常具有堿性磷酸酶活性，該酶可通過(guò)用4% 多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用Vector Red作為底物顯影來(lái)檢測(cè)，如生產(chǎn)商所描述的(Vector Laboratories,Burlingame Calif)。未分化的多能干細(xì)胞還通常表達(dá)0ct_4和TERT，這可通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。增殖的多能干細(xì)胞的另一理想表型是分化成所有三個(gè)胚層即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層組織的細(xì)胞的潛能。多能干細(xì)胞的多能性可例如通過(guò)這樣來(lái)證實(shí)將細(xì)胞注射進(jìn)重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用固定劑例如4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后對(duì)它們進(jìn)行組織學(xué)檢驗(yàn)以確定是否存在來(lái)自三個(gè)胚層的細(xì)胞類型。作為另一種選擇，多能性可通過(guò)這樣來(lái)確定產(chǎn)生胚狀體并評(píng)價(jià)該胚狀體是否存在與三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)志物。增殖的多能干細(xì)胞系可以用標(biāo)準(zhǔn)G-顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析并與所公開(kāi)的相應(yīng)靈長(zhǎng)類物種的核型相比較。理想的是獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，“正常核型”的細(xì)胞意指該細(xì)胞是整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒(méi)有顯著改變。多能干細(xì)胞的來(lái)源可使用的多能干細(xì)胞的類型包括從妊娠后形成的組織衍生而來(lái)的確立多能細(xì)胞系，包括在妊娠期間任何時(shí)間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時(shí)間通常是但不一定是在大約10-12周妊娠前。非限制性實(shí)例是確立的人胚胎干細(xì)胞系或人胚胎生殖細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系H1、H7和H9 (WiCell)。還考慮的是在這類細(xì)胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本發(fā)明的組合物，在這種情形中，源細(xì)胞將會(huì)是直接取自源組織的原代多能細(xì)胞。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群體的細(xì)胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細(xì)胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens, GA)。在一個(gè)實(shí)施例中，人胚胎干細(xì)胞是如Thomson等人所述制備(美國(guó)專利 No. 5，843，780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr.Top. Dev. Biol. 38 :133ff.，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)。多能干細(xì)胞的培養(yǎng)在一個(gè)實(shí)施例中，通常在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞可以多種方式支持多能干細(xì)胞。或者，在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞，但同樣支持多能干細(xì)胞的增殖而不會(huì)進(jìn)行顯著的分化。使用通過(guò)此前培養(yǎng)另一細(xì)胞類型而調(diào)理過(guò)的培養(yǎng)基來(lái)支持多能干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)而不分化。作為另一種選擇，用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基來(lái)支持多能干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)而不分化。例如，Reubinoff 等人(Nature Biotechnology 18:399—404(2000))禾口 Thompson 等人(kience，1998年11月6日第282卷，no. 5391，第1145-1147頁(yè))公開(kāi)了用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層來(lái)培養(yǎng)來(lái)自人胚泡的多能干細(xì)胞系。Richards 等人(Stem Cells 21 :546-556,2003)對(duì)一組 11 個(gè)不同的成人、胎兒和新生兒飼養(yǎng)細(xì)胞層支持人多能干細(xì)胞培養(yǎng)的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Richards等人聲稱“在成人皮膚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞系保持了人胚胎干細(xì)胞形態(tài)并保持了多能性”。US20020072117公開(kāi)了可產(chǎn)生支持靈長(zhǎng)類多能干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基的細(xì)胞系。