專利名稱：用于細(xì)菌懸液的貯存的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于貯存細(xì)菌的介質(zhì)組合物和方法，其中細(xì)菌貯存的方式能夠保存被 貯存細(xì)菌的理想特征。
背景技術(shù)：
分析發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光是一種對水和其它流體進(jìn)行衛(wèi)生監(jiān)測和毒性測試的快速、有效的方法。在基于發(fā)光細(xì)菌的化驗中，細(xì)菌發(fā)出的光的減少與樣品中毒性物質(zhì)的存在成 正比。這種類型的化驗是靈敏的、定量且快速的?，F(xiàn)有技術(shù)中可獲得的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用于在對發(fā)光細(xì)菌發(fā)出的光進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上 進(jìn)行的毒性測試，通常依賴于提供活性細(xì)菌培養(yǎng)試液或者提供再生細(xì)菌試液(例如凍干培 養(yǎng)物的再水化)。活性細(xì)菌培養(yǎng)試液可以從封閉培養(yǎng)或者開放生長系統(tǒng)中提供。在封閉培養(yǎng)系統(tǒng)中生長的細(xì)菌，包括發(fā)光細(xì)菌，表現(xiàn)出各種不同的生長階段滯后 期、加速期、指數(shù)期、減速期和死亡期。封閉式批量培養(yǎng)容器中含有處于細(xì)胞周期的各個階 段的微生物的混合物。在培養(yǎng)物的不同生長期中，微生物的數(shù)量會以不同的速率增加，且培 養(yǎng)物最終將衰敗和死亡。隨著培養(yǎng)物中有機(jī)體數(shù)量的上升，這些有機(jī)體生存的環(huán)境改變了。 許多細(xì)胞成分例如ATP、DNA和蛋白質(zhì)響應(yīng)這些改變，從而使得它們的生化反應(yīng)(發(fā)光)中 的個體差別發(fā)生變化。在開放式生長系統(tǒng)中，生長基質(zhì)(介質(zhì))不斷輸入，廢物、細(xì)胞和不使用的基質(zhì)不 斷被除去。在生長過程中可以監(jiān)測一些參數(shù)例如PH值、氧、溫度等，例如通過物質(zhì)添加來刺 激或延遲生長，從而對生長過程中發(fā)生的變化進(jìn)行自動補(bǔ)償。在開放式生長或者連續(xù)培養(yǎng) 系統(tǒng)中，指數(shù)生長期被無限期地延長，作為連續(xù)培養(yǎng)的增補(bǔ)和脫除。現(xiàn)有技術(shù)中，準(zhǔn)連續(xù)毒性試驗通常采用再水化凍干細(xì)菌懸液。美國專利5，801，052 描述了用于再造干細(xì)菌的設(shè)備。有些文獻(xiàn)描述了發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)，例如文獻(xiàn)[Zavoruev and Mezhevikin(1983) Prikl· Biokhim· Mikrobiol·19， pp. 564—568]。 胃 t ■ [D' Souza,2001 Biosens Bioelectron. 2001Aug ； 16 (6) :337_53]則提出了一種重組細(xì)菌生物傳感器系統(tǒng)。美國專利6，949，382描述了一種含有肌糖和鎂的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)。文獻(xiàn)[Rupaniet al. ,Biotechnol Prog(1886) 12 :367_392]描述了用乙醇作為細(xì) 胞生長誘導(dǎo)劑。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個示范性實(shí)施例中，提供一種介質(zhì)組合物，該組合物包括約NaCl/KCl(% )1. 0-3. O ；肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖(％ )0.5-7.0;Mg/Ca (mM)0.0-300;酵母提取物/酸水解酪素(％ )0. 01-0. 05 ；
牛血清白蛋白(BSA)/卵白蛋白(％ )0.02-1.0;和乙醇/ 甲醇 / 丙醇(％)0.1-3.5。選擇性地，所述介質(zhì)組合物包括約NaCl/KCl (% )2. 0-3. 0 ；肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖(％ )5.0-7.0;Mg/Ca (mM)1. 0-200 ；酵母提取物/酸水解酪素(％ )0. 01-0. 05 ；BSA/卵白蛋白(％)0.02-0.1;和乙醇/ 甲醇 / 丙醇(％)1.0-3.5。選擇性地，所述介質(zhì)組合物包括約NaCl/KCl(% )2.0;肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖(％ )5.0；Mg/Ca (mM)2. 0 ；酵母提取物/酸水解酪素(％ )0. 05 ；BSA/卵白蛋白(％)0.05;和乙醇/甲醇/丙醇(％)1.5。選擇性地，所述介質(zhì)組合物包括抗生素。選擇性地，所述介質(zhì)組合物為液體。在本發(fā)明一個示范性實(shí)施例中，提供一種細(xì)菌懸液，該細(xì)菌懸液包括如上所述的 介質(zhì)組合物，細(xì)菌懸浮于該介質(zhì)組合物中。選擇性地，所述細(xì)菌包括發(fā)光細(xì)菌。