專(zhuān)利名稱(chēng)：：制備發(fā)泡劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及工業(yè)發(fā)酵方法。具體地，本發(fā)明涉及發(fā)泡劑的細(xì)胞外發(fā)酵制備。
背景技術(shù)：
：發(fā)泡是需氧深層發(fā)酵中的常見(jiàn)問(wèn)題。發(fā)泡由于將氣體鼓入(sparging)發(fā)酵培養(yǎng)基而引起，將氣體鼓入發(fā)酵培養(yǎng)基的目的是為正在培養(yǎng)的需氧有機(jī)體(例如細(xì)菌、酵母、真菌、藻類(lèi)、細(xì)胞培養(yǎng)物)的生長(zhǎng)提供氧氣。若發(fā)酵培養(yǎng)基含有諸如蛋白質(zhì)、多糖或脂肪酸之類(lèi)的表面活性組分，則當(dāng)鼓入的氣泡脫離液體時(shí)，可在培養(yǎng)基的表面上形成泡沫。發(fā)泡引起許多問(wèn)題，包括不合需要地將產(chǎn)品、營(yíng)養(yǎng)素和細(xì)胞帶(stripping)入泡沫，并且可能使工藝控制變得困難?？刂瓢l(fā)泡的一種已知方法是使用消泡劑，其中的幾類(lèi)是常用的基于硅氧烷的消泡劑(例如聚二甲基硅氧烷)、聚亞烷基二醇(例如聚丙二醇)、脂肪酸、聚酯和天然油(例如亞麻籽油、大豆油)。消泡劑代替氣泡表面上的發(fā)泡組分，導(dǎo)致泡沫因氣泡聚結(jié)而破滅。在發(fā)酵開(kāi)始和/或期間加入消泡劑。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)品有意用于食品、個(gè)人用品或藥品時(shí)，非常希望通過(guò)生產(chǎn)有機(jī)體(producingorganism)將所述產(chǎn)品分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中(即，細(xì)胞外而非細(xì)胞內(nèi)制備)。這樣不需要通過(guò)物理或化學(xué)方法破壞細(xì)胞，以便釋放供回收的產(chǎn)品。通過(guò)保持細(xì)胞完整，可容易地將細(xì)胞材料與產(chǎn)品分離，以致產(chǎn)品不含細(xì)胞內(nèi)材料和遺傳材料，所述材料通常被視為不合需要的污染物。若生產(chǎn)有機(jī)體已經(jīng)過(guò)基因修飾，這樣做可能尤其重要。然而，細(xì)胞外制備可加強(qiáng)發(fā)酵罐中的發(fā)泡程度，若產(chǎn)品(例如生物表面活性劑或疏水蛋白)促進(jìn)泡沫形成或增強(qiáng)泡沫穩(wěn)定性，尤其如此。使用消泡劑在此類(lèi)發(fā)泡劑的細(xì)胞外制備中產(chǎn)生特殊問(wèn)題，其原因有二第一，由于發(fā)泡劑本身促進(jìn)了發(fā)酵罐中的發(fā)泡，因此所需消泡劑的量增加。第二，由于消泡劑的存在濃度低，不影響產(chǎn)品的功能(functionality)，因此非必需從大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)品中去除消泡劑。然而，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)品是發(fā)泡劑時(shí)，必須基本上去除消泡劑，因?yàn)橄輨┐嬖谟诋a(chǎn)品中將削弱該產(chǎn)品的功能。Bailey等，Appl.Microbiol.Biotechnol.58(2002)pp.721-727公開(kāi)了通過(guò)里氏木霉(Trichodermareesei)轉(zhuǎn)化株的發(fā)酵來(lái)制備疏水蛋白HFBI和HFBII。使用消泡劑(StruktolJ633)來(lái)防止發(fā)泡，并使用雙水相萃取提純疏水蛋白。然而，諸如雙水相萃取或色譜方法之類(lèi)的分離方法昂貴，且可能需要與食品不相容的化學(xué)品。Davis等，EnzymeandMicrobialTechnology28(2001)pp.346-354公開(kāi)了一種另選(alternative)方法，該方法不需要消泡劑。在該方法中，收集發(fā)酵期間產(chǎn)生的泡沫，并從中回收產(chǎn)品。該方法已成功應(yīng)用于回收和濃縮表面活性肽(surfactin)(—種脂肽生物表面活性劑)。然而，該方法存在許多缺陷第一，持續(xù)去除泡沫會(huì)損害發(fā)酵的無(wú)菌性質(zhì)；第二，去除泡沫會(huì)影響發(fā)酵罐中活細(xì)胞計(jì)數(shù)(因?yàn)橛行┘?xì)胞可能會(huì)隨泡沫帶出)、液體體積和營(yíng)養(yǎng)素水平，使發(fā)酵更難控制；第三，從泡沫中提取產(chǎn)品可能是困難的，尤其是當(dāng)產(chǎn)品形成非常穩(wěn)定的泡沫時(shí)。因此，對(duì)用于細(xì)胞外制備發(fā)泡劑的改進(jìn)的發(fā)酵方法仍然存在需求。發(fā)明概述我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用一組特定的消泡劑在發(fā)泡劑的細(xì)胞外發(fā)酵制備中抑制發(fā)泡，可以容易地從產(chǎn)品中去除該消泡劑。因此，在第一方面中，本發(fā)明提供制備發(fā)泡劑的方法，其包括i)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在細(xì)胞外分泌發(fā)泡劑；并且所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有具有濁點(diǎn)的消泡劑(antifoam)；ii)當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于所述濁點(diǎn)時(shí)去除消泡劑。在發(fā)酵期間使用消泡劑使發(fā)泡達(dá)到最小。選擇具有濁點(diǎn)的消泡劑，并確保發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于此濁點(diǎn)，這樣導(dǎo)致消泡劑以微粒形式“析出(cloudout)”(沉淀)。這提供了簡(jiǎn)單途徑，通過(guò)該途徑能夠在發(fā)酵完成之后去除消泡劑，例如通過(guò)過(guò)濾、離心或吸附來(lái)去除。