專利名稱：：結合間皮素的人抗體及其應用的制作方法結合間皮素的人抗體及其應用相關申請的交叉引用本申請要求2007年10月1日提交的美國臨時申請60/976，626、2007年11月30日提交的美國臨時申請60/991，692和2008年7月1日提交的美國臨時申請61/077，397在35USC.§119(e)下的權益；其公開內容通過引用而并入本文。
背景技術：
：間皮素(mesothelin)是存在于腹膜、胸膜和心包體腔間皮襯里(mesotheliallining)的細胞表面上的糖蛋白。其最初從人胰腺癌細胞系HPC-Y5純化得到并且顯示具有強化巨核細胞的能力，從而命名為巨核細胞強化因子(MPF)(Yamaguchi等(1994)J.Biol.Chem.269805-808)。間皮素cDNA克隆自HPC-Y5細胞系制備的文庫(Kojima等(1995)J.Biol.Chem.270=21984-21990)。cDNA也使用識別間皮瘤的單克隆抗體Kl進行克隆(Chang和Pastan(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:136-40)。結構上，間皮素作為60kDa前體多肽表達在細胞表面上，所述多肽通過蛋白水解而加工成3IkDa脫落組分(shedcomponent)(相應于MPF)禾口40kDa膜結合組分(membraneboundcomponent)(Hassan等(2004)Clin.Cancer.Res.10:3937_3942)。除表達在正常間皮細胞上之外，間皮素還過量表達在幾種人腫瘤中，包括所有間皮瘤、許多卵巢癌和胰腺癌以及一些胃癌、肺癌和子宮內膜癌。例如，間皮素表達于所有卵巢癌的約70%、乳頭狀漿液性腺癌的約82%、所有胰腺癌的約83%和所有胰腺導管腺癌的約86%。已經(jīng)制備了這樣的突變小鼠，其中間皮素基因通過同源重組而破壞(Bera，Τ.K.和Pastan,I.(2000)Mol.Cell.Biol.202902-2906)。沒有檢測到解剖學、血液學或生殖異常，這表明至少在那些小鼠中，間皮素功能對于生長或生殖不是必需的。間皮素特異性地與CA125(也稱為MUC-16)相互作用，所述CA125為存在于腫瘤細胞表面上的粘蛋白樣糖蛋白，先前已被鑒定為卵巢癌抗原。進一步，CA125對膜結合間皮素的結合介導異型細胞粘附并且CA125和間皮素共表達在晚期卵巢腺癌中(Rump，A.等(2004)J.Biol.Chem.279=9190-9198)0間皮素在腹膜襯里中的表達與卵巢癌轉移形成的優(yōu)選位點有關，而間皮素-CA125結合被認為促進卵巢腫瘤的腹膜轉移(Gubbels，J.Α.等(2006)Mol.Cancer550)。鑒于上述，感興趣的是調控間皮素活性的另外的試劑。概述本公開提供分離的單克隆抗體，具體而言，提供人單克隆抗體，其特異性結合間皮素并且具有期望的性質，如高親和性結合人間皮素、被表達間皮素的細胞內化、抑制間皮素結合CA125和/或介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。本發(fā)明抗體可以用于，例如，檢測間皮素或抑制表達間皮素的細胞，如表達間皮素的腫瘤細胞的生長。在一個方面，本發(fā)明涉及分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體結合人間皮素并且展示至少一種下列性質(a)以1XIO-8M或更小的Kd結合人間皮素；6(b)被表達間皮素的細胞內化；(c)抑制間皮素結合卵巢癌抗原CA125；(d)對表達間皮素的細胞顯示ADCC；和(e)當連接于細胞毒素時抑制體內表達間皮素的細胞的生長。優(yōu)選地，該抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的至少兩種。更優(yōu)選地，該抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的至少三種。更優(yōu)選地，該抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)的四種。甚至更優(yōu)選地，該抗體顯示所有五種性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該抗體以5X10_9M或更小的Kd結合間皮素。在又一個優(yōu)選的實施方案中，當該抗體綴合至細胞毒素時其抑制體內表達間皮素的腫瘤細胞的生長。在另一個方面中，本發(fā)明涉及分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中該抗體交叉競爭結合至人間皮素上的表位，該表位被參考抗體識別，所述參考抗體具有(a)重鏈可變區(qū)(Vh)，其包含SEQIDNO19的氨基酸序列，以及輕鏈可變區(qū)(Vl)，其包含SEQIDNO22的氨基酸序列；(b)包含SEQIDNO20的氨基酸序列的Vh和包含SEQIDNO23的氨基酸序列的VL;(c)包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的Vh和包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的V”上述參考抗體在下文分別被稱為參考抗體(a)、(b)和(C)。在優(yōu)選的實施方案中，參考抗體包含VH，其包含SEQIDNO:19的氨基酸序列，以及八，其包含SEQIDNO:22的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，參考抗體包含Vh，其包含SEQIDNO:20的氨基酸序列，以及Vl，其包含SEQIDNO:23的氨基酸序列。在又一個優(yōu)選的實施方案中，參考抗體包含VH，其包含SEQIDNO:21的氨基酸序列，以及\，其包含SEQIDNO24的氨基酸序列。在另一個方面中，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含Vh，所述Vh是人Vh3-33基因或AVh3-7基因的產(chǎn)物或源自人Vh3_33基因或AVh3_7基因，其中所述抗體特異性結合人間皮素。在另一個方面中，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含\，所述\是人VkL6基因或AVkA27基因的產(chǎn)物或源自人VkL6基因或人VkA27基因，其中所述抗體特異性結合人間皮素。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含(a)Vh，其是AVh3_33基因的產(chǎn)物或源自人Vh3_33基因，以及Vl，其是人VkL6基因的產(chǎn)物或源自人VkL6基因；或(b)Vh，其是AVh3-7基因的產(chǎn)物或源自人Vh3_7基因，以及\，其是人VkA27基因的產(chǎn)物或源自人VkA27基因；其中所述抗體特異性結合人間皮素。特別優(yōu)選的抗體或其抗原結合部分(“實施方案A”)包含(a)重鏈可變區(qū)CDRl，其包含SEQIDNO1；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO4；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包含SEQIDNO7；(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，其包含SEQIDNO10；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO13；以及(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含SEQIDN0:16。另一個特別優(yōu)選的抗體或其抗原結合部分(“實施方案B”)包含(a)重鏈可變區(qū)CDRl，其包含SEQIDNO2；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO5；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包含SEQIDNO8；(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，其包含SEQIDNO11；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:14，以及(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含SEQIDN0:17。另一個特別優(yōu)選的抗體或其抗原結合部分(“實施方案C”)包含(a)重鏈可變區(qū)CDRl，其包含SEQIDNO3；(b)重鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO6；(c)重鏈可變區(qū)CDR3，其包含SEQIDNO9；(d)輕鏈可變區(qū)CDRl，其包含SEQIDNO12；(e)輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含SEQIDNO:15；以及(f)輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含SEQIDN0:18。在另一個方面中，本發(fā)明涉及分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含(a)VH，其包含選自SEQIDNO19-21的氨基酸序列；以及(b)\，其包含選自SEQIDNO:22_24的氨基酸序列；其中所述抗體特異性結合人間皮素。優(yōu)選的組合包含(a)Vh,其包含SEQIDNO19的氨基酸序列；以及(b)Vl,其包含SEQIDNO22的氨基酸序列。另一個優(yōu)選的組合包含(a)VH，其包含SEQIDNO20的氨基酸序列；以及(WVl，其包含SEQIDNO23的氨基酸序列。另一個優(yōu)選的組合包含(a)VH，其包含SEQIDNO21的氨基酸序列；以及(WVl，其包含SEQIDNO24的氨基酸序列。本公開的抗體可以具有，例如，IgGl或IgG4同種型。備選地，它們可以是抗體片段，如Fab、Fab，或Fab，2片段，或者是單鏈抗體。本公開還提供連接到配偶體分子的免疫連接物，其包含本公開的抗體或其抗原結合部分。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供連接到化合物細胞毒素A的免疫連接物，其包含本公開的抗體或其抗原結合部分，所述化合物細胞毒素A在下文中鑒定以及論述于WO2008/083312——其公開內容通過引用并入本文。本發(fā)明提供下列優(yōu)選的免疫連接物，其包含連接到本發(fā)明抗體的細胞毒素A，其中所述抗體(i)與參考抗體(a)、(b)或(c)交叉競爭結合至人間皮素的表位；(ii)依照實施方案A;(iii)依照實施方案B；或(iv)依照實施方案C。某些此類抗體-配偶體分子連接物能夠被內化入表達間皮素的細胞并且能夠調節(jié)ADCC0在一個方面，這些抗體-配偶體分子連接物經(jīng)由化學接頭連接。在一些實施方案中，接頭是肽基接頭并且在本文中描述為(L4)p-F-(L1)1^其它接頭包括胼和二硫化物接頭并且在在本文中分別描述為(L4)p-H-⑴^或(L4)p-J-(L1)mt5除了附著到所述配偶體的接頭之外，本發(fā)明還提供可切割連接臂，其適于附著到基本上任何分子種類。本公開還提供雙特異性分子，其包含本公開的抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分連接到具有不同于所述抗體或其抗原結合部分的結合特異性的第二功能部分。還提供組合物，其包含本公開的抗體或其抗原結合部分或者免疫連接物或者雙特異性分子以及藥學上可接受的載體。本公開還包括編碼本公開的抗體或其抗原結合部分的核酸分子，以及包含這些核酸的表達載體和包含這些表達載體的宿主細胞。還提供使用包含這些表達載體的宿主細胞制備抗間皮素抗體的方法以及所述方法可以包括下列步驟(i)在宿主細胞中表達抗體和(ii)從宿主細胞中分離抗體。在又一個方面中，本發(fā)明涉及制備抗間皮素抗體的方法。所述方法包括(a)提供⑴Vh抗體序列，其包含選自SEQIDNO1-3的CDRl序列、選自SEQIDNO4-6的CDR2序列和/或選自SEQIDNO:7_9的CDR3序列；和/或抗體序列，其包含選自SEQIDNO10-12的CDRl序列、選自SEQIDNO13-15的CDR2序列和/或選自SEQIDNO16-18的CDR3序列；(b)改變Vh抗體序列和/或\抗體序列中至少一個氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種改變的抗體序列；以及(c)將改變的抗體序列表達為蛋白質。在另一個方面中，本發(fā)明涉及抑制表達間皮素的腫瘤細胞生長的方法，其包括使腫瘤細胞與本公開的抗體-配偶體分子連接物接觸，以便抑制腫瘤細胞生長。優(yōu)選地，表達間皮素的腫瘤細胞是間皮瘤細胞、胰腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、胃腫瘤細胞、肺腫瘤細胞或子宮內膜腫瘤細胞。在其它實施方案中，表達間皮素的腫瘤細胞來自選自下列的癌間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宮內膜樣粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食管腺癌、結腸直腸腺癌和乳腺癌。在另一個方面中，本發(fā)明涉及治療受試者癌癥的方法。所述方法包括給予受試者本公開的抗體_配偶體分子連接物，以便在受試者中治療癌癥。治療的特別優(yōu)選的癌癥是間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌和子宮內膜癌。在其它實施方案中，待被治療的癌癥選自間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宮內膜樣粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食管腺癌、結腸直腸腺癌和乳腺癌。附圖簡述圖IA顯示3C10人單克隆抗體Vh的核苷酸序列(SEQIDNO25)和氨基酸序列(SEQIDNO19)。描述了CDRl區(qū)(SEQIDNO1)、CDR2區(qū)(SEQIDNO4)和CDR3區(qū)(SEQIDNO7)。圖IB顯示3C10人單克隆抗體\的核苷酸序列(SEQIDNO28)和氨基酸序列(SEQIDNO22)。描述了CDRl區(qū)(SEQIDNO10)、CDR2區(qū)(SEQIDNO13)和CDR3區(qū)(SEQIDNO16)。圖2A顯示6A4人單克隆抗體Vh的核苷酸序列(SEQIDNO26)和氨基酸序列(SEQIDNO20)。描述了CDRl區(qū)(SEQIDNO:2)、CDR2區(qū)(SEQIDNO5)和CDR3區(qū)(SEQID9NO8)。圖2B顯示6A4人單克隆抗體\的核苷酸序列(SEQIDNO29)和氨基酸序列(SEQIDNO23)。描述了CDRl區(qū)(SEQIDNO11)、CDR2區(qū)(SEQIDNO14)和CDR3區(qū)(SEQIDNO17)。圖3A顯示7B1人單克隆抗體Vh的核苷酸序列(SEQIDNO27)和氨基酸序列(SEQIDNO21)。描述了CDRl區(qū)(SEQIDNO3)、CDR2區(qū)(SEQIDNO6)和CDR3區(qū)(SEQIDNO9)。圖3B顯示7B1人單克隆抗體\的核苷酸序列(SEQIDNO30)和氨基酸序列(SEQIDNO24)。描述了CDRl區(qū)(SEQIDNO12)、CDR2區(qū)(SEQIDNO15)和CDR3區(qū)(SEQIDNO18)。圖4顯示3C10(SEQIDNO19)和6A4(SEQIDNO20)的Vh氨基酸序列與人種系Vh3-33氨基酸序列(SEQIDNO31)的比對。圖5顯示3C10(SEQIDNO22)和6A4(SEQIDNO23)的Vl氨基酸序列與人種系VkL6氨基酸序列(SEQIDNO33)的比對。圖6顯示7B1的Vh氨基酸序列(SEQIDNO21)與人種系Vh3-7氨基酸序列(SEQIDNO32)的比對。圖7顯示7B1的Vl氨基酸序列(SEQIDNO24)與人種系VkA27氨基酸序列(SEQIDNO34)的比對。圖8顯示0VCAR3卵巢癌細胞粘附測定的結果。圖9A和9B顯示使用NCI-H226(肺間皮瘤)異種移植小鼠模型進行體內研究的結^ο圖IOA和IOB顯示使用HPAC(人胰腺癌)異種移植小鼠模型體內進行研究的結果。圖11是顯示在卵巢癌小鼠異種移植模型中本發(fā)明免疫連接物減小卵巢癌腫瘤體積的圖。圖12顯示本發(fā)明非巖藻糖基化的抗體對卵巢癌細胞(0VCAR3細胞，圖12a)和NSCLC細胞(H226細胞，圖12b)的ADCC0發(fā)明詳述本公開涉及分離的單克隆抗體，具體而言涉及人單克隆抗體，其結合人間皮素并且具有期望的性質。在某些實施方案中，本公開的抗體源自特定的重鏈和輕鏈種系序列和/或包含特定的結構特征，如含有特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本公開提供分離的抗體、制備這些抗體的方法、抗體_配偶體分子連接物和包含這些抗體的雙特異性分子以及含有這些抗體、抗體_配偶體分子連接物或雙特異性分子的藥物組合物。還提供變體或備選物，如同源抗體、具有保守修飾的抗體、改造和修飾的抗體、抗體片段和抗體模擬物，每個進一步描述在下文中。本公開還涉及使用抗體以例如檢測間皮素蛋白的方法，以及使用本發(fā)明的抗間皮素抗體抑制表達間皮素的細胞如腫瘤細胞生長的方法。因此，本公開還提供使用本公開的抗間皮素抗體治療各種類型癌癥的方法，所述癌癥例如，卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宮內膜癌和間皮瘤。優(yōu)選地，抗體、連接物、雙特異性分子、備選物或變體具有這些性質中的一種或更多種結合人間皮素、被表達間皮素的細胞內化、抑制間皮素結合CA125、介導針對表達間皮素的細胞的ADCC和抑制體內表達間皮素的腫瘤細胞的生長?？贵w可以是人的(優(yōu)選)、人源化的或嵌合的。按本公開可以被更容易理解的順序，首先定義某些術語。另外的定義在整個詳述中闡明。術語“間皮素”包括變體、同種型、同源物、直系同源物和旁系同源物。例如在某些情況下，對人間皮素蛋白特異性的抗體可以與來自非人物種的間皮素蛋白交叉反應。在其它實施方案中，抗體可以對人間皮素蛋白是完全特異的并且不顯示物種交叉反應性或其它類型的交叉反應性，或與來自某些其它物種但不是所有其它物種的間皮素交叉反應(例如，與靈長類間皮素交叉反應而不與小鼠間皮素交叉反應)。術語“人間皮素”指人序列間皮素，如具有Genbank登錄號NP_005814的人間皮素的全氨基酸序列。術語“小鼠間皮素”指小鼠序列間皮素，如具有Genbank登錄號NP_061345的小鼠間皮素的全氨基酸序列。間皮素的N端部分也被稱為巨核細胞強化因子(MPF)。人間皮素序列可以由于具有例如保守突變或在非保守區(qū)中的突變而不同于Genbank登錄號NP_005814的人間皮素，并且該間皮素具有與Genbank登錄號NP_005814的人間皮素基本上相同的生物功能，如結合CA125。具體的人間皮素序列在氨基酸序列上通常至少90%同一于Genbank登錄號NP_005814的人間皮素并且含有當與其它物種(例如，鼠)的間皮素氨基酸序列比較時將氨基酸序列鑒定為人源的氨基酸殘基。在某些情況下，人間皮素在氨基酸序列上可以至少95%或甚至至少96%、97%、98%或99%同一于Genbank登錄號NP_005814的間皮素。在某些實施方案中，人間皮素序列將顯示不超過10個氨基酸不同于Genbank登錄號NP_005814的間皮素序列。在某些實施方案中，人間皮素可以顯示不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個氨基酸不同于Genbank登錄號NP_005814的間皮素序列。同一性百分比可以如本文所述進行測定。術語“CA125”指卵巢癌抗原或卵巢癌腫瘤標志物，也稱為MUC-16。術語“人CA125”指人序列CA125，如具有Genbank登錄號NP_078966的人CA125的全氨基酸序列。