專利名稱：利用hima表達(dá)減少的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株從包含木糖的培養(yǎng)基生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。更具體地講，發(fā)現(xiàn)了編碼整合宿主因子的 α亞基的himA基因涉及發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)的乙酸鹽抗性。開(kāi)發(fā)了利用木糖的發(fā) 酵單胞菌屬菌株，該菌株對(duì)himA基因進(jìn)行了基因修飾，它在存在乙酸鹽的情況下表現(xiàn)出改 進(jìn)的乙醇產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
通過(guò)微生物生產(chǎn)乙醇提供了一種替代化石燃料的可供選擇的能源，因此成為當(dāng)前 研究的重要領(lǐng)域。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonasmobilis)是一種產(chǎn)生乙醇的細(xì)菌，它可利 用葡萄糖、果糖、和蔗糖生長(zhǎng)，經(jīng)由Entner-Douderoff途徑將這些糖代謝成CO2和乙醇。希望使用水解的木質(zhì)纖維質(zhì)生物質(zhì)通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，所述木質(zhì)纖維質(zhì)生物質(zhì) 能夠提供豐富的可利用低成本碳底物。木糖是水解的木質(zhì)纖維質(zhì)材料中的主要戊糖。雖 然運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的野生型菌株不能利用木糖作為碳源，但是已經(jīng)工程化了能夠利用該 糖生長(zhǎng)的重組菌株(US 5514583，US 5712133, WO 95/28476，F(xiàn)eldmann 等人(1992) Appl Microbiol Biotechnol 38 :354_361，Zhang 等人(1995) Science267 :240_243)。這些菌 株經(jīng)修飾用于表達(dá)木糖代謝所需的四種酶1)木糖異構(gòu)酶，它催化木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖；2) 木酮糖激酶，它將木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)轉(zhuǎn)酮醇酶；和4)轉(zhuǎn)醛醇酶(US 5514583，US 6566107 ;Zhang 等人(1995) Science 267:240-243)。具有這四種酶并且在細(xì) 胞的正常代謝機(jī)制下，三分子木糖被轉(zhuǎn)化成兩分子6-磷酸葡萄糖和一分子3-磷酸甘油醛， 它們隨后通過(guò)葡萄糖支路途徑被轉(zhuǎn)化成乙醇和CO2 (

圖1)。雖然已經(jīng)成功地工程化了運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株用于木糖代謝，該菌株在木糖上 的生長(zhǎng)以及乙醇生產(chǎn)不像它在葡萄糖上一樣好。甚至在理想環(huán)境下，木糖代謝比葡萄糖代 謝慢 3 至 4 倍(Lawford 等人(2000) Applied Biochemistry and Biotechnology 84-86 277-293)，在不利條件下差距更大。因?yàn)樘纪烤徛?，木糖上穩(wěn)態(tài)水平的ATP也增加較 慢(Kim 等人(2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1) :186_193)，因此 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬在該糖上生長(zhǎng)時(shí)更易于受到脅迫和抑制劑的影響(Joachimsthal等 人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84_86 :343_356 ;Kim 等人(2000)Applied Biochemistry and Biotechnology84_6 :357_370)。使用水解木質(zhì)纖維質(zhì)生物 質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵時(shí)會(huì)遇到的特別脅迫是乙酸鹽(Kim等人(2000) Applied Biochemistry and Biotechnology84-86 :357_370)，它來(lái)自預(yù)處理和糖化加工期間半纖維素中的乙酰化木糖殘基。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬應(yīng)對(duì)乙酸和其它有機(jī)酸相關(guān)的脅迫的機(jī)制仍未被闡明，并且文 獻(xiàn)中無(wú)關(guān)于該過(guò)程中起作用的基因的報(bào)道。因此使用合理設(shè)計(jì)來(lái)基因工程化具有高乙酸鹽 抗性的菌株不是當(dāng)前的選擇。另一方面，已經(jīng)描述了具有高乙酸鹽抗性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌 屬突變體(Joachimsthal 等人(1998) Biotechnol. Lett. 20(2) 137-142 Jeon 等人(2002) Biotechnol. Lett. 24 :819_824 ；美國(guó)專利申請(qǐng)20030162271)。在用亞硝基胍(NTG)進(jìn)行隨 機(jī)化學(xué)誘變后，進(jìn)行選擇以生成這些突變體，但是在這些實(shí)例的任何一個(gè)中未鑒定出負(fù)責(zé) 抗乙酸鹽表型的修飾基因。也未測(cè)定是否需要一種突變或多種突變以在存在乙酸鹽的情況 下進(jìn)行更好的發(fā)酵。因此當(dāng)前從上文所引用的研究中不知道如何使用定向基因工程將乙酸 鹽抗性賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的其它菌株。需要鑒定涉及乙酸鹽抗性的基因，可修飾該基因以產(chǎn)生發(fā)酵單胞菌屬抗乙酸鹽菌 株，該菌株用于發(fā)酵從預(yù)處理并糖化的木質(zhì)纖維質(zhì)生物質(zhì)中制備的水解產(chǎn)物，從而生產(chǎn)乙

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及使用利用木糖的發(fā)酵單胞菌屬菌株來(lái)生產(chǎn)乙醇，所述菌株在存在乙酸 鹽的條件下具有改善的性能。申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)乙酸鹽抗性受編碼整合宿主因子α亞基的 himA基因的影響。利用木糖的發(fā)酵單胞菌屬具有進(jìn)行了基因修飾的himA基因，當(dāng)它在存 在乙酸鹽的葡萄糖和木糖濃縮混合物中培養(yǎng)時(shí)，其乙酸鹽抗性提高。himA修飾使內(nèi)源himA 基因的表達(dá)減少。在這些條件下，himA經(jīng)修飾的菌株的木糖利用率和乙醇產(chǎn)量顯著高于具 有正常himA基因表達(dá)的可比較菌株。因此，本發(fā)明提供從包含木糖的混合糖培養(yǎng)基生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括(a)提供能夠利用木糖生產(chǎn)乙醇的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株，所述菌株包含至少一 種減少整合宿主因子α亞基蛋白(HimA)的表達(dá)的基因修飾；和(b)在包含木糖的混合糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述(a)的菌株，其中所述菌株利用木糖 作為碳源來(lái)生產(chǎn)乙醇。附圖簡(jiǎn)述和序列描述通過(guò)下面的發(fā)明詳述、附圖和隨附的序列描述可以更全面地理解本發(fā)明，這些詳 細(xì)描述、附圖和序列描述形成本專利申請(qǐng)的一部分。圖1示出四種酶(加框表示)的圖表，它們已經(jīng)用于工程化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬使 其能利用木糖以及用于利用木糖生產(chǎn)乙醇的生物化學(xué)途徑。圖2示出pMODgap/aada的質(zhì)粒圖譜，該質(zhì)粒用于生成ZW801-4中的轉(zhuǎn)座子插入文庫(kù)。