所采用的細(xì)胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)的間質(zhì)細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。US20020072117還公開(kāi)了所述細(xì)胞系作為原代飼養(yǎng)細(xì)胞層的用途。又如，Wang等人(Stem Cells 23 1221-1227，2005)公開(kāi)了用于人多能干細(xì)胞在衍生自人胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層上長(zhǎng)期生長(zhǎng)的方法。又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23 :306-314,2005)公開(kāi)了一種衍生自人胚胎干細(xì)胞的自發(fā)分化的飼養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)。在另一實(shí)例中，Miyamoto等人(Stem Cells 22 =433-440,2004)公開(kāi)了從人胎盤獲得的飼養(yǎng)細(xì)胞的來(lái)源。Amit等人(Biol. R印rod 68 :2150_2156，2003)公開(kāi)了衍生自人包皮的飼養(yǎng)細(xì)胞層。又如，Inzunza等人(Stem Cells 23 =544-549,2005)公開(kāi)了來(lái)自人出生后包皮成纖維細(xì)胞的飼養(yǎng)細(xì)胞層。US6642048公開(kāi)了可支持靈長(zhǎng)類多能干(pPQ細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的培養(yǎng)基以及可用于產(chǎn)生這種培養(yǎng)基的細(xì)胞系。US6642048聲稱“本發(fā)明包括從胚胎組織獲得或從胚胎干細(xì)胞分化而來(lái)的間質(zhì)細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系。在本公開(kāi)中描述并闡明了用于衍生這種細(xì)胞系、處理培養(yǎng)基以及用該調(diào)理培養(yǎng)基培育干細(xì)胞的方法”。又如，W02005014799公開(kāi)了一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的維持、增殖和分化的調(diào)理培養(yǎng)基。W02005014799聲稱“通過(guò)鼠細(xì)胞(特別是分化并永生化的轉(zhuǎn)基因肝細(xì)胞，稱為 MMH(Met鼠肝細(xì)胞))的細(xì)胞分泌活性對(duì)根據(jù)本發(fā)明制備的培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)理”。又如，Xu等人(Stem Cells 22 =972-980,2004)公開(kāi)了一種從人胚胎干細(xì)胞衍生物獲得的調(diào)理培養(yǎng)基，所述干細(xì)胞衍生物已經(jīng)過(guò)遺傳修飾而過(guò)表達(dá)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。又如，US20070010011公開(kāi)了一種用于維持多能干細(xì)胞的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。一種可供選擇的培養(yǎng)系統(tǒng)采用補(bǔ)充有能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基。例如，Cheon 等人(BioIteprodDOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870，2005 年 10 月19日)公開(kāi)了一種無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細(xì)胞維持在補(bǔ)充有能引發(fā)胚胎干細(xì)胞自我更新的不同生長(zhǎng)因子的未經(jīng)調(diào)理的血清替代(SR)培養(yǎng)基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006)公開(kāi)了使用補(bǔ)充有 bFGF 的培養(yǎng)基，在不存在成纖維細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下長(zhǎng)期培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法。又如，US20050148070公開(kāi)了一種在無(wú)血清且無(wú)成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞的成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、至少一種轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白替代品、至少一種胰島素或胰島素替代品的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞，該培養(yǎng)基基本上無(wú)哺乳動(dòng)物胎兒血清且含有至少約lOOng/ml能激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，其中該生長(zhǎng)因子的供給來(lái)源不是僅為成纖細(xì)胞飼養(yǎng)層，該培養(yǎng)基支持干細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞或調(diào)理培養(yǎng)基的情況下以未分化狀態(tài)增殖。又如，US20050233446公開(kāi)了一種可用于培養(yǎng)干細(xì)胞的成分確定的培養(yǎng)基，所述干細(xì)胞包括未分化的靈長(zhǎng)類原始干細(xì)胞。在溶液中，該培養(yǎng)基與被培養(yǎng)的干細(xì)胞基本上等滲。 