專利名稱：活的減毒的枝原體菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新的抗細(xì)菌性病原體的疫苗。
背景技術(shù)：
枝原體(Mycoplasma)是屬于柔膜菌綱(Mollicutes)的小的原核生物(0.2至0.3μm)，柔膜菌綱的成員缺少細(xì)胞壁并且具有小基因組。柔膜菌綱包括至少100種枝原體。枝原體的種是人和非人動(dòng)物以及植物中幾種疾病的致病物(causative agent)。
在人類中，例如肺炎枝原體(M.pneumoniae)，是社區(qū)獲得性肺炎(非肺炎球菌細(xì)菌性肺炎)的主要病因。另一種人病原性枝原體，人型枝原體(M.hominis)與男性的泌尿生殖道和女性的上泌尿生殖道的病理狀況有關(guān)。人型枝原體被認(rèn)為是非淋球菌尿道炎，尿道前列腺炎(urethroprostatitis)，陰道炎，子宮內(nèi)膜炎，盆腔炎性疾病，宮頸炎，不孕，產(chǎn)后敗血癥，妊娠廢物(pregnancy wastage)，低出生體重和出生缺陷的病因。其他人病原性枝原體的種包括生殖道枝原體(M.genitalium)(牽涉關(guān)節(jié)炎，慢性非淋球菌尿道炎，慢性盆腔炎性疾病，其他泌尿生殖器感染，不孕和AIDS/HIV)，發(fā)酵枝原體(M.fermentans)(牽涉關(guān)節(jié)炎，海灣戰(zhàn)爭(zhēng)綜合癥，纖維肌痛，慢性疲勞綜合癥，狼瘡，AIDS/HIV，自身免疫疾病，ALS，銀屑病和硬皮病，Crohn′s和IBS，癌癥，內(nèi)分泌失調(diào)，多發(fā)性硬化和糖尿病)，唾液枝原體(M.salivarium)(牽涉關(guān)節(jié)炎，TMJ障礙，眼和耳的障礙和感染，牙齦炎和牙周病包括齲齒)，未識(shí)枝原體(M.incognitus)和穿透枝原體(M.penetrans)(牽涉AIDS/HIV，泌尿生殖器感染和疾病，和自身免疫障礙和疾病)，梨枝原體(M.pirum)(牽涉泌尿生殖器感染和疾病，和AIDS/HIV)，咽喉枝原體(M.faucium)，嗜脂枝原體(M.lipophilum)和頰枝原體(M.buccale)(牽涉齦溝和呼吸道的疾病)。
雞敗血枝原體(M.gallisepticum)和關(guān)節(jié)液枝原體(M.synoviae)造成家禽中顯著的疾病病狀。雞敗血枝原體，例如與雞和火雞的急性呼吸道疾病有關(guān)并且還可以引起獵禽的上呼吸道疾病。另外，雞敗血枝原體已經(jīng)被認(rèn)為是北美家雀結(jié)膜炎的病因。關(guān)于關(guān)節(jié)液枝原體，家禽被這個(gè)物種感染導(dǎo)致體重增加的減少和產(chǎn)蛋量降低。
在豬中，豬肺炎枝原體(M.hyopneumoniae)是枝原體肺炎的病原，導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)顯著的經(jīng)濟(jì)損失(由于重量增加的減少和低飼料轉(zhuǎn)化效率)。豬被豬肺炎枝原體感染導(dǎo)致慢性咳嗽，無(wú)光澤的皮毛，遲滯的生長(zhǎng)和不壯實(shí)的外觀(持續(xù)數(shù)周)。在受感染的動(dòng)物中觀察到紫色至灰色的實(shí)變區(qū)的特征性損害，特別是在腹部末端(ventral apical)和心葉中。
牛枝原體(M.bovis)是家養(yǎng)或集中飼養(yǎng)的牛和奶牛中的牛病原體。最經(jīng)常報(bào)告的臨床表現(xiàn)是小牛的肺炎，其經(jīng)常伴隨關(guān)節(jié)炎，又稱為肺炎-關(guān)節(jié)炎綜合癥。它的病因?qū)W作用還與母牛和公牛的乳腺炎，耳炎，和生殖疾病或障礙有關(guān)。
用于預(yù)防和控制由枝原體感染引起的疾病的有效的策略，是用枝原體細(xì)菌的活的減毒菌株進(jìn)行疫苗接種。通常，活的減毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)包括，將感染劑的所有相關(guān)免疫原性決定簇以其天然形式呈遞給宿主免疫系統(tǒng)，和需要相對(duì)小量的免疫劑(由于所述試劑在被接種的宿主中增殖的能力)。
活的減毒疫苗菌株通常通過(guò)在培養(yǎng)基中多次連續(xù)傳代毒株產(chǎn)生。雖然已經(jīng)通過(guò)連續(xù)傳代獲得抗某些枝原體物種的活的減毒疫苗菌株，但此類菌株通常很少在分子水平上進(jìn)行表征。據(jù)認(rèn)為，通過(guò)連續(xù)傳代產(chǎn)生的減毒菌株具有累積的突變，其使該微生物具有較少的毒力但仍能夠復(fù)制。然而關(guān)于減毒的枝原體菌株，導(dǎo)致減毒的突變的結(jié)果(例如，其表達(dá)模式在減毒菌株中發(fā)生改變的蛋白質(zhì)的身份(identity))通常是未知的。
因此，本領(lǐng)域需要新的活的減毒枝原體細(xì)菌，其已在蛋白質(zhì)組水平上進(jìn)行表征并且在疫苗制劑中是安全而有效的。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及活的減毒枝原體細(xì)菌，其相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌可以是任何枝原體物種。在特定的，非限制性示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供活的減毒雞敗血枝原體菌株，其相對(duì)于野生型雞敗血枝原體細(xì)菌，表現(xiàn)出丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35的降低的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌通過(guò)蛋白質(zhì)組分析表征為具有一種或多種上述蛋白的降低的表達(dá)。
本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌的疫苗組合物，和給動(dòng)物接種疫苗以抗枝原體感染的方法。
