專利名稱：使用miRNA檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞死亡情況的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了分離和檢測(cè)體液中脫細(xì)胞小RNA特別是微小RNA(miRNA)序列的非 介入性的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涵蓋通過(guò)分析尿液和其它體液中miRNA的水平(用于 臨床診斷和治療監(jiān)測(cè))檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞死亡情況的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞死亡是多細(xì)胞生物體發(fā)育和機(jī)能的正常部分。作為自然過(guò)程，細(xì)胞死亡涉及 許多由內(nèi)部因素引起的疾病的病理學(xué)。細(xì)胞死亡還伴隨著由外部的物理、化學(xué)、生物試劑引 起的疾病的發(fā)生。存在兩種主要類型的細(xì)胞死亡壞死和凋亡，它們表現(xiàn)出不同的形態(tài)特性 和分子特性(Kerr 等，Br. J. Cancer. 26,239-257(1972) ；Umansky, Theor. Biol. 97, 591-602(1982) ；Umansky 等，Adv Pharmacol. 41，383-407 (1997) ；Ameisen, Cell Death Differ. 11,4-10(2004) ；Lockshin 等.Int J Biochem Cell Biol.36，2405-19(2004)； G.Kroemer，等，Cell Death and Differentiation 12，1463-1467 (2005))。壞死被認(rèn)為直 接由嚴(yán)重的分子和/或結(jié)構(gòu)損害的引起的災(zāi)難性代謝失效，并導(dǎo)致炎癥和對(duì)周圍細(xì)胞的繼 發(fā)性損害。凋亡是比壞死普遍得多的生物學(xué)現(xiàn)象，可由特定信號(hào)如激素、細(xì)胞因子；由特定 信號(hào)如生長(zhǎng)或粘附因子的缺乏或由不造成災(zāi)難性地失去完整性的分子損傷所誘導(dǎo)。凋亡 是積極的細(xì)胞應(yīng)答的結(jié)果，后者涉及分子事件有序和特定級(jí)聯(lián)的開始。凋亡導(dǎo)致各種現(xiàn)象 的出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮和邊緣化、核碎裂、細(xì)胞萎縮、胞膜起泡和核DNA的酶促核小體間斷裂 (enzymatic internucleosomalfragmentation)(Umansky ^,Biochim Biophys Acta. 655, 9-17(1981) ；Arends 等，Am J Pathol. 136，593-608 (1990))。還有文獻(xiàn)描述以特定形態(tài) 學(xué)為特點(diǎn)的其它更罕見的細(xì)胞死亡模式，例如所謂的自體吞噬細(xì)胞死亡(Bredesen等， Stroke. 38(2 Suppl) :652_660 (2007)。無(wú)論細(xì)胞死亡的特定機(jī)制和類型如何，檢測(cè)死亡細(xì)胞類型的方法對(duì)于各種疾病的 診斷是重要的，對(duì)于疾病和治療監(jiān)測(cè)是關(guān)鍵的，對(duì)于不同的診斷是有幫助的。此外，能夠檢 測(cè)體內(nèi)特定細(xì)胞死亡的方法對(duì)于開發(fā)預(yù)防或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的藥物以及對(duì)于新開發(fā)藥物細(xì) 胞毒性的分析是有用的?，F(xiàn)存某些對(duì)與疾病相關(guān)的過(guò)度細(xì)胞死亡的診斷的臨床試驗(yàn)，其基于對(duì)組織特異性 標(biāo)記物如血液或其它體液中的抗原、酶和其它蛋白的檢測(cè)。例如，血液中肝特異性酶活性 的測(cè)定是一種廣泛使用的肝細(xì)胞死亡評(píng)價(jià)方法(Amacher，等，Regul Toxicol Pharmacol. Apr ；27 (2) 119-130(1988) ； Salaspuro,等，Enzyme 37 :87_107(1987) ；Herlong, Hosp. Pract. (Off Ed). 29(11) :32_38 (1994))。對(duì)心肌細(xì)胞特異抗原水平的評(píng)價(jià)已用于診斷心肌 梗塞(Mair等，Clin Chem Lab Med. 37 1077-1084(1999) ；Nunes等，Rev Port Cardiol. 20 785-788(2001))。然而，這種技術(shù)的數(shù)量?jī)H限于某些疾病，所述疾病中標(biāo)記物和檢測(cè)方法 是已知的，可用于提供有意義的、組織特異性結(jié)果的分析(Oh S等，CurrGastroenterol Rep. 3 12-18 (2001) ；Rochling 等，Clin Cornerstone. 3 (6) 1-12 (2001)) 其它方法需要 對(duì)懷疑有疾病狀態(tài)的特定組織進(jìn)行介入性活檢以獲取分析樣本。然而，某些器官和組織如 大腦的活檢是高度介入性的，因而往往難以實(shí)施。已知凋亡即程序性細(xì)胞死亡(哺乳動(dòng)物機(jī)體中主要的細(xì)胞死亡形式)伴隨著核 DNA的核小體間斷裂。很多實(shí)驗(yàn)室證明了一部分這種DNA出現(xiàn)在血液中(Lo Y. M. Ann N Y Acad Sci. 945 :1-7 (2001) ；Lichtenstein 等，Ann N Y Acad Sci. 945 :239_249(2001)； Taback 等，CurrOpin Mo I Ther. 6 273-278 (2004) ；Bischoff 等，Hum ReprodUpdate. 8 493-500，(2002))。已經(jīng)證明這種斷裂的DNA(稱之為跨腎DNA(Tr_DNA))跨過(guò)腎屏障并可 在尿液中檢測(cè)到(Botezatu 等，Clin Chem. 46 :1078_1084，(2000) ；Su 等，J Mol Diagn. 6 101-107(2004) ；Su 等，AnnN Y Acad Sci. 1022 :81_89 (2004)。盡管脫細(xì)胞血漿DNA和Tr-DNA都可被用作診斷工具，但是當(dāng)評(píng)估組織特異性事件 如細(xì)胞死亡時(shí)它們提供的方法相當(dāng)有限。因此，提供更廣范圍的特定病理學(xué)適應(yīng)癥的非介 入性分析方法，因其檢測(cè)特定組織和器官中死亡細(xì)胞水平的能力，而可用于診斷和監(jiān)測(cè)患 者不同疾病狀態(tài)或病理學(xué)狀況。另外，提供用于監(jiān)測(cè)患者對(duì)疾病治療反應(yīng)的工具的組織特 異性分析方法可用于確定治療效果，并且在藥物治療情況下可用于確定給藥所需的最適劑 量。為了解決這些問(wèn)題，本發(fā)明致力于作為監(jiān)測(cè)體液如血清或尿液中體內(nèi)細(xì)胞死亡的 診斷工具的微小RNA(miRNA)的應(yīng)用。與脫細(xì)胞血漿DNA和Tr_DNA不同的是，許多miRNA 顯示細(xì)胞、組織和器官特異性表達(dá)概況(Liang等，Genomics,8 =166(2007) ；Lukiw等， Neuroreport. 18 297-300 (2007) ；Lagos-Quintana 等，Curr Biol. 12 735-739 (2002)； Chen Nat Genet. 38 228-233 (2006) ；Beuvink J. Nucleic Acids Res. 35 e52(2007))。此外，已證明了 miRNA細(xì)胞和組織特異概況與不同病理學(xué)和腫瘤類型的 相關(guān)性(Visone R.，等 Oncogene. 