在本發(fā)明一個示范性實(shí)施例中，提供一種制備如上所述的細(xì)菌懸液的方法，該方 法包括將具有細(xì)菌培養(yǎng)的纖維潤濕，以形成濕纖維；將濕纖維凍干，以形成塞子；和將塞子浸入介質(zhì)組合物中，以形成細(xì)菌懸液。在本發(fā)明一個示范性實(shí)施例中，提供一種貯存細(xì)菌的方法，該方法包括(a)使細(xì)菌懸浮在權(quán)利要求1-3中任一項所述的介質(zhì)組合物中，以便形成細(xì)菌懸 液；禾口(b)將所述細(xì)菌懸液貯存在用于維持細(xì)菌存活并防止細(xì)菌擴(kuò)張的條件下。選擇性地，懸浮步驟包括將纖維上的凍干細(xì)菌浸入所述介質(zhì)組合物中。選擇性地，所述細(xì)菌包括發(fā)光細(xì)菌。選擇性地，所述維持細(xì) 存活和防止細(xì)菌擴(kuò)張在2_8°C進(jìn)行至少2周。選擇性地，所述介質(zhì)組合物包括至少一種抗生素。選擇性地，所述至少一種抗生素包括選自氯霉素和氨芐青霉素的至少一種化合 物。選擇性地，所述至少一種抗生素的濃度約為15mg/L。選擇性地，所述條件還包括維持所述發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光。在本發(fā)明一個示范性實(shí)施例中，提供一種制品，包括
(a)根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的介質(zhì)組合物；和(b)用于將細(xì)菌懸浮在所述介質(zhì)組合物中以形成細(xì)菌懸液和將細(xì)菌貯存在_2 +8°C的說明書。


現(xiàn)在僅僅通過舉例的方式、參照附圖來對本發(fā)明作詳細(xì)說明。在具體參照附圖時， 需要強(qiáng)調(diào)的是，圖中所示內(nèi)容只是一種示例，其目的是用圖示的方式討論本發(fā)明的優(yōu)選實(shí) 施方式，圖中展示的實(shí)施例被認(rèn)為對于理解本發(fā)明的原理和概念最有用、最容易理解。在這 方面，除了出于讓讀者基本理解本發(fā)明的需要之外，沒有企圖更詳細(xì)地展示本發(fā)明的結(jié)構(gòu) 特征。本說明書及附圖能夠讓本領(lǐng)域技術(shù)人員明了本發(fā)明的幾種形式并予以實(shí)施。在附圖中圖1為根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方式的細(xì)菌懸液貯存方法簡化流程圖，所述方法用于 在一個延長的時期內(nèi)將細(xì)菌懸液貯存于冷藏溫度下；圖2是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了白蛋白濃度的不同 所造成的影響；圖3是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了醇濃度的不同所造 成的影響；圖4是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了糖濃度的不同所造 成的影響；圖5是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了二價陽離子濃度的 不同所造成的影響；圖6是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了一價鹽濃度的不同 所造成的影響；圖7是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了 pH值的不同所造成 的影響；圖8是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了蛋白質(zhì)混合物濃度 的不同所造成的影響；和圖9是發(fā)光的相對發(fā)光單位隨時間變化的曲線圖，該圖展示了抗生素的不同所造 成的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的實(shí)施方式涉及介質(zhì)組合物，在一些實(shí)施方式中，所述介質(zhì)組合物可用來 貯存細(xì)菌懸液，可在冷藏溫度下將細(xì)菌懸液貯存至少2周，選擇性地，也可以貯存3、4或5 周，同時維持懸液的經(jīng)選擇的特性處于理想范圍。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述方法采 用一種介質(zhì)，該介質(zhì)具有一組新成分，這些成分具有經(jīng)選擇的濃度。特別地，本發(fā)明的一些實(shí)施方式可用于維持處于靜止懸液中的細(xì)菌的發(fā)光。在本 發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述發(fā)光用于對液態(tài)(水)樣品中的一種或多種毒性物質(zhì)進(jìn)行分 析。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