相反，沒(méi)有濁點(diǎn)的消泡劑需要更復(fù)雜和/或更昂貴的分離方法，例如雙水相萃取或色■i並曰O優(yōu)選地，在步驟i)中，通過(guò)向其中鼓入空氣或富氧空氣對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行充氣。優(yōu)選地，在步驟i)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于消泡劑的濁點(diǎn)。優(yōu)選地，在步驟ii)中，通過(guò)過(guò)濾、離心或吸附去除消泡劑。更優(yōu)選地，通過(guò)膜(交叉流)過(guò)濾去除消泡劑。優(yōu)選地，在步驟ii)中，去除至少75%(更優(yōu)選至少85%、最優(yōu)選至少90%)的消泡劑。優(yōu)選地，在步驟ii)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于濁點(diǎn)至少10°C，更優(yōu)選高于濁點(diǎn)至少20°C，最優(yōu)選高于濁點(diǎn)至少30°C。優(yōu)選地，在步驟ii)中，還從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，在步驟ii)之后，例如通過(guò)超濾從發(fā)酵培養(yǎng)基中提純和/或濃縮發(fā)泡劑。優(yōu)選地，消泡劑為食品級(jí)。優(yōu)選地，消泡劑包含至少一種非離子型表面活性劑/聚合物，例如聚醚、聚亞烷基二醇、環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、基于環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二酉享的聚醚分散體(polypropyleneglycol-basedpolyetherdispersion)或燒氧基化脂肪酸酯。優(yōu)選地，發(fā)泡劑為食品級(jí)。優(yōu)選地，發(fā)泡劑是疏水蛋白，更優(yōu)選為II類(lèi)疏水蛋白，最優(yōu)選為來(lái)自里氏木霉(Trichodermareesei)的HFBI或HFBII。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是基因修飾真菌，更優(yōu)選為酵母，最優(yōu)選為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)0優(yōu)選地，在步驟ii)之后，消泡劑與發(fā)泡劑的重量比小于0.2，更優(yōu)選小于0.15，最優(yōu)選小于0.1。發(fā)明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)領(lǐng)域)普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。用于分子和生物化學(xué)方法的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可見(jiàn)于Sambrook等，MolecularCloning=ALaboratoryManual,3,(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,L^l^AusubelShortProtocolsinMolecularBiology(1999)HJohnffiley&Sons.Inc.片反白勺g禾爾力CurrentProtocolsinMolecularBiology)巾。發(fā)泡劑在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“發(fā)泡劑”是指生物來(lái)源的表面活性劑，它促進(jìn)泡沫形成和/或通過(guò)抑制氣泡聚結(jié)來(lái)增強(qiáng)泡沫的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，發(fā)泡劑是這樣的根據(jù)以下測(cè)試，所述發(fā)泡劑在水溶液中產(chǎn)生氣相體積至少占20%的泡沫，在5°C下貯存1小時(shí)之后(更優(yōu)選2小時(shí)之后，最優(yōu)選4小時(shí)之后)，保留所述氣相體積的至少50%。制備SOmL發(fā)泡劑水溶液(0.5重量％)。在垂直安裝、帶夾套、經(jīng)過(guò)冷卻(2°C)的圓筒形不銹鋼容器中，通過(guò)剪切該溶液對(duì)該溶液進(jìn)行充氣，所述容器的內(nèi)部大小(internalproportions)為高度105mm、直徑72mm。所述容器的蓋占其內(nèi)部容積的54%，留下46%(ISOmL)給樣品。用于剪切樣品的轉(zhuǎn)子(rotor)由矩形葉輪組成，所述葉輪具有恰當(dāng)?shù)拇笮?72mmx41.5mm)，以便當(dāng)其轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)刮擦容器的內(nèi)表面。所述轉(zhuǎn)子還連有兩個(gè)半圓形(直徑為60mm)高剪切刀片，所述刀片與矩形連接件(attachment)成45°角放置。將SOmL溶液傾入容器中，蓋緊蓋子。然后以1250rpm剪切溶液10分鐘。將充氣溶液立即傾入量筒中。立即從量筒上讀取泡沫體積，在5°C下貯存之后再次讀數(shù)。如下所示，從測(cè)量的泡沫體積和已知的水相體積(即80mL)來(lái)確定氣相體積氣相體積=[(泡沫體積-80mL)/泡沫體積]xlOO泡沫中的液體隨時(shí)間排出，產(chǎn)生兩個(gè)分開(kāi)且截然不同的層頂部的泡沫和下部的水溶液。然而，這里的關(guān)注點(diǎn)是泡沫相的穩(wěn)定性。對(duì)于計(jì)算氣相體積，將泡沫體積視為該體系(即，氣相和液相兩者)的總體積，而不管它們是否已分為兩個(gè)截然不同的層。因此，氣相體積的值給出了泡沫對(duì)于氣體損失的穩(wěn)定性(thestabilityofthefoamtolossofgas)的量化指示。