26 7590-7595 (2007) ；Nelson 等，Neuropathol Exp Neurol. 66 461-468 (2007) ；Negrini 等，J Cell Sci. 120 1833-1840 (2007) ；Chang 等， Annu Rev GenomicsHum Genet. 8 :215_239 (2007) Jay 等，Cell Biol. 26 293-300 (2007)) 因此，本發(fā)明提供了通過(guò)檢測(cè)具有特定病理學(xué)特征的組織特異性miRNA來(lái)測(cè)量體 液如血清或尿液中體內(nèi)細(xì)胞死亡的方法?；跈z測(cè)體液中miRNA的本方法可用于進(jìn)一步開 發(fā)診斷或監(jiān)測(cè)試驗(yàn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及以下新方法通過(guò)分析從體液獲得的脫細(xì)胞核酸的特定miRNA序列的 水平來(lái)檢測(cè)和測(cè)量體內(nèi)細(xì)胞死亡，所述miRNA來(lái)源于整個(gè)身體的細(xì)胞死亡；以及用所得到 的分析結(jié)果確定患者疾病狀態(tài)或異常的醫(yī)學(xué)病癥。本發(fā)明方法基于脫細(xì)胞核酸在陰離子交換劑上的吸附和洗脫，這使得濃縮和分離 大于10個(gè)核苷酸的核酸片段成為可能。具體而言，本發(fā)明證明了 (i)miRNA在體液中的存 在；(ii)在尿液中對(duì)來(lái)源于位于泌尿系統(tǒng)外部器官的miRNA (例如跨腎miRNA (Tr_miRNA)) 的檢測(cè)，這意味著所述miRNA已跨越了腎屏障；(iii)對(duì)血清中的miRNA的檢測(cè)，(iv)與特 定細(xì)胞、組織和/或器官中細(xì)胞死亡相關(guān)的病理伴隨著所述器官特異性miRNA水平的變化。
本發(fā)明提供了以下方法檢測(cè)和定量體液中細(xì)胞、組織和/或器官特異性脫細(xì)胞 miRNA，以評(píng)價(jià)各種組織和器官中的體內(nèi)細(xì)胞死亡情況，其中體內(nèi)細(xì)胞死亡情況與特定組織 和/或器官(含有從受試對(duì)象獲得的體液樣品)的疾病相關(guān)；對(duì)所述體液樣品進(jìn)行針對(duì)一 種或多種特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步驟用與所述特定miRNA序列的 一部分基本上互補(bǔ)的引物和/或探針檢測(cè)所述miRNA。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，體內(nèi)細(xì)胞 死亡過(guò)度或不足與特定組織疾病有關(guān)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，體液是尿液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述尿樣分析方 法包括選自以下的技術(shù)雜交、循環(huán)探針反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分析 單鏈構(gòu)象多態(tài)性的PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然而在另一個(gè)實(shí)施方案中，減少所述尿樣中的 核酸降解。本發(fā)明的方法包括減少核酸降解作用，其包括通過(guò)以下方式抑制核酸酶活性添 加一種或多種RNA酶抑制劑；熱滅活或者用選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和 十二烷基硫酸鈉的化合物處理所述尿樣。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，尿樣在膀胱中停留 的時(shí)間低于12個(gè)小時(shí)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，體液是血清。本發(fā)明的方法包括對(duì)血清樣品的分析， 其包括選自以下的技術(shù)雜交、循環(huán)探針反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分析 單鏈構(gòu)象多態(tài)性的PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。然而在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)脫細(xì)胞miRNA，其作為用于與組 織或器官中細(xì)胞死亡過(guò)度或不足相關(guān)的特定疾病的特定標(biāo)記物。任選地，所述疾病是病原 體感染。優(yōu)選所述病原體是病毒。更優(yōu)選所述病毒是埃巴病毒。任選地，所述疾病是腦中 風(fēng)、阿爾茨海默病、帕金森病、與懷孕和/或胎兒相關(guān)的疾病或唐氏綜合癥。本發(fā)明提供了檢測(cè)因與組織或器官中細(xì)胞死亡過(guò)度或不足相關(guān)的疾病而在受試 對(duì)象的不同器官和組織(包括非泌尿系統(tǒng)區(qū)域)中產(chǎn)生的尿液脫細(xì)胞miRNA的方法，所述 方法包括從受試對(duì)象獲得尿樣，以及對(duì)所述尿樣進(jìn)行針對(duì)一種或多種特定miRNA序列的 分析，其中所述分析包括以下步驟用與所述特定miRNA序列的一部分基本上互補(bǔ)的引物 和/或探針檢測(cè)所述miRNA。本發(fā)明方法提供了通過(guò)定量分析體液中特定脫細(xì)胞miRNA以在受試對(duì)象中監(jiān)測(cè) 疾病和/或治療的方法，所述方法包括定期從受試對(duì)象獲取體液樣品，并對(duì)所述樣品進(jìn)行 針對(duì)一種或多種在目標(biāo)細(xì)胞、組織或器官中特異性/過(guò)量表達(dá)的特定miRNA序列的分析，其 中所述分析包括以下步驟用與所述特定miRNA序列的一部分基本上互補(bǔ)的引物和/或探 針檢測(cè)所述miRNA。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述體液是尿液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述體液 是血清。附圖簡(jiǎn)述根據(jù)附圖中所闡述的內(nèi)容，從本發(fā)明實(shí)施方案更詳細(xì)說(shuō)明可得知本發(fā)明上述和其 它目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)。附圖對(duì)于范圍、重點(diǎn)不是必需的，而是旨在說(shuō)明本發(fā)明的原理。

圖1是用Q-S印harose 濾過(guò)的尿液中所提取核酸的聚丙烯酰胺凝膠電泳的照片圖2是來(lái)源于EBV的BARTlmiRNA特異性RT-PCR產(chǎn)物的聚丙烯凝膠分析照片圖3A-3G是表示腦中風(fēng)后12和24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的患者尿樣miRNA濃度 的點(diǎn)圖。
圖4是表示miRNA 129和219濃度變化與腦中風(fēng)結(jié)果之間相關(guān)性的圖表。標(biāo)記為 〇和□的患者在中風(fēng)后一個(gè)月其臨床狀況改善，標(biāo)記為x的患者在中風(fēng)后一個(gè)月臨床狀況
