專利名稱：：Cdh3肽以及含有cdh3肽的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的肽，它們可用作針對諸如胰腺癌，膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌，肺癌等高表達P-鈣黏連蛋白(CDH3)的癌癥的疫苗，還涉及用于治療和預(yù)防癌癥的含此類肽的藥劑。
背景技術(shù)：
：胰腺癌約占所有惡性腫瘤的2-3%。每年世界上大約200，000人死于胰腺癌，它的死亡人數(shù)是惡性腫瘤死亡人數(shù)的第5位。在日本每年大約20，000人死亡。導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生的危險因素包括糖尿病，慢性胰腺炎，吸煙等等，有報道表明家族史也是危險因素之一。人們做了各種早期診斷的嘗試，包括改善診斷成像；然而，大多數(shù)患者是在晚期被診斷出來，此時他們已經(jīng)對化療有了抗性。因此，他們的五年存活率約為9.7%，即使通過手術(shù)切除的病例中存活率也只有約13%。在消化系統(tǒng)的癌癥中胰腺癌的預(yù)后結(jié)果最不理想。由于難以診斷，在癌癥引起的死亡中胰腺癌所致的比率逐步提高，尤其是在發(fā)達國家。雖然人們正在運用多學(xué)科治療，主要包括外科切除術(shù)和放療、化療等其他治療方法，但是治療效果并沒有得到明顯的改善，因此迫切需要新的治療策略。膽管細(xì)胞癌約占原發(fā)肝癌的10%，是繼肝細(xì)胞癌之后的第二大常見癌癥。它缺乏特征性的臨床表現(xiàn)，在很多病例中，此癌癥在檢出時已是晚期，并伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等等。五年存活率為20%，在手術(shù)切除的病例中存活率為35%，但不進行手術(shù)切除的病例中存活率很低，只有7.4%。雖然手術(shù)切除是唯一有希望實現(xiàn)長期存活的治療方法，但很多患者在檢測出癌癥時，已經(jīng)不能進行手術(shù)(手術(shù)比例66%，非根治性切除比例20%)。患者的抗癌藥物敏感性和放射敏感性都很低，需要建立一種對無法手術(shù)的病例，包括非根治性切除的病例的治療方法。與西方國家相比，在亞洲國家胃癌的發(fā)病率較高，如日本和中國。隨著醫(yī)學(xué)檢測的普及，胃癌的早期檢測已經(jīng)成為可能，并且隨著內(nèi)窺鏡儀器和檢查方法的進步，患者的數(shù)量不斷減少。然而，在日本胃癌仍然是惡性腫瘤致死的第二大原因，在死因中所占的比例依然很高。在西方國家結(jié)腸癌是第二大常見癌癥，在日本該疾病也是惡性腫瘤中的第三大致死原因。胃癌和結(jié)腸癌的治療主要依靠手術(shù)切除，也借助化學(xué)治療，放射治療等方法。對于前面提到的治療方法無法治療的轉(zhuǎn)移癌癥和頑固癌癥的治療，通過提高癌癥患者針對癌癥的免疫力來抑制癌細(xì)胞生長的免疫療法作為一種新的方法逐漸受到關(guān)注。近年來，在世界范圍內(nèi)肺癌的數(shù)量持續(xù)增加，目前一年大約有一百萬人死于肺癌。在日本肺癌死亡人數(shù)也在持續(xù)增加，預(yù)計在2015年將會達到123，000人。在日本肺癌是惡性腫瘤死亡的首要原因。人們認(rèn)為隨著人口老齡化的發(fā)展患者數(shù)量會逐漸增加。早檢測、早治療對于肺癌治療非常重要。然而，最近報道指出健康檢查中進行的簡單的胸部χ-光和痰化驗對于肺癌的早期檢測效果不好，并不能減少癌癥死亡。由于肺癌死亡人數(shù)會持續(xù)增力口，開發(fā)新的治療策略是一項緊迫的任務(wù)。另外，最近的分子生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的進展闡明了細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞識別由癌細(xì)胞中特異性高表達的蛋白降解所產(chǎn)生的肽而引起免疫反應(yīng)從而破壞癌細(xì)胞，這些肽是通過HLA分子呈遞到癌細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞表面的。此外，已經(jīng)鑒定出很多這樣的能刺激產(chǎn)生攻擊癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)的腫瘤抗原蛋白和肽。并且抗原特異性的腫瘤免疫療法正在開展臨床應(yīng)用。I型HLA分子在體內(nèi)所有的有核細(xì)胞表面表達。該分子通過結(jié)合由細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核產(chǎn)生的蛋白在細(xì)胞內(nèi)所降解形成的肽從而表達于細(xì)胞表面。在正常細(xì)胞表面，來自于正常蛋白的肽與I型HLA分子結(jié)合，免疫系統(tǒng)里的T細(xì)胞不會識別這些蛋白而破壞該細(xì)胞。另一方面，在癌變的過程中，癌細(xì)胞有時會大量表達在正常細(xì)胞中很少表達或不會表達的蛋白。當(dāng)I型HLA分子與這類由癌細(xì)胞特異高表達的蛋白降解所產(chǎn)生并隨后表達在癌細(xì)胞表面的肽結(jié)合時，殺傷性T細(xì)胞將識別這些肽，并且只破壞癌細(xì)胞。此外，通過對個體施用此類癌特異性的抗原或肽，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生一種破壞癌細(xì)胞并且抑制癌癥生長的免疫反應(yīng)而不會傷害正常細(xì)胞。這就叫做應(yīng)用癌癥特異性抗原進行的癌癥免疫療法。II型HLA分子主要在抗原呈遞細(xì)胞表面表達。II型HLA分子結(jié)合來自于癌癥特異性抗原的肽-這些肽是由抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)化的胞外癌癥特異性抗原在細(xì)胞內(nèi)降解所產(chǎn)生的-然后表達于細(xì)胞表面。然后識別了這些肽的輔助性T細(xì)胞被激活，并且通過產(chǎn)生各種可以激活其他免疫能細(xì)胞的細(xì)胞因子來誘導(dǎo)或增強抗腫瘤的免疫反應(yīng)。因此，如果能夠研發(fā)出一種以癌癥中特異的高表達的抗原為靶標(biāo)的免疫療法，就可能有效地消滅癌細(xì)胞而不會對個體自身的正常器官造成任何傷害。這種治療也有望可用于任何不能進行其他治療的終末期癌癥患者。另外，通過預(yù)先對此類癌癥的高危人群施用癌癥特異性抗原和肽疫苗，或許可以預(yù)防癌癥的發(fā)生。雖然對于胰腺癌有多種治療方法，與其他癌癥相比胰腺癌的預(yù)后很差。這主要是因為胰腺癌早期檢出難、發(fā)展快，因此一般只能在晚期發(fā)現(xiàn)。雖然手術(shù)切除是目前最有希望根治的方法，但可切除病例僅占總數(shù)的20%。并且胰腺癌手術(shù)創(chuàng)傷大，晚期病例即使在手術(shù)切除后預(yù)后也很差。不能進行切除手術(shù)的病例一般通過主要使用吉西他濱的化療和放療來進行醫(yī)治。然而，很多病例顯示出對此類治療的抗性并且細(xì)胞減滅的效果很差，這也是為什么說胰腺癌是難治性的原因之一。相應(yīng)地，如果開發(fā)出一種使用在胰腺癌中特異性高表達的抗原作為靶標(biāo)的免疫療法，那么這種療法將有效消滅癌癥而不會引起對個體自身正常器官的任何傷害。這種治療也可望用于任何終末期癌癥患者。此外，由于胰腺癌易于在切除后復(fù)發(fā)，這種治療也有希望成為有效的的手術(shù)后的輔助治療方法。本發(fā)明者先前使用cDNA微陣列分析在全基因組范圍內(nèi)對27648個人類基因進行了基因表達分析，檢測了這些基因在16個胰腺癌病例中，嬰兒器官和各種成人正常器官中的表達譜。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)了P-鈣黏連蛋白(⑶H3)在很多胰腺癌中高表達，同時它在成年人的正常器官中很少表達。此外，還發(fā)現(xiàn)CDH3在膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞肺癌，睪丸癌，宮頸癌，骨肉瘤，軟骨組織瘤等癌癥中的大多數(shù)病例中也是高表達的。這些事實提示在很多癌癥中，CDH3可以做為癌癥特異性的抗原。HLA-A2無論在哪個種族的人群中都常見，約30%的日本人攜帶有HLA-A2。因此，如果能夠鑒定出一種通過HLA-A.2呈遞給殺傷性T細(xì)胞的肽，則該種肽不僅可以廣泛的應(yīng)用于日本人，而且可用于歐美白人等人群。所以，鑒定出被HLA-A2呈遞給殺傷性T細(xì)胞的癌癥抗原肽是一項重要課題。這將有利于將這種癌癥抗原肽用于發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)都很高的肺癌的免疫治療。與本申請相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)文獻如下所示[非專利文獻1JNakamura,T.，etal.，Oncogene23:2385_2400(2004)[非專利文獻2]Obama,K.，etal.，Hepatology411339-1348(2005)[非專利文獻3]Taniuchi，K.，etal.，CancerRes65:3092_3099(2005)[非專利文獻4]Soler，A.P.，etal.，Cancer861263-1272(1999)[非專利文獻5]Paredes,J.，etal.，ClinCancerRes11:5869_5877(2005)[非專利文獻6]Ingunn，M.，etal.，JClinOncol221242-1252(2004)[非專利文獻7]Glenn,L.，etal.，JCellBiol1391025-1032(1997)[非專利文獻8]Bauer，R.，etal.,Exp.Mol.Pathol.81:224_230(2006)[非專利文獻9]Muzon-Guerra,M.F.，etal.Cancer103:960_969(2005)[非專利文獻10]Marck,V.V.，etal.，CancerRes.65:8774_8783(2005)
發(fā)明內(nèi)容[本發(fā)明需要解決的問題]本發(fā)明要達成的目的是開發(fā)一種手段來實現(xiàn)通過提高癌癥患者的抗癌免疫力來抑制癌癥生長的免疫治療，作為一種新療法用于治療難以通過手術(shù)、化療和放療(它們應(yīng)用于胰腺癌、膽管細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等癌癥的治療)來治療的轉(zhuǎn)移或難治性癌癥。本發(fā)明提供了已得到鑒定的、在癌癥細(xì)胞中特異性高表達并通過HLA-A2呈遞給殺傷性T細(xì)胞的肽。從而為開發(fā)能夠應(yīng)用于約30%的高表達⑶H3的各種癌癥的日本人患者的免疫治療提供了可能。[解決問題的方法]本發(fā)明通過對胰腺癌組織進行cDNA微陣列分析，鑒定出CDH3(GenBankAccessionNo.NM_001793)是胰腺癌高表達的基因。為了檢測抗癌免疫力是否由CDH3特異性的殺傷性T細(xì)胞所誘導(dǎo)，使用了表達HLA-A2(約30%的日本人攜帶有該基因)的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠。具體的說，利用具有HLA-A2結(jié)合結(jié)構(gòu)域的人源CDH3肽對小鼠骨髓來源的樹突細(xì)胞進行沖激(pulse)后，用該樹突細(xì)胞免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測是否可誘導(dǎo)HLA-A2限制性的肽特異的殺傷性T細(xì)胞。使用ELISP0T方法來檢測由通過識別由HLA-A2呈遞的肽被激活的殺傷性T細(xì)胞產(chǎn)生的Y-干擾素(IFN-γ)從而來檢測免疫過的小鼠的脾細(xì)胞中是否誘導(dǎo)產(chǎn)生CDH3肽特異的殺傷性T細(xì)胞。結(jié)果，本發(fā)明者鑒定出了兩種新的CDH3肽，它們可用于HLA-A2陽性癌癥患者的免疫治療。此外還發(fā)現(xiàn)通過使用這些肽誘導(dǎo)出的⑶H3反應(yīng)性CTL具有對表達內(nèi)源性⑶H3和HLA-A2分子的癌細(xì)胞特異的細(xì)胞毒性，同時CTL以I型HLA限制性的方式識別靶細(xì)胞。此外，還揭示了通過靜脈注射肽誘導(dǎo)的CD8陽性細(xì)胞(CTL過繼免疫法)，移植到N0D/SCID小鼠上的腫瘤的生長明顯受到抑制。更具體來說，本發(fā)明提供(1).以下(A)或⑶的肽(A)包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽；(B)包含在SEQIDNO:1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或增加一個、兩個或者幾個氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，其中該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞的活性。(2).(1)的肽，其中該肽自N末端起的第二個氨基酸是亮氨酸或者甲硫氨酸。(3).(1)的肽，其中C末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。