在給定的培養(yǎng)物中，特定的培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各為一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸，所述bFGF、胰島素和抗壞血酸為支持原始干細(xì)胞進(jìn)行基本上非分化性生長(zhǎng)所必需。又如，US6800480聲稱“在一個(gè)實(shí)施例中，提供了用于培養(yǎng)處于基本上未分化狀態(tài)的衍生自靈長(zhǎng)類的原始干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括可有效支持衍生自靈長(zhǎng)類的原始干細(xì)胞生長(zhǎng)的低滲透壓、低內(nèi)毒素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。該基礎(chǔ)培養(yǎng)基與可有效支持衍生自靈長(zhǎng)類的原始干細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)血清和選自飼養(yǎng)細(xì)胞和衍生自飼養(yǎng)細(xì)胞的胞外基質(zhì)組分的基質(zhì)物質(zhì)相混合。該培養(yǎng)基還包括非必需氨基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長(zhǎng)因子”。又如，US20050M4962聲稱“在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了培養(yǎng)靈長(zhǎng)類胚胎干細(xì)胞的方法?？稍诨旧蠠o(wú)哺乳動(dòng)物胎兒血清(優(yōu)選還基本上無(wú)任何動(dòng)物血清)的培養(yǎng)物中且在存在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的情況下培養(yǎng)所述干細(xì)胞，該成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的供給來(lái)源不是僅為成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。在優(yōu)選的形式中，通過(guò)添加足量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使得之前為維持干細(xì)胞培養(yǎng)物所需的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層變得非必需”。在又一個(gè)實(shí)例中，W020050653M公開(kāi)了一種基本上無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)血清的成分確定的等滲培養(yǎng)基，包含a.基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b.bFGF，其量足以支持基本上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長(zhǎng)；c.胰島素，其量足以支持基本上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長(zhǎng)；和d.抗壞血酸， 其量足以支持基本上未分化的哺乳動(dòng)物干細(xì)胞生長(zhǎng)。又如，W02005086845公開(kāi)了一種維持未分化的干細(xì)胞的方法，所述方法包括使干細(xì)胞暴露于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGFi3)蛋白家族的成員、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)蛋白家
16族的成員或煙酰胺(NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)達(dá)足以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果的一段時(shí)間。可將多能干細(xì)胞接種至合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是胞外基質(zhì)成分，例如衍自基膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是MATRIGEL (Becton Dickenson)。MATRIGEL 是來(lái)自EngeIbreth-HoIm-Swarm腫瘤細(xì)胞的可溶性制品，其在室溫下膠凝而形成重構(gòu)的基底膜。其他胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴(kuò)增的細(xì)胞類型，這可包括單獨(dú)的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合?？稍诖嬖诖龠M(jìn)細(xì)胞存活、增殖和保持理想特性的培養(yǎng)基存在的情況下，以合適的分布將多能干細(xì)胞接種于所述基質(zhì)上。所有這些特性可得益于對(duì)接種分布的認(rèn)真考慮并可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。合適的培養(yǎng)基可用如下組分制備，例如達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)， Gibco # 11965-092 ； Knockout達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(KODMEM)，Gibco # 10829-018 ；Ham' s F12/50% DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mM L-谷氨酰胺，Gibco # 15039-027 ； 非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β-巰基乙醇，Sigma # M7522 ；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF), Gibco # 13256-029o本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)如下實(shí)例舉例說(shuō)明，但不受限于如下實(shí)例。SM實(shí)例1人胰腺細(xì)胞系的建立胰腺制備-在取得有關(guān)用于研究用途的適當(dāng)同意后，從全國(guó)疾病研究交流中心 (The National Disease Research Interchange,Philadelphia,PA)
