專利名稱：微生物的快速檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文件涉及用于檢測微生物的方法和材料。更具體地講，本文件涉及通過快速富集微生物和使用基于不經(jīng)擴(kuò)增的核酸的測試來檢測微生物的微生物檢測方法。
背景技術(shù)：
為防止食源性病原體的傳播，食物產(chǎn)品的制造商和/或加工者在產(chǎn)品投放給消費 者之前要例行測試樣品確定是否存在受污染產(chǎn)品。大量病原體的存在會導(dǎo)致食物產(chǎn)品的污 染，另外如果被人或動物消費的話會導(dǎo)致食源性疾病。在美國，與消費受污染食物產(chǎn)品有關(guān) 的食物中毒病例數(shù)目據(jù)保守估計每年有好幾百萬例。雖然大多數(shù)的細(xì)菌性食物中毒人病例 僅導(dǎo)致急性癥狀性疾病(例如惡心、嘔吐、腹瀉、發(fā)冷、發(fā)燒和虛脫)，但在嬰兒、老人、孕婦 和免疫系統(tǒng)受損者中可出現(xiàn)死亡。檢測病原體的典型方法包括預(yù)富集，即在非選擇性培養(yǎng)基中對食物樣品進(jìn)行富 集，以使受損傷的細(xì)菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀況；選擇性富集，即向培養(yǎng)基中加入促生 長物質(zhì)和選擇性抑制試劑以促進(jìn)選定的病原微生物的生長，同時限制大多數(shù)其他細(xì)菌的增 殖；和通過生化測定、免疫測定、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或血清學(xué)技術(shù)檢測任何病原微生物。 這些方法要花24-72小時才能完成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了用于檢測樣品中的微生物的快速方法。該方法包括可在用于勻化樣 品的同一容器中進(jìn)行的富集步驟。可通過多種方法在富集的樣品中檢測微生物，包括基于 不經(jīng)擴(kuò)增的核酸的測試，如雜交保護(hù)測定。本文所述的方法可用來在不到18小時內(nèi)檢測食 品基質(zhì)中的低水平病原體。在一個方面，本發(fā)明公開了檢測樣品(例如食物樣品如乳制品、肉、蔬菜或海產(chǎn)食 品)中的靶標(biāo)微生物的方法。該方法包括在容器(例如袋)中勻化樣品，其中該容器包 含生長培養(yǎng)基；對容器中經(jīng)勻化的樣品進(jìn)行溫育以在樣品中存在靶標(biāo)微生物時對其進(jìn)行 富集；以及對靶標(biāo)微生物的不經(jīng)擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測。靶標(biāo)微生物可在包含來自非靶標(biāo) 微生物的核酸的混合物中檢測到。靶標(biāo)微生物選自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和 微球菌科(Micrococcaceae)。例如，靶標(biāo)微生物可選自葡萄球菌屬(Staphylococcus)、 鏈球菌屬(Streptococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸球菌屬(Enterococcus)、 沙門氏菌屬(Salmonella)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、志賀氏菌屬(Shigella)、耶爾 森氏菌屬(Yersinia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、±矣希氏菌屬(Escherichia)、芽孢 桿菌屬(Bacillus)、李斯特氏菌屬(Listeria)、梭菌屬(Clostridium)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter)(Vibrio)禾口胃M (Corynebacteriii)。檢測步驟可包括溶解樣品中的微生物；使核酸探針與靶標(biāo)微生物的靶標(biāo)核酸序列 雜交以形成探針靶標(biāo)復(fù)合物，其中包含被該復(fù)合物穩(wěn)定化的標(biāo)記；選擇性降解未雜交的 探針中存在的標(biāo)記；以及檢測被穩(wěn)定化的標(biāo)記的存在或量，作為樣品中靶標(biāo)核酸序列的存 在或量的度量。探針可用吖啶鐺酯進(jìn)行標(biāo)記。探針可與靶標(biāo)微生物的核糖體RNA雜交。
