專利名稱：：用于發(fā)酵的酶摻和物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及包括葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶的酶摻和物。本發(fā)明也涉及在淀粉轉(zhuǎn)化工藝中利用該酶摻和物的方法，例如用于生產(chǎn)終產(chǎn)物如乙醇。
背景技術(shù)：
：工業(yè)發(fā)酵主要使用葡萄糖作為生產(chǎn)諸如酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、糖醇、藥物和其它生物化學(xué)品的大量終產(chǎn)物的原料。在許多應(yīng)用中，從包括淀粉和纖維素的底物(例如全研磨谷類谷粒)的酶促轉(zhuǎn)化來生產(chǎn)葡萄糖。淀粉包括兩種多糖部分，直鏈淀粉和支鏈淀粉，該淀粉作為粒狀顆粒儲(chǔ)藏在植物細(xì)胞中。這些顆粒的部分結(jié)晶結(jié)構(gòu)在冷水中引起不溶性，并且導(dǎo)致淀粉顆粒在水中的溶解通常需要熱能以破壞該顆粒的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。已經(jīng)將多種工藝用于淀粉溶解并且這些包括直接和間接加熱包括顆粒淀粉的底物(參見例如，STARCHCHEMISTRYANDTECHNOLOGY，R.L.Whistler等人編，第二版，1984AcademicPressInc.，OrlandoFLandSTARCHCONVERSIONTECHNOLOGY,G.M.A.VanBeynum等人編，F(xiàn)oodScienceandTechnologySeries1985MarcelDekkerInc.NY)。淀粉向葡萄糖的加工通常由兩步組成并且這些步驟包括淀粉的液化和對(duì)液化后的淀粉的糖化作用。進(jìn)一步的步驟可以包括(a)當(dāng)想要的終產(chǎn)物是純化的葡萄糖或果糖時(shí)的純化和異構(gòu)化或者(b)當(dāng)想要的底物是例如醇(如乙醇)時(shí)的發(fā)酵和蒸餾。淀粉液化工藝的一個(gè)目的是將淀粉聚合物顆粒的漿液轉(zhuǎn)化成低粘度的較短鏈長度糊精溶液。這對(duì)于方便地操作用于淀粉轉(zhuǎn)化工藝的工業(yè)設(shè)備是重要的步驟。通常，通過使用高溫和酶促生物轉(zhuǎn)化來液化淀粉。例如，通常的酶促液化工藝包括向包括底物(包括淀粉)的漿液中加入耐熱細(xì)菌α淀粉酶(例如SPEZYMEPRIME和SPEZYMEFRED,SPEZYMEETHYL(DaniscoU.S.,Inc,GenencorDivision)或TERMAMYLSC,TERMAMYLSUPRA或TERMANYL120L(Novozymes))并將pH調(diào)至5.5至6.5之間以及溫度大于90°C。淀粉被液化然后經(jīng)歷糖化酶的作用。通常，糖化作用在葡糖淀粉酶如來自黑曲霉(Aspergillusniger)(例如，OPTIDEXL-400(GenencorInternationalInc.))的葡糖淀粉酶存在下，在比液化步驟的PH更加酸性的pH下發(fā)生。存在對(duì)于淀粉底物的液化和糖化的多種變化。然而，需要用于淀粉液化、糖化和發(fā)酵的更有效的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括葡糖淀粉酶(GA)、酸性真菌蛋白酶(AFP)以及酸穩(wěn)定的α淀粉酶(AA)的酶摻和物組合物。優(yōu)選地，葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶的比率為約11.50.1至約181，或120.2至150.6，如由GAUSSUSAPU所測(cè)。該酶摻和物組合物用于從可發(fā)酵的糖生產(chǎn)終產(chǎn)物，尤其是用于由液化物(Iiquefact)生產(chǎn)乙醇。該酶摻和物組合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于相對(duì)于單獨(dú)由葡糖淀粉酶在基本相同的條件下生產(chǎn)的乙醇量，該組合物產(chǎn)生更大量的乙醇。在一個(gè)方面，相對(duì)于單獨(dú)的GA，該增加大于0.5%，包括大于1.O0AA.5%、2%和2.5%。在一個(gè)方面，GA獲自選自由木霉屬(Trichodermaspp·)、籃狀菌屬(Taleromycesspp.)、青霉菌屬(Penicilliumspp.)、曲霉菌屬(Aspergillusspp.)禾口腐質(zhì)霉屬(Humicolaspp)組成組的絲狀真菌。在再一方面，葡糖淀粉酶與具有SEQIDN0:1序列的葡糖淀粉酶有至少90%的序列同一性，和/或AFP與具有SEQIDNO14序列的AFP有至少90%的序列同一性，和/或α淀粉酶與具有SEQIDNO5序列的AA有至少90%的序列同一性，和/或α淀粉酶與具有SEQIDNO:5序列的AA有至少95%的序列同一性。酶摻和物組合物任選地包括一種或多種其他的酶，例如第二種葡糖淀粉酶、第二種α淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、第二種蛋白酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、β-淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、β“葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、環(huán)糊精轉(zhuǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶、和它們的組合。本發(fā)明還涉及從可發(fā)酵的糖生產(chǎn)諸如醇的終產(chǎn)物的方法。該方法包括步驟(a)將包括含淀粉的研磨谷粒的漿液與α淀粉酶接觸以生產(chǎn)液化物；(b)將該液化物與葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶相接觸以生產(chǎn)可發(fā)酵的糖；和(C)在發(fā)酵生物存在下，將可發(fā)酵的糖發(fā)酵以生產(chǎn)終產(chǎn)物。該方法中，步驟(b)的糖化作用和步驟(C)發(fā)酵可以順序發(fā)生或者同時(shí)發(fā)生?？梢詫⑵咸堑矸勖?、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶分別加入液化物?；蛘?，將包括葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶的酶摻和物組合物加入液化物。任選地，在工藝期間使用至少一種其他酶，例如α淀粉酶、葡糖淀粉酶、植酸酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、蛋白酶或漆酶。附圖簡要說明圖1示出在使用按實(shí)施例2中進(jìn)一步描述所液化的完全磨過的玉米進(jìn)行同時(shí)糖化/發(fā)酵期間，使用不同的酶摻和物獲得的最終醇濃度。Y軸是乙醇％作八)，乂軸如下1.TrGA,0.25GAU/gds玉米，2.#1+0.05SAPUAFP/gds玉米，3.#1+2.OSSUa淀粉酶/gds玉米，4.No.1+0.05SAPU,AFP+2.0SSUα淀粉酶/gds玉米。發(fā)明詳細(xì)說明定義除非本文另有說明，否則本文使用的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的普通理解相同的含義。Singleton等人，DICTI0NARY0FMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，第二版，JohnffileyandSons,NewYork(1994)，和Hale&Markham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,N.Y.(1991)向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本文所用的許多術(shù)語的一般含義。另外，出于清楚和易于參考的目的，下面定義了一些術(shù)語。"α淀粉酶”是α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(Ε.C.3.2.1.1)并且是切割或水解淀粉(例如支鏈淀粉或直鏈淀粉聚合物)中內(nèi)部α-1，4_糖苷鍵的酶。術(shù)語“低于凝膠化溫度”指小于凝膠化溫度的溫度。術(shù)語“DE”或“葡萄糖當(dāng)量”是以基于干重的D-葡萄糖所計(jì)算，用于測(cè)量總還原糖的濃度的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。未水解的顆粒淀粉具有基本上為0的DE并且D-葡萄糖具有DE為100?！昂笔瞧咸烟堑亩替溇酆衔?例如2至10個(gè)單元)。術(shù)語“干物質(zhì)(ds)”指基于干重，以％表示的漿液的總固體。術(shù)語“終產(chǎn)物”指任何從可發(fā)酵底物酶促轉(zhuǎn)化的源自碳源的產(chǎn)物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，終產(chǎn)物是醇(例如乙醇)。如本文所使用，術(shù)語“乙醇生產(chǎn)者”或“生產(chǎn)乙醇的微生物”指能夠從單糖或寡糖生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵生物。術(shù)語“可發(fā)酵的糖”指任何能夠被發(fā)酵生物所發(fā)酵的糖?？砂l(fā)酵的糖包括寡糖和糊精?！翱砂l(fā)酵的糖”指可在發(fā)酵工藝中，通過微生物與該可發(fā)酵的糖接觸來生產(chǎn)終產(chǎn)物而被轉(zhuǎn)化的單糖或二糖。在一些實(shí)施方式中，可發(fā)酵的糖被微生物代謝并且在其他實(shí)施方式中，通過微生物來表達(dá)和/或分泌酶實(shí)現(xiàn)了可發(fā)酵的糖的期望轉(zhuǎn)化。術(shù)語“發(fā)酵”指由微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)的酶促和厭氧分解以生產(chǎn)更簡單的有機(jī)化合物。當(dāng)在厭氧條件下發(fā)生發(fā)酵時(shí)，該術(shù)語并不旨在僅僅局限于嚴(yán)格的厭氧條件，因?yàn)樵谘醮嬖谙乱舶l(fā)生發(fā)酵。如本文使用，術(shù)語“發(fā)酵生物”指任何適合用于發(fā)酵來直接或間接生產(chǎn)終產(chǎn)物的微生物或細(xì)胞。術(shù)語“功能等同物”意指酶具有與野生型酶相同的酶促功能特征并且源于該野生型酶。術(shù)語“凝膠化”意指通常通過烹調(diào)使淀粉分子溶化以形成有粘性的懸浮物。術(shù)語“凝膠化溫度”指含有淀粉的底物開始凝膠化的最低溫度。凝膠化的準(zhǔn)確溫度取決于特定淀粉并且可以根據(jù)諸如植物種類以及環(huán)境和生長條件的因素來改變。術(shù)語“顆粒淀粉”意指粗淀粉，它是沒有經(jīng)歷凝膠化溫度的淀粉。