人CA125序列可以由于具有例如保守突變或在非保守區(qū)中的突變而不同于Genbank登錄號NP_078966的人CA125。具體的人CA125序列在氨基酸序列上通常至少90%同一于Genbank登錄號NP_078966的人CA125并且含有當與其它物種(例如，鼠)的間皮素氨基酸序列比較時將氨基酸序列鑒定為人源的氨基酸殘基。在某些情況下，人CA125在氨基酸序列上可以至少95%，或甚至至少96%、97%、98%或99%同一于Genbank登錄號NP_078966的CA125。在某些實施方案中，人CA125序列顯示不超過10個氨基酸不同于Genbank登錄號NP_078966的CA125序列。在某些實施方案中，人CA125可以顯示不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個氨基酸不同于Genbank登錄號NP_078966的CA125序列。同一性百分比可以如本文所述進行測定。術語“免疫應答”是指例如，淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞、以及由上述細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子、以及補體)的作用，這些作用導致對侵入性病原體、被病原體感染的細胞或組織、癌細胞，或者，在自身免疫及病理炎癥情況下，正常的人類細胞或組織的選擇性損害、破壞或將它們從人體清除。“信號轉導途徑”是指在多種信號傳導分子之間的生物化學關系，這些分子在將信號從細胞的一部分傳遞到細胞的另一部分中發(fā)揮作用。短語“細胞表面受體”包括能夠接受信號并將這種信號傳遞穿過細胞的原生質膜的分子及分子的復合體?！凹毎砻媸荏w”的實例是人間皮素。術語“抗體”包括整個抗體及它們的任何抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或它們的單鏈?！翱贵w”指包括通過二硫鍵互相連接的至少兩條重鏈(H鏈)及兩條輕鏈(L鏈)的糖蛋白，或其抗原結合部分。每一條重鏈都包括重鏈可變區(qū)(在此縮寫為Vh)以及重鏈恒定區(qū)。該重鏈恒定區(qū)包括三個結構域，CH1、CH2以及CH3。每一條輕鏈都包括輕鏈可變區(qū)(在此縮寫為VJ及輕鏈恒定區(qū)。該輕鏈恒定區(qū)包括一個結構域，Q。V1^nt可以進一步被細分為多個高可變性區(qū)域，被稱為互補決定區(qū)(CDR)，其間散布有更為保守的被稱為構架區(qū)(FR)的多個區(qū)域。每個Vh以及\均由3個CDR及4個FR構成，按照以下順序從氨基端至羧基端排布FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結合域。這些抗體的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主的組織或因子的結合，這些宿主的組織或因子包括免疫系統(tǒng)的不同細胞(例如效應細胞)及經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)。在此所使用的術語“抗體片段”以及抗體的“抗原結合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保留特異性結合抗原(例如間皮素)的能力的抗體的一個或多個片段。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗體的抗原結合功能可以由全長抗體的片段來實現(xiàn)。術語抗體的“抗原結合部分”中所涵蓋的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由\、VH、Cl及Chi結構域構成的單價片段組成；(ii)F(ab')2片段，為包括在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個Fab片段的一個二價片段；(iii)Fab，片段，它實質上是帶有鉸鏈區(qū)部分的Fab(見，F(xiàn)UNDAMENTALIMMUNOLOGY(Pauled.，3rded.1993)；(iv)由Vh及ChI結構域構成的Fd片段；(ν)由抗體的一個單臂的\及Vh結構域構成的Fv片段；(vi)dAb片段(Wardetal.，(1989)Nature341544-546)，它由Vh結構域構成；(vii)分離的互補決定區(qū)(CDR)；以及(viii)納米抗體(nanobody)，含有一個單一可變結構域及兩個恒定結構域的重鏈可變區(qū)。此外，雖然Fv片段的兩個結構域，\與VH，是由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法由合成接頭將它們連接起來，該接頭使它們成為單一蛋白鏈，其中域配對形成單價分子(被稱為單鏈Fv(SCFV)；參見例如Birdetal.(1988)Science242:423_426；及Hustonetal.(1988)Science242:423_426；及Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。術語抗體的“抗原結合部分”也旨在涵蓋此類單鏈抗體。這些抗體片段可通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法獲得，并且對于這些片段進行的有用性的篩選與篩選完整抗體的方式相同?！胺蛛x的抗體”，指抗體，它基本上沒有具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，特異性結合間皮素的分離的抗體基本上沒有特異性結合其他抗原的抗體)。然而，特異性結合間皮素的分離的抗體對于其他抗原，例如來自其他物種的間皮素分子，可以具有交叉反應性。此外，分離的抗體可以基本上沒有其他細胞材料和/或化學物。術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指由單一分子組分的抗體分子形成的制劑。單克隆抗體組合物顯示了針對某一特定表位的單一結合特異性及親和力。術語“人抗體”意指包括具有可變區(qū)的抗體，在這些可變區(qū)中，構架區(qū)及CDR區(qū)均源自人類種系免疫蛋白序列。此外，如果該抗體包括恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也源自人類種系免疫球蛋白序列。本公開的人抗體可以包括不是由人類種系免疫球蛋白序列所編碼的氨基酸殘基(例如，在體外由隨機誘變或位點特異性誘變引入的突變或在體內由體細胞突變引入12的突變)。然而，術語“人抗體”并非意指包括以下抗體其中源自另一個哺乳動物物種(例如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人類構架區(qū)序列上。術語“人單克隆抗體”是指顯示出單一結合特異性的抗體，這些抗體具有多個可變區(qū)，其中構架和CDR區(qū)均源自人類種系免疫球蛋白序列。在一個實施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤包括由轉基因非人類的動物(例如轉基因小鼠)獲到的B細胞，所述動物具有包括融合至無限增殖化細胞的人類重鏈轉基因及輕鏈轉基因的基因組。此處使用的術語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人抗體，例如(a)從動物(例如小鼠)中分離的抗體，該動物對于人類免疫球蛋白基因是轉基因的或轉染色體的，或從由其制備出的雜交瘤分離的抗體(以下將進一步說明)；(b)從經(jīng)轉化以表達人抗體的宿主細胞(例如轉染瘤)中分離的抗體，(c)從重組的組合人抗體文庫中分離的抗體，以及(d)通過任何其他方法來制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體，這些方法包括將人類免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列。這種重組人抗體具有可變區(qū)，其中構架區(qū)及⑶R區(qū)均源自于人類種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施方案中，這種重組人抗體也可經(jīng)受體外誘變(或者，在使用對于人類Ig序列轉基因的動物時，經(jīng)受體內體細胞誘變)，并且接著，重組抗體的Vh和\區(qū)域的氨基酸序列為這樣的序列其盡管衍生于人類種系Vh和\序列并與其相關，但是并不天然存在于體內人抗體種系所有組成成分之中。術語“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體種類(例如IgM或IgGl)。短語“識別抗原的抗體”與“對抗原特異的抗體”此處可以與術語“特異性結合抗原的抗體”互換使用。術語“人抗體衍生物”是指人抗體的任何經(jīng)修飾的形式，例如，該抗體與另一種試劑或抗體的偶聯(lián)物。術語“人源化抗體”意指以下抗體，其中源自另一個哺乳動物物種(如小鼠)的種系的CDR序列被移植到人類構架序列上?？梢栽谌祟悩嫾苄蛄兄羞M行額外的構架區(qū)修飾。術語“嵌合抗體”意指以下抗體，其中可變區(qū)序列源自一個物種而恒定區(qū)序列源自另一個物種，例如一種抗體，其中可變區(qū)序列源自小鼠抗體而恒定區(qū)序列源自人抗體。術語“抗體模擬物”表示能夠模擬抗體的結合抗原的能力的分子，但是它們不局限于天然抗體結構。此類抗體模擬物的實例包括但不限于親和體(AfTibody)、經(jīng)設計的錨蛋白重復蛋白(DARPin)、抗運載蛋白(Anticalin)、Avimer、以及萬能抗體(Versabody)，所有這些在下文中進一步描述。術語“配偶體分子”指實體，它綴合至抗體-配偶體分子綴合物中的抗體上。配偶體分子的實例包括藥物、毒素、標記分子、蛋白質以及治療劑。如本文所用，“特異性結合人間皮素”的抗體意圖指這樣的抗體，其以IXICT7M或更小，更優(yōu)選5X10_8M或更小，更優(yōu)選3X10_8M或更小，更優(yōu)選1X10_8M或更小，甚至更優(yōu)選5X10_9M或更小的Kd結合人間皮素。此處使用的術語“基本上不結合”一種蛋白質或細胞是指不結合或不以高親和力結合蛋白質或細胞，即，以1XIO-6M或更大，更優(yōu)選為1XIO-5M或更大，更優(yōu)選為1X10_4M或更大，更優(yōu)選為1X10_3M或更大，甚至更優(yōu)選為1X10_2M或更大的Kd結合蛋白質或細胞。此處使用的術語"Kass。?！被颉癒a”旨在表示特定的抗體_抗原相互作用的結合速率，而此處使用的術語"Kdis”或“K/’旨在表示特定的抗體-抗原相互作用的解離速率。此處使13用的術語“KD”旨在表示解離常數(shù)，它是由之比(即Kd/Ka)得到，并被表示為摩爾濃度(M)?？贵w的Kd值可以使用本領域成熟的方法進行確定。確定抗體的Kd的一種優(yōu)選方法是通過使用表面等離振子共振，優(yōu)選使用諸如Biacore系統(tǒng)的生物傳感器系統(tǒng)。術語IgG抗體的“高親和性”指抗體對于靶抗原具有IXICT7M或更小、更優(yōu)選5XIO-8M或更小、甚至更優(yōu)選1XIO-8M或更小、甚至更優(yōu)選5X10_9或更小并且甚至更優(yōu)選IXICT9M或更小的KD。然而，“高親和性”結合對于其它抗體同種型可以不同。例如，IgM同種型的“高親和性”結合指抗體具有10_6M或更小、更優(yōu)選10_7M或更小、甚至更優(yōu)選10_8M或更小的Kd。術語“受試者”包括任何人類或非人類動物。術語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人靈長類動物、綿羊、犬、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動物、爬行動物等等。除非另作說明，術語“烷基”，就其本身或作為另一個取代基的部分，是指直鏈或支鏈的或環(huán)狀烴基、或它們的組合，它可以是完全飽和的、單不飽和的、或多不飽和的，并且能包括二價以及多價原子彈，具有所指定的碳原子數(shù)目(即C1-Cltl是指1至10個碳原子)。飽和烴基的實例包括但不限于以下基團，例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基、以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物或異構體、以及類似物。不飽和烷基基團是具有一個或多個雙鍵或三鍵的基團。不飽和烷基基團的實例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4_戊二烯基、3-(1，4_戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高級同系物以及異構體。除非另有說明，術語“烷基”還意在包括那些以下詳細說明的烷基衍生物，如“雜烷基”。限于烴基基團的烷基基團被稱為“同烷基”。術語“亞烷基”其本身或作為另一個取代基的部分是指衍生自烷烴的二價基團，例如但不局限于-CH2CH2CH2CH2-,并且進一步包括那些如下說明為“雜亞烷基”的基團。典型地，烷基(或亞烷基)基團將具有1到24個碳原子，其中具有10個或更少的碳原子的那些基團在本發(fā)明中是優(yōu)選的。“低級烷基”或“低級亞烷基”是較短鏈的烷基或亞烷基基團，一般具有八個或更少的碳原子。除非另作說明，術語“雜烷基”就其本身或與另一個術語組合，是指穩(wěn)定的直鏈或支鏈、或環(huán)狀烴基、或它們的組合，由所說明的數(shù)目的碳原子以及至少一個雜原子組成，該雜原子選自0、N、Si、以及S，并且其中氮、碳、以及硫原子會可任選地被氧化，并且氮雜原子會可任選地被季銨化。一個或多個雜原子0、N、S、及Si可位于雜烷基基團的任何內部位置，或可位于該烷基團附著于該分子的其余部分的位置。實例包括但不限于-CH2CH20CH3、-CH2CH2NHCH3^-CH2CH2N(CH3)2、-CH2SCH2CH3^-CH2CH2S(0)CH3、-CH2CH2S(O)2CH3^-CH=CHOCH3、-Si(CH3)3、-CH2CH=NOCH3和-CH=CHN(CH3)2。多達兩個雜原子可以是連續(xù)的，例如-CH2NHOCH3和-CH2OSi(CH3)3。類似地，術語“雜亞烷基”就其本身或作為另一個取代基的部分是指衍生自雜烷基的二價基，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-以及-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。對于雜亞烷基基團，雜原子也可占據(jù)鏈末端的任一端或兩端(例如，亞烷氧基、亞烷二氧基、亞烷基氨基、亞烷基二氨基、等等)。術語“雜烷基”與“雜亞烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(參見例如，ShearwaterPolymersCatalog,2001)此外，對于亞烷基以及雜亞烷基連接基團，書寫連接基團的分子式的方向并不表示連接基團的方向。例如，式-C(O)2R’-代表-C(O)2R'-以及-R’c(0)2-。與術語“烷基”或“雜烷基”組合使用的術語“低級”是指具有1到6個碳原子的部分術語“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺?；?、以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)都是以它們的常規(guī)意義使用，并分別指通過氧原子、氨基基團、SO2基團、或硫原子附著于該分子的其余部分的那些烷基基團。術語“芳香磺酰基”是指通過SO2基團附著于該分子其余部分的芳基基團，且術語“巰基”是指SH基團。—般而言，“酰基取代基”也選自以上所給出的組。在此使用的術語“?；〈敝父街隰驶疾M足其化合價的基團，該羰基碳直接或間接地附著于本發(fā)明的此合物的多環(huán)核上。除非另作說明，術語“環(huán)烷基”與“雜環(huán)烷基”，就它們本身或與其他術語組合，分別表示環(huán)型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“雜烷基”。另外，對于雜環(huán)烷基，雜原子可占據(jù)雜環(huán)附著于分子的其余部分的位置。環(huán)烷基的實例包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基、等等。雜環(huán)烷基的實例包括但不限于1_(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1_哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、等等。環(huán)結構的雜原子以及碳原子可任選地被氧化。除非另作說明，術語“鹵”或“鹵素”，就它們自身或作為另一個取代基的部分，是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，術語如“鹵烷基”是指包括單鹵烷基以及多鹵烷基。例如，術語“鹵(C1-C4)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2_三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙基、寸寸。除非另作說明，術語“芳基”是指取代或未取代的多不飽和的芳香烴取代基，它可以是單一的環(huán)或多環(huán)(優(yōu)選地從1至3個環(huán))，這些環(huán)稠合在一起或以共價鍵相連接。術語“雜芳基”指芳基基團(或環(huán))，這些芳基基團含有一至四個選自N、0、以及S的雜原子，其中氮、碳、以及硫原子可任選地被氧化，并且氮原子可任選地被季銨化的。雜芳基可以通過雜原子附著于該分子的其余部分。芳基以及雜芳基基團的非限制性實例包括苯基、ι-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、以及6-喹啉基。以上提到的每一個芳基以及雜芳基環(huán)狀體系的取代基選自以下說明的可接受的取代基的組?！胺蓟币约啊半s芳基”也包括環(huán)體系，其中一個或多個非芳香族環(huán)體系被稠合、或者以其他方式結合至芳基或雜芳基體系上。簡言之，術語“芳基”當與其他術語(如芳氧基、芳硫基、芳烷基)組合使用時，包括以上定義的芳基環(huán)以及雜芳基環(huán)。因此，術語“芳烷基”意在包括那些基團，其中芳基基團附著于烷基基團(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基、等等)；包括那些烷基基團，其中一個碳原子(例如，亞甲基基團)已被(例如)一個氧原子取代(如苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1_萘氧基)丙基、等等)。以上術語(如“烷基”、“雜烷基”、“芳基”、以及“雜芳基”)各自均包括指定基團的取代以及未取代的形式。以下提供每個類型基團的優(yōu)選取代基。烷基、以及雜烷基的取代基(包括那些經(jīng)常提到的如亞烷基、鏈烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基、以及雜環(huán)烯基)一般分別稱為“烷基取代基”以及“雜烷基取代基”，并且它們可以是一個或多個基團，這些基團選自但不限于-0R’、=0、=NR，、=NOR，、-NR，R”、-SR，、-鹵素、-SiR'R”R，”、-OC(=0)R，、_C(=0)R\-CO2R\-CONR'R”、-0C(=0)NR，R”、_NR”C(=0)R，、_NR，C(=0)NR”R，”、_NR”C(=0)2R，、-NRC(NR，R”R，”)=NR”“、-NRC(NR，R”)=NR，”、_S(0)R，、_S(0)2R，、_S(0)2NR，R”、-NRSO2R'、-CN和-NO2，數(shù)量在從0到(2m’+l)的范圍內，其中m’是這種基團的碳原子的總數(shù)。R’、R”、R’”以及R””各自均優(yōu)選地獨立地指氫、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基，例如取代有1至3個鹵素的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基團、或芳烷基基團。