的方法和/或裝置的原理和操作將借助于附圖和相伴的描述得到更好的理解。 在對本發(fā)明的至少一種實(shí)施方式進(jìn)行具體說明之前，必須理解本發(fā)明不限于下 面描述的具體內(nèi)容或者實(shí)施例中述及的具體內(nèi)容。本發(fā)明可以有其它的實(shí)施方式，或者說 可以用不同的方式予以實(shí)施。還有必須理解，在此采用的措辭和術(shù)語只是為了描述的需要， 而不應(yīng)被視為一種限制。本發(fā)明人通過艱苦的實(shí)驗和篩選，合成了一種新的介質(zhì)組合物，該介質(zhì)組合物可 用于在延長的時間段內(nèi)、將細(xì)菌的發(fā)光保持在理想范圍。所述介質(zhì)組合物(溶液)包括一價鹽、糖、可選的二價陽離子源、蛋白質(zhì)混合物、白 蛋白和醇。選擇性地，所述介質(zhì)組合物包括至少一種抗生素。選擇性地，所述蛋白質(zhì)混合物 包括非蛋白成分，如維生素和/或脂肪酸和/或血脂。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述一價鹽包括NaCl和/或KCl。選擇性地，所述一 價鹽的濃度約為1_3%，優(yōu)選約2%。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，采用2%的NaCl。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，約0. 8%的一價鹽濃度是有用的。選擇性地，0. 8%的 NaCl可用于維持轉(zhuǎn)基因大腸桿菌發(fā)光。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述糖選自肌糖、乳糖、海藻糖和葡聚糖。選擇性地， 提供的所述糖的濃度至少為約0.5%，但不大于約7%。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，采用 5-7%的肌糖。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述二價陽離子包括鎂離子。選擇性地，提供的所述 鎂離子的濃度約為l_200mM。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述蛋白質(zhì)混合物包括酵母提取物和/或酸水解酪 素。選擇性地，所述蛋白質(zhì)混合物包括濃度至少約為0. 01%、但不超過約0. 05%的酵母提 取物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述白蛋白包括牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)。選擇性地，提供的BSA的濃度至少約為0. 02%、但不超過約1. 0%。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述醇選自乙醇、甲醇和丙醇。選擇性地，所述醇包 括濃度至少約為0. 01%、但不超過約5%、優(yōu)選為1. 5%的乙醇。在本發(fā)明的采用抗生素的實(shí)施方式中，可以使用氯霉素和/或氨芐青霉素，其濃 度可選擇為約15mg/L。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，提供一種介質(zhì)組合物，包括1. 0-3. 0 %的一價 鹽(例如NaCl和/或KCl)、0· 5-7. 0%的糖(例如肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖)、0_300mM 的二價陽離子(例如鎂離子或鈣離子)、0. 01-0. 05%的氨基酸源(例如酵母提取物或酸水 解酪素)、0. 02-1.0%的白蛋白(例如BSA或者卵白蛋白)以及0. 1-3. 5%的醇(例如乙醇、 甲醇或者丙醇)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述介質(zhì)組合物包括2. 0-3. 0%的一價鹽(例如 NaCl和/或KCl)、5. 0-7. 0 %的糖(例如肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖)、l-200mM的二價陽 離子(例如鎂離子或鈣離子)、0. 01-0. 05%的氨基酸源(例如酵母提取物或酸水解酪素)、 0.02-1.0%的白蛋白(例如BSA或者卵白蛋白)以及1.0-3. 5%的醇(例如乙醇、甲醇或者
丙醇)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方式中，所述介質(zhì)組合物包括約2%的一價鹽(例如NaCl和/或KC1)、約5%的糖(例如肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖)、約2mM的二價陽離子(例 如鎂離子或鈣離子)、約0. 05%的氨基酸源(例如酵母提取物或酸水解酪素)、約0. 05%的 白蛋白(例如BSA或者卵白蛋白)以及約1.5%的醇(例如乙醇、甲醇或者丙醇)。根據(jù)本發(fā)明的各種不同實(shí)施方式，所述介質(zhì)組合物可為固態(tài)或液態(tài)?？捎铆傊?脂糖或其它固化劑形成固態(tài)組合物。這里所描述的介質(zhì)組合物可用消過毒的試劑制得?？蛇x擇地或附加地，可在制得 所述介質(zhì)組合物后再對其進(jìn)行消毒。一旦組合物制備完成，細(xì)菌就可以懸浮于其中。列出來的介質(zhì)組合物的成分可通過多種途徑從市場上獲得。例如，NaCl、KCl、 MgCl2、CaCl2、肌糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、甲醇、乙醇、丙醇、酵母提取物、BSA、卵白蛋白可從 例如Sigma-Aldrich Co.公司(位于美國密蘇里州圣路易斯市)購得。酸水解酪素可從例 如Becton Dickinson and Co.公司(位于美國新澤西州富蘭克林湖)購得。如實(shí)施例1-13所述，本發(fā)明的介質(zhì)組合物可用于建立在細(xì)菌發(fā)光基礎(chǔ)上的毒性 測試中。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種貯存細(xì)菌的方法。