生長培養(yǎng)基可包含針對非靶標(biāo)微生物的生長抑制劑。生長抑制劑可選自膽汁鹽、 脫氧膽酸鈉、亞硒酸鈉、硫代硫酸鈉、氯化鋰、亞碲酸鉀、連四硫酸鈉、乙酰磺胺鈉、扁桃酸、 亞硒酸半胱氨酸連四硫酸鹽、磺胺二甲嘧啶、亮綠、孔雀石綠、結(jié)晶紫、Tergit014、磺胺嘧 啶、阿米卡星、氨曲南、萘啶酮酸、吖啶黃、多粘菌素B、新生霉素和阿拉磷。溫育步驟可在30°C至45°C下進(jìn)行10至18小時。例如，溫育步驟可在35°C至42°C 下進(jìn)行10至18小時。生長培養(yǎng)基可包含能讓靶標(biāo)微生物生長至最低水平IO4CfuAiL的營 養(yǎng)物。生長培養(yǎng)基可包含支持超過一種靶標(biāo)微生物的生長的營養(yǎng)物。本發(fā)明還涉及用于檢測微生物的制品。該制品包括多孔固體基材，其中該固體基 材的每個孔用裂解試劑和核酸探針進(jìn)行包被。在一些實施例中，基材還用選擇劑進(jìn)行包被。 該制品還可包括勻化容器，其中該勻化容器包含涂覆在該容器內(nèi)表面上的生長培養(yǎng)基。該 涂覆層可以是干燥的涂覆層。勻化容器還可包含涂覆在容器內(nèi)表面上的針對非靶標(biāo)微生物 的生長抑制劑。多孔固體基材可以是96孔板、384孔板或微流控樣品處理裝置。該制品可 包括多個多孔基材，其中每個多孔基材專用于不同的微生物。除非另有定義，否則本文使用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。下文描述的是合適的方法和材料，不過與本文所述的 方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于實施本發(fā)明。本文提及的所有出版物、專利 申請、專利及其他參考文獻(xiàn)全文以引用方式并入本文中。如有沖突，應(yīng)以本說明書(包括定 義在內(nèi))為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實例僅是示例性的，并無意于限制本發(fā)明。本發(fā)明的一個或多個實施例的細(xì)節(jié)在以下附圖
和具體實施方式
中給出。根據(jù)具體 實施方式和附圖以及權(quán)利要求書，本發(fā)明的其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點將顯而易見。
具體實施例方式總體而言，本發(fā)明公開了用于檢測樣品中的微生物的材料和方法。本文所公開的 方法包括在包含生長培養(yǎng)基的容器中勻化樣品，并在對經(jīng)勻化的樣品進(jìn)行溫育以富集微生 物后，用基于核酸的測試如雜交保護(hù)測定來檢測微生物。這樣的方法讓使用者以極少的操 作就能檢測微生物。本文所公開的方法可用于檢測各種各樣的含有微生物混合群體的食物樣品和非 食物樣品中的微生物?！笆澄铩敝腹腆w、液體或半固體的可食用組合物。食物的例子包括但 不限于肉、禽、蛋、魚、海產(chǎn)食品、蔬菜、水果、預(yù)制食品(例如湯、醬、糊)、谷物產(chǎn)品(例如面 粉、谷類、面包)、罐頭食品、干酪、乳、嬰兒配方食品(例如粉末的或液體的嬰兒配方食品)、 其他乳制品(例如干酪、酸奶、酸奶油)、脂肪、油、甜點、調(diào)味品、香料、意大利面食、飲料、 水、其他合適的可食用材料，以及它們的組合。“非食物”指不在“食物”定義范圍內(nèi)的所關(guān)注的物源。具體地講，非食物源包括但 不限于通常不可食用以及可歸類為以下的一者或多者的物質(zhì)細(xì)胞裂解物、全血或其部分 (例如血清)、其他體液(例如唾液、汗液、皮脂、尿液)、糞便、細(xì)胞、組織、器官、植物材料、木 材、土壤、沉淀物、動物飼料、動物胴體、植物沖洗液、處理用水、藥品、化妝品、環(huán)境采樣裝置 (例如海綿或拭子)和其他合適的非可食材料，以及它們的組合。特別受關(guān)注的微生物包括原核生物和真核生物，特別是革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、原生動物、支原體、酵母、病毒(例如HIV和HPV)和帶脂質(zhì)包膜的病毒。特別相關(guān)的生物包括以下各科屬的成員腸桿菌科(Enterobacteriaceae)和微球菌 禾斗(Micrococcaceae)或者葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸球菌屬(Enterococcus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、軍 團(tuán)菌屬(Legionella)、志賀氏菌屬(Shigella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、腸桿菌屬 (Enterobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、李斯特氏菌屬 (Listeria) > ^ ffi ff ^ M (Campylobacter) > ^ M (Vibrio) ^MM (Clostridium) > 棒狀桿菌屬(Corynebacteria)。