因此，若泡沫的初始?xì)庀囿w積為50%，則貯存之后，氣相體積應(yīng)為至少25%；若初始?xì)庀囿w積為20%，則貯存之后，氣相體積必須為至少10%。發(fā)泡劑包括疏水蛋白和生物表面活性劑，例如糖脂(例如鼠李糖脂、海藻糖脂、纖維二糖脂、槐糖脂)；脂肽和脂蛋白(例如肽-脂質(zhì)、沙雷濕潤(rùn)素(serrawettin)、黏質(zhì)、表面活性肽、枯草桿菌蛋白酶、短桿菌肽、多黏菌素)；脂肪酸、中性脂質(zhì)和磷脂；高分子生物表面活性劑(例如乳化膠(emulsan)、biodispersan、甘露聚糖-脂質(zhì)-蛋白質(zhì)、脂乳化劑(liposan)、碳水化合物-蛋白質(zhì)_脂質(zhì)、蛋白質(zhì)PA)、粒狀生物表面活性劑(囊泡(vesicles)和傘毛(fimbriae)、全細(xì)胞)、糖苷(例如皂苷)和纖維狀蛋白質(zhì)(例如絲心蛋白)。乳及大豆蛋白/蛋白水解物也是發(fā)泡劑，雖然它們通常不是通過(guò)發(fā)酵方法來(lái)制備。優(yōu)選地，發(fā)泡劑不是乳或大豆的蛋白或蛋白水解物。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)泡劑是疏水蛋白?？赏ㄟ^(guò)培養(yǎng)宿主有機(jī)體獲得發(fā)泡劑，所述宿主有機(jī)體將發(fā)泡劑自然分泌至發(fā)酵培養(yǎng)基中。例如，可通過(guò)培養(yǎng)絲狀真菌獲得疏水蛋白，所述絲狀真菌例如為絲孢綱(hyphomycetes)(例如木霉屬(Trichoderma))、擔(dān)子菌綱(basidiomycetes)和子囊菌綱(ascomycetes)。特別優(yōu)選的宿主是食品級(jí)有機(jī)體，例如栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)，它分泌一種稱(chēng)作cryparin的疏水蛋白(MacCabe和VanAlfen,1999，App.Environ.Microbiol65:5431-5435)。類(lèi)似地，可從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)獲得表面活性肽，可從例如銅綠假單胞菌(Pseudomanasaeruginosa)、紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)、分枝桿菌屬(Mycobacteriumspecies)和球擬酵母(Torulopsisbombicola)獲得糖月旨(Desai和Banat，MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,1997年3月,pp47-64)?；蛘?，可通過(guò)使用重組技術(shù)制備發(fā)泡劑。例如，可對(duì)宿主細(xì)胞(典型為微生物)進(jìn)行修飾，以表達(dá)發(fā)泡劑。用于將編碼發(fā)泡劑的核酸構(gòu)建物(其中發(fā)泡劑是多肽)或者制備發(fā)泡劑所必需的酶(其中發(fā)泡劑是非肽物質(zhì)(non-peptide)，例如生物表面活性劑)引入宿主細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。重組技術(shù)也可用于修飾發(fā)泡劑序列，或者合成具有所需/改進(jìn)性質(zhì)的新穎發(fā)泡劑。典型地，通過(guò)編碼所需多肽發(fā)泡劑的核酸構(gòu)建物對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞或有機(jī)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化?？蓪⒕幋a多肽的核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體中，所述載體編碼用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件(elements)，插入的方式使得所述核苷酸序列將在適當(dāng)?shù)臈l件(例如，在恰當(dāng)?shù)姆较蚝驼_的閱讀框架中，具有恰當(dāng)?shù)陌邢蚝捅磉_(dá)序列)下表達(dá)。構(gòu)建這些表達(dá)載體所需的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。許多表達(dá)體系可用于表達(dá)多肽編碼序列。這些表達(dá)體系包括但不限于用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)菌、真菌(包括酵母)以及昆蟲(chóng)細(xì)胞體系和植物細(xì)胞培養(yǎng)體系。優(yōu)選的宿主是視為食品級(jí)——“一般認(rèn)為安全”(GRAS)的那些宿主。合適的真菌屬包括酵母菌和絲狀菌屬(filamentousspecies)，前者例如但不限于酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)等屬的那些，后者例如但不限于曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、毛霉屬(Mucor)、脈孢菌屬(Neurospora)、鐮孢霉屬(Fusarium)等屬的那些。編碼多肽發(fā)泡劑的序列優(yōu)選與自然界中鑒定的發(fā)泡劑在氨基酸水平上具有至少80%的同一性，更優(yōu)選具有至少95%或100%的同一性。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可作出不降低發(fā)泡劑的生物活性的保守置換或其他的氨基酸變化。疏水蛋白是一類(lèi)特別優(yōu)選的發(fā)泡劑。我們以前曾在EP1623631中發(fā)現(xiàn)，疏水蛋白允許產(chǎn)生具有優(yōu)異的抗歧化(disproportionation)和抗聚結(jié)穩(wěn)定性的水性泡沫。由于疏水蛋白是非常有效的發(fā)泡劑，因此它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)基中的存在對(duì)泡沫控制形成一個(gè)特別挑戰(zhàn)。