另外，本發(fā)明提供用于制備和/或鑒定減毒枝原體克隆的方法。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，本方法包括使枝原體細(xì)菌的初始群體(initialpopulation)經(jīng)歷減毒條件，測(cè)定單獨(dú)的克隆相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌的一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35，以及測(cè)試所述克隆的毒力。根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法產(chǎn)生的枝原體克隆將優(yōu)選表現(xiàn)出至少一種上述蛋白的降低的表達(dá)和降低的毒力(相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌)。
附圖簡(jiǎn)述
圖1是二維(2-D)聚丙烯酰胺凝膠的照片，其圖示減毒的雞敗血枝原體菌株MGx+47的蛋白斑點(diǎn)。編號(hào)19，49，74，108，114，127，147，166，175和225的畫圈的點(diǎn)對(duì)應(yīng)于在MGx+47中上調(diào)(相對(duì)于野生型菌株R-980)的蛋白。編號(hào)40，68，98，99，130，136和217的畫圈的點(diǎn)對(duì)應(yīng)于在MGx+47中下調(diào)(相對(duì)于野生型菌株R-980)的蛋白。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及適用于疫苗制劑的活的減毒枝原體細(xì)菌。本發(fā)明的枝原體細(xì)菌表現(xiàn)出一種或多種下述蛋白的降低的表達(dá)丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和/或核糖體蛋白L35，相對(duì)于這些蛋白在相同物種的野生型枝原體細(xì)菌中的表達(dá)。
枝原體物種 本發(fā)明部分基于新的活的減毒雞敗血枝原體疫苗菌株的驚人發(fā)現(xiàn)，其通過(guò)蛋白質(zhì)組分析證明具有降低的蛋白水平，所述蛋白例如丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。(參見本文實(shí)施例3)。本發(fā)明通過(guò)使用雞敗血枝原體的實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明；然而，丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35的降低的水平與細(xì)菌減毒有關(guān)的發(fā)現(xiàn)適用于枝原體的所有的種(由于這些蛋白質(zhì)在枝原體物種中的保守性)。
例如，雞敗血枝原體丙酮酸脫氫酶蛋白(又稱為AcoA)的同源物，特別地，在豬肺炎枝原體232，豬肺炎枝原體7448，豬肺炎枝原體J，M.florum，山羊枝原體山羊亞種(Mycoplasma capricolum subsp.capricolum)，生殖道枝原體，運(yùn)動(dòng)枝原體(Mycoplasma mobile)163K，蕈狀枝原體蕈狀亞種(Mycoplasma mycoides subsp.mycoides)SC，穿透枝原體，肺炎枝原體，肺枝原體(Mycoplasma pulmonis)和關(guān)節(jié)液枝原體中發(fā)現(xiàn)。
雞敗血枝原體的磷酸丙酮酸水合酶蛋白(又稱為Eno)的同源物，特別地，在豬肺炎枝原體232，豬肺炎枝原體7448，豬肺炎枝原體J，M.florum，山羊枝原體山羊亞種，生殖道枝原體，運(yùn)動(dòng)枝原體163K，蕈狀枝原體蕈狀亞種SC，穿透枝原體，肺炎枝原體，肺枝原體，關(guān)節(jié)液枝原體，洋蔥黃化植原體(Onion yellows phytoplasma)，解脲尿枝原體(Ureaplasma urealyticum)/微小尿枝原體(Ureaplasmaparvum)和翠菊黃化叢枝植原體(Aster yellows witches-broomphytoplasma)中發(fā)現(xiàn)。
雞敗血枝原體的2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶蛋白(又稱為DERA或DeoC)的同源物，特別地，在豬肺炎枝原體232，豬肺炎枝原體7448，豬肺炎枝原體J，M.florum，山羊枝原體山羊亞種，生殖道枝原體，運(yùn)動(dòng)枝原體163K，蕈狀枝原體蕈狀亞種SC，穿透枝原體，肺炎枝原體，肺枝原體，關(guān)節(jié)液枝原體，和解脲尿枝原體/微小尿枝原體中發(fā)現(xiàn)。
雞敗血枝原體核糖體蛋白L35蛋白(又稱為RpmI)的同源物，特別地，在豬肺炎枝原體232，豬肺炎枝原體7448，豬肺炎枝原體J，M.florum，生殖道枝原體，肺炎枝原體和肺枝原體中發(fā)現(xiàn)。
上文列出的同源物意欲是舉例說(shuō)明性的而不是窮舉的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，除上文所列的那些之外，枝原體物種中存在雞敗血枝原體AcoA，Eno，DeoC和/或RpmI的另外的同源物。
因?yàn)榇蠖鄶?shù)枝原體物種表達(dá)某種形式的丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35，并且因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)顯然在這些物種中提供同源的功能，因而這些蛋白的減少的表達(dá)是減毒枝原體菌株的限定性特征，如通過(guò)本文實(shí)施例中描述的減毒的雞敗血枝原體菌株例證的。
本發(fā)明的減毒枝原體細(xì)菌可以是任何枝原體物種。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，減毒的細(xì)菌來(lái)源于動(dòng)物病原性枝原體細(xì)菌。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)″動(dòng)物病原性枝原體細(xì)菌″指這樣的細(xì)菌，其野生型，非減毒狀態(tài)可以感染并且引起動(dòng)物的疾病和/或病恙(illness)。″動(dòng)物的疾病和/或病恙″包括動(dòng)物的不利的身體表現(xiàn)以及僅通過(guò)組織學(xué)、顯微鏡和/或分子診斷學(xué)指示的疾病或感染的臨床癥狀。