毒力特別強(qiáng)的生物包括大腸桿菌(Escherichia coli) (例如大腸桿菌0157:H7)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和傷寒沙門氏菌 (Salmonellatyphi)。通常，將樣品(例如食物樣品)放在含有生長培養(yǎng)基的容器(例如袋、管、燒瓶或 瓶)中?？蓪悠愤M(jìn)行勻化以將樣品和生長培養(yǎng)基混合，并釋放出固體或半固體樣品中可 能含有的任何微生物。勻化技術(shù)可包括攪動、混合、攪拌、摻和或渦旋混合。例如，如美國食 品與藥物管理局的"Food Sampling and Preparation of Sample Homogenate，，,第一章； FDA Bacteriological Manual, 1998年，第八版，1. 06節(jié)中所建議，可使用混合器在10，000 至12，OOOrpm下勻化樣品?？墒褂谩拔竸?stomaching) ”裝置，其為使用兩個槳以捏合類 型的動作將袋中的物源和稀釋液進(jìn)行混合。參見例如美國專利No. 3，819，158。美國專利 No. 6，273，600中描述了一種商標(biāo)為PULSIFIER 的振蕩裝置，其采用放置在攪拌金屬環(huán) 內(nèi)的袋。另一種技術(shù)即分析物懸浮液的渦旋混合在美國專利No. 6，273，600中已有描述。另 參見美國專利申請公開說明書No. 2007/026931A-1中的可將樣品和生長培養(yǎng)基進(jìn)行混合 的裝置。合適的生長培養(yǎng)基含有能讓潛在受損的靶標(biāo)微生物得到快速恢復(fù)以及讓靶標(biāo)微 生物生長至最少每毫升104個菌落形成單位(cfu/mL)的營養(yǎng)物。生長培養(yǎng)基的非限制性例 子包括胰酶大豆肉湯(TSB)、緩沖蛋白胨水(BPW)、通用預(yù)富集肉湯(UPB)、李斯特氏菌富集 肉湯(LEB)或者本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其他一般的非選擇性培養(yǎng)基或適度選擇性培養(yǎng)基。 培養(yǎng)基可包含支持超過一種靶標(biāo)微生物的生長的營養(yǎng)物。通常，生長培養(yǎng)基包含針對非靶標(biāo)微生物的生長抑制劑。例如，可使用一種或 多種以下的物質(zhì)來抑制非靶標(biāo)微生物的生長膽汁鹽、脫氧膽酸鈉、亞硒酸鈉、硫代硫 酸鈉、氯化鋰、亞碲酸鉀、連四硫酸鈉、乙?；前封c、扁桃酸、亞硒酸半胱氨酸連四硫酸鹽 (selenitecysteinetetrathionate)、磺胺二甲嘧啶、亮綠、孔雀石綠、結(jié)晶紫、Tergitol 4、 磺胺嘧啶、阿米卡星、氨曲南、萘啶酮酸、吖啶黃、多粘菌素B、新生霉素和阿拉磷。在一些實施例中，容器包含液體生長培養(yǎng)基。在其他實施例中，容器的內(nèi)表面涂覆 有生長培養(yǎng)基和/或生長抑制劑?？蓪⑼扛矊痈稍镆栽谌萜鲀?nèi)表面上提供干培養(yǎng)基。該干 培養(yǎng)基可在加入樣品和適當(dāng)?shù)木彌_液時再水化。勻化后將容器進(jìn)行溫育，溫育的時間和溫度足以讓靶標(biāo)微生物生長到至少 104cfus/mL。例如，可將容器在30°C至45°C下溫育10至18小時。35°C至42°C的溫育溫度 是特別有用的。檢測不經(jīng)擴(kuò)增的核酸微生物可例如用雜交保護(hù)測定法(HPA)進(jìn)行檢測。在這個方法中，可將微生物進(jìn) 行裂解以釋放出核酸。例如，可使用去污劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)或N-月桂酰肌氨酸鈉或者酶如溶菌酶或溶葡球菌酶來裂解細(xì)胞。或者，可采用改變溫度、PH或滲透壓來裂解細(xì) 胞。寡核苷酸探針可與靶標(biāo)微生物的靶標(biāo)核酸序列雜交以形成探針靶標(biāo)復(fù)合物。如 本文所用，術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體， 或者它們的類似物。核酸類似物可在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈進(jìn)行修飾，以例如改善核 酸的穩(wěn)定性、雜交或溶解性。在堿基部分的修飾包括用脫氧尿苷取代脫氧胸苷，和用5-甲 基-2'-脫氧胞苷和5-溴-2'-脫氧胞苷取代脫氧胞苷。