專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于檢測(cè)核酸的雙寡核苷酸方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文件涉及用于檢測(cè)核酸的方法和材料。更具體地講，本文件涉及用兩種含有互相互補(bǔ)的序列以及與靶核酸不同部分互補(bǔ)的序列的經(jīng)5'標(biāo)記的寡核苷酸來(lái)檢測(cè)核酸的方法。背景信息熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)機(jī)制已被結(jié)合到多種用于檢測(cè)核酸的測(cè)定法中，包括分子信標(biāo)測(cè)定法和Taqman測(cè)定法。參見(jiàn)Epstein等人(2002),AnalyticaChimicaActa,469:3-36。對(duì)于分子信標(biāo)，使用能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈探針。該探針經(jīng)雙重標(biāo)記，在一端含有熒光團(tuán)，在另一端含有猝滅劑。當(dāng)該探針處于發(fā)夾構(gòu)象時(shí)，熒光被猝滅。當(dāng)與其靶標(biāo)雜交時(shí)，則觀察到熒光。Taqman測(cè)定法依靠DNA聚合酶的5‘-外切核酸酶活性來(lái)消化雙重標(biāo)記探針，這使熒光標(biāo)記的核苷酸與猝滅劑物理分離，導(dǎo)致熒光增加。對(duì)于不要求雙重標(biāo)記探針或兩種以上的寡核苷酸的核酸檢測(cè)方法存在著需求。
發(fā)明內(nèi)容本文公開(kāi)了擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的簡(jiǎn)化方法，該方法使用兩種含有5'互補(bǔ)序列和3'靶標(biāo)特異性序列的經(jīng)5'標(biāo)記的寡核苷酸。當(dāng)該寡核苷酸與它們的靶標(biāo)退火時(shí)，觀察到熒光。相反，當(dāng)寡核苷酸互相退火時(shí)，熒光被猝滅。本文所述的方法與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)擴(kuò)增技術(shù)相比背景減低，可用于從多種樣品檢測(cè)核酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一組用于檢測(cè)靶核酸的寡核苷酸。該組寡核苷酸包括第一和第二寡核苷酸。第一寡核苷酸包括5'和3'核苷酸序列，其中5'核苷酸序列從第一寡核苷酸的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5-23個(gè)核苷酸，其中3'序列與靶核酸的第一部分具有至少80%(例如至少90%或99%)同一性，且其中熒光部分連接在第一寡核苷酸的5'核苷酸序列(例如連接到5'末端核苷酸)。第二寡核苷酸包括5'和3'核苷酸序列，其中5'核苷酸序列從第二寡核苷酸的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5-23個(gè)核苷酸，其中3'核苷酸序列與靶核酸的第二部分具有至少80%(例如至少90%或99%)同一性，且其中受體部分連接在第二寡核苷酸的5'核苷酸序列(例如連接到5'末端核苷酸)。第一寡核苷酸的5'核苷酸序列與第二寡核苷酸的5'核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%(例如至少90%或99%)同一性。每種寡核苷酸的3'核苷酸序列不用與連接到第一寡核苷酸的熒光部分或連接到第二寡核苷酸的受體部分相容的熒光部分或受體部分進(jìn)行標(biāo)記。第一和第二寡核苷酸長(zhǎng)度可為25至50個(gè)核苷酸。第一和第二寡核苷酸的5'核苷酸序列在比第一或第二寡核苷酸的3'核苷酸序列退火到靶核酸所需的溫度更低的溫度下互相退火。例如，第一和第二寡核苷酸的5'核苷酸序列可在比第一或第二寡核苷酸二者的3'核苷酸序列退火到靶核酸所需的溫度更低的溫度下互相退火。受體分子可為猝滅劑(例如IOWABLACK)。寡核苷酸可在42°C至50°C下互相退火，熒光部分的熒光可在退火溫度下被猝滅。相對(duì)于熒光部分在不存在猝滅時(shí)的熒光，熒光可被猝滅至少50%。熒光部分的最大發(fā)射光譜可在420至620nm之間(例如6-羧基熒光素(6-FAM)、羅丹明綠、俄勒岡綠、六氯熒光素(HEX)、6-羧基-4'，5'-二氯-2'，7'-二甲氧基熒光素(JOE)、四氯熒光素(TET)或吲哚二碳菁3(Cy3))。該組寡核苷酸還可包括用于檢測(cè)不同靶核酸的第三和第四寡核苷酸。第三寡核苷酸可包括5'和3'核苷酸序列，其中5'核苷酸序列從第三寡核苷酸的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5-23個(gè)核苷酸，其中3'序列與該不同靶核酸的第一部分具有至少80%(例如至少90%或99%)同一性，且其中熒光分子連接在第三寡核苷酸的5'核苷酸序列(例如連接到5'末端核苷酸)。第四寡核苷酸可包括5'和3'核苷酸序列，其中5'核苷酸序列從第四寡核苷酸的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5-23個(gè)核苷酸，其中3'核苷酸序列與該不同靶核酸的第二部分具有至少80%(例如至少90%或99%)同一性，且其中受體分子連接在第四寡核苷酸的5'核苷酸序列(例如連接到5'末端核苷酸)中。第三寡核苷酸的5'核苷酸序列與第四寡核苷酸的5'核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%(例如至少90%或99%)同一性。