動(dòng)物病原性枝原體細(xì)菌包括人和非人病原性枝原體細(xì)菌。人病原性枝原體細(xì)菌包括但不限于，例如枝原體屬物種生殖道枝原體，發(fā)酵枝原體，唾液枝原體，人型枝原體，肺炎枝原體，未識(shí)枝原體，穿透枝原體，梨枝原體，咽喉枝原體，嗜脂枝原體和頰枝原體的細(xì)菌。非人病原性枝原體細(xì)菌包括例如鳥，豬，綿羊，牛，山羊或犬病原性枝原體細(xì)菌。鳥病原性枝原體細(xì)菌包括但不限于，例如枝原體屬物種陰溝枝原體(M.cloacale)，雞枝原體(M.gallinarum)，雞敗血枝原體，火雞枝原體(M.gallopavonis)，噬乙二醇枝原體(M.glycophilum)，不活躍枝原體(M.iners)，衣阿華枝原體(M.iowae)，生脂枝原體(M.lipofaciens)，火雞枝原體(M.meleagridis)和關(guān)節(jié)液枝原體的細(xì)菌。豬病原性枝原體細(xì)菌包括但不限于，例如枝原體屬物種絮狀枝原體(M.flocculare)，豬肺炎枝原體，豬鼻枝原體(M.hyorhinis)和豬關(guān)節(jié)液枝原體(M.hyosynoviae)的細(xì)菌。綿羊，牛，山羊或犬病原性枝原體細(xì)菌包括但不限于，例如枝原體屬物種山羊枝原體山羊亞種，山羊枝原體山羊肺亞種(M.capricolum subsp.capripneumoniae)，蕈狀枝原體蕈狀亞種LC，蕈狀枝原體山羊亞種(M.mycoides subsp.capri)，牛枝原體，牛眼枝原體(M.bovoculi)，犬枝原體(M.canis)，加利福尼亞枝原體(M.californicum)和殊異枝原體(M.dispar)的細(xì)菌。
枝原體蛋白的降低的表達(dá) 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)能夠確定減毒的枝原體細(xì)菌是否表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白在野生型枝原體細(xì)菌細(xì)胞中正常表達(dá)。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種方法確定減毒細(xì)菌是否相對(duì)于野生型細(xì)菌表現(xiàn)出特定的蛋白(例如丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶，核糖體蛋白L35等)的降低的表達(dá)。示例性的方法包括，例如定量的基于抗體的方法，例如蛋白質(zhì)印跡法，放射免疫測(cè)定(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)，其中使用檢測(cè)并且結(jié)合目的蛋白的抗體。另外，因?yàn)樾攀筊NA(mRNA)水平通常反映其編碼的蛋白的量，所以也可以使用定量的基于核酸的方法以確定減毒的枝原體細(xì)菌是否表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)。例如，可以使用定量的逆轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法以測(cè)量對(duì)應(yīng)于特定目的蛋白的mRNA的量。很多定量的基于核酸的方法是本領(lǐng)域公知的。
下述是非限定性示例性方法，其能夠用于確定減毒的枝原體細(xì)菌是否表現(xiàn)出例如磷酸丙酮酸水合酶的降低的表達(dá)。為了該示例性方法，假定枝原體細(xì)菌是雞敗血枝原體細(xì)菌，然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，該示例性方法同樣可以應(yīng)用于枝原體屬的所有物種并且可用于評(píng)估任何枝原體蛋白的相對(duì)表達(dá)。
首先，減毒的雞敗血枝原體細(xì)胞群和野生型雞敗血枝原體細(xì)胞群在基本上相同的條件下在基本上相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后，兩個(gè)細(xì)胞群經(jīng)歷細(xì)胞破碎條件。破碎的細(xì)胞(或其包含蛋白的級(jí)分)平行地經(jīng)歷SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并且經(jīng)歷蛋白質(zhì)印跡法(其使用與雞敗血枝原體磷酸丙酮酸水合酶蛋白結(jié)合的抗體(此類抗體可以用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法獲得))。然后使用標(biāo)記的二抗以提供可測(cè)量的信號(hào)，所述信號(hào)與來(lái)源于所述細(xì)胞的蛋白的量成正比。如果由減毒的雞敗血枝原體菌株表現(xiàn)的信號(hào)的量小于由野生型雞敗血枝原體菌株表現(xiàn)的信號(hào)的量，則可以推斷，減毒菌株相對(duì)于野生型菌株表現(xiàn)出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表達(dá)。該示例性方法的變體和其替代物對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。
本發(fā)明包括減毒的枝原體細(xì)菌，其表現(xiàn)出蛋白(例如丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶，核糖體蛋白L35等)表達(dá)的任何程度的減少(與野生型菌株中觀察到的該蛋白的表達(dá)相比)。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型細(xì)菌，減毒的細(xì)菌表現(xiàn)出蛋白表達(dá)減少至少約5％。例如，如果給定量的野生型枝原體菌株表現(xiàn)出100單位的特定蛋白的表達(dá)并且相同量的相同物種的候選減毒枝原體菌株表現(xiàn)出95單位的所述蛋白的表達(dá)，則推斷，相對(duì)于野生型細(xì)菌，所述減毒菌株表現(xiàn)出所述蛋白表達(dá)減少5％(計(jì)算″表達(dá)減少的百分比″的其他實(shí)例在本文的其他地方闡明)。在某些其他的實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型枝原體細(xì)菌，減毒的細(xì)菌表現(xiàn)出所述蛋白的表達(dá)減少至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在其他的實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型枝原體細(xì)菌，減毒的枝原體菌株表現(xiàn)出不表達(dá)所述蛋白(即表達(dá)減少100％)。