術(shù)語“顆粒淀粉水解(GSH)酶”和“具有顆粒淀粉水解(GSH)活性的酶”指具有水解顆粒形式的淀粉的能力的酶。術(shù)語“同源性％”在此與術(shù)語“同一性％”互換使用?？梢杂糜跍y(cè)定兩序列間同一性的示例性計(jì)算機(jī)程序包括但不限于BLAST程序組，例如BLASTN、BLASTX、和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，并且公眾可自網(wǎng)絡(luò)獲得(參見例如，NationalCenterforBiotechnologyInformation網(wǎng)站的BLAST頁面)。也參見Altschul等人，1990和Altschul等人，1997。當(dāng)相對(duì)于GenBankDNASequences和其他公共數(shù)據(jù)庫中的核酸序列來評(píng)估給定核酸序列時(shí)，通常使用BLASTN程序進(jìn)行序列檢索。優(yōu)選BLASTX程序來檢索核酸序列，將該核酸序列針對(duì)于GenBankProteinSequences和其他公共數(shù)據(jù)庫的氨基酸序列在所有的讀碼框中翻譯。使用開放空位罰分為11.0以及延伸空位罰分為1.0的默認(rèn)參數(shù)并且利用BL0SUM-62矩陣來進(jìn)行BLASTN和BLASTX(參見例如Altschul等人，1997)?！耙夯铩币卜Q作可溶淀粉底物或液化底物，它是含有熱穩(wěn)定的α淀粉酶的完全磨過的谷粒漿液，其經(jīng)歷了高溫液化而產(chǎn)生用于糖化和發(fā)酵或SSF的可溶底物。高溫是高于谷粒凝膠化溫度的溫度?！耙夯被颉笆挂夯币庵笇⒌矸坜D(zhuǎn)化成較短鏈以及較小粘性的糊精的工藝。術(shù)語“研磨的”在此用于指例如通過碾磨、壓碎、分級(jí)分離或任何其他使顆粒尺寸減小的手段，而使尺寸減小的植物材料。研磨包括干磨或濕磨?！案赡ァ敝刚麄€(gè)干谷粒的研磨?！皾衲ァ敝腹攘Ｊ紫冉?浸)在水中以使谷粒軟化的工藝。術(shù)語“寡糖”指任何具有以糖苷鍵連接在一起的2至10個(gè)單糖單元的化合物。簡單糖類的這些短鏈多聚物包括糊精。如在此使用，對(duì)于在此鑒定的氨基酸或核苷酸序列的“序列同一性百分?jǐn)?shù)(％)”，將其定義為在序列比對(duì)并引入空位后(如需要，以實(shí)現(xiàn)最大序列同一性百分?jǐn)?shù)，并且不將任何保守取代當(dāng)做序列同一性的部分)，候選序列中與一序列的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分?jǐn)?shù)。進(jìn)行序列比對(duì)以及測(cè)定序列同一性的方法是技術(shù)人員已知的，可以不經(jīng)過多實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，并且可以明確獲得同一性數(shù)值的計(jì)算。參見例如，Ausubel等人編(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,第19章(GreenePublishingandffiley-Interscience,NewYork)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978),見AtlasofProteinSequenceandStructure5:Suppl.3(NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C.)?？色@得許多用于比對(duì)序列和測(cè)定序列同一性的算法，包括例如Needleman等人的同源性比對(duì)算法(1970)J.Mol.Biol.48443；Smith等人的局部同源性算法(1981)Adv.Appl.Math.2482；Pearson等人的相似性檢索方法(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)；以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(參見Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215403-410)。也可獲得使用這些算法的計(jì)算機(jī)化程序，其包括但不限于=ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件，或WU-BLAST-2(Altschul等人，Meth.Enzym.，266460-480(1996))；或GAP、BESTFIT、BLASTAltschul等人，上文，獲自GeneticsComputingGroup(GCG)包，第8版，Madison,Wis.，USA的FASTA和TFASTA；以及Intelligenetics，MountainView,Calif的PC/Gene程序中的CLUSTAL。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用來測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在被比較的序列長度上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的算法。優(yōu)選地，使用由該程序所確定的默認(rèn)參數(shù)來測(cè)定序列同一性。具體地，可以通過以下述檢索參數(shù)空位開放罰分12，以及空位延伸罰分1，使用仿射空位檢索，在MSPRCH程序(OxfordMolecular)中實(shí)施Smith-Waterman同源性檢索算法來測(cè)定序列同一性。優(yōu)選地,可以使用GeneticsComputerGroup，Inc.,Madison,Wis.的GCG序列分析軟件包的GAP程序，利用bloSum62氨基酸取代矩陣，空位權(quán)重為12以及長度權(quán)重為2來進(jìn)行成對(duì)氨基酸比較。對(duì)于兩氨基酸序列的最佳比對(duì)，變體氨基酸序列的相鄰節(jié)段相對(duì)于參考氨基酸序列可以具有額外的氨基酸殘基或者缺失的氨基酸殘基。用于與參考氨基酸序列進(jìn)行比較的相鄰節(jié)段將包括至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基并且可以是30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^指定空位罰分而在推導(dǎo)的氨基酸序列中進(jìn)行對(duì)與包括空位相關(guān)的序列同一性增加的校正。術(shù)語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在此互換使用。在本公開內(nèi)容和權(quán)利要求中，使用編碼氨基酸殘基的常規(guī)單字母和三字母密碼子。按照IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature(JCBN)來定義氨基酸的3字母密碼子。也應(yīng)理解由于遺傳密碼子的簡并性，可以由一種以上的核苷酸序列來編碼一種多肽。通過下面的命名法[原始氨基酸殘基/位置/取代的氨基酸殘基]來描述本發(fā)明的變體。例如，在第89位用蘇氨酸(T)對(duì)丙氨酸(A)的取代表示為A89T。當(dāng)在給定位置有一個(gè)以上的氨基酸被取代時(shí)，該取代表示為例如1)A89C，A89D或A89T；2)A89C，D，或T或c)A89C/D/T。當(dāng)在此鑒定出適于取代的位置而沒有提出特定的氨基酸時(shí)，應(yīng)理解任何氨基酸殘基可以取代該位置中存在的氨基酸殘基。術(shù)語“糖化酶”和“葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)”在此互換使用并且指任何能夠催化從淀粉的非還原端釋放D-葡萄糖以及相關(guān)的寡糖和多糖的酶。短語“同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)”指在終產(chǎn)物的生產(chǎn)中，諸如生產(chǎn)乙醇的微生物的發(fā)酵生物以及諸如糖化酶的至少一種酶在相同容器中，于相同工藝步驟中組合的工藝。術(shù)語“漿液”指包括不溶固體(例如顆粒淀粉)的水性混合物。如在此使用，術(shù)語“淀粉”指任何由植物的復(fù)合多糖碳水化合物組成的物質(zhì)，即具有通式(C6H1(I05)X的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中x可以是任何數(shù)字。術(shù)語“稀酒糟”意指自含有懸浮細(xì)顆粒和溶解物質(zhì)的固體分離(例如通過篩選或離心)的酒糟的液體部分。術(shù)語“回流物(backset)”通常用于意指回收的稀酒糟。術(shù)語“總糖含量”指存在于淀粉組合物中的總糖含量。術(shù)語“變體”在用來指酶(例如，a淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性真菌蛋白酶、植酸酶等)時(shí)，意指這樣的酶，其源自天然發(fā)生(野生型)的酶，但相比于該天然發(fā)生的酶具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、插入或缺失。該術(shù)語包括雜合形式的酶，其中例如，該酶可以具有源自一種芽孢桿菌屬(Bacillusp.)(例如地衣芽孢桿菌(B.licheniformis))的C-端和源自不同的芽孢桿菌屬(例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus))的N_端。變體相對(duì)于野生型可以具有一種或多種改變的特性，例如但不限于在一PH范圍上增加的熱穩(wěn)定性，增加的蛋白水解穩(wěn)定性，增加的比活性，更寬的底物特異性，更寬的活性或它們的組合。如本文所使用，術(shù)語“野生型”指在宿主細(xì)胞中天然發(fā)生(天生的)酶。示例性實(shí)施方式本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了包括a淀粉酶、葡糖淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶摻和物。此種組合物在糖化和/或糖化/發(fā)酵期間用于淀粉轉(zhuǎn)化工藝。在淀粉轉(zhuǎn)化工藝中使用此種組合物比單獨(dú)使用葡糖淀粉酶提供優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明涉及包括葡糖淀粉酶、酸性真菌蛋白酶和酸穩(wěn)定的a淀粉酶的組合物。本發(fā)明也涉及該組合物的使用來從可發(fā)酵的糖生產(chǎn)想要的終產(chǎn)物，例如從液化物生產(chǎn)乙醇。該組合物的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其相對(duì)于由葡糖淀粉酶單獨(dú)在基本上相同的條件下生產(chǎn)的乙醇的量，產(chǎn)生更大量的乙醇。