疏水蛋白是一類(lèi)充分定義的蛋白質(zhì)(ffessels,1997,Adv.Microb.Physio.381-45；ffosten,2001,AnnuRev.Microbiol.55:625_646)，其能夠在疏水/親水界面處自組裝，并具有以下保守序列Xn-C-X5_9-C-C-Xn_39-C-X8_23-C-X5_9-C-C-X6_18-C-Xm(SEQIDNo.1)其中X代表任何氨基酸，η和m獨(dú)立地代表整數(shù)。典型地，疏水蛋白具有至多125個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。該保守序列中的半胱氨酸殘基(C)是二硫橋鍵(bridge)的一部分。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“疏水蛋白”具有更寬的含義，包括仍然顯示在疏水-親水界面自組裝產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜的特性的功能上等價(jià)的蛋白質(zhì)，例如包含以下序列或其部分，仍然顯示在疏水-親水界面自組裝產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜的特性的蛋白質(zhì)Xn-C-Xp5。-C-Xh-C-Xh^-C-Xhoo-C-Xh。-C-Xh-C-Xh。-C-Xm(SEQIDNo.2)。根據(jù)本發(fā)明的定義，可通過(guò)將蛋白質(zhì)吸附到特氟隆上，并使用圓二色性，以確定二級(jí)結(jié)構(gòu)(一般是α-螺旋)的存在來(lái)檢測(cè)自組裝(DeVocht等，1998，Biophys.J.742059-68)?？梢酝ㄟ^(guò)在蛋白質(zhì)溶液中孵育特氟隆片，然后用水或緩沖液洗滌至少3次來(lái)確定膜的形成(Wosten等，1994,Embo.J.13=5848-54)?？赏ㄟ^(guò)如本領(lǐng)域充分建立的任何合適的方法(例如用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，或者通過(guò)使用熒光抗體)來(lái)顯現(xiàn)蛋白質(zhì)膜。m和η的值典型為0-2000，但更通常地，m和η的總和小于100或200。在本發(fā)明的上下文中，疏水蛋白的定義包括疏水蛋白與另一種多肽的融合蛋白，以及疏水蛋白與其他分子(如多糖)的綴合物。至今所鑒定的疏水蛋白一般歸類(lèi)為I類(lèi)或II類(lèi)。這兩種類(lèi)型已在真菌中鑒定為分泌性蛋白質(zhì)，它們?cè)谑杷缑嫣幾越M裝成兩親膜。I類(lèi)疏水蛋白的組裝體(Assemblages)一般相對(duì)不可溶解，而II類(lèi)疏水蛋白的那些組裝體容易溶解在各種溶劑中。優(yōu)選地，所述疏水蛋白溶于水，這意味著，其至少0.1%(優(yōu)選至少0.5%)可溶于水。至少0.可溶于水是指使99.9mL水中的0.Ig疏水蛋白在20°C下經(jīng)受30000g離心30分鐘時(shí)，不發(fā)生疏水蛋白沉淀。在絲狀細(xì)菌(如放線(xiàn)菌(Actinomycetesp.)和鏈霉菌(Str印tomycessp.))中也鑒定了疏水蛋白樣蛋白質(zhì)(例如“chaplins，，)(W001/74864；Talbot,2003,Curr.Biol.13R696-698)。與真菌疏水蛋白形成對(duì)照，這些細(xì)菌蛋白可能只形成至多一個(gè)二硫橋鍵，因?yàn)樗鼈兛赡苤挥袃蓚€(gè)半胱氨酸殘基。此類(lèi)蛋白質(zhì)是功能上等效于具有SEQIDNos.1和2中所示共有序列的疏水蛋白的實(shí)例，并包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。已經(jīng)從超過(guò)16個(gè)真菌物種中克隆了多于34種編碼疏水蛋白的基因(參見(jiàn)例如W096/41882，其給出了雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)中鑒定的疏水蛋白的序列；以及Wosten,2001,AnnuRev.Microbiol.55:625_646)。就本發(fā)明而言，與天然存在的疏水蛋白在氨基酸水平上具有至少80%的同一性的疏水蛋白也包括在術(shù)語(yǔ)“疏水蛋白”內(nèi)。消泡劑術(shù)語(yǔ)“消泡劑”既包括通常在發(fā)生發(fā)泡前加入的消泡劑，也包括通常在一旦形成泡沫就加入的那些消泡劑(有時(shí)稱(chēng)作“消泡劑(defoamers)”)。適用于本發(fā)明的一組特定消泡劑是顯示濁點(diǎn)的那些消泡劑。濁點(diǎn)是在其下消泡劑水溶液當(dāng)發(fā)生相分離(即，消泡劑分子形成散射光的聚集體)時(shí)變得明顯渾濁的溫度，如J.Eastoe在T.Cosgrove編著的ColloidSciencePrinciples,MethodsandApplications(BlackwellPublishing,2005)中SurfactantAggregationandAdsorptionatInterfaces第63頁(yè)所述。顯示濁點(diǎn)的消泡劑的例子包括基于聚亞烷基二醇(PAG)的化合物，例如環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、基于環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的聚醚；以及基于脂肪酸酯的化合物。濁點(diǎn)取決于表面活性劑的組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于聚氧乙烯(PEO)非離子型表面活性劑，對(duì)于給定的疏水基團(tuán)，濁點(diǎn)隨著EO含量的增加而升高。優(yōu)選地，消泡劑的濁點(diǎn)在0°C與9°C之間，更優(yōu)選在5°C與60°C之間。優(yōu)選地，消泡劑包含至少一種非離子型表面活性劑/聚合物，如聚醚、聚亞烷基二醇、環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、基于環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二醇的聚醚分散體或烷氧基化脂肪酸酯?