當本發(fā)明的化合物包括多于一個R基團時，例如，當這些基團中多于一個基團存在時，這些R基團各自均獨立地選為R’、R”、R’”以及R””基團。當R’和R”附著于相同的氮原子時，它們可與氮原子組合成5、6、或7元環(huán)。例如，-NR’R”旨在包括，但不局限于，1-吡咯烷基以及4-嗎啉基。從以上取代基的討論中，本領域中的技術人員會明白術語“烷基”旨在包括結合到非氫基團的基團上的碳原子的基團，例如鹵烷基(如-CF3和-CH2CF3)以及酰基(例如，-C(=0)CH3>-C(=0)CF3>-C(=0)CH2OCH3等)。類似于對烷基基團所說明的取代基，芳基取代基以及雜芳基取代基通常分別被稱為“芳基取代基”以及“雜芳基取代基”，并且是不同的并選自，例如鹵素、-OR’、=0、=NR，、=N-0R，、-NR，R”、-SR，、_鹵素、_SiR，R”R，”、-OC(=0)R，、_C(=0)R，、_C02R，、_C(=0)NR，R”、-0C(=0)NR，R”、-NR”C(=0)R，、_NR，C(=0)NR”R，”、_NR”C02R，、_NRC(NR，R”)=NR，”、-S(=0)R，、-S(=0)2R，、-S(=0)2NR，R”、-NRSO2R，、-CN和-N02、-R，、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基，并且其數(shù)目從0到芳香環(huán)狀體系上開放化合價的總數(shù)的范圍內；并且其中R’、R”、R’”以及R””優(yōu)選獨立地選自氫、(C1-C8)烷基以及雜烷基、未取代的芳基以及雜芳基、(未取代的芳基P(C1-C4)烷基、以及(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。當本發(fā)明的化合物包括多于一個R基團時，例如，當這些基團中多于一個基團存在時這些R基團各自均被獨立地選為R’、R”、R’，，以及R””基團。任選地，在該芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個芳基取代基可被具有式為-T-C(0)-(CRR，)「U-的取代基取代，其中，T和U獨立為-NR-、_0_、-CRR，-或單鍵；且q是從0到3的整數(shù)。備選地，在該芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可任選被具有式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中，A和B獨立地為-CRR，-、-0-、-NR-、-S-、-S(0)-,-S(0)2-、-S(O)2NR'-或單鍵；且r是從1到4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的單鍵之一可任選被雙鍵代替。備選地，在該芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子的取代基上的兩個取代基可任選地被具有式為"(CRR')S-X-(CR，，R，”)d-的取代基取代，其中s和d獨立地是從0至3的整數(shù)，并且X是-0-、-NR，-、-S-、-S(=0)-、-S(=0)2-或-S(=0)2NR，-。優(yōu)選地，取代基R、R’、R”以及R’，，獨立地選自氫或取代或未取代的(C1-C6)烷基。此處使用的術語“二磷酸酯”包括但不局限于包含兩個磷酸酯基團的磷酸的酯。術語“三磷酸酯”包括但不局限于包含三個磷酸酯基團的磷酸的酯。此處使用的術語“雜原子”包括氧(0)、氮(N)、硫(S)、以及硅(Si)。除非上下文另有說明，符號“R”是一個通用縮寫，它代表取代基，該取代基選自取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、以及取代或未取代的雜環(huán)基基團。在以下各分部中進一步詳細地說明了本發(fā)明的不同方面。具有特定功能性質的抗間皮素抗體本公開的抗體的特征在于特定的功能特征或性質。例如，它們特異性結合人間皮素，如在細胞表面上表達的人間皮素。優(yōu)選地，本公開的抗體以高親和性結合人間皮素，例如以1XIO-7M或更小的KD，更優(yōu)選以5X10_8M或更小的KD，甚至更優(yōu)選以1X10_8M或更小的Kd結合。本公開的抗間皮素抗體結合人間皮素并且優(yōu)選顯示下列性質中的一種或更多種(a)以1XIO-8M或更小的Kd結合人間皮素；(b)被表達間皮素的細胞內化；(c)抑制間皮素結合卵巢癌抗原CA125；(d)對表達間皮素的細胞顯示抗體依賴性細胞毒性(ADCC)；以及(e)當連接到細胞毒素時抑制體內表達間皮素的細胞生長。優(yōu)選地，本公開的抗體以5X10_8M或更小的Kd結合間皮素蛋白，以3X10_8M或更小的Kd結合間皮素蛋白，以IXICT8M或更小的Kd結合間皮素蛋白，以7XICT9M或更小的Kd結合間皮素蛋白，以6XICT9M或更小的Kd結合間皮素蛋白或以5XICT9M或更小的Kd結合間皮素蛋白?？贵w對間皮素的結合親和性可以通過例如，標準BIAC0RE分析進行評價。(參見例如，實施例3B)。本發(fā)明的優(yōu)選抗體是人單克隆抗體。另外或備選地，抗體可以是，例如，嵌合或人源化單克隆抗體。單克隆抗體3C10、6A4和7B1本公開的優(yōu)選抗體是人單克隆抗體3C10、6A4和7B1，如實施例1和2中所述分離和結構表征。3C10、6A4和7B1的Vh氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:19、20和21中。3C10、6A4和7B1的Vl氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:22、23和24中。在另一個方面中，本公開提供這樣的抗體其包含3C10、6A4或7B1的重鏈和輕鏈⑶R1、⑶R2和⑶R3，或其組合。3C10、6A4和7B1的VhCDRI的氨基酸序列分別顯示在SEQIDN0:l-3中。3C10、6A4和7B1的VHCDR2的氨基酸序列分別顯示在SEQIDN0:4_6中。3C10、6A4和7B1的VHCDR3的氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:7_9中。3C10、6A4和7B1的VlCDRI的氨基酸序列分別顯示在SEQIDNO:10_12中。3C10、6A4和7B1的VLCDR2的氨基酸序列顯示在SEQIDNO13-15中。3C10、6A4和7B1的VLCDR3的氨基酸序列分別顯示在SEQIDN0:16-18中。使用Kabat系統(tǒng)描繪CDR區(qū)(Kabat，Ε.A.，等(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,USDepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242，下文稱為“Kabat‘242，，)。如果這些抗體中每一種均可以結合人間皮素以及主要由⑶R1、⑶R2和⑶R3區(qū)提供抗原_結合特異性，則VfDRl、⑶R2和⑶R3序列以及VraKl、⑶R2和⑶R3序列可以“混合和配對”(即，盡管每種抗體必須含有VhCDRI、⑶R2和⑶R3以及VfDRl、⑶R2和⑶R3，來自不同抗體的CDR也可以混合和配對)，以產(chǎn)生本公開的其它抗間皮素結合分子。優(yōu)選地，當VhCDR序列被混合和配對時，特定Vh序列的⑶R1、⑶R2和/或⑶R3序列被結構上類似的⑶R序列(一個或多個)替代。同樣，當VfDR序列被混合和配對時，特定\序列的⑶R1、CDR2和/或CDR3序列優(yōu)選被結構上類似的CDR序列(一個或多個)替代。對本領域技術人員而言，容易顯而易見的是，新Vh和八序列可以這樣產(chǎn)生通過用與本文公開的單克隆抗體3C10、6A4和7B1的⑶R序列結構上類似的序列取代一個或更多個Vh和/或VfDR區(qū)序列。因此，在另一個方面中，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含(a)包含選自SEQIDNO:1_3的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶Rl；(b)包含選自SEQIDNO:4_6的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R2；(c)包含選自SEQIDNO:7_9的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)⑶R3；(d)包含選自SEQIDNO10-12的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶Rl；(e)包含選自SEQIDNO:13_15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R2；以及(f)包含選自SEQIDNO:16_18的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)⑶R3；其中所述抗體特異性結合人間皮素。在一個優(yōu)選的實施方案中，抗體依照實施方案A。在另一個優(yōu)選的實施方案中，抗體依照實施方案B。在又一個優(yōu)選的實施方案中，抗體依照實施方案C。在本領域中公知，⑶R3結構域，獨立于⑶Rl和/或⑶R2結構域，其單獨可以決定抗體對同源抗原的結合特異性，以及基于共同的CDR3序列可以預測可產(chǎn)生具有相同結合特異性的多個抗體。因此，本公開提供單克隆抗體，其包含源自人或非人動物的抗體的一個或更多個重鏈和/或輕鏈CDR3結構域，其中所述單克隆抗體能夠特異性結合人間皮素。在某些方面中，本公開提供單克隆抗體，其包含非人抗體如小鼠或大鼠抗體的一個或更多個重鏈和/或輕鏈CDR3結構域，其中所述單克隆抗體能夠特異性結合間皮素。在一些實施方案中，包含非人抗體的一個或更多個重鏈和/或輕鏈CDR3結構域的這類發(fā)明抗體(a)能夠與相應的親代非人抗體競爭結合；(b)保留相應的親代非人抗體的功能特征；(c)結合與相應的親代非人抗體相同的表位；和/或(d)具有類似于相應的親代非人抗體的結合親和性。在其它方面中，本公開提供單克隆抗體，其包含來自人抗體的一個或更多個重鏈和/或輕鏈CDR3結構域，所述人抗體諸如從非人動物獲得的人抗體，其中所述人抗體能夠特異性結合人間皮素。在其它方面中，本公開提供單克隆抗體，其包含第一人抗體一個或更多個重鏈和/或輕鏈CDR3結構域，所述第一人抗體諸如從非人動物獲得的人抗體，其中第一人抗體能夠特異性結合人間皮素以及其中第一人抗體的CDR3結構域替代缺乏間皮素結合特異性的人抗體中的CDR3結構域，以產(chǎn)生能夠特異性結合人間皮素的第二人抗體。在一些實施方案中，包含第一人抗體的一個或更多個重鏈和/或輕鏈⑶R3結構域的本發(fā)明抗體(a)能夠與相應的親代第一人抗體競爭結合；(b)保留相應的親代第一人抗體的功能特征；(c)結合與相應的親代第一人抗體相同的表位；和/或(d)具有類似于相應的親代第一人抗體的結合親和性。具有特定種系序列的抗體在某些實施方案中，本公開的抗體包含特定種系重鏈免疫球蛋白基因的Vh和/或特定種系輕鏈免疫球蛋白基因的\。例如，在優(yōu)選的實施方案中，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含是人Vh3-33基因或AVh3-7基因產(chǎn)物或源自人Vh3_33基因或人Vh3_7基因的Vh，其中所述抗體特異性結合人間皮素。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含是人VkL6基因或AVkA27基因產(chǎn)物或源自人VkL6基因或人VKA27基因的Vy其中所述抗體特異性結合人間皮素。在又一個優(yōu)選的實施方案中，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體包含是人Vh3-33基因產(chǎn)物或源自人\3-33基因的Vh并且包含是人VKL6基因產(chǎn)物或源自人VkL6基因的\，其中所述抗體特異性結合人間皮素。在又一個優(yōu)選的實施方案中，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體包含是人Vh3-7基因產(chǎn)物或源自人Vh3-7基因的Vh并且包含是人VkA27基因產(chǎn)物或源自人VkA27基因的\，其中所述抗體特異性結合人間皮素。這些抗體也可以具有一種或更多種上面詳細描述的功能特征，如高親和性結合人間皮素，被表達間皮素的細胞內化，抑制間皮素結合CA125，調節(jié)針對表達間皮素的細胞的ADCC的能力和/或當連接至細胞毒素時抑制體內表達間皮素的腫瘤細胞的腫瘤生長。分別具有Vh3-33和VkL6的Vh和\的抗體實例是3C10和6A4抗體。分別具有Vh3-7和VkA27的Vh和\的抗體實例是7B1抗體。如本文所用，人抗體包含重鏈或輕鏈可變區(qū)，所述重鏈或輕鏈可變區(qū)是特定種系序列的“產(chǎn)物”或“源自，，特定種系序列——如果抗體的可變區(qū)從使用人種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)獲得的話。這些系統(tǒng)包括用感興趣的抗原免疫攜帶人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠或用感興趣的抗原篩選在噬菌體上展示的人免疫球蛋白基因文庫。是人種系免疫球蛋白序列的“產(chǎn)物”或“源自”人種系免疫球蛋白序列的人抗體可以這樣鑒定比較人抗體氨基酸序列與人種系免疫球蛋白氨基酸序列并且選擇序列最接近(即，最大同一性％)人抗體序列的人種系免疫球蛋白序列。一種“產(chǎn)自”或“源自”特定的人類種系免疫球蛋白序列的人抗體，與該種系序列相比，可以含有氨基酸差異，因為例如，自然產(chǎn)生的體細胞突變或故意引入定點突變。然而，經(jīng)選擇的人抗體典型地與由人類種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90%的同一性，而且與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠類種系序列)進行比較時，含有將所述人抗體鑒定為人源的氨基酸殘基。在某些情況下，人抗體與該種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列在氨基酸序列上可以具有至少95%、或甚至至少96%、97%、98%、或99%的同一性。典型地，與由人類種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列相比，來自特定的人類種系序列的人抗體將展示不超過10個氨基酸差異。在某些情況下，與由該種系免疫球蛋白基因所編碼的氨基酸序列相比，所述人抗體可以展示不超過5個，或甚至不超過4個、3個、2個，或1個氨基酸差異。同源抗體在又一個實施方案中，本公開的抗體包括一些重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)，這些可變區(qū)含有與本文所述的優(yōu)選抗體的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中，該抗體保留本公開的抗_間皮素抗體的所希望的功能特性。例如，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含V1^PVy其中(a)Vh包含的氨基酸序列至少80%同源于選自SEQIDNO19-21的氨基酸序列；(b)Vl包含的氨基酸序列至少80%同源于選自SEQIDNO:22_24的氨基酸序列；以及(c)該抗體特異性結合人間皮素。在其它實施方案中，￥11和/或八氨基酸序列可以85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源于上述序列。具有Vh和Vl區(qū)——所述Vh和\區(qū)與上述序列Vh和\區(qū)具有高同源性(即，80%或更大)——的抗體可以這樣獲得通過編碼SEQIDNO:25-27或28-30的核酸分子的誘變(例如，定點誘變或PCR-介導的誘變)，接著使用本文描述的功能測定測試編碼的改變的抗體所保留的功能(即，上述功能)。兩個氨基酸序列之間的同源性百分比等同于兩個序列之間的同一性百分數(shù)。在這兩個序列之間的同一性百分數(shù)是這些序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即，％同源性=相同位置數(shù)/位置總數(shù)X100)，考慮到空位(gap)的數(shù)目，及每個空位的長度，它們需要被引入用于這兩條序列的最優(yōu)比對。正如在以下的非限制性實例中所述，使用數(shù)學算法可以完成兩條序列之間的序列比較以及同一性百分數(shù)的測定。使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，411-17(1988)的算法可以確定在兩條氨基酸序列之間的同一性百分數(shù)，該算法已經(jīng)結合至ALIGN程序(版本2.0)中，該算法使用了PAM120權重殘基表(weightresiduetable)、空位長度罰分(gaplengthpenalty)12以及空位罰分4。此外，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48444-453(1970))算法能確定在兩條氨基酸序列之間的同一性百分數(shù)，該算法已結合至GCG軟件包的GAP程序中(可在http//www.gcg.com獲得)，該算法使用了Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及空位權重16、14、12、10、8、6，或4以及長度權重1、2、3、4、5，或6。本公開的蛋白質序列可進一步用作“查詢序列”，對公共數(shù)據(jù)庫進行檢索，例如鑒定相關序列。這種檢索可采用Altschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215:403_10的XBLAST程序(版本2.0)來進行。通過XBLAST程序，記分=50，字長=3進行BLAST蛋白質檢索，以獲得與本公開的抗體分子同源的氨基酸序列。為獲得用于比較目的的空位比對，可利用如Altschuletal.((1997)NucleicAcidsRes.25(17):3389_3402所述的GappedBLAST。當利用BLAST及GappedBLAST程序時，可使用各自的程序(例如XBLAST與NBLAST)的默認參數(shù)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。具有保守修飾的抗體在某些實施方案中，本公開的抗體包含VH，其包含⑶R1、⑶R2和⑶R3序列，以及Vl,其包含⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列，其中這些⑶R序列中的一個或更多個包含基于已知抗間皮素抗體的指定氨基酸序列、或其保守修飾，以及其中所述抗體保留本公開的抗間皮素抗體的期望功能性質。在本領域中可以理解的是，可以進行某些保守序列修飾，其不去除抗原結合。因此，本公開提供分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含含有CDR1、CDR2和⑶R3序列的Vh和含有⑶Rl、⑶R2和⑶R3序列的\，其中(a)VHCDR3序列包含選自SEQIDNO7-9的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；(b)VfDR3序列包含選自SEQIDNO16-18的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；以及(c)所述抗體特異性結合人間皮素。