在一個(gè)方面，相對(duì)于單獨(dú)使用葡糖淀粉酶，該增加大于0.5%，優(yōu)選大于1.0%、1.5%、2%禾口2.5%。葡糖淀粉酶葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)是將淀粉和糊精分解成葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶是外切作用酶；它水解淀粉中的a1-4和a1-6糖苷鍵并釋放葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明有用的葡糖淀粉酶可以是野生型葡糖淀粉酶，其變體或片段或者雜合葡糖淀粉酶，該雜合葡糖淀粉酶源于例如一種微生物源的催化結(jié)構(gòu)域和另一種微生物源的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。下面的葡糖淀粉酶是可以用于本發(fā)明所包含的工藝中的葡糖淀粉酶的非限制性實(shí)例。葡糖淀粉酶可以獲自黑曲霉(Aspergillusniger)Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等人，(1984)EMBOJ.31097-1102；W092/00381,W000/04136和USP6,352,851)；泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(W084/02921)；米曲霉(Aspergillusoryzae)葡糖淀粉酶(Hata等人，(1991)Agric.Biol.Chem.55941-949)和曲霉菌(Aspergillusshirousami)(參見Chen等人，(1996)Prot.Eng.9499-505；Chen等人，(1995)Prot.Eng.8575-582；和Chen等人，(1994)BiochemJ.302:275_281)的菌株?；@狀菌(Talaromyces)如源自T.emersonii、T.leycettanus、T.duponti和嗜熱籃狀菌(T.thermophilus)的那些(W099/28488；USPNo.RE:32，153；USPNo.4，587，215)；木霉菌菌株，如里氏木霉(T.reesei)并且尤其是與USPat.Pub.No.2006-0094080公開的SEQIDNO:4具有至少80%、85%、90%和95%的序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉菌菌株，如雪白根霉(R.niVeuS)和米根霉(R.oryzae)；毛霉菌(Mucor)菌株和腐質(zhì)霉菌菌株，如灰腐質(zhì)霉(H.grisea)(參見Boel等人，(1984)EMB0J.31097-1102；W092/00381；W000/04136;Chen等人，(1996)Prot.Eng.9499-505；Taylor等人，(1978)CarbohydrateRes.61:301_308；USP.4，514，496；USP4，092，434；USP4，618，579Jensen等人，(1988)Can.J.Microbiol.34:218_223和W02005/052148的SEQIDNO:3)。在一些實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶將與W005/052148的SEQIDNO3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%序列同一性。其他用于本發(fā)明的葡糖淀粉酶包括獲自羅氏阿太菌(Atheliarolfsii)及其變體的那些(W004/111218)。商品化使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶生產(chǎn)自例如黑曲霉(來自GeneneorInternationalInc.的商品名DISTILLASE，0PTIDEXL-400和GZYMEG9904X)或根霉菌種類(來自ShinNihonChemicals,Japan的商品名CU.C0NC)。還有來自AmanoPharmaceuticals,Japan(Takahashi等人’(1985)J.Biochem.98663-671)白勺商品名為GLUCZYME的商品化消化酶。其他酶包括根霉菌屬的三種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Glucl”(MW74，000)、“Gluc2”(MW58，600)禾口“Gluc3”(MW61，400)。酶制劑GC480(GenencorInternationalInc.)也用于本發(fā)明。上面提及的葡糖淀粉酶和商品化酶并不旨在限制本發(fā)明而只是作為實(shí)例提供。葡糖淀粉酶可以源自細(xì)菌、植物和真菌源的異源或內(nèi)源蛋白表達(dá)。通過絲狀真菌和酵母的若干菌株來生產(chǎn)用于本發(fā)明的優(yōu)選的葡糖淀粉酶，特別是由木霉菌菌株分泌的葡糖淀粉酶。表1示出具有599個(gè)氨基酸的里氏木霉葡糖淀粉酶的推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，催化結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO2)沒有下劃線并由第1-453位殘基所表示；接頭區(qū)域(SEQIDNO3)加下劃線并由第454-491位殘基所表示；而淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域SEQIDNO:4為黑體并由第492-599位殘基所表示。表1里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO1)1SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYM51WTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLAD101GSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQST151VSNVIWPIVRNDLNYVAQYffNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGA201TLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDV251NSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIP301AGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTAT351SLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADG401SLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIP451STCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCKTPTSVXVT8501FHELVSTQFGQTVKVAGSOiAALGNt/STSAAVRLBAVNTADNHPLWXGTm551LEHGDWSmYINVGQDGSVTWESDPUHTYTVBAVACVTQWKBDTWQS本發(fā)明人鑒定出負(fù)責(zé)葡糖淀粉酶活性的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的保守突變可能產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的蛋白質(zhì)。盡管這些結(jié)構(gòu)域中的保守氨基酸取代不是所有都必然產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的蛋白質(zhì)，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將預(yù)期這些保守取代中的許多將產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的蛋白質(zhì)。此外，在該兩個(gè)鑒定出的功能結(jié)構(gòu)域以外的氨基酸取代不可能大大影響葡糖淀粉酶活性。在一些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的葡糖淀粉酶與SEQIDNO:1或2的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。a淀粉酶根據(jù)本發(fā)明有用的a淀粉酶可以是野生型a淀粉酶，其變體或片段或者雜合a淀粉酶，該雜合a淀粉酶源于例如一種微生物源的催化結(jié)構(gòu)域和另一種微生物源的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；蛘撸琣淀粉酶可以是經(jīng)遺傳改造而酸穩(wěn)定的變體。a淀粉酶也可以是具有顆粒淀粉水解活性(GSHE)的a淀粉酶，因?yàn)樵撁赣糜趯⒁夯镏械母嗟牡矸鄯纸?。真菌a淀粉酶的實(shí)例包括獲自絲狀真菌菌株的那些，包括但不限于曲霉菌(例如，黑曲霉、A.kawachi和米曲霉)；木霉菌屬、根霉菌屬、毛霉菌屬和青霉菌屬的菌株。在一些實(shí)施方式中，a淀粉酶獲自曲霉菌(Aspergilluskawachi)的菌株或者里氏木霉的菌株。考慮用于本發(fā)明所包括的組合物和方法中的商業(yè)可得的a淀粉酶包括GZYME997；禾PCLARASEL(GenencorInternationalInc.)；TERMAMYL120-L，LC和SC以及SUPRA(NovozymesBiotech)；SANSUPER(NovozymesA/S)和FUELZYMEFL(Diversa/ValleyResearch)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明有用的a淀粉酶是酸穩(wěn)定的a淀粉酶，其以有效量加入時(shí)，在pH范圍為3.0至7.0，并且優(yōu)選在pH范圍3.5至6.5時(shí)具有活性，包括在pH約4.0、4.5、5.0、5.5和6.0時(shí)具有活性。根據(jù)本發(fā)明有用的酸穩(wěn)定的a淀粉酶可以是真菌a淀粉酶或細(xì)菌a淀粉酶。優(yōu)選的酸穩(wěn)定的a淀粉酶包括獲自曲霉菌(Aspergilluskawachi)(例如AkAA)、黑曲霉(例如AnAA)和里氏木霉(例如TrAA)的那些。表2示出曲霉菌(Aspergilluskawachi)a淀粉酶(AkAA)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO5)o推定的接頭是TTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTT(SEQIDN0:6)，加下劃線。接頭上游氨基酸包括催化結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:7)，未加下劃線。接頭下游氨基酸包括淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)(SEQIDNO:8)，粗體。