第三和第四寡核苷酸各自的3'核苷酸序列不用與連接到第一或第三寡核苷酸的熒光部分或連接到第二或第四寡核苷酸的受體部分相容的熒光部分或受體部分進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明還涉及檢測(cè)在生物樣品中是否存在靶核酸的方法。該方法包括(a)使生物樣品與一組寡核苷酸接觸，以在樣品中存在靶核酸時(shí)產(chǎn)生熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子，以及(b)檢測(cè)該擴(kuò)增子的熒光。該組寡核苷酸包括本文所述的兩種寡核苷酸。該接觸步驟和檢測(cè)步驟可在實(shí)時(shí)PCR條件下進(jìn)行。該檢測(cè)步驟可包括對(duì)熒光的量進(jìn)行定量。擴(kuò)增子長(zhǎng)度可在30至500個(gè)(例如50至150個(gè))核苷酸之間。另一方面，本發(fā)明描述了檢測(cè)在生物樣品中是否存在至少兩種靶核酸的方法。該方法包括(a)使生物樣品與一組寡核苷酸接觸，以在樣品中存在靶核酸時(shí)產(chǎn)生兩種熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增子的熒光。該組寡核苷酸包括本文所述的四種寡核苷酸。又一方面，本發(fā)明描述了用于檢測(cè)核酸的試劑盒。該試劑盒包括本文所述的一組寡核苷酸。該試劑盒還可包括DNA聚合酶、MgCl2、KCl或脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)。本發(fā)明還描述了用于對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行基于熒光的監(jiān)測(cè)的反應(yīng)混合物。該反應(yīng)混合物包括本文所述的一組寡核苷酸、DNA聚合酶、dNTP和MgCl2。該反應(yīng)混合物還可包括熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。該擴(kuò)增子的有義鏈的5'核苷酸序列與該擴(kuò)增子的反義鏈的5'核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%序列同一性，其中所述5'核苷酸序列從該擴(kuò)增子的每條鏈的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5至23個(gè)核苷酸，且其中該擴(kuò)增子的一條鏈的5'核苷酸序列用熒光部分進(jìn)行標(biāo)記，該擴(kuò)增子的另一條鏈的5'核苷酸序列用相容的受體部分進(jìn)行標(biāo)記。該擴(kuò)增子的長(zhǎng)度可為30至500個(gè)核苷酸。除非另有定義，否則本文使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語(yǔ)的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。下文描述的是合適的方法和材料，不過(guò)與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于實(shí)施本發(fā)明。本文提及的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利及其他參考文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文中。如有沖突，應(yīng)以本說(shuō)明書(shū)(包括定義在內(nèi))為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)例僅是示例性的，并無(wú)意于限制本發(fā)明。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例的細(xì)節(jié)在以下附圖和具體實(shí)施方式中給出。根據(jù)具體實(shí)施方式和附圖以及權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見(jiàn)。圖1A-1C是用一對(duì)5'標(biāo)記引物進(jìn)行的擴(kuò)增程序的示意圖。具體實(shí)施例方式大體上講，本發(fā)明公開(kāi)了使用一組兩種寡核苷酸來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)核酸的材料和方法，其中所述寡核苷酸的5'核苷酸序列互相互補(bǔ)，并且3'核苷酸序列與靶標(biāo)特異性序列的不同部分互補(bǔ)。每種寡核苷酸在5'核苷酸序列中(例如在其5'末端處)進(jìn)行標(biāo)記；一種寡核苷酸用熒光供體部分進(jìn)行標(biāo)記，并且另一種寡核苷酸用相容的受體部分進(jìn)行標(biāo)記。如下所述，這樣的寡核苷酸對(duì)可作為引物用來(lái)實(shí)時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)核酸，而不需要進(jìn)行雙重標(biāo)記或另外的寡核苷酸引物或探針。寡核苷酸如本文所用，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體，或者它們的類(lèi)似物。核酸類(lèi)似物可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈進(jìn)行修飾，以例如改善核酸的穩(wěn)定性、雜交或溶解性。在堿基部分的修飾包括用脫氧尿苷取代脫氧胸苷，和用5-甲基-2'-脫氧胞苷和5-溴-2'-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。