；赑AG的消泡劑(例如可得自希倫賽勒赫公司(SchillandSeilacher)的StruktolJ647)、基于ΕΡ/Ρ0嵌段共聚物的多元醇(例如可得自希倫賽勒赫公司的StruktolJ647)及其他非離子型表面活性劑消泡劑在消滅泡沫方面特別有效，即使存在強(qiáng)有力的發(fā)泡劑(如疏水蛋白)時(shí)也是如此?？梢允褂孟輨┑幕旌衔?，在該情況下，這種混合物的濁點(diǎn)定義為單獨(dú)組分中的最高濁點(diǎn)。顯示濁點(diǎn)的一些常見(jiàn)的市售消泡劑示于表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通過(guò)以下方式進(jìn)行發(fā)酵，以制備發(fā)泡劑在生物反應(yīng)器(例如工業(yè)發(fā)酵罐)內(nèi)，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞。選擇培養(yǎng)基的組成(例如營(yíng)養(yǎng)素、碳源等)、溫度和PH，為培養(yǎng)物的生長(zhǎng)和/或發(fā)泡劑的制備提供適當(dāng)?shù)臈l件。將空氣或富氧空氣正常鼓入培養(yǎng)基中，為培養(yǎng)物的呼吸提供氧氣?？蓪⑾輨┌ㄔ诔跏寂囵B(yǎng)基組合物中且/或在發(fā)酵期間按需加入。通常的實(shí)踐是采用泡沫檢測(cè)方法，例如電導(dǎo)探針，其自動(dòng)啟動(dòng)消泡劑的加入。在本發(fā)明中，消泡劑的存在濃度優(yōu)選為0.l_20g/L，更優(yōu)選為l-10g/L。在步驟i)期間，即，在發(fā)酵期間，發(fā)酵罐溫度可高于或低于消泡劑的濁點(diǎn)。優(yōu)選地，發(fā)酵罐溫度高于消泡劑的濁點(diǎn)，因?yàn)橄輨┰诟哂谄錆狳c(diǎn)的溫度下對(duì)引起氣泡聚結(jié)和泡沫崩塌最有效。一般對(duì)發(fā)酵罐溫度進(jìn)行選擇，以達(dá)到用于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)和/或發(fā)泡劑制備的最適宜條件。在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，必須基本上去除消泡劑，以確保發(fā)泡劑的功能不受削弱。優(yōu)選去除至少75%(更優(yōu)選至少85%、最優(yōu)選至少90%)的消泡劑。例如，在步驟ii)之后，消泡劑與發(fā)泡劑的重量比優(yōu)選小于0.2，更優(yōu)選小于0.15，最優(yōu)選小于0.1。通過(guò)確保發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于消泡劑的濁點(diǎn)，以使消泡劑相分離，實(shí)現(xiàn)消泡劑的去除。可通過(guò)任何合適的方法將相分離的消泡劑從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除，所述方法例如-過(guò)濾，例如死端過(guò)濾或壓濾器-膜(交叉流)過(guò)濾，例如微濾或超濾-離心-吸附，使用例如活性炭、二氧化硅或硅藻土作為吸附劑?？赏ㄟ^(guò)例如這些方法之一經(jīng)單一步驟進(jìn)行消泡劑的去除?；蛘?，這些方法可重復(fù)或組合進(jìn)行。例如，在第一過(guò)濾步驟之后，可重新加熱(若有必要)濾液，然后再次過(guò)濾。我們發(fā)現(xiàn)，若發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于所述濁點(diǎn)至少10°C，優(yōu)選高于所述濁點(diǎn)至少20°C，最優(yōu)選高于所述濁點(diǎn)至少30°C，則去除更多消泡劑。發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度不可高到使發(fā)泡劑變性。為此，優(yōu)選發(fā)泡劑具有熱穩(wěn)定性，例如疏水蛋白。發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度優(yōu)選低于90°C，更優(yōu)選低于75°C。在優(yōu)選實(shí)施方式中，消泡劑的濁點(diǎn)為20-30°C，步驟ii)中發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度為40-60°C。相反，在常規(guī)方法中，刻意避免將發(fā)酵培養(yǎng)基保持在如此的高溫下，以便使發(fā)生降解反應(yīng)(其可引起顏色和風(fēng)味變化)、酶失活、蛋白質(zhì)變性和損失功能的可能性達(dá)到最小(參見(jiàn)例如Grandison，Α.S.；Lewis,Μ.J.編著的"SeparationProcessesintheFoodandBiotechnologyIndustries，，第7頁(yè))。用于分離消泡劑的優(yōu)選方法是膜過(guò)濾。一般認(rèn)為，在高于消泡劑的濁點(diǎn)的溫度下對(duì)含消泡劑的發(fā)酵液進(jìn)行膜過(guò)濾，導(dǎo)致由沉淀的消泡劑引起的膜污垢，導(dǎo)致低的滲透通量以及后續(xù)的處理困難參見(jiàn)例如Yamagiwa等，J.Chem.Eng.Japan,26(1993)pp13-18和WO01/014521。因此，先前認(rèn)為膜過(guò)濾應(yīng)在低于濁點(diǎn)的溫度下進(jìn)行。然而，我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，在高于消泡劑的濁點(diǎn)約25°C的溫度下進(jìn)行超濾和微濾操作時(shí)，獲得可接受的通量。為了確保發(fā)泡劑產(chǎn)品不含細(xì)胞內(nèi)材料和基因材料(其通常視為不合需要的污染物)，必須從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，在去除沉淀的消泡劑的同時(shí)，將細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離，例如在高于濁點(diǎn)的溫度下所進(jìn)行的微濾步驟中分離。