(4).一種用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的藥劑，該藥劑含有一種或多種⑴的肽作為活性成分。(5).一種用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑，該藥劑含有一種或多種⑴的肽作為活性成分。(6).一種用于誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥齊U，該藥劑含有一種或多種(1)的肽作為活性成分。(7).一種用于誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)性活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，該藥劑含有一種或多種編碼(1)的肽的多核苷酸作為活性成分。(8).一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞的藥劑，該藥劑含有一種或多種(1)的肽作為活性成分。(9).針對(1)的肽的抗體。(10).使用(1)的肽誘導(dǎo)的輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群。(11).一種抗原呈遞細(xì)胞，其呈遞包含⑴的肽及HLA抗原的復(fù)合物。(12).(11)的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞是被(6)或(7)的藥劑所誘導(dǎo)的。(13).一種外來體，其呈遞包含(1)的肽及HLA抗原的復(fù)合物。(14).(13)的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA_A2*0201)。(15).一種誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括使抗原呈遞細(xì)胞接觸(1)的肽的步驟。(16).一種誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括將編碼(1)的肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染至抗原呈遞細(xì)胞中的步驟。(17).一種誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞的方法，該方法包括使T細(xì)胞接觸(1)的肽的步驟。(18).誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的方法，該方法包括向受試者施用(1)的肽的步驟。(19).治療和/或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括向受試者施用⑴的肽的步驟。(20).(1)的肽用于生產(chǎn)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的藥劑的用途。(21).⑴的肽用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防癌癥的藥物的用途。圖1顯示鑒定被HLA-A2限制性殺傷T細(xì)胞識別的⑶H3的流程。(將脾細(xì)胞從免疫小鼠中分離的那天設(shè)定為“0天”)。圖2是顯示18個⑶H3肽ELISPOT分析結(jié)果的圖片。使用ELISPOT來檢測從免疫小鼠中獲得的殺傷性T細(xì)胞是否可以與經(jīng)CDH3肽沖激的細(xì)胞特異性結(jié)合，并且產(chǎn)生IFN-γ。用⑶H3-4或⑶H3-7肽誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞會特異性識別利用⑶H3肽沖激過的BM-DC并產(chǎn)生IFN-γ；而用其他肽誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞沒有顯示出CDH3特異的CTL免疫反應(yīng)。因此可以確認(rèn)⑶H3-4和⑶H3-7肽是能夠誘導(dǎo)⑶H3特異的HLA-A2限制性殺傷T細(xì)胞的表位肽。圖2中展示的⑶H3肽的編號對應(yīng)的是表1中的“位置”一欄處顯示的肽編號，而不是本文所述的SEQIDNO。圖3是顯示用ELISP0T測定法檢測通過特異性地識別⑶H3肽而被激活的殺傷性T細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-Y的結(jié)果的圖片。針對用⑶!13-4655_663肽(A左、B上)沖激過的BM-DC，CD4-陰性的脾細(xì)胞顯示283.7士40.0個點/孔，針對未經(jīng)肽沖激(A右、B下)的BM-DC，CD4-陰性的脾細(xì)胞顯示48.7士11.9個點/孔(P<0.05)。相似地，針對經(jīng)過CDH3_7757_765肽(C首行)沖激的BM-DC，⑶4-陰性的脾細(xì)胞顯示79.3士3.2個點/孔，而針對未經(jīng)肽沖激(C末行)的BM-DC⑶4-陰性的脾細(xì)胞顯示42.7士2.5個點/孔(P<0.05)。實驗重復(fù)2次，結(jié)果相同。圖4是顯示從HLA-A2陽性的健康供體和癌癥患者的PBMC中誘導(dǎo)⑶H3-特異的人CTL的結(jié)果的線形圖。A從HLA-A2陽性的健康供體的PBMC中誘導(dǎo)產(chǎn)生⑶H3肽反應(yīng)性CTL。在利用自體單核細(xì)胞來源的、并經(jīng)過⑶H3-4655_663(上)或⑶H3-7757_765(下)肽沖激的DC刺激三次以后，通過標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放測定法來分析針對經(jīng)過或未經(jīng)過每種肽沖激的T2細(xì)胞(HLA-A2陽性，TAP缺陷)的細(xì)胞毒性。CTL顯示出對經(jīng)過⑶H3_4655_663(上)或⑶H3-7757_765(下)肽沖激的T2細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但對未經(jīng)肽沖激的T2細(xì)胞無毒性。B=CTL顯示出對CDH3+HLA-A2+人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、口腔鱗癌細(xì)胞系HSC3，以及PANC1/CDH3細(xì)胞系的細(xì)胞毒性，其中該PANC1/CDH3細(xì)胞系用CDH3基因轉(zhuǎn)化了的CDH3—HLA-A2+人胰腺癌PANCl細(xì)胞系。但是，CTL對CDH3T1LA-A2+的人肝癌細(xì)胞系SKH印1、PANCl和CDH3+HLA-A2.的人胰腺癌細(xì)胞系PK8并無細(xì)胞毒性。C:從HLA-A2陽性胰腺癌(PC)患者和胃癌(GC)患者的PMBC中誘導(dǎo)產(chǎn)生的⑶H3反應(yīng)性的CTL顯示出對HCTl16和PANCl/⑶H3細(xì)胞毒性，但是對PANCl和PK8沒有毒性。D該圖顯示抗I類HLA單抗對細(xì)胞毒性的抑制。將靶細(xì)胞SKHepl/CDH3和HSC3與抗I類HLA單抗(W6/32，IgG2a)或抗HLA-DR單抗(H-DR-l，IgG2a)共同孵育1小時后，加入了從經(jīng)過CDH3-4655_663(左側(cè)，中間)或CDH3-7757_765(右側(cè))刺激過的健康供體的PBMC中誘導(dǎo)的CTL。W6/32會明顯的抑制IFN-γ的產(chǎn)生(左側(cè)和右側(cè)，IFN-yELISPOT測定)和細(xì)胞(中間，51Cr釋放測定)，但是H-DR-I沒有這樣的抑制作用。圖.5是顯示⑶H3誘導(dǎo)的人CTL針對移植入N0D/SCID小鼠的人癌細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤活性。A:將人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116(raH3+，HLA-A2+)移植到移植了CTL后的N0D/SCID中，該癌細(xì)胞的生長受到了抑制。在皮下腫瘤移植后的第七天，腫瘤的大小達到25mm2，靜脈內(nèi)接種對于CDH3-4655_663肽(□)和CDH3-7757_765肽(■)具有反應(yīng)性的人CTL。第14天再次用相同的方式接種CTL。用HLA-A2限制性HIV肽刺激的對照組⑶8+T細(xì)胞沒有顯示出細(xì)胞毒性()。該圖顯示了在第7天和第14天兩次施用CDH3反應(yīng)性CTL(η=7)、對照組CD8+T細(xì)胞(η=7)、或只施用PBS(〇，η=7)的N0D/SCID小鼠體內(nèi)的腫瘤大小。腫瘤大小用平方毫米表示。B每組的腫瘤大小用士SD(n=7)表示。本發(fā)明的具體實施例方式除非有另有指出，否則這里使用的措辭“一種”、“一個”和“該”表示“至少一種”或“至少一個”。除非有其他的定義，這里使用所有的技術(shù)和科學(xué)名詞的含義與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的理解的含義相同。依據(jù)本發(fā)明的肽是一種受HLA-A2限制的抗原表位，HLA-A2是日本人和白種人群中常見的HLA等位基因。具體來說，依據(jù)它們與HLA-A2的結(jié)合能力，選出來源于CDH3的HLA-A2結(jié)合性肽的候選物。對于選中的肽，通過檢測來源于HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞(BM-DC)的樹突細(xì)胞經(jīng)過選中的肽沖激后是否能夠在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出殺傷性T細(xì)胞來進行評價。在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中，CDH3-4(FILPVLGAV(SEQIDNO1))和⑶H3-7(FIIENLKAA(SEQIDNO:2))能誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞。這些肽誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞對加入了這些肽的BM-DC顯示出免疫反應(yīng)。但這些殺傷性T細(xì)胞對沒有加入這些肽的BM-DC沒有顯示任何免疫反應(yīng)。這些結(jié)果表明來源于⑶H3的肽可以用作誘導(dǎo)針對⑶H3呈遞細(xì)胞的免疫反應(yīng)的肽，并且這些來源于⑶H3的肽是HLA-A2限制性的抗原表位肽。⑶H3在大部分癌癥病例中都高表達，如胰腺癌，膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞肺癌，睪丸癌，宮頸癌，骨肉瘤和軟組織腫瘤。這表明在很多癌癥免疫治療中可以將CDH3作為靶點。(1)依據(jù)本發(fā)明的肽及包含這些肽的用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的藥劑。依據(jù)本發(fā)明的肽是下列肽中的任何一種(A)包含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽；(B)包含在SEQIDNO:1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或增加一個、兩個或者幾個氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，其中該肽具有誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的活性。(C)(B)的肽，其中該肽自N-端起的第二個氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(D)(B)的肽，其中該肽C-端的氨基酸是纈氨酸或亮氨酸；本發(fā)明的肽是具有少于40個氨基酸，優(yōu)選的是少于20個氨基酸，更優(yōu)選的是少于15個氨基酸的抗原表位肽，該肽包括氨基酸序列SEQIDNO:1或2，并且具有誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的活性?；蛘撸丝乖砦浑目砂ㄟ@樣的肽，其具有SEQIDN0:1或2的氨基酸序列中取代，刪除，插入和/或增加一個，兩個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，只要其保留了誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的活性即可。被取代，刪除，插入和/或增加的殘基數(shù)通常為5個氨基酸或者更少，優(yōu)選的是4個氨基酸或更少，更優(yōu)選的是3個氨基酸或更少，最優(yōu)選的是1個氨基酸或2個氨基酸。已知肽變體(也就是，包含由原氨基酸序列通過取代，刪除，插入和/或增加一個，兩個或幾個氨基酸殘基發(fā)生改變而得到的氨基酸序列的肽)會保留原有的生物活性(MarkDFetal.，(1984)ProcNatlAcadSciUSA81:5662_6；ZollerMJandSmithΜ,(1982)NucleicAcidsRes106487-500；Dalbadie-McFarlandGetal,.