在優(yōu)選的實施方案中，重鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQIDNO:4_6的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；以及輕鏈可變區(qū)⑶R2序列包含選自SEQIDN0:13-15的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，重鏈可變區(qū)CDRl序列包含選自SEQIDNO:1-3的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列；以及輕鏈可變區(qū)⑶Rl序列包含選自SEQIDNO10-12的氨基酸序列和其保守修飾的氨基酸序列。術語“保守性序列修飾”意指不會顯著影響或改變含有該氨基酸序列的抗體的結合特性的氨基酸修飾。這種保守性修飾包括氨基酸的置換、添加、以及缺失。通過本領域已知的標準技術(例如位點定向誘變及PCR介導的誘變)可將修飾引入本公開的抗體中。保守性氨基酸置換是指以下的置換，其中氨基酸殘基被具有相似側鏈的氨基酸殘基替換。已經(jīng)在本領域中定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側鏈的氨基酸(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支側鏈的氨基酸(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，以及具有芳香族側鏈的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本公開的抗體的CDR區(qū)中的一個或多個氨基酸殘基可以被來自相同側鏈家族的其他氨基酸殘基替代，并且使用此處說明的功能測定對已改變的抗體的保留功能進行測試與抗間皮素抗體結合相同表位的抗體在另一個實施方案中，本公開提供結合間皮素上由本公開的任何抗間皮素單克隆抗體識別的表位的抗體(即，具有與本公開的任何單克隆抗體交叉競爭結合人間皮素的能力的抗體)。在優(yōu)選的實施方案中，用于交叉競爭研究的參考抗體可以是單克隆抗體3C10(其具有分別在SEQIDNO:19和22中顯示的Vh和\序列)或單克隆抗體6A4(其具有分別在SEQIDNO20和23中顯示的Vh和\序列)或單克隆抗體7B1(其具有分別在SEQIDNO:21禾口24中顯示的Vh和Vl序列)。這些交叉競爭的抗體可以這樣鑒定基于在標準間皮素結合測定如ELISA或BIAcore分析中它們與3C10、6A4或7B1交叉競爭的能力。在優(yōu)選的實施方案中，結合人間皮素上由3C10、6A4或7B1識別的相同表位的抗體是人單克隆抗體。這些單克隆抗體可以如實施例中所述制備和分離。改造和修飾的抗體本發(fā)明的抗體進一步可以這樣制備使用具有一個或更多個已知抗間皮素抗體Vh和/或\序列的抗體作為起始材料，以改造與起始抗體相比具有改變性質的修飾抗體。在Vh和\之一或兩者內的、在一個或更多個CDR區(qū)內的和/或在一個或更多個構架區(qū)內的一個或更多個氨基酸可以修飾。因此或備選地，在恒定區(qū)(一個或多個)內的殘基可以被修飾來改變抗體的效應功能。在某些實施方案中，可以使用CDR移植以對抗體的可變區(qū)進行工程化?？贵w與靶抗原主要通過其CDR中的氨基酸殘基進行相互作用。因此，CDR中的氨基酸序列在各個抗體之間比在CDR之外的序列更具有多樣性。因為CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，所以通過構建表達載體，表達模擬特定自然發(fā)生的抗體特性的重組抗體是可能的，所述表達載體包括來自自然發(fā)生的抗體的CDR序列，其被移植至來自具有不同特性的不同抗體的構架序列(參見，例如Riechmann,L.etal.(1998)Nature332:323_327Jones,P.etal.(1986)Nature321522-525；Queen,C.etal(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.Α.8610029-10033；Winter的美國專利號5，225，539，以及Queen等人的美國專利號5，530，101；5，585，089；5，693，762及6，180，370)。因此，本公開的另一個實施方案涉及分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含含有CDRl、CDR2和CDR3序列的VH，所述CDRl、CDR2和CDR3序列分別包含選自SEQIDNO:1-3、SEQIDNO:4_6和SEQIDNO:7_9的氨基酸序列，以及含有CDRl、CDR2和CDR3序列的Vl，所述CDRl、⑶R2和⑶R3序列分別包含選自SEQIDN0:10_12、SEQIDN0:13_15禾口SEQIDNO:16-18的氨基酸序列。因而，這些抗體含有單克隆抗體3C10、6A4或7B1的Vh和VlCDR序列，也可以含有這些抗體的不同構架序列。這些構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫或出版的文獻獲得。例如，人Vdn八基因的種系DNA序列可以在下列中找到“VBaSe”人種系序列數(shù)據(jù)庫(以www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase在Internet上獲得)，以及Kabat'242；Tomlinson,I.M.，等(1992)J.Mol.Biol.227:776_798；和Cox,J.P.L.等(1994)Eur.J.Immunol.24827-836；其每一個通過引用并入本文。作為另一個實例，人Vh和八基因的種系DNA序列可以在Genbank數(shù)據(jù)庫中找到。例如，在HCo7HuMAb小鼠中發(fā)現(xiàn)的下列重鏈種系序列以所附的Genbank登錄號可以得到1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)、3-33(NG_0010109和NT_024637)和3_7(NG_0010109和NT_024637)。作為另一個實例，在HuMAb小鼠類型的HCol2小鼠中發(fā)現(xiàn)的下列重鏈種系序列以所附的Genbank登錄號可以得到1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)、5-51(NG_0010109和NT_024637)、4-34(NG_0010109和NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)以及(AJ406678)。人重鏈和輕鏈種系序列的又一個來源是可從IMGT(http://imgt.cines.fr)得到的人免疫球蛋白基因數(shù)據(jù)庫。用序列相似性檢索方法中的一種方法(被稱為GappedBLAST)將抗體蛋白序列與匯編的蛋白數(shù)據(jù)庫進行比較(Altschuletal.(1997)NucleicAcidsResearch25:3389-3402)，這種方法對于本領域的技術人員而言是熟知的。BLAST是一種啟發(fā)式算法，因為在抗體序列與數(shù)據(jù)庫序列之間的在統(tǒng)計學上顯著的比對可能包含比對字符的高得分片段對(HSP)。通過擴展或修正不能提高片段對分數(shù)的片段對被稱為命中項(hit)。簡言之，翻譯VBASE來源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php)，并且保留FRl至FR3構架區(qū)之間的區(qū)域(包括FRl至FR3構架區(qū))。這些數(shù)據(jù)庫序列具有的平均長度為98個殘基。除去重復序列(它們是蛋白質全部長度上的精確匹配)。用于蛋白質的BLAST搜索，使用帶有默認值的程序blastp、除低復雜性過濾(已被關閉)以外的標準參數(shù)，以及BL0SUM62的置換矩陣，針對實現(xiàn)序列相配的前5個命中項進行過濾。在全部六個框架中翻譯核苷酸序列，并且在數(shù)據(jù)庫序列的匹配片段中不具有終止密碼子的框架被視為潛在的命中項。進而使用BLAST程序tblastx對此進行確認。該程序翻譯了全部六個框架中的抗體序列，并且將這些翻譯與在全部六個框架中被動態(tài)翻譯的VBASE核苷酸序列進行比較?？梢匀缫陨险f明使用類似于VBASE的方法對其他人類種系序列數(shù)據(jù)庫(例如可從IMGT(http://imgt.cines.fr)獲得的數(shù)據(jù)庫)進行檢索。同一性是在抗體序列與蛋白質數(shù)據(jù)庫之間序列的全長上精確的氨基酸匹配。這些陽性項(同一性+取代匹配)不是相同的，而是由BL0SUM62置換矩陣所引導的氨基酸置換。如果抗體序列以相同的同一性匹配數(shù)據(jù)庫序列中的兩條序列，則具有最大陽性的命中項將被判定為匹配的序列命中項?？捎糜诒竟_的抗體的優(yōu)選的構架序列是與所選擇的本公開的抗體所用的構架序列在結構上類似的那些構架序列，例如類似于本公開的優(yōu)選的單克隆抗體所使用的以下構架序列:VH3-33(SEQIDNO:31)或Vh3-7(SEQIDNO:32)構架序列和/或￥￡L6(SEQIDNO33)或VkA27(SEQIDNO34)構架序列。這些VHCDR1、CDR2、禾口CDR3序列，以及VkcdeU⑶R2、和⑶R3序列可以被移植至多個構架區(qū)上，這些構架區(qū)具有與從中衍生出該構架序列的種系免疫球蛋白基因中所發(fā)現(xiàn)的序列相同的序列，或者這些⑶R序列可以被移植至多個構架區(qū)上，這些構架區(qū)與這些種系序列相比含有一個或多個突變。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下對構架區(qū)內的殘基進行突變以保持或增強抗原結合能力是有益的(參見例如Queen等人的美國專利號5，530，101；5，585，089；5，693，762以及6，180，370)。另一種類型的可變區(qū)修飾是在Vh和/或VKmKl、⑶R2和/或⑶R3區(qū)中對氨基酸殘基進行突變，由此改善目的抗體的一種或多種結合特性(例如親和力)?？梢赃M行定向誘變或PCR介導的誘變來引入一種或多種突變，并且對于抗體的結合能力、或其他目的功能特性的作用可以在體內或體外試驗中進行評估，如本文所述。優(yōu)選地引入保守性修飾。這些突變可以是氨基酸置換、添加、或缺失，但優(yōu)選是置換。此外，典型地在一個CDR區(qū)域中改變不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。因此，在另一個實施方案中，本公開提供分離的抗間皮素單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含(a)V_1區(qū)，其包含選自SEQIDNO1_3的氨基酸序列或與SEQIDNO1-3相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VHmK2區(qū)，其包含選自SEQIDNO4-6的氨基酸序列或與SEQIDNO:4_6相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VfDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO7-9的氨基酸序列或與SEQIDNO:7_9相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VmfflI區(qū)，其包含選自SEQIDNO:10_12的氨基酸序列或與SEQIDNO:10-12相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VLCDR2區(qū)，其包含選自SEQIDNO13-15的氨基酸序列或與SEQIDNO13-15相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列；以及(f)VlCDR3區(qū)，其包含選自SEQIDNO16-18的氨基酸序列或與SEQIDNO16-18相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。本發(fā)明的改造抗體包括這些抗體其中對Vh和/或\中構架殘基進行修飾，例如以改善抗體性質。通常進行這些構架修飾，以降低抗體的免疫原性。一種方法是將一個或更多個構架殘基“回復突變”成相應的種系序列。更具體而言，已經(jīng)經(jīng)歷體細胞突變的抗體可以含有不同于所述抗體從其來源的種系序列的構架殘基。這些殘基可以通過比較抗體構架序列與所述抗體從其來源的種系序列來鑒定。例如，表A顯示其中構架區(qū)氨基酸位置(使用Kabat編號系統(tǒng))不同于種系的區(qū)域以及該位置如何通過給出的取代而回復突變成種系_表A-示例性回復突變_區(qū)域丨構架I基酸位置I回復突變_3]3C10Vh3Y3Q3C10Vh27I27F3C10Vh82L82Q6A4Vh3H3Q6A4Vh23V23A6A4Vh27Ι27Γ6A4Vh30R30S6A4Vh93I93V7B1Vh3H3Q7B1Vh41Q41P7B1Vh_80_S80Y另一種類型的構架修飾涉及對構架區(qū)內一個或多個殘基，或甚至對一個或多個CDR區(qū)域內的一個或多個殘基進行突變，以去除T細胞表位，由此降低該抗體的潛在免疫原性。這一方法也被稱為“去免疫原化”，并且在Carr等人的US20030153043中有進一步的詳細說明。除了在構架區(qū)或CDR區(qū)域內進行的修飾之外，或作為其替代，還可以對本公開的抗體進行工程化，以在Fc區(qū)域內也包括一些修飾，典型地改變一種或多種功能特性，例如血清半衰期、補體固定(complementfixation)、Fc受體結合、和/或依賴抗原的細胞毒性作用。此外，本公開的抗體可以被化學修飾(例如，可以將一個或多個化學物部分附著至該抗體)，或被修飾以改變其糖基化作用，再次以便改變該抗體的一個或多個功能特性。以下對這些實施方案中的每一個均進行進一步詳細的說明。Fc區(qū)中殘基的編號是Kabat的EU索引編號。在一個實施方案中，CHl的鉸鏈區(qū)被修飾，以便改變(即，增加或減少)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基數(shù)，如Bodmer等的US5，677，425中所述。這些改變可以促進輕鏈和重鏈的裝配或增加或降低抗體穩(wěn)定性。在另一個實施方案中，對抗體的Fc鉸鏈區(qū)進行突變以減小該抗體的生物半衰期。更確切地說，將一個或多個氨基酸突變引入Fc鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區(qū)域，使得相對于天然Fc鉸鏈域的葡萄球菌A蛋白(StaphylococciproteinA,SpA)的結合而言，該抗體減弱了SpA的結合。Ward等人的US6，165，745更詳細地說明了這一方法。在另一個實施方案中，對該抗體進行修飾以增大其生物半衰期。例如，如Ward的US6,277，375所述，引入以下突變中的一個或多個突變T252L、T254S、T256F。備選地，該抗體可以在CHl或CL區(qū)域中發(fā)生變化以包括從IgG的Fc區(qū)域的CH2結構域的兩個環(huán)處獲得的補救受體(salvagerec印tor)結合表位，如Presta等人的US5,869，046及6，121，022中所述。在又一其它實施方案中，F(xiàn)c區(qū)通過用不同的氨基酸殘基置換至少一種氨基酸殘基來改變，以改變其(一種或多種)效應功能。例如，氨基酸殘基234、235、236、237、297、318,320和322中的一個或更多個可以用不同的氨基酸殘基置換，以便抗體對于效應子配體——例如，F(xiàn)c受體或補體的Cl組分——具有改變的親和性但保留親代抗體的抗原結合能力，如在Winter等的US5，624，821和5，648，260中所述在另一個實例中，氨基酸殘基329、331和322中的一個或更多個可以被置換，以便抗體具有改變的Clq結合和/或降低或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)，如在Idusogie等的US6，194,551中所述。在另一個實例中，氨基酸位置231和239中的一個或更多個氨基酸殘基被改變，從而改變抗體固定補體的能力。該方法進一步描述在Bodmer等的WO94/29351中。在另一個實例中，為了提高該抗體介導抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)的能力和/或提高該抗體對Fcγ受體的親和性，通過在下列位置修飾一個或多個氨基酸，對Fc區(qū)域進行了修飾:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的WO00/42072中進一步詳細地說明了這一方法。此外，在人類IgGl上已做出針對FcγRI、FcyRII,FcyRIII及FcRn的結合位點的圖譜，并說明了具有改善的結合的變體(參見Shields，R.L.etal.(2001)J.Biol.Chem.2766591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339具有的特定突變顯示出改善對FcγRIII的結合。另外，下列組合突變體顯示出改善FcYRIII的結合T256A/S298A，S298A/E333A,S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。在再一個實施方案中，如PCT/US2008/073569(其全文并入本文作為參考)所說明，通過引入半胱氨酸殘基來修飾本發(fā)明的抗體的C末端。此類修飾包括但不限于在全長重鏈序列的C端處或在其附近替換現(xiàn)有的氨基酸殘基，以及將包含半胱氨酸的延長序列(extension)引入至全長重鏈序列的C端。在優(yōu)選的實施方案中，包含半胱氨酸的延長序列包括序列半胱氨酸_丙氨酸_丙氨酸(從N端至C端)。在優(yōu)選的實施方案中，此類C末端的半胱氨酸修飾的存在為配偶體分子的綴合提供了位點，該配偶體分子為例如治療劑或標記物分子。特別是，由于C末端半胱氨酸修飾，反應性硫羥基的存在可以被用于利用二硫化物接頭或硫氫基_反應性馬來酰亞胺基團來連接配偶體分子?？贵w與配偶體分子以這一方式的綴合使得可以增強對所附著的特異的位點的控制。此外，通過在C末端或在其附近引入該附著點，優(yōu)化了綴合，使得它減少或者消除對該抗體的功能特性的干擾，并且使得綴合物制備物的簡化分析以及質量控制成為可能。在又一實施方案中，抗體的糖基化通過消除糖基化(去糖基化)或改變糖基化的位點(一個或多個)來修飾，以增加其對其抗原的親和性。例如，可以進行導致一個或更多個可變區(qū)構架糖基化位點消除的一個或更多個氨基酸取代。這些去糖基化可以增加抗體對抗原的親和性。參見Co等的US5，714，350和6，350，861。改變糖基化的另外的方法描述在Hanai等的US7,214，775；Presta的US6，737，056；Presta的US20070020260；Dickey等的WO2007/084926；Zhu等的WO2006/089294；以及Ravetch等的W02007/055916中；其中每一個通過引用全部并入。另外地或備選地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，如低巖藻糖基化的抗體，其具有減少量的巖藻糖基殘基，或具有增加的二等分GlcNac結構的抗體。這些改變的糖基化模式已經(jīng)被證實增加抗體的ADCC能力。這些糖類修飾可以通過例如，在具有糖基化改變機制的宿主細胞中表達抗體來完成。例如，細胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏巖藻糖基轉移酶基因，F(xiàn)UT8(a(1,6)巖藻糖基轉移酶)，使得在這些細胞系中表達的抗體在它們的糖類上缺乏巖藻糖。參見Yamane等的US2004/0110704和Yamane-Ohnuki等(2004)BiotechnolBioeng87:614_22。作為另一個實例，Hanai等的EP1，176，195描述了具有功能上被破壞的FUT8基因的細胞系，該FUT8基因編碼巖藻糖基轉移酶，使得在這種細胞系中表達的抗體顯示出低巖藻糖基化。Hanai等還描述了這樣的細胞系，其具有將巖藻糖添加到結合至抗體Fc區(qū)的N-乙酰葡糖胺的低酶活性。