SBD包括該多肽的最后102個(gè)氨基酸。表2Aspergilluskawachia淀粉酶的成熟蛋白質(zhì)序列(AkAA)(SEQIDNO5)LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTGDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPITEQLPQDTSDGEAYHGYWQQKIYNVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMGYAGNGNDVDYSVEDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTIWYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVEEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQKYLDGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISNLY匪IKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSG⑶VPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLAISADSDYITYANDPIYTDSNTIAMRKGTSGSQIITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKLIEAYTCTSVTVDSNGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGNTTTTTTAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSSCTATSTTLPITFEELVOTTYGERVYLSGSISQLGEWOTSDAVKLSADD<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>本發(fā)明人鑒定出負(fù)責(zé)a淀粉酶活性的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域的保守突變可能產(chǎn)生具有a淀粉酶活性的蛋白質(zhì)。盡管這些結(jié)構(gòu)域中的保守氨基酸取代不是所有都必然產(chǎn)生具有a淀粉酶活性的蛋白質(zhì)，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將預(yù)期這些保守取代中的許多將產(chǎn)生具有a淀粉酶活性的蛋白質(zhì)。此外，在該兩個(gè)鑒定出的功能結(jié)構(gòu)域以外的氨基酸取代不可能大大影響a淀粉酶活性。在一些實(shí)施方式中，a淀粉酶與SEQIDNO:5或7的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。表3示出黑曲霉a淀粉酶(AnAA)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO:9)。在表中，以第1-478位氨基酸(SEQIDNO:10)表示催化結(jié)構(gòu)域，未加下劃線。接頭區(qū)域加下劃線(SEQIDN0:11)。淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榇煮w(SEQIDN0:12)。表3黑曲霉a淀粉酶(AnAA)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO9)LSAAEWRTQSIYFLLTDRFGRTDNSTTATCNTCDQIYCGGSWQGIINHLDYIQGMGFTAIWISPITEQLPQDTADGEAYHGYWQQKIYDVNSNFGTADDLKSLSDALHARGMYLMVDVVPNHMGYAGNGNDVDYSVFDPFDSSSYFHPYCLITDWDNLTMVQDCWEGDTIVSLPDLNTTETAVRTIWYDWVADLVSNYSVDGLRIDSVLEVEPDFFPGYQEAAGVYCVGEVDNGNPALDCPYQEYLDGVLNYPIYWQLLYAFESSSGSISDLY匪IKSVASDCSDPTLLGNFIENHDNPRFASYTSDYSQAKNVLSYIFLSDGIPIVYAGEEQHYSGGKVPYNREATWLSGYDTSAELYTWIATTNAIRKLAISADSAYITYANDAFYTDSNTIAMRKGTSGSQVITVLSNKGSSGSSYTLTLSGSGYTSGTKLIEAYTCTSVTVDSSGDIPVPMASGLPRVLLPASVVDSSSLCGGSGSNSSTTTTTTATSSSTATSKSASTSSTSTACmTSTSIAVTPEELVTOTYgBEIYLSGSISQLGDWiyrSDAVKMSAPPYTSSNPEWSVTVTLPVGTTPBTKFIKVESDGTVTWESDPNREYTVPECGSGETVVOTWR在一些實(shí)施方式中，a淀粉酶與SEQIDNO:9或10的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。表4給出具有443個(gè)氨基酸的木霉菌a淀粉酶(TrAA)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDN0:13)。這一a淀粉酶不含有SBD或接頭。表4里氏木霉a淀粉酶(TrAA)(443個(gè)氨基酸)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO13)DTAAWRSRTIYFALTDRIARGSGDTGGSACGNL⑶YCGGTFQGLESKLDYIKGMGFDAIffITPVVTSDDGGYHGYWAEDIDSINSHYGSADDLKSLVNAAHSKGFYMMVDVVANHMGYANISDDSPSPLNQASSYHPECDIDYNNQTSVENCWISGLPDLNTQSSTIRSLYQDWVSNLVSTYGFDGVRIDTVKHVEQDYWPGFVNATGVYCIGEVFD⑶PNYLLPYASLMPGLLNYAIYYPMTRFFLQQGSSQDMVNMHDQIGSMFPDPTALGTFVDNHDNPRFLSIKNDTALLKNALTYTILSRGIPIVYYGTEQAFSGGNDPANREDLWRSGFNAQSDMYDAISKLTYAKHAVGGLADNDHKHLYVADTAYAFSRAGGNMVALTTNSGSGSSAQHCFGTQVPNGRWQNVFDEGNGPTYSADGNGQLCLNVSNGQPIVLLSS在一些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的a淀粉酶與SEQIDNO13的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。酸性真菌蛋白酶根據(jù)本發(fā)明有用的酸性真菌蛋白酶(AFP)可以是野生型酸性真菌蛋白酶，其變體或片段，或者遺傳改造的突變AFP。酸性真菌蛋白酶包括例如，獲自曲霉菌、木霉菌、毛霉菌和根霉菌，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉(M.miehei)的那些。AFP可以源自細(xì)菌、植物和真菌源的異源或內(nèi)源蛋白表達(dá)。特別地，優(yōu)選木霉菌的菌株分泌的AFP。表5示出來自里氏木霉的優(yōu)選AFP的成熟蛋白質(zhì)序列(355個(gè)氨基酸)(SEQIDNO14)。表5里氏木霉酸性真菌蛋白酶(AFP)的成熟蛋白質(zhì)序列(SEQIDN014)KYGAPISDNLKSLVAARQAKQALAKRQTGSAPNHPSDSADSEYITSVSIGTPAQVLPLDFDTGSSDLWVFSSETPKSSATGHAIYTPSKSSTSKKVSGASWSISY⑶GSSSSGDVYTDKVTIGGFSVNTQGVESATRVSTEFVQDTVISGLVGLAFDSGNQVRPHPQKTWFSNAASSLAEPLFTADLRHGQNGSYNFGYIDTSVAKGPVAYTPVDNSQGFWEFTASGYSVGGGKLNRNSIDGIADTGTTLLLLDDNVVDAYYANVQSAQYDNQQEGVVFDCDEDLPSFSFGVGSSTITIPGDLLNLTPLEEGSSTCFGGLQSSSGIGINIF⑶VALKAALVVFDLGNERLGWAQK在一些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明的酸性真菌蛋白酶與SEQIDN0:14的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的序列同一性。二級(jí)酶雖然本發(fā)明的一些實(shí)施方式包括含至少一種酸穩(wěn)定的a淀粉酶、至少一種葡糖淀粉酶和至少一種酸性真菌蛋白酶的組合物，但是該組合物可以任選地包括其它酶。例如，當(dāng)該組合物用于不同應(yīng)用時(shí)(例如淀粉加工應(yīng)用)，可以進(jìn)一步包括二級(jí)酶。根據(jù)本發(fā)明的摻和物組合物可以與發(fā)酵微生物以及其它組分和其它二級(jí)酶一起用于糖化步驟和/或發(fā)酵步驟。其它酶包括但不限于其它葡糖淀粉酶、其它a淀粉酶、其它蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、3“葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、環(huán)糊精轉(zhuǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)，淀粉酶和它們的組合。在一些實(shí)施方式中，其他酶是二級(jí)酸穩(wěn)定的a淀粉酶，例如真菌a淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，二級(jí)a淀粉酶是GSHE，例如AkAA，TrAA或AsAA。其他可以與該摻和物組合使用的a淀粉酶的非限制性實(shí)例是源于芽孢桿菌、曲霉菌、木霉菌、根霉菌、鐮孢(Fusarium)、青霉菌、脈孢菌(Neurospora)和腐質(zhì)霉菌的那些。這些淀粉酶中的一些是商品化可得的，例如獲自NovoNordiskA/S的TERMAMYL和SUPRA，獲自Diversa的FUELZYMEFL,獲自NovoNordiskA/S的LIQUEZYMESC以及獲自GenencorInternational,Inc.的SPEZYMEFRED、SPEZYMEETHYL和GZYMEG997。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明可以包括植酸酶的添加。植酸酶是能夠從肌醇六磷酸釋放至少一種無機(jī)磷酸的酶。根據(jù)植酸酶對(duì)植酸分子上磷酸酯基團(tuán)的特定位置(在11此處開始水解)的偏好將它們分類(例如，分類為3-植酸酶(EC3.1.3.8)或?yàn)?-植酸酶(EC3.1.3.26))。