(1982)ProcNatlAcadSciUSA79:6409-13)。氨基酸改變優(yōu)選保留原有氨基酸側(cè)鏈的特性。氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F(xiàn)，P，W，Y，V)，親水性氨基酸(R，D，N,C，E，Q，G，H，K，S，T)以及具有下列共有功能基團或特性的側(cè)鏈脂肪族側(cè)鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側(cè)鏈(S，T，Y)；含硫原子側(cè)鏈(C，M)；含羧基和氨基的側(cè)鏈(D，N，E，Q)；含堿性氨基酸的側(cè)鏈(R，K，H)；和含芳族的側(cè)鏈(H，F(xiàn)，Y，W)，此處括號中的字母是指氨基酸的單字母代碼。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的肽(免疫原性肽)是九肽(9聚體)或十肽(10聚體)。此處，具有誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的活性的肽，是指具有可刺激殺傷性T細(xì)胞(細(xì)胞毒性T細(xì)胞/CTL)的T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽。為了獲得具有高親和力和殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽，天然的CDH3的部分肽的氨基酸序列可能通過取代，刪除，插入和/或增加一個，兩個或幾個氨基酸而被改變。此處，“幾個”指5個或更少，優(yōu)選的為3個或更少，更優(yōu)選為2個或更少。此外，由于具有HLA抗原高親和性的肽序列的規(guī)則性是已知的(KuboRT，etal.，(1994)J.Immunol.，152=3913-24；RammenseeHG,etal.,(1995)Immunogenetics.41178-228；KondoA,etal.(1995)J.Immunol.155:4307_12)，可以依據(jù)該規(guī)則性來改變本發(fā)明的肽(抗原表位肽)以提高肽對HLA抗原的親和力。例如，將自N-端起的第二個氨基酸替換為亮氨酸或者甲硫氨酸，可以獲得與HLA-2具有高結(jié)合親和力的肽。相似地，將C-端的氨基酸替換為纈氨酸或亮氨酸，也可以獲得具有與HLA-2的高結(jié)合親和力的肽。當(dāng)抗原表位肽的序列與具有不同功能的內(nèi)源或外源蛋白的一部分氨基酸序列相同時，會引起包括自身免疫異?；?qū)μ囟ㄎ镔|(zhì)的過敏反應(yīng)在內(nèi)的副作用。為了避免這樣的副作用，改變后的抗原表位肽應(yīng)該與已知蛋白的氨基酸序列不同。為了這個目的，有必要利用已有的數(shù)據(jù)庫進行同源搜索來確認(rèn)沒有與改變后的抗原表位肽有100%的相似性而功能不同的內(nèi)源或外源蛋白。通過這個過程，可以避免上面提到的為了增加與HLA抗原的結(jié)合親和力和/或為了增加殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性而改變氨基酸序列帶來的風(fēng)險。雖然上述的具有對HLA抗原的高結(jié)合親和力的肽有希望成為高效的癌癥疫苗，對于用高親和力作為指標(biāo)選出的候選肽，必須檢查它們是否確實具有殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。殺傷性τ細(xì)胞誘導(dǎo)活性可以通過下面的方法確認(rèn)誘導(dǎo)具有人MHC抗原的抗原呈遞細(xì)胞(如，B-淋巴細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞)，或更具體地，誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞來源的樹突細(xì)胞；用感興趣的肽刺激這些細(xì)胞；然后將它們與CD8陽性細(xì)胞混合；測量對靶細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。反應(yīng)體系可以使用表達人HLA抗原(例如，BenMohamedL，etal.，(2000)Hum.Immunol.61(8):764_79，及相關(guān)文章、書籍和鏈接所述的)的轉(zhuǎn)基因動物。例如，可以用51Cr或類似的同位素標(biāo)記靶細(xì)胞，依據(jù)靶細(xì)胞釋放的放射性來計算細(xì)胞毒活性?；蛘?，可以通過以下方法檢查靶細(xì)胞在具有固定化肽的抗原呈遞細(xì)胞存在的情況下，測量從殺傷性T細(xì)胞中產(chǎn)生和釋放的IFN-γ；然后用抗IFN-γ的單抗來使培養(yǎng)基上產(chǎn)生IFN-γ的區(qū)域可見。如實施例子所示，對肽的殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的檢查結(jié)果表明對HLA抗原具有高結(jié)合親和力的肽不一定有高的殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。然而，含有氨基酸序列CDH3-4(FILPVLGAV(SEQIDNO1))或CDH3-7(FIIENLKAA(SEQIDNO2))的肽顯示出特別高的殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性。如上所述，本發(fā)明提供具有殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽，更具體來說，包含氨基酸序列SEQIDNO:1或2，或其變體(也就是其中一個，兩個，或幾個氨基酸被替換，刪除，插入和/或增加的氨基酸序列)的肽。對于包含SEQIDNO:1或2或其變體的九個氨基酸的肽，它們的氨基酸序列優(yōu)選是與其他內(nèi)源性蛋白不一致的。尤其是，可以通過用亮氨酸或甲硫氨酸替換N-端起第二個氨基酸，和/或用纈氨酸或亮氨酸來替換C-端的氨基酸，來獲得具有針對HLA-A2的高結(jié)合親合力的肽。本發(fā)明的肽可包括修飾如糖基化、側(cè)鏈氧化和磷酸化，以肽不喪失殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性為限。其他修飾包括，如，D-氨基酸或其他可以用來增加肽的血清半衰期的氨基酸類似物。用于獲得和制造本發(fā)明的肽的方法沒有特別限制。本發(fā)明的肽可以是化學(xué)合成的肽或者是通過基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組肽。本發(fā)明的化學(xué)合成的肽可以依照化學(xué)合成方法如Fmoc法(芴甲氧羰基法)和t-Boc法(叔丁氧羰基法)來合成。本發(fā)明的肽也可以利用各種商用肽合成儀合成。本發(fā)明的肽可以作為重組蛋白來制備，方法是獲得具有編碼該肽或其變體或其同源物的核酸序列的DNA，并將它們導(dǎo)入到合適的表達系統(tǒng)中。表達載體優(yōu)選地可以是任何這樣的載體其可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制或可整合入宿主細(xì)胞染色體，并且在合適的位點包含啟動子，使得肽的編碼基因能夠表達?？梢酝ㄟ^將上述的表達載體轉(zhuǎn)入宿主來產(chǎn)生含本發(fā)明肽的編碼基因的轉(zhuǎn)化體。宿主可以是任何細(xì)菌，酵母，動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞，并且可以根據(jù)宿主的情況使用任何已知技術(shù)將表達載體轉(zhuǎn)入宿主。本發(fā)明中，可以通過培養(yǎng)如上所述的轉(zhuǎn)化體，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生和積累肽，從培養(yǎng)物中收集肽，來分離本發(fā)明的重組肽。當(dāng)轉(zhuǎn)化體是原核生物如大腸桿菌(E.coli)或真核生物如酵母時，用于培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基既可以是天然培養(yǎng)基也可以是合成培養(yǎng)基，只要其包含了碳源，氮源，礦物質(zhì)等可以被微生物利用的物質(zhì)且便于有效率地培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體即可。培養(yǎng)條件可以是常用的微生物培養(yǎng)條件。培養(yǎng)后，可以用常規(guī)的肽分離純化方法從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)基中分離純化本發(fā)明的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的編碼核苷酸序列的信息來適當(dāng)?shù)禺a(chǎn)生或獲得包含在SEQIDNO:1或2的氨基酸序列中替換或增加一個，兩個或幾個氨基酸而成的氨基酸序列的肽。具體來說，對于包含在SEQIDNO:1或2的氨基酸序列中替換、刪除、插入、和/或增加一個、兩個或幾個氨基酸而得到的氨基酸序列、并且具有殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用例如化學(xué)合成，基因工程或誘變等任何方法來生產(chǎn)其編碼基因。例如，基因工程技術(shù)之一的定點誘變技術(shù)是有用的，因為該技術(shù)可以在特定的位置引入特定的突變。可以按照MolecularCloningALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY.,1989(下文簡禾爾MolecularCloning2ndEd.),CurrentProtocolinMolecularBiology,Supplement1-38，JohnWiley&Sons(1987—1997)(下文簡稱CurrentProtocolinMolecularBiology)及類似的文獻中描述的方法來進行定點誘變操作。本發(fā)明中的上述肽可以引起抗癌免疫反應(yīng)，下面的實施例中有詳細(xì)描述。所以，根據(jù)本發(fā)明，提供用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的包含本發(fā)明肽的藥劑。本發(fā)明的誘導(dǎo)免疫力的藥劑也可以通過組合2種或更多種抗原表位肽來制備成混合配制劑。通過混合多種肽組成的誘導(dǎo)免疫力的藥劑可以是一種雞尾酒(cocktail)，或用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將多種肽互相連接而成。組合的抗原表位肽可以是來源于相同基因的具有不同氨基酸序列的肽，或者是具有來源于不同基因的氨基酸序列的肽。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明中的肽時，施用的肽被密集地呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的HLA抗原上，然后與施用的肽和HLA抗原形成的復(fù)合物特異地反應(yīng)的殺傷性T細(xì)胞被誘導(dǎo)出來?；蛘?，通過使從受試者處收集的樹突細(xì)胞接觸本發(fā)明的肽(或通過利用本發(fā)明的肽沖激從受試者處收集的樹突細(xì)胞)，可以獲得在其細(xì)胞表面呈遞本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞。將這些抗原呈遞細(xì)胞輸回受試者體內(nèi)，則可在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出殺傷性T細(xì)胞，結(jié)果是針對呈遞本發(fā)明肽的靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)被增強。當(dāng)按照本發(fā)明將誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的藥劑用于體外或體內(nèi)，優(yōu)選的是體外時，可以誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞，殺傷性T細(xì)胞，或者包括這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群，因此產(chǎn)生針對癌癥的免疫力。(2)按照本發(fā)明用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物制劑(癌癥疫苗)實施例中顯示了本發(fā)明的肽可以在體內(nèi)誘導(dǎo)特異針對癌細(xì)胞的殺傷性T細(xì)胞。而且，先前的發(fā)明顯示CDH3在大多數(shù)病例中高表達，如胰腺癌，膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞肺癌，睪丸癌，宮頸癌，骨肉瘤，軟組織瘤等。因此，包括本發(fā)明的肽的用于誘導(dǎo)免疫力的藥劑可望作為治療和/或預(yù)防癌癥的有效藥劑。