o圖5是表示阿爾茨海默病患者和同齡對(duì)照的未過(guò)濾尿樣中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA濃度 的點(diǎn)圖。圖6是表示阿爾茨海默病患者和同齡對(duì)照的過(guò)濾尿樣中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA濃度的 點(diǎn)圖。圖7是表示阿爾茨海默病患者和同齡對(duì)照的血清樣品中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA濃度的 點(diǎn)圖。圖8是表示帕金森病患者和同齡對(duì)照的尿樣中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA濃度的點(diǎn)圖。圖9是表示懷有唐氏綜合癥胎兒和正常胎兒的孕婦尿樣中經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的miRNA-9濃 度的點(diǎn)圖。發(fā)明詳述本發(fā)明技術(shù)是基于對(duì)存在于體液中的小RNA、尤其是包括跨腎miRNA (Tr-miRNA) 在內(nèi)的特定微小RNA (miRNA)的發(fā)現(xiàn)，它們的濃度反映了與器官損傷或其它病理學(xué)相關(guān)的 細(xì)胞死亡。因此，這些核酸序列以低于或高于對(duì)照組的水平存在，表明從中獲取樣品的患者 中可能存在異?；虿±頎顩r。由于本發(fā)明方法所固有的非介入性特點(diǎn)，其提供了優(yōu)于現(xiàn)有的診斷、檢測(cè)和監(jiān)測(cè) 方法的改進(jìn)。為了幫助理解本發(fā)明，許多術(shù)語(yǔ)定義如下術(shù)語(yǔ)“引物”是指當(dāng)處于啟動(dòng)引物延伸的條件下能夠用作合成起始點(diǎn)的寡核苷酸。 寡核苷酸“引物”可以天然存在于純化的限制性消化物中，或者合成制備。選定引物使其與模板的特異性序列鏈“基本上”互補(bǔ)。引物必須充分地互補(bǔ)以與 模板鏈雜交從而使引物延伸得以發(fā)生。引物序列無(wú)需反映確切的模板序列。例如，引物的 5'末端可連接有非互補(bǔ)的核苷酸片段，而引物序列的剩余部分與上述鏈基本上互補(bǔ)。還可 使非互補(bǔ)的堿基或較長(zhǎng)的序列散布在引物中，前提是引物序列與模板序列有足夠的互補(bǔ)性 來(lái)實(shí)現(xiàn)雜交，并由此形成用于合成引物延伸產(chǎn)物的模板引物復(fù)合體?！鞍小焙怂崾峭ㄟ^(guò)雜交、擴(kuò)增或任何其它分析核酸序列的方法(包括分析方法的組 合)進(jìn)行評(píng)價(jià)的miRNA序列?！半s交”方法包括使互補(bǔ)序列與靶核酸序列(所分析的序列)退火。兩種含有互 補(bǔ)序列的核酸多聚體互尋并經(jīng)由堿基配對(duì)作用的退火的能力是公認(rèn)的現(xiàn)象。由Marmur和 Lane，Proc. Natl. Acad. Sci. USA46 453 (1960)以及 Doty 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46 461(1960)提出的“雜交”過(guò)程的最初觀察結(jié)果現(xiàn)已改進(jìn)成現(xiàn)代生物學(xué)的重要工具。雜交包 括但不限于狹線雜交、斑點(diǎn)雜交和印跡雜交技術(shù)。對(duì)于某些診斷應(yīng)用來(lái)說(shuō)，重要的是確定雜交是否代表完全或部分互補(bǔ)性。例如，當(dāng) 期需簡(jiǎn)單地檢測(cè)病原體miRNA的存在或不存在時(shí)，唯一重要的是，存在相應(yīng)的序列時(shí)雜交 方法確保雜交得以進(jìn)行；當(dāng)部分互補(bǔ)的探針和完全互補(bǔ)的探針會(huì)發(fā)生雜交時(shí)，可選定條件。 然而，其它診斷應(yīng)用可能需要區(qū)分部分互補(bǔ)性與完全互補(bǔ)性的雜交方法。檢測(cè)遺傳多態(tài)性 可能是受關(guān)注的。
本文所用術(shù)語(yǔ)“探針”是指寡核苷酸(即核苷酸序列)，無(wú)論是天然存在于純化的 限制性消化物中或者是合成制備的，其由于探針中至少一段序列與其它核酸中的序列的互 補(bǔ)性或其它可重現(xiàn)的吸引作用方式而與另一核酸序列形成雙螺旋結(jié)構(gòu)或其它復(fù)合體。探針 可用于特定基因序列的檢測(cè)、鑒定和分離。預(yù)期本發(fā)明所使用的任何探針將用任何“報(bào)告分 子”來(lái)標(biāo)記，以便可在任何檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行檢測(cè)，所述系統(tǒng)包括但不限于酶(例如ELISA和 基于酶的組織化學(xué)分析)、熒光、放射性和發(fā)光系統(tǒng)。進(jìn)一步期望目標(biāo)寡核苷酸(即待檢測(cè) 的目標(biāo)寡核苷酸)將用報(bào)告分子標(biāo)記。還期望探針和目標(biāo)寡核苷酸兩者都被標(biāo)記。沒有預(yù) 期本發(fā)明受限于任何特定的檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)記物。
本文所用術(shù)語(yǔ)“miRNA”是非編碼的單鏈小RNA的子集，其長(zhǎng)度大約為18_23個(gè)核 苷酸，在代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)中起重要的作用，特別是由于它們參與調(diào)節(jié)編碼特定蛋白的mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯。miRNA還參與其它重要的過(guò)程，如異染色質(zhì)形成和基因組重排。術(shù)語(yǔ)體內(nèi)細(xì)胞死亡“過(guò)度”或“不足”描述以下情況特定器官或組織中死亡的細(xì) 胞數(shù)分別高于或低于相應(yīng)年齡和性別對(duì)照中的細(xì)胞數(shù)。本文所用術(shù)語(yǔ)“純化的”、“凈化的”和“滅菌的”是指去除樣品中的一種或多種污 染物。本文所用術(shù)語(yǔ)“基本上純化”和“基本上分離”是指以下核酸序列所述核酸序列 從它們的自然環(huán)境中移出、分離或獨(dú)立出來(lái)，并且優(yōu)選60%、更優(yōu)選75%、最優(yōu)選90%脫離 與它們天然締合的其它組分。因此，“分離的多核苷酸”是基本上純化的多核苷酸。預(yù)期為 了實(shí)施本發(fā)明的方法，多核苷酸可以但不必為基本上純化。在本技術(shù)領(lǐng)域中已知有很多以 不純的形式檢測(cè)核酸序列的方法。本文中所用術(shù)語(yǔ)“PCR產(chǎn)物”和“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指在變性、退火和延伸的PCR步驟的 二個(gè)或多個(gè)循環(huán)完成之后所得的化合物的混合物。這些術(shù)語(yǔ)包括已擴(kuò)增一種或多種靶序列 的一種或多種片段的情況。本文所用術(shù)語(yǔ)“尿道”是指參與尿液從身體分泌和排除的器官和通道。本文所用術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試對(duì)象”是指治療受體。包括哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物 患者。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，患者是哺乳動(dòng)物，如人、犬、鼠、貓、牛、綿羊、豬或山羊。在 特定的實(shí)施方案中，患者是人。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被檢測(cè)的miRNA來(lái)源于并特異性表達(dá)于體內(nèi)的特定 細(xì)胞類型、組織和器官中，其中所述miRNA水平的變化表明所述組織的急性病狀，例如與心 肌細(xì)胞死亡相關(guān)的急性心肌梗塞、與神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡相關(guān)的腦中風(fēng)、與由病毒 或其它感染或毒素作用引起的肝細(xì)胞死亡相關(guān)的肝炎或肝硬化、與各種胰腺細(xì)胞死亡相關(guān) 的急性胰腺炎、與所移植器官的細(xì)胞過(guò)度死亡相關(guān)的移植器官排斥作用、各種器官的創(chuàng)傷 性傷害、各種急性感染例如與肺部和/或其它感染器官細(xì)胞死亡相關(guān)的肺結(jié)核。