的人胰腺。用器官保存液將胰腺轉(zhuǎn)移至冰上的不銹鋼盤中，并修剪掉所有的外部組織。用 18號(hào)導(dǎo)管插入胰管中，并用酶溶液注入胰腺中，該酶溶液含有溶解于杜伯科氏磷酸緩沖鹽水(DPBS)中的 LIBERASE HI 酶(Roche-0. 5mg/ml)和 DNA 酶 I (0. 2mg/ml)?？焖贆C(jī)械解離后進(jìn)行酶消化-將酶灌注的胰腺在組織處理器中勻化，脈沖3-5 次，每次脈沖3-5秒，并將解離的組織轉(zhuǎn)移至兩個(gè)裝有磁力攪拌棒的500ml胰酶培養(yǎng)瓶 (Bellco)中。然后，將50-100ml所述酶溶液加至每個(gè)培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶在37°C水浴中置于可沉入水中的攪拌板上，并讓其以中等攪拌速率溫育10分鐘。停止攪拌，將細(xì)小的經(jīng)消化組織從培養(yǎng)瓶移出并轉(zhuǎn)移進(jìn)4°C的裝有DPBS、5%胎牛血清(FBQ和0. lmg/ml DNA酶 I (DPBS+)的250ml管中，以猝滅該消化過(guò)程。給培養(yǎng)瓶補(bǔ)充50_100ml該酶溶液并返回水浴中，再攪拌十分鐘。再次，移出培養(yǎng)瓶，收集細(xì)小的消化物并轉(zhuǎn)移至冰上的250ml管中。再重復(fù)該過(guò)程3-5次，直至胰腺完全消化。逐步機(jī)械解離，同時(shí)進(jìn)行酶消化-根據(jù)Diabetes 37 :413-420(1988)中所述的方法對(duì)酶灌注的胰腺進(jìn)行處理。簡(jiǎn)而言之，清除胰腺的外部組織并注入如上所述的酶溶液。 然后將胰腺置于具有小珠的Ricordi室中，并用目尺寸為400-600 μ m的篩網(wǎng)覆蓋以保留較大的組織簇。覆蓋該室并在大約37°C下使酶溶液循環(huán)通過(guò)該室，并且搖動(dòng)該室以讓小珠使胰腺組織破裂，同時(shí)酶對(duì)胰腺進(jìn)行消化。一旦實(shí)現(xiàn)足夠的解離和消化，則終止消化并收集組織。組織分離-將收集的組織在4°C下以150Xg離心5分鐘。吸出上清液并在DPBS+ 中額外洗滌組織兩次。最后一次洗滌后，將組織施加到不連續(xù)的梯度以進(jìn)行純化。將消化 的組織懸浮于密度為1. 108g/ml的聚蔗糖(Mediatech，VA)中，比率為每IOml聚蔗糖溶液 對(duì)l_2ml組織粒料。然后將組織懸浮液轉(zhuǎn)移至圓底聚碳酸酯離心管中，并將密度為1. 096 和1. 037的聚蔗糖溶液小心地施加至該管內(nèi)。最后施加一層DMEM，完成該不連續(xù)的純化梯 度。將該梯度管在4°C下以2000rpm離心20分鐘，不要進(jìn)行制動(dòng)。離心后，從每個(gè)界面(三 個(gè)界面)收集組織，并如上所述在DPBS+中洗滌數(shù)次，并收集于50ml試管中。進(jìn)一步的細(xì)胞簇解離-可任選地，可用上述規(guī)程將所獲得的大的細(xì)胞簇進(jìn)一步解 離成較小的簇或單細(xì)胞懸浮液。最后一次洗滌后，將來(lái)自每個(gè)級(jí)分的組織懸浮于IOml含有 200U/ml DNA酶I的IX胰蛋白酶/EDTA溶液中。將所述管置于水浴中并用IOml血清學(xué)吸 管反復(fù)吸入和排出5-6分鐘，直至實(shí)現(xiàn)接近單細(xì)胞懸浮。加入4°C DPBS+對(duì)消化進(jìn)行猝滅， 并以SOOrpm將管離心5分鐘。用DPBS+洗滌細(xì)胞懸浮液并如下所述進(jìn)行培養(yǎng)。胰腺細(xì)胞培養(yǎng)-最后一次洗滌后，將來(lái)自每個(gè)界面的細(xì)胞再懸浮于DMEM、2% FBS、 100U/ii g青霉素/鏈霉素、ITS、2mM L-谷氨酰胺、0. 0165mM ZnS04 (Sigma)和 0. 38 u M 2-巰 基乙醇(Invitrogen，CA)(下文稱為“選擇培養(yǎng)基”)中。將6ml細(xì)胞懸浮液接種于T-25 組織培養(yǎng)瓶中，將12ml細(xì)胞懸浮液接種于T-75培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶置于具有5% CO2的 37°C培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)2-4周后，進(jìn)行一次完全的培養(yǎng)基更換，將粘附的細(xì)胞返回具有5% FBS(HyClone,UT) ,1% P/S、0. 0165mM ZnS04 的 DME]\U2750mg/L D-葡萄糖、862mg/L 谷氨酰 胺)(Gibco，CA)(下文稱為“生長(zhǎng)培養(yǎng)基”)中培養(yǎng)，并讓其達(dá)到接近鋪滿(該階段稱為“第 0代”或“P0”)，在該時(shí)間點(diǎn)將它們進(jìn)行傳代。隨后在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中以5000個(gè)細(xì)胞/cm2培 養(yǎng)細(xì)胞。每7-10天在大約70-90%鋪滿時(shí)將培養(yǎng)物進(jìn)行傳代。據(jù)證實(shí)，在梯度純化后所得 的三個(gè)級(jí)分的每一者均分離得到了基質(zhì)細(xì)胞。實(shí)例2胰腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)將根據(jù)實(shí)例1分離的胰腺細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基中，在低氧條件(5% C02,3% O2和 92% N2)下或在常氧條件(5% CO2,20% O2和75% N2)下培養(yǎng)2_4周。然后將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)換 至生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且每周加料二至三次。