在另選的實(shí)施方式中，可在去除消泡劑之前，在單獨(dú)的步驟中，在低于濁點(diǎn)的溫度下從培養(yǎng)基中去除細(xì)胞——例如通過(guò)過(guò)濾(例如死端過(guò)濾或壓濾器)、膜/交叉流過(guò)濾(例如微濾或超濾)或離心。在該實(shí)施方式中，提純和/或濃縮步驟(例如通過(guò)超濾)可在去除細(xì)胞之后但在分離消泡劑之前進(jìn)行(再次在低于濁點(diǎn)的溫度下)。然后將培養(yǎng)基加熱至高于濁點(diǎn)的溫度，以致可如已經(jīng)描述的那樣將消泡劑去除。—旦已從發(fā)酵培養(yǎng)基中去除消泡劑和細(xì)胞，就可根據(jù)需要，例如通過(guò)超濾進(jìn)一步提純和濃縮發(fā)泡劑產(chǎn)品。若發(fā)泡劑是疏水蛋白，可通過(guò)例如WO01/57076中所描述的程序?qū)⑵鋸陌l(fā)酵培養(yǎng)基中提純，所述程序涉及將疏水蛋白吸附到一表面上，然后使該表面與表面活性劑(如Tween20)接觸，以將疏水蛋白從表面上洗脫。還參見(jiàn)Collen等，2002，BiochimBiophysActa.1569139-50；Calonje^,2002,Can.J.Microbiol.481030-4；Askolin等，2001，ApplMicrobiolBiotechnol.57:124_30；和DeVries等，1999，EurJBiochem.262:377_85?，F(xiàn)將參考以下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的而非限制性的，在所述附圖中圖1顯示了StruktolJ647和J633的0.2重量％水溶液的作為溫度的函數(shù)的％透身寸(transmission)。圖2顯示了實(shí)施例2中測(cè)定的校準(zhǔn)圖。實(shí)施例實(shí)施例1消泡劑的濁點(diǎn)測(cè)定通過(guò)以下方法測(cè)量消泡劑的濁點(diǎn)，這里說(shuō)明兩種市售消泡劑，其中一種具有濁點(diǎn)(StruktolJ647)，而另一種沒(méi)有濁點(diǎn)(StruktolJ633)。在室溫下以水溶液的形式制備每種消泡劑的0.2重量％溶液。將20mL樣品傾入圓筒形玻璃小瓶(Turbiscan)中。在測(cè)量溫度下，在水浴中使樣品平衡1小時(shí)。使用TurbiscanLabExpert(弗穆拉克申(Formulaction)，法國(guó))測(cè)定樣品的濁度。該儀器具有波長(zhǎng)λ為880nm的光源以及與入射光成180°的光學(xué)傳感器，所述光學(xué)傳感器測(cè)量在離容納樣品溶液的小瓶底部25mm處的透射通過(guò)樣品的入射光百分比。隨著溶液變得更渾濁，透射光減少。將樣品小瓶轉(zhuǎn)移到同樣設(shè)定在所需測(cè)量溫度下的TurbiscanLabExpert中。從5V開(kāi)始，按5°C的間隔測(cè)量作為溫度的函數(shù)的％透射，結(jié)果示于圖1中。對(duì)于J647，在20°C與25°C之間，透射從75%急劇降低到0%，表明在該溫度范圍內(nèi)已經(jīng)達(dá)到濁點(diǎn)。這與制造商所報(bào)的24°C溫度值相一致。(若需要更精確的濁點(diǎn)值，可采用更小的溫度間隔(例如1°C或2V)進(jìn)行測(cè)量。)相反，J633顯示很小的濁度變化，因?yàn)樗鼪](méi)有濁點(diǎn)。因此，J647是本發(fā)明中使用的合適消泡劑，而J633不是。實(shí)施例2從典型(model)溶液中去除消泡劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以說(shuō)明可通過(guò)將溶液的溫度升高至高于濁點(diǎn)，并通過(guò)過(guò)濾去除沉淀來(lái)將消泡劑從典型溶液中去除。取3.OOgStruktolJ647的等分試樣，用MilliQ水稀釋至1L，由此制備0.3%(w/v)StruktolJ647溶液。通過(guò)將該溶液的樣品在設(shè)定于所需溫度的水浴中放置1小時(shí)，將其加熱到高于濁點(diǎn)。然后，通過(guò)回蕩輕輕混合樣品，并立即過(guò)濾。進(jìn)行兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)。首先，在固定的溶液溫度(50°C)下，使用帶有2ml注射器，孔徑為0.45μm(購(gòu)自頗爾生命科學(xué)公司(PallLifeScienceAcrodisc))、0·2μm、1·20μm和5.00μm(均購(gòu)自SM公司(SartoriusMinisart))的過(guò)濾器研究過(guò)濾器孔徑的影響。其次，將溶液溫度從30°C變化到70°C(即，高于濁點(diǎn)6-46°C)，同時(shí)使用固定孔徑(0.2μm)。通過(guò)使用用于非離子型表面活性劑的LangeLCK433水測(cè)試試劑盒來(lái)測(cè)定濾液中的消泡劑濃度。其利用這樣的原理非離子型表面活性劑(如J647)與指示劑TBPE(四溴酚酞乙酯(tetrabromophenolphthaleinethylester))形成絡(luò)合物，可將所述絡(luò)合物萃取于二氯甲烷中，并經(jīng)光度計(jì)測(cè)量，以確定濃度。首先構(gòu)建校準(zhǔn)曲線(xiàn)。取3.OOgStruktolJ647等分試樣，在15°C下用MilliQ水稀釋至1L，由此制備0.3%(w/v)StruktolJ647溶液。從該溶液中取出等分試樣，用MilliQ水稀釋?zhuān)越o出下列濃度6、15、30、60、150和300mg/L。使用MilliQ作為空白樣品。將每種濃度的0.2ml樣品加入到容納TBPE和二氯甲烷的試劑盒測(cè)試試管中。將試管輕輕混合2分鐘，允許靜置30分鐘。然后，按照測(cè)試試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在LangDR2800分光光度計(jì)中于605nm處對(duì)它們進(jìn)行測(cè)量。