在本發(fā)明的某些示例性實(shí)施方案中，相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌，減毒的細(xì)菌表現(xiàn)出一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少5％，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。
如本文所用的，由減毒的枝原體菌株表現(xiàn)的特定蛋白的″表達(dá)減少的百分比″(相對(duì)于野生型菌株)通過(guò)下式計(jì)算(A-B)/Ax100；其中A＝野生型枝原體菌株中所述蛋白的表達(dá)的相對(duì)水平；并且B＝減毒菌株中所述蛋白的表達(dá)的相對(duì)水平。僅僅用于舉例說(shuō)明，如果野生型枝原體菌株表現(xiàn)出0.2500單位的蛋白″Y″的表達(dá)，并且枝原體減毒菌株表現(xiàn)出0.1850單位的蛋白″Y″的表達(dá)，則所述減毒菌株稱為相對(duì)于野生型菌株，表現(xiàn)出蛋白″Y″的表達(dá)減少[(0.2500-0.1850)/0.2500×100]＝26％。本文實(shí)施例3中的表5提供計(jì)算示例性雞敗血枝原體減毒菌株相對(duì)于野生型雞敗血枝原體菌株的表達(dá)減少的百分比的另外的說(shuō)明性實(shí)例。
疫苗組合物 本發(fā)明還包括疫苗組合物，所述疫苗組合物包含本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的，表達(dá)″本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌″包括任何活的減毒枝原體細(xì)菌，其在本文其它地方描述和/或要求保護(hù)。藥學(xué)上可接受的載體可以是例如水，穩(wěn)定劑，防腐劑，培養(yǎng)基或緩沖劑。包含本發(fā)明的減毒的枝原體細(xì)菌的疫苗制劑可以以懸浮液形式或凍干形式或可選地以冷凍形式配制。如果是冷凍的，則可以添加甘油或其他相似的試劑以在冷凍時(shí)增強(qiáng)穩(wěn)定性。
給動(dòng)物接種疫苗的方法 本發(fā)明還包括給動(dòng)物接種疫苗以抗枝原體感染的方法。根據(jù)本發(fā)明的這一方面的方法包括對(duì)動(dòng)物施用免疫有效量的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌。如本文所用的，表達(dá)″本發(fā)明的活的減毒枝原體細(xì)菌″包括任何活的減毒枝原體細(xì)菌，其在本文其它地方描述和/或要求保護(hù)。表述″免疫有效量″指接種時(shí)引起動(dòng)物中產(chǎn)生保護(hù)水平的抗體所需要的疫苗組合物的量。疫苗組合物可以以本領(lǐng)域已知的任何方式施用給動(dòng)物，包括口服，鼻內(nèi)，粘膜，局部，透皮，和胃腸外(例如靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮內(nèi)，皮下或肌內(nèi))途徑。還可以用無(wú)針遞送裝置進(jìn)行施用?？梢杂媒M合途徑進(jìn)行施用，例如首先用胃腸外途徑施用，隨后用粘膜途徑施用等。
在其中活的減毒枝原體細(xì)菌是鳥病原性枝原體細(xì)菌例如雞敗血枝原體細(xì)菌的本發(fā)明的實(shí)施方案中，對(duì)其施用所述減毒細(xì)菌的動(dòng)物優(yōu)選是鳥類，例如雞或火雞。當(dāng)所述動(dòng)物是鳥類時(shí)，可以施用本發(fā)明的疫苗制劑以使制劑立即或最終與鳥類的呼吸粘膜接觸。因此，疫苗制劑可以例如鼻內(nèi)，口服和/或眼內(nèi)施用給鳥類。用于鳥施用的疫苗組合物可以如上所述進(jìn)行配制和/或配制為適于通過(guò)噴霧施用的形式，包括氣溶膠(用于鼻內(nèi)施用)或在飲用水中(用于口服施用)。
通過(guò)將活的減毒枝原體細(xì)菌摻入小的液體顆粒中來(lái)配制本發(fā)明的通過(guò)噴霧或氣溶膠施用的疫苗組合物。所述顆?？梢跃哂屑s10μm至約100μm的初始液滴大小?？梢酝ㄟ^(guò)例如常規(guī)噴霧器和氣溶膠發(fā)生器，包括商業(yè)可獲得的用于背負(fù)式噴霧，孵化場(chǎng)噴霧和原子噴霧(atomist spray)的噴霧發(fā)生器來(lái)產(chǎn)生這樣的顆粒。
用于制備減毒枝原體克隆的方法 在本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于鑒定和/或制備減毒枝原體克隆的方法。根據(jù)本發(fā)明的這一方面的方法包括使枝原體細(xì)菌的初始群體經(jīng)歷減毒條件，從而產(chǎn)生推定減毒的細(xì)菌群體。然后，測(cè)定推定減毒的細(xì)菌群體的單獨(dú)的克隆相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌的一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶，核糖體蛋白L35。然后測(cè)試被鑒定為具有一種或多種上述蛋白的降低的表達(dá)的克隆的毒力。表現(xiàn)出一種或多種上述蛋白的降低的表達(dá)和降低的毒力(相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌)的克隆被鑒定為減毒枝原體克隆。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面，″枝原體細(xì)菌的初始群體″可以是任何量的枝原體細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，細(xì)菌是野生型細(xì)菌?？蛇x地，細(xì)菌可以包含一個(gè)或多個(gè)突變。然而，優(yōu)選地，初始群體中的細(xì)菌是克隆同一的(clonally identical)或基本上克隆同一的；即細(xì)菌優(yōu)選全部來(lái)源于單個(gè)親本枝原體細(xì)菌細(xì)胞和/或具有相同的或基本上相同的基因型和/或表型特征。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)″減毒條件″指具有將一個(gè)或多個(gè)遺傳改變(例如核苷酸突變)引入枝原體細(xì)菌基因組的潛力的任何條件或條件的組合。示例性非限定性減毒條件包括例如在培養(yǎng)物中傳代細(xì)菌，用可插入基因組的基因元件例如轉(zhuǎn)座子(例如隨機(jī)插入枝原體基因組的轉(zhuǎn)座子)轉(zhuǎn)化細(xì)菌，將細(xì)菌暴露于一種或多種誘變劑(例如化學(xué)誘變劑或紫外線)等。當(dāng)通過(guò)體外傳代減毒細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞可以體外傳代任意次，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40或更多次。