在該初始培養(yǎng)周期后，在于缺氧和常氧條件下培養(yǎng) 的平板中觀察到了粘附的細(xì)胞。此外，在該初始的2-4周培養(yǎng)后，平板中留下的胰島樣結(jié)構(gòu) 或管狀結(jié)構(gòu)十分少。實(shí)例3從 WiCell Research Institute, Inc. , (Madison，WI)獲得人胚胎干細(xì)胞系 H9， 并根據(jù)該來(lái)源公司提供的說(shuō)明進(jìn)行培養(yǎng)。將已在失活的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上 維持的未分化的H9人胚胎干細(xì)胞在60% FBS,20% DMSO和20% DMEM/F12 (Invitrogen/ GIBC0)中以-1°C /分鐘的速率冷藏，并保存在氣相氮中，所述DMEM/F12補(bǔ)充有20 % knockout血清替代品、IOOnM MEM非必需氨基酸、0. 5mM^-巰基乙醇、具有如g/ml人堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺(全部得自hvitrogen/GIBCO)。將所述細(xì)胞解凍，并涂布于經(jīng)絲裂霉素C處理的以52，000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種的D551人真皮成纖維細(xì)胞上。在D551細(xì)胞上傳代三次后，采集多能細(xì)胞并然后轉(zhuǎn)移至調(diào)理培養(yǎng)基中的MATRIGEL上，該調(diào)理培養(yǎng)基來(lái)自補(bǔ)充有8ng/ml bFGF的滅活MEF的培養(yǎng)物。將接種于 MATRIGEL上的人胚胎干細(xì)胞(1 30)在37°C的5% CO2的氣氛中，在調(diào)濕的組織培養(yǎng)箱內(nèi)在60mm組織培養(yǎng)平板中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)鋪滿時(shí)(涂布后大約5-7天)，用lmg/ml分散酶 (Invitrogen/GIBCO)處理人胚胎干細(xì)胞25-40分鐘。一旦細(xì)胞從培養(yǎng)平板脫離，就用2ml 血清學(xué)吸移管反復(fù)抽吸，直到達(dá)到所需的集落大小。將細(xì)胞以IOOOrpm離心5分鐘，然后將沉淀物以細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中為1 3至1 4的比率重新懸浮，并接種于MATRIGEL包被的細(xì)胞培養(yǎng)平板上。在MATRIGEL上傳代5至10次后，將多能H9細(xì)胞轉(zhuǎn)移至多種不同的飼養(yǎng)細(xì)胞上。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞在組織培養(yǎng)物處理過(guò)的6孔板中在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基由補(bǔ)充有20% knockout血清替代品、IOOnM MEM非必需氨基酸、 0. 5πιΜβ -巰基乙醇、具有如g/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺 (全部得自 Invitrogen/GIBCO)的 DMEM/F12 anvitrogen/GIBCO)組成。該板通過(guò)這樣制備在接種飼養(yǎng)細(xì)胞前用0. 明膠(Sigma)包被并在37°C下溫育最少4小時(shí)。將即將接種前，抽吸明膠并將飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液遞送至該6孔板的每個(gè)孔。在開(kāi)始進(jìn)行分化規(guī)程前，讓細(xì)胞擴(kuò)增5天。對(duì)人表皮成纖維細(xì)胞系D551(ATCC No. CCL-110)、人包皮成纖維細(xì)胞系Hs27 (ATCC No. CRL-1634)和人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系(在W02006094286中公開(kāi))維持多能性的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將D551人飼養(yǎng)細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FBS的EMEM(ATCC 30-2003)中培養(yǎng)。一旦鋪滿，則通過(guò)絲裂霉素-C處理使細(xì)胞滅活，并在EMEM、10% FBS和5% DMSO中以_1°C /分鐘的速率冷藏并保存于氣相氮中。將細(xì)胞在37°C下解凍，并在具有10% FBS的EMEM中以 52，000/cm2接種于明膠包被的組織培養(yǎng)平板上。將Hs27人飼養(yǎng)細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FBS的 DMEM(ATCC 30-2002)中培養(yǎng)。一旦鋪滿，則通過(guò)絲裂霉素-C處理使細(xì)胞滅活，并在DMEM、 10% FBS和5% DMSO中以-1°C /分鐘的速率冷藏并保存于氣相氮中。將細(xì)胞在37°C下解凍，并在具有10% FBS的DMEM中以55，000/cm2接種于明膠包被的組織培養(yǎng)平板上。將人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系在DMEM和10% FBS中培養(yǎng)直至鋪滿，并用絲裂霉素C處理。將細(xì)胞在90% FBS和10% DMSO中以_1°C /分鐘的速率冷藏并在氣相氮中保存。使細(xì)胞在37°C下解凍，并在具有10% FBS的DMEM中以43，000/cm2接種于明膠包被的組織培養(yǎng)平板上。將接種于市售小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFSM)和新鮮衍生的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物作為對(duì)照。