可取代天然堿基的核堿基的其 他例子包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C) ；5-羥基甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌 呤；腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基衍生 物和其他烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶和 胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-氮雜尿嘧啶；胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧 啶)；4-硫代尿嘧啶；8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌 呤和鳥嘌呤；5-鹵代特別是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基 鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤 ；8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤；7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤 以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。其他有用的核堿基包括例如美國專利No. 3，687，808 中所公開的那些。糖部分的修飾可包括修飾核糖的2'羥基以形成2' -0-甲基糖或2' -0-烯丙 基糖。可將脫氧核糖磷酸主鏈進(jìn)行修飾，以產(chǎn)生其中每個堿基部分與六元嗎啉代環(huán)連接的 嗎啉代核酸，或者其中脫氧磷酸主鏈被假肽主鏈(例如氨基乙基甘氨酸主鏈)取代而保留 四種堿基的肽核酸。參見例如 Summerton 和 ffeller (1997) Antisense Nucleic Acid DruR Dev. 7 187-195 ；和 Hyrup 等，(1996)BioorRan. Med. Chem. 4 :5_23。另外，脫氧磷酸主鏈可 用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主鏈、亞磷酰胺或烷基磷酸三酯主鏈代替。參見例如美 國專禾Ij No. 4，469，863,5, 235，033,5, 750，666和5，596，086關(guān)于制備具有經(jīng)修飾的主鏈的 寡核苷酸的方法。寡核苷酸探針可與來自靶標(biāo)微生物的核酸的任何部分雜交。例如，寡核苷酸可 與編碼細(xì)胞壁蛋白質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)成分如膜蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)運蛋白或酶的核酸雜交。在一些實 施例中，寡核苷酸與靶標(biāo)微生物的核糖體RNA(rRNA)或mRNA雜交。參見例如美國專利 No. 4，851，330。例如，寡核苷酸可與16S、23S或5S rRNA雜交。與rRNA的雜交可提高測定 的靈敏度，因為大多數(shù)微生物含有數(shù)千個拷貝的每種rRNA。例如，大腸桿菌含有約IO4個拷 貝的每種rRNA亞基。寡核苷酸探針通常用能被探針靶標(biāo)雜交復(fù)合物穩(wěn)定的分子進(jìn)行標(biāo)記。例如，寡 核苷酸探針可用高度化學(xué)發(fā)光的吖啶鐺酯(AE)分子進(jìn)行標(biāo)記。對AE的酯鍵進(jìn)行堿性水解 能使它永久不化學(xué)發(fā)光。當(dāng)探針為單鏈時，即不與其靶標(biāo)雜交時，AE的酯鍵的水解是快速 的。相反，當(dāng)探針與其靶標(biāo)雜交時，AE的酯鍵的水解大大降低。因此，可在非水解條件下使 寡核苷酸探針與其靶標(biāo)核酸雜交。雜交后，可通過調(diào)節(jié)溶液的PH使其為適度堿性(例如pH 7至11)，使未雜交的探針中存在的標(biāo)記選擇性降解。參見例如Nelson等(1996) ,Nucleic Acids Res. 24(24) :4998_5003。寡核苷酸探針的長度可在10-75個(例如10-14、15-30、25-50、30-45、33-40、 20-30、31-40、41-50或51-75)個核苷酸之間。本領(lǐng)域知道，寡核苷酸的序列不需要與其靶核酸的序列100%互補(bǔ)才能進(jìn)行雜交。相反，當(dāng)寡核苷酸與其靶標(biāo)序列的互補(bǔ)序列具有至少 80% (例如至少85%、90%、95%、99%或100% )序列同一性時，就可進(jìn)行雜交。