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于并特異性表達(dá)于體內(nèi)特定的 細(xì)胞、組織或器官中，其中所述miRNA的水平變化表明所述組織的慢性病狀，例如阿爾茨海 默病、帕金森病、額顳癡呆(frontotemporal dementia)和神經(jīng)元死亡所引起或伴隨的其它 中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、與心肌細(xì)胞死亡相關(guān)的慢性心力衰竭、與肺細(xì)胞死亡相關(guān)的肺氣腫、與 胰腺β細(xì)胞的死亡相關(guān)的1型糖尿病、與腎細(xì)胞死亡相關(guān)的腎小球性腎炎、與活躍增生的 癌前細(xì)胞的凋亡死亡相關(guān)的癌前病癥、與由于供血不足所致的大量細(xì)胞壞死相關(guān)的癌癥和慢性感染器官或組織中的細(xì)胞死亡。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于并特異性表達(dá)于體內(nèi)特定的細(xì)胞類型、組織或器官，并且所述miRNA的水平變化表明理化試劑的細(xì)胞毒作用，例如與殺 死骨髓細(xì)胞的相對(duì)低劑量和導(dǎo)致胃腸系統(tǒng)上皮細(xì)胞死亡的較高劑量以及殺死腦神經(jīng)元的 更高劑量相關(guān)的輻射；以及與由天然或合成的毒性化合物引起的各種器官和組織的細(xì)胞死 亡相關(guān)的化學(xué)細(xì)胞毒性。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于并特異性表達(dá)于體內(nèi)特定的 細(xì)胞類型、組織或器官并可被用于疾病結(jié)果的預(yù)后。顯示疾病發(fā)展/消退、治療或手術(shù)介入 的成功的相應(yīng)miRNA水平變化可用于疾病和治療的監(jiān)測(cè)。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于移植的細(xì)胞、組織或器官，并且 它們的水平指示出排斥發(fā)作和相應(yīng)治療。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于病原體，并可用于感染診斷和 監(jiān)測(cè)。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，病原體是病毒如埃巴病毒。在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于受感染器官的細(xì)胞，并可用 于支持診斷、評(píng)價(jià)受感染組織的損傷以及進(jìn)一步監(jiān)測(cè)疾病和治療。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于孕婦的胎兒，并以胎兒的狀 況或病理學(xué)為特征，例如先兆子癇，其特征在于胎盤營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度死亡。在再一個(gè)實(shí)施方 案中，所檢測(cè)的miRNA來(lái)源于孕婦的胎兒，并以胎兒的狀況或病理學(xué)為特征，例如伴隨著器 官發(fā)育延遲和細(xì)胞死亡過(guò)度或受抑制的唐氏綜合癥和其它三體綜合癥(trisomies)。在本發(fā)明再一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于單獨(dú)的或與其它標(biāo)記物結(jié)合的組織或細(xì)胞特異 性miRNA的水平的信息用于診斷或監(jiān)測(cè)癌癥或癌前病癥，例如肝癌、腎癌、前列腺癌、結(jié)直 腸癌、胰腺癌和其它已知的癌癥。在一些實(shí)施例中，利用血清中遍在的miRNA水平、尿中白蛋白或肌酸酐水平或用 于標(biāo)準(zhǔn)化其它組織特異性胎兒miRNA的胎盤特異性miRNA水平來(lái)對(duì)細(xì)胞特異性和/或組織 特異性miRNA的水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在本發(fā)明的一方面，分析所述尿樣以檢測(cè)特定miRNA的步驟包括選自以下的技 術(shù)雜交、循環(huán)探針反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性的 PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在本發(fā)明的某些方面，所述尿樣中的核酸降解作用減少。減少核酸降解作用的方 法包括利用RNA酶抑制劑抑制核酸酶活性，或者用選自以下的化合物處理所述尿樣鹽酸 胍、異硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸鈉。在本發(fā)明另一方面，所述尿樣在膀胱 中儲(chǔ)存的時(shí)間少于12小時(shí)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所測(cè)量的miRNA序列特別涉及到體內(nèi)的組織，這些 組織可選自但不限于肺、心、肝、神經(jīng)系統(tǒng)、大腦、血液、腎、骨、眼或胰腺。選作分析的組織可以是正常組織或異常組織(例如惡性組織)。惡性組織和腫 瘤通常包括癌癥、肉瘤、黑素瘤和白血病，更具體地說(shuō)選自與以下癌癥相關(guān)的惡性組織和 腫瘤膽管癌、膀胱細(xì)胞癌、骨癌、腦和CNS癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、慢性骨髓性白血 病、結(jié)腸癌、結(jié)締組織癌、皮膚T-細(xì)胞白血病、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、眼癌、濾泡性淋巴瘤、胃 癌、毛細(xì)胞白血病、何杰金白血病、上皮內(nèi)瘤、喉癌、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌)、黑素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸 癌、腎細(xì)胞癌、肉瘤、皮膚癌、鱗狀細(xì)胞癌、睪丸癌、甲狀腺癌和腎癌。該方法可用來(lái)區(qū)別良性 和惡性腫瘤?？蓮闹惺斋@所述組織樣品的受試對(duì)象包括那些處于發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試對(duì) 象。處于發(fā)展成癌癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試對(duì)象是具有高度發(fā)展成癌癥可能性(即比一般人群中 的可能性更高的可能性)的受試對(duì)象。例如，這些受試對(duì)象包括具有遺傳異常(已證明其 存在與發(fā)展為癌癥的可能性有關(guān)，這種可能性高于一般人群的可能性)的受試對(duì)象、暴露 于致癌因子(即致癌物)如煙草、石棉、或其它化學(xué)毒素的受試對(duì)象、或者以前接受過(guò)癌癥 治療并正處于明顯的減退的受試對(duì)象。本方法包括從患者體液中分離miRNA。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可在體液如血液、羊 水、腦脊液、血漿、乳液、精液、血清、痰、唾液和尿液中檢測(cè)目標(biāo)miRNA。在本發(fā)明的一個(gè)方 面，在尿液中檢測(cè)miRNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在血清中檢測(cè)miRNA。分離本發(fā)明miRNA的本發(fā)明方法可利用市售的陰離子交換材料。不論強(qiáng)的還是弱 的陰離子交換劑都可使用。通過(guò)利用所選的吸附和洗脫溶液，可將miRNA純化、濃縮并基本 上地分離?？赏ㄟ^(guò)利用已知離子強(qiáng)度的溶液使miRNA與陰離子交換柱材料初步結(jié)合，將包括 其它帶負(fù)電的分子如蛋白質(zhì)(微弱結(jié)合的污染物)在內(nèi)的大多數(shù)水溶性組分經(jīng)由交換柱洗 去。