即，通過將本發(fā)明的肽與適當(dāng)?shù)淖魟┮黄鹱⑸涞襟w內(nèi)，或使用該肽沖激抗原呈遞細(xì)胞如樹突細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)和激活能攻擊腫瘤的殺傷性T細(xì)胞，其結(jié)果是可以預(yù)期產(chǎn)生抗癌效果。此外，可以將編碼本發(fā)明肽的基因整合到合適的載體中。轉(zhuǎn)化了重組DNA的抗原呈遞細(xì)胞(樹突細(xì)胞等)和細(xì)菌如BCG結(jié)核分枝桿菌(Mycobaceriumtuberculosis)，或基因組中整合了編碼本發(fā)明肽DNA的病毒如牛痘病毒，可以有效地用作活疫苗來治療和/或預(yù)防人類癌癥。癌癥疫苗的使用劑量和施用方法與通常的天花疫苗或BCG疫苗相同。本發(fā)明中涉及的詞匯“疫苗”(也稱免疫原性組合物)指這樣的一種物質(zhì)，當(dāng)對動物接種該物質(zhì)后，可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力或抑制各種癌癥。依照本發(fā)明，包含SEQIDNO1或2的氨基酸序列的肽可能是HLA-A2限制性抗原表位肽，它可以誘導(dǎo)強的、特異的抗CDH3呈遞細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明也包括用含SEQIDNO:1或2的氨基酸序列的肽或其變體來誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的方法，所述變體可以含有一個，兩個，或更多個氨基酸的替換，刪除，或添加。一般說來，抗腫瘤免疫力包括下面的免疫應(yīng)答(1)誘導(dǎo)針對含⑶H3表達細(xì)胞的腫瘤的殺傷性T細(xì)胞；(2)誘導(dǎo)識別含⑶H3表達細(xì)胞的腫瘤的抗體；和(3)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗癌細(xì)胞因子。如果通過對動物接種某種特定的肽，該肽可以誘導(dǎo)出這些免疫應(yīng)答中的任何一種，即確定這種肽具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力效果?？梢酝ㄟ^觀察宿主體內(nèi)或體外對此肽的免疫應(yīng)答來確定該肽對抗癌免疫力的誘導(dǎo)。例如，檢測殺傷性T細(xì)胞的誘導(dǎo)的方法已為人所熟知。侵入活體內(nèi)的外源物質(zhì)通過抗原呈遞細(xì)胞(APC)的作用被呈遞給T細(xì)胞和B細(xì)胞。以抗原特異的方式對抗原呈遞細(xì)胞呈遞的抗原作出應(yīng)答的T細(xì)胞，通過抗原的刺激，分化成為殺傷性T細(xì)胞(也稱細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞或CTL)，接著增殖。此處，將該過程稱作T細(xì)胞的“活化”。特定的肽對殺傷性T細(xì)胞的誘導(dǎo)可以通過利用經(jīng)肽沖激的抗原呈遞細(xì)胞將該肽呈遞給T細(xì)胞，然后檢測殺傷性T細(xì)胞的誘導(dǎo)，來進行評估。此外，抗原呈遞細(xì)胞有激活⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞的效果。由于CD4+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中很重要，可以將這些細(xì)胞的活化效果作為評價肽的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力的效果的指標(biāo)。用樹突細(xì)胞(DC)作為抗原呈遞細(xì)胞來誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的評估殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)效果的方法是本領(lǐng)域已熟知的。在抗原呈遞細(xì)胞中，DC有最強的殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)效果。此方法包括首先使測試肽接觸DC細(xì)胞，然后使該DC細(xì)胞接觸T細(xì)胞。從與DC接觸后的T細(xì)胞中檢出對靶細(xì)胞有細(xì)胞毒作用的T細(xì)胞。如果T細(xì)胞對靶細(xì)胞顯示細(xì)胞毒活性，表示測試肽有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。例如，殺傷性T細(xì)胞對靶細(xì)胞，如腫瘤細(xì)胞的活性可以用51Cr-標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的裂解作為指標(biāo)來檢測。或者，可以通過用3H-胸腺嘧啶攝取活性或乳糖脫氫酶的釋放作為指標(biāo)來評價對腫瘤細(xì)胞的破壞程度。用這些方法確認(rèn)的具有殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的測試肽是具有DC活化效果和后續(xù)的殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的肽。所以，誘導(dǎo)針對腫瘤的細(xì)胞殺傷性T細(xì)胞的肽可以作為針對呈遞CDH3的癌癥的疫苗。而且，通過接觸此肽而獲得誘導(dǎo)針對癌癥的殺傷性T細(xì)胞的活性的抗原呈遞細(xì)胞可以作為抗癌疫苗。此外，通過抗原呈遞細(xì)胞呈遞肽而獲得細(xì)胞毒性的殺傷性T細(xì)胞也可以作為針對呈遞CDH3的癌癥的疫苗。利用抗原呈遞細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞所致的抗腫瘤免疫來治療癌癥的方法叫做細(xì)胞免疫治療。一般而言，當(dāng)利用肽進行細(xì)胞免疫治療時，通過組合具有不同結(jié)構(gòu)的多種肽可以提高殺傷性T細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。所以，當(dāng)用蛋白片段刺激DC時，使用多于一種的肽段的混合物比較有利。肽對抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)也可以通過觀察針對腫瘤的抗體的產(chǎn)生來評估。例如，若用肽免疫的實驗動物中誘導(dǎo)出針對該肽的抗體，而且如果這些抗體能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，增殖和/或轉(zhuǎn)移，則可確認(rèn)這些肽可誘導(dǎo)抗癌免疫力。施用本發(fā)明的疫苗可以誘導(dǎo)抗腫瘤免疫力，抗腫瘤免疫力的誘導(dǎo)有助于治療和預(yù)防癌癥。治療癌癥或者預(yù)防癌癥發(fā)病的效果可包括癌細(xì)胞生長的抑制，癌細(xì)胞的衰退，和癌細(xì)胞發(fā)展的抑制。降低癌癥個體的死亡率、減少血液中的腫瘤標(biāo)志物、和減輕癌癥伴隨的可檢測癥狀也包括在治療或預(yù)防癌癥的效果中。這種抗癌疫苗的治療或預(yù)防的效果優(yōu)選與沒有接種疫苗的對照組相比是在統(tǒng)計學(xué)上顯著的。例如，觀察到這種效果的顯著性水平小于或等于5%。用于確定統(tǒng)計顯著性的統(tǒng)計方法有例如，Studentt檢驗，Marm-WhitneyU檢驗，或AN0VA。在本發(fā)明中，受試者優(yōu)選是哺乳動物。實例包括人類，非人靈長類，小鼠，大鼠，狗，貓，馬或牛，但是不局限于這些?？梢詫κ茉囌唧w內(nèi)或回體施用本發(fā)明的肽。此外，為了產(chǎn)生用于治療或預(yù)防癌癥的免疫原性組合物，可以使用本發(fā)明的免疫原性肽，即SEQIDNO:1或2的氨基酸序列，或從其變體肽中選擇出的九肽。更具體來說，本發(fā)明提供用于治療腫瘤或預(yù)防腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等的藥物制劑，該制劑包括一種或多種本發(fā)明的肽作為活性成分。本發(fā)明的肽對于治療胰腺癌，膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞肺癌，睪丸癌，宮頸癌和腫瘤如骨肉瘤和軟組織肉瘤特別有用。本發(fā)明的肽可以使用常規(guī)的配制方法配制成藥物制劑施用受試者。除了本發(fā)明中的肽，這種制劑可以包括藥用載體、賦形劑、和其他需要的成分。本發(fā)明的藥物藥劑可以用于治療和預(yù)防各種腫瘤。而且，為了有效的建立細(xì)胞免疫，在包含一種或更多種本發(fā)明的肽作為活性成分用于治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物制劑中可以摻入佐劑?；蛘?，此組合物可以與其他活性成分如抗腫瘤劑共同施用。適當(dāng)?shù)闹苿┻€包括顆粒劑。適當(dāng)?shù)淖魟┰谖墨I(JohnsonAG.,(1994)Clin.Microbiol.Rev.，7:277_89)中有所描述。佐劑的例子包括非完全弗氏佐劑，BCG,海藻糖(TDM)，脂多糖(LPS)，明礬佐劑，二氧化硅佐劑，磷酸鋁，氫氧化鋁，和硫酸鋁鉀，但不局限于這些。此外，也可以方便的使用脂質(zhì)體制劑，藥物附著在幾微米直徑的珠子上的顆粒劑，以及通過將脂類與前面提到的肽結(jié)合起來形成的藥劑。施用方法可以是口服，皮內(nèi)注射，皮下注射，靜脈注射等，并且包括全身施用或在目標(biāo)腫瘤附近局部施用。本發(fā)明的肽的使用劑量可以根據(jù)治療的疾病，患者的年齡、體重，施用的方法等進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。劑量通常是0.001毫克到1，000毫克，優(yōu)選的是0.01毫克到100毫克，更優(yōu)選的是0.1毫克到10毫克。優(yōu)選的是幾天施用一次到幾個月施用一次，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地選擇合適的劑量和施用方法，并且完全可以在常規(guī)技術(shù)的范圍內(nèi)選擇和優(yōu)化這些參數(shù)。制劑的形式也無特別限制，可以凍干或通過加入糖等賦形劑制粒。本發(fā)明的藥物制劑中可以添加用來增加腫瘤反應(yīng)性的T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的佐劑，包括BCG細(xì)菌的細(xì)菌成分和胞壁酰二肽(MDP)、在Nature，vol.344,p.873(1990)中提到的ISC0M、在J.Immunol,vol.148，p.1438(1992)中描述的皂角苷系列中的QS-21、脂質(zhì)體、和氫氧化鋁。此外，免疫刺激劑如香菇多糖(Ientinan)，西佐喃(sizofiran)，和溶鏈菌制劑(picibanil)也可以用作佐劑。可以加強T細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子等，如IL-2，IL-4，IL-12，IL-1，IL-6，和TNF，與通過與Toll樣受體結(jié)合激活天然免疫系統(tǒng)的CpG和脂多糖(LPS)和可以激活NKT細(xì)胞的α-半乳糖基神經(jīng)酰胺也可以用做佐劑。本發(fā)明的疫苗成分包括初次刺激(prime)殺傷性T細(xì)胞的成分。脂類已經(jīng)被確定為一類可以在體內(nèi)針對病毒抗原進行初次刺激的物質(zhì)。例如，可以在賴氨酸的ε-氨基和α-氨基上搭接棕櫚酸殘基，然后與本發(fā)明的免疫原性肽連接。然后脂質(zhì)肽可以通過摻入膠束或顆粒、包入脂質(zhì)體或乳化在佐劑中等任一方法直接施用。另一個脂類初次刺激的可能例子是，當(dāng)其與合適的肽共價結(jié)合時，用大腸桿菌(E.coli)脂蛋白，如三棕櫚酰-S-甘油酰半胱氨酰-絲胺酰-絲氨酸(P3CSS)進行初次刺激(DeresK.,etal.，(1989)Nature342561-4)。本發(fā)明的免疫原性肽還可以用病毒載體或細(xì)菌載體表達。適當(dāng)?shù)谋磉_載體的例子包括減毒的病毒宿主如牛痘或禽痘。例如，可以使用痘苗病毒作為載體來表達編碼所述肽的核苷酸序列。將重組痘苗病毒引入宿主細(xì)胞，表達免疫原性肽，引起免疫反應(yīng)。也可以使用在如美國專利4，722，848中描述過的使用痘苗載體進行免疫的方法。也可以使用卡介苗(BacilledeCalmetteetGuerin)(BCG)的。StoverCK等在(1991)Nature31:456_60中描述了BCG載體。可用于治療性施用或免疫的多種其他載體在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，這些載體包括腺病毒和腺伴隨病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，傷寒桿菌(傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi))載體和脫毒的炭疽毒素載體。參見，例如，ShataMT,etal.，(2000)Mol.Med.Today666-71；ShedlockDJandWeinerDBetal.，(2000)J.Leukoc.Biol.68:793_806；和HippJD,etal.，(2000)InVivol4:571_85。