用PBS洗滌滅活的人飼養(yǎng)細(xì)胞的平板，并用ES培養(yǎng)基中的胚胎干細(xì)胞接種。將胚胎干細(xì)胞在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)5天。隨后，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEF,圖1)、市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM，圖1)、人表皮成纖維細(xì)胞(D551，圖1)、人包皮成纖維細(xì)胞(Hs27，圖1)和W02006094286中所公開(kāi)的人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系(HP， 圖1)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞中CXCR4、Sox-17、Fox-A2, HNF_4a、HNF-6和AFP的表達(dá)。圖 1中示出了代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。將結(jié)果相對(duì)于在MATRIGEL (Off MG，圖1)上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行歸一化。CXCR4、Sox-17、R)x-A2、HNF-4a、HNF-6和AFP是與分化相關(guān)的標(biāo)志物。 在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞導(dǎo)致這些標(biāo)志物的表達(dá)降低。這些數(shù)據(jù)表明，人表皮成纖維細(xì)胞系D551、人包皮成纖維細(xì)胞Hs27和W02006094286中所公開(kāi)的人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系保持了人胚胎干細(xì)胞的多能性。實(shí)例4人胚胎干細(xì)胞在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上分化成表汰胰腺內(nèi)分泌譜系特征件標(biāo)志物的細(xì)胞從WiCell Research Institute, Inc. , (Madison，WI)獲得人胚胎干細(xì)胞系 Hl 和H9，并根據(jù)該來(lái)源公司提供的說(shuō)明進(jìn)行培養(yǎng)。將已在滅活的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上維持的未分化的Hl和H9人胚胎干細(xì)胞在60% FBS,20% DMSO和20% DMEM/ F12(Invitrogen/GIBC0)中以_1°C /分鐘的速率冷藏，并保存在氣相氮中，所述DMEM/F12 補(bǔ)充有20% knockout血清替代品、IOOnM MEM非必需氨基酸、0. 5πιΜβ巰基乙醇、具有如g/ ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺(全部得自hvitrogen/GIBCO)。 將所述細(xì)胞解凍，并涂布于經(jīng)絲裂霉素C處理的以52，000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種的D551 人真皮成纖維細(xì)胞上。在D551細(xì)胞上傳代三次后，采集多能細(xì)胞并然后轉(zhuǎn)移至調(diào)理培養(yǎng)基中的MATRIGEL上，該調(diào)理培養(yǎng)基來(lái)自補(bǔ)充有8ng/ml bFGF的滅活MEF的培養(yǎng)物。在37°C 的5%0)2的氣氛中，將接種于嫩11^^1^上的人胚胎干細(xì)胞(1 30)在調(diào)濕的組織培養(yǎng)箱內(nèi)在60mm組織培養(yǎng)平板中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)鋪滿時(shí)(涂布后大約5-7天)，用lmg/ml分散酶 (Invitrogen/GIBCO)處理人胚胎干細(xì)胞25-40分鐘。一旦細(xì)胞從培養(yǎng)平板脫離，就用2ml 血清學(xué)吸移管反復(fù)抽吸，直到達(dá)到所需的集落大小。將細(xì)胞以IOOOrpm離心5分鐘，然后將沉淀物以細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中為1 3至1 4的比率重新懸浮，并接種于MATRIGEL包被的細(xì)胞培養(yǎng)平板上。在MATRIGEL上傳代11次后，將多能Hl和H9細(xì)胞轉(zhuǎn)移至下述多種不同的飼養(yǎng)細(xì)胞上。簡(jiǎn)而言之，在組織培養(yǎng)物處理過(guò)的6孔板中將細(xì)胞在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中的飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基由補(bǔ)充有20% knockout血清替代品、IOOnM MEM非必需氨基酸、0. 5πιΜβ -巰基乙醇、具有如g/ml人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的2mM L-谷氨酰胺(全部得自 Invitrogen/GIBCO)的 DMEM/F12 anvitrogen/GIBCO)組成。該板通過(guò)這樣制備在接種飼養(yǎng)細(xì)胞前用0. 明膠(Sigma)包被并在37°C下溫育最少4小時(shí)。將即將接種前，抽吸明膠并將飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液遞送至該6孔板的每個(gè)孔中。在開(kāi)始進(jìn)行分化規(guī)程前，讓細(xì)胞擴(kuò)增5天。對(duì)人飼養(yǎng)細(xì)胞層支持人胚胎干細(xì)胞分化的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將胚胎干細(xì)胞在絲裂霉素C滅活的人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)5天。