在經(jīng)歷減毒條件后，枝原體細(xì)胞的初始群體在本文稱為推定減毒的細(xì)菌群體?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)技術(shù)(包括例如連續(xù)稀釋細(xì)胞并且挑出單個(gè)細(xì)胞接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上)來(lái)獲得推定減毒的細(xì)菌群體的單獨(dú)的克隆。在獲得后，就一種或多種指定蛋白的降低的表達(dá)測(cè)定推定減毒的細(xì)菌群體的單獨(dú)的克隆。用于確定減毒枝原體細(xì)菌是否表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)的方法在本文其它地方描述，所述的蛋白在野生型枝原體細(xì)菌細(xì)胞中正常表達(dá)。示例性方法包括例如基于RT-PCR的方法，蛋白質(zhì)印跡等。
可以通過(guò)將克隆施用給對(duì)野生型(未減毒的)細(xì)菌的感染易感的動(dòng)物來(lái)測(cè)試鑒定為具有一種或多種蛋白(例如丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶，核糖體蛋白L35)的降低的表達(dá)的單獨(dú)的克隆的毒力。如本文所用的，″對(duì)野生型枝原體細(xì)菌的感染易感的動(dòng)物″是用野生型枝原體細(xì)菌攻擊后展示至少一種臨床癥狀的動(dòng)物。所述癥狀是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。例如，在表現(xiàn)出降低的例如丙酮酸脫氫酶的表達(dá)的推定減毒的雞敗血枝原體菌株的情況下，所述菌株可以施用給例如火雞或雞(其通常對(duì)野生型雞敗血枝原體的感染易感)。家禽動(dòng)物的雞敗血枝原體感染的臨床癥狀包括，例如急性呼吸癥狀，心包炎，肝周炎，肺泡炎(air sacculitis)，氣管增厚，減少的體重增加，纖毛脫落(deciliation)，異常杯狀細(xì)胞，毛細(xì)管擴(kuò)張，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和/或異嗜白細(xì)胞的數(shù)量增加，和在某些情況下產(chǎn)蛋量降低。因此，如果推定減毒的雞敗血枝原體菌株施用給雞或火雞時(shí)導(dǎo)致與感染野生型雞敗血枝原體菌株的火雞或雞相比，較少和/或較不嚴(yán)重的癥狀，則推定減毒的雞敗血枝原體菌株被認(rèn)為具有″降低的毒力″。任何程度的癥狀的減輕將推定減毒的菌株鑒定為具有降低的毒力。在某些實(shí)施方案中，推定減毒的菌株是無(wú)毒力的。
根據(jù)本發(fā)明，表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)且表現(xiàn)出降低的毒力(相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌)的枝原體克隆是減毒枝原體克隆，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。
下列實(shí)施例舉例說(shuō)明而非限定本發(fā)明的方法和組合物。通常在分子生物學(xué)和化學(xué)中遇到的條件和參數(shù)的種種其他適當(dāng)?shù)母淖兒托薷?鑒于本公開內(nèi)容，其對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的)，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
實(shí)施例 實(shí)施例1 活的減毒雞敗血枝原體菌株的產(chǎn)生 通過(guò)體外傳代野生型雞敗血枝原體菌株R980多次來(lái)產(chǎn)生新的活的減毒雞敗血枝原體菌株。特別地，將0.1mL野生型雞敗血枝原體菌株R-980的種子材料接種到20mL改良的Frey′s培養(yǎng)基中(Frey等，Am.J.Vet.Res.292163-2171(1968)(本文中也稱為″MG培養(yǎng)基″)。培養(yǎng)野生型細(xì)胞直到培養(yǎng)基的顏色變?yōu)榱咙S色。隨后，亮黃色的培養(yǎng)物用于再接種如上所述的新鮮MG培養(yǎng)基。以這種方式總共傳代培養(yǎng)物47次。通過(guò)給多組鳥接種疫苗然后用野生型雞敗血枝原體攻擊，就減毒測(cè)試所得到的菌株。攻擊兩周后尸檢(necropsized)所有的鳥，觀察到枝原體相關(guān)病理。高傳代的菌株(x+47)提供抗與雞敗血枝原體感染相關(guān)的臨床癥狀的保護(hù)。命名為MGx+47的減毒雞敗血枝原體菌株(也稱為″MG-P48″)于2007年6月19日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108并且賦予登錄號(hào)PTA-8485。
實(shí)施例2 活的減毒雞敗血枝原體疫苗在雞中的安全性和功效的評(píng)估 在本實(shí)施例中，在雞中評(píng)估實(shí)施例1中獲得的新的雞敗血枝原體疫苗菌株MGx+47的安全性和功效。