此外，為了在患者體內(nèi)有效的誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞，在體外加入抗原肽以便將抗原呈遞給從患者處收集來的細(xì)胞或呈遞給其他共有部分HLA等位基因(alio)的人的細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處?；蛘?，將此肽加入患者的外周血淋巴細(xì)胞并在體內(nèi)培養(yǎng)從而在體內(nèi)誘導(dǎo)出殺傷性T細(xì)胞后，這些細(xì)胞可以血管內(nèi)施用給患者或局部施用到腫瘤處。這種通過細(xì)胞轉(zhuǎn)移進行的治療作為一種癌癥治療方法已經(jīng)在實行并且是一種被熟悉此領(lǐng)域的人所熟知的方法。本發(fā)明的癌癥類型無特別限制，具體的例子包括食道癌，乳腺癌，甲狀腺癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，惡性黑素瘤，惡性淋巴瘤，骨肉瘤，嗜鉻細(xì)胞瘤，頭頸癌，子宮癌，卵巢癌，腦瘤，慢性白血病，急性白血病，腎癌，前列腺癌，肺癌，胃癌，肝癌，膽囊癌，睪丸癌、甲狀腺癌，膀胱癌和肉瘤。適合使用本發(fā)明的癌癥的例子優(yōu)選的是胰腺癌，膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌或肺癌。(3)本發(fā)明的抗體本發(fā)明涉及能夠識別作為抗原表位(抗原)的本發(fā)明上述的肽的一部分或完整的肽的抗體，還涉及通過利用該蛋白或該肽體外刺激而誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞。一般來說，殺傷性T細(xì)胞比抗體顯示出更強的抗腫瘤活性。此外，與本發(fā)明的肽相似，本發(fā)明抗體可用于預(yù)防和/或治療表達CDH3的癌癥，至少這些抗體能抑制癌癥抗原CDH3的活性。在一種具體的應(yīng)用中，本發(fā)明的肽或抗體可以直接施用，或與藥用載體和/或稀釋劑一起施用，如果需要可以與佐劑配合使用，施用方法可以是通過注射或者通過噴霧的粘膜透皮吸收之類的方法。更具體地說，人血清白蛋白可以作為此處提到的載體的例子，PBS、無菌水等可以作為稀釋液的例子。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來生產(chǎn)。例如，多克隆抗體的獲得可以用本發(fā)明的肽作為抗原免疫哺乳動物或鳥類，然后收集該動物或鳥類的血液，從收集來的血液中分離純化抗體。例如，可以用于免疫的哺乳動物有如小鼠，倉鼠，豚鼠，雞，大鼠，兔，狗，山羊，綿羊和牛，或鳥類。免疫的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，抗原可以以7到30天的間隔施用2到3次。劑量可以是，例如，每次施用約0.05毫克到2毫克的抗原。施用路徑可以是皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈、肌肉等任何適合的途徑施用，但不局限于此。此外，抗原可以在溶解于適當(dāng)?shù)木彌_液，例如，含常用的佐劑如弗氏完全佐劑或氫氧化鋁的緩沖液后再使用。經(jīng)過免疫的哺乳動物或鳥類飼養(yǎng)一定時間，當(dāng)抗體滴度增加后，可以再用如100微克到1000微克的抗原免疫它們。最后一次施用的一到兩個月后，從經(jīng)免疫的哺乳動物或鳥類收集血液，血液可以用常規(guī)方法來分離，從而以多克隆抗血清的形式獲得識別本發(fā)明肽的多克隆抗體，其中所述的常規(guī)方法包括如離心、用硫酸銨或聚乙二醇沉淀、以及層析例如凝膠過濾層析，離子交換層析和親和層析。單克隆抗體可以通過制備雜交瘤獲得。例如，雜交瘤細(xì)胞可以通過將抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合獲得。產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤可以通過如下面所述的細(xì)胞融合方法獲得。使用來自于經(jīng)免疫動物的脾細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞等作為抗體生產(chǎn)細(xì)胞。將本發(fā)明的肽用作抗原。如小鼠和大鼠這樣的動物可以用作經(jīng)免疫動物，對這些動物施用抗原可以使用常規(guī)方法來進行。例如，將作為抗原的本發(fā)明的肽與佐劑如弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑形成的懸浮液或乳化液，通過靜脈，皮下，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)等途徑免疫動物幾次。從免疫動物中獲取抗體生產(chǎn)細(xì)胞，如脾細(xì)胞，并可以用已知方法(G.Kohleretal.,Nature,256=495(1975))將它們與骨髓瘤細(xì)胞融合來產(chǎn)生雜交瘤。P3X63Ag8，P3U1，Sp2/0等小鼠是可用于細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞系的例子。細(xì)胞融合中使用融合促進劑如聚乙二醇和仙臺病毒，細(xì)胞融合后，依照常規(guī)方法使用次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基篩選雜交瘤。通過細(xì)胞融合獲得的雜交瘤可以用如有限稀釋法等方法來克隆。根據(jù)需要，產(chǎn)生特異識別本發(fā)明肽的單抗的細(xì)胞系可以用本發(fā)明的肽通過酶聯(lián)免疫測定篩選獲得。除上述方法之外，可以通過使用本發(fā)明的肽、表達所述肽的細(xì)胞、或其裂解物體外刺激人淋巴細(xì)胞，如感染了EB病毒的淋巴細(xì)胞，來制備免疫細(xì)胞。與本發(fā)明的肽結(jié)合的人抗體可以通過融合這樣的經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞和人來源的骨髓瘤細(xì)胞如U266(特開昭63-17688)來獲得。為了從這樣獲得的雜交瘤細(xì)胞中得到需要的單克隆抗體，可以用常規(guī)培養(yǎng)方法或腹水形成方法培養(yǎng)雜交瘤，可以從培養(yǎng)上清液或腹水中純化單克隆抗體。從培養(yǎng)上清液或腹水中純化單克隆抗體可以使用常規(guī)方法。例如，硫酸銨分級、凝膠過濾、離子交換層析、親和層析等，根據(jù)需要可以組合使用。此外，也可以用本發(fā)明肽，表達所述肽的細(xì)胞、或其裂解物來免疫具有一組人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動物?？梢詮慕?jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動物中獲取抗體生成細(xì)胞與上述骨髓瘤細(xì)胞系融合獲得雜交瘤。需要的單抗可以從雜交瘤中產(chǎn)生(W092-03918；W094-02602；W094-25585；W094-33735；W096-34096)?；蛘?，也可以使用癌基因使生產(chǎn)抗體的免疫細(xì)胞(如經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞)永生化，用來制備單克隆抗體。這樣獲取的單克隆抗體也可以用基因操作技術(shù)(BorrbaeckandLarrick，(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies)進行調(diào)節(jié)。例如，可以從抗體生產(chǎn)細(xì)胞(如雜交瘤和經(jīng)免疫的淋巴細(xì)胞)中克隆編碼抗體的DNA，將其插入適當(dāng)?shù)妮d體，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞來制備重組抗體。本發(fā)明的抗體還可以是抗體片段或修飾的抗體，只要它們可以與本發(fā)明的肽結(jié)合即可。抗體片段可以是Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v，或單鏈Fv(SCFv)，其中來自于H和L鏈的Fv片段以合適的接頭連接在一起(Hustonetal.，(1998)ProcNatlAcadSciUSA85:5879_83)。具體來說，可以用酶如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶(Coetal.，(1994)JImmunol152:2968-76;BetterandHorwitz,(1989)MethodsEnzymol178:476_96；PluckthunandSkerra,(1989)MethodsEmzymol178:497_515;Lamoyi(1986)MethodsEnzymol121:652-63;Rousseauxetal.,(1986)MethodsEnzymol121:663_9；BirdandWalker,(1991)TrendsBiotech9:132-7)來處理抗體，獲得抗體片段。本發(fā)明的抗體包括連接各種分子如聚乙二醇(PEG)而獲得的修飾抗體。抗體可以用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的常規(guī)的化學(xué)修飾方法來進行修飾。本發(fā)明的抗體包括嵌合抗體和人源化抗體，嵌合抗體包含來源于非人抗體的可變區(qū)和來源于人抗體的恒定區(qū)，人源化抗體包括來源于非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)、來源于人抗體的框架區(qū)(FR)和來源于人抗體的恒定區(qū)。這樣的抗體可以用本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的常規(guī)方法制備。人源化抗體是用具有需要的結(jié)合活性的人抗體的CDR序列區(qū)域取代嚙齒動物的CDR區(qū)而獲得的(Verhoeyenetal.，(1988)Science2391534-6)。相應(yīng)地，與嵌合抗體相比，人源化抗體是在一個更小的區(qū)域內(nèi)用相應(yīng)的非人源區(qū)域取代人抗體而得到的抗體。還可以制備具有人的框架區(qū)、恒定區(qū)和人的可變區(qū)的完整人抗體。例如，在一種體外方法中，可以利用展示人抗體片段的噬菌體重組文庫來進行篩選(HoogenboomandWinter,(1992)JMolBiol227:381-8)。相似地，可以通過將人免疫球蛋白基因座位引入內(nèi)源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的轉(zhuǎn)基因動物來制備人抗體(US6，150，584，US5,545，807，US5,545，806，US5,569，825，US5,625，126，US5,633，425，US5,661，016)。如上所述獲得的抗體可以用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法進行純化。例如，可以使用普通的蛋白分離和純化方法?？贵w的分離純化可以組合使用柱層析法如親和層析，過濾，超濾，鹽析，透析，SDS聚丙烯凝膠電泳，等電聚焦電泳等；但是分離純化方法不局限于這些方法(Antibodies:ALaboratoryManual，EdHarlowandDavidLane，(1988)ColdSpringHarborLaboratory)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作親和柱。蛋白A柱用的典型例子有HyperD,POROS禾口SepharoseF.F(Pharmacia)。除了親和層析外，離子交換層析，疏水層析，凝膠過濾，反相層析，吸附層析等也iM白勺M(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.etal.)。液相色譜如HPLC和FPLC也可以用作層析。本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合親和力可以用一些方法測量，例如，吸光率測定，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，酶免疫測定(EIA)，放射性免疫測定(RIA)，和免疫熒光測定；然而，方法不局限于此。對ELISA來說，將本發(fā)明的抗體固定在平板上，加入本發(fā)明的肽，再加入含有抗體生產(chǎn)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液或純化抗體的樣本。下一步，加入具有可檢測標(biāo)記、并且能夠識別抗原結(jié)合親和力待測的抗體的第二抗體。洗滌平板后，加入用于檢測第二抗體上標(biāo)記物的試劑，檢測吸光度等。例如，酶如堿性磷酸酶可以用作第二抗體的標(biāo)記物，酶底物如磷酸對硝基苯酯可以用作檢測試劑。BIAcore(Pharmacia)也可以用于評估抗體活性。本發(fā)明的抗體可以檢測包含在樣品中的本發(fā)明的肽。即，例如，通過將癌組織的活檢樣本暴露于本發(fā)明的抗體，可以確認(rèn)本發(fā)明的肽在癌組織中的存在。在使用本發(fā)明肽治療和/或預(yù)防癌癥之前，用本發(fā)明的抗體確認(rèn)本發(fā)明肽在將進行治療的癌癥中的表達情況，可以在治療前對是否能夠有效治療受試者進行預(yù)測。