圖2顯示了所得的校準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。然后用MilliQ水將各濾液稀釋1/10。如前所述在分光光度計(jì)中對(duì)0.2ml樣品進(jìn)行測(cè)量，并從校準(zhǔn)曲線(xiàn)圖讀取每個(gè)濾液中的消泡劑濃度。根據(jù)下式計(jì)算濾液中剩余的消泡劑的量(％)(濾液中的測(cè)量濃度)/(已知的起始濃度)xl00%低至0.2mg/L(2xlO_5%w/v)的消泡劑濃度可通過(guò)類(lèi)似技術(shù)，使用LangeLCK333水測(cè)試試劑盒來(lái)測(cè)量，并在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)構(gòu)建校準(zhǔn)曲線(xiàn)。在此情況下，將待測(cè)量樣品的2ml等分試樣而非0.2ml等分試樣加入測(cè)試試劑盒中。表2中給出結(jié)果。使用0.2μm過(guò)濾器在50°C下的兩次測(cè)量的消泡劑剩余量之間的差異(即6%)顯示與該方法有關(guān)的誤差棒(errorbar)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>數(shù)據(jù)顯示，過(guò)濾器孔徑越小，去除的消泡劑的量越多，S卩，溶液中剩余的量如預(yù)期的那樣減少。對(duì)于J647，5.Oym的孔徑不夠小，不足以去除大部分消泡劑，而0.2μm的孔徑導(dǎo)致去除約90%的消泡劑。數(shù)據(jù)還顯示，對(duì)于給定孔徑，升高溶液溫度導(dǎo)致更加有效地去除消泡劑。實(shí)施例3從典型發(fā)酵培養(yǎng)基中去除消泡劑為說(shuō)明從典型發(fā)酵培養(yǎng)基中去除消泡劑，制備典型發(fā)酵培養(yǎng)基。首先，制備組成如表3所示的兩種溶液。在典型的流加式發(fā)酵中，批料1是原來(lái)培養(yǎng)基，批料2在進(jìn)料期間逐漸送入。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在121°C下，將每種批料(體積1L)高壓滅菌(autOClaved)20分鐘。然后將這兩種批料混合(5050)，得到消泡劑濃度為0.6g/L的典型發(fā)酵培養(yǎng)基。不對(duì)該培養(yǎng)基進(jìn)行接種或發(fā)酵，而是以其原初形式進(jìn)行測(cè)試。加熱樣品，過(guò)濾去除消泡劑，測(cè)量消泡劑的剩余量，所有操作如實(shí)施例2中所描述。表4中給出了每種情況下剩余消泡劑的比例。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，但在典型發(fā)酵培養(yǎng)基中加入額外的消泡劑，以使起始濃度為3g/L。結(jié)果示于表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>這說(shuō)明，通過(guò)選擇具有濁點(diǎn)的消泡劑，可用簡(jiǎn)單且便利的方式從典型發(fā)酵培養(yǎng)基中基本上去除消泡劑。實(shí)施例4從含有發(fā)泡劑的發(fā)酵液中去除消泡劑對(duì)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因修飾菌株進(jìn)行流加式發(fā)酵。通過(guò)摻入編碼來(lái)自真菌里氏木霉(Trichodermareesei)的疏水蛋白HFBII(—種發(fā)泡劑)的基因，將所述菌株修飾，以致在發(fā)酵過(guò)程中實(shí)現(xiàn)疏水蛋白的細(xì)胞外表達(dá)?；救鐅andeLaarT等在BiotechnolBioeng.96(3)=483-94(1997)中所述進(jìn)行發(fā)酵，使用葡萄糖作為碳源，并在300L發(fā)酵容器中將該工藝過(guò)程按比例放大(scaling)到總體積為150L。使用消泡劑StruktolJ647來(lái)控制發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)泡(而非vandeLaarT等所使用的StruktolJ673)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，在15°C(即，低于消泡劑J647的濁點(diǎn))下微濾發(fā)酵液，以去除酵母細(xì)胞。在具有孔徑為0.1μπ!的Keras印陶瓷膜的中試裝置(pilotscaleplant)上進(jìn)行微濾，使用去離子水進(jìn)行兩體積滲濾(twovolumesofdiafiltration)。然后，再次在15°C下，對(duì)液體進(jìn)行超濾，以部分提純HFBII。通過(guò)IkDSynder纏繞式(spiralwound)聚合物膜，在0.9巴的跨膜壓力下進(jìn)行超濾，進(jìn)行四體積滲濾。超濾步驟之后，發(fā)酵液中消泡劑的濃度經(jīng)測(cè)量(如實(shí)施例2中所述)為0.196g/L。HFBII的濃度通過(guò)如下所述的高效液相色譜(HPLC)測(cè)量為0.320g/L。分析之前，用60%乙醇水溶液稀釋樣品，使其濃度約為200μg/ml。在30°C下，在VydacProteinC4柱(250x4.6mm)上進(jìn)行HPLC分離。通過(guò)214nm處的UV檢測(cè)測(cè)量疏水蛋白，通過(guò)與得自VTT生物技術(shù)公司(VTTBiotechnology)(埃斯普(Esp00)，芬蘭)的已知HFBII濃度的樣品作比較，計(jì)算其濃度。然后如實(shí)施例2中所述，將不含細(xì)胞的發(fā)酵液加熱至50°C，在該溫度下保持30分鐘，然后過(guò)濾(0.2μm孔徑)，以去除消泡劑。如前所述測(cè)量濾液中消泡劑和HFBII的剩余量，表6中給出結(jié)果(標(biāo)題為“階段1”欄)。然后將來(lái)自該第一階段的濾液再加熱至50°C，在該溫度下保持額外30分鐘，并如前所述過(guò)濾。測(cè)量所得濾液中HFBII和消泡劑的濃度，表6中給出結(jié)果(“階段2”)。