植酸酶的典型實(shí)例是肌醇六磷酸酯-3-磷酸水解酶。植酸酶可以獲自微生物如真菌和細(xì)菌生物。這些微生物的一些包括例如曲霉菌(如，黑曲霉，土曲霉(A.terreus)和煙曲霉(A.fumigatus))、毀絲霉(Myceliophthora)(嗜熱毀絲霉(M.thermophila))、籃狀菌(Talaromyces)(嗜熱籃狀菌(T.thermophilus))、木霉菌屬(里氏木霉)和嗜熱絲孢菌(Thermomyces)(W099/49740)。植酸酶也可獲自青霉菌種類，例如大麥青霉(P.hordei，ATCCNo.22053)，檜狀青霉(P.piceum)(ATCCNo.10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(ATCCNo.48944)。參見例如USP6,475,762。此外，植酸酶獲自隔孢伏革菌(Peniophora)，大腸桿菌、檸檬酸桿菌(Citrobacter)，產(chǎn)氫菌(Enterbacter)和布丘氏菌(Buttiauxella)(參見2005年10月17日遞交的W02006/043178)。商品化植酸酶可獲自例如NATUPHOS(BASF)、R0N0ZYMEP(NovozymesA/S)、PHZYME(DaniscoA/S,Diversa)和FINASE(ABEnzymes)0在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明有用的植酸酶是源自細(xì)菌布丘氏菌屬的酶。布丘氏菌屬包括鄉(xiāng)間布丘氏菌(B.agrestis)，布里納氏布丘氏菌(B.brennerae),費(fèi)拉格布丘氏菌(B.ferragutiase),伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae),伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)，諾基亞布丘氏菌(B.noackiae)，和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiEie)。胃禾中g(shù)的胃自DSMZ，GermanNationalResourceCenterforBiologicalMaterial(Inhoffenstrabe7B,38124Braunschweig,Germany)。以登錄號(hào)NCIMB41248保藏的布丘氏菌屬菌株P(guān)l-29是尤其有用的菌株，從該菌株可以獲得植酸酶并按照本發(fā)明來使用。纖維素酶也可以與本發(fā)明的摻和物和/或組合物一起使用。纖維素酶是水解纖維素(3-l，4-D-葡聚糖鍵)和/或其衍生物例如磷酸溶脹纖維素的酶組合物。纖維素酶包括外切纖維二糖水解酶(CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和葡糖苷酶(BG)的分類(EC3.2.191，EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)。纖維素酶的實(shí)例包括來自青霉菌、木霉菌、腐質(zhì)霉菌、鐮孢(Fusarium)、嗜熱單孢霉(Thermomonospora)、纖維單胞菌(Cellulomonas)、梭菌(Clostridium)和曲霉菌的纖維素酶。以飼料用途出售的商品化可獲得的纖維素酶是3_葡聚糖酶，例如ROVABIO(Adisseo)、NATUGRAIN(BASF)、MULTIFECTBGL(DaniscoGenencor)禾口EC0NASE(ABEnzymes)。木聚糖酶也可以與本發(fā)明的摻和物和/或組合物一起使用。水解木聚糖主鏈的木聚糖酶(例如，內(nèi)切_木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)，可以獲自細(xì)菌源，例如芽孢桿、II#(Streptomyces)、W.M(Clostridium)、fl；胃(Acidothermus)、/]、0？&胃(Microtetrapsora)或嗜熱單孢霉(Thermonospora)。此外，木聚糖酶可以來自真菌源，例如曲霉菌、木霉菌、脈孢菌、腐質(zhì)霉菌、青霉菌或鐮孢(Fusarium)。(參見例如，EP473545；USP5,612,055；W092/06209;和W097/20920)。商品化制劑包括MULTIFECT和FEEDTREATY5(DaniscoGenencor),R0N0ZYMEWX(NovozymesA/S)以及NATUGRAINWHEAT(BASF)。其它蛋白酶也可以與本發(fā)明的摻和物和/或組合物一起使用。蛋白酶可以源自細(xì)菌或真菌源。細(xì)菌源蛋白酶包括來自芽孢桿菌，如解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、緩慢芽孢桿菌(B.lentus)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的蛋白酶。這些來源包括枯草桿菌蛋白酶，例如獲自解淀粉芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶和它的突變體(USP4，760，025)。適合的商品化蛋白酶包括12MULTIFECTP3000(DaniscoGenencor)和SUMIZYMEFP(ShinNihon)。真菌蛋白酶源包括例如，木霉菌(例如NSP-24)、曲霉菌、腐質(zhì)霉菌和青霉菌。酶摻和物組合物本發(fā)明的酶摻和物組合物包括葡糖淀粉酶、a淀粉酶和酸性真菌蛋白酶。三種酶組分可以以包括三種酶組分混合在一起的摻和物制劑來使用，或者可以在工藝步驟期間單獨(dú)加入酶組分以產(chǎn)生本發(fā)明所包含的組合物。優(yōu)選地，在淀粉轉(zhuǎn)化步驟期間使用本發(fā)明的組合物以便維持下面定義的活性率。這可包括以按時(shí)間的方式加入組合物的單獨(dú)組分以便維持該比率，例如同時(shí)加入該組分。在一些實(shí)施方式中，酶摻和物組合物包括a)與SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，與SEQIDNO5具有至少97%的序列同一性的AkAA以及AFP；b)與SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，酸穩(wěn)定的AA，以及AFP；c)與SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，GSHEAA，以及與SEQIDNO:14具有至少90%、95%或99%序列同一性的AFP；d)GA,AkAA或TrAA，以及與SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的酸性真菌蛋白酶；e)GA，AkAA，以及與SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的酸性真菌蛋白酶；f)與SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，AkAA,以及與SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的AFP；g)與SEQIDNO1具有至少95%或至少97%的序列同一性的GA，TrAA,以及與SEQIDNO14具有至少95%或至少97%的序列同一性的酸性真菌蛋白酶；h)與SEQIDNO1的序列具有至少95%的序列同一性的GA，與SEQIDN014的序列具有至少95%的序列同一性的AFP，以及與SEQIDN05的序列具有至少95%序列同一性的AA;i)與SEQIDNO1的序列具有至少98%序列同一性的GA，與SEQIDN014序列具有至少98%序列同一性的AFP，以及與SEQIDNO5的序列具有至少98%序列同一性的AA;以及j)STARGEN001，它是酸穩(wěn)定Aspergilluskawachia淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶(商品化獲自GenencorInternational,Inc)，和酸性真菌蛋白酶的摻和物。通常以用于葡糖淀粉酶的GAU，用于a淀粉酶的SSU，以及用于酸性真菌蛋白酶的SAPU來測(cè)量酶活性。在一些實(shí)施方式中，酶活性比率如下面所定義，其中每種酶的比率參考葡糖淀粉酶(GA)來顯示。例如，GA(GAU)與AA(SSU)的比率從約11至約115，包括但不限于12、13、14、15、16、17、18、19禾P110。該比率可以低至11和高達(dá)115。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，GA(GAU)與AA(SSU)的比率從約11.5至約18，或從約12至約15。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，GA(GAU)與AA(SSU)的比率為14。在一些實(shí)施方式中，GA(GAU)與AFP(SAPU)的比率從約10.1至約15，包括但不限于10.2、10.3,10.4,10.5,10.6,10.7,10.8,10.9,11或高達(dá)15，包括12、13禾Pl4。優(yōu)選地，GA(GAU)與AFP(SAPU)的比率在約10.1至11之間，或10.2至10.8，或10.2至10.6。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，GA(GAU)與AFP(SAPU)的比率為約10.4。在一種優(yōu)選的組合物中，按GAUSSUSAPU來測(cè)量，葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率為約11.50.1至約181。在另一種優(yōu)選的組合物中，按GAUSSUSAPU來測(cè)量，葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率為約120.2至約150.6。在一種優(yōu)選的組合物中，GAAAAFP的比率為約140.4。如本文關(guān)于活性比率所使用，“約”意味著包括所述數(shù)值士15%。使用方法本發(fā)明還涉及從可發(fā)酵的糖生產(chǎn)終產(chǎn)物的方法。該方法包括步驟(a)將包括含有淀粉的研磨谷粒的漿液與α淀粉酶接觸以生產(chǎn)液化物；(b)將該液化物與葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶接觸以生產(chǎn)可發(fā)酵的糖；和(C)在發(fā)酵微生物存在下，使該可發(fā)酵的糖發(fā)酵以生產(chǎn)終產(chǎn)物。在該方法中，步驟(b)糖化和步驟(C)發(fā)酵可以順序發(fā)生或同時(shí)發(fā)生。葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶可以分別地加入該液化物?；蛘撸梢詫ㄆ咸堑矸勖?、酸穩(wěn)定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶的酶摻和物組合物加入該液化物。每一步都在下面詳細(xì)說明。淀粉轉(zhuǎn)化通過本領(lǐng)域已知的方法使包括植物材料的底物減小或研磨。