可取代天然堿基的核堿基的其他例子包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羥基甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2_氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2_丙基衍生物和其他烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-氮雜尿嘧啶；胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其他8_取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7_脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其他有用的核堿基包括例如美國(guó)專(zhuān)利No.3，687，808中所公開(kāi)的那些。糖部分的修飾可包括修飾核糖的2'羥基以形成2'-0-甲基糖或2'-0-烯丙基糖?？蓪⒚撗鹾颂橇姿嶂麈溸M(jìn)行修飾，以產(chǎn)生其中每個(gè)堿基部分與六元嗎啉代環(huán)連接的嗎啉代核酸，或者其中脫氧磷酸主鏈被假肽主鏈(例如氨基乙基甘氨酸主鏈)取代而保留四種堿基的肽核酸。參見(jiàn)例如Summerton和ffeller(1997)AntisenseNucleicAcidDruRDev.7187-195；和Hyrup等，(1996)BioorRan.Med.Chem.4:5_23。另外，脫氧磷酸主鏈可用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主鏈、亞磷酰胺或烷基磷酸三酯主鏈代替。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)禾IjNo.4，469，863,5,235，033,5,750，666和5，596，086關(guān)于制備具有經(jīng)修飾的主鏈的寡核苷酸的方法。本發(fā)明的寡核苷酸長(zhǎng)度可在15至50個(gè)(例如15-30、25-50、30-45、33-40、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、35、37、38、39或40個(gè))核苷酸之間，且具有相互互補(bǔ)的5'核苷酸序列。通常，5'核苷酸序列從寡核苷酸的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5至23個(gè)核苷酸。本領(lǐng)域知道，寡核苷酸的序列不需要與其靶核酸的序列100%互補(bǔ)才能進(jìn)行雜交。相反，當(dāng)一種寡核苷酸的5'核苷酸序列與另一種寡核苷酸的5'核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%(例如至少85%、90%、95%、99%或100%)序列同一性時(shí)，就可進(jìn)行雜交。可基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)的退火溫度下的熒光水平檢測(cè)5'核苷酸序列的雜交，即當(dāng)兩種寡核苷酸在退火溫度下互相雜交時(shí)，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，從而熒光被猝滅。如果不發(fā)生雜交，則產(chǎn)生熒光?？扇缦聹y(cè)定核酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)。首先，用BLAST2SequenceS(B12seq)程序?qū)⒛澈怂嵝蛄信c靶核酸序列進(jìn)行比較，該程序來(lái)自包含BLASTN2.0.14版和BLASTP2.0.14版的單機(jī)版BLASTZ。該單機(jī)版BLASTZ可獲自Fish&Richardson的網(wǎng)站(www.fr.com/blast)、美國(guó)政府的國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)或者紐約州立大學(xué)OldWestbury分校圖書(shū)館(QH497.m6714)。介紹如何使用B12seq程序的說(shuō)明書(shū)可在BLASTZ隨附的自述文件中找到。B12seq是用BLASTN算法進(jìn)行兩個(gè)序列之間的比較。為比較兩個(gè)核酸序列，將選項(xiàng)設(shè)置如下_i設(shè)置為含有要比較的第一核酸序列的文件(例如C:\seql.txt)；-j設(shè)置為含有要待比較的第二核酸序列的文件(例如C:\seq2.txt)；_p設(shè)置為blastn;_ο設(shè)置為任何所需的文件名(例如C:\output.txt)；_q設(shè)置為-1；_r設(shè)置為2;所有其他選項(xiàng)保留其默認(rèn)設(shè)置。例如，可用以下命令來(lái)產(chǎn)生含有兩個(gè)序列之間的比較的輸出文件C:\B12Seq-ic:\seql.txt-jc:\seq2.txt_pblastn-oc:\output.txt-q-l_r2。如果第一核酸序列與第二核酸序列的任何部分具有同源性，則指定的輸出文件將把那些同源性區(qū)域作為比對(duì)序列呈現(xiàn)。如果第一核酸序列與第二核酸序列的任何部分不具有同源性，則指定的輸出文件將不呈現(xiàn)比對(duì)序列。一旦得到比對(duì)，則通過(guò)對(duì)所顯示的第一核酸序列與第二核酸序列的序列對(duì)齊的連續(xù)核苷酸的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，來(lái)確定長(zhǎng)度。匹配位置是任何其中同一核苷酸在靶標(biāo)序列和哺乳動(dòng)物序列兩者中都呈現(xiàn)的位置。第一序列中出現(xiàn)的空位不進(jìn)行計(jì)數(shù)，因?yàn)榭瘴徊皇呛塑账峄虬被釟埢Ｍ瑯?，第二序列中出現(xiàn)的空位也不進(jìn)行計(jì)數(shù)。