在將pH 調(diào)節(jié)至適度堿性條件后可根據(jù)觀察到的化學(xué)發(fā)光來檢測寡核苷酸與其靶標(biāo)的雜交。如果發(fā) 生雜交，則會觀察到化學(xué)發(fā)光。如果不發(fā)生雜交，則AE分子的酯將會發(fā)生水解，從而不會觀 察到化學(xué)發(fā)光或者會顯著降低?？扇缦聹y定核酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)。首先，用BLAST 2SequenceS (B12seq)程 序?qū)⒛澈怂嵝蛄信c靶核酸序列進(jìn)行比較，該程序來自包含BLASTN 2.0. 14版和BLASTP 2. 0. 14版的單機(jī)版BLASTZ。該單機(jī)版BLASTZ可獲自Fish&Richardson的網(wǎng)站(www. fr. com/blast)、美國政府的國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(www. ncbi. nlm. nih. gov)或者紐 約州立大學(xué)Old Westbury分校圖書館(QH 497.m6714)。介紹如何使用B12seq程序的說明 書可在BLASTZ隨附的自述文件中找到。B12seq是用BLASTN算法進(jìn)行兩個序列之間的比較。為比較兩個核酸序列，將選項 設(shè)置如下_i設(shè)置為含有要比較的第一核酸序列的文件(例如C Aseql. txt) ；_j設(shè)置為含 有要待比較的第二核酸序列的文件(例如C :\seq2. txt) ；-ρ設(shè)置為blastn ；-ο設(shè)置為任 何所需的文件名(例如C Aoutput. txt) ；-q設(shè)置為-1 ；-r設(shè)置為2 ；所有其他選項保留其 默認(rèn)設(shè)置。例如，可用以下命令來產(chǎn)生含有兩個序列之間的比較的輸出文件C :\B12seq-i c :\seql. txt _j c :\seq2. txt_p blastn-o c Aoutput. txt-q-l-r20 如果第——核酸序列 與第二核酸序列的任何部分具有同源性，則指定的輸出文件將把那些同源性區(qū)域作為比對 序列呈現(xiàn)。如果第一核酸序列與第二核酸序列的任何部分不具有同源性，則指定的輸出文 件將不呈現(xiàn)比對序列。一旦得到比對，則通過對所顯示的第一核酸序列與第二核酸序列的序列對齊的連 續(xù)核苷酸的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，來確定長度。匹配位置是任何其中同一核苷酸在靶標(biāo)序列和哺 乳動物序列兩者中都呈現(xiàn)的位置。第一序列中出現(xiàn)的空位不進(jìn)行計數(shù)，因為空位不是核苷 酸或氨基酸殘基。同樣，第二序列中出現(xiàn)的空位也不進(jìn)行計數(shù)。某確定長度上的同一性百分?jǐn)?shù)是如下進(jìn)行測定計數(shù)該長度上的匹配位置的數(shù) 目，將該數(shù)目除以該長度，然后將所得數(shù)值乘以100。例如，如果(1)將某300個氨基酸的靶 標(biāo)序列與參考序列進(jìn)行比較，(2)B12seq程序顯示靶標(biāo)序列有200個連續(xù)氨基酸與參考序 列的某個區(qū)域進(jìn)行對齊，以及⑶在該200個對齊的氨基酸中匹配的數(shù)目為180，則該300 個氨基酸的靶標(biāo)序列含有長度為200且該長度上同一性百分?jǐn)?shù)為90 (即(180 + 200) X100 =90)的氨基酸區(qū)段。應(yīng)指出，序列同一性百分?jǐn)?shù)值四舍五入到小數(shù)點后一位。例如，75. 11,75. 12、 75. 13 和 75. 14 下舍入為 75. 1，而 75. 15,75. 16,75. 17,75. 18 和 75. 19 上舍入為 75. 2。還
應(yīng)指出，長度值總是整數(shù)。合成寡核苷酸的方法是已知的。通常使用自動DNA合成儀，如得自Applied Biosystems (Foster City, CA)的自動DNA合成儀。一旦合成寡核苷酸并除去任何保護(hù)基， 可將該寡核苷酸純化(例如通過萃取和凝膠純化或離子交換高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行 純化)，并可測定該寡核苷酸的濃度(例如通過在分光光度計中于260nm處測量光密度來測 定)。可在寡核苷酸合成過程中用AE分子標(biāo)記該寡核苷酸，或者在合成之后連接上AE分子?？墒褂眠B接分子用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將AE分子連接至寡核苷酸上。通常，使用無堿 基接頭_臂化學(xué)(abasic linker-armchemistry)，該法例如在美國專利No. 