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>這說(shuō)明，通過(guò)選擇具有濁點(diǎn)的消泡劑，可用簡(jiǎn)單且便利的方式從含有宿主細(xì)胞和發(fā)泡劑的發(fā)酵液中基本上去除消泡劑。適當(dāng)時(shí)，以上各單獨(dú)部分中提到的本發(fā)明各種特征和實(shí)施方式經(jīng)過(guò)必要的修改后，應(yīng)用于其他部分。因此，適當(dāng)時(shí)，一個(gè)部分中指明的特征可與其他部分中指明的特征相組合。在以上說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物均通過(guò)引用并入本文。不背離本發(fā)明范圍的本發(fā)明所述方法的各種修改和變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。盡管已結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)厥芟抻诖祟?lèi)具體的實(shí)施方式。實(shí)際上，對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的用于實(shí)施本發(fā)明的所述方式的各種修改有意包括在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。權(quán)利要求制備發(fā)泡劑的方法，其包括i)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在細(xì)胞外分泌發(fā)泡劑；并且所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有具有濁點(diǎn)的消泡劑；ii)當(dāng)所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于所述濁點(diǎn)時(shí)去除消泡劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟i)中，通過(guò)向其中鼓入空氣或富氧空氣對(duì)所述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行充氣。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在步驟i)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于所述消泡劑的濁點(diǎn)。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟ii)中，通過(guò)過(guò)濾、離心或吸附去除所述消泡劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中通過(guò)膜過(guò)濾去除所述消泡劑。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟ii)中，去除至少75%的所述消泡劑。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟ii)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于所述濁點(diǎn)至少10°C。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟ii)中，從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中去除所述宿主細(xì)胞。9.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟ii)之后，從所述發(fā)酵培養(yǎng)基中提純和/或濃縮所述發(fā)泡劑。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述消泡劑為食品級(jí)。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述消泡劑包含至少一種非離子型表面活性劑/聚合物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述消泡劑是聚醚、聚亞烷基二醇、環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、基于E0/P0嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二醇的聚醚分散體或烷氧基化脂肪酸酯。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)泡劑為食品級(jí)。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述發(fā)泡劑是疏水蛋白。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是基因修飾真菌。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟ii)之后，消泡劑與發(fā)泡劑的重量比小于0.2。全文摘要提供一種制備發(fā)泡劑的方法，該方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞在細(xì)胞外分泌發(fā)泡劑，且其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有具有濁點(diǎn)的消泡劑；然后，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的溫度高于濁點(diǎn)時(shí)去除消泡劑。文檔編號(hào)C12N1/00GK101827932SQ200880112405公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2008年10月16日優(yōu)先權(quán)日2007年10月18日發(fā)明者A·B·拉塞爾,A·R·科克斯,C·M·蒂爾申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司