71只SPF白色來(lái)亨雞(leghorn chicken)被分成如下七組 表1研究設(shè)計(jì) 以3.62×107CCU/mL/只用減毒菌株MGx+47接種組2，3，4a，4b和4c中的雞，通過(guò)在4周齡時(shí)粗噴施用。以7.74×105CCU/mL用0.5mL雞敗血枝原體菌株R氣管內(nèi)(IT)攻擊7周齡的組1和3中的雞。在9周齡時(shí)尸檢組1，2，3和5中的雞，并且分別在疫苗接種后第7，14和21天(DPV)尸檢組4a，4b和4c的雞。就平均體重增加，心包炎，肝周炎，肺泡炎和氣管炎對(duì)雞進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果在表2中概括。
表2安全性和功效概要 疫苗接種＝3.62×107CFU/mL/只 攻擊＝0.5mL(以7.74×105CFU/mL) 表3安全性表福爾馬林固定的來(lái)自單獨(dú)的疫苗接種/未攻擊的雞(組4a，4b和4c)的雞氣管的組織學(xué)報(bào)告
表4功效表福爾馬林固定的來(lái)自單獨(dú)的雞的雞氣管的組織學(xué)報(bào)告
安全性和功效表(表3和4)的關(guān)鍵詞 ●所有″接種疫苗的″鳥以3.62×107CCU/mL/只用疫苗菌株MGx+47通過(guò)粗噴接種疫苗； ●所有″被攻擊的″鳥以7.74×105CCU/mL用0.5mL雞敗血枝原體菌株R進(jìn)行氣管內(nèi)(IT)攻擊。
●時(shí)間點(diǎn)(在表3安全性表中)＝雞被檢查時(shí)的疫苗接種后的天數(shù)，表示為疫苗接種后#天(DPV)。
●纖毛″N ″＝正常纖毛；″-″＝纖毛脫落； ●杯狀細(xì)胞/M(″-″＝正常杯狀細(xì)胞；″+″＝粘液處于呼吸面上)； ●毛細(xì)管擴(kuò)張(″-″＝?jīng)]有擴(kuò)張或炎癥；″+″＝中度的毛細(xì)管擴(kuò)張或炎癥；″++″＝嚴(yán)重的毛細(xì)管擴(kuò)張或炎癥)； ●LC/PC＝淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(″-″＝?jīng)]有；″+″＝幾乎沒(méi)有； ″++++″＝很多)； ●PMN＝異嗜白細(xì)胞(″-″＝?jīng)]有；″+″＝幾乎沒(méi)有；″++++″-很多)； 組2的雞(接種疫苗但未被攻擊)的組織學(xué)分析與組5的雞(未接種疫苗且未被攻擊)的組織學(xué)分析基本上相似，表明新產(chǎn)生的MGx+47疫苗菌株的安全性。(參見例如上文表2)。
關(guān)于功效，組3的雞(接種疫苗并被攻擊)展示與組1的雞(未接種疫苗但被攻擊)相比顯著降低的肺泡炎。(參見例如表2和4)。另外，如表4中舉例說(shuō)明的，組3的雞表現(xiàn)出更少的關(guān)于纖毛，杯狀細(xì)胞，毛細(xì)管擴(kuò)張，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞(LC/PC)，異嗜白細(xì)胞(PMN)和氣管厚度的雞敗血枝原體感染的組織學(xué)癥狀(參見表4)。
因此，本實(shí)施例證明MGx+47是安全的并且有效的活的減毒雞敗血枝原體疫苗菌株。
實(shí)施例3 MGX+47疫苗菌株的蛋白質(zhì)組特征 為了更精確地在分子水平上定義MGx+47疫苗菌株(參見實(shí)施例1和2)，對(duì)該菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。
在本實(shí)施例中，從野生型雞敗血枝原體菌株R-980和新鑒定的疫苗菌株MGx+47中分離總蛋白。通過(guò)2維聚丙烯酰胺凝膠電泳然后通過(guò)計(jì)算機(jī)分析凝膠圖像而分辨來(lái)自各個(gè)菌株的蛋白。(參見圖1)。鑒定在疫苗菌株中差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)。從凝膠中切除與野生型菌株相比在疫苗菌株中不存在的或以顯著降低的水平表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)。
鑒定出5個(gè)點(diǎn)，其與野生型雞敗血枝原體相比在MGx+47疫苗菌株中以顯著更低的水平表達(dá)。從凝膠切除各個(gè)所述蛋白斑點(diǎn)并進(jìn)行酶促消化。然后用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-TOFMS)得到肽質(zhì)譜指紋。將各個(gè)蛋白斑點(diǎn)的鑒定的質(zhì)譜與肽質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較以鑒定所述蛋白和編碼它們的相應(yīng)基因。該分析的結(jié)果在下表中概括 表5MGx+47的蛋白質(zhì)組分析的概要 基因產(chǎn)物表達(dá)的減少還可以表示為″表達(dá)的倍數(shù)減少″。例如，在表5中，菌株MGx+47可以被稱為表現(xiàn)出acoA，eno，deoC，rpmI和MGA_0621的表達(dá)分別減少2.2，3.9，1.7，4.5和5.4倍(相對(duì)于野生型MG)。
如表5中指出的，鑒定出5種基因產(chǎn)物，其在活的減毒MGx+47疫苗菌株中與野生型R-980菌株相比具有顯著降低的表達(dá)AcoA，Eno，DeoC，RmpI和MGA_0621(鑒定的假定蛋白，NCBI登錄號(hào)NP_852784)。重要的是，這些基因中的三種(acoA，eno和deoC)編碼參與代謝/能量產(chǎn)生途徑的蛋白。另外，在大多數(shù)枝原體物種中發(fā)現(xiàn)了AcoA，Eno，DeoC和RpmI的同源物，有力地表明一種或多種這些基因產(chǎn)物的下調(diào)可能是使枝原體減毒的一般策略。
*** 雖然為了清楚地理解，前述發(fā)明已經(jīng)通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例進(jìn)行了相當(dāng)詳細(xì)的描述，但本發(fā)明不限于所公開的特定實(shí)施方案，而意欲覆蓋在本發(fā)明的精神和范圍(如通過(guò)所附權(quán)利要求書所定義的)內(nèi)的所有的變化和修飾。
在本說(shuō)明書中提到的所有出版物和專利表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員的技術(shù)水平。所有的出版物和專利通過(guò)引用并入本文，如同每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)明確且單獨(dú)地被指明通過(guò)引用并入。
權(quán)利要求