Presta的W003/035835描述了變體CHO細胞系——Lecl3細胞，其將巖藻糖連接到Asn(297)-連接的糖類的能力降低，這也導致低巖藻糖基化(也參見Shields,R.L.等·(2002)J.Biol.Chem.277:26733_26740)。Umana等的W099/54342描述了這樣的細胞系，其被改造來表達修飾糖蛋白的糖基轉移酶，使得這些細胞系表達的抗體顯示出抗體的二等分GlcNac結構增加以及ADCC活性增加(也參見Umana等(1999)Nat.Biotech.17176-180)。備選地，抗體的巖藻糖殘基可以使用巖藻糖苷酶切割掉(Tarentino,A.L.等(1975)Biochem.14:5516_23)。另外地或備選地，可以制備具有改變類型的糖基化的抗體，其中所述改變涉及抗體的唾液酸化水平。這些改變描述在Dickey等的W02007/084926和Ravetch等的WO2007/055916中，兩者通過引用而并入。例如，可以利用采用唾液酸酶的酶反應，如US5，831，077中所述，其通過引用而并入本文。適合的酶的其它實例是神經(jīng)氨酸酶和N-糖苷酶F，如Schloemer等，J.Virology,15(4)，882-893(1975)和Leibiger等，BiochemJ.，338，529-538(1999)中分別所述。備選地，可以采用如通過使用唾液酸轉移酶來增加唾液酸化水平的方法，如Basset等，ScandinavianJournalofImmunology,51(3),307-311(2000)中所述。本發(fā)明考慮的本文抗體的另一種修飾是聚乙二醇化。抗體可以聚乙二醇化，以便，例如增加其生物(例如，血清)半衰期。為使抗體聚乙二醇化，抗體或其片段通常與聚乙二醇(PEG)衍生物，如PEG的反應性酯或醛衍生物反應?；蛘撸垡叶蓟ㄟ^與反應性PEG分子(或類似的反應性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻獊韺嵤?。如本文所用，術語“聚乙二醇”包括已經(jīng)用于衍生化其它蛋白質的PEG的任何形式，如單(Cl-ClO)烷氧基_或芳氧基_聚乙二醇或者聚乙二醇_馬來酰亞胺。待聚乙二醇化的抗體可以是去糖基化的抗體。使蛋白質聚乙二醇化的方法在本領域中是已知的并且可以應用于本發(fā)明抗體。參見例如，Nishimura等的EPO154316和Ishikawa等的EPO401384?？贵w片段和抗體模擬物本發(fā)明不限于常規(guī)的抗體，并可通過抗體片段以及抗體模擬物的使用得以實施。多種抗體片段以及抗體模擬物技術現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)出來并且已在本領域廣為人知。結構域抗體(dAb)是抗體的最小功能結合單位，對應于人抗體的重鏈(Vh)或輕鏈(Vl)的可變區(qū)。結構域抗體的分子量大約為13kDa。Domantis已經(jīng)開發(fā)了一系列全部人類Vh與\dAb的大而高功能性文庫(每一文庫中有超過一百億個不同的序列)，并使用這些文庫來選擇對治療靶標特異的dAb。與許多常規(guī)的抗體相比，結構域抗體在細菌、酵母、以及哺乳動物的細胞體系中的表達良好。結構域抗體及其生產(chǎn)方法的進一步細節(jié)可通過參見以下文獻而獲得:US6，291，158；6，582，915；6，593，081；6，172，197；以及6，696，245；US2004/0110941；EP1433846、0368684和0616640;W02005/035572、2004/101790、2004/081026,2004/058821,2004/003019和2003/002609，其中每一項的全文完整并入本文作為參考。納米抗體(Nanobody)是源自抗體的治療性蛋白質，它包含天然發(fā)生的重鏈抗體的獨特結構及功能特性。這些重鏈抗體包含一個單一可變區(qū)(VHH)和兩個恒定區(qū)(CH2與CH3)。重要的是，經(jīng)克隆并分離的VHH結構域是攜帶原始重鏈抗體的全部抗原結合能力的完全穩(wěn)定的多肽。納米抗體與人抗體的Vh結構域有高同源性，并且可以進一步被人源化而不會損失任何活性。重要的是，納米抗體具有低免疫原性的潛力，這在使用納米抗體先導化合物的靈長類動物研究中已得到證實。納米抗體結合了常規(guī)抗體的優(yōu)點以及小分子藥物的重要特征。與常規(guī)抗體一樣，納米抗體顯示出高靶標特異性，對它們的靶標的高親和力以及低固有毒性。然而，像小分子藥物一樣，它們能夠抑制酶類并且容易接近受體裂縫(receptorcleft)。此外，納米抗體非常穩(wěn)定，可以通過注射之外的方法進行給藥(例如，參見WO2004/041867，其全文并入本文作為參考)，并且易于制造。納米抗體的其他優(yōu)點包括由于其尺寸小而識別不常見的或隱藏的表位；由于其獨特的三維的、藥物形式的靈活性而以高親和力及選擇性結合進入蛋白靶標的空腔或活性位點；對半衰期的定制，以及容易并且快速的發(fā)現(xiàn)藥物。納米抗體由單一基因編碼，并在幾乎全部的原核宿主和真核宿主中被有效生產(chǎn)，這些宿主例如大腸桿菌(E.coli)(參見，如，US6，765，087，其全文并入本文作為參考)、霉菌(例如曲霉屬或木霉屬)、以及酵母(例如酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、或畢赤酵母屬)(參見，如，US6,838，254，其全文并入本文作為參考)。納米克隆方法(見，例如WO06/079372，其全文并入本文作為參考)是一種用于產(chǎn)生針對所希望的靶標的納米抗體的專有方法，它基于B細胞的自動高通量選擇，并且能夠在本發(fā)明的情況中使用。迷你抗體(UniBodies)是另一種抗體片段技術，然而其基于去除IgG4抗體鉸鏈區(qū)。缺失鉸鏈區(qū)產(chǎn)生基本上是傳統(tǒng)IgG4抗體大小一半的分子并且具有單價結合區(qū)，而不是IgG4抗體的二價結合區(qū)。像IgG4抗體一樣，迷你抗體是惰性的并且不與免疫系統(tǒng)相互作用，這對于不期望免疫反應的疾病治療可以是有利的。迷你抗體可以起抑制或沉默但不殺死它們所結合的細胞的功能。另外，結合到癌細胞的迷你抗體不刺激癌細胞增殖。而且，由于迷你抗體幾乎都較小，所以它們以潛在的有利功效在較大的實體腫瘤上顯示較好的分布。迷你抗體以類似于完整IgG4抗體的速度從體內清除并且能夠對其抗原以類似的親和性結合。迷你抗體的進一步詳述可以通過參考WO2007/059782而獲得，其通過引用而全部并入。親和抗體(Affibody)分子是基于58個氨基酸殘基蛋白結構域的親和蛋白，所述結構域源自葡萄球菌A蛋白的三螺旋束IgG-結合結構域。該結構域已經(jīng)被用作構建組合噬菌粒文庫的支架，使用噬菌體展示技術可以從所述文庫選擇靶向期望分子的親和抗體變體(Nordφ,NatBiotechnol1997；15772~7；Ronmarketal.，EurJBiochem2002；2692647-55)。親和抗體分子簡單穩(wěn)健的結構和低的分子量(6kDa)使得它們適用于多種應用，例如，用作受體相互作用的檢測試劑和抑制劑。有關親和抗體及其生產(chǎn)的進一步描述發(fā)現(xiàn)在US5，831，012中，其通過引用全部并入本文。標記的親和抗體也可以用于成像應用中，以測定同種型的豐度。DARPin(設計的錨蛋白重復蛋白)體現(xiàn)了DRP(設計的重復蛋白)抗體模擬技術，其被發(fā)展來開發(fā)非抗體多肽的結合能力。重復蛋白如錨蛋白和富含亮氨酸的重復蛋白是普遍存在的結合分子，不像抗體一樣，所述結合分子出現(xiàn)在細胞內和細胞外。它們的獨特模塊式結構特征在于重復結構單元(重復)，其堆疊在一起形成顯示可變的和模塊式靶結合表面的細長重復結構域。基于這種模塊性，可以產(chǎn)生具有高度多樣化結合特異性的多肽組合文庫。該策略包括展示可變表面殘基的可自相容重復的共有區(qū)設計和它們隨機裝配入重復結構域。DARPin可以以非常高的收率產(chǎn)生于細菌表達系統(tǒng)中并且是已知最穩(wěn)定的蛋白質之一。已經(jīng)制成高度特異性、高親和性DARPin——其結合眾多種目標蛋白，包括人受體、細胞因子、激酶、人蛋白酶、病毒和膜蛋白，包括具有個位數(shù)納摩爾濃度至兆摩爾濃度范圍的親和性的一些DARPin。DARPin已經(jīng)被用于多種應用中，包括ELISA、夾心ELISA、流式細胞分析(FACS)、免疫組織化學(IHC)、芯片應用、親和純化或蛋白質印跡法。DARPin不僅理想地阻斷蛋白-蛋白相互作用，而且理想地抑制酶。在腫瘤上非?？焖俸吞禺愋愿患约胺浅Ｓ欣哪[瘤/血液比使得DARPin非常適于體內診斷或治療方法。有關DARPin及其它DRP技術的另外的信息可以發(fā)現(xiàn)在US2004/0132028和WO02/20565中，兩者通過引用而并入。Anticalin是另一種抗體模擬技術，然而在這種情況下，結合的特異性源自脂籠蛋白，脂籠蛋白是一個低分子量蛋白家族，在人體組織及體液中天然地大量表達。脂籠蛋白已經(jīng)得到進化，在體內進行與生理運輸及化學敏感的或不溶性化合物的存儲有關的多種功能。脂籠蛋白具有堅固的內部結構，包括在該蛋白的一端支持四個環(huán)的高度保守的桶。這些環(huán)形成了結合口袋的入口，并且在分子這一部分中的構象差異解釋了在各個脂籠蛋白之間的結合特異性的不同。盡管由保守的片層構架支持的超變環(huán)的整體結構讓人聯(lián)想起免疫球蛋白，但脂籠蛋白與抗體在大小上差異顯著，它由160至180個氨基酸的單個多肽鏈構成，該單個多肽鏈略大于單個免疫球蛋白結構域。對脂籠蛋白進行克隆，并對它們的環(huán)工程化以便產(chǎn)生抗運載蛋白。已經(jīng)生成了在結構上多樣的抗運載蛋白的文庫，并且抗運載蛋白的展示允許對結合功能進行選擇和篩選，隨后通過在原核或真核體系中表達并產(chǎn)生可溶性蛋白而進一步分析。研究已經(jīng)成功地證明了可以開發(fā)出對幾乎任何人類靶蛋白特異的抗運載蛋白，可以將它們分離出來，并且可以獲得在納摩爾或更高范圍內的結合親和力?？惯\載蛋白還可以被編排成雙靶向性蛋白(Duocalin)。使用標準的生產(chǎn)方法，Duocalin在易于生產(chǎn)的單體蛋白中結合兩種單獨的治療性靶標，同時保持靶標特異性和親和力，無論它的兩個結合結構域的結構取向如何。通過單個分子調節(jié)多個靶標在已知涉及一種以上發(fā)病因子的疾病中是特別有優(yōu)勢的。此外，二價或多價結合形式(例如Duocalin)通過細胞表面受體的結合及聚簇在靶定疾病中的細胞表面分子、介導信號轉導通路上的激動效應或誘導增強的內化效應具有顯著的潛力。此外，Duocalin的高固有穩(wěn)定性與單體抗運載蛋白是相當?shù)摹Ｓ嘘PAnticalin的其他信息可以在US7，250，297和WO99/16873中找到，它們的全文均并入本文作為參考。在本公開的上下文中有用的另一種抗體模擬技術是Avimer。Avimer是通過體外外顯子改組及噬菌體展示從人類細胞外受體結構域的大家族中演化而來，產(chǎn)生具有結合及抑制特性的多結構域蛋白。已顯示連接多種獨立的結合結構域產(chǎn)生親合力，并且與常規(guī)的單一表位結合蛋白相比，該結合結構域產(chǎn)生了經(jīng)改善的親和力及特異性。其他潛在的優(yōu)點包括在大腸桿菌中簡單并有效地產(chǎn)生多靶標特異性的分子，經(jīng)改善的熱穩(wěn)定性以及對蛋白酶的抵抗力。已經(jīng)得到了針對多種靶標的具有亞納摩爾親和力的Avimer。關于Avimer的其他信息可在US2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，其全部內容均并入本文作為參考Versabody是另一種可用于本公開上下文的抗體模擬技術。Versabody是具有大于15%的半胱氨酸的小分子蛋白質(3至5kDa)，它形成高二硫化物密度支架，替換典型蛋白具有的疏水核。這種替換使得蛋白質更小，更親水(聚集及非特異性結合更小)，對于蛋白酶及熱具有更大的抵抗力，并且具有較低密度的T細胞表位，因為對MHC呈遞的貢獻最多的殘基是疏水性的。這些特性中的全部四種都公知會影響免疫原性，并且預期它們一起會大幅度降低免疫原性。鑒于Versabody的結構，這些抗體模擬物提供了多樣的形式，包括多價、多特異性、多樣化的半衰期機制、組織靶定模塊及抗體Fc區(qū)域的缺失。此外，可以在大腸桿菌中以高產(chǎn)率生產(chǎn)Versabody，并且由于它們的親水性和尺寸小，Versabody高度可溶，而且能夠被配制成高濃度。Versabody具有特別的熱穩(wěn)定性，并且具有延長的保質期。有關Versabody的另外的信息發(fā)現(xiàn)在US2007/0191272中，其通過引用全部并入本文?？贵w片段和模擬技術的上述描述意圖不是包括全部。多種另外的技術可以用于本發(fā)明中，包括基于選擇性多肽的技術，如在Qui等，NatureBiotechnology,25(8)921-929(2007)中所綜述的互補決定區(qū)融合，以及基于核酸的技術，如RNA適體技術，其描述在US5，789，157；5，864，026；5，712，375；5，763，566；6，013，443；6，376，474；6，613，526；6,114，120；6,261，774；禾口6，387，620中；所有這些通過引用并入本文。抗體物理性質本公開抗體可以由其各種物理性質表征，以檢測和/或區(qū)別其不同的種類。本公開抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)中包含一個或更多個糖基化位點。由于改變的抗原結合，這些糖基化位點可導致抗體免疫原性增加或抗體PK改變(Marshall等(1972)AnnuRevBiochem41:673_702；Gala和Morrison(2004)JImmunol1725489-94；Wallick等(1988)JExpMedl681099-109；Spiro(2002)Glycobiology12:43R_56R；Parekh等(1985)Nature316:452_7;Mimura等(2000)MolImmunol37:697-706)。糖基化已知發(fā)生在包含N-X-S/T序列的基序處。在一些情況下，優(yōu)選具有不包含可變區(qū)糖基化的抗間皮素抗體。這可以通過選擇可變區(qū)不包含糖基化基序的抗體或使糖基化區(qū)中的殘基突變來實現(xiàn)。在優(yōu)選的實施方案中，本公開抗體不包含天冬酰胺異構位點。天冬酰胺脫酰胺可以發(fā)生在N-G或D-G序列上并且導致異天冬氨酸殘基產(chǎn)生，所述異天冬氨酸殘基將扭結位點引入到多肽鏈中并且降低其穩(wěn)定性(異天冬氨酸效應)。每種抗體具有獨特的等電點(pl)，其一般落入6和9.5之間的pH范圍內。IgGl抗體的Pl通常落入7-9.5的pH范圍內以及IgG4抗體的pi通常落入6-8的pH范圍內。推測具有正常范圍外Pl的抗體在體內條件下可能具有一些去折疊和不穩(wěn)定性。因此，優(yōu)選包含落在正常范圍內的Pl值的抗間皮素抗體。這可以通過選擇具有正常范圍內Pl的抗體或使帶電的表面殘基突變來實現(xiàn)。每種抗體將具有特征熔解溫度，其中熔解溫度越高表明體內整體穩(wěn)定性越高(KrishnamurthyR禾口ManningMC(2002)CurrPharmBiotechnol3:361_71)。一般，優(yōu)選Tmi(最初去折疊溫度)高于60°C，優(yōu)選高于65°C，甚至更優(yōu)選高于70°C?？贵w的熔點可以使用差示掃描量熱法(Chen等(2003)PharmRes201952-60；Ghirlando等(1999)ImmunolLett6847-52)或圓二色性(Murray等(2002)J.ChromatogrSci40:343_9)來測量。在優(yōu)選的實施方案中，選擇不快速降解的抗體?？贵w的降解可以使用毛細管電泳(CE)和MALDI-MS(AlexanderAJandHughesDE(1995)AnalChem67:3626_32)來測量。在另一個優(yōu)選的實施方案中，選擇具有最小聚集效應的抗體，所述聚集效應可以導致引發(fā)不必要的免疫反應和/或改變的或不利的藥物代謝動力學性質。一般地，這樣的抗體是可接受的，其具有的聚集為25%或更小、優(yōu)選20%或更小、甚至更優(yōu)選15%或更小、甚至更優(yōu)選10%或更小以及甚至更優(yōu)選5%或更小。聚集可以通過幾種技術來測量，包括大小排阻柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)和光散射。改造抗體的方法如上所論述，具有已知Vh和八序列的抗間皮素抗體可以用于產(chǎn)生新的抗間皮素抗體，其通過修飾它們或連接到它們的恒定區(qū)(一個或多個)進行。因此，在本公開的另一個方面中，已知的抗間皮素抗體例如，3C10、6A4或7B1的結構特征被用于產(chǎn)生結構上相關的抗間皮素抗體，其保留本公開抗體的至少一種功能性質，如結合人間皮素。例如，已知的抗間皮素抗體或其突變的一個或更多個CDR區(qū)可以與已知的構架區(qū)和/或其它CDR重組組合，以產(chǎn)生另外的、重組改造的本公開抗間皮素抗體，如上所論述。修飾的其它類型包括先前部分中描述的那些。改造方法的起始物質是本文提供的一個或更多個Vh和/或\序列，或其一個或更多個CDR區(qū)。為產(chǎn)生改造的抗體，不必要實際制備(即，表達為蛋白質)具有本文提供的一個或更多個Vh和/或\序列或其一個或更多個CDR區(qū)的抗體。而是，包含在序列(一個或多個)中的信息被用作起始物質來產(chǎn)生源自原始序列(一個或多個)的“第二代”序列(一個或多個)，然后“第二代”序列(一個或多個)作為蛋白質而制備和表達。因此，在另一個實施方案中，本公開提供制備抗間皮素抗體的方法，其包括(a)提供(i)Vh抗體序列，其包含選自SEQIDNO:1_3的CDRl序列、選自SEQIDNO4-6的CDR2序列和/或選自SEQIDNO:7_9的CDR3序列；和/或抗體序列，其包含選自SEQIDNO10-12的CDRl序列、選自SEQIDNO13-15的CDR2序列和/或選自SEQIDNO16-18的CDR3序列；(b)改變\抗體序列和/或\抗體序列中至少一個氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種改變的抗體序列；以及(C)將改變的抗體序列表達為蛋白質。標準分子生物學技術可以用于制備和表達改變的抗體序列。在某些實施方案中，可以沿全部或部分抗間皮素抗體編碼序列隨機或選擇性地引入突變并且可以針對結合活性和/或本文描述的其它功能性質對所形成的修飾的抗間皮素抗體進行篩選。突變方法已經(jīng)描述在本領域中。例如，Short的WO02/092780描述了使用飽和誘變、合成性連接裝配或其組合來產(chǎn)生和篩選抗體突變的方法。備選地，Lazar等的WO03/074679描述了使用計算篩選方法來優(yōu)化抗體理化性質的方法。編碼本發(fā)明抗體的核酸分子本公開的另一個方面涉及對本公開的抗體進行編碼的核酸分子。這些核酸可以存在于整個細胞中、細胞裂解液中、或者以部分純化或基本上純的形式存在。當通過標準技術(包括堿/SDS處理，CsCl成帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳以及本領域的其他熟知技術)從其他細胞成分或其他雜質(如其他細胞核酸或蛋白質)中純化出核酸時，該核酸是“分離的”或“使之基本上是純的，，。參見F.Ausubeletal.(1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingandWileyInterscience,NewYork。本公開的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有內含子序列。在優(yōu)選的實施方案中，核酸為cDNA分子。使用標準的分子生物學技術可以獲得本公開的核酸。對于雜交瘤表達的抗體(例如，從以下進一步說明的攜帶人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠制備的雜交瘤)而言，通過標準的PCR擴增或cDNA克隆技術可以獲得編碼雜交瘤產(chǎn)生的抗體的輕鏈和重鏈的cDNA。