某確定長(zhǎng)度上的同一性百分?jǐn)?shù)是如下進(jìn)行測(cè)定計(jì)數(shù)該長(zhǎng)度上的匹配位置的數(shù)目，將該數(shù)目除以該長(zhǎng)度，然后將所得數(shù)值乘以100。例如，如果(1)將某300個(gè)氨基酸的靶標(biāo)序列與參考序列進(jìn)行比較，(2)B12seq程序顯示靶標(biāo)序列有200個(gè)連續(xù)氨基酸與參考序列的某個(gè)區(qū)域進(jìn)行對(duì)齊，以及(3)在該200個(gè)對(duì)齊的氨基酸中匹配的數(shù)目為180，則該300個(gè)氨基酸的靶標(biāo)序列含有長(zhǎng)度為200且該長(zhǎng)度上同一性百分?jǐn)?shù)為90(即(180+200)X100=90)的氨基酸區(qū)段。應(yīng)指出，序列同一性百分?jǐn)?shù)值四舍五入到小數(shù)點(diǎn)后一位。例如，75.11,75.12、75.13和75.14下舍入為75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18和75.19上舍入為75.2。還應(yīng)指出，長(zhǎng)度值總是整數(shù)。本發(fā)明的寡核苷酸的3'核苷酸序列與靶核酸的不同部分具有至少80%(例如至少85%、90%、95%、99%或100%)序列同一性，使得當(dāng)該對(duì)寡核苷酸引物用于相同的PCR反應(yīng)時(shí)，靶核酸的特定區(qū)域可得到擴(kuò)增(即得到復(fù)制，使得產(chǎn)生出許多拷貝)。一種寡核苷酸的3'核苷酸序列與該待擴(kuò)增的靶核酸的該特定區(qū)域的有義鏈具有至少80%序列同一性，而另一寡核苷酸與該靶核酸的該特定區(qū)域的反義鏈具有至少80%序列同一性。通常，3'核苷酸序列長(zhǎng)度為5至45個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施例中，一種或多種寡核苷酸的3'核苷酸序列可包含萬(wàn)古霉素抗性基因的一部分，所述基因?yàn)槔缡耗c球菌(Enterococcusfaecium)的VanA基因。在某些實(shí)施例中，其中一種寡核苷酸的3'核苷酸序列包含如本文中SEQIDNO:1中或SEQIDNO2中所列出的核苷酸序列，如表1中所示。在某些實(shí)施例中，第一寡核苷酸的3'核苷酸序列可包含如SEQIDNO:1中所列出的核苷酸序列，第二寡核苷酸的3'核苷酸序列可包含如SEQIDNO:2中所列出的核苷酸序列。表IvanA寡核苷酸的核苷酸序列SEQIDNO1I5'TTGTGCGGTATTGGGAAACAGTG3'SEQIDNO2~~5'CCGGCTCGACTTCCTGATGAATA3'由SEQIDNO:1中所表示的核苷酸序列組成的寡核苷酸可與vanA核酸靶標(biāo)雜交，對(duì)應(yīng)于GenBank登記號(hào)EF206285(在本文中標(biāo)示為SEQIDNO3)的核苷酸590-611，EF206285描述的是屎腸球菌的vanA部分基因序列。由SEQIDNO:2所列出的核苷酸序列組成的寡核苷酸可與vanA核酸靶標(biāo)雜交，對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:3的核苷酸667-689的反向互補(bǔ)序列。包含SEQIDNO1中所列出的3'核苷酸序列的寡核苷酸，或者包含SEQIDNO2中所列出的3'核苷酸序列的寡核苷酸，或者其中第一寡核苷酸包含SEQIDN0:1中所列出的3'核苷酸序列并且第二寡核苷酸包含SEQIDNO:2中所列出的3'核苷酸序列的寡核苷酸混合物，可用于根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的檢測(cè)靶核酸的方法?；旧嫌蒘EQIDN0:1中所列出的3'核苷酸序列組成的寡核苷酸，或者基本上由SEQIDNO:2中所列出的3'核苷酸序列組成的寡核苷酸，或者其中第一寡核苷酸基本上由SEQIDNO:1中所列出的3'核苷酸序列組成并且第二寡核苷酸基本上由SEQIDNO:2中所列出的3'核苷酸序列組成的寡核苷酸混合物，可用于根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的檢測(cè)靶核酸的方法。表2.GenBank登記號(hào)EF206285所列出的屎腸球菌的部分vanA核苷酸序列。SEQIDNO31ggtaaaatctgcaatagagatagccgctaacattaataaa41gaaaaatacgagccgttatacattggaattacgaaatctg81gtgtatggaaaatgtgcgaaaaaccttgcgcggaatggga121aaacgacaattgctattcagctgtactctcgccggataaa161aaaatgcacggattacttgttaaaaagaaccatgaatatg201aaatcaaccatgttgatgtagcattttcagctttgcatgg241caagtcaggtgaagatggatccatacaaggtctgtttgaa281ttgtccggtatcccttttgtaggctgcgatattcaaagct321cagcaatttgtatggacaaatcgttgacatacatcgttgc361gaaaaatgctgggatagctactcccgccttttgggttatt401aataaagatgataggccggtggcagctacgtttacctatc441ctgtttttgttaagccggcgcgttcaggctcatccttcgg481tgtgaaaaaagtcaatagcgcggacgaattggactacgca521attgaatcggcaagacaatatgacagcaaaatcttaattg561agcaggctgtttcgggctgtgaggtcggttgtgcggtatt601gggaaacagtgccgcgttagttgttggcgaggtggaccaa641atcaggctgcagtacggaatctttcgtattcatcaggaag681tcgagccggaaaaaggctctgaaaacgcagttataaccgt721tcccgcagacctttcagcagaggagcgaggacggatacag761gaaacggcaaaaaaaatatataaagcgctcggctgtagag801gtctagcccgt由SEQIDNO:4所列出的核苷酸序列組成的寡核苷酸可與SEQIDNO3雜交。