植物材料可以獲自小麥、玉米、黑麥、高粱(蜀黍)、稻、小米、燕麥、黑小麥、木薯(木薯粉)、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、以及豆類如大豆和豌豆。優(yōu)選的植物材料包括玉米、燕麥、小麥、稻、蜀黍和它們的組合。植物材料可以包括雜交品種和遺傳修飾的品種(例如包括異源基因的轉(zhuǎn)基因玉米、大麥或大豆)。植物任何含有淀粉的部分可以用于生產(chǎn)液化物，包括但不限于植物部分如葉、莖、殼、外殼、塊莖、穗軸、谷粒等。優(yōu)選的全谷粒包括玉米、小麥、黑麥、大麥、高粱和它們的組合。在其它實(shí)施方式中，淀粉可以獲自分級(jí)分離的谷物谷粒，包括纖維、胚乳和/或胚芽組分。分級(jí)分離的植物材料如玉米和小麥的方法是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方式中，可以將獲自不同來源的植物材料(例如玉米和蜀黍或玉米和大麥)混合在一起。研磨方法是本領(lǐng)域公知的并且參考THEALCOHOLTEXTBOOKAREFERENCEFORTHEBEVERAGE,FUELANDINDUSTRIALALCOHOLINDUSTRIES，第三版，K.A.Jacques等人編，(1999)NottinghamUniversityPress。參見第二禾口第四章。在一些實(shí)施方式中，通過研磨或其他手段減小的植物材料將與一溶液組合以產(chǎn)生包含淀粉底物的漿液。在一些實(shí)施方式中，該漿液可以包括來自淀粉工藝的側(cè)流，例如回流物。在一些實(shí)施方式中，該漿液將包括15-55%ds(例如20-50%，25-45%，25-40%，和20-35%)0包括減小的植物材料的漿液可以進(jìn)行液化工藝，其中可以在液化步驟期間加入α淀粉酶。這產(chǎn)生液化物。為了產(chǎn)生液化物，可以向該漿液中加入單一或分次劑量的α淀粉酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定用于液化處理中的α淀粉酶的有效劑量。在一些實(shí)施方式中，用于液化的α淀粉酶的量是對(duì)于造成大部分淀粉液化有效的量。在其它實(shí)施方式中，該量是使得大于40%，包括50%，60%，70%，80%，90%，和100%的淀粉液化的量。在一些實(shí)施方式中，該范圍將是0.05至50AAU/gds，還有0.1至20AAU/gds以及還有1.0至lOAAU/gds。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，α淀粉酶的劑量將在0.01至10.Okg/公噸(MT)ds；還有0.05至5.Okg/MTds；以及還有0.1至4.Okg/MTds的范圍。在一些實(shí)施方式中，在比減小的植物材料的顆粒淀粉的淀粉凝膠化溫度低0至30°C的溫度下加入α淀粉酶。這一溫度可以比淀粉凝膠化溫度低0至25°C，0至20°C，0至15°C和0至10°C。這一特定值將變化并取決于包括該漿液的谷粒類型。例如，玉米的淀粉凝膠化溫度通常高于黑麥或小麥的淀粉凝膠化溫度。在一些實(shí)施方式中，溫度將在45至80°C之間，還有在50至75°C之間，還有在50至72°C之間，以及在一些實(shí)施方式中，溫度將低于68°C；低于65°C，低于62°C，低于60°C以及還有低于55°C。在其它實(shí)施方式中，溫度將高于40°C，高于45°C，高于50°C，和高于55°C。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，孵育溫度將在58至72°C之間以及還有在60至68°C之間。在一些實(shí)施方式中，漿液將維持在pH范圍為約3.0至小于6.5，還有在pH范圍為4.0至小于6.2，還有在pH范圍為約4.5至小于6.0以及優(yōu)選pH范圍為約5.0至6.0(例如約5.4至5.8)，并且漿液中的研磨谷粒將與酶組合物接觸2分鐘至8小時(shí)的一段時(shí)間(例如5mins至3hrs；15mins至2.5hrs和30min至2hrs)。在進(jìn)一步的步驟中，通過使孵育底物在PH為約4.0至6.5時(shí)暴露于在淀粉凝膠溫度之上如0至55°C(例如至65°C到120°C，70VIlJIlO0C,70V到90V)的溫度增加2分鐘至8小時(shí)的一段時(shí)間(例如2分鐘至6hrs,5分鐘至4小時(shí)和優(yōu)選Ihr至2hrs)而液化該孵育底物。在一些實(shí)施方式中，溫度可以升至在約85-90°C之間的溫度并且可以使用單劑量的α淀粉酶。如果溫度升至高于90_105°C，那么可以在溫度返回至正常后加入第二劑量的α淀粉酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，溫度可以升高至約105和140°C之間并且可以使用分次劑量的α淀粉酶，其一部分在升溫前加入而另一部分在溫度降至至少低于105°C加入，包括低于104、103、102、101、100、99、98、97、96、95、94、93、92、和91°C，但優(yōu)選低于90°C。在一些實(shí)施方式中，生成的液化物在糖化之前冷卻。糖化作用和發(fā)酵上面獲得的液化物可以以單一劑量或分次劑量與葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶接觸，只要維持想要的酶比率。因此，分次劑量意味著以一部分以上，包括兩部分或三部分加入想要比率的總劑量。在一個(gè)實(shí)施方式中，在開始時(shí)加入總劑量的一部分而在工藝中的指定時(shí)間加入第二部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，在糖化(或SSF)開始時(shí)加入該劑量的至少一部分以開始糖化工藝。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以分別而不是同時(shí)或在時(shí)間上足夠近地將酶組合物中的每種酶加入液化物以便維持活性率?；蛘?，可以在糖化和發(fā)酵中的一種或兩種期間加入包含葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶的酶摻和物組合物。葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶、和酸性真菌蛋白酶的比率優(yōu)選約11.50.1至約181，并且更優(yōu)選約120.2至150.6，如按GAUSSUSAPU所測(cè)量。糖化工藝可以持續(xù)12至120小時(shí)。然而，通常進(jìn)行糖化30分鐘至2小時(shí)并且然后在發(fā)酵期間完成糖化。有時(shí)，這被稱作同時(shí)糖化和發(fā)酵(SSF)。糖化通常在30至65°C的溫度并且通常在pH為3.0至5.0，包括4.0至5.0進(jìn)行。糖化可以導(dǎo)致可發(fā)酵糖的生成。在一些實(shí)施方式中，用發(fā)酵微生物對(duì)可發(fā)酵糖進(jìn)行發(fā)酵。接觸步驟和發(fā)酵步驟可以在相同的反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行或順序進(jìn)行?？傮w上，發(fā)酵工藝描述于AlcoholTextbook,第三片反，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries，Jacques等人編，(1999)NottinghamUniversityPress，UK。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括使用可發(fā)酵糖(糊精，例如葡萄糖)作為發(fā)酵原料在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件下進(jìn)行微生物發(fā)酵以獲得終產(chǎn)物，例如醇類(例如，乙醇)、有機(jī)酸(例如，琥珀酸，乳酸)、糖醇(例如，丙三醇)、抗壞血酸中間產(chǎn)物(例如，葡糖酸、DKG，KLG)、氨基酸(例如，賴氨酸)、蛋白質(zhì)(例如，抗體及其片段)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，可發(fā)酵的糖與酵母在15至40°C，20至38°C，以及還有25至35°C的溫度范圍，在pH范圍為pH3.O至6.5；還有pH3.O至6.O;pH3.O至5.5，pH3.5至5.O以及還有pH3.5至4.5下進(jìn)行發(fā)酵5hrs至120小時(shí)，優(yōu)選12至120和更優(yōu)選24至90小時(shí)的一段時(shí)間以生產(chǎn)醇產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇。通常以每ml發(fā)酵培養(yǎng)液IO4至1012，并且優(yōu)選IO7至IOltl個(gè)可見酵母計(jì)數(shù)的量來供應(yīng)酵母細(xì)胞。發(fā)酵除了發(fā)酵微生物(例如酵母)養(yǎng)分外將包括任選地酸和其它酶。在一些實(shí)施方式中，除了上述原材料，發(fā)酵培養(yǎng)基將含有補(bǔ)充物，該補(bǔ)充物包括但不限于維生素(例如，生物素、葉酸、煙酸、核黃素)、輔因子和大量及微量養(yǎng)分和鹽(例如(NH4)2SO4;K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，研磨的植物材料包括大麥、蜀黍、玉米和它們的組合，并且接觸和發(fā)酵步驟在pH范圍為3.5至5.5，溫度范圍為30-45°C下同時(shí)進(jìn)行48至90hrs的一段時(shí)間，其中至少50%的淀粉溶解。終產(chǎn)物目前發(fā)酵工藝的一種優(yōu)選的終產(chǎn)物是醇產(chǎn)物，例如乙醇。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，終產(chǎn)物是發(fā)酵副產(chǎn)物，例如干酒糟(DDG)以及干酒糟及可溶物(DDGS)，它們可以用作動(dòng)物飼料。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，通過使用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵微生物，發(fā)酵終產(chǎn)物可以包括但不限于丙三醇、1，3-丙二醇、葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸和它們的衍生物。發(fā)酵生物發(fā)酵生物的實(shí)例是產(chǎn)乙醇微生物或生產(chǎn)乙醇的微生物，例如產(chǎn)乙醇細(xì)菌，該細(xì)菌表達(dá)乙醇脫氫酶和丙酮酸脫氫酶并且可以獲自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單孢菌(Zymomonasmoblis)(參見例如，USP5，000，000；USP5，028，539，USP5,424，202；USP5，514，583和USP5，554，520)。