對(duì)于洗脫，通過(guò)使用已知濃度的鹽如NaCl (其可與緩沖液混合以控制pH)來(lái)達(dá)到所需 的離子強(qiáng)度，理想的是，所述離子強(qiáng)度對(duì)應(yīng)于核酸被完全洗脫的最低離子強(qiáng)度。由此，以比 核酸更高的嚴(yán)格性結(jié)合到陰離子交換樹脂的污染物可留在柱內(nèi)，即，結(jié)合較強(qiáng)的污染物與 核酸分離開。優(yōu)選的弱交換劑是其中伯、仲或叔胺基團(tuán)(即可質(zhì)子化的胺)提供交換位點(diǎn)的那 些交換劑。強(qiáng)堿陰離子交換劑具有季胺基團(tuán)(即不可質(zhì)子化并且總是帶正電荷的)作為交 換位點(diǎn)?？筛鶕?jù)其各自的吸附和洗脫離子強(qiáng)度和/或用于分離miRNA的pH來(lái)選定這兩種 交換劑。溶液強(qiáng)度高于結(jié)合強(qiáng)度。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了從尿液中分離跨腎miRNA的方法，該方法包括提供 來(lái)自受試對(duì)象的尿液；任選通過(guò)過(guò)濾或離心從尿液中分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片；向尿液中加入 EDTA和Tris-HCl ；向尿液中加入無(wú)硅陰離子交換樹脂；溫育混合物；從尿液中除去陰離子 交換介質(zhì)；并從樹脂中洗脫miRNA。在一個(gè)從尿液中分離miRNA的方法的實(shí)施方案中，EDTA和Tris_HCl在加入尿液 中之后的濃度在10-100mM范圍之間，溶液的pH在約8. 0-約8. 5之間。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在吸附到陰離子交換介質(zhì)之前，任選地將體液通過(guò)膜進(jìn) 行預(yù)過(guò)濾。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，陰離子交換介質(zhì)是用陽(yáng)離子季銨基團(tuán)功能化的基于瓊脂 糖的樹脂。用陽(yáng)離子季銨基團(tuán)功能化的基于瓊脂糖的樹脂的實(shí)例包括Q-Sepharose ANX-4 Sepharose Fast Flow、DEAE-Sepharose 禾口 Q-Sepharose-XL DEAE Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，陰離子交換介質(zhì)選自基于瓊脂糖的季銨陰離子交換介質(zhì) 如 Q-過(guò)濾劑(Q-filter)或 Q-樹脂(Q-resin)。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將陰離子交換介質(zhì)固定在單獨(dú)的載體上，其中該載體是可用于運(yùn)輸或儲(chǔ)存介質(zhì)/核蛋白結(jié)合復(fù)合體的柱式、筒式或便攜式過(guò)濾系統(tǒng)。在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，例如，定期對(duì)存在于同一人的尿液樣中的miRNA序 列進(jìn)行分析，可提供關(guān)于特定器官或組織中病理過(guò)程的早期信息。例如，miRNA122僅在肝 臟中合成，并且其數(shù)量的增加可為肝炎或其它肝臟病理標(biāo)志。阿爾茨海默綜合癥可伴隨著 神經(jīng)元中特異性表達(dá)的miRNA濃度的增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)患者樣品體液中組織特異性miRNA的更詳細(xì)的監(jiān)測(cè)可用 于評(píng)價(jià)疾病的嚴(yán)重性和治療的有效性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，關(guān)于組織特異性miRNA的數(shù)據(jù)聯(lián)合腫瘤特異突變的分析有 助于確定腫瘤位置。本發(fā)明其它方面涉及由一種或多種特定miRNA表達(dá)的變化所引起或伴隨的疾病。 所述技術(shù)將有助于診斷這種類型的病狀。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本方法的應(yīng)用可延伸至監(jiān)測(cè)患者尿液中合成的SiRNA的藥 物代謝動(dòng)力學(xué)，從而加強(qiáng)siRNA藥物設(shè)計(jì)的最優(yōu)化。除非另有說(shuō)明，否者本文所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù) 人員通常所理解的同等含義。盡管相似或等同于那些本文所述的方法和材料可用于本發(fā)明 的實(shí)踐中，但合適的方法和材料描述如下。本文所提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其 它參考資料清楚地通過(guò)整體引用結(jié)合到本文中。在有沖突的情況下，將以包括定義在內(nèi)的 本說(shuō)明書為準(zhǔn)。另外，本文所描述的材料、方法和實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的，沒有限制的意思。
實(shí)施例實(shí)施例的提出是為了更充分地說(shuō)明本發(fā)明的各種實(shí)施方案。這些實(shí)施例決不應(yīng)理 解為限制所附權(quán)利要求書中所記載的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1從尿液中提取miRNAMitMM:為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，將來(lái)自患者或志愿者的尿樣收集到無(wú)菌 11 Oml尿液收集杯中，并立即用EDTA補(bǔ)充至終濃度到10-150mM之間，優(yōu)選為50mM。樣 品于-80°C下以10-50ml等份試樣貯存。在收集樣品之后、加入EDTA之前立即在 Stericup (Mi 11 ipore, Vacuum Driven Filtration System, 0. 45 μ Durapore 過(guò)濾器)上 進(jìn)行尿液的選擇性過(guò)濾。Q 結(jié)合在 50ml 的試管中，用等體積 50mM EDTA (pH 8. 0)和 50mM Tris-HCl (pH 8. 0)稀釋 20mL 的尿液，然后補(bǔ)充 l-2ml Q-Sepharose (GE Healthcare ；17-0510-10)漿液， 于室溫下劇烈攪拌混合10-30min。使用浮桶式轉(zhuǎn)頭(swing bucket rotor)的臺(tái)式臨床離心 機(jī)在室溫下以2000g離心5min收集結(jié)合了核酸的樹脂。通過(guò)抽吸將接近500 μ 1的上清液 除去。將樹脂沉淀重懸于殘存的上清液中并轉(zhuǎn)移至Micro Bio-Spin色譜柱(Bio-Rad)或等 效物中，其通過(guò)真空離心來(lái)操作。用500 μ 1 2xSSC(300mM NaCL/30mM檸檬酸鈉(pH 7.0)) 或具有相近離子強(qiáng)度的緩沖液(例如300mM NaCl或LiCl)洗滌柱中的樹脂三次。用高離 子強(qiáng)度(例如IM NaCl或LiCl)將核酸從Q-S印harose中洗脫下來(lái)，但下面所描述的方法 能更好地保存RNA。
Q-Seoharosea 和 TRIzola 相分離洗脫用 500 μ 1 TRIzol 試劑(Invitrogen)進(jìn) 一步洗脫結(jié)合的核酸。按照制造商的指示從TRIzol中萃取核酸。簡(jiǎn)言之，為了進(jìn)行相分離， 用100 μ 1氯仿補(bǔ)充TRIzol洗脫液，劇烈混合，于室溫下孵育3-5min并以12，OOOxg于4°C 離心15min。將300 μ 1上層相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，同時(shí)避免碰觸界面。然后將核酸沉淀 或者另外在硅膠柱上進(jìn)行清洗并脫鹽。核酸沉淀為了進(jìn)行核酸沉淀，用1 μ 1 20mg/mL糖原(Roche)和300 μ 1 100% 異丙醇補(bǔ)充上述制備物。離心收集核酸，用200μ1 70%乙醇洗滌沉淀兩個(gè)，室溫下風(fēng)干 5min，然后將核酸溶解在30 μ 10. ImMEDTA/lx RNA Secure (Ambion)。將樣品于60°C下孵育 IOmin以滅活殘存的RNA酶活性。