6，004, 745和 WO 89/02933中提出。例如，可使用無堿基接頭-臂化學(xué)，在寡核苷酸的合成過程中在該寡 核苷酸的預(yù)定位置摻入胺封端的接頭。在純化寡核苷酸后，可通過該胺封端的接頭連接上 AE 分子。參見例如 Nelson 等(1996), Nucleic AcidsRes. 24(24) :4998_5003?？捎霉舛扔?例如LEADER 發(fā)光計，得自美國加州San Diego的Gen-Probe Incorporated公司；或者BacLite3光度計，得自美國明尼蘇達(dá)州St. Paul的3M公司；或者 LUMIstar Galaxy光度計，得自美國北卡羅來納州Durham的BMG公司)評估未經(jīng)修飾的標(biāo) 記的存在、不存在或量。諸如BacLite3光度計和LUMIstar Galaxy光度計之類的光度計具 有試劑分配能力和溫度控制，對于使本文所公開的方法自動化是特別有用的?？沙绦蚩刂?這些發(fā)光計，以按預(yù)定的順序分配試劑供進(jìn)行裂解、雜交和檢測以及使得能進(jìn)行溫育。自動 試劑分配除了能提高測試系統(tǒng)對使用者的友好性之外，還能使潮濕環(huán)境(如水浴)中碰到 的污染問題減至最低。應(yīng)理解，本發(fā)明方法并不受用來檢測寡核苷酸探針上的標(biāo)記的裝置 所局限。Mrn可將用來執(zhí)行本文所述的方法的試劑與包裝材料進(jìn)行組合，作為用于檢測樣品中 的微生物的試劑盒出售。例如，試劑盒可包括多孔基材如96孔或384孔板以及裂解試劑、 寡核苷酸探針和選擇劑。在其他實施例中，基材的每個孔包被有裂解試劑和所需的寡核苷 酸探針。在其他實施例中，每個孔可包被有裂解試劑、所需的寡核苷酸探針和選擇劑。多孔 基材還可以是微反應(yīng)容器系統(tǒng)(例如微流控試劑卡)。參見例如美國專利No. 6，627，159的 樣品處理裝置。在其他實施例中，試劑盒包括一個或多個另外的多孔固體基材，其中每個基材、孔 或孔組專用于不同的微生物。例如，制品可包括2、3、4、5、6、7、8、9或10個多孔基材，使得可 同時檢測多種微生物。例如，一個多孔基材可包被有用于一種微生物(例如大腸桿菌)的 裂解試劑和寡核苷酸探針，另一個多孔基材可包被有用于另一種微生物(例如沙門氏菌) 的裂解試劑和寡核苷酸探針。這些基材可為條帶形式，其中每個條帶含有用于檢測特定微 生物的試劑。制品或試劑盒可還可包括勻化容器，該容器包含涂覆在其內(nèi)表面上的生長培養(yǎng)基 和/或生長抑制劑。制品還可包括用于執(zhí)行本文公開的方法的試劑(例如緩沖液、對照核 酸、無菌水或者其他可用于進(jìn)行雜交保護(hù)測定法的試劑)。制品還可包括包裝標(biāo)簽或插頁， 其上有關(guān)于檢測特定微生物或多種微生物組合的說明。生產(chǎn)制品的組分和方法是公知的。其他實施例應(yīng)當(dāng)理解，雖然已結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但前面的描述旨在舉 例說明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍是由所附權(quán)利要求書的范圍來限定。其他的方 面、優(yōu)點和修改形式也落入所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種檢測樣品中的靶標(biāo)微生物的方法，所述方法包括a)在容器中勻化樣品，其中所述容器包含生長培養(yǎng)基；b)溫育所述容器中的所述經(jīng)勻化的樣品以在靶標(biāo)微生物存在于所述樣品中時對其進(jìn)行富集；以及c)檢測所述靶標(biāo)微生物的不經(jīng)擴(kuò)增的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶標(biāo)微生物選自腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)和微球菌科(Micrococcaceae) 。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述靶標(biāo)微生物選自葡萄球菌屬 (Staphylococcus spp.)、鏈球菌屬(Sreptococcus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、沙門氏菌屬(Salmonella spp.)、軍團(tuán)菌屬 (Legionella spp.)、志賀氏菌屬(Shigella spp.)、耳口爾森氏菌屬(Yersinia spp.)、腸 桿菌屬(Enterobacter spp.)、埃希氏菌屬(Escherichia spp.)