在其它實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶(將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的酶)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，使用木糖異構(gòu)酶將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖。在具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用能夠?qū)⑽焯呛图禾前l(fā)酵成乙醇的微生物。例如，在一些實(shí)施方式中，微生物可以是天然的或非遺傳改造的微生物或者在其它實(shí)施方式中，微生物可以是重組微生物。發(fā)酵微生物包括但不限于來自芽孢桿菌、乳桿菌(LactoBacillus)、大腸桿菌、歐文氏菌(Erwinia)、泛菌(Pantoea)(例如檸檬泛菌(P.citrea))、假單胞菌(Pseudomonas)和克雷伯氏菌(Klebsiella)(例如產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca))的細(xì)菌。(參見例如USP5，028，539，USP5，424，202和WO95/13362)。芽孢桿菌是優(yōu)選的發(fā)酵微生物。用于發(fā)酵步驟的發(fā)酵微生物將取決于待生產(chǎn)的終產(chǎn)物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物是真菌微生物，例如木霉菌、酵母并且特別是酵母屬(Saccharomyces)，例如釀酒酵母(S.cerevisiae)(USP4,316,956)的菌株。多種釀酒酵母是商品化可獲得的并且這些包括但不限于FALI(Fleischmarm’sYeast),SUPERSTART(Alltech)，F(xiàn)ERMIOL(DSMSpecialties)，REDSTAR(Lesaffre)和安琪乙醇酵母(AngelYeastCompany,China)。例如，當(dāng)乳酸是想要的終產(chǎn)物時(shí)，可以使用乳桿菌屬(LactoBacillussp.)(干酪乳桿菌(Lcasei))；當(dāng)丙三醇或1，3_丙二醇是想要的產(chǎn)物時(shí)，可以使用大腸桿菌；以及當(dāng)2-酮基-D-葡糖酸，2，5-二酮基-D-葡糖酸，和2-酮基-L-古洛糖酸是想要的產(chǎn)物時(shí)，可以使用檸檬泛菌(Pantoeacitrea)作為發(fā)酵微生物。上面枚舉的列表僅僅是實(shí)例并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉可以被適當(dāng)?shù)厥褂靡垣@得想要的終產(chǎn)物的許多發(fā)酵微生物。終產(chǎn)物回收可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離和/或純化根據(jù)本發(fā)明工藝生產(chǎn)的終產(chǎn)物。分離和純化的方法是已知的，例如，通過對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行提取、蒸餾和柱層析。在一些實(shí)施方式中，通過對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高壓液相層析(HPLC)分析來直接鑒定終產(chǎn)物。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，糊狀物可以通過例如離心而分離成液相和固相，并且回收終產(chǎn)物如醇和固體?？梢酝ㄟ^諸如蒸餾和分子篩脫水或超濾的方法來回收醇。在一些實(shí)施方式中，在乙醇生產(chǎn)方法中使用本發(fā)明的酶摻和物或組合物將產(chǎn)生大于8%、10%、12%、14%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、和22%(ν/ν)的乙醇產(chǎn)量。任選地，在發(fā)酵后，可以通過例如蒸餾來提取醇(例如乙醇)。乙醇可以用于燃料，便攜式或工業(yè)乙醇。實(shí)施例在下面的實(shí)施例中將更詳細(xì)地描述本發(fā)明，該實(shí)施例不旨在以任何方式限制本發(fā)明主張的范圍。附圖意在和本發(fā)明的說明一起當(dāng)做說明書的整體部分。所有引用的參考文獻(xiàn)在此具體引用作為參考。下面的實(shí)施例提供對(duì)所主張發(fā)明的說明，但不限制它。在下面的公開內(nèi)容和實(shí)驗(yàn)部分，應(yīng)用下面的縮寫(重量百分?jǐn)?shù))；°C(攝氏度);H20(水)；dH20(去離子水)；dIH20(去離子水，Milli-Q過濾)；g或gm(克)；yg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μ(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；tm(微米)；M(摩爾)；mM(毫摩)；μΜ(微摩)；U(單位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時(shí))；D0(溶氧)；W/V(重量/體積)；W/W(重量/重量)；V/V(體積/體積)；IKA(IKAWorksInc.2635NorthChaseParkwaySE,Wilmington,NC)；Genencor(GenencorInternational,Inc.，PaloAlto,CA)；Ncm(牛頓厘米)和ETOH(乙醇)·eq(當(dāng)量)；N(正常)；ds或DS(干物質(zhì)含量)，SAPU(分光光度計(jì)測(cè)量的酸性蛋白酶單位，其中1SAPU是在檢測(cè)條件下每分鐘從酪蛋白底物釋放1微摩爾酪氨酸的蛋白酶酶活性的量)和GAU(葡糖淀粉酶單位，其定義為按照每小時(shí)葡萄糖來計(jì)算，在PH4.2和60°C下，從可溶淀粉底物生產(chǎn)Ig還原糖的酶量)O材料和方法粘度測(cè)量使用玻璃烹飪器-粘度計(jì)，LR-2.ST系統(tǒng)IKA來測(cè)量粘度。簡言之，該粘度計(jì)由具有錨定混合器的2000ml的雙層玻璃容器組成，該混合器通過EurostarLabortechnik功率控制粘度計(jì)來攪拌(Viscoklick粘度計(jì)的粘度范圍為0-600Ncm)。通常，對(duì)于在此描述的實(shí)施例，將包括淀粉底物的漿液和適量酶倒入粘度計(jì)容器中。在加熱至85°C期間記錄溫度和粘度并繼續(xù)孵育另外60至120mins。不時(shí)記錄以Ncm測(cè)量的粘度。塵使用的葡糖淀粉酶是表1中SEQIDNO=I所示的里氏木霉GA(TrGA)(也參見US2006/0003408，公開于1/5/2006和US2006/0094080,公開于5/4/2006，它們都通過引用作為參考)。實(shí)施例中使用的酸性真菌蛋白酶是具有SEQIDNO:14的序列的里氏木霉蛋白質(zhì)(也參見US2006/015342，公開于7/13Λ006，SEQIDNO10，其通過引用作為參考)，使用的α淀粉酶是在此SEQIDNO:5所示的Aspergilluskawachiα淀粉酶(AkAA)(美國專利7，205，138)。所有的專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^整體引用作為參考。通過高壓液相層析(HPLC)講行碳水化合物分析通過維持在50°C并裝有折射率(RI)檢測(cè)器(ERC-7515A,RIDetector(AnspecCompanyInc.)的HPLC(BeckmanSystemGold32KaratFullerton，CA，配有HPLC柱(Rezex8u8%H,Monosaccharides)來測(cè)量寡糖的反應(yīng)產(chǎn)物組分。根據(jù)分子量將糖分開。指定DPl為單糖，如葡萄糖；指定DP2為二糖，如麥芽糖；指定DP3為三糖，如麥芽三糖和指定“DP4+〃為具有4個(gè)或更多的聚合程度(DP)的寡糖。α淀粉酶活件(AAU)通過淀粉水解諫率來測(cè)定,其反映在由分光光度計(jì)測(cè)量的碘染色能力的減小速率。α淀粉酶活性的1個(gè)AAU是在標(biāo)準(zhǔn)化條件下每分鐘水解IOmg淀粉所需的酶量。α淀粉酶活性按可溶淀粉單位(SSU)來測(cè)定并且基于在ρΗ4.5，50°C下，可溶馬鈴薯淀粉底物(4%DS)被等分的酶樣品水解的程度。使用如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31:426_428所述的DNS方法來測(cè)量還原糖含量。根據(jù)USP5，958，739公開的方法來測(cè)量用于SPEZYMEFRED的LiquifonUnits(LU)中的α淀粉酶活性。簡言之，該檢測(cè)方法使用對(duì)_硝基苯基麥芽庚糖苷作為底物，其非還原末端糖被化學(xué)封閉。對(duì)_硝基苯基釋放速率與α淀粉酶活性成比例并且在410nm處監(jiān)測(cè)釋放。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照計(jì)算活性。葡糖淀粉酶活件單元(GAU)=使用PNPG檢測(cè)來測(cè)量葡糖淀粉酶的活性。酸性真菌蛋白酶活性(SAPU)=酸性真菌蛋白酶活性是基于在ρΗ3.0和37°C下從30分鐘蛋白水解的純化的高氮酪蛋白底物釋放的可溶的酪蛋白肽。未水解的底物與三氯乙酸一起沉淀并通過過濾而被移除。溶解的酪蛋白隨后通過分光光度計(jì)測(cè)量。一個(gè)分光光度計(jì)酸性蛋白酶單位(SAPU)是在本方法的條件下，每克酶每分鐘釋放1微摩爾酪氨酸當(dāng)量的活性。實(shí)施例1、TrGA、AkAA和AFP摻和物或組合物對(duì)乙醇發(fā)酵的影響這一實(shí)施例示出了葡糖淀粉酶、α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的摻和物在乙醇發(fā)酵中的出人意料的用處。分析了在酵母發(fā)酵期間；酸性真菌蛋白酶(來自Genencor-Danisco的FERMGEN)和酸穩(wěn)定的α淀粉酶(具有SEQIDNO:5的AkAA)以及葡糖淀粉酶(里氏木霉或黑曲霉)對(duì)于碳轉(zhuǎn)化效率(醇產(chǎn)量)的影響。研究了含有液化的完全磨過的玉米的培養(yǎng)基。通過用稀酒糟(獲自NewEnergy,SouthBendIN的9·8%DS)將NewEnergy(SouthBendIN)液化物(39.8%DSff/ff)稀釋到32%DS來制造糊狀物。這一糊狀物含有29.3%玉米DS。用6N硫酸將糊狀物的pH調(diào)至4.2，加入600ppm尿素以及RedStarEthanol酵母接種物。在含有300gm的糊狀物的500ml燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵。稀釋酶以便將0.2ml加入燒瓶中。所有酶劑量為每gm的玉米DS。將燒瓶放在32°C水浴中并且不時(shí)混合。使用表6中示出的酶濃度。發(fā)酵期間，取出近2ml啤酒樣品(培養(yǎng)液)用于HPLC分析。