上面披露的和下面實(shí) 施例中描述的介質(zhì)可用于貯存自然發(fā)光細(xì)菌(例如鰒發(fā)光桿菌、費(fèi)氏弧菌、哈維氏弧菌)和 /或細(xì)菌表達(dá)外源基因(例如費(fèi)式弧菌的大腸桿菌包藏發(fā)光系統(tǒng))。選擇性地，毒素敏感促 進(jìn)劑可用于調(diào)節(jié)發(fā)光基因。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用與發(fā)光無關(guān)的生化性質(zhì)作為化驗的基礎(chǔ)。在本發(fā)明這一方面的一個實(shí)施方式中懸浮著細(xì)菌的凍干顆粒。選擇性地，可將羊 毛或棉纖維浸在細(xì)菌培養(yǎng)液中，凍干并保持相當(dāng)長時間的貯存，直到懸浮在貯存溶液中。在 本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，細(xì)菌在纖維間的分散有助于再懸浮的緩解。選擇性地，細(xì)菌培養(yǎng) 物可沉淀(例如通過離心過濾)并懸浮在前述的介質(zhì)溶液中，以形成細(xì)菌懸液。所述細(xì)菌懸液可貯存于-2 +8°C，可選擇-1 +6°C，還可選擇+2 +5°C，最優(yōu) 選約4°C，貯存至少2周，同時保持懸液的經(jīng)選擇的性質(zhì)處于理想范圍。在本發(fā)明的一個實(shí) 施方式中，所述經(jīng)選擇的性質(zhì)包括在使用發(fā)光細(xì)菌時，細(xì)菌懸液的發(fā)光度。選擇性地，或者 附加地，也可采用其它生化性質(zhì)(例如顏色或者經(jīng)選擇的酶活性)。選擇性地，所述介質(zhì)維 持所述懸液的所述經(jīng)選擇的性質(zhì)處于理想范圍達(dá)3、4或5周，或者中間或更長的時間段?，F(xiàn)在看附圖，圖1展示了貯存細(xì)菌的方法100。方法100包括提供包括一價鹽、 糖、二價陽離子源、蛋白質(zhì)混合物、白蛋白和醇的介質(zhì)組合物(步驟110)。選擇性地，所述介 質(zhì)組合物包括至少一種抗生素。選擇性地，所述蛋白質(zhì)混合物包括非蛋白成分，例如維生素 和/或脂肪酸和/或血脂。根據(jù)圖中的方法，使細(xì)菌懸浮在介質(zhì)組合物中、以形成細(xì)菌懸液(步驟120)。在本 發(fā)明的一個實(shí)施方式中，細(xì)菌的凍干顆粒懸浮著。選擇性地，可將羊毛或棉纖維浸在細(xì)菌培 養(yǎng)液中，凍干并保持相當(dāng)長時間的貯存，直到懸浮在介質(zhì)組合物中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方 式中，細(xì)菌在纖維間的分散有助于再懸浮的緩解。選擇性地，細(xì)菌培養(yǎng)物可沉淀(例如通 過離心過濾)并懸浮在介質(zhì)組合物中，以形成細(xì)菌懸液。接著可將所述細(xì)菌懸液貯存在-2 +8°C、優(yōu)選-1 +6°C、更優(yōu)選+2 +5°C、最 優(yōu)選約4°C至少2周，同時維持懸液的經(jīng)選擇的性質(zhì)處于理想范圍(步驟130)。在本發(fā)明 的一個實(shí)施方式中，所述經(jīng)選擇的性質(zhì)包括細(xì)菌懸液的發(fā)光度。選擇性地，所述介質(zhì)維持組
7合物所述懸液的所述經(jīng)選擇的性質(zhì)處于理想范圍達(dá)3、4或5周，或者中間或更長的時間段。除非另有說明，否則在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 通常理解的相同的涵義。雖然與本文述及的方法和材料類似或相同的方法和材料也可用于 本發(fā)明的實(shí)踐或測試中，但這里描述的是比較合適的方法和材料。當(dāng)存在沖突時，專利說明 書，包括定義，將控制沖突。此外，所述材料、方法和實(shí)施例均只是示例性的而不是限制性 的。措辭“基本由...組成”或者類似的表述在此用于說明述及的特征、等分試樣、步 驟或者成分，但并不排除附加一種或多種另外的特征、等分試樣、步驟、成分或它們的集合， 如果這些另外的特征、等分試樣、步驟、成分或它們的集合不會實(shí)質(zhì)性地改變本發(fā)明要求保 護(hù)的組合物、設(shè)備或方法的基本的和新的特點(diǎn)的話。術(shù)語“方法”是指為了完成給定的任務(wù)而采取的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不 限于那些從微生物學(xué)和/或毒理學(xué)技術(shù)人員已知的方式、手段、技術(shù)和程序中知道的或者 容易地發(fā)展出來的方式、手段、技術(shù)和程序。除非另有說明，否則通常以粉末或晶體形式提供的化學(xué)品(例如鹽、糖和蛋白質(zhì)) 的百分比(％)是指重量/體積比(weight per V0lUme，W/V)。除非另有說明，否則通常以 液體形式提供的化學(xué)品(例如醇)的百分比(％)是指體積/體積比(volume per volume, V/V)。在這里，所謂“懸液的經(jīng)選擇的性質(zhì)處于理想范圍”是指例如可以通過重組增殖表 現(xiàn)的可行性，所述重組增殖是在合適的生長條件、共培養(yǎng)、基因表達(dá)、生長/表達(dá)誘導(dǎo)(例如 IPTG誘導(dǎo))及報告基因活性(如發(fā)光)、理想的催化活性(如益生菌活性或礦物燃料水解) 的孵化下進(jìn)行的。術(shù)語“包括”和“具有”及類似詞在此是指“包括但不限于”。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述介質(zhì)組合物被提供為制品的一部分。選擇性地， 所述介質(zhì)被提供為無菌和/或計量單位。