對于從免疫球蛋白基因文庫中獲得的抗體(例如使用噬菌體展示技術)而言，可以從該文庫回收編碼該抗體的核酸。優(yōu)選的核酸分子是編碼3C10、6A4或7B1單克隆抗體Vh和\序列的核酸分子。編碼3C10、6A4和7B1序列的DNA序列分別顯示在SEQIDN0:25_27中。編碼3C10、6A4和7B1的Vl序列的DNA序列分別顯示在SEQIDNO:28_30中。一旦獲得了編碼Vh和\區(qū)段的DNA片段，則通過標準的重組DNA技術可以進一步操作這些DNA片段，例如將可變區(qū)基因轉變成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼\或Vh的DNA片段被有效連接至編碼另一種蛋白質(例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭)的另一條DNA片段。在此使用的術語“有效連接”意指連接兩條DNA片段，使得它們編碼的氨基酸序列保留在讀框內。通過將編碼Vh的DNA有效連接至編碼重鏈恒定區(qū)(CHI、CH2及CH3)的DNA分子，可以將編碼Vh區(qū)的分離的DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恒定區(qū)基因的序列在本領域中是已知的(參見Kabat‘242)，并且包含這些區(qū)域的DNA片段可以通過標準PCR擴增來獲得。該重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但最優(yōu)選是IgGl或IgG4恒定區(qū)。對于Fab片段重鏈基因而言，可以將編碼Vh的DNA有效連接至僅對重鏈CHl恒定區(qū)進行編碼的DNA分子。通過將編碼Vl的DNA有效連接至另一個編碼輕鏈恒定區(qū)Q的DNA分子上，可以將編碼\區(qū)的分離的DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恒定區(qū)基因序列在本領域中是已知的(參見例如Kabat，Ε.Α.，elal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，并且通過標準PCR擴增可以獲得包含這些區(qū)的DNA片段。在優(yōu)選的實施方案中，該輕鏈恒定區(qū)可以為κ或λ恒定區(qū)。為了產(chǎn)生scFv基因，將編碼Vh和\的DNA片段有效連接至編碼柔性接頭的另一條片段，例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3，使得\和Vh序列可表達為連續(xù)的單鏈蛋白，其中V1^nVl區(qū)域通過柔性接頭連接(參見，例如Birdetal.(1988)Science242:423-426;Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883；McCaffertyetal.,(1990)Nature348:552_554)。本公開單克隆抗體的產(chǎn)生可以通過多種技術產(chǎn)生本公開的單克隆抗體(mAb)，該技術包括KohlerandMilstein(1975)Nature256:495的標準體細胞雜交技術。雖然優(yōu)選體細胞雜交步驟，但是原則上可以采用其他技術，例如B淋巴細胞的病毒性轉化或致癌性轉化。用于制備雜交瘤的優(yōu)選的動物系統(tǒng)是鼠類系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是充分確立的程序。用于分離被免疫的脾細胞以進行融合的免疫方案和技術在本領域中是已知的。融合配偶體(例如鼠骨髓瘤細胞)和融合程序也是已知的?；谌缟纤鲋苽涞姆侨藛慰寺】贵w的序列，可以制備本公開的嵌合抗體或人源化抗體。從目的非人雜交瘤可以獲得對重鏈和輕鏈免疫球蛋白進行編碼的DNA，并且使用標準的分子生物學技術進行工程化，以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為生成嵌合抗體，使用本領域中已知的方法可以將鼠類可變區(qū)與人類恒定區(qū)連接(參見例如Cabilly等人的美國專利號4，816，567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，使用本領域已知的方法可以將鼠類⑶R區(qū)插入人類構架區(qū)(參見例如Winter的美國專利號5，225，539及Queen等人的美國專利號5，530，101；5，585，089；5，693，762以及6，180，370)。優(yōu)選地，抗體是人類單克隆抗體。使用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉基因小鼠或轉染色體小鼠，這些轉基因小鼠及轉染色體小鼠包括在此分別稱為HuMAbMouse及KMMouse的小鼠，并在此統(tǒng)稱為“人類Ig小鼠”。HuMAbmouse型小鼠(Medarex，Inc.)含有對非重排的人重鏈(μ及Y)以及κ輕鏈免疫球蛋白序列進行編碼的人類免疫球蛋白基因微基因座，并含有使內源性μ和κ鏈基因座失活的靴向突變(參見例如Lonberg，etal.(1994)Nature368(6474)856-859)。因此，這些小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或κ的表達降低，并且響應于免疫應答，被導入的人類重鏈和輕鏈轉基因經(jīng)歷了類別轉換及體細胞突變，以產(chǎn)生高親和力的人類IgGK單克隆抗體(Lonberg,N.etal.(1994)，supra；Lonberg,N.(1994)HandbookofExperimentalPharmacology113:49_101；Lonberg,N.andHuszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.1365-93，以及Harding，F(xiàn).andLonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536_546中綜述)。HuMAbMouse型小鼠的制備和用途，以及由這種小鼠攜帶的基因組修飾，進一步記載于Taylor,etal.(1992)NucleicAcidsResearch20:6287_6295；Chen,J.etal.(1993)InternationalImmunology5647-656；Tuaillonetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA903720-3724；Choietal.(1993)NatureGenetics4:117—123;Chen，J.etal.(1993)EMBOJ.12:821_830；Tuaillonetal.(1994)J.Immunol.1522912-2920；Taylor,L.etal.(1994)InternationalImmunology6:579-591；以及Fishwild,D.etal.(1996)NatureBiotechnology14:845_851，所有這些文獻的內容完整并入本文作為參考。進一步參見，均為Lonberg及Kay的美國專利號5,545,806；5,569,825；5，625，126；5，633，425；5，789，650；5，877，397；5，661，016；5，814，318；5，874，299；及5，770，429；Surani等人的美國專利號5，545，807；均為Lonberg及Kay的WO92/03918,WO93/12227，WO94/25585，WO97/13852，W098/24884及W99/45962；以及Korman等人的WO01/14424。還可以使用攜帶人類λ輕鏈基因的轉基因小鼠，如Bruggemann的WO00/26373中說明的那些轉基因小鼠。例如，攜帶人類λ輕鏈轉基因的小鼠可與攜帶人類重鏈轉基因(如HCo7)并可任選地還攜帶人類κ輕鏈轉基因(如KCo5)的小鼠進行雜交以產(chǎn)生同時攜帶人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因的小鼠(見，如實施例1)在另一個實施方案中，本公開的人抗體可以使用攜帶轉基因和轉染色體上人免疫球蛋白序列的小鼠而產(chǎn)生，如攜帶人重鏈轉基因和人輕鏈轉染色體的小鼠。本文將該小鼠稱為具有KMMouse品系或類型并且詳細描述在Ishida等的WO02/43478中。再者，備選的表達人類免疫球蛋白基因的轉基因動物系統(tǒng)在本領域內是可以獲得的，并且可以用于生產(chǎn)本公開的抗-間皮素抗體。例如，可以使用被稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)的備選轉基因系統(tǒng)；這種小鼠記載于，例如Kucherlapat等人的美國專利號5，939，598；6,075,181；6，114，598；6，150，584及6，162，963中。此外，備選的表達人類免疫球蛋白基因的轉基因動物系統(tǒng)在本領域內是可以獲得的，并且可以用于生產(chǎn)本公開的抗-間皮素抗體。例如，可以使用被稱作“TC小鼠”的小鼠，該小鼠同時攜帶人類重鏈轉染色體和人類輕鏈轉染色體；這種小鼠記載于Tomizukaetal.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:722-727中。此外，在本領域中已經(jīng)說明了攜帶人類重鏈轉染色體和人類輕鏈轉染色體的奶牛(例如，Kuroiwaetal.(2002)NatureBiotechnology20:889_894和WO2002/092812)。本公開的人單克隆抗體也可以使用用于篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法來制備。參見例如Ladner等的US5，223，409；5,403，484；和5，571，698；Dower等的US5，427，908和5，580，717；McCafferty等的US5,969，108和6，172，197；以及Griffiths等的US5，885，793；6，521，404；6，544，731；6，555，313；6，582，915和6，593，081。使用SCID小鼠也可以制備本公開的人類單克隆抗體，其中人類免疫細胞已被重建入SCID小鼠，使得免疫時可產(chǎn)生人抗體反應。這種小鼠記載于Wilson等人的美國專利號5，476，996及5，698，767中。在另一個實施方案中，可以使用如Buechler等的美國專利號6，794，132中說明的人類Ig小鼠以及噬菌體展示技術的組合來制備人類抗間皮素抗體。更確切地說，該方法首先涉及通過用一種或多種間皮素抗原對人類Ig小鼠(如HuMabMouse或KMMouse品系的那些)進行免疫，在這些小鼠中形成抗間皮素抗體反應，隨后從該小鼠的淋巴細胞中分離編碼人抗體鏈的核酸，并將這些核酸導入展示載體(例如噬菌體)中以提供展示包裝體(displaypackage)文庫。由此，每個文庫成員包含編碼一種人抗體鏈的核酸，并且每種抗體鏈通過展示包裝體被展示出來。然后用間皮素蛋白篩選該文庫以分離出與間皮素特異性結合的文庫成員。然后將所選文庫成員中的核酸插入片段進行分離并通過標準方法測序以確定所選間皮素結合子的輕鏈和重鏈可變序列。通過標準的重組DNA技術可以將可變區(qū)轉化成全長抗體鏈，這些技術例如，將可變區(qū)克隆進入攜帶人類重鏈及輕鏈恒定區(qū)的表達載體，使得Vh區(qū)被可操作地連接至Ch區(qū)，并且\區(qū)被可操作地連接至Q區(qū)。人Ig小鼠的免疫當人類Ig小鼠用于產(chǎn)生本公開的人抗體時，用間皮素抗原和/或重組間皮素、或表達間皮素蛋白的細胞、或間皮素融合蛋白的經(jīng)純化或者富集的制品，可以對此類小鼠進行免疫，如Lonberg，N等(1994)Nature368(6474):856_859；Fishwild，D等(1996)NatureBiotechn.14:845_851；以及WO98/24884和WO01/14424所述。。優(yōu)選地，這些小鼠在初次輸注時是6至16周齡。例如，用間皮素抗原的經(jīng)純化的或重組的制備物(5至50μg)經(jīng)腹膜內和/或皮下可對人Ig小鼠進行免疫。最優(yōu)選地，用于生產(chǎn)本公開的抗體的免疫原是間皮素融合蛋白，該融合蛋白包括間皮素蛋白的細胞外結構域，在其N-末端與非間皮素的多肽(例如His標簽)相融合(見例如實施例1)。在實施例1中說明了用于產(chǎn)生結合人類間皮素的全長人類單克隆抗體的詳細操作。關于不同抗原的積累的經(jīng)驗已顯示，在以下條件下HuMAbMouse型轉基因小鼠會應答當用完全弗氏佐劑中的抗原經(jīng)腹膜內(IP)進行初始免疫，隨后每隔一周用不完全弗氏佐劑中的抗原進行IP免疫(達到共6次)。然而，發(fā)現(xiàn)除弗氏佐劑之外的其他佐劑也是有效的(例如RIBI佐劑)。另外，也發(fā)現(xiàn)在沒有佐劑的情況下整個細胞具有高度的免疫原性。在免疫過程中可以用眶后取血得到的血漿樣品監(jiān)測免疫應答。通過ELISA可以篩選該血漿，并且具有足夠滴度的抗-間皮素人類免疫球蛋白的小鼠可用于融合。例如可以在處死并取出脾臟前的3天，通過靜脈內對小鼠用抗原加強。預期對每個免疫可能需要進行2至3次融合。每種抗原通常對6至24只小鼠進行免疫。通常使用HCo7與HCol2品種。另外，HCo7與HCol2兩個轉基因均可以被共同培育成單一小鼠，該小鼠具有兩種不同的人類重鏈轉基因(HCo7/HCol2)。備選地或額外地，可以使用KMMouse品系。產(chǎn)生本發(fā)明人單克隆抗體的雜交瘤的產(chǎn)生為了生成產(chǎn)生本公開的人單克隆抗體的雜交瘤，從被免疫的小鼠分離脾細胞和/或淋巴結細胞，并且與合適的無限增殖化細胞系(例如小鼠骨髓瘤細胞系)融合。針對抗原特性抗體的產(chǎn)生對得到的雜交瘤進行篩選。例如，通過50%的PEG可以將來自經(jīng)免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸液與六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL1580)相融合。備選地，使用電融合方法，使用CytoPulse大腔細胞融合電穿孑匕儀(largechambercellfusionelectroporator)(CytoPulseSciences,Inc.，GlenBurnieMaryland)，融合來自經(jīng)免疫的小鼠脾淋巴細胞的單細胞懸液。將大約2X105個細胞接種于平底微量滴定板上，之后在以下選擇性培養(yǎng)基中培育2周該培養(yǎng)基含有20%胎CloneSerumU8%“653”條件培養(yǎng)基、5%origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、ImM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0.055mM的2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素以及IXHAT(Sigma;融合后24小時加入HAT)。大約2周后，將細胞培養(yǎng)于以HT替換HAT的培養(yǎng)基中。然后由ELISA針對人類單克隆IgM與IgG抗體這些單個孔進行篩選。一旦出現(xiàn)雜交瘤的擴大生長，通常在10至14天后觀察培養(yǎng)基。對分泌抗體的雜交瘤進行再接種、再篩選，并且如果對人類IgG仍是陽性，則通過有限稀釋將該單克隆抗體亞克隆至少2次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以便在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。為了純化人類單克隆抗體，將已選擇的雜交瘤培養(yǎng)于2升的旋瓶中用于單克隆抗體純化?？梢詫ι锨逡哼M行過濾并濃縮，之后用A蛋白-瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)進行親和層析。通過凝膠電泳及高效液相層析檢查被洗脫的IgG級分以確保純度。將該緩沖液交換為PBS，并且通過OD28tl使用1.43的消光系數(shù)確定其濃度。將單克隆抗體等份，并保存于-80°C。產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的轉染瘤的產(chǎn)生使用(例如)本領域中熟知的重組DNA技術及基因轉染方法的結合，在宿主細胞轉染瘤中也可以產(chǎn)生本公開的抗體(例如Morrison，S.(1985)Science229:1202)。例如，為了表達抗體，或它們的抗體片段，可以通過標準的分子生物學技術(例如，使用表達目的抗體的雜交瘤的PCR擴增或cDNA克隆)獲得對部分或全長輕鏈和重鏈進行編碼的DNA，并且可以將這些DNA插入至表達載體中，使得這些基因被有效連接至轉錄和翻譯控制序列。在本文中，術語“有效連接”意指將抗體基因連接進入載體，使得載體中轉錄和翻譯控制序列起到其調節(jié)抗體基因的轉錄和翻譯的預期功能。對表達載體及表達控制序列進行選擇以便與所使用的表達宿主細胞相容?？梢詫⒃摽贵w輕鏈基因與該抗體重鏈基因插入至單獨的載體中，或者更典型地是將兩個基因均插入至相同的表達載體中。通過標準的方法(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補限制位點，或者如果不存在限制位點則進行平端連接)將這些抗體基因插入至該表達載體中。可以通過以下方法將本文所述的該抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)用于生產(chǎn)任何抗體同種型的全長抗體基因將輕鏈和重鏈可變區(qū)插入至已經(jīng)對希望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)進行編碼的表達載體中，使得Vh區(qū)段有效連接至載體中的Ch區(qū)段，并且將Vk區(qū)段有效連接至載體中的Q區(qū)段。另外地或備選地，重組的表達載體可以編碼一種信號肽，該信號肽有助于從宿主細胞中分泌抗體鏈?？梢詫⒖贵w鏈基因克隆進入該載體，使得該信號肽符合讀框地被連接至該抗體鏈基因的氨基末端。該信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或者是異源的信號肽(即，來自非免疫球蛋白的信號肽)。本公開的重組表達載體除了抗體鏈基因之外，還攜帶在宿主細胞中調控抗體鏈基因表達的調節(jié)序列。術語“調節(jié)序列”意指包括啟動子、增強子以及控制抗體鏈基因的轉錄或翻譯的其他表達控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號)。這種調控序列被描述于，例如Goeddel(GeneExpressionTechnology.MethodsinEnzymology185,AcademicPress，SanDiego,CA(1990))中。本領域技術人員將會了解，表達載體的設計，包括調節(jié)序列的選擇，可以依賴于以下因素，如待轉化的宿主細胞的選擇、希望的蛋白質的表達水平等。用于哺乳動物宿主細胞表達的優(yōu)選調節(jié)序列包括指導蛋白質在哺乳動物細胞中高水平表達的病毒元件，例如來自巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒的那些。備選地，可以使用非病毒調節(jié)序列，例如泛蛋白啟動子或β-珠蛋白啟動子。再者，可使用由來自不同來源的序列組成的調節(jié)元件，例如SRa啟動子系統(tǒng)，它包含來自SV40早期啟動子及人類T細胞白血病病毒I型的長末端重復序列(Takebe,Y.etal.(1988)Mol.Cell.Biol.8466-472)。本公開的重組表達載體除了攜帶抗體鏈基因和調節(jié)序列之外，還可以攜帶另外的序列，例如在宿主細胞中調節(jié)載體復制的序列(例如，復制起點)及可選擇的標記基因。該可選擇的標記基因有利于對其中已導入載體的宿主細胞的選擇(參見例如，均為Axel等人的美國專利號4，399，216,4,634，665及5，179，017)。