、芽抱桿菌屬(Bacillus spp.)、李斯特氏菌屬(Listeriaspp.)、彎曲桿菌屬(Campylobacter spp.)、弧菌屬(Vibrio spp·)、梭菌屬(Clostridium spp.)和棒狀桿菌屬(Corynebacteria spp·)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟包括i)裂解所述樣品中的微生物； )使核酸探針與所述靶標(biāo)微生物的靶標(biāo)核酸序列雜交以形成探針靶標(biāo)復(fù)合物，其中所 述探針包含被所述復(fù)合物穩(wěn)定的標(biāo)記；iii)選擇性降解未雜交的探針中存在的所述標(biāo)記； 以及iv)檢測被穩(wěn)定化的標(biāo)記的存在或量，作為所述樣品中所述靶標(biāo)核酸序列的存在或量 的度量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述探針用吖啶鐺酯進(jìn)行標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述探針與所述靶標(biāo)微生物的核糖體RNA雜交。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基包含針對非靶標(biāo)微生物的生長抑 制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述生長抑制劑選自膽汁鹽、脫氧膽酸鈉、亞硒酸 鈉、硫代硫酸鈉、氯化鋰、亞碲酸鉀、連四硫酸鈉、乙酰磺胺鈉、扁桃酸、亞硒酸半胱氨酸連四 硫酸鹽、磺胺二甲嘧啶、亮綠、孔雀石綠、結(jié)晶紫、Tergitol 4、磺胺嘧啶、阿米卡星、氨曲南、 萘啶酮酸、吖啶黃、多粘菌素B、新生霉素和阿拉磷。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溫育步驟是在30°C至45°C下進(jìn)行10至18小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溫育步驟是在35°C至42°C下進(jìn)行10至18 小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基包含能讓靶標(biāo)微生物生長至最 低水平104Cfu/mL的營養(yǎng)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生長培養(yǎng)基包含支持超過一種靶標(biāo)微生物 的生長的營養(yǎng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品是食物樣品。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述食物樣品是乳制品、肉、蔬菜或海產(chǎn)食品。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述容器是袋。
16.一種用于檢測微生物的制品，所述制品包括多孔固體基材，其中所述固體基材的每個孔包被有裂解試劑和核酸探針。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制品，其還包括勻化容器，所述勻化容器包含涂覆在所述 容器內(nèi)表面上的生長培養(yǎng)基。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制品，其中所述涂覆層為干燥的涂覆層。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的制品，其中所述勻化容器還包含包被在所述容器內(nèi)表面上 的針對非靶標(biāo)微生物的生長抑制劑。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的制品，其中所述制品包括多個多孔基材，其中每個多孔基 材專用于不同的微生物。
全文摘要
本發(fā)明描述了利用不經(jīng)擴(kuò)增的核酸、經(jīng)吖啶鎓標(biāo)記的ONA探針和選擇性生長培養(yǎng)基來快速檢測腸桿菌科和微球菌科微生物的方法，特別是用于與食品科學(xué)產(chǎn)業(yè)和公共衛(wèi)生有關(guān)的特定微生物物種。本發(fā)明還描述了包括用于同時檢測多種微生物的試劑的制品。
文檔編號C12Q1/04GK101827945SQ200880112277
公開日2010年9月8日 申請日期2008年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者塞拉嘉·常德拉帕蒂 申請人:3M創(chuàng)新有限公司