選擇性地，每一計量單位位于單個容器中。選擇性地，所述介質(zhì)具有用于使細(xì)菌懸浮于其中以形成細(xì)菌懸液的導(dǎo)向，所述細(xì) 菌懸液的經(jīng)選擇的性質(zhì)一段時間內(nèi)被維持在_2 +8°C的理想范圍，所述一段時間為至少 2-5周。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述經(jīng)選擇的性質(zhì)包括發(fā)光度。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，所述介質(zhì)具有懸浮于其中的細(xì)菌，并被提供為帶標(biāo) 簽的冷藏制品，所述標(biāo)簽標(biāo)示了一段時間內(nèi)、_2 +8°C溫度下、維持懸液的經(jīng)選擇的性質(zhì) 處于在理想范圍內(nèi)的辦法，所述一段時間為至少2-5周。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述 經(jīng)選擇的性質(zhì)包括發(fā)光度。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，每一計量單位被裝在一個容器中提供，所述容器被 配置為可附加到自動毒性試驗儀器上。選擇性地，計量單位可供應(yīng)特定數(shù)量的試驗。通常， 一次毒性試驗使用10-50 u 1的細(xì)菌懸液(如處于l_5ml反應(yīng)體積中)，因此，lml懸液足 夠20-100次試驗使用。假設(shè)每次試驗持續(xù)15-60分鐘，那么50ml計量單位足夠供應(yīng)10-50 天的試驗使用。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，提供有50、100、150、200、250、300或400ml (或 者中間體積)的計量單位，且給單個儀器內(nèi)的多個測試室提供等分的細(xì)菌懸液。選擇性地，可將多個計量單位提供給單個儀器并按順序使用。在本發(fā)明的一個實(shí) 施方式中，按順序使用的2個或2個以上計量單位有助于在自動化儀器2次維修之間的時間段內(nèi)使用。預(yù)計在本專利的專利權(quán)期限內(nèi)，細(xì)菌毒物的許多有關(guān)影響將被開發(fā)出來，術(shù)語“試 驗/測試/化驗”的范圍將先驗性地包括所有這些新技術(shù)。在此，術(shù)語“約”是指士 5%或士 10%。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明的另外的目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征將隨著下面的非限 制性實(shí)施例的描述而變得清晰。此外，上面描述的以及權(quán)利要求書中要求保護(hù)的本發(fā)明的 各個實(shí)施方式和方面中的每一個均能在下面的實(shí)施例中找到實(shí)驗支持。實(shí)施例下面參考實(shí)施例，這些實(shí)施例與上面的描述一起，以非限制性的方式，展示了本發(fā) 明。實(shí)施例1 通用滴定程序為了確定適合用于發(fā)光細(xì)菌(例如鰒發(fā)光桿菌、費(fèi)氏弧菌、哈維氏弧菌)懸液的長 期介質(zhì)的貯存條件，需要就不同濃度的一價鹽、糖、二甲陽離子源、蛋白質(zhì)混合物、白蛋白和 醇進(jìn)行測試。NaCl被選擇為代表性的一價鹽，因為在細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)中常常使用它。相信也可使 用類似濃度的其它一價鹽，這些一價鹽包括但不限于KCl。鎂離子被選擇為代表性的二價陽離子，因為在細(xì)菌培養(yǎng)介質(zhì)中常常使用它。在這 里描述的實(shí)驗中，鎂離子以MgCl2的形式添加。也可以使用類似濃度的其它的二價陽離子， 包括但不限于鈣離子。由于設(shè)想大量介質(zhì)的商業(yè)生產(chǎn)，因此對于每種成分均選擇市場上有售的產(chǎn)品。乙醇被選擇為代表性的醇，雖然也可以使用其它的醇(如甲醇或丙醇)。酵母提取物被選擇為代表性的蛋白質(zhì)混合物，雖然也可以使用其它的蛋白質(zhì)混合 物(如酸水解酪素)。肌糖被選擇為代表性的糖，雖然也可以使用其它糖(如乳糖、海藻糖和葡聚糖)。 選擇性地，可根據(jù)要懸浮和貯存在溶液中的細(xì)菌的特定類型來選擇糖。牛血清白蛋白(BSA)被選擇為代表性的白蛋白，雖然也可以使用其它的白蛋白 (如卵白蛋白)。下表1概括了介質(zhì)成分和試驗檢測范圍。表1:滴定范圍概要
成分類型采用的成分示 滴定范圍在滴定其它成分時的用量
例
一價鹽N^cINaCl 0. 1-4. 5%2%
~~ffiMl0-11% ；5%