在螺口試管中向4.45ml水和0.05ml的IN硫酸中加入0.5ml的樣品上清液。蓋上試管并在75°C水中放置15分鐘以使酶活性失活。加熱后，通過0.2-微米過濾膜來過濾稀釋后的樣品用于HPLC分析。在600C，使用20-ul樣品注射，以每分鐘0.6ml的0.OlN硫酸移動(dòng)相在Phenominex酸性柱上進(jìn)行HPLC分離。71小時(shí)后，終止發(fā)酵并丟棄啤酒。表6中的HPLC結(jié)果顯示了在酵母發(fā)酵期間酸穩(wěn)定的α淀粉酶(AkAA)和酸性真菌蛋白酶(FERMGEN/AFP)的作用(0.25GAU的Tr-GA/gds玉米，32%ds，pH4.3，32°C)。聚合程度或DP是在聚合反應(yīng)中于時(shí)間t時(shí)平均聚合物鏈的重復(fù)單元數(shù)。長度是單體單元。聚合程度是分子量的度量。DP-I的實(shí)例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP-2的實(shí)例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP-3指麥芽三糖。DP>3表示聚合程度大于3的聚合物。表6中的DP-1、DP-2和DP-3是由淀粉水解產(chǎn)生的糖。乳酸是在碳水化合物發(fā)酵時(shí)由乳桿菌細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)酸。乳酸的產(chǎn)生是在污染的乙醇發(fā)酵中產(chǎn)量損失的主要原因。如此，常規(guī)監(jiān)測(cè)乳酸。丙三醇是乙醇發(fā)酵的副產(chǎn)物；它常規(guī)被監(jiān)測(cè)而作為酵母健康的指標(biāo)。表6的結(jié)果示出了當(dāng)酶摻和物中的AkAA水平增加時(shí)，高級(jí)糖還原(>DP3)率和因此的乙醇生產(chǎn)率以及最終的乙醇產(chǎn)量增加。表6=HPLC結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>和糖譜組成的影響的HPLC數(shù)據(jù)。表7在酵母發(fā)酵下，0.325GAU的TrGA/gds中AkAA和AFP濃度對(duì)最終醇產(chǎn)量的影響。表8中名為“說明”一欄所示出的比率是GAUSSUSAPU0<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>表8中的數(shù)據(jù)顯示了相比于對(duì)照，加入酸性真菌蛋白酶(AFP)導(dǎo)致醇生產(chǎn)速率的增加，但是加入α淀粉酶(AkAA)產(chǎn)生甚至更高的醇產(chǎn)量。表8中總結(jié)的質(zhì)量平衡數(shù)據(jù)顯示了含有TrGA、AFP和AkAA的三種酶摻和物導(dǎo)致比TrGA單獨(dú)結(jié)合AFP或AkAA更高的碳轉(zhuǎn)化效率(2,67%)0表8來自不同酶比率的酵母發(fā)酵的質(zhì)量平衡數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>來自蒸餾的醇產(chǎn)量顯示出與CO2數(shù)值相同的趨勢(shì)，其表明就每蒲式耳玉米的乙醇加侖值而言，含有7300和5000SSU/g的α淀粉酶的摻和物彼此相當(dāng)并且比對(duì)照更好(參見表8)。表8中的數(shù)據(jù)顯示了增加AkAA的劑量使得發(fā)酵最后的乙醇水平增加。最終啤酒的HPLC分析充分地顯示了相同的趨勢(shì)，然而沒有達(dá)到CO2和蒸餾數(shù)值的程度。在酵母發(fā)酵條件下，使用液化的完全磨過的玉米，用不同的酶組合物獲得的最終醇濃度與TrGA相比較并顯示于圖1。圖1示出了在液化的完全磨過的玉米的酵母發(fā)酵期間，酸性真菌蛋白酶(SAPU)和酸穩(wěn)定的α淀粉酶(SSU)加上TrGA對(duì)最終醇產(chǎn)量的影響。附圖中按編號(hào)的不同酶混合物為1:TrGA,0.25GAU/gds玉米，2:No#l+0.05SAPUAFP/gds玉米，3:No#l+2.OSSU的α淀粉酶/gds.玉米，和4:No#l+0.05SAPU,AFP+2.OSSU的α淀粉酶/gds玉米。結(jié)果出人意料地顯示了碳轉(zhuǎn)化效率(每克玉米ds的醇產(chǎn)量)取決于酶摻和物組合物。含有AFP或AkAA的TrGA的醇產(chǎn)量的增加不是加性的，但是顯示出出乎意料的協(xié)同效益。上面說明書中提及的所有出版物和專利都在此通過引用作為參考。本發(fā)明所述方法和系統(tǒng)的多種修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的而不背離本發(fā)明的范圍和精神。盡管本發(fā)明結(jié)合具體優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解不應(yīng)將所主張的發(fā)明不恰當(dāng)?shù)鼐窒抻诖诵┚唧w實(shí)施方式。事實(shí)上，旨在將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的用于進(jìn)行本發(fā)明所述模式的多種修改包括在下面的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求一種組合物，包含葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶。2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中按GAUSSUSAPU來測(cè)量，葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率為約11.50.1至約181。3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中按GAUSSUSAPU來測(cè)量，葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率為約120.2至150.6。4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中葡糖淀粉酶獲自選自木霉菌、籃狀菌、青霉菌、曲霉菌和腐質(zhì)霉組成的組的真菌。5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中葡糖淀粉酶包含與SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中葡糖淀粉酶包含SEQIDNO:1的氨基酸序列。7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中酸穩(wěn)定的α淀粉酶獲自木霉菌或曲霉菌。8.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中酸穩(wěn)定的α淀粉酶包含與SEQIDN0:5、7、9、10或13的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其中葡糖淀粉酶包含SEQIDNO:5的氨基酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中酸性真菌蛋白酶獲自木霉菌。11.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中酸性真菌蛋白酶包含與SEQIDNO14的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中酸性真菌蛋白酶包含SEQIDNO14的氨基酸序列。13.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，還包括其他酶，該其他酶選自第二種葡糖淀粉酶、第二種α淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、第二種蛋白酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、果膠酶、β“葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、環(huán)糊精轉(zhuǎn)糖基轉(zhuǎn)移酶和它們的組合。14.一種從可發(fā)酵的糖生產(chǎn)終產(chǎn)物的方法，包括步驟a.將包括含淀粉的研磨谷粒的漿液與α淀粉酶接觸以生產(chǎn)液化物；b.將該液化物與葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶相接觸以生產(chǎn)可發(fā)酵的糖；以及c.在發(fā)酵生物存在下，將可發(fā)酵的糖發(fā)酵以生產(chǎn)終產(chǎn)物。15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述終產(chǎn)物是醇。16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中按GAUSSUSAPU來測(cè)量，葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的比率為約11.50.1至約181。17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中步驟(b)和(c)順序地發(fā)生。18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中步驟(b)和(c)同時(shí)發(fā)生。19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中步驟(b)在30-65°C和pH3.0-5.0下進(jìn)行。20.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中步驟(c)在15-40°C和pH3.0-6.5下進(jìn)行。全文摘要本發(fā)明涉及包含葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶和酸性真菌蛋白酶的酶摻和物組合物。本發(fā)明還涉及從可發(fā)酵的糖生產(chǎn)諸如醇的終產(chǎn)物的方法。該方法包括步驟(a)將包括含淀粉的研磨谷粒的漿液與α淀粉酶接觸以生產(chǎn)液化物；(b)將該液化物與葡糖淀粉酶、酸穩(wěn)定的α淀粉酶以及酸性真菌蛋白酶相接觸以生產(chǎn)可發(fā)酵的糖；和(c)在發(fā)酵生物存在下，將可發(fā)酵的糖發(fā)酵以生產(chǎn)終產(chǎn)物。文檔編號(hào)C12N9/62GK101827935SQ200880111682公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年10月14日優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日發(fā)明者J·K·舍蒂,O·J·蘭特羅,S·布萊尼曼申請(qǐng)人:丹尼斯科美國公司