由SEQIDNO:5所列出的核苷酸序列組成的寡核苷酸可與SEQIDNO:3雜交。包含SEQIDNO:4所列出的核苷酸序列的寡核苷酸，或者包含SEQIDN0:5所列出的核苷酸序列的寡核苷酸，或者其中第一寡核苷酸包含SEQIDNO:4所列出的核苷酸序列并且第二寡核苷酸包含SEQIDNO5所列出的核苷酸序列的寡核苷酸混合物，可用于根據(jù)本公幵內(nèi)容的檢測(cè)靶核酸的方法?；旧嫌蒘EQIDNO:4所列出的核苷酸序列組成的寡核苷酸，或者基本上由SEQIDNO:5所列出的核苷酸序列組成的寡核苷酸，或者其中第一寡核苷酸基本上由SEQIDNO:4所列出的核苷酸序列組成并且第二寡核苷酸基本上由SEQIDNO5所列出的核苷酸序列組成的寡核苷酸混合物，可用于根據(jù)本公幵內(nèi)容的檢測(cè)靶核酸的方法。表3.anA基因雜交的寡核苷酸的核苷酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>將寡核苷酸(如包含SEQIDNO:4、5、6或7中所列出的核苷酸序列中的任意一者的寡核苷酸或者基本上由SEQIDNO:4、5、6或7中所列出的核苷酸序列中的任意一者組成的寡核苷酸)的5'核苷酸序列設(shè)計(jì)成使得5'核苷酸序列相互間的退火溫度比3'核苷酸序列和它們的靶標(biāo)之間的退火溫度低。例如，5'核苷酸序列的退火溫度可比3'核苷酸序列與它們的靶標(biāo)的退火溫度低5至20°C(例如6至18°C、7至17°C、8至14°C或9至Il0O0這使得每種寡核苷酸的3'核苷酸序列在寡核苷酸互相退火(即退火成引物二聚體)之前與其靶標(biāo)退火。參見(jiàn)圖1A-1C。5'核苷酸序列相互間的退火溫度和3'核苷酸序列與它們的靶標(biāo)序列的退火溫度之間較大的差異，能使得在達(dá)到寡核苷酸可互相退火而形成引物二聚體的最終退火溫度之前，反應(yīng)偏向于寡核苷酸與它們的靶標(biāo)退火。退火溫度可憑經(jīng)驗(yàn)確定，或者由計(jì)算得到的寡核苷酸解鏈溫度(Tm)減去5至10°C來(lái)確定。寡核苷酸的Tm值取決于序列的長(zhǎng)度、序列的鳥(niǎo)嘌呤+胞嘧啶含量以及所存在的陽(yáng)離子(特別是鈉離子(Na+))的類(lèi)型和濃度，可桉SantaLucia(ProcNatlAcadSciUSA(1998)951460-5)的方法計(jì)算。在某些實(shí)施例中，寡核苷酸的5'核苷酸序列可包含SEQIDNO:6或SEQIDNO:7所列出的核苷酸序列。表4.寡核苷酸的5'核苷酸序列。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>包含SEQIDNO:6所列出的5'核苷酸序列的寡核苷酸，或者包含SEQIDNO:7所列出的5'核苷酸序列的寡核苷酸，或者其中第一寡核苷酸包含SEQIDNO:6所列出的5'核苷酸序列并且第二寡核苷酸包含SEQIDNO:7所列出的5'核苷酸序列的寡核苷酸混合物，可用于根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的檢測(cè)靶核酸的方法?；旧嫌蒘EQIDNO:6所列出的5'核苷酸序列組成的寡核苷酸，或者基本上由SEQIDNO:7所列出的5'核苷酸序列組成的寡核苷酸，或者其中第一寡核苷酸基本上由SEQIDNO:6所列出的5'核苷酸序列組成并且第二寡核苷酸基本上由SEQIDN0:7所列出的5'核苷酸序列組成的寡核苷酸混合物，可用于根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的檢測(cè)靶核酸的方法。每種寡核苷酸(例如包含SEQIDNO:4、5、6或7所列出的核苷酸序列中的任意一者的寡核苷酸或者基本上由SEQIDNO:4、5、6或7所列出的核苷酸序列中的任意一者組成的寡核苷酸)的5'核苷酸序列用熒光供體部分或受體部分進(jìn)行標(biāo)記。每種寡核苷酸的3'核苷酸序列不用與連接到該組寡核苷酸中的任何寡核苷酸的熒光供體部分或受體部分相容的熒光供體部分或受體部分進(jìn)行標(biāo)記。在許多實(shí)施例中，5'核苷酸序列在其5'末端進(jìn)行標(biāo)記，即5‘末端核苷酸被標(biāo)記。很多種熒光供體在文獻(xiàn)中公知，包括例如咕噸染料，例如熒光素染料或羅丹明染料，包括5-羧基熒光素(FAM)、6_羧基熒光素(6-FAM)、六氯熒光素(HEX)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、四氯熒光素(ΤΕΤ)、熒光素的氟化類(lèi)似物(例如俄勒岡綠3)、6_羧基羅丹明(R6G)、N,N,N,N'-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6_羧基-X-羅丹明(ROX)。合適的熒光供體還包括在α或β位置具有氨基的萘胺染料。萘基氨基化合物的非限制性例子包括1-二甲氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸酯和2-對(duì)甲苯氨基-6-萘磺酸鹽、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。