例如，典型地可選擇的標記基因賦予已導入載體的宿主細胞對，例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的藥物抗性。優(yōu)選的可選擇的標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主細胞中用于甲氨喋呤選擇/擴增)以及neo基因(用于G418選擇)。為了輕鏈及重鏈的表達，將編碼這些重鏈與輕鏈的一個或多個表達載體轉染進入宿主細胞中。術語“轉染”的不同形式旨在涵蓋范圍寬廣的多種技術，這些技術一般用于將外源DNA導入原核的或真核的宿主細胞，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉染等等。雖然在理論上可以無論在原核宿主細胞或在真核宿主細胞中均表達本公開的抗體，但是在真核細胞中抗體的表達，并且最優(yōu)選在哺乳動物宿主細胞中的表達是最優(yōu)選的，因為它們比原核細胞更有可能組裝并分泌正確折疊并且具有免疫活性的抗體。用于表達本公開的重組抗體的優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CH0細胞)(包括dhfrXHO細胞，說明于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA774216-4220,使用DHFR選擇標記，例如R.J.KaufmanandP.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159601-621中所說明)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。特別是，對于使用NSO骨髓瘤細胞而言，另一種優(yōu)選的表達系統(tǒng)是在(Wilson的)WO87/04462、(Bebbington的)WO89/01036、以及(Bebbington的)EP338，841中披露的GS基因表達系統(tǒng)。在編碼抗體基因的重組表達載體基因被引入哺乳動物宿主細胞時，通過對宿主細胞培養(yǎng)一段時間可以產(chǎn)生抗體，所述時間足夠使該抗體在該宿主細胞中得到表達，或者更優(yōu)選地使該抗體分泌進入生長宿主細胞的培養(yǎng)基。使用標準的蛋白純化方法可以從培養(yǎng)基中回收抗體。結合抗原的抗體的表征通過例如標準ELISA可以對本發(fā)明抗體結合人間皮素進行測試。簡言之，用在PBS中的lyg/mL純化和/或重組的間皮素蛋白(參見，例如，實施例1)包被微量滴定板，然后用在PBS中的5%牛血清白蛋白封閉。將抗體稀釋液(例如，來自間皮素免疫小鼠的血漿稀釋液)添加到每個孔中并且在37°C下溫育1-2小時。用PBS/吐溫沖洗該板，并接著與綴合至堿性磷酸酶的第二試劑(例如，對于人抗體而言，一種山羊-抗人類IgGFc特異性的多克隆試劑)在37°C孵育1小時。沖洗后，用pNPP底物(lmg/ml)對該板進行顯影，并在OD405至650下進行分析。優(yōu)選地，形成最高效價的小鼠將用于融合。以上說明的ELISA測定還可用于篩選與間皮素蛋白免疫原顯示陽性反應的雜交瘤。對以高親合力和/或親和力結合間皮素的雜交瘤進行亞克隆并且進一步表征?？梢詮拿總€雜交瘤(通過ELISA)選擇保持親本細胞反應性的一個克隆，用于制備5至10小瓶細胞庫，保存于-140°C，并用于抗體純化。為了純化抗間皮素抗體，將已選擇的雜交瘤生長于兩升的組織培養(yǎng)瓶或旋瓶中用于單克隆抗體純化。將上清液進行過濾并濃縮，之后用A蛋白-瓊脂糖(Pharmacia，Piscataway,N.J.)進行親和層析。通過凝膠電泳及高效液相層析可以檢查被洗脫的IgG級分以確保純度。將該緩沖液交換到PBS中，并且通過OD28tl使用1.43消光系數(shù)確定其濃度。將單克隆抗體等分，并保存于-80°C。為了確定已選擇的抗-間皮素單克隆抗體是否結合至獨特的表位，使用可商購的試劑(Pierce，Rockford，IL)可以對每種抗體進行生物素化。使用未標記的單克隆抗體及生物素化的單克隆抗體的競爭性研究可以用以上描述的經(jīng)間皮素蛋白包被的ELISA板進行。使用鏈霉抗生物素蛋白_抗生物素蛋白_堿性磷酸酶探針可以檢測生物素化的mAb結I=IO為了確定純化的抗體的同種型，可以使用對特定同種型特異的試劑進行同種型ELISA。例如，為了確定人類單克隆抗體的同種型，可以用lyg/ml的抗-人類免疫球蛋白抗體在4°C下過夜對微量滴定板的孔進行包被。用1%BSA封閉后，該板與1μg/ml或更低的測試單克隆抗體或者經(jīng)純化的同種型對照在環(huán)境溫度下反應1至2小時。隨后將這些孔與人類IgGl或人類IgM-特異的堿性磷酸酶綴合的探針進行反應。如以上所述對板進行顯影并分析。通過蛋白質印跡法可以測試抗間皮素人類IgG與間皮素抗原的反應性。簡言之，制備間皮素抗原并對其進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。將被分開的抗原轉移至硝酸纖維素膜上，用10%胎牛血清封閉，并用待測試的單克隆抗體進行探測。使用抗人類IgG堿性磷酸酶檢測人類IgG結合并用BCIP/NBT底物片進行顯影(SigmaChem.Co.，St.Louis,Mo.)還可以通過監(jiān)測該抗體與表達間皮素蛋白的細胞的結合(例如通過流式細胞術)，來確定本公開的抗體的結合特異性。可以使用天然表達間皮素蛋白的細胞或細胞系例如0VCAR3、NCI-H226、CFPAC-I或KB細胞，或者可以用編碼間皮素的表達載體轉染細胞系(例如CHO細胞系)，使得間皮素在這些細胞的表面上表達。該經(jīng)轉染的蛋白可包含標簽，如myc-標簽或his-標簽，優(yōu)選地位于N-末端，使用針對該標簽的抗體進行檢測。本公開的抗體與間皮素蛋白的結合可以通過將該經(jīng)轉染的細胞與該抗體孵育，并且檢測所結合的抗體進行確定?？蓪⒖贵w與經(jīng)轉染蛋白上的標簽的結合用作陽性對照。雙特異性分子在另一個方面中，本公開的特征是包含本公開的抗間皮素抗體或其片段的雙特異性分子，所述抗體或其片段連接到另一種功能分子，例如，另一種肽或蛋白質如另一種抗體、結合模擬物或受體的配體，所述雙特異性分子結合至少兩種不同的結合位點或靶分子。本公開的抗體實際上可以連接到一種以上其它功能分子，以產(chǎn)生結合兩種以上不同結合位點和/或靶分子的多特異性分子。這些多特異性分子也意圖被本文所用的術語“雙特異性分子”所包括。連接可以是化學偶聯(lián)、基因融合、非共價連接或其它方式。因此，本公開還包括雙特異性分子，該雙特異性分子含有針對間皮素的至少一種第一結合特異性以及針對第二靶表位的第二結合特異性。在本公開的一個具體實施方案中，該第二靶表位是Fc受體，例如人類FcγRI(⑶64)或人類Fcα受體(⑶89)。因為，本公開包括的雙特異性分子既能夠結合表達FcγR或FcαR受體的效應細胞(例如單核細胞、巨噬細胞或多形核細胞(PMN))，又能夠結合表達間皮素蛋白的靶細胞。這些雙特異性分子將表達間皮素的細胞靶向效應細胞，并觸發(fā)Fc受體介導的效應細胞活性，例如，表達間皮素的細胞的吞噬作用、ADCC、細胞因子的釋放、或超氧化物陰離子的生成。當雙特異性分子是多特異性時，該分子除了包括抗-Fc結合特異性及抗-間皮素結合特異性之外，還能進一步包括第三種結合特異性。在一個實施方案中，第三結合特異性是抗增強因子(EF)部分，例如，結合至涉及細胞毒素活性的表面蛋白上并由此增強針對靶細胞的免疫應答的分子?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨梢允墙Y合至給定分子(例如抗原或受體)的抗體、功能抗體片段、或配體，并且由此增強Fc受體或靶細胞抗原的結合決定簇的效果?！翱乖鰪娨蜃硬糠帧笨梢越Y合Fc受體或靶細胞抗原。備選地，抗增強因子部分可以結合實體，該實體不同于第一及第二結合特異性結合的實體。例如，抗增強因子部分可結合細胞毒性T細胞(例如，經(jīng)⑶2、⑶3、⑶8、⑶28、⑶4、⑶40、ICAM-1、或其他免疫細胞，導致針對該靶細胞的免疫應答的增強)。在一個實施方案中，本公開的雙特異性分子包含作為一種結合特異性的至少一種抗體、或該抗體的抗體片段，包括，F(xiàn)ab、Fab，、F(ab')2、Fv、Fd、dAb或單鏈Fv。該抗體還可以是輕鏈或重鏈二聚物，或是其任何最小片段，例如Fv或單鏈構建體，如在Ladner等人的美國專利號4，946，778所述，其內容明確地并入本文作為參考。在一個實施方案中，F(xiàn)cY受體的結合特異性由單克隆抗體提供，其結合并未被人類免疫球蛋白G(IgG)所阻斷。在此所使用的術語“IgG受體”指位于染色體1上的8個γ鏈基因的任何基因。這些基因總共編碼12種跨膜或可溶性受體同種型，它們被分為三類Fcγ受體=FcyRI(CD64)、FcγRII(CD32)、以及FcyRIII(CD16)。在一個優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)cγ受體是人類高親合性FcγRI。人類FcyRI是一種72kDa的分子，它對單體IgG具有高親合性(IO8至IO,1)。在Fanger等人的TO88/00052及美國專利號4，954，617中描述了某些優(yōu)選的抗-Fcγ單克隆抗體的制備及表征，其中傳授的內容都通過引用全部結合在此。這些抗體結合至FcγI、FcγII及FcγIII的表位上不同于受體的Fcγ結合位點的位點，并因此它們的結合基本上不會被IgG的生理水平所阻斷。在本公開有用的特異性抗-FcyRI抗體是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62及mAb197。產(chǎn)生mAb32的雜交瘤可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得，ATCC保藏號HB9469。在其他實施方案中，抗-Fcγ受體抗體是一種單克隆抗體22(Η22)的人源化形式。Η22抗體的制備及表征說明于Graziano，R.F.etal.J.(1995)Immunol155(10):4996_5002，及Tempest等人的WO94/10332中。產(chǎn)生H22抗體的細胞系保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，被命名為HA022CL1，保藏號為CRL11177。在另外的優(yōu)選實施方案中，對于Fc受體的結合特異性由結合至人類IgA受體的抗體提供，所述人類IgA受體例如是Fcα受體(FeαRI(CD89))，這種結合優(yōu)選不會被人類免疫球蛋白A(IgA)所阻斷。術語“IgA受體”意在包括位于染色體19上的一個α基因(FcaRI)的基因產(chǎn)物。已知這一基因編碼幾種55至IlOkDa的選擇性剪接的跨膜同種型。FcaRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及嗜中性粒細胞中組成型表達，但在非效應細胞類群中不組成型表達。FcαRI對于IgAl和IgA2都具有中等的親合力(5XIO7M"1)，該親合性在暴露于細胞因子例如G-CSF或GM-CSF時會增加(Morton，H.C.etal.(1996)CriticalReviewsinImmunologyl6:423_440)。已經(jīng)描述了四種FcαRI特異性的單克隆抗體，被鑒定為A3、Α59、Α62及Α77，它們結合IgA配體結合域外側的FcaRI(Monteiro，R.C.etal.(1992)J.Immunol.1481764)。在本公開的雙特異性分子的使用中，F(xiàn)cαRI及FcγRI是優(yōu)選的觸發(fā)受體，因為它們(1)主要表達于免疫效應細胞(例如單核細胞、ΡΜΝ、巨噬細胞和樹突細胞)；(2)表達水平高(例如5，000至100，000/細胞)；(3)是細胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介體；以及⑷介導靶向它們的抗原(包括自身抗原)的增強的抗原呈遞。雖然人類單克隆抗體是優(yōu)選的，但是可用于本公開的雙特異性分子的其他抗體是鼠類抗體、嵌合抗體及人源化單克隆抗體。使用本領域中已知的方法通過綴合組成性結合的特異性(例如，抗-FcR及抗_間皮素的結合特異性)可以制備本公開的雙特異性分子。例如，可以單獨地生成雙特異性分子中的每一種結合特異性，并接著將它們綴合在一起。當結合特異性是蛋白質或肽時，可以使用多種偶聯(lián)試劑或交聯(lián)試劑來進行共價綴合。交聯(lián)試劑的實例包括蛋白Α、碳二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-亞苯基二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基_3_(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、以及4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-SMCC)(參見例如，Karpovskyetal.(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu,MAetal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA828648)。其他方法包括在Paulus(1985)BehringIns.Mitt.No.78,118-132；Brennanetal.(1985)Science229:81_83)，以及Glennieetal.(1987)J.Immunol.139=2367-2375)中說明的方法。優(yōu)選的綴合試劑是SATA及磺基-SMCC，都可從PierceChemicalCo.(Rockford,IL)公司購得。當這些結合特異性是抗體時，它們可以通過兩個重鏈之間的C末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵合相綴合。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，在綴合之前對鉸鏈區(qū)進行修飾，使其含有奇數(shù)個巰基殘基，優(yōu)選地含有一個巰基殘基。備選地，兩種結合特異性均可以在相同的載體中被編碼并在同一宿主細胞中被表達并且組裝。當雙特異性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab，)2或配體XFab融合蛋白時，這一方法特別有用。本公開的一種雙特異性分子可以是含有一個單鏈抗體及一個結合決定簇的單鏈分子，或含有兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可以含有至少兩種單鏈分子。制備雙特異性分子的方法說明在例如美國專利號5，260，203；5，455，030；4，881，175；5，132，405；5，091，513；5，476，786；5，013，653；5，258，498；及5，482，858中，將它們都明確并入本文作為參考。雙特異性分子與它們的特異性靶標的結合可以通過下列方法來確認，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(例如生長抑制)、或蛋白印跡測定。這些測定中的每一種測定通常都是通過采用對目的復合體特異的標記試劑(例如，抗體)，檢測特定目的蛋白_抗體復合體的存在。例如，可以使用例如識別并且特異性結合至抗體-FcR復合體的酶聯(lián)抗體或抗體片段來檢測這些FcR-抗體復合體。備選地，使用多種其他免疫測定中的任何測定可以檢測這些復合體。例如，該抗體可被放射性標記，并用于放射免疫測定(RIA)中(參見例如，Weintraub，B.,PrinciplesofRadioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,March，1986，將其并入本文作為參考)。可以使用例如Y計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或通過放射自顯影來檢測放射性同位素。連接物在另一個方面中，提供抗體-配偶體分子連接物，其中配偶體分子通過化學接頭(本文有時簡稱為“接頭”)連接到本發(fā)明的抗體。配偶體分子可以是治療劑或標記物。治療劑可以是，例如，細胞毒素、非細胞毒性藥物(例如，免疫抑制劑)、放射活性劑、另一種抗體、或酶。優(yōu)選的配偶體分子是細胞毒素。標記物可以是產(chǎn)生可檢測信號的任何標記，如放射性標記、熒光標記或催化底物的可檢測修飾的酶?？贵w充當靶向功能通過結合在其中發(fā)現(xiàn)它的抗原的靶組織或細胞，抗體將連接物引向該靶組織或細胞。在那里，接頭被切割，釋放配偶體分子以行使其期望的生物功能。在一些情況下，連接物被內化在靶細胞中并且在其中發(fā)生切割。接頭在一些實施方案中，接頭是肽基接頭，本文將其描述為(L4)p-F-(L1)mt5其它接頭包括胼和二硫化物接頭，本文將它們分別描述為(L4)p-H-(L1)n^P(L4)p-J-(L1)mtlF、H和J分別是肽基、胼和二硫化物部分，它們是可切割的，以從抗體釋放配偶體分子，而L1和L4是連接基團。F、H、J、L1和L4以及下標ρ和m在下文中更充分地進行限定。這些和其它接頭的制備和使用描述在WO2005/112919中，其公開內容通過引用并入本文?？贵w-配偶體連接物中肽基和其它接頭的使用描述在US2006/0004081；2006/0024317；2006/0247295；6，989，452；7，087，600；and7,129，261；WO2007/051081；2007/038658；2007/059404；和2007/089100中；其全部通過引用而并入本文。另外的接頭描述于US6，214，345;2003/0096743；和2003/0130189;deGroot等，J.Med.Chem.42，5277(1999)；deGroot等J.Org.Chem.43，3093(2000)；deGroot等，J.Med·Chem.66，8815，(2001)；W002/083180;Carl等，J.Med.Chem.Lett.24,479,(1981)；Dubowchik等，Bioorg&Med.Chem.Lett.8，3347(1998)，其公開內容通過引用而并入本文。除連接抗體和配偶體分子外，接頭可以賦予配偶體分子穩(wěn)定性、減少其體內毒性或另外有利地影響其藥物代謝動力學、生物利用度和/或藥物動力學。通常優(yōu)選的是，一旦連接物輸送至其作用位點，接頭被切割，釋放配偶體分子。也優(yōu)選地，接頭是無痕跡的，以便一旦從配偶體分子除去(如在激活期間)，不殘留接頭存在的痕跡。在另一個實施方案中，接頭的特征在于其在靶細胞中或附近位點被切割的能力，如在配偶體分子的治療作用或標記物活性的位點。這種切割在性質上可以是酶促的。該特征有助于減少配偶體分子系統(tǒng)性激活、降低毒性和系統(tǒng)性副作用。酶促切割的優(yōu)選可切割基團包括肽鍵、酯鍵和二硫鍵，如上述F、H和J部分。在其它實施方案中，接頭對pH敏感，并且通過pH改變而被切割。一個重要方面是控制接頭切割速度的能力。通常期望切割快的接頭。然而，在一些實施方案中，可以優(yōu)選切割更慢的接頭。例如，在持續(xù)釋放劑型或在具有快速釋放和慢速釋放組分的劑型中，提供更慢切割的接頭是有用的。上述WO2005/112919公開了胼接頭，其可以設計來以非?？熘练浅Ｂ乃俣确秶M行切割。接頭也可以用來穩(wěn)定配偶體分子而在連接物循環(huán)時不降解，即在其到達靶組織或細胞之前不降解。該特征提供明顯的益處，因為其延長配偶體分子的循環(huán)半衰期。接頭也用來削弱配偶體分子活性，以便連接物在循環(huán)時相對溫和，但在期望作用位點處激活后配偶體分子具有期望的效應——例如細胞毒性。對于治療劑連接物，接頭的該特征用來改善藥劑的治療指數(shù)。分別除可切割肽、胼或二硫基F、H或J外，一個或更多個連接基團L1被任選引入于配偶體分子和F、H或J(視情況而定)之間。這些連接基團L1也可以描述為間隔基團并且含有至少兩個官能團。根據(jù)下標m(即，L1基團存在數(shù))的值和具體基團L1的位置，基團L1的化學官能度可以結合到配偶體分子的化學官能度、F、H或J(視情況而定)的化學官能度或另一個連接基團L1(如果存在一個以上L1)的化學官能度。