核酸的硅膠柱清洗為了與硅膠柱(Qiagen PCR清洗柱或等效物)結(jié)合，將3倍 體積96%的乙醇加入到來(lái)自Trlzol上層相的核酸制備物中，室溫下孵育3min之后，將混 合物加樣到在柱上。用500μ1 2MLiCl/80%乙醇洗滌柱子兩次，并用500μ 1 80%乙醇洗 滌兩次。用50μ 1的0. ImM EDTA/Ix RNA Secure(Ambion)洗脫核酸。于60°C下溫育樣品 IOmin滅活任何殘存的RNA酶。DNA_I和RNA酶A消化為了檢驗(yàn)用上述方案從尿液中提取材料的核酸身份，用 DNA酶I和/或RNA酶A消化該制備物。在含有2個(gè)單位無(wú)RNA酶的DNA酶I (NEB)的DNA 酶I反應(yīng)緩沖液(NEB)中進(jìn)行DNA酶I的消化。在補(bǔ)充了 50ng/mL經(jīng)煮沸RNA酶A的TE 緩沖液中進(jìn)行RNA酶A的消化。于37°C下孵育樣品60min，在加入加樣染料之后，將樣品進(jìn) 行5%聚丙烯酰胺IxTBE凝膠電泳，并用1/10000稀釋的SYBR Gold(Invitrogen)進(jìn)行 染色。如圖1所示，經(jīng)分離的材料代表低分子量的核酸、主要是RNA及其片段。另外(見圖 1)，為了進(jìn)行比較，泳道2和3為用3M NaCl從Q-樹脂洗脫的核酸，泳道4和5為用Trizol 洗脫的核酸。在圖1中，泳道1和5分別代表用高鹽和TriZol從Q-S印harose洗脫來(lái)分離的核 酸；泳道2和6 ;3和7 ；4和8分別代表用DNA酶、RNA酶或DNA酶+RNA酶處理后的核酸。此外，為了證明RNA的存在和分子大小，用DNA酶I消化純化的核酸的RNA等份試 樣，即泳道3和5。從血清中提取RNA為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，將1. 2ml TRIzol LS加到0. 4ml血清中，以14，OOOrpm離心混 合物lOmin。將上清液轉(zhuǎn)移至2ml Eppendorf管中，加入0. 3ml氯仿，將混合物振蕩15秒 鐘。14，OOOrpm離心15min之后，將上清液轉(zhuǎn)移至5ml管中并加入乙醇至最終濃度為70%。 將混合物加樣到Quiagen Quick柱真空歧管上，用0. 5ml的2M LiCl-80% EtOH洗滌柱子兩 次，一次用0.5ml 80%乙醇-80mM醋酸鈉(pH 5. 0)，最后用0. 5ml 95%乙醇。以14，OOOrpm 在1. 5ml Eppendorf管中離心柱子3min，并用40 μ 1 H2O洗脫RNA。實(shí)施例2該實(shí)施例證明了來(lái)自死亡細(xì)胞的miRNA跨越腎屏障，并可在患者的尿液中檢測(cè) 到。尿液中人類miRNA分子的檢測(cè)在本實(shí)施例中所分析的微小RNA種類可分成三組不同的類型，即在所有或多種組 織中表達(dá)的遍在miRNA、組織特異性miRNA和在特定的組織或細(xì)胞類型中其表達(dá)有顯著變 在大多數(shù)尿液R\A制備物種檢測(cè)到所有三種類型的miR\A。最高的拷貝數(shù)以遍在miR\A為特征。然而，組織特異性miRNA或在特定組織或細(xì)胞類型中過(guò)量表達(dá)的miR\A也是可檢測(cè)到的。已經(jīng)清楚地表明來(lái)自死亡細(xì)胞一部分ｍｉＲ＼Ａ不被降解，但出現(xiàn)在血液里，并最終分泌到尿液中。實(shí)施例3
該實(shí)施例證明了來(lái)自人類鼻咽癌(NPC)細(xì)胞的miRNA可跨越患者的腎障礙，并可 通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR在患者的尿液中檢測(cè)出來(lái)。尿液中來(lái)源于病毒的miRNA已知以一些病毒也編碼和合成miRNA。由于埃巴病毒(EBV)涉及鼻咽癌(NPC)的 發(fā)展，該系統(tǒng)用于探求來(lái)自NPC細(xì)胞的病毒miRNA是否可以達(dá)到患者的尿液中并從中檢測(cè) 出來(lái)。按照本申請(qǐng)的實(shí)施例1所描述的方法收集并貯存來(lái)自NPC患者的尿樣。通過(guò)檢測(cè)尿 液中病毒特異性DNA序列來(lái)證實(shí)EBV的感染。從健康供者收集的尿液呈EBV特異性DNA序 列陰性。在此項(xiàng)研究中，分析了兩種EBV特異性miRNA，即BART3-3p和BARTl-3p BART3-3P CGC ACC ACU AGU CAC CAG GUG U SEQ ID NO 21BART1-3P UAG CAC CGC UAU CCA CUA UGU CU SEQ ID NO 22反轉(zhuǎn)錄在15 μ 1體系中完成，取1/10的RT反應(yīng)物，用來(lái)自Sigma的JumpStart DNA 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。下列引物的使用濃度為500ηΜ。JD序列SQ K) NOBART3-3PRT GTC GTA TOC AGT GCA GGG TOC GAG GTA TTC GCA CTG GAT AOG ACA CAC CT 23BART1-3PRT GTC GTA TOC AGT GCA GGG TOC GAG GTA TTC GCA CTG GAT AOG ACA GAC AT 24BART3-3PF OGC OGC AOC ACT AGT CAC25BART1-3PF CGC TAG CAC CGC TAT CCA26miRNACR GTG CAG GGT CCG AGG T27以15%聚丙烯酰胺凝膠(PAAG)分析產(chǎn)物。如圖2中所示，BART3和BART ImiRNA兩者都在NPC患者的尿液中檢測(cè)出來(lái)，但在 健康供者尿液中沒有檢測(cè)到。這些數(shù)據(jù)再次說(shuō)明可在尿液中檢測(cè)到來(lái)自位于泌尿系統(tǒng)外的 死亡細(xì)胞的miRNA。在圖2中，泳道1代表標(biāo)記物；泳道2和3代表鼻咽癌患者；泳道4和 5代表對(duì)照患者；泳道6代表陽(yáng)性對(duì)照，其代表相應(yīng)的合成miRNA。實(shí)施例4該實(shí)施例證明可通過(guò)測(cè)量患者尿液中神經(jīng)元特異性miRNA的濃度指示體內(nèi)由中 風(fēng)引起的神經(jīng)元死亡。腦中風(fēng)診斷為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，對(duì)腦中風(fēng)患者進(jìn)行了研究，以分析中風(fēng)后腦特異性miRNA或 腦中過(guò)量表達(dá)的miRNA濃度的變化情況。由于目前還不清楚什么類型的腦細(xì)胞以及在腦部 什么區(qū)域表達(dá)這些miRNA，因此對(duì)9種不同的腦特異性miRNA進(jìn)行了研究。患者從在醫(yī)院急診室接收的患者中收集尿樣。腦中風(fēng)的診斷基于臨床癥狀。中 風(fēng)后12和24小時(shí)收集尿樣。對(duì)照尿樣由沒有中風(fēng)癥狀的同齡志愿者提供。按照本申請(qǐng)實(shí) 施例1所述的方法收集并貯存樣品。miRNA種類按照實(shí)施例1所述的方法提取尿液中的miRNA。對(duì)與675 μ 1尿液中 所分離的RNA等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，取1/10的RT-PCR混合物的進(jìn)行最終實(shí)時(shí)PCR， 這通過(guò)用制造商所提供的方案來(lái)實(shí)施。通過(guò)按照尿液中的肌酸酐濃度重新計(jì)算來(lái)對(duì)所獲得 的數(shù)據(jù)進(jìn)行針對(duì)個(gè)體腎過(guò)濾率(individual kidney filtration rate)的標(biāo)準(zhǔn)化。為了進(jìn) 行這些實(shí)驗(yàn)，將從同一年齡組的健康供者中收集的尿樣用作基線。不同的miRNA種類如下 所示