1.活的減毒枝原體細(xì)菌，其相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌，表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。
2.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌來(lái)源于動(dòng)物病原性枝原體細(xì)菌。
3.權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中所述動(dòng)物病原性枝原體細(xì)菌是人病原性枝原體細(xì)菌。
4.權(quán)利要求3的細(xì)菌，其中所述人病原性枝原體細(xì)菌是選自生殖道枝原體(M.genitalium)，發(fā)酵枝原體(M.fermentans)，唾液枝原體(M.salivarium)，人型枝原體(M.hominis)，肺炎枝原體(M.pneumonia)，未識(shí)枝原體(M.incognitus)，穿透枝原體(M.penetrans)，梨枝原體(M.pirum)，咽喉枝原體(M.faucium)，嗜脂枝原體(M.lipophilum)和頰枝原體(M.buccale)的物種的細(xì)菌。
5.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌來(lái)源于非人病原性枝原體細(xì)菌。
6.權(quán)利要求5的細(xì)菌，其中所述非人病原性細(xì)菌是鳥病原性枝原體細(xì)菌。
7.權(quán)利要求6的細(xì)菌，其中所述鳥病原性枝原體細(xì)菌是選自陰溝枝原體(M.cloacale)，雞枝原體(M.gallinarum)，雞敗血枝原體(M.gallisepticum)，火雞枝原體(M.gallopavonis)，噬乙二醇枝原體(M.glycophilum)，不活躍枝原體(M.iners)，衣阿華枝原體(M.iowae)，生脂枝原體(M.lipofaciens)，火雞枝原體(M.meleagridis)和關(guān)節(jié)液枝原體(M.synoviae)的物種的細(xì)菌。
8.權(quán)利要求5的細(xì)菌，其中所述非人病原性細(xì)菌是豬病原性枝原體細(xì)菌。
9.權(quán)利要求8的細(xì)菌，其中所述豬病原性枝原體細(xì)菌是選自絮狀枝原體(M.flocculare)，豬肺炎枝原體(M.hyopneumoniae)，豬鼻枝原體(M.hyorhinis)和豬關(guān)節(jié)液枝原體(M.hyosynoviae)的物種的細(xì)菌。
10.權(quán)利要求5的細(xì)菌，其中所述非人病原性細(xì)菌是綿羊，牛，山羊或犬病原性枝原體細(xì)菌。
11.權(quán)利要求10的細(xì)菌，其中所述綿羊，牛，山羊或犬病原性枝原體細(xì)菌是選自山羊枝原體山羊亞種(M.capricolum subsp.capricolum)，山羊枝原體山羊肺亞種(M.capricolum subsp.capripneumoniae)，蕈狀枝原體蕈狀亞種(M.mycoides subsp.mycoides)LC，蕈狀枝原體山羊亞種(M.mycoides subsp.capri)，牛枝原體(M.bovis)，牛眼枝原體(M.bovoculi)，犬枝原體(M.canis)，加利福尼亞枝原體(M.californicum)和殊異枝原體(M.dispar)的物種的細(xì)菌。
12.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌相對(duì)于所述野生型細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少25％。
13.權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌相對(duì)于所述野生型細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少50％。
14.權(quán)利要求3的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌相對(duì)于所述野生型細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少75％。
15.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的丙酮酸脫氫酶的表達(dá)。
16.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表達(dá)。
17.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶的表達(dá)。
18.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的核糖體蛋白L35的表達(dá)。
19.權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35的降低的表達(dá)。
20.疫苗組合物，其包含
(a)活的減毒枝原體細(xì)菌，其相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌，表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35；和
(b)藥學(xué)上可接受的載體。
21.權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中相對(duì)于所述野生型細(xì)菌，所述細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少25％。
22.權(quán)利要求21的疫苗組合物，其中相對(duì)于所述野生型細(xì)菌，所述細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少50％。
23.權(quán)利要求22的疫苗組合物，其中相對(duì)于所述野生型細(xì)菌，所述細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少75％。
24.權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的丙酮酸脫氫酶的表達(dá)。