二價陽離子源 氯化續(xù)0~ Μ2mM 介質(zhì)的pH值也被滴定在pH 5. 5-8范圍內(nèi)。單獨(dú)檢測每種介質(zhì)成分(包括pH值)，同時保持所有其它成分為表1所示的不變 濃度。在滴定其它成分時，將PH值保持在7. 2不變。處于每一測試濃度(或pH值)的每 種成分對細(xì)菌發(fā)光的影響在為期數(shù)周的一段時間后確定。為了進(jìn)行介質(zhì)成分的滴定，在生長一夜之后，將細(xì)菌培養(yǎng)物涂覆在平板(LA plate)上，每板約300菌落。從具有ASW(artificial seawater，人工海水)的平板上收集 菌落并進(jìn)行離心分離(10000g，10分鐘，4°C)。將獲得的細(xì)菌再次懸浮在不同的溶液中，以 形成實(shí)驗用細(xì)菌懸液。將實(shí)驗用細(xì)菌懸液貯存在-2 +4°C。每周都將每個實(shí)驗用細(xì)菌懸液的等分試樣倒入人工海水(ASW 含有0. 5M的NaCl、 50mM的MgS04. 7H20、10mM的CaCl2. 2H20、lOmM的KC1)中稀釋，所述人工海水中補(bǔ)充有50ppm 的酵母提取物/葡萄糖，且在26-28°C溫度下培養(yǎng)。30分鐘后記錄發(fā)光度。每種成分的滴定結(jié)果列示在下文中。用凍干細(xì)菌顆粒來制備實(shí)驗用懸液也獲得了 類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。實(shí)施例2BSA滴定結(jié)果為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中白蛋白對發(fā)光的影響，將BSA添加到介 質(zhì)中，BSA的濃度分別為0. 02,0. 1,0. 4,0. 5、1和3%。將不含BSA的介質(zhì)作為陰性對照組。 BSA的影響試驗如實(shí)施例1所述。圖2概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表明，
0.5-1%的BSA比其它測試濃度更好地減緩了發(fā)光的衰減。當(dāng)所有其它成分都經(jīng)過優(yōu)化時， 選擇0. 05%的BSA濃度。實(shí)施例3乙醇滴定結(jié)果為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中醇對發(fā)光的影響，將乙醇添加到介質(zhì) 中，乙醇的濃度分別為0.1、1、1.5、3、3.5和5%。將不含乙醇的介質(zhì)作為陰性對照組。乙醇 的影響試驗如實(shí)施例1所述。圖3概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表明，
1.5%或1. 5%以上的乙醇比1. 5%以下的測試濃度更好地減緩了發(fā)光的衰減。實(shí)施例4肌糖滴定結(jié)果
10
為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中糖對發(fā)光的影響，將肌糖添加到介質(zhì) 中，肌糖的濃度分別為0.5、5、7和11%。將不含肌糖的介質(zhì)作為陰性對照組。肌糖的影響 試驗如實(shí)施例1所述。圖4概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表明， 5%的肌糖比其它測試濃度更好地減緩了發(fā)光的衰減。7%的肌糖在28-50天時具有相似的 效果，但是在更短的時間內(nèi)效力不如5%的肌糖。
實(shí)施例5鎂離子滴定結(jié)果為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中二價陽離子對發(fā)光的影響，將鎂離子 (MgCl2)添加到介質(zhì)中，鎂離子的濃度分別為1、50、200、300、600和lOOOrnM。將不含鎂離子 的介質(zhì)作為陰性對照組。鎂離子的影響試驗如實(shí)施例1所述。圖5概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表 明，200mM的鎂離子比其它測試濃度更好地減緩了發(fā)光的衰減。300mM的鎂離子在0_14天 時最有效，但是在第28天時卻比對照溶液發(fā)光更弱。當(dāng)所有其它成分都經(jīng)過優(yōu)化時，選擇 2mM的鎂離子濃度。實(shí)施例6NaCl滴定結(jié)果為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中一價鹽對發(fā)光的影響，將NaCl添加到 介質(zhì)中，NaCl的濃度分別為0. 1,0. 5,2. 0,3. 0和4. 5%。沒有設(shè)置陰性對照組，因為很低濃 度的NaCl會殺死細(xì)菌。NaCl的影響試驗如實(shí)施例1所述。圖6概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表明， 2-3%的NaCl比其它測試濃度更好地減緩了發(fā)光的衰減。2%的NaCl在0-14天時最有效， 但是3%的NaCl在第28天后最有效。這兩個濃度在14-28天時間段內(nèi)得到相似的結(jié)果。實(shí)施例7pH值滴定結(jié)果為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中pH值對發(fā)光的影響，測試了 pH值為 5. 5,6. 0,6. 5,7. 2,7. 5和8. 0的貯存溶液。pH值的影響試驗如實(shí)施例1所述。圖7概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表 明，7. 2-7. 5%的pH值比其它pH值更好地減緩了發(fā)光的衰減。7. 2的pH值直到第28天都 最有效，但28天以后，7.5的pH值最有效。令人驚訝的是，6.0的pH值直到第14天為止提供了最高的發(fā)光度，之后發(fā)光度快 速下降。實(shí)施例8酵母提取物滴定結(jié)果為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中蛋白質(zhì)混合物對發(fā)光的影響，測試了含 有濃度為0. 01、0. 05和0. 2%的酵母提取物的貯存溶液。將沒有添加酵母提取物的介質(zhì)作 為陰性對照組。酵母提取物的影響試驗如實(shí)施例1所述。圖8概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表明， 0. 