將接種于市售小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM)和新鮮衍生的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)上的人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物作為對(duì)照。對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞(D551，圖2和幻、人包皮成纖維細(xì)胞(HS27，圖2和5)和 W02006094286中所公開(kāi)的人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系(HP，圖2和5)支持人胚胎干細(xì)胞系 H9 (圖幻和Hl (圖幻群體分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將在市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM，圖2和5)和新鮮衍生的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF，圖2和5)上培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞群體作為對(duì)照。將激活蛋白A(100ng/ml)加入在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞群體中。將細(xì)胞在存在激活蛋白A的情況下連續(xù)培養(yǎng)并在 3天后采集。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)水平(圖2和5)。圖 2和5中所示的結(jié)果相對(duì)于在開(kāi)始分化規(guī)程前的細(xì)胞(DO)進(jìn)行了歸一化。激活蛋白A誘發(fā)了在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞中 CXCR4、Sox-17和R)X-A2表達(dá)的增加。這些數(shù)據(jù)表明，人飼養(yǎng)細(xì)胞成能夠支持人胚胎干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞(D551，圖3和6)、人包皮成纖維細(xì)胞(HS27，圖3和6)和 W02006094286中所公開(kāi)的人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系(HP，圖3和6)支持衍生自人胚胎干細(xì)胞系H9(圖3)和Hl (圖6)的群體的、表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞群體分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將在市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF-SM，圖3和6)和新鮮衍生的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF，圖3和6)上培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞群體作為對(duì)照。將ΙμΜ視黃酸、0. 25uM KAAD-環(huán)巴胺和FGF-10 (50ng/ml)加入衍生自在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞的、表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞群體中。在8天后采集細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)PCR分析胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的表達(dá)水平(圖 3和6)。圖3和6中所示的結(jié)果相對(duì)于DO基因表達(dá)進(jìn)行了歸一化。視黃酸、0. 25 μ M KAAD環(huán)巴胺和FGF-10處理誘發(fā)了在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞中Fox-A2、HNF-4a、HNF-6和PDX-I表達(dá)的增加。這些數(shù)據(jù)表明， 人飼養(yǎng)細(xì)胞層能支持衍生自人胚胎干細(xì)胞系H9(圖幻和Hl (圖6)的、表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成可表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞(D551，圖4和7)、人包皮成纖維細(xì)胞(HS27，圖4和7)和 W02006094286中所公開(kāi)的人胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞系(HP，圖4和7)支持衍生自人胚胎干細(xì)胞系H9(圖4)和Hl (圖7)的群體的、表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。將在市售的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 (MEF-SM，圖4和7)和新鮮衍生的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF，圖4和7)上培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞群體作為對(duì)照。將1 μ M的γ -分泌酶抑制劑DAPT、毒蜥外泌肽-4、IGF-I和HGF (全部為 50ng/ml)加入衍生自在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞的、表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞群體中。