間隔基團L1的合適化學官能度的實例包括羥基、巰基、羰基、羧基、氨基、酮基團、醛基團和巰基基團。接頭L1可以是取代或未取代烷基、取代或未取代芳基、取代或未取代雜芳基或者取代或未取代雜烷基。在一個實施方案中，烷基或芳基可以包含1至20個碳原子。它們也可以包含聚乙二醇部分。示例性基團L1包括，例如6-氨基己醇、6-巰基己醇、10-羥基癸酸、甘氨酸和其它氨基酸、1，6_己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5_氨基戊酸、6-氨基己酸、3-馬來酰亞胺基苯甲酸、2-苯并呋喃酮、α-取代的2-苯并呋喃酮、羰基、縮醛胺酯、核酸、肽等?；鶊FL1的一個功能是提供F、H或J(視情況而定)與配偶體分子之間的空間分隔，以免后者干擾(例如，經(jīng)由空間或電子效應)在F、H或J處的切割化學。基團L1也可以用來將另外的分子團和化學官能度引入到連接物中。一般地，另外的分子團和化學官能度影響連接物的血清半衰期和其它性質。因而，通過仔細選擇間隔基團，可以產(chǎn)生具有一定范圍血清半衰期的連接物。任選地，一個或更多個接頭L1可以是下文描述的自消基團。下標m選自0、1、2、3、4、5和6的整數(shù)。當多個L1基團存在時，它們可以相同或不同。L4是提供F、H或J(視情況而定)和抗體之間空間分隔的接頭部分，以免F、H或J干擾抗體結合抗原或抗體干擾在F、H或J處的切割化學。優(yōu)選地，L4賦予連接物以增加的溶解性或減少的聚集性，其利用包含該部分或修飾連接物水解速率的接頭進行。像L1那樣，L4任選是自消基團。在一個實施方案中，L4部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的雜烷基、或未取代的雜烷基，這些基團中的任一種可以是直鏈、支鏈、或環(huán)狀的。這些取代基可以是例如低級(C1-C6)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、或者二烷基氨基。在一些實施方案中，L4包括非環(huán)狀部分。在另一個實施方案中，L4包括帶正電或負電的氨基酸聚合物，如聚賴氨酸或聚精氨酸。L4可包括諸如聚乙二醇部分的聚合物。另夕卜，L4接頭可以包括，例如多聚體成分以及小分子部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，L4包括聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分可以是長度為1到50個單元。優(yōu)選地，PEG將具有1到12個重復單元，更優(yōu)選3到12個重復單元，更優(yōu)選2到6個重復單元，或甚至更優(yōu)選3到5個重復單元，并且最優(yōu)選4個重復單元。L4可僅僅由PEG部分組成，或也可包括其他的取代或未取代的烷基或雜烷基。將PEG作為L4部分的一部分進行組合可以用于提高復合體的水溶性。另外，該PEG部分在藥物與抗體綴合時降低了聚集度。下標ρ是0或1卩，L4的存在是任選的。在存在的情況下，L4具有至少兩種官能團，一種官能團結合F、H或J(視情況而定)中的化學官能度，另一個官能團結合抗體。基團L4的合適化學官能度的實例包括羥基、巰基、羰基、羧基、氨基、酮基團、醛基團和巰基基團。因為抗體通常經(jīng)由硫氫基(例如，來自未氧化的半胱氨酸殘基、將含有硫氫基的延伸用亞氨基硫烷添加至賴氨酸殘基或將二硫化物橋還原)、氨基(例如，來自賴氨酸殘基)、醛基(例如，來自糖苷側鏈的氧化)或羥基(例如，來自絲氨酸殘基)連接，所以用于附著抗體的優(yōu)選化學官能團是與上述基團起反應的那些基團，實例為馬來酰亞胺、硫氫基、醛、胼、氨基脲和羧基?？贵w上硫氫基和L4上馬來酰亞胺基團的組合是優(yōu)選的。在一些實施方案中，L4包含OR26'R25'R26R25^20<Ρ，其直接附著于(ΑΑ1)。的N末端。R2tl是選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、以及?；某蓡T。R25、R25’、R26、以及R26’各自獨立地選自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、以及取代或未取代的雜環(huán)烷基；并且s和t獨立地是1至6的整數(shù)。優(yōu)選地，R2°、R25、R25，、R26、以及R26，是疏水的。在一些實施方案中，R2tl是H或烷基(優(yōu)選未取代的低級烷基)。在一些實施方案中，R25、R25，、R26以及R26，獨立地是H或烷基(優(yōu)選未取代的C1-C4烷基)。在某些實施方案中，R25、R25，、R26、以及R26，均為H。在某些實施方案中，t是1并且s是1或2肽接頭(F)如上所述，本發(fā)明的肽基接頭可以由通式(L4)p-F-(L1)m來表示，其中F表示包含肽基部分的部分。在一個實施方案中，F(xiàn)部分包含任選的另外的自消接頭L2和羰基，其相應于式(a)的連接物xH4HaaOd在該實施方案中，ΛΛρ和m如上所限定。X4是抗體，D是配偶體分子。下標ο是O或1，而L2，如果存在，表示自消接頭。AA1表示一種或更多種天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸；c是1至20的整數(shù)。在一些實施方案中，c的范圍是2至5或c是2或3。在式(a)中，AA1在其氨基端直接連接到L4或當L4不存在時直接連接到X4。在一些實施方案中，當L4存在時，L4不包含直接連接到(AA1)。的N-端的羧?；?。在另一個實施方案中，F(xiàn)部分包含氨基和任選的間隔基團L3，而L1不存在(S卩，m是0)，其相應于式(b)的連接物xH4Haa丨‘P在該實施方案中，X4、D、L4、AA1、c和ρ如上所定義。下標ο是O或1。L3，如果存在，是包含伯胺或仲胺或羧基官能團的間隔基團，L3的胺與D的側羧基官能團形成酰胺鍵，或者L3的羧基與D的側胺官能團形成酰胺鍵。自消接頭L2自消接頭L2是雙官能化學部分，它能將兩個間隔的化學部分共價連接成通常穩(wěn)定的三節(jié)分子，通過酶切割的方法從該三節(jié)分子釋放所述間隔的化學部分中的一個；在所述酶切割之后，從該分子的其余部分中自發(fā)切割而釋放所述間隔的化學部分中的另一個。根據(jù)本發(fā)明，自消間隔基在其一端以共價鍵與肽部分相連，并在其另一端以共價鍵與藥物部分的化學反應位點相連，藥物部分的衍生化會抑制藥理學活性，以便間隔并將肽部分與藥物部分共價連接成三節(jié)分子，該分子在靶標酶不存在的情況下是穩(wěn)定的，并且無藥理活性，但在將間隔基部分與肽部分共價連接的鍵上可被此類靶標酶進行酶促切割，從而使肽部分從該三節(jié)分子中釋放。反過來，該酶促切割又能夠激活間隔基部分的自消性質，且引發(fā)共價連接間隔基部分與藥物部分的鍵的自發(fā)斷裂，從而實現(xiàn)藥理學活性形式的藥物的釋放。參見，例如，Carl等，J.Med.Chem.，24(3)，479-480(1981)；Carl等，W081/01145(1981)；Toki等，J.Org.Chem.67,1866-1872(2002)；Boyd等，W02005/112919；和Boyd等，WO2007/038658，其公開內容通過引用并入本文。一種特別優(yōu)選的自消間隔基可以由式(C)表示權利要求分離的人單克隆抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體結合人間皮素并且顯示至少一種下列性質(a)以1x108M或更小的KD結合人間皮素；(b)被表達間皮素的細胞的內化；(c)抑制間皮素結合卵巢癌抗原CA125；(d)對表達間皮素的細胞顯示抗體依賴性細胞毒性(ADCC)；或(e)當連接于細胞毒素時，在體內抑制表達間皮素的細胞的生長。2.權利要求1所述的抗體，其中所述抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的至少兩種。3.權利要求1所述的抗體，其中所述抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的至少三種。4.權利要求1所述的抗體，其中所述抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的四種。5.權利要求1所述的抗體，其中所述抗體顯示性質(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的所有五種。6.權利要求1所述的抗體，其以5xlO_9M或更小的Kd結合人間皮素。7.分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其結合被參考抗體識別的人間皮素上的表位，其中所述參考抗體包含(f)包含SEQIDNO19的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO22的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；(g)包含SEQIDNO20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO23的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)；或(h)包含SEQIDN0:21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。8.權利要求7所述的抗體，其中所述參考抗體包含包含SEQIDNO:19的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。9.權利要求7所述的抗體，其中所述參考抗體包含包含SEQIDNO:20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:23的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。10.權利要求7所述的抗體，其中所述參考抗體包含包含SEQIDNO:21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQIDNO:24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。11.分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)是人Vh3-33基因或人Vh3-7基因的產(chǎn)物或源自人Vh3-33基因或人VH3_7基因，其中所述抗體特異性結合人間皮素。12.分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)是人VKL6基因或人VKA27基因的產(chǎn)物或源自人VKL6基因或人VKA27基因，其中所述抗體特異性結合人間皮素。13.分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含(a)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)是人VH3-33基因的產(chǎn)物或源自人Vh3-33基因，所述輕鏈可變區(qū)是人VKL6基因的產(chǎn)物或源自人VKL6基因；或(b)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)是人Vh3-7基因的產(chǎn)物或源自人Vh3-7基因，所述輕鏈可變區(qū)是人VKA27基因的產(chǎn)物或源自人VKA27基因；其中所述抗體特異性結合人間皮素。14.權利要求1所述的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO1的重鏈可變區(qū)⑶Rl；(b)包含SEQIDNO4的重鏈可變區(qū)⑶R2；(C)包含SEQIDNO7的重鏈可變區(qū)⑶R3；(d)包含SEQIDNO10的輕鏈可變區(qū)⑶Rl；(e)包含SEQIDNO13的輕鏈可變區(qū)⑶R2；和(f)包含SEQIDNO16的輕鏈可變區(qū)⑶R3。15.權利要求1所述的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO2的重鏈可變區(qū)⑶Rl；(b)包含SEQIDNO5的重鏈可變區(qū)⑶R2；(C)包含SEQIDNO8的重鏈可變區(qū)⑶R3；(d)包含SEQIDNO11的輕鏈可變區(qū)⑶Rl；(e)包含SEQIDNO14的輕鏈可變區(qū)⑶R2；和(f)包含SEQIDNO17的輕鏈可變區(qū)⑶R3。16.權利要求1所述的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO3的重鏈可變區(qū)⑶Rl；(b)包含SEQIDNO6的重鏈可變區(qū)⑶R2；(C)包含SEQIDNO9的重鏈可變區(qū)⑶R3；(d)包含SEQIDNO12的輕鏈可變區(qū)⑶Rl；(e)包含SEQIDNO15的輕鏈可變區(qū)⑶R2；和(f)包含SEQIDNO18的輕鏈可變區(qū)⑶R3。17.分離的單克隆抗體或其抗原結合部分，其包含(a)包含選自SEQIDNO19-21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(b)包含選自SEQIDNO22-24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)其中所述抗體特異性結合人間皮素蛋白。18.權利要求17所述的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO19的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO22的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。19.權利要求17所述的抗體，其包括(a)包含SEQIDNO20的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO23的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。20.權利要求17所述的抗體，其包含(a)包含SEQIDNO21的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和(b)包含SEQIDNO24的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。21.組合物，其包含權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分以及藥學上可接受的載體。22.抗體-配偶體分子連接物，其包含權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分以及配偶體分子，其中所述配偶體分子是治療劑。23.組合物，其包含權利要求22所述的抗體-配偶體分子連接物以及藥學上可接受的載體。24.權利要求22所述的抗體-配偶體分子連接物，其中所述治療劑是細胞毒素。25.組合物，其包含權利要求24所述的抗體-配偶體分子連接物和藥學上可接受的載體。26.權利要求22所述的抗體-配偶體分子連接物，其中所述治療劑是放射性同位素。27.組合物，其包含權利要求26所述的抗體-配偶體分子連接物和藥學上可接受的載體。28.分離的核酸分子，其編碼權利要求1所述的抗體或其抗原結合部分。29.表達載體，其包含權利要求28所述的核酸分子。30.宿主細胞，其包含權利要求29所述的表達載體。31.制備抗間皮素抗體的方法，其包括在權利要求30所述的宿主細胞中表達所述抗體并從所述宿主細胞分離所述抗體。32.抑制表達間皮素的腫瘤細胞生長的方法，其包括將所述表達間皮素的腫瘤細胞與權利要求1所述的抗體接觸，從而抑制所述表達間皮素的腫瘤細胞的生長。33.抑制表達間皮素的腫瘤細胞生長的方法，包括將所述表達間皮素的腫瘤細胞與權利要求22所述的抗體-配偶體分子連接物接觸，從而抑制所述表達間皮素的腫瘤細胞的生長。34.權利要求33所述的方法，其中所述治療劑是細胞毒素。35.權利要求32所述的方法，其中所述表達間皮素的腫瘤細胞是間皮瘤細胞、胰腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞、胃腫瘤細胞、肺腫瘤細胞或子宮內膜腫瘤細胞。36.權利要求32所述的方法，其中所述表達間皮素的腫瘤細胞來自選自下列的癌癥間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宮內膜樣粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食管腺癌、結腸直腸腺癌和乳腺癌。37.治療受試者癌癥的方法，包括對所述受試者施用權利要求1的抗體，從而治療所述受試者的癌癥。38.治療受試者癌癥的方法，包括對所述受試者施用權利要求22的抗體_配偶體分子，從而治療所述受試者的癌癥。39.權利要求38所述的方法，其中所述治療劑是細胞毒素。40.權利要求37所述的方法，其中所述癌癥是間皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌或子宮內膜癌。41.權利要求37所述的方法，其中所述癌癥選自間皮瘤、乳頭狀漿液性卵巢腺癌、透明細胞卵巢癌、混合Mullerian卵巢癌、子宮內膜樣粘液性卵巢癌、胰腺癌、胰腺導管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外膽管癌、胃腺癌、食管腺癌、結腸直腸腺癌和乳腺癌。42.制備抗間皮素抗體的方法，包括(a)提供(i)重鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO:1_3的⑶Rl序列、選自SEQIDNO4-6的CDR2序列和/或選自SEQIDNO:7_9的CDR3序列；和/或(ii)輕鏈可變區(qū)抗體序列，其包含選自SEQIDNO10-12的CDRl序列、選自SEQIDNO13-15的CDR2序列和/或選自SEQIDNO16-18的CDR3序列；(b)改變所述重鏈可變區(qū)抗體序列和/或所述輕鏈可變區(qū)抗體序列中至少一個氨基酸殘基，以產(chǎn)生至少一種改變的抗體序列；和(c)將所述改變的抗體序列表達為蛋白質。43.抗體-配偶體分子連接物，其包含連接到配偶體分子的權利要求1所述的抗體，其中所述配偶體分子通過化學接頭連接到所述抗體。44.權利要求45所述的抗體-配偶體分子連接物，其中所述化學接頭選自肽基接頭、胼接頭和二硫化物接頭。45.分離的抗間皮素抗體，其中所述抗體缺少巖藻糖殘基。46.權利要求45所述的抗體，其中所述抗體增強表達細胞表面間皮素的細胞的抗體依賴性細胞毒性。47.抑制表達間皮素的細胞生長的方法，包括將所述表達間皮素的細胞與權利要求46所述的抗體在足以誘導所述細胞的抗體依賴性細胞毒性的條件下接觸。48.權利要求47所述的方法，其中所述細胞是腫瘤細胞。49.權利要求47所述的方法，其中所述抗間皮素抗體是人抗體。50.抑制受試者中表達間皮素的腫瘤細胞生長的方法，包括以有效抑制所述受試者中所述表達間皮素的腫瘤細胞生長的量對所述受試者施用去巖藻糖基化的抗間皮素抗體。51.權利要求50所述的方法，其中所述抗間皮素抗體是人抗體。全文摘要本公開提供以高親和性特異性結合間皮素的分離的單克隆抗體，特別是人單克隆抗體。優(yōu)選地，所述抗體結合人間皮素。在某些實施方案中，所述抗體能夠內化入表達間皮素的細胞或能夠介導抗原依賴性細胞毒性。本發(fā)明進一步提供可以抑制間皮素結合卵巢癌抗原CA125的抗間皮素抗體。也提供編碼本公開抗體的核酸分子、表達載體、宿主細胞以及表達本公開抗體的方法。也提供抗體-配偶體分子連接物、雙特異性分子和包含本公開抗體的藥物組合物。本公開還提供檢測間皮素的方法以及使用本公開的抗間皮素抗體治療諸如間皮瘤、胰腺癌和卵巢癌的癌癥的方法。文檔編號C12P21/08GK101951946SQ200880110024公開日2011年1月19日申請日期2008年9月29日優(yōu)先權日2007年10月1日發(fā)明者B·陳,C·拉奧-納伊克,J·A·特雷特,K·托伊,L·楊,S·L·波格申請人:百時美施貴寶公司