此外，由于本發(fā)明抗體識別CDH3肽片段，而該肽段的表達在癌細(xì)胞中增加，所以認(rèn)為該肽段不僅可以應(yīng)用于診斷，也可以用于治療。(4)輔助性T細(xì)胞，殺傷性T細(xì)胞，或包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的肽在體外刺激產(chǎn)生的輔助性T細(xì)胞，殺傷性T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞群。例如，當(dāng)使用本發(fā)明肽在體外刺激外周血淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞時，可誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤反應(yīng)性的活化的T細(xì)胞，這些活化的T細(xì)胞可以有效地用于過繼性免疫治療。此外，作為強力的抗原呈遞細(xì)胞，樹突細(xì)胞也可以用本發(fā)明肽進行沖激或可以通過轉(zhuǎn)化來表達這些肽，然后可以利用這些樹突細(xì)胞在體內(nèi)或體外刺激T細(xì)胞來誘導(dǎo)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，可以使用本發(fā)明的肽和免疫刺激劑進行體外刺激，來產(chǎn)生輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞或包含它們的免疫細(xì)胞群。此處的免疫刺激劑包括細(xì)胞生長因子或細(xì)胞因子。向體內(nèi)輸注如上所述獲得的輔助性T細(xì)胞，殺傷性T細(xì)胞或包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群，可以抑制腫瘤細(xì)胞并且可以預(yù)防和/或治療癌癥。如上所述的可以抑制腫瘤的輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞，或包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群，也可以用本發(fā)明的肽來制備。所以，本發(fā)明提供含有本發(fā)明肽的細(xì)胞培養(yǎng)基?？梢杂眠@樣的細(xì)胞培養(yǎng)基制備可以抑制腫瘤的輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞，或包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群。此外，本發(fā)明提供包括上述的細(xì)胞培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒用于制備輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞，或包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群。(5)抗原呈遞外來體本發(fā)明進一步提供一種稱為“外來體”(exosome)的細(xì)胞內(nèi)小泡，該外來體將本發(fā)明肽和HLA抗原之間形成的復(fù)合物呈遞到其表面。外來體可以使用例如在第平11-510507號和第2000-512161號中公開的日語翻譯中詳細(xì)描述的方法進行制備。優(yōu)選地，可以用從治療和/或預(yù)防的目標(biāo)受試者獲取的抗原呈遞細(xì)胞來制備該外來體?？梢杂门c本發(fā)明肽相似的方式將本發(fā)明的外來體作為癌癥疫苗接種。在本發(fā)明中使用的HLA抗原類型應(yīng)該與需要治療和/或預(yù)防的受試者的HLA抗原類型相匹配。例如HLA-A2，優(yōu)選的是HLA-A2(HLA-A*0201)?！癏LA-A2”表示蛋白，“HLA-A*0201”表示與該蛋白的區(qū)段相應(yīng)的基因(使用這種叫法是因為目前沒有代表該蛋白區(qū)段的詞)。(6)誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞和殺傷性T細(xì)胞的方法本發(fā)明提供使用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的方法?？梢杂帽景l(fā)明的一種或多種肽沖激由外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)而來的樹突細(xì)胞來誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞。當(dāng)對受試者施用本發(fā)明的肽時，可以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出在其表面呈遞本發(fā)明的肽的抗原呈遞細(xì)胞?；蛘?，使抗原呈遞細(xì)胞與本發(fā)明的肽接觸后(或在利用本發(fā)明肽沖激抗原呈遞細(xì)胞之后)，可以將該細(xì)胞作為疫苗用回體施用方法施用給受試者。例如，回體施用方法包括步驟(1)從受試者處收集抗原呈遞細(xì)胞；和(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細(xì)胞接觸本發(fā)明的肽(或者利用本發(fā)明肽沖激步驟(1)中的抗原呈遞細(xì)胞)。可以將從步驟(2)中獲取的抗原呈遞細(xì)胞作為疫苗施用受試者。本發(fā)明也包括提供誘導(dǎo)具有高水平的殺傷性T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法。這種方法包括體外轉(zhuǎn)染基因進入抗原呈遞細(xì)胞，此基因包含編碼一種或多種本發(fā)明的肽的多核苷酸。用于轉(zhuǎn)染的基因可以是DNA或RNA。在轉(zhuǎn)染方法方面，本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種方法均可適用，如脂質(zhì)體，電穿孔和磷酸鈣方法，但不局限于此。具體來說，轉(zhuǎn)染可以按照ReevesME,etal.，(1996)CancerRes.,56:5672_7；ButterfieldLH,etal.，(1998)J.Immunol.，161:5607_13；BoczkowskiD，etal.，(1996)JExp.Med.，184:465_72；和TO2000-509281的日語譯本中的描述進行。當(dāng)基因轉(zhuǎn)入抗原呈遞細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)得以轉(zhuǎn)錄和翻譯。這樣獲得的蛋白沿著I型MHC或II型MHC通路進行加工，經(jīng)過抗原呈遞通路并且以部分肽的形式呈遞在抗原呈遞細(xì)胞的表面。本發(fā)明進一步提供用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的方法。通過將一種或多種本發(fā)明的肽施用于受試者，可以在受試者體內(nèi)誘導(dǎo)出殺傷性T細(xì)胞，從而加強針對腫瘤組織中呈遞CDH3的癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。另一種方式，可以通過在體外使來自受試者的抗原呈遞細(xì)胞和CD8陽性細(xì)胞與一種或多種本發(fā)明的肽接觸，然后進一步體外使外周血單核白細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞接觸來刺激細(xì)胞從而誘導(dǎo)活化的殺傷性T細(xì)胞。在回體治療方法中，可以通過將活化的殺傷性T細(xì)胞回輸給受試者來增強針對受試者癌組織中呈遞CDH3的目標(biāo)癌細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。例如，此方法包括步驟；(1)從受試者收集抗原呈遞細(xì)胞；(2)使步驟(1)中的抗原呈遞細(xì)胞接觸本發(fā)明的肽(或利用本發(fā)明的肽沖激步驟(1)中的抗原呈遞細(xì)胞)；(3)，將(2)中的抗原呈遞細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞混合并共培養(yǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞；禾口(4)從(3)共培養(yǎng)物中收集⑶8+T細(xì)胞從(4)中獲得的具有細(xì)胞毒性的CD8+T細(xì)胞可以作為疫苗施用受試者。本發(fā)明進一步提供分離用一種或多種本發(fā)明的肽誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，用本發(fā)明的方法誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞是來源于要進行治療和/或預(yù)防的受試者。它們可以和其他藥劑，包括呈遞本發(fā)明一種或多種肽的抗原呈遞細(xì)胞或外來體，組合施用。獲得的殺傷性T細(xì)胞特異性地針對呈遞與誘導(dǎo)所用的肽相同的肽的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞是內(nèi)源性表達CDH3的細(xì)胞或者是轉(zhuǎn)染了CDH3基因的細(xì)胞。經(jīng)過本發(fā)明的肽刺激而在其表面呈遞本發(fā)明的肽的細(xì)胞，如來自于胰腺癌，膽管細(xì)胞癌，胃癌，結(jié)腸癌，非小細(xì)胞肺癌，睪丸癌，宮頸癌，骨肉瘤和軟組織肉瘤的癌細(xì)胞，可以作為攻擊的目標(biāo)。本發(fā)明也提供呈遞HLA抗原和一種或多種本發(fā)明的肽的復(fù)合物的抗原呈遞細(xì)胞。表達一種或多種本發(fā)明的肽或編碼這些肽的核苷酸的抗原呈遞細(xì)胞，優(yōu)選地是從將進行治療和/或預(yù)防的受試者收集獲得的。本發(fā)明的肽、呈遞此肽的抗原呈遞細(xì)胞、外來體、或活化的殺傷性T細(xì)胞，可以作為疫苗與其他藥劑組合使用。將在下面的實施例中對本發(fā)明作進一步的說明。然而，本發(fā)明不局限于這些實施例。本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻均通過援弓I方式并入本文。實施例[實施例1]⑶H3在惡性腫瘤中的表達根據(jù)此前cDNA基因微陣列分析的結(jié)果，在包括胃癌，大腸癌等多種惡性腫瘤中，CDH3的表達高于臨近的正常組織(表1)(NakamuraT，etal.，Oncogene2004；232385-2400；Kitahara0，CancerRes2001；613544-3549.，ObamaK,etal.,Hepatology2005；411339-1348.)。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*相對表達比(癌癥/正常組織)>5時視為“陽性”。[實施例2]具有結(jié)合HLA-A2能力的⑶Η3肽庫的選擇。利用BIMAS系統(tǒng)對人CDH3氨基酸序列進行搜索，按照與HLA-A2的推定結(jié)合親和性進行降序排列并選擇出結(jié)合能力較強的18種肽(表2)。[表2]結(jié)合能肽_M_肽的氨基酸序列_力得分CDH3-1659-677VLGAVLALL(SEQIDNO:3)84CDH3-2629-637QLTVIRATV(SEQIDNO:4)70CDH3-3602-610VYLSLKKFL(SEQIDNO:5)65CDH3-4655-663FILPVLGAV(SEQIDNO:1)49CDH3-5419-428KLPTSTATI(SEQIDNO:6)37CDH3-6564-572VLNITDKDL(SEQIDNO:7)36CDH3-7757-765FIIENLKAA(SEQIDNO:2)30CDH3-8187-195AVSENGASV(SEQIDNO:8)25CDH3-9152-160SPPEGVFAV(SEQIDNO:9)25CDH3-10228-237VLPGTSVMQV(SEQIDNO:10)272CDH3-11500-509TLDREDEQFV(SEQIDNO:11)153CDH3-12419-428KLPTSTATIV(SEQIDNO:12)100CDH3-13440-449FVPPSKVVEV(SEQIDNO:13)64CDH3-1466-75FSTDNDDFTV(SEQIDNO:14)50CDH3-152-11GLPRGPLASL(SEQIDNO:15)49CDH3-16101-110ILRRHKRDWV(SEQIDNO:16)24CDH3-17223-232SVLEGVLPGT(SEQIDNO:17)23CDH3-18655-664FILPVLGAVL(SEQIDNO:18)_20本發(fā)明鑒定出的HLA-A2限制性殺傷性T細(xì)胞表位用下劃線進行標(biāo)識。[實施例3]首先，利用此前描述的方法(KomoriHetal.ClinicalCancerResearch12:2689-2697,2006)從HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞中誘導(dǎo)出樹突細(xì)胞(DC)。