A. hsa-mir-128aB. hsa-mir-9C. hsa-mir-127D. hsa-mir-137E. hsa-mir-129F. hsa-mir-219G. hsa-mir-218圖3A-3G總結(jié)的結(jié)果清楚地表明在腦中風(fēng)之后，幾種腦特異性miRNA(128a，129， 218，219)水平的顯著增加，這反映了腦細(xì)胞死亡的動(dòng)力學(xué)。實(shí)施例5該實(shí)施例證明中風(fēng)后患者尿液中miRNA濃度的動(dòng)力學(xué)提供了有關(guān)疾病結(jié)果的信 肩、o腦中風(fēng)監(jiān)測(cè)為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)腦中風(fēng)患者進(jìn)行了研究，以分析腦特異性miRNA濃度變化與疾 病發(fā)展之間相關(guān)性。從在醫(yī)院急診室接收的患者中收集尿樣。腦中風(fēng)的診斷基于臨床癥狀和 MRI分析。在中風(fēng)后12、24、48小時(shí)和一周收集尿樣。中風(fēng)后30天對(duì)患者臨床狀態(tài)進(jìn)行評(píng) 價(jià)。由無(wú)中風(fēng)癥狀的同齡志愿者提供對(duì)照尿樣。根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例1所述的方法收集和貯 存樣品。miRNA種類根據(jù)實(shí)施例1所述的方法從尿液中提取miRNA，并用TaqMan miRNA測(cè) 定(Applied Biosystems)對(duì)其進(jìn)行分析。對(duì)與400 yl尿液中所分離的RNA等量的RNA進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄PCR，取1/10的RT-PCR混合物進(jìn)行最終實(shí)時(shí)PCR，這通過(guò)用制造商所提供的方案 來(lái)實(shí)施。通過(guò)按照尿液中的肌酸酐濃度重新計(jì)算來(lái)對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行針對(duì)個(gè)體腎過(guò)濾率 的標(biāo)準(zhǔn)化。圖4A和B總結(jié)的結(jié)果清楚地表明在腦中風(fēng)之后，Tr-miRNA 129和Tr_miRNA 219 的變化動(dòng)力學(xué)在不同的患者中有差異，并且與疾病的發(fā)展相關(guān)。第3名患者中風(fēng)后一周 神經(jīng)元死亡的增加對(duì)應(yīng)于患者臨床狀況的惡化。與此同時(shí)，研究證明，跨腎神經(jīng)元特異性 miRNA趨于正?；膬擅颊哂酗@著改善。實(shí)施例6阿爾茨海默病診斷阿爾茨海默病是由神經(jīng)元(特別是在大腦皮質(zhì)和海馬組織)死亡引起的漸進(jìn)性神 經(jīng)系統(tǒng)疾病。診斷基于神經(jīng)檢查并排除其它癡呆因素，而僅在尸檢時(shí)才可作出確定的診斷。 本發(fā)明證明了以過(guò)度神經(jīng)元死亡為表征的阿爾茨海默病可通過(guò)測(cè)量從患者尿液中分離到 的腦特異性miRNA水平來(lái)監(jiān)測(cè)。為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，對(duì)診斷為阿爾茨海默病的患者進(jìn)行了研究，以分析因神經(jīng)元 死亡引起的腦特異性miRNA或過(guò)量表達(dá)的miRNA濃度的變化。M 從診斷為不同時(shí)期阿爾茨海默病的患者收集尿樣和血清樣品。由沒有阿爾 茨海默病癥狀的同齡志愿者提供對(duì)照尿樣和血清樣品。根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例1所述的方法收 集和貯存樣品。在按照實(shí)施例1所述進(jìn)行收集之后，過(guò)濾某些尿樣以除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
miRNA種類根據(jù)實(shí)施例1所述的方法從尿液和血清中提取RNA。在一組實(shí)驗(yàn)中，對(duì)與750 μ 1尿液中所分離的RNA等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，取 1/10的RT-PCR混合物進(jìn)行最終實(shí)時(shí)PCR，者通過(guò)用制造商(Applied Biosystems)所提供 的方案來(lái)實(shí)施。通過(guò)按照尿液中的肌酸酐濃度重新計(jì)算來(lái)對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行針對(duì)個(gè)體腎 過(guò)濾率的標(biāo)準(zhǔn)化。圖5清楚地表明在阿爾茨海默病患者的尿液中幾種腦特異性miRNA的 濃度增加。在另一組實(shí)驗(yàn)中，分析了從過(guò)濾的尿液或血清中分離的RNA。對(duì)與0.6ml尿液或 50 μ 1血清中所分離的RNA等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，取1/10的RT-PCR混合物進(jìn)行最 終實(shí)時(shí)PCR，這通過(guò)用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案來(lái)實(shí)施。通過(guò)按照尿液 中的肌酸酐濃度重新計(jì)算來(lái)對(duì)所獲得的關(guān)于尿液miRNA的數(shù)據(jù)進(jìn)行針對(duì)個(gè)體腎過(guò)濾率的 標(biāo)準(zhǔn)化。按照遍在miRNA-16對(duì)所獲的關(guān)于血漿miRNA的數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。圖6和圖7顯 示在阿爾茨海默病患者的過(guò)濾的尿液和血清中某些神經(jīng)元特異性miRNA的水平都比同齡 對(duì)照高。
實(shí)施例7帕金森病帕金森病是一種通常損害患者運(yùn)動(dòng)技巧和語(yǔ)言能力的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。 本發(fā)明證明特征在于多巴胺能神經(jīng)元的過(guò)度細(xì)胞死亡的帕金森病可以通過(guò)測(cè)量分離自患 者尿液中的腦特異性miRNA的水平來(lái)監(jiān)測(cè)。為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，對(duì)診斷為帕金森病的患者進(jìn)行研究，以分析由神經(jīng)元死亡引 起的腦特異性miRNA或過(guò)量表達(dá)的miRNA的濃度變化?；碱翉脑\斷為各個(gè)時(shí)期帕金森病的患者中收集尿樣。由沒有帕金森病癥狀的同 齡志愿者提供對(duì)照尿樣。根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例1所述的方法收集和貯存樣品。miRNA種類為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)施例1所述的方法從尿液中提取RNA。對(duì) 與750 μ 1尿液中所分離的RNA等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，取1/10的RT-PCR混合物進(jìn)行 最終實(shí)時(shí)PCR，這通過(guò)用制造商(Applied Biosystems)所提供的方案來(lái)實(shí)施。