01%的酵母提取物比其它測試濃度更好地減緩了發(fā)光的衰減。當(dāng)所有其它成分都經(jīng)過優(yōu)化時，選擇0. 05%的酵母提取物濃度。實(shí)施例9不同抗生素的影響為了確定在冷藏溫度下的長期貯存過程中不同抗生素對發(fā)光的影響，測試了分別 含有濃度為15mg/L的氨芐青霉素、氯霉素、新霉素和卡那霉素的貯存溶液。將沒有添加抗 生素的介質(zhì)作為陰性對照組。另外還測試了含有所有四種抗生素的介質(zhì)(每種抗生素的濃 度為15mg/L)?？股氐挠绊懺囼炄鐚?shí)施例1所述。圖9概要展示了發(fā)光度(相對光單位)隨時間(天)變化的實(shí)驗結(jié)果。結(jié)果表明， 氨芐青霉素和氯霉素比其它被測試的抗生素更好地減緩了發(fā)光的衰減。實(shí)施例10示范性介質(zhì)和示范性成分的范圍表2列出了示范性介質(zhì)的組成和基于實(shí)施例2-9中實(shí)驗結(jié)果的示范性范圍。表2 根據(jù)本發(fā)明各個實(shí)施方式的細(xì)菌介質(zhì)的示范性組成和所述介質(zhì)的示范性成 分的示范性范圍 “方案”一欄表示當(dāng)綜合考慮所有滴定結(jié)果時，用于介質(zhì)的示范性濃度?！胺秶鶬” 一欄表示與指定成分的陰性對照組相比提供了顯著進(jìn)步的濃度范圍?！胺秶鶬I”一欄表示相對于指定成分的陰性對照組沒有產(chǎn)生負(fù)面影響的濃度范圍。在有些情形下，將溶液中鎂離子的濃度降低至0. OmM比較好。實(shí)施例11通用滴定程序在待測樣品與細(xì)菌接觸之后，在測量細(xì)菌發(fā)光度偏離基線的變化的基礎(chǔ)上進(jìn)行毒 性物質(zhì)的存在測試。因此，可以使用一種懸液，該懸液不含隨著時間推移其密度不變的活細(xì) 胞。但最初的基線必須足夠高，從而使得變化能被測量出來。為了確定整個實(shí)驗期間的細(xì)胞密度，連續(xù)稀釋的來自表2所示示范性介質(zhì)的細(xì)菌 懸液被鍍出，計算菌落的數(shù)量，從而確定細(xì)菌懸液中活細(xì)胞的密度。結(jié)果列示在下表3中。表3 隨時間變化的活細(xì)胞密度
12 表3中的結(jié)果表明，在第一個7天中，活細(xì)胞(鰒發(fā)光桿菌、大腸桿菌)的濃度降 低了約50%，然后保持相對穩(wěn)定，直到第21天，到第28天總共下降一個數(shù)量級，到第35天 總共下降2個數(shù)量級。表3顯示了對每個菌株進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗所獲得的平均數(shù)。表3中的結(jié)果表明，至少在28-35天時還能獲得用于毒性分析的足夠的發(fā)光。實(shí)施例12隨時間變化的靈敏度為了確定貯存在根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方式的溶液中的細(xì)菌懸液在多長時間內(nèi) 能夠用于進(jìn)行毒性測試，隨著時間的推移重復(fù)進(jìn)行毒性測試(實(shí)驗儀器為以色列Qiryat Tivon 市 CheckLight Ltd 公司生產(chǎn)的 ToxScreen-II)。在測試過程中，在30天內(nèi)的4個時間點(diǎn)處，從介質(zhì)中的細(xì)菌懸液(鰒發(fā)光桿菌) 中取出O.OlmL的等分試樣，并用礦泉水稀釋的緩沖液中的化學(xué)毒物培養(yǎng)所述等分試樣。30 分鐘后、27°C時確定發(fā)光度。表4 鰒發(fā)光桿菌對各種毒物的靈敏度(mg/L) 表4中的結(jié)果表明，實(shí)施例11所述活細(xì)胞數(shù)量的下降不會干擾作為毒性測試基質(zhì) 的被貯存細(xì)菌懸液的有用性。在表4概括的實(shí)驗中，每種被測毒物的測試結(jié)果隨著時間的 推移是穩(wěn)定的，存在這種生物測定所期望的偏離。實(shí)施例13利用轉(zhuǎn)基因細(xì)菌為了證明根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的貯存溶液在發(fā)光(發(fā)光是基因操作的結(jié)果)細(xì)菌 中的效用，對費(fèi)式弧菌的大腸桿菌包藏發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)施例6所述的NaCl濃度滴定(數(shù)據(jù) 沒有列出)。測出0. 8-0. 85%的鹽濃度可用于這些細(xì)菌中。采用多種數(shù)值指標(biāo)來描述儀器的各組成部分和/或儀器與水源之間的關(guān)系。應(yīng)當(dāng) 理解即使進(jìn)一步根據(jù)結(jié)合到本發(fā)明中的多種工程原則、材料、用途和設(shè)計來說，這些數(shù)值 指標(biāo)也是可以變化的。此外，屬于本發(fā)明的實(shí)施方式并被描述為單個單元的組成部分和/ 或動作可以分成若干子單元。相反地，屬于本發(fā)明的實(shí)施方式并被描述為子單元的組成部分和/或動作也可結(jié)合成具有描述/描寫的功能的單個單元。選擇性地，或者附加地，用于描述方法的特征可用來刻畫儀器，且用于描述儀器的特征也可用來刻畫方法。還應(yīng)當(dāng)理解，上面描述的各個特征可被結(jié)合到所有可能的組合和子組合中，以形 成本發(fā)明的示范性實(shí)施方式。上面的實(shí)施例在本質(zhì)上是示范性的，不用于限制本發(fā)明的范 圍，本發(fā)明的范圍只由權(quán)利要求確定。特別地，本發(fā)明只描述了水系統(tǒng)的情況，但是本發(fā)明 也可用于其它流體的分析。所有本說明書中提及的出版物、專利和專利申請均以整體被本說明書所引用。此 夕卜，本申請中對參考文件的引用或鑒定不得被解釋為承認(rèn)本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)。