隨后，如此獲得的BM-DC用CDH3肽(10μΜ)沖激后，以5ΧIO5個細(xì)胞/小鼠的量腹膜內(nèi)施用給HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠。以一周間隔施用兩次進行免疫之后，將小鼠脾細(xì)胞收集起來用于檢測殺傷性T細(xì)胞。為了能夠精確地測定來源于⑶8+Τ細(xì)胞的殺傷性T細(xì)胞的誘導(dǎo)，在摘出脾臟后利用MACS微珠去除脾細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞，使用這樣的脾細(xì)胞。圖1展示的是用于確定能夠被HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中的HLA-A2限制性殺傷T細(xì)胞識別的CDH3肽的規(guī)程。將從免疫過的小鼠中收集脾細(xì)胞的日期設(shè)定為“第0天”。第21天(1)通過向來自于HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的骨髓細(xì)胞加入GM-CSF來啟動骨髓來源的樹突細(xì)胞(下文中將其稱為“BM-DC”)的誘導(dǎo)。第14天⑵向誘導(dǎo)出的BM-DC中加入含有三種⑶H3肽的混合物。兩小時之后以5XIO5個細(xì)胞/小鼠的量腹膜內(nèi)施用該BM-DC。以1周的間隔重復(fù)(1)和⑵步驟兩次。第0天從免疫過的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中收獲脾細(xì)胞，并將該細(xì)胞與BM-DC共培養(yǎng)六天，在共培養(yǎng)之前利用CDH3肽再次孵育該BM-DC兩小時。第6天為了檢測能夠識別⑶H3的殺傷性T細(xì)胞，在抗原刺激之后利用ELISP0T測定對T細(xì)胞產(chǎn)生的伽瑪干擾素(IFN-Y)進行了定量。使用經(jīng)⑶H3肽沖激過的BM-DC和未沖激過的BM-DC作為靶細(xì)胞。通過ELISP0T測定考察⑶H3特異性殺傷T細(xì)胞的活性為了確認(rèn)在這些細(xì)胞中確實已經(jīng)存在能夠特異地與⑶H3反應(yīng)并產(chǎn)生IFN-γ的殺傷性T細(xì)胞，通過ELISP0T測定對其進行了考察。利用MouseIFN-YELISPOTSet(BDBiosciences)檢測了IFN-γ。當(dāng)殺傷性T細(xì)胞(效應(yīng)物)對刺激物細(xì)胞(靶)產(chǎn)生應(yīng)答并生成IFN-γ時，IFN-γ可以作為紅色斑點被檢測到。使用BM-DC或者經(jīng)CDH3肽沖激的BM-DC作為靶細(xì)胞。首先，利用抗小鼠IFN-γ抗體包被ELISP0T板(BDBiosciences)18個小時，然后利用10%FCS/RPMI封閉2小時。將效應(yīng)物細(xì)胞(100微升/孔)和靶細(xì)胞(100微升/孔)混合，并在37°C培養(yǎng)22小時。該實驗是按照效應(yīng)物/靶比例(E/T比)為101進行的。然后利用無菌水洗滌該板并使該板與生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-Y反應(yīng)兩小時，此后進一步的與鏈霉抗生物素蛋白-HRP反應(yīng)一小時。在底物溶液中檢出了IFN-Y陽性點。使用MINERVATECH的自動分析軟件對斑點進行了計數(shù)。結(jié)果是，在利用⑶H3-4或者⑶H3-7兩種肽誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞中觀察到了CDH3特異性殺傷T細(xì)胞免疫應(yīng)答，而用其他的肽誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞中則沒有觀察到CDH3特異性免疫應(yīng)答(圖2和3)。用CDH3-4肽(SEQIDNO1)和CDH3-7肽(SEQIDNO2)誘導(dǎo)的殺傷性T細(xì)胞的ELISP0T測定結(jié)果如圖3所示。針對用CDH3-4肽(SEQIDNO1)沖激過的BM-DC，殺傷性T細(xì)胞顯示了283.7士40.0個點/孔的應(yīng)答，但是在未經(jīng)肽沖激的BM-DC存在的情況下殺傷性T細(xì)胞顯示出48.7士11.9個點/孔的應(yīng)答(P<0.05)。同樣地，針對用CDH3-7肽(SEQIDNO2)沖激過的BM-DC，殺傷性T細(xì)胞顯示了79.3士3.2個點/孔的應(yīng)答，而在未肽沖激的BM-DC存在的情況下顯示出42.7個點/孔(P<0.05)。統(tǒng)計分析使用雙尾Studentt檢驗(Two-tailedStudent'sttest)方法來評估從ELISPOT測定獲得的數(shù)據(jù)及治療群體的腫瘤大小的統(tǒng)計顯著性。P值<0.05認(rèn)為是顯著的。統(tǒng)計分析使用商業(yè)的統(tǒng)計學(xué)分析軟件(SPSSforWindows(TM),version11.0,Chicago,IL,USA)[實施例4]細(xì)胞系和HLA表達用于評估細(xì)胞毒活性的人胰腺癌細(xì)胞系PANC1、口腔癌細(xì)胞系HSC3、和TAP-缺陷與HLA-A2(A*0201)陽性細(xì)胞系T2均是從RikenCellBank(Tsukuba,Japan)購買的。人胰腺癌細(xì)胞系PK8由日本東北大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)用細(xì)胞資源中心友情提供。人結(jié)腸癌MIMMHCTl16SDr.B.Vogelstein,JohnsHopkinsUniversity(Baltimore,MD)^ffil供。人肝癌細(xì)胞系SKH印1由日本久留美大學(xué)(Kurume,Japan)伊藤恭悟教授友情提供。為了篩選HLA-A2陽性血供體和用于細(xì)胞毒性測定的靶細(xì)胞系，用抗HLA-A2單克隆抗體(mAb)BB7.2(OneLambda,Inc.，CanogaPark,CA,USA)對HLA-A2的表達情況進行流式細(xì)胞術(shù)檢測。這些細(xì)胞用加有10%FCS的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基在37°C5%CO2中培養(yǎng)。慢病毒基因轉(zhuǎn)移慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的操作按照先前的描述進行(Tahara-HanaokaS，etal.ExpHematol2002;30:11-17)。簡言之，使用Lipofectamine2000(InvitrogenCorporation,CA,USA),將攜帶CDH3cDNA的17微克自滅活載體CSII-CMV-RfA禾口CSIIEF-RfA(MiyoshiH,etal.JViro11998；72:8150—8157)與10微克pCMV-VSV-G-RSV-Rev和pCAG-HIVgp轉(zhuǎn)入10厘米培養(yǎng)皿上生長的293T細(xì)胞。60小時后，回收培養(yǎng)基，用超速離心法(50，OOOxg,2小時)沉降病毒顆粒。用50微升RPMI1640培養(yǎng)基重懸沉淀，將10微升病毒懸液加入到以每孔5XIO4個細(xì)胞的濃度接種的培養(yǎng)在平底96-孔板的PANCl細(xì)胞或SKifepl細(xì)胞。轉(zhuǎn)染⑶H3的表達用Western印跡分析來確定。CDH3反應(yīng)性人CTL的誘導(dǎo)用Ficoll-Conray密度梯度離心從HLA-A2陽性的胰腺癌患者、胃癌患者、結(jié)腸癌患者或健康人供者的肝素化的血液中分離PBMC。用先前報道的方法(YoshitakeY，etal.ClinCancerRes2004；10:6437_6448，KomoriH,etal.ClinCancerRes2006；12:2689-2697)制備來源于外周單核細(xì)胞的DC。在37°C、加有2%熱滅活的自體血清的AIM-V(Invitrogen)中，存在4微克/毫升β2-微球蛋白(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)的條件下，利用20微克/毫升的候選肽沖激DC2小時。然后照射這些DC(40Gy)，再與CD8陽性細(xì)胞共孵育。孵育在24孔板中進行，每個孔包含2毫升加有2%熱滅活的自體血清的AIM-V、1XIO5個肽沖激過的DC、2XIO6個⑶8+T細(xì)胞和5納克/毫升人重組IL_7(Wako,Osaka,Japan)。兩天后，向這些培養(yǎng)物中加入人重組IL-2(P^roTecInc.)至終濃度20IU/毫升。使用經(jīng)相同的肽沖激過的自體DC，以相同的方法再刺激兩次，每周一次(在第7天和第14天)。在最后一次刺激后的第六天，用51Cr釋放測定和IFNiELISP0T測定來評估誘導(dǎo)出的CTL的抗原特異性應(yīng)答。將用作靶細(xì)胞的各種癌癥細(xì)胞或肽沖激過的T2細(xì)胞(5X103個細(xì)胞/孔)與CTL以適當(dāng)?shù)男?yīng)物/靶細(xì)胞比例共培養(yǎng)，用已知的方法進行51Cr釋放測定(KomoriH,etal.，ClinCancerRes2006；12:2689_2697)。嘗試通過利用⑶H3-4655_663和CDH3_7757_765肽刺激從來源于HLA-A2陽性的健康供者和各種癌癥患者PBMC誘導(dǎo)CDH3-特異的CTL。將從PBMC中分選出的CD8T細(xì)胞與來源于自體單個核細(xì)胞(單核細(xì)胞)的、用每種肽沖激過的DC進行共孵育。經(jīng)過三次刺激，用51Cr釋放測定(圖4A)和IFN-yELISPOT測定評估對肽沖激過的T2細(xì)胞的細(xì)胞殺傷效果。從健康供者的PBMC誘導(dǎo)的CTL顯示出對經(jīng)CDH3-4655_663肽或CDH3_7757_765肽沖激過的T2細(xì)胞的殺傷效果，但是對沒有經(jīng)過肽沖激的T2細(xì)胞沒有殺傷效果。在其他供體上也觀察到相似的應(yīng)答。這些結(jié)果表明這些CTL具有肽特異的細(xì)胞毒性。接著，檢測了這些CTL對表達⑶H3和HLA-A2的人癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。如圖4B中所示，用⑶H3-4655_663肽刺激得到的⑶H3反應(yīng)性的CTL在正常供者中顯示出對HCTl16(CDH3+，HLA-A2+)、HSC3(CDH3+，HLA-A2+)、和PANC1/CDH3(CDH3+，HLA-A2+)的細(xì)胞毒性，其中PANCl細(xì)胞中已經(jīng)轉(zhuǎn)入CDH3基因；然而，這些CTL對PANCl(CDH3-，HLA-A2+)、SKH印1(CDH3-，HLA-A2+)和PK8(CDH3+，HLA-A2-)并沒有展示相同的效果。相似地，用CDH3-7757_765肽刺激的CTL對HSC3顯示出細(xì)胞毒性，但是對PANC1、PK8、和SKifepl無細(xì)胞毒性?？梢詮膩碓从诟鞣N癌癥患者的CTL中觀察到這種細(xì)胞毒性(圖4C)。為了確認(rèn)在自然條件下這些肽是否可以從⑶H3蛋白加工產(chǎn)生，將PANCl/⑶H3和SKH印1/⑶H3(⑶H3+，HLA-A2+)用作靶細(xì)胞，其中SKifepl細(xì)胞中已轉(zhuǎn)入⑶H3基因。如圖4C所示，用CDH3-4655_663或CDH3-7757_765肽刺激誘導(dǎo)出的CTL對HCTl16、PANC1/CDH3和SKifepl/⑶H3顯示出細(xì)胞毒性，但是對PANC1、SKHepl和PK8沒有細(xì)胞毒性。以上結(jié)果表明這些肽在自然狀態(tài)下被加工，并與HLA-A2分子一起呈遞在癌細(xì)胞表面。CDH3反應(yīng)性的CTL對表達內(nèi)源性CDH3和HLA-A2分子二者的癌細(xì)胞顯示出特異的細(xì)胞毒性。I類HLA限制性的確認(rèn)為了確認(rèn)誘導(dǎo)出的CTL是否可以以I類HLA限制的方式識別靶細(xì)胞，將靶癌細(xì)胞與10微克/毫升抗I類HLA單克隆抗體(W6/32)或10微克/毫升抗-HLA-DR單克隆抗體(H-DR-I)溫育1小時，然后與CTL和用于51Cr釋放測定或ELISP0T測定的癌細(xì)胞系共培養(yǎng)前，并用已知的方法(GomiS，etal.，JImmunol1999；163=4994-5004)檢測單克隆抗體對CTL的細(xì)胞毒性或IFN-γ的產(chǎn)生的影響。結(jié)果，在由⑶H3-4655_663肽刺激產(chǎn)生的CTL針對抗SKH印1/⑶H3的ELISP0T測定中，抗I類HLA抗體可以統(tǒng)計學(xué)顯著性地抑制IFN-γ的產(chǎn)生(圖4D，左，P<0.01)。在51Cr釋放測定中該抗體也可以抑制針對HCTl16的細(xì)胞毒活性(圖4D，中)。相似地，在由CDH3-7757_765肽刺激產(chǎn)生的CTL針對HSC3細(xì)胞的ELISP0T測定中，抗I類HLA抗體可以統(tǒng)計學(xué)顯著性地抑制IFN-Y的產(chǎn)生(圖4D，右，P<0.01)。這些結(jié)果提示誘導(dǎo)的CTL以I類HLA限制的方式識別表達⑶H3的靶細(xì)胞。[實施例5]過繼免疫療法對N0D/SCID小鼠過繼免疫的⑶H3誘導(dǎo)的人CTL的體內(nèi)抗癌活性為了評估CDH3反應(yīng)性的CTL施用于移植有CDH3陽性人癌細(xì)胞的小鼠后對小鼠的治療效果，如先前所述(KomoriH,etal.ClinCancerRes2006；12:2689_2697)進行了實驗性過繼免疫治療。