其他的熒光供體包括香豆素，如3-苯基-7-異氰酸香豆素；吖啶，例如9-異硫氰酸根合吖啶和吖啶橙；N-(ρ-(2-苯并噁唑基)苯基)馬來(lái)酰亞胺；花菁，如吲哚二碳菁3(Cy3)、吲哚二碳菁5(Cy5)、吲哚二碳菁5.5(Cy5.5)、3-(-羧基-戊基)-3‘-乙基-5，5'-二甲基氧雜碳菁(CyA);1H，5H，11H，15H-咕噸并[2，3，4-ij:5，6，7-i'j']二喹嗪-18-鐺、9-[2(或4)-[[[6-[2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]_6_氧代已基]氨基]磺?；鵠_4(或2)-磺苯基]-2，3，6，7，12，13，16，17-八氫內(nèi)鹽(TR或者說(shuō)德克薩斯紅)；BODIPYTM染料；苯并噁二唑；芪；芘等。5'受體部分必須與5'供體熒光部分相容。本文所用的“相容受體”是其吸收光譜與供體的發(fā)射光譜重疊的分子。受體部分可以是猝滅劑，即造成供體部分降低其熒光發(fā)射強(qiáng)度的非熒光分子，或者是接受從供體非發(fā)射性放出的能量并以受體的特征性發(fā)射光譜再發(fā)射該能量的熒光分子。參見(jiàn)Epstein等(2002)AnalyticaChimicaActa,469:3_36。受體部分的非限制性例子包括TAMRA、Dabcyl(4_(二甲氨基偶氮)苯_4_甲酸)、BlackHoleQuencher如BHQ-1(對(duì)500-550nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光的吸收最大)、BHQ-2.BHQ-3(對(duì)650-700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光的吸收最大)、IowaBlack3FQ(對(duì)420_700nm之間(例如420-620nm之間)的光的吸收最大)、LC-Red640、LC-Red705、Cy5、Cy5.5(對(duì)500-705nm之間的光的吸收最大)、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、四甲基異硫氰酸羅丹明、異硫氰酸羅丹明X、異硫氰酸赤蘚紅、熒光素、二亞乙基三胺五乙酸或鑭系元素離子(例如銪或鋱)的其他螯合物。例如，6-FAM、羅丹明綠、俄勒岡綠、HEX、JOE、TET或Cy3可用作熒光供體，IowaBlack3FQ可用作受體。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.20060263816關(guān)于合成暗猝滅劑和將暗猝滅劑連接到寡核苷酸的方法。供體部分和受體部分可獲自例如MolecularProbes(JunctionCity,OR)、IntegratedDNATechnologies,Inc.(Coralville,IA)或SigmaChemicalCo.(St.Louis,M0)。經(jīng)5'標(biāo)記的寡核苷酸互相雜交后，熒光供體部分和相容的受體部分必須靠近以使得FRET可發(fā)生。FRET技術(shù)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利No.4，996，143,5,565，322,5,849，489和6，162，603)是基于這樣的原理當(dāng)將供體部分和相容的受體部分定位成相互間相隔Foster距離以內(nèi)時(shí)，這兩個(gè)部分之間發(fā)生可見(jiàn)的或者以別的方式檢測(cè)的和/或定量的能量轉(zhuǎn)移。FSrster距離指相容的FRET對(duì)之間的共振能量轉(zhuǎn)移下降至50%時(shí)的距離，通常在10至100A之間。因此，當(dāng)寡核苷酸互相雜交時(shí)，每種寡核苷酸的5'供體部分和5'受體部分相隔可最多達(dá)23個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23)個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，5'標(biāo)記相互間相隔1至20個(gè)(例如3至20、4至19、6至18、8至15或11至14個(gè))核苷酸以內(nèi)。當(dāng)受體部分是猝滅劑時(shí)，兩種寡核苷酸互相雜交時(shí)會(huì)觀察到熒光發(fā)射強(qiáng)度下降。相對(duì)于熒光分子在不存在猝滅時(shí)的熒光，供體的熒光下降至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或98%是特別有用的。如果受體部分是另一熒光部分，會(huì)在該受體的特征性發(fā)射光譜觀察到熒光，而供體熒光降低。合成寡核苷酸的方法是已知的。通常使用自動(dòng)DNA合成儀，如得自AppliedBiosystems(FosterCity,CA)的自動(dòng)DNA合成儀。一旦合成寡核苷酸并除去任何保護(hù)基，可將該寡核苷酸純化(例如通過(guò)萃取和凝膠純化或離子交換高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行純化)，并可測(cè)定該寡核苷酸的濃度(例如通過(guò)在分光光度計(jì)中于260nm處測(cè)量光密度來(lái)測(cè)定)。寡核苷酸可在合成過(guò)程中用供體部分或受體部分進(jìn)行標(biāo)記，或者可在合成之后連接上供體部分或受體部分?？墒褂媒宇^分子用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將供體部分或受體部分連接到寡核苷酸。參見(jiàn)例如《MolecularProbes公司的熒光探針和標(biāo)記技術(shù)指南手冊(cè)》(TheHandbook-AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologiesfromMolecularProbes,見(jiàn)www.probes,invitrogen.com/handbook)。