25.權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表達(dá)。
26.權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶的表達(dá)。
27.權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的核糖體蛋白L35的表達(dá)。
28.權(quán)利要求20的疫苗組合物，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35的降低的表達(dá)。
29.一種給動(dòng)物接種疫苗以抗枝原體感染的方法，所述方法包括給動(dòng)物施用免疫有效量的疫苗組合物，所述疫苗組合物包含活的減毒枝原體細(xì)菌，所述枝原體細(xì)菌相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌具有降低的一種或多種蛋白的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。
30.權(quán)利要求29的方法，其中相對(duì)于所述野生型細(xì)菌，所述細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少25％。
31.權(quán)利要求30的方法，其中相對(duì)于所述野生型細(xì)菌，所述細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少50％。
32.權(quán)利要求31的方法，其中相對(duì)于所述野生型細(xì)菌，所述細(xì)菌表現(xiàn)出所述一種或多種蛋白的表達(dá)減少至少75％。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的丙酮酸脫氫酶的表達(dá)。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的磷酸丙酮酸水合酶的表達(dá)。
35.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶的表達(dá)。
36.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出降低的核糖體蛋白L35的表達(dá)。
37.權(quán)利要求29的方法，其中所述細(xì)菌表現(xiàn)出丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35的降低的表達(dá)。
38.一種用于鑒定減毒的枝原體克隆的方法，所述方法包括
(a)使枝原體細(xì)菌的初始群體經(jīng)歷減毒條件，從而產(chǎn)生推定減毒的細(xì)菌群體；和
(b)測(cè)定所述推定減毒的細(xì)菌群體的單獨(dú)的克隆相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌的一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35；和
(c)測(cè)試在(b)中鑒定為具有降低的所述一種或多種蛋白的表達(dá)的克隆的毒力；
其中相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌表現(xiàn)出降低的所述一種或多種蛋白的表達(dá)和降低的毒力的枝原體克隆是減毒的枝原體克隆。
39.權(quán)利要求38的方法，其中(a)所述的減毒條件包括在體外傳代所述枝原體細(xì)菌的初始群體至少2次。
40.權(quán)利要求39的方法，其中(a)所述的減毒條件包括在體外傳代所述枝原體細(xì)菌的初始群體至少5次。
41.權(quán)利要求40的方法，其中(a)所述的減毒條件包括在體外傳代所述枝原體細(xì)菌的初始群體至少10次。
42.權(quán)利要求38的方法，其中(a)所述的減毒條件包括用隨機(jī)插入枝原體基因組的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化所述枝原體細(xì)菌的初始群體。
43.權(quán)利要求38的方法，其中(a)所述的減毒條件包括將所述枝原體細(xì)菌的初始群體暴露于化學(xué)誘變劑或紫外線。
44.權(quán)利要求38的方法，其中在(b)中通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)就所述一種或多種蛋白的降低的表達(dá)測(cè)定所述推定減毒的細(xì)菌群體的所述單獨(dú)的克隆。
45.權(quán)利要求38的方法，其中在(b)中通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法就所述一種或多種蛋白的降低的表達(dá)測(cè)定所述推定減毒的細(xì)菌群體的所述單獨(dú)的克隆。
46.權(quán)利要求38的方法，其中在(c)中通過(guò)下述測(cè)試(b)中鑒定的所述克隆的毒力將一種或多種所述克隆施用給對(duì)所述野生型枝原體細(xì)菌的感染易感的動(dòng)物，并且在施用所述一種或多種克隆后將在所述動(dòng)物中觀察到的臨床癥狀與未施用所述克隆的對(duì)照動(dòng)物的臨床癥狀進(jìn)行比較。
47.權(quán)利要求29的方法，其中所述疫苗組合物通過(guò)直接注射，噴霧施用或飲用水施用施用給所述動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供活的減毒枝原體細(xì)菌，其相對(duì)于相同物種的野生型枝原體細(xì)菌，表現(xiàn)出一種或多種蛋白的降低的表達(dá)，所述蛋白選自丙酮酸脫氫酶，磷酸丙酮酸水合酶，2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶和核糖體蛋白L35。還提供了疫苗和疫苗接種方法(其包括使用所述活的減毒枝原體細(xì)菌)，以及用于制備活的減毒枝原體細(xì)菌的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101820902SQ200880111517
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者M·庫(kù)瑪, M·A·卡恩 申請(qǐng)人:惠氏有限責(zé)任公司