簡單地說，對N0D/SCID小鼠的右脅部皮下接種對HLA-A2和內(nèi)源性CDH3均為陽性的HCT116細(xì)胞(4X106個細(xì)胞)。當(dāng)小鼠接種腫瘤后的第7天腫瘤大小為25平方毫米時，分別用CDH3肽_4655_663特異的CTL系、或CDH3肽_7757_765_特異的CTL系、或作為陰性對照的用HLA-A2限制性HIV肽(SLYNTYATL，SEQIDNO19)刺激的來自5位健康供者的⑶8+T細(xì)胞系，懸浮在100微升PBS中，對小鼠作靜脈注射(4X106)。在第14天再次進行T細(xì)胞靜脈注射。腫瘤大小一周測量2次，用測徑器測量2個相互垂直的直徑。用雙尾Student’st檢驗評估腫瘤尺寸的統(tǒng)計顯著性。P值<0.05認(rèn)為是顯著的。用商業(yè)化的統(tǒng)計分析軟件包(SPSSforWindows(TM)，version11.0.)進行統(tǒng)計學(xué)分析。對照HIV肽刺激的⑶8+T細(xì)胞在體外不顯示對HCT116的細(xì)胞毒性。評估每組7只小鼠的腫瘤尺寸(圖5A)和每組腫瘤大小的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差(圖5B)。對照T細(xì)胞系和單獨的PBS對腫瘤生長都沒有抑制效果。接種了CDH3刺激的CTL的小鼠的腫瘤尺寸明顯小于分別接種單獨的PBS或接種對照HIV肽誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞的小鼠中的腫瘤尺寸(P<0.001)。這些結(jié)果說明了⑶H3反應(yīng)性人CTL的過繼性轉(zhuǎn)移免疫治療對于N0D/SCID小鼠中的⑶H3+人腫瘤的效力。討論在本研究中，發(fā)明人通過對胰腺癌進行cDNA基因微陣列分析鑒定出鈣黏著蛋白3(⑶H3)/P-鈣黏著蛋白是一種新的TAA。根據(jù)cDNA基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，⑶H3在胰腺癌細(xì)胞中有很強的表達而在卵巢和乳腺中微弱表達。在其他的器官中很難檢測到CDH3的表達。而且，微陣列和RT-PCR的數(shù)據(jù)顯示除了在胰腺癌中⑶H3也在胃癌和結(jié)直腸癌中有表達，而在對應(yīng)的正常組織中幾乎沒有表達。已經(jīng)有研究者報道，通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)胰腺癌組織中CDH3是過表達的，而在胰腺的正常的導(dǎo)管和腺泡細(xì)胞中幾乎沒有表達(TaniuchiK,etal.CancerRes2005;65:3092-3099)。這些結(jié)果表明CDH3可以是對上述癌癥進行免疫治療的新的靶標(biāo)，而該靶標(biāo)引起自身免疫反應(yīng)的風(fēng)險很小。根據(jù)其組織分布可將鈣黏著蛋白家族分為不同的亞家族，包括鈣黏著蛋白I(CDHl)/E-鈣黏著蛋白，鈣黏著蛋白2(CDH2)/N-鈣黏著蛋白，以及鈣黏著蛋白3(CDH3)/P-鈣黏著蛋白。CDHl是主要的鈣黏著蛋白家族成員，該蛋白表達在所有的上皮組織中。研究者推測CDHl起到腫瘤抑制因子的作用，該蛋白對癌細(xì)胞的浸潤和擴散起到負(fù)調(diào)節(jié)作用(FrixenUH,etal.JCellBiol1991；113:173_185，BerxG,etal.Genomics1995；26281-289,OkaH,etal.CancerRes1993;53:1696_1701)。在浸潤性癌癥中CDH2的表達增力口，并且CDH2可以通過與成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)以及下游信號傳導(dǎo)相互作用而促進浸潤現(xiàn)象(SuyamaK，etal.CancerCell2002;2:301_314)。對CDH3在癌癥中的表達和作用的了解非常少。在此前的研究中Taniuchi等人表明了CDH3的表達的增加可能是增強胰腺癌浸潤作用的一個因素，可能是通過與pl20ctn和Rho家族GTP酶Racl和Cdc42發(fā)生相互作用來增強胰腺癌的浸潤性的(TaniuchiK，etal.CancerRes2005；65=3092-3099)其他的在先研究提示CDH3也是乳腺癌(PalaciosJ，etal.AmJPathol1995；146=605-612,ParedesJ,etal.ClinCancerRes2005；11:5869_5877,PeraltaSolerA,etal.Cancer1999;86:1263-1272)和子宮內(nèi)膜癌(StefanssonIΜ,etal.JClinOncol2004；221242-1252.)中浸潤性增加以及預(yù)后變差的因素。將此前的報道綜合在一起可以發(fā)現(xiàn)臨床試驗中癌癥疫苗對于癌癥的客觀應(yīng)答率僅為2.6%(RosenbergSA,etal.NatMed2004;10:909-915)。一個可能的原因是，免疫誘導(dǎo)性治療的結(jié)果使得癌細(xì)胞TAA缺失、突變或者下調(diào)，導(dǎo)致癌細(xì)胞得以躲避免疫反應(yīng)?；谀[瘤細(xì)胞不能夠失去腫瘤發(fā)生所需要的抗原的觀點，CDH3將會是抗癌免疫治療的一個有用的備選TAA。在本發(fā)明中，發(fā)明者從通過BIMAS算法篩選出來的18個備選肽中鑒定出了兩種HLA-A2限制性⑶H3表位肽，已經(jīng)確認(rèn)該兩種肽能夠在HLA-A2.1(HHD)轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)HLA-A2限制性小鼠CTL。進一步地，發(fā)明者確認(rèn)了通過使用這些肽能夠從來自于健康供體和癌癥患者的PBMC產(chǎn)生⑶H3反應(yīng)性的CTL(圖4)。這些CTL不僅對經(jīng)過相應(yīng)的肽沖激的T2細(xì)胞有殺傷作用，也能夠殺傷表達⑶H3和HLA-A2的癌細(xì)胞系。上述結(jié)果提示，該⑶H3肽(⑶H3-4655_663和⑶H3-7757_765)可在癌細(xì)胞中通過對⑶H3蛋白的加工而天然地產(chǎn)生，并且細(xì)胞會將這些肽與HLA-A2分子一起呈遞到細(xì)胞表面然后被CTL所識別。本發(fā)明的⑶H3反應(yīng)性CTL的細(xì)胞毒性，已經(jīng)通過體外的51Cr釋放測定和體內(nèi)的CTL過繼免疫治療得到了確認(rèn)。如圖5所示，與對照的CD8+細(xì)胞相比，靜脈注射通過本發(fā)明的肽誘導(dǎo)過的⑶8+細(xì)胞顯著地抑制了N0D/SCID小鼠中移植的腫瘤的生長。HLA-A2(A*0201)在包括亞洲人，非洲人，美洲黑人以及白種人在內(nèi)的多種人種中都是最普通的HLA等位基因之一(BrowningΜ.etal.ImmunolToday1996；17:165_170)。因此，如果能夠在醫(yī)學(xué)探索中證明本發(fā)明鑒定出的肽在癌癥免疫治療中的安全性和有效性，那么這些能夠被殺傷性T細(xì)胞通過HLA-A2呈遞的肽具有全球性的臨床應(yīng)用的可能。進一步地，由于攜帶HLA-A2的人在日本人和全人類中都是常見的，鑒定出被殺傷性T細(xì)胞通過HLA-A2呈遞的肽，很可能為全球大約30%的胰腺癌患者適用的癌癥免疫治療用藥物的開發(fā)提供可能。工業(yè)實用件HLA-A2是大約30%日本人具有的I類HLA等位基因。當(dāng)利用本發(fā)明的⑶H3肽免疫表達人HLA-A2的轉(zhuǎn)基因小鼠時，這些肽會通過誘導(dǎo)能夠識別結(jié)合于HLA-A2分子的該肽的細(xì)胞毒性T細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。這些肽在人類中也很有可能誘導(dǎo)出人細(xì)胞毒性T細(xì)胞，該T細(xì)胞能夠殺傷表達該肽和HLA-A2分子所成的復(fù)合物的癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明的肽可以應(yīng)用于對HLA-A2陽性的胰腺癌、膽管細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌以及非小細(xì)胞肺癌患者進行免疫治療。因此，這些肽可望通過抑制上述癌癥的增殖和/或惡化來提高患者的Q0L。權(quán)利要求以下(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO1或2的氨基酸序列的肽；(B)包含在SEQIDNO1或2的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或增加一個、兩個或者幾個氨基酸而得到的氨基酸序列的肽，其中該肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞的活性。2.權(quán)利要求1的肽，其中自N末端起的第二個氨基酸是亮氨酸或者甲硫氨酸。3.權(quán)利要求1的肽，其中C末端氨基酸是纈氨酸或亮氨酸。4.一種用于誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的藥劑，該藥劑含有一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。5.一種用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥劑，該藥劑含有一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。6.一種用于誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，該藥劑含有一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。7.一種用于誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)性活性的抗原呈遞細(xì)胞的藥劑，該藥劑含有一種或多種編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸作為活性成分。8.一種用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞的藥劑，該藥劑含有一種或多種權(quán)利要求1的肽作為活性成分。9.針對權(quán)利要求1的肽的抗體。10.使用權(quán)利要求1的肽誘導(dǎo)的輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞或者包含這些細(xì)胞的免疫細(xì)胞群。11.一種抗原呈遞細(xì)胞，其呈遞包含權(quán)利要求1的肽及HLA抗原的復(fù)合物。12.權(quán)利要求11的抗原呈遞細(xì)胞，該細(xì)胞是被權(quán)利要求6或7的藥劑所誘導(dǎo)的。13.—種外來體，其呈遞包含權(quán)利要求1的肽及HLA抗原的復(fù)合物。14.權(quán)利要求13的外來體，其中所述HLA抗原是HLA-A2(HLA_A2*0201)。15.一種誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括使抗原呈遞細(xì)胞接觸權(quán)利要求1的肽的步驟。16.一種誘導(dǎo)具有細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的方法，該方法包括將編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸轉(zhuǎn)染至抗原呈遞細(xì)胞中的步驟。17.一種誘導(dǎo)細(xì)胞毒性(殺傷性)T細(xì)胞的方法，該方法包括使T細(xì)胞接觸權(quán)利要求1的肽的步驟。18.一種誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的方法，該方法包括向受試者施用權(quán)利要求1的肽的步驟。19.一種治療和/或預(yù)防癌癥的方法，該方法包括向受試者施用權(quán)利要求1的肽的步驟。20.權(quán)利要求1的肽用于生產(chǎn)誘導(dǎo)針對癌癥的免疫力的藥劑的用途。21.權(quán)利要求1的肽用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防癌癥的藥物的用途。全文摘要本發(fā)明提供以下(A)或(B)的肽(A)包含SEQIDNO1或2所示的氨基酸序列的肽；和(B)包含在SEQIDNO1或2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或增加一個、兩個或者幾個氨基酸而得到的氨基酸序列，并具有誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的活性的肽。文檔編號C12N15/00GK101827936SQ20088011209公開日2010年9月8日申請日期2008年6月5日優(yōu)先權(quán)日2007年8月20日發(fā)明者中村佑輔,今井克憲,西村泰治,角田卓也申請人:腫瘤療法科學(xué)股份有限公司