通過(guò)按照尿 液中的肌酸酐濃度重新計(jì)算來(lái)對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行針對(duì)個(gè)體腎過(guò)濾率的標(biāo)準(zhǔn)化。圖8證 明帕金森病患者的尿液中幾種腦特異性miRNA的濃度增加。實(shí)施例8懷孕相關(guān)疾病或胎兒疾病的產(chǎn)前試驗(yàn)?zāi)I屏障對(duì)miRNA分子滲透性的重要發(fā)現(xiàn)開辟了利用母體尿液進(jìn)行對(duì)先天性疾病 的完全非介入性產(chǎn)前診斷的先河。這種非介入性篩查可如下進(jìn)行首先，從懷孕患者中收集尿樣。然后根據(jù)需要，用上述方法分離、純化和/或處理 尿樣中的miRNA以防降解。然后用定量PCR或miRNA陣列進(jìn)行miRNA概況分析(profiling)， 根據(jù)關(guān)于以上其它病狀所述，所得的數(shù)據(jù)用來(lái)確定不同的胎兒病狀。實(shí)施例9唐氏綜合癥為了進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究了懷有正常胎兒和唐氏綜合癥胎兒的婦女的母體尿液中腦特 異性miRNA濃度的差異?；碱翉耐ㄟ^(guò)羊膜腔穿刺術(shù)診斷為唐氏綜合癥的孕婦中收集尿樣。同齡的正常孕婦提供對(duì)照尿樣。根據(jù)本申請(qǐng)實(shí)施例1所述的方法收集和貯存樣品。
miRNA種類根據(jù)實(shí)施例1所述的方法從尿液中提取miRNA。對(duì)與750 μ 1尿液中 所分離的RNA等量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，取1/10的RT-PCR混合物進(jìn)行最終實(shí)時(shí)PCR，這 通過(guò)用制造商(AppliedBiosystems)所提供的方案來(lái)實(shí)施。按照胎盤特異性miRNA 518對(duì) 所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 圖9表明，與正常孕婦尿液相比，懷有唐氏綜合癥胎兒的孕婦尿液中 腦特異性miRNA 9的濃度較低，這表明與相應(yīng)的對(duì)照相比細(xì)胞死亡不足。
權(quán)利要求
一種檢測(cè)和定量測(cè)定體液中的細(xì)胞、組織和/或器官特異性脫細(xì)胞miRNA以評(píng)價(jià)各種組織和器官中的體內(nèi)細(xì)胞死亡的方法，其中體內(nèi)細(xì)胞死亡與特定組織和/或器官病癥有關(guān)，所述方法包括(a)從受試對(duì)象獲得體液樣品；以及(b)對(duì)所述體液樣品進(jìn)行針對(duì)一種或多種特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步驟用與所述特定miRNA序列的一部分基本上互補(bǔ)的引物和/或探針檢測(cè)所述miRNA。
2.權(quán)利要求1的方法，其中體內(nèi)細(xì)胞死亡過(guò)度或不足與特定組織病癥相關(guān)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述體液是尿液。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述分析尿樣的步驟包括選自以下的技術(shù)雜交、循環(huán)探針 反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性的PCR和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述尿樣中的核酸降解作用減少。
6.權(quán)利要求5的方法，其中減少核酸降解作用包括通過(guò)以下方式抑制核酸酶活性加 入一種或多種RNA酶抑制劑；熱滅活；或者用選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和 十二烷基磺酸鈉的化合物處理所述尿樣。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述尿樣停留于膀胱的時(shí)間少于12小時(shí)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述體液是血清。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述分析血清樣品的步驟包括選自以下的技術(shù)雜交、循環(huán) 探針反應(yīng)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分析單鏈構(gòu)象多態(tài)性的PCR和連接酶鏈 式反應(yīng)。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是病原體感染。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述病原體是病毒。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述病毒是埃巴病毒。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是腦中風(fēng)。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是阿爾茨海默病。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥是帕金森病。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與懷孕和/或胎兒病狀相關(guān)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述胎兒病癥是唐氏綜合癥。
18.—種檢測(cè)因與組織或器官中細(xì)胞死亡過(guò)度相關(guān)的疾病而在受試對(duì)象的非泌尿系統(tǒng) 區(qū)域中產(chǎn)生的尿液脫細(xì)胞miRNA的方法，所述方法包括(a)從受試對(duì)象獲得尿樣以及(b)對(duì)所述尿樣進(jìn)行針對(duì)一種或多種特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下 步驟用與所述特定miRNA序列的一部分基本上互補(bǔ)的引物和/或探針檢測(cè)所述miRNA。
19.一種通過(guò)定量分析體液中的特定脫細(xì)胞miRNA以在受試對(duì)象中監(jiān)測(cè)疾病和/或治 療的方法，所述方法包括(a)定期從受試對(duì)象中獲得體液樣品；以及(b)對(duì)所述樣品進(jìn)行針對(duì)一種或多種在目標(biāo)細(xì)胞、組織或器官中特異性表達(dá)/過(guò)量表 達(dá)的特定miRNA序列的分析，其中所述分析包括以下步驟用與所述特定miRNA序列的一部分基本上互補(bǔ)的引物和/或探針檢測(cè)所述miRNA。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述體液是尿液。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述體液是血清。
全文摘要
本發(fā)明描述通過(guò)測(cè)量遍在和組織特異miRNA的水平檢測(cè)體內(nèi)細(xì)胞死亡的非介入性方法。該方法可用于檢測(cè)細(xì)胞死亡伴隨或引起的病理以及診斷感染性疾??；由不同理化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒作用和特定的胎兒異常的存在情況。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101861399SQ200880113585
公開日2010年10月13日 申請(qǐng)日期2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日
發(fā)明者E·M·沙克特曼, H·S·梅爾科尼楊, S·R·烏曼斯基 申請(qǐng)人:申諾米克斯公司