常用來(lái)將供體焚光部分(如熒光素)偶聯(lián)到寡核苷酸的接頭包括硫脲接頭(FITC衍生的，例如得自GlenResearch或ChemGene(Ashland，ΜΑ)的熒光素-CPG)、酰胺接頭(熒光素-NHS-酯衍生的，如得自BioGenex(SanRamon,CA)的熒光素-CPG)或者要求在寡核苷酸合成后偶聯(lián)熒光素-NHS-酯的3'-氨基-CPG。檢測(cè)核酸的方法本文公開(kāi)的方法可用于檢測(cè)任何生物體的核酸，包括任何微生物、植物或動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，如小鼠、大鼠、貓、狗、馬、牛、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物如食蟹猴、或者人)。因此，所述方法可用來(lái)診斷生物樣品(例如食物產(chǎn)品或者來(lái)自人的血液或組織樣品)中是否存在傳染病因子(例如引起人類(lèi)疾病的微生物)。特別值得關(guān)注的微生物包括原核微生物和真核微生物，特別是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、支原體、酵母、病毒和脂質(zhì)包膜病毒。通常，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌可通過(guò)檢測(cè)該細(xì)菌的特征性細(xì)胞壁成分(如編碼細(xì)胞壁蛋白質(zhì)的核酸)的存在來(lái)進(jìn)行鑒定。特別相關(guān)的微生物包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)或微球菌禾斗(Micrococcaceae)或葡萄球菌屬(Staphylococcus)物禾中、鏈球菌屬(Streptococcus)物種、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)物種、腸球菌屬(Enterococcus)物種、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)物種、軍團(tuán)菌屬(Legionella)物種、志賀桿菌屬(Shigella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)物種、埃希氏菌屬(Escherichia)物種、芽孢桿菌屬(Bacillus)物種、李斯特菌屬(Listeria)物種、弧菌屬(Vibrio)物種、棒桿菌屬(Corynebacteria)物種以及皰疹病毒、曲霉屬(Aspergillus)物種、鐮刀菌屬(Fusarium)物種和假絲酵母屬(Candida)物種。毒力特別強(qiáng)的微生物包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(包括抗性菌株如甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、月市炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)、化月農(nóng)性鏈球菌(S.pyogenes)、屎腸球菌(Enterococcusfaecalis)>萬(wàn)古霉素抗性腸球菌(Enterococcus(VRE))、萬(wàn)古霉素抗性金黃色葡萄球菌(VRSA)、萬(wàn)古霉素中等抗性金黃色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、黑曲霉(Aspergillusniger)、煙曲霉(A.fumigatus)、棒曲霉(A.clavatus)、爺腐鍵刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、厚垣鐮刀菌(F.chlamydosporum)、單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、伊凡諾夫李其j特菌(Listeriaivanovii)、霍舌匕弧菌(Vibriocholera)、副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)、豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonellacholerasuis)、傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、光滑念珠菌(C.glabrata)、克柔念珠菌(C.krusei)、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)、大腸桿菌(E.coli)0157和多藥物抗性革蘭氏陰性桿菌(MDR)。通常，可由是否存在編碼負(fù)責(zé)抗生素抗性的內(nèi)部細(xì)胞成分(如膜蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、酶等)的核酸，來(lái)檢測(cè)抗生素抗性微生物?？赏ㄟ^(guò)使生物樣品與上述的一對(duì)寡核苷酸接觸，從而在樣品中存在靶核酸時(shí)產(chǎn)生熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子，來(lái)檢測(cè)在生物樣品中是否存在靶核酸。如本文所用的，“擴(kuò)增子”指長(zhǎng)度通常為30-500個(gè)核苷酸(例如30-300、30-200、30-150或50-150個(gè)核苷酸)的雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。在熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子當(dāng)中，有義鏈的5'核苷酸序列與反義鏈的5'核苷酸序列的互補(bǔ)序列具有至少80%(例如至少85%、90%、95%、99%或100%)序列同一性。