在培養(yǎng)9天后，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞特征性標(biāo)志物的表達(dá)水平進(jìn)行分析(圖4和7)。圖4和7中所示的結(jié)果相對(duì)于DO基因表達(dá)進(jìn)行了歸一化。γ -分泌酶抑制劑、毒蜥外泌肽-4、IGF-I和HGF處理誘發(fā)了在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞中i^ox-AZ、HNF-4a、HNF-6, neuro-Dl、Nkx2. 2、Pax-4, Nkx6. 1、PDX-1、胰高血糖素和胰島素表達(dá)的增加。這些數(shù)據(jù)表明，人飼養(yǎng)細(xì)胞層能支持衍生自人胚胎干細(xì)胞系H9(圖3)和Hl (圖6)的、表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞中胰島素和胰高血糖素的表達(dá)比在小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)的細(xì)胞中的要高。這些數(shù)據(jù)表明，人飼養(yǎng)細(xì)胞層更能夠支持人胚胎干細(xì)胞的分化。將本文通篇中所引用的出版物的全文以引用的方式并入本文。盡管已通過(guò)參考實(shí)例和優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的多個(gè)方面進(jìn)行了闡述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的范圍不由前面的描述限定，而是由專利法的原理正確解釋的權(quán)利要求書所限定。
權(quán)利要求
1.一種使多能干細(xì)胞分化的方法，包括如下步驟a.培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，b.將所述多能干細(xì)胞接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上，和c.用至少一種促進(jìn)所述多能干細(xì)胞的分化的因子處理所述多能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人飼養(yǎng)細(xì)胞層包含真皮成纖維細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人飼養(yǎng)細(xì)胞層包含包皮成纖維細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述人飼養(yǎng)細(xì)胞層包含胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述胚胎干細(xì)胞是人胚胎干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞在至少一種選自如下的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)上基本上是陰性的NCAM、ABCG2、細(xì)胞角蛋白7、細(xì)胞角蛋白8、細(xì)胞角蛋白18和細(xì)胞角蛋白19。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述胰腺衍生的基質(zhì)細(xì)胞在至少一種選自如下的蛋白質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)上基本上是陽(yáng)性的⑶44、⑶73、⑶90和⑶105。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞的步驟是在胞外基質(zhì)上完成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞的步驟是在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上完成。
14.一種治療糖尿病的方法，包括如下步驟a.培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，b.將所述多能干細(xì)胞接種到人飼養(yǎng)細(xì)胞層上，c.用至少一種促進(jìn)所述多能干細(xì)胞的分化的因子處理所述多能干細(xì)胞，和d.將已用至少一種促進(jìn)多能干細(xì)胞分化的因子處理過(guò)的多能干細(xì)胞移植進(jìn)患有糖尿病的人患者體內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述用至少一種促進(jìn)所述多能干細(xì)胞分化的因子處理所述多能干細(xì)胞的步驟導(dǎo)致所述多能干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌譜系的細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞的分化是在兩個(gè)或更多個(gè)步驟中完成，每個(gè)步驟需要通過(guò)至少一種促進(jìn)細(xì)胞分化成定形內(nèi)胚層譜系、胰腺內(nèi)胚層譜系和胰腺內(nèi)分泌譜系中的一種或更多種的因子對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。
全文摘要
本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞分化的領(lǐng)域。本發(fā)明提供了用于多能干細(xì)胞在人飼養(yǎng)細(xì)胞層上分化的方法。具體而言，本發(fā)明提供了一種使用人飼養(yǎng)細(xì)胞層使多能干細(xì)胞分化成胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的改進(jìn)方法。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102317443SQ200880108821
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2008年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日
發(fā)明者J·J·奧奈爾 申請(qǐng)人:生命掃描有限公司