權(quán)利要求
一種介質(zhì)組合物，該組合物包括約1.0-3.0％的NaCl/KCl、0.5-7.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、0.0-300mM的Mg/Ca、0.01-0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.02-1.0％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和0.1-3.5％的乙醇/甲醇/丙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的介質(zhì)組合物，其特征在于，包括約2.0-3. 0%的NaCl/KCl、 5. 0-7. 0 %的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、1. 0-200mM的Mg/Ca、0. 01-0. 05%的酵母提取 物/酸水解酪素、0. 02-0. 的牛血清白蛋白/卵白蛋白和1.0-3. 5%的乙醇/甲醇/丙 醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的介質(zhì)組合物，其特征在于，包括約2.0%的NaCl/KCl、5. 0% 的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、2. OmM的Mg/Ca、0. 05 %的酵母提取物/酸水解酪素、 0. 05%的牛血清白蛋白/卵白蛋白和1.5%的乙醇/甲醇/丙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的介質(zhì)組合物，其特征在于包括抗生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的介質(zhì)組合物，其特征在于被提供為液體。
6.一種細(xì)菌懸液，其特征在于包括權(quán)利要求1-3所述的介質(zhì)組合物和懸浮于所述介 質(zhì)組合物之中的細(xì)菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)菌懸液，其特征在于所述細(xì)菌包括發(fā)光細(xì)菌。
8.制備根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的細(xì)菌懸液的方法，該方法包括將具有細(xì)菌培養(yǎng)的纖維潤濕，以形成濕纖維；將濕纖維凍干，以形成塞子；和將塞子浸入介質(zhì)組合物中，以形成細(xì)菌懸液。
9.貯存細(xì)菌的方法，該方法包括(a)使細(xì)菌懸浮在權(quán)利要求1-3中任一項所述的介質(zhì)組合物中，以便形成細(xì)菌懸液；和(b)將所述細(xì)菌懸液貯存在用于維持細(xì)菌存活并防止細(xì)菌擴(kuò)張的條件下。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述步驟(a)包括將纖維上的凍干細(xì)菌 浸入所述介質(zhì)組合物中。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌包括發(fā)光細(xì)菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述維持細(xì)菌存活并防止細(xì)菌擴(kuò)張的條 件在2-8°C保持至少2周。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述介質(zhì)組合物包括至少一種抗生素。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述至少一種抗生素包括選自氯霉素 和氨芐青霉素的至少一種化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述至少一種抗生素的濃度約為15mg/L0
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述條件還包括維持所述發(fā)光細(xì)菌的 發(fā)光。
17.一種制品，包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的介質(zhì)組合物；和(b)用于將細(xì)菌懸浮在所述介質(zhì)組合物中以形成細(xì)菌懸液和將細(xì)菌貯存在_2 +8°C 的說明書。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種介質(zhì)組合物。該介質(zhì)組合物包括約1.0-3.0％的NaCl/KCl、0.5-7.0％的肌糖/乳糖/海藻糖/葡聚糖、0.0-300mM的Mg/Ca、0.01-0.05％的酵母提取物/酸水解酪素、0.02-1.0％的牛血清白蛋白/卵白蛋白和0.1-3.5％的乙醇/甲醇/丙醇。
文檔編號C12N1/00GK101874105SQ200880109373
公開日2010年10月27日 申請日期2008年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月25日
發(fā)明者尼日特·尤利特則爾 申請人:切克萊特有限公司