術(shù)語(yǔ)“有義鏈”和“反義鏈”在本文中用來(lái)表示雙鏈核酸分子的每條鏈，并不限于該核酸的編碼區(qū)。5'核苷酸序列從擴(kuò)增子的每條鏈的5'末端開(kāi)始長(zhǎng)度為5至23個(gè)核苷酸。此外，一條鏈的5'核苷酸序列用熒光部分進(jìn)行標(biāo)記，另一條鏈的5'核苷酸序列用相容的受體部分進(jìn)行標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)每條鏈的5'末端核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。參見(jiàn)例如圖1C。接觸步驟是在PCR(例如實(shí)時(shí)PCR)條件下進(jìn)行，使得靶核酸(如果存在的話)能被擴(kuò)增而產(chǎn)生熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。通常，在實(shí)時(shí)PCR條件下產(chǎn)生的擴(kuò)增子長(zhǎng)度在30-200個(gè)(例如30-150或50-150個(gè))核苷酸。在本文所述的方法中，對(duì)核酸分子進(jìn)行擴(kuò)增包括使模板核酸變性；通過(guò)逐漸降低溫度，直到達(dá)到低于引物的5'核苷酸序列的解鏈溫度的最終退火溫度，使寡核苷酸引物與靶核酸退火或者寡核苷酸引物互相退火；從引物進(jìn)行酶促延伸，產(chǎn)生熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子。如上所論述的，寡核苷酸引物的3'核苷酸序列在比寡核苷酸引物的5'核苷酸序列互相退火的溫度高的溫度下與它們的靶標(biāo)退火。引物二聚體的形成不會(huì)對(duì)背景熒光有貢獻(xiàn)，因?yàn)橛锈绨l(fā)生，且引物二聚體不能被聚合酶延伸。因此，引物二聚體的形成不會(huì)干擾反應(yīng)。擴(kuò)增通常要求存在有脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶(例如PlatinumTaq)和使聚合酶處于最佳活性的適當(dāng)緩沖液和/或輔因子。PCR條件通常由反應(yīng)緩沖液中的鹽(例如MgCl2和KCl)的濃度和由解鏈、退火和延伸所采用的溫度來(lái)限定。還可提出寡核苷酸引物、靶核酸、dNTP和DNA聚合酶的具體濃度和數(shù)量。例如，如下的PCR條件可以是特別有用的緩沖液含有1.5至2.5mMMgCl2，解鏈、退火和延伸溫度分別為94_95°C、35-65°C(例如42-50°C)和60-72°C。在一些實(shí)施例中，可使用含有適當(dāng)濃度的緩沖液、鹽、dNTP和DNA聚合酶的市售混合物(例如得自AppliedBiosystems公司的GeneAmpFastPCRMasterMix(2X))。每個(gè)循環(huán)中變性、退火和延伸各可進(jìn)行例如15-45秒(例如30秒)，共25至50個(gè)循環(huán)(例如45個(gè)循環(huán))。初始變性步驟(例如94-95°C1至2分鐘)和/或最終延伸步驟(例如60-72°C1至10分鐘)也可以是可用的。例如，可進(jìn)行95°C變性1分鐘，接著進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的95°C變性15秒，45°C退火30秒，60°C延伸30秒。在變性、退火和延伸步驟之間可根據(jù)需要以每秒5-30°C(例如20°C)的速度降低或提高溫度。單個(gè)PCR反應(yīng)混合物可含有一組寡核苷酸引物。一組引物是一對(duì)即兩種寡核苷酸?；蛘?，單個(gè)反應(yīng)混合物可含有多種寡核苷酸引物對(duì)，在這種情況下可產(chǎn)生許多擴(kuò)增子。每組引物可擴(kuò)增例如編碼區(qū)或其部分(例如全長(zhǎng)編碼區(qū)、一個(gè)外顯子或外顯子的一部分)或者非編碼區(qū)或其部分(例如啟動(dòng)子或內(nèi)含子或它們的部分)。在使用兩組或更多組寡核苷酸引物的實(shí)施例中，每組寡核苷酸的3'核苷酸序列可設(shè)計(jì)成使得從兩種或更多種靶核酸產(chǎn)生擴(kuò)增子(例如為了檢測(cè)一群或更多群微生物)，或者從同一靶核酸的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域產(chǎn)生擴(kuò)增子(例如為了使針對(duì)具有遺傳變異的微生物的檢測(cè)的包容性最大化)。各引物對(duì)的5'核苷酸序列可具有相同或不同的核苷酸序列。可使用例如光子計(jì)數(shù)落射熒光顯微鏡系統(tǒng)(裝有適當(dāng)?shù)挠糜诒O(jiān)測(cè)特定范圍的熒光發(fā)射的二向色鏡和濾光器)、光子計(jì)數(shù)光電倍增器系統(tǒng)或熒光計(jì)，對(duì)擴(kuò)增子的熒光進(jìn)行檢測(cè)，在一些實(shí)施例中還進(jìn)行定量?？捎脷咫x子激光器、高強(qiáng)度汞(Hg)弧光燈、纖維導(dǎo)光光源或其他經(jīng)適當(dāng)濾光以在所需范圍進(jìn)行激發(fā)的高強(qiáng)度光源來(lái)進(jìn)行激發(fā)以引發(fā)能量轉(zhuǎn)移。可在已達(dá)到最終退火溫度和寡核苷酸已互相退火之后進(jìn)行熒光檢測(cè)。可將可檢測(cè)到FRET的循環(huán)數(shù)目(即Ct值)與生物樣品中的靶核酸的量建立關(guān)聯(lián)。更通常，在熱循環(huán)儀裝置當(dāng)中進(jìn)行多個(gè)接觸步驟和檢測(cè)步驟，所述裝置為例如LIGHTCYCLER(Roche)(美國(guó)猶他大學(xué)研究基金會(huì)、國(guó)際發(fā)明者耶西·D·米勒申請(qǐng)人:3M創(chuàng)新有限公司