圖3是W801-4在存在兩種不同量乙酸鹽的葡萄糖和木糖濃縮混合物中的生長(zhǎng)示 意圖。圖4是富集的轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫(kù)培養(yǎng)物與對(duì)照菌株ZW801-4的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇產(chǎn)量的比較示意圖，它們?cè)诰哂?00g/L葡萄糖，90g/L木糖、和6g/ L乙酸鹽的培養(yǎng)基(A)或具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸鹽培養(yǎng)基(B)中生長(zhǎng)。圖5是在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中的ZW801_4(A)和轉(zhuǎn)座子插入突變體AcR#3 (B)在 不同量乙酸鉀情況下的生長(zhǎng)示意圖。圖6是在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)43小時(shí)后的ZW801_4(A)和轉(zhuǎn)座子插入突變 體AcR#3 (B)的終點(diǎn)值示意圖，所述培養(yǎng)基具有不同的乙酸鹽。圖7是AcR#3和ZW801-4在具有105g/L葡萄糖，100g/L木糖，和9g/L乙酸鹽的培 養(yǎng)基中的葡萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇產(chǎn)量示意圖。圖8是ZW801_4(A)和AcR#3(B)在100%模擬水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中的葡萄糖利用率、 木糖利用率、和乙醇產(chǎn)量示意圖，所述培養(yǎng)基包含 9. 5g/L的乙酸鹽和190mM的銨離子，以 及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。圖 9 是在構(gòu)建 himA 基因敲除菌株載體 pLDHTcl39#7 (A)、pLDHTcl39#7-9ffff (B)、和 pLDHSp-9ffff(C)期間制備的質(zhì)粒的圖譜。圖10A示出用于制備插入himA自殺載體pHimA的himA側(cè)接DNA的引物的基因組 位置，圖10B是pHimA質(zhì)粒的環(huán)形圖譜。圖11是ZW801_4(A)和ZW801-4: AhimA(B)在100%模擬水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中的葡 萄糖利用率、木糖利用率、和乙醇產(chǎn)量示意圖，所述培養(yǎng)基包含 9. 5g/L的乙酸鹽和190mM 的銨離子，以及110g/L的葡萄糖和90g/L的木糖。圖 12 是 ZW801-4 (A)、AcR#3 (B)、禾口 ZW801-4: AhimA(C)在包含葡萄糖的培養(yǎng)基 中的生長(zhǎng)示意圖，培養(yǎng)基中以鉀鹽形式加入0或8g/L的乙酸鹽。根據(jù)下面的詳細(xì)描述和附帶的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明，下面的詳細(xì)描 述和所附的序列描述形成了本申請(qǐng)的一部分。下面的序列遵照37C. F. R. 1.821-1. 825 ( “對(duì)包含核苷酸序列和/或氨基酸序 列公開(kāi)內(nèi)容的專利申請(qǐng)的要求-序列規(guī)則”("Requirements forPatent Applications Containing Nuceotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”))，并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(World Intellectual Property Organization) (WIPO) ST. 25標(biāo)準(zhǔn)(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(規(guī)則5. 2和 49. 5(a-bis)以及行政指令(Administrative Instructions)的 208 節(jié)和附錄 C)。用于核 苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C. F. R. § 1. 822中示出的規(guī)則。隨同在光盤上提供了序列表。包含序列表的光盤的內(nèi)容遵照37CFR 1.52(e)，其 以引用方式并入本文。提交兩張彼此相同的光盤。所述光盤標(biāo)記有“Copy I-Sequence Listing” 和 “Copy 2 Sequence listing”。它們包含以下文件CL4041 seq list. ST25。SEQ ID N0:1是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬himA編碼區(qū)的核苷酸序列。SEQ ID NO 2和3是序列轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的引物核苷酸序列。SEQ ID NO 4和5是包含Idh基因和一些圍繞DNA的DNA片段的PCR擴(kuò)增引物的 核苷酸序列。SEQ ID NO 6和7是包含來(lái)自pACY184的抗四環(huán)素盒的DNA片段的PCR擴(kuò)增引物 的核苷酸序列。
SEQ ID NO :8和9是用于制備IoxP位點(diǎn)的寡核苷酸序列，所述IoxP位點(diǎn)用于插 入質(zhì)粒 pLDHTcl39#7。SEQ ID NO 10和11是用于制備IoxP位點(diǎn)的寡核苷酸序列，所述IoxP位點(diǎn)用于 插入質(zhì)粒 pLDHTcl39#7-9W。SEQ ID NO 12和13是包含來(lái)自質(zhì)粒pHP15578的抗奇放線菌素盒的DNA片段的 PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列。SEQ ID NO 14和15是用于PCR擴(kuò)增3，himA的側(cè)接DNA片段引物核苷酸序列。SEQ ID NO 16和17是用于PCR擴(kuò)增5，himA的側(cè)接DNA片段引物核苷酸序列。SEQ ID NO :18和19是PCR引物的核苷酸序列，該引物用于確認(rèn)在pHimA中的 5’ himA側(cè)接DNA和其染色體副本之間發(fā)生的單交換事件。SEQ ID NO :20和21是PCR引物的核苷酸序列，該引物用于確認(rèn)在pHimA中的 3’ himA側(cè)接DNA和其染色體副本之間發(fā)生的單交換事件。SEQ ID NO 22和23是PCR引物的核苷酸序列，該引物用于確認(rèn)在pHimA中的5， 和3’ himA側(cè)接DNA序列和染色體中的himA基因之間發(fā)生的雙交換事件。SEQ ID NO 24是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的GFOR編碼區(qū)的完整核苷酸序列。SEQ ID NO 25是ZW801-4中遭中斷的GFOR編碼區(qū)的完整核苷酸序列(從初始起 始密碼子至初始終止密碼子)。SEQ ID NO 26是運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬HimA蛋白的氨基酸序列。發(fā)明詳述本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容描述了用于制備乙醇的方法，所述方法包括在包含糖(例如葡 萄糖、木糖和乙酸鹽)混合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)利用木糖的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株；其中所 述菌株包含經(jīng)修飾的所述菌株內(nèi)源himA基因。對(duì)所述himA基因的修飾減少了所述基因的 表達(dá)，并且使得經(jīng)himA修飾的發(fā)酵單胞菌屬菌株當(dāng)在如本文所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)具有 改善的性能。由經(jīng)himA修飾的發(fā)酵單胞菌屬菌株生產(chǎn)的乙醇可用作化石燃料的替代能源。以下縮寫和定義將用于說(shuō)明書和權(quán)利要求的判讀。將“整合宿主因子”縮寫為IHF?！盎颉敝改軌虮磉_(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，其可包括編碼序列前的調(diào)控序列(5' 非編碼序列)和編碼序列后的調(diào)控序列(3'非編碼序列)?！疤烊换颉被颉耙吧突颉?指具有其自身調(diào)控序列的天然存在的基因?！扒逗匣颉敝覆皇翘烊换虻娜魏位?，包含 在天然情況下不是一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源于不同來(lái)源 的調(diào)控序列和編碼序列，或者包括源于同一來(lái)源但以不同于天然存在的方式排列的調(diào)控序 列和編碼序列?！皟?nèi)源性基因”指位于生物的基因組內(nèi)它的天然位置的天然基因?！巴鈦?lái)基 因”指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，它通過(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物。外來(lái)基因可 以包含插入到非天然生物體內(nèi)的天然基因，或嵌合基因。術(shù)語(yǔ)“基因構(gòu)建體”指編碼表達(dá)一種或多種特定蛋白的核酸片段。在基因構(gòu)建體 中基因可以是天然的、嵌合的、或外來(lái)的。通?；驑?gòu)建體將包含“編碼序列”。“編碼序列” 指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)控制區(qū)”指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。一 般來(lái)講，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3'端。啟動(dòng)子可整個(gè)源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的啟動(dòng)子的不同元件組成，或者甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可以在不同的組織或細(xì)胞類型中，或者在不同的發(fā)育階段，或者 響應(yīng)不同的環(huán)境條件而引導(dǎo)基因的表達(dá)。通常將在大多數(shù)細(xì)胞類型中、在大多數(shù)情況下引 起基因表達(dá)的啟動(dòng)子稱為“組成型啟動(dòng)子”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”指轉(zhuǎn)錄和衍生自基因的有義(mRNA)或反義RNA的穩(wěn)定積 聚。表達(dá)也可指將mRNA翻譯成多肽。“反義抑制”指產(chǎn)生能夠抑制靶蛋白表達(dá)的反義RNA 轉(zhuǎn)錄物?！俺磉_(dá)”指在轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物超出在正常生物或未轉(zhuǎn)化生物中產(chǎn)生 的基因產(chǎn)物的水平?！肮惨种啤敝府a(chǎn)生能夠抑制相同的或基本上類似的外源或內(nèi)源性基因表 達(dá)的正義RNA轉(zhuǎn)錄物。(美國(guó)專利5，231，020)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“信使RNA (mRNA) ”指無(wú)內(nèi)含子并且可以由細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的 RNA。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“無(wú)功能基因”指野生型菌株中通常不表達(dá)編碼蛋白的基因，其 中所述基因是內(nèi)源的。可以在任何水平上中斷無(wú)功能基因的表達(dá)，例如轉(zhuǎn)錄、RNA加工、或 翻譯。無(wú)功能基因通常很少表達(dá)或不表達(dá)其編碼的蛋白。然而它也可編碼酶活性低于野生 型蛋白的修飾蛋白。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”指將核酸片段轉(zhuǎn)移至宿主生物體內(nèi)，導(dǎo)致在基因上穩(wěn)定 遺傳。轉(zhuǎn)化的核酸可以是宿主細(xì)胞中保留的質(zhì)粒形式，或者一些轉(zhuǎn)化的核酸可以被整合進(jìn) 宿主細(xì)胞基因組中。含有轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生 物體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”和“載體”是指通常攜帶有不屬于細(xì)胞中心代謝的部分 的基因的染色體外元件，并且常常是環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。這類元件可以是源自任何 來(lái)源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或單鏈或雙鏈DNA或RNA的核苷酸序列(線 性或環(huán)狀)，其中多種核苷酸序列已連接或重組進(jìn)入一種獨(dú)特構(gòu)建體中，該獨(dú)特構(gòu)建體能夠 將所選基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列與相應(yīng)的3'末端非翻譯序列一起引入細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”指單個(gè)核酸片段上的核酸序列的關(guān)聯(lián)，使得其中一種核酸序 列的功能受到另一種核酸序列的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即，該編 碼序列受到該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)時(shí)，則該啟動(dòng)子與該編碼序列可操作地連接。編碼序列 可以以有義或反義的取向可操作地連接至調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記”指一種鑒定因子，通常是抗生素或化學(xué)藥品抗性基因，該因子 能基于標(biāo)記基因的效應(yīng)，即，對(duì)抗生素的抗性進(jìn)行選擇，其中所述效應(yīng)用于追蹤遺傳的受關(guān) 注核酸和/或用于鑒定遺傳了受關(guān)注核酸的細(xì)胞或生物。術(shù)語(yǔ)“高濃度混合糖”指培養(yǎng)基中的總糖濃度導(dǎo)致利用木糖的發(fā)酵單胞菌屬的生 長(zhǎng)受到抑制。這通常在當(dāng)總糖濃度高于約100g/L時(shí)發(fā)生，并且糖濃度越高，該效應(yīng)越嚴(yán)重。 然而，生長(zhǎng)抑制開(kāi)始發(fā)生時(shí)的精確糖濃度高度依賴于培養(yǎng)基中的其它組分。術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵糖”指在發(fā)酵過(guò)程中能被微生物用作碳源的低聚糖和單糖。術(shù)語(yǔ)“木質(zhì)纖維質(zhì)”指包含木質(zhì)素和纖維素的組合物。木質(zhì)纖維質(zhì)材料也可包含 半纖維素。術(shù)語(yǔ)“纖維質(zhì)”指包含纖維素和包括半纖維素在內(nèi)的附加組分的組合物。術(shù)語(yǔ)“糖化”指從多糖中生產(chǎn)可發(fā)酵糖。
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術(shù)語(yǔ)“預(yù)處理的生物質(zhì)”意指在糖化之前已經(jīng)經(jīng)過(guò)預(yù)處理的生物質(zhì)?！吧镔|(zhì)”指任何纖維質(zhì)或木質(zhì)纖維質(zhì)材料，并包括包含纖維素的材料，以及任選 地還包含半纖維素、木質(zhì)素、淀粉多糖、低聚糖和/或單糖的材料。生物質(zhì)也可包括附加組 分如蛋白質(zhì)和/或脂質(zhì)。生物質(zhì)可來(lái)源于單一來(lái)源，或者生物質(zhì)可包括來(lái)源于一種以上來(lái) 源的混合物；例如，生物質(zhì)可包括玉米芯和玉米秸稈的混合物或纖維，或草和葉片的混合 物。生物質(zhì)包括但不限于生物能作物、農(nóng)業(yè)殘余物、市政固體垃圾、工業(yè)固體垃圾、來(lái)自造紙 業(yè)的淤渣、庭院垃圾、木材和林業(yè)垃圾。生物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于玉米粒、玉米芯、作物 殘余如玉米殼、玉米秸稈、玉米纖維、草、小麥、小麥秸稈、大麥、大麥秸稈、干草、稻稈、柳枝 稷、廢紙、蔗渣、高粱、大豆、獲取自谷物、樹(shù)、枝、根、葉、木屑、鋸末、灌木及矮樹(shù)叢、蔬菜、水 果、花和動(dòng)物糞肥的研磨物的組分?！吧镔|(zhì)水解產(chǎn)物”指來(lái)源于生物質(zhì)糖化的產(chǎn)物。也可在糖化前預(yù)處理生物質(zhì)。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且已經(jīng)在如下文獻(xiàn)中 有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾口 Maniatis, T. Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2版；Cold Spring HarborLaboratory : Co Id Spring Harbor, New York, 1989 (Tr 文稱為"Maniatis，，)；以及 Silhavy, Τ. J. , Bennan, Μ. L.禾口 Enquist, L. W. Experiments with GeneFusions ；Cold Spring Harbor Laboratory :Cold Spring Harbor, New York, 1984 ；以及 Ausubel, F. M.等人，In Current Protocols in MolecularBiology,由 Greene Publishing 禾口 Wiley-Interscience 公布于 1987 年。本發(fā)明涉及工程化利用木糖的發(fā)酵單胞菌屬菌株，所述菌株在存在乙酸鹽的條件 下具有改善的性能。乙酸鹽是發(fā)酵單胞菌屬的抑制劑，如果在發(fā)酵期間乙酸鹽存在的話，它 會(huì)減少生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量。乙酸鹽是發(fā)酵單胞菌屬中的代謝副產(chǎn)品，并且它也是經(jīng)預(yù)處理和 糖化的生物質(zhì)的組分。因此使用來(lái)源于生物質(zhì)的糖用于發(fā)酵的一個(gè)挑戰(zhàn)是克服乙酸鹽對(duì)生 物催化劑的抑制效應(yīng)以提高乙醇產(chǎn)量。本文證明了當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基包含乙酸鹽時(shí)，工程化中 斷利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中的內(nèi)源himA基因改善發(fā)酵性能，包括木糖利用率和乙 醇產(chǎn)量。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)乙醇的方法，其中本發(fā)明的發(fā)酵單胞菌屬菌株在包含木糖的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。禾U用木酵單朐,Ir屬宿tir株可使用能利用木糖作碳源的任何發(fā)酵單胞菌屬菌株(包括運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌 株)作為制備本發(fā)明所用的菌株的宿主。尤其有用的是已經(jīng)進(jìn)行了工程化的發(fā)酵單胞菌屬 菌株，它能將木糖發(fā)酵成乙醇。內(nèi)源基因可提供部分代謝途徑，或者可以通過(guò)任何已知的基 因操縱技術(shù)進(jìn)行改變以提供具有酶活性的蛋白用于木糖代謝。例如，內(nèi)源轉(zhuǎn)酮醇酶可在建 立木糖代謝途徑時(shí)補(bǔ)充其它導(dǎo)入的酶活性。如以引用方式并入本文的US 5514583所述，通 常已將四種基因?qū)脒\(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中表達(dá)四種涉及木糖代謝(圖1)的酶。這些基因包 括編碼木糖異構(gòu)酶的基因，該酶催化木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖，以及木酮糖激酶，該酶磷酸化木酮 糖以形成5-磷酸木酮糖。此外，轉(zhuǎn)酮醇酶和轉(zhuǎn)醛醇酶是戊糖磷酸化途徑中的兩種酶，它們 將5-磷酸木酮糖轉(zhuǎn)化成連接戊糖代謝與糖酵解Entner-Douderoff途徑的中間體(6-磷酸 果糖和3-磷酸甘油醛)，該途徑使木糖代謝成乙醇。編碼這些酶的DNA序列可從能夠代謝木 糖的多種微生物中的任何一種獲得，例如腸細(xì)菌和一些酵母以及真菌。編碼區(qū)的來(lái)源包括 黃單胞菌屬(Xanthomonas)、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)、埃希氏菌屬(Escherichia)、紅細(xì)菌屬(Rhodobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、葡糖桿 胃M (Gluconobacter) > Ifl^^M (Rhizobium)、H干胃M (Agrobacterium) > Π K^M (Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonads)、和發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)。尤其有用的是 大腸桿菌(E.coli)的編碼區(qū)。將編碼DNA序列可操作地連接至發(fā)酵單胞菌屬細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子如發(fā)酵單胞 菌屬甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(GAP啟動(dòng)子)和發(fā)酵單胞菌屬烯醇酶啟動(dòng)子(ENO啟 動(dòng)子)。編碼區(qū)可從啟動(dòng)子開(kāi)始單個(gè)表達(dá)，或者兩個(gè)或更多個(gè)編碼區(qū)可接合到一個(gè)操縱 子中，從相同啟動(dòng)子開(kāi)始一起表達(dá)。可將所得嵌合基因?qū)氚l(fā)酵單胞菌屬并保持在質(zhì)粒 中，或者使用例如同源重組、定點(diǎn)整合、或隨機(jī)整合的方法整合進(jìn)基因組中。特別有用的 是利用木糖的菌株，它們包括 CP4 (pZB5) (US5514583)、ATCC31821/pZB5 (US 6566107)、 8b(US 20030162271 ;Mohagheghi 等人，(2004)Biotechnol. Lett. 25 ;321_325)、和 ZW658(ATTCC#PTA-7858)。附加地將發(fā)酵單胞菌屬菌株工程化以利用除木糖之外的其它糖，該菌株正常情況 下不能利用這些糖，本方法也可使用這種菌株。將利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株進(jìn)一 步工程化以利于阿拉伯糖的一個(gè)實(shí)例描述于US 5843760，該專利以引用方式并入本文。也可使用進(jìn)行附加工程化以減少非期望的木糖醇副產(chǎn)物的發(fā)酵單胞菌屬菌株。 這些菌株描述于共有的和共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)#11/862566以及未決的US專利公 布#US20080187973A1，這些專利以引用方式并入本文。描述的菌株ZW800、ZW801-4、和 ZW801-6具有編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)的中斷基因。GFOR基因的表達(dá)中斷可 使用下文所述的用于中斷himA基因的相同方法完成，該方法使用GFOR編碼區(qū)(SEQ ID NO 24)的已知序列。圍繞GFOR編碼序列的DNA序列也可用于一些修飾方法，并且可用于發(fā)酵 單胞菌屬全基因組序列(GenBank Accession#AE008692)。發(fā)現(xiàn)減少GFOR的表達(dá)會(huì)降低木 糖醇產(chǎn)量并提高乙醇產(chǎn)量。發(fā)現(xiàn)himA涉及乙酸鹽抗性雖然對(duì)乙酸鹽對(duì)發(fā)酵單胞菌屬生長(zhǎng)和產(chǎn)量的抑制效應(yīng)的基礎(chǔ)機(jī)制已經(jīng)相當(dāng)了解 (Lawford 等人(1993 Applied Biochemistry andBiotechnology 39-40 :687_699 ;Kim 等 人(2000)Applied Biochemistry andBiotechnology 84-86 :357_370)，但是仍未鑒定出該 微生物在乙酸鹽抗性中起作用的基因。申請(qǐng)人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)對(duì)himA基因的基因操 縱使得發(fā)酵單胞菌屬在存在抑制濃度乙酸鹽的情況下性能良好。具體地講，申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)中斷發(fā)酵單胞菌屬himA基因能改善包含乙酸鹽的培養(yǎng)基的生長(zhǎng)和乙醇產(chǎn)量。用于發(fā)現(xiàn) 本文實(shí)施例1和2中所述的himA的抗乙酸鹽作用的突變文庫(kù)富集方法是一種完全無(wú)偏方 法，并且不基于任何預(yù)測(cè)結(jié)果。未預(yù)料到中斷發(fā)酵單胞菌屬himA基因能改善該菌株在存在乙酸鹽情況下的性 能，因?yàn)槲墨I(xiàn)中沒(méi)有任何該基因在發(fā)酵單胞菌屬或任何其它微生物中對(duì)乙酸鹽抗性起作用 的指示或建議。himA基因編碼的蛋白本文稱為“HimA”蛋白，它是整合宿主因子(IHF)的α 亞基(SEQID Ν0:26)，整合宿主因子是一種也包括由himD基因編碼的β亞基的蛋白。因 此，IHF是一種由兩種密切相關(guān)的亞基構(gòu)成的異源二聚體蛋白。已經(jīng)在大腸桿菌中對(duì)IHF進(jìn) 行了研究，研究顯示一種DNA結(jié)合和DNA彎曲蛋白涉及DNA重組、DNA復(fù)制、和基因表達(dá)調(diào)控 (Friedman (1988) Cell 55 :545_554 ；Arfin 等人(2000) J. Biol. Chem. ”275 :29672_29684)。大腸桿菌中的基因表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明himA基因失活顯著地改變至少120種基因的表達(dá) 水平，并且該操縱活化比它抑制的基因更多的基因(Arfin等人(2000)J.Biol. Chem. ”275 29672-29684)。也已知大腸桿菌himA基因轉(zhuǎn)錄最活躍的時(shí)期是當(dāng)細(xì)胞從指數(shù)期過(guò)渡到穩(wěn) 定期時(shí)，并且認(rèn)為himA基因產(chǎn)物在此過(guò)程中起到作用。因此himA影響廣泛的DNA過(guò)程，并 且是大腸桿菌中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)子，但是這些被認(rèn)為起到調(diào)節(jié)作用的許多基因中沒(méi)有基因 明顯地與乙酸鹽抗性相關(guān)。此外，已經(jīng)使用微陣列對(duì)暴露于抑制濃度乙酸鹽后的大腸桿菌 中基因表達(dá)的整體分析進(jìn)行了檢查，himA基因不在受該處理影響的86種基因中(Arnold 等人(2001)J. Bacteriol. 183 :2178-2186)。最后，發(fā)酵單胞菌屬中的himA基因的作用是 未知的。我們也未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中有任何顯示himA基因失活導(dǎo)致任何類型的有益效應(yīng)的報(bào)道。 實(shí)際上考慮到大量基因和蛋白可能受這一操縱的影響，這將是一個(gè)令人驚訝的實(shí)例。因此 這一推斷是合理的本領(lǐng)域的技術(shù)人員不能預(yù)測(cè)到himA基因的失活將賦予運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞 菌屬或任何其它微生物較高的乙酸鹽抗性。發(fā)酵單胞菌屬HimA蛋白與大腸桿菌同源物(GenBank保藏號(hào)NP_416227)有 46%相同。最密切相關(guān)的已知蛋白是鞘氨醇單胞菌的HimA同源物(GenBank保藏號(hào) YP_001264041)，使用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬himA編碼區(qū)(SEQ ID NO :1)作查詢序列，通過(guò) tBLASTx搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)測(cè)定它們有67%相同。himA基因表汰的改變對(duì)本發(fā)明的利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株進(jìn)行了基因修飾，使得整合宿主因 子α亞基蛋白(HimA)的表達(dá)減少或消失。通常通過(guò)減少himA基因表達(dá)的修飾使得HimA 蛋白表達(dá)減少。減少HimA蛋白表達(dá)可包括例如減少編碼mRNA翻譯的修飾，或者降低HimA 蛋白穩(wěn)定性的修飾。HimA蛋白的表達(dá)減少導(dǎo)致在存在乙酸鹽的情況下具有改善的性能。可 使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何用于減少蛋白表達(dá)的基因修飾方法改變HimA的表達(dá)。方 法包括但不限于去除整個(gè)或部分himA基因、將DNA片段插入himA基因(插入啟動(dòng)子或編 碼區(qū))使得編碼蛋白不表達(dá)、將添加終止密碼子或移碼的突變導(dǎo)入himA編碼區(qū)使得功能性 蛋白不表達(dá)、以及將一種或多種突變導(dǎo)入himA編碼區(qū)以改變氨基酸使得表達(dá)的活性蛋白 無(wú)功能或功能減弱。此外，可通過(guò)表達(dá)反義RNA或干涉RNA阻止himA的表達(dá)，并且可導(dǎo)入 導(dǎo)致共抑制的構(gòu)建體。本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用已知的himA編碼序列(SEQ ID NO=D以及 圍繞himA編碼序列的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬DNA序列能輕易地實(shí)施所有這些方法，所述序列在 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬全基因組序列中是可用的(GenBank Accession#AE008692)。如本文實(shí)施例5和6所例示的那樣，制備基因修飾的himA菌株的尤其適用的方法 是使用himA側(cè)接DNA序列介導(dǎo)的同源重組，該序列與奇放線菌素抗性基因或其它標(biāo)記基因 結(jié)合，導(dǎo)致標(biāo)記基因插入himA編碼區(qū)，使得功能性蛋白不表達(dá)。此外，標(biāo)記基因可通過(guò)位 點(diǎn)特異性重組結(jié)合到位點(diǎn)上，以便對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)特異性重組酶的隨后表達(dá)，所述抗性基因從 himA基因中切除。位點(diǎn)特異性重組留下了中斷himA基因表達(dá)的重組位點(diǎn)。也可以構(gòu)建同 源重組載體以在切除標(biāo)記后在himA基因中留下去除，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。優(yōu)選完全消除himA的表達(dá)，然而在很大程度上減少himA的表達(dá)也是本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方案。在該實(shí)例中，無(wú)功能的himA基因指在正常情況下不行使功能，使得存在的編 碼蛋白低于正常水平。一些基因失活方法可導(dǎo)致一些持續(xù)的低水平表達(dá)，例如共抑制。本 文中修飾himA菌株指具有減弱的HimA酶活性或無(wú)HimA酶活性的基因修飾菌株。
himA修飾菌株的件能本發(fā)明的himA修飾的利用木糖運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株當(dāng)在包含一定量木糖 的混合糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)具有改善的性能。該培養(yǎng)基也可包含一定量的乙酸鹽。培養(yǎng) 基中希望使用從糖化生物質(zhì)中制備的糖用于利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬。通常生物 質(zhì)進(jìn)行過(guò)預(yù)處理，例如如專利公布W02004/081185以及共有的和共同未決的US專利公 布US20070031918A1所述進(jìn)行預(yù)處理，然后用糖化酶進(jìn)行處理，參見(jiàn)Lynd，L. R.，等人 (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002)66:506-577)。包含木糖和其它糖(即，“混合糖培養(yǎng) 基”)的預(yù)處理和糖化生物質(zhì)的水解產(chǎn)物通常也包含乙酸鹽。生物質(zhì)中的半纖維素包含乙 ?；咎菤埢?，并且所述乙酸鹽在非常溫和的條件下釋放。雖然從處理過(guò)的生物質(zhì)中除去 乙酸鹽是一個(gè)解決問(wèn)題的方法，加入該步驟將大幅度增加制備纖維質(zhì)乙醇的費(fèi)用。因此，能 夠工程化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株以提供較高的乙酸鹽抗性是一項(xiàng)大幅度的改善。如本文所分析，在存在乙酸鹽的情況下改善的性能包括生長(zhǎng)速度、木糖利用率、以 及乙醇產(chǎn)量。修飾himA的利用木糖運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株相對(duì)于具有相同基因特征的菌 株(同基因菌株)具有改善的性能，但是缺少對(duì)himA基因的修飾。用于himA基因修飾的 親本菌株通常用于該比較中。在任何乙酸鹽水平上都能看到改善，其中未修飾himA的菌株 不能充分發(fā)揮其生長(zhǎng)和乙醇生產(chǎn)的潛力。取決于培養(yǎng)基的組成和PH控制，改善通常在乙酸 鹽濃度為約5g/L或更高的情況下發(fā)生?！耙宜猁}抑制”程度也取決于pH，因?yàn)橐种莆镔|(zhì)實(shí) 際上是乙酸，而乙酸和乙酸鹽的平衡取決于pH。不控制pH的話，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬像其它 革蘭氏陰性菌一樣迅速酸化培養(yǎng)基。如果PH從5. 8降至4. 8，由于乙酸的 4. 8pKA，乙酸 濃度增加5倍。因此乙酸(抑制劑)的實(shí)際濃度取決于培養(yǎng)基的pH以及培養(yǎng)基中存在的 質(zhì)子化的和非質(zhì)子化的物質(zhì)總量。在存在乙酸鹽的葡萄糖和木糖濃縮混合物中，未修飾和修飾了 himA的菌株在控 制PH的條件下同樣地利用葡萄糖，其中葡萄糖在木糖消耗之前已經(jīng)消耗了很多。然而，在 發(fā)酵晚期，在所有葡萄糖已經(jīng)消耗完之后，修飾himA的菌株與具有正常himA基因表達(dá)的同 基因親本菌株相比，能夠?qū)⒏嗟哪咎寝D(zhuǎn)化成乙醇。himA基因修飾賦予的較高乙醇生產(chǎn)水平取決于在pH控制條件下的培養(yǎng)基組分， 包括糖含量和不同類型糖的比率，以及存在的其它抑制劑。例如，在存在126g/L葡萄糖、 107g/L木糖和10%乙酸鹽的情況下，修飾himA的菌株與未修飾himA的同基因菌株相比， 其乙醇滴定度具有4%的提高。當(dāng)培養(yǎng)基也包含其它抑制劑時(shí)，乙醇產(chǎn)量的提高程度可能甚 至更大。例如，在包括110g/L葡萄糖、90g/L木糖、 9. 5g/L乙酸鹽和190mM銨離子(另 一種運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬生長(zhǎng)抑制劑(Agrawal (1989) Biotechnology and Bioengineering 34 :278-281)，它可以以這一濃度存在于生物質(zhì)水解產(chǎn)物中)的模擬水解產(chǎn)物培養(yǎng)基中，乙 醇產(chǎn)量具有約11 %的提高，并且木糖利用更完全。因此，在較苛刻的條件下，在修飾himA的 菌株和同基因的未修飾himA的菌株之間的乙醇產(chǎn)量差值可能甚至大于所引用的實(shí)例的差 值。例如，在較高糖濃度下，或者當(dāng)除銨離子和乙酸鹽之外還存在來(lái)源于水解產(chǎn)物的其它抑 制劑時(shí)。因此取決于培養(yǎng)條件，乙醇產(chǎn)量的改善可以是至少約4%或更高。發(fā)酵生產(chǎn)乙醇在本發(fā)明的方法中，在包含任何糖混合物(也包括木糖)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明 的修飾himA的、利用木糖的菌株。具體地講，本發(fā)明的菌株可在生物質(zhì)水解產(chǎn)物或生物質(zhì)水解產(chǎn)物的稀釋液中培養(yǎng)。在生物質(zhì)水解產(chǎn)物中糖化生物質(zhì)制備糖，所述糖通?？砂?糖與葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、和/或阿拉伯糖的混合物。優(yōu)選地是包括木糖和 葡萄糖的混合糖組合物，其中可存在附加的糖。混合物中不同糖的比率可以不同，木糖通常 占糖總量的至少約10%。木糖優(yōu)選地介于約40%和約60%之間。果糖存在于通過(guò)糖化一 些生物質(zhì)(例如蔗渣)制備的糖中，并且可置換一部分木糖或果糖，使得木糖保持占糖混合 物的至少約10%。此外，阿拉伯糖來(lái)源于半纖維素，因此是來(lái)源于包含半纖維素的生物質(zhì)糖 化的混合糖的典型組分。在本發(fā)明的菌株發(fā)酵期間，木糖是其中一種用作乙醇生產(chǎn)碳源的 糖。為了獲得最大的乙醇產(chǎn)量和發(fā)酵效率，希望在包含包括木糖在內(nèi)的濃縮混合物的培養(yǎng) 基內(nèi)培養(yǎng)本發(fā)明的修飾himA的、利用木糖的菌株。這允許直接使用生物質(zhì)糖化糖，或者使 用其低倍稀釋液，從而減少發(fā)酵體積，這是商業(yè)規(guī)模的乙醇生產(chǎn)所期望的。使用較高的糖濃 度以便可制備較高濃度的乙醇。發(fā)酵培養(yǎng)基中的混合糖的濃度通常為至少約120g/L，最多 約300g/L?；旌咸怯绕淇捎玫母邼舛冉橛诩s150g/L和約235g/L之間。在生產(chǎn)乙醇所需的高濃度混合糖條件下，可在發(fā)酵培養(yǎng)基中包括山梨醇用于培養(yǎng) 修飾himA的、利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬，該方法如共有的和共同未決的US專利公布 #US20080081358A1所述，該專利以引用方式并入本文。山梨醇(D-山梨醇和/或L-山梨 醇)可存在于培養(yǎng)基中，其濃度介于約2mM和200mM之間。培養(yǎng)基中較合適的終濃度介于 約2mM和IOOmM之間，優(yōu)選地介于5mM和20mM之間。甘露糖醇可替代山梨醇用于培養(yǎng)基中， 或者與山梨醇組合用于培養(yǎng)基中。此外，發(fā)現(xiàn)可使用半乳糖醇和/或核糖醇替代山梨醇或 甘露糖醇，或者與山梨醇或甘露糖醇組合使用。山梨醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇或它們 的組合都使用與所述山梨醇濃度相同的濃度。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬在其中進(jìn)行發(fā)酵并且產(chǎn)生乙醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。發(fā)酵在不補(bǔ)充 空氣、氧氣、或其它氣體(這可包括各種條件如厭氧、微氧、或微需氧發(fā)酵)的情況下運(yùn)行至 少約24小時(shí)，并且可以運(yùn)行48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。達(dá)到最大乙醇產(chǎn)量的時(shí)間是不確定的，取 決于發(fā)酵條件。如果抑制劑存在于培養(yǎng)基中，通常需要更長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間。發(fā)酵運(yùn)行溫度可 在介于約25°C和約40°C的范圍內(nèi)，發(fā)酵pH可在約4. 5至約7. 5。尤其合適的溫度介于約 30°C和約37°C之間。尤其合適的pH也包括使pH保持在高于乙酸pKA至少約IpH單位的水 平，使得PH介于約5. 8和7. 5之間，以降低乙酸對(duì)乙酸鹽的比率。可以在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中和按比例增加的發(fā)酵中(其中生產(chǎn)了商業(yè)規(guī)模量 的乙醇)，在包含包括木糖在內(nèi)的混合糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)修飾himA的、利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā) 酵單胞菌屬。此外，如上所述該培養(yǎng)基可包含乙酸鹽。當(dāng)需要商業(yè)生產(chǎn)乙醇時(shí)，可使用多種 培養(yǎng)方法。例如，從修飾himA的、利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中的大規(guī)模生產(chǎn)可以通過(guò) 分批培養(yǎng)方法和連續(xù)培養(yǎng)方法進(jìn)行。經(jīng)典的分批培養(yǎng)方法是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成 在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)設(shè)定并且在培養(yǎng)過(guò)程期間不進(jìn)行人工改變。因此，在培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始時(shí)，用所需 的生物接種培養(yǎng)基，并且不向系統(tǒng)中添加任何物質(zhì)可以發(fā)生生長(zhǎng)或代謝活性。然而，通常來(lái) 說(shuō)，“分批”培養(yǎng)是指碳源的添加是成批的，但經(jīng)常試圖控制諸如PH和氧濃度之類的因素。 在分批系統(tǒng)中，代謝產(chǎn)物和生物質(zhì)組成持續(xù)改變直至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞通 常緩慢通過(guò)靜態(tài)延滯期到達(dá)生長(zhǎng)期，并最后達(dá)到穩(wěn)定期，此時(shí)生長(zhǎng)速率減緩或終止。如果不 加以處理，穩(wěn)定期中的細(xì)胞將最終死亡。在某些系統(tǒng)中對(duì)數(shù)期中的細(xì)胞通常負(fù)責(zé)最終產(chǎn)物 或中間產(chǎn)物的批量生成。在其他系統(tǒng)中可以獲得穩(wěn)定或指數(shù)后期生成。
標(biāo)準(zhǔn)分批式系統(tǒng)的一種變型是補(bǔ)料分批系統(tǒng)。分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法也適用于修飾 himA的、利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的培養(yǎng)，并且該方法包括典型的分批系統(tǒng)，除了一 點(diǎn)不同底物隨著培養(yǎng)進(jìn)行以遞增方式添加。在代謝產(chǎn)物往往抑制細(xì)胞的代謝作用以及其 中期望培養(yǎng)基中具有有限量的底物時(shí)，補(bǔ)料分批式系統(tǒng)是有用的。補(bǔ)料分批式系統(tǒng)中的實(shí) 際底物濃度難于測(cè)量并因而可根據(jù)一些可測(cè)量因素(例如PH以及廢氣例如CO2的分壓) 進(jìn)行評(píng)估。分批和補(bǔ)料-分批培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域內(nèi)是常用的且眾所周知，并且實(shí)例可見(jiàn)于 Biotechnology :A Textbookof Industrial Microbiology,Crueger,Crueger,禾口Brock,第 二版(1989) Sinauer Associates, Inc. , Sunderland, MA,或 Deshpande, Mukund V, App 1. Biochem. Biotechnol.，36，227，(1992)，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。乙醇的商業(yè)生產(chǎn)也可通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行。連續(xù)培養(yǎng)是一種開(kāi)放式系統(tǒng)，其中將設(shè) 定好的培養(yǎng)基連續(xù)加入生物反應(yīng)器里，并同時(shí)移出等量條件培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)培養(yǎng)一 般使細(xì)胞維持在其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的恒定高液相密度?；蛘?，連續(xù)培養(yǎng)可以用 固定化細(xì)胞來(lái)進(jìn)行，其中連續(xù)添加碳和營(yíng)養(yǎng)素，且連續(xù)從細(xì)胞團(tuán)塊中取出有價(jià)值的產(chǎn)物、副 產(chǎn)物或廢棄物。細(xì)胞固定可使用范圍廣泛的固體載體進(jìn)行，所述固體載體由本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的天然材料和/或合成材料組成。連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)允許調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、或最終產(chǎn)物濃度的一種因素或 任何數(shù)目的因素。例如，一種方法將以固定的速率維持限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)例如碳源或氮水平 并且允許所有其他參數(shù)適度。在其他系統(tǒng)中，影響生長(zhǎng)的許多因素可以連續(xù)改變，而通過(guò)培 養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度保持不變。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件，且因此由于培養(yǎng)基 取出的細(xì)胞喪失必須針對(duì)培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)速度進(jìn)行平衡。對(duì)于連續(xù)培養(yǎng)過(guò)程調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng) 素和生長(zhǎng)因子的方法以及用于使產(chǎn)物形成速度達(dá)到最大的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域眾所 周知的，并且各種方法由Brock，同上所述。尤其適用于乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵方法如下所述。所需修飾himA的、利用木糖的運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌屬菌株在包含半復(fù)合培養(yǎng)基的搖瓶中生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C至約37°C，在回旋 振蕩器中以約150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)，然后將其轉(zhuǎn)移到包含相似培養(yǎng)基的IOL種子發(fā)酵 罐中。種子培養(yǎng)物在種子發(fā)酵罐中厭氧生長(zhǎng)至OD6tltl介于3和6之間，然后將其轉(zhuǎn)移到生 產(chǎn)發(fā)酵罐中，其中的發(fā)酵參數(shù)經(jīng)最優(yōu)化用于乙醇生產(chǎn)。從種子罐轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)罐的典型種菌 體積在約2%至約20% ν/ν的范圍內(nèi)。典型的發(fā)酵培養(yǎng)基包含基本培養(yǎng)基組分如磷酸鉀 (1. 0-10. Og/Ι)、硫酸銨(0-2. Og/Ι)、硫酸鎂(0-5. Og/Ι)、復(fù)合氮源如酵母提取物或大豆產(chǎn) 物(0-10g/l)。培養(yǎng)基中存在終濃度約5mM的山梨醇或甘露糖醇。包括木糖和至少一種附 加糖如葡萄糖(或蔗糖)的混合糖提供碳源，當(dāng)初始批次碳源(50-200g/L)耗盡時(shí)將混合 糖持續(xù)加入發(fā)酵罐中以最大化乙醇比率和滴定量。碳源進(jìn)料速率進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)以確保培養(yǎng) 物不過(guò)度積聚葡萄糖，過(guò)多的葡萄糖會(huì)導(dǎo)致積聚毒性副產(chǎn)物如乙酸鹽。為了最大化從利用 的底物中生產(chǎn)的乙醇產(chǎn)量，通過(guò)磷酸鹽的量來(lái)限制生物量增長(zhǎng)，磷酸鹽是初始時(shí)成批加入 的或在發(fā)酵期間加入的。通過(guò)自動(dòng)加入氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉、或其它強(qiáng)堿，控制/ 保持發(fā)酵肉湯的PH。將發(fā)酵罐溫度控制在所需范圍內(nèi)。為了最小化泡沫，按需加入消泡劑 (任何種類一硅氧烷基的、有機(jī)物基的等)到罐中。可任選地使用抗生素(菌株中有該抗 生素的抗性標(biāo)記)如卡那霉素以最小化污染。任何上述調(diào)整條件和這些條件中的附加變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，它們是通過(guò)本發(fā)明利用木糖的、修飾himA的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株生產(chǎn)乙醇的適用條件。 實(shí)施例本發(fā)明將在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步限定。應(yīng)當(dāng)理解，盡管這些實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā) 明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅是以例證的方式給出的。通過(guò)上述論述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員可確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特征，并且在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行各種變化和修改以適應(yīng)多種用途和條件。一般方法本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且已經(jīng)在如下文 獻(xiàn)中有所描述Sambrook, J. , Fritsch, E. F.禾P Maniatis, T.的 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Co Id Spring Harbor, NY(1989)(下文稱為 “Maniatis”)；以及 Silhavy，Τ. J.，Bennan, Μ. L.禾Π Enquist，L. W.， Experiments withGene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory : Co Id Spring Harbor, NY (1984) -MR Ausubel, F. M.等人，Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Assoc.禾口 Wiley-Interscience 出版，Hoboken, NJ(1987)。縮寫的含義如下“kb”指千堿基，“bp”指堿基對(duì)，“nt”指核苷酸，“hr”指小時(shí)， “min”指分鐘，“sec”指秒，“d”指天，“L”指升，“ml”指毫升，“ μ L”指微升，“ μ g”指微克， “ng”指納克，“g”指克，“?！敝负聊枺?μ Μ”指微摩爾，“nm”指納米，“ μ mol ”指微摩爾， “pmol”指皮摩爾，“Cm”指氯霉素，"Cmr"指氯霉素抗性，"Specr"指奇放線菌素抗性，“cfu” 指每單位菌落數(shù)，“0D_”指在600納米波長(zhǎng)下測(cè)得的光密度，“SE”指標(biāo)準(zhǔn)誤差，“rpm”指每 分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“ ”指大約。實(shí)施例1生成ZW801-4基于轉(zhuǎn)座子的敲除/超表達(dá)文庫(kù)在利用木糖的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬重組菌株中構(gòu)建基于轉(zhuǎn)座子的基因組敲除/超 表達(dá)文庫(kù)以篩選抗乙酸鹽突變體。使用轉(zhuǎn)座子生成文庫(kù)有兩個(gè)首要原則。第一，它是完 全無(wú)偏的方法，不需要作任何對(duì)在乙酸鹽抗性中起作用的該基因的事先了解。第二，易于 鑒定負(fù)責(zé)所需表型的中斷基因，因?yàn)樗眠x擇性標(biāo)記“標(biāo)記”過(guò)。易于生成文庫(kù)的菌株是 ZW801-4。如以引用方式并入本文的美國(guó)專利申請(qǐng)#60/847813所詳述，ZW801-4通過(guò)中間體 菌株ZW800衍生自ZW658 (ATCC#PTA_7858)。ZW800通過(guò)從側(cè)接有野生型IoxP位點(diǎn)的抗奇 放線菌素盒(Sped-盒)的自殺質(zhì)粒雙交換插入編碼葡萄糖-果糖氧化還原酶(GFOR)的基 因進(jìn)行構(gòu)建。所得GFOR敲除突變體顯示具有降低的木糖醇產(chǎn)量，這是一種木糖代謝的有害 副產(chǎn)物，并且在用葡萄糖和木糖進(jìn)行的混合糖發(fā)酵期間具有更高的乙醇產(chǎn)量。然后通過(guò)Cre 介導(dǎo)的Speclr-盒切除將ZW800轉(zhuǎn)化成ZW801-4。消除選擇性標(biāo)記在GFOR開(kāi)放閱讀框的中 間留下一個(gè)單獨(dú)的野生型IoxP位點(diǎn)，它導(dǎo)致產(chǎn)生了過(guò)早截去翻譯蛋白的框內(nèi)終止密碼子。 此夕卜，作為設(shè)計(jì)自殺構(gòu)建體的結(jié)果，ZW801-4中的GFOR編碼序列在圍繞IoxP位點(diǎn)的區(qū)域丟 失了 72bp的初始野生型GFOR核苷酸序列。ZW801-4中的突變GFOR編碼區(qū)的序列是SEQ ID N0:25。像它的中間前體(ZW800) —樣，ZW801-4不生成任何可檢測(cè)的木糖醇，因?yàn)樗?產(chǎn)生功能性GFOR酶。用于生成ZW801-4基因組敲除/超表達(dá)文庫(kù)的方法基于Epicentre (Madison，WI)轉(zhuǎn)座技術(shù)，該技術(shù)使用pM0D -2<MCS>轉(zhuǎn)座子構(gòu)造載體(Transposon Construction Vector, Cat. No. M0D0602)o該質(zhì)粒包括一種氨芐青霉素抗性基因(ampR)、一個(gè)大腸桿菌復(fù) 制起點(diǎn)(ori)、和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所述多克隆位點(diǎn)位于Tn5轉(zhuǎn)座酶相互作用的兩個(gè)嵌合末 端(Mosaic Ends, ME)之間。就本發(fā)明的專利申請(qǐng)而言，如圖2所示將pM0D -2<MCS>轉(zhuǎn)化 成pMODgap/aadA，這是通過(guò)將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Pgap)的 Sped-盒(它具有自身啟動(dòng)子)和強(qiáng)組成型啟動(dòng)子插入位于兩個(gè)ME之間的多克隆位點(diǎn)； Pgap啟動(dòng)子和Sped-盒取向相反。因此，在轉(zhuǎn)座期間使用該構(gòu)建體隨機(jī)插入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞 菌屬染色體中的DNA片段包含Spec1-盒和Pgap啟動(dòng)子。將Pgap啟動(dòng)子加到轉(zhuǎn)座子上以 提高文庫(kù)的遺傳多樣性，因?yàn)樗軡撛诘馗淖冟徑D(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬染 色體基因的表達(dá)。ZW801-4基因組敲除/超表達(dá)文庫(kù)由 17，500種獨(dú)立突變體組成，并且甘油原液 的滴定量是 7. 1 X IO8Specr菌落形成單位數(shù)(cfu)每毫升。這翻譯成 1個(gè)轉(zhuǎn)座子插入 事件/115種核苷酸，它基于轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入序列和 2000種平均大小為 Ikb的基因是 約8x的全基因組覆蓋度。因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的低轉(zhuǎn)化頻率，期望無(wú)突變體或非常少的 突變體將具有一種以上的轉(zhuǎn)座子插入序列。實(shí)施例2『帝細(xì)801-4軒·循·/膽汰f隨體肺觀 體篩選ZW801-4基因組敲除/超表達(dá)文庫(kù)以獲得如下所述的抗乙酸鹽突變體。然而 在進(jìn)行該篩選之前，重要的是建立用于突變體富集方法的合適選擇條件。目標(biāo)是為了通過(guò) 兩個(gè)因素中的至少一個(gè)找到減緩生長(zhǎng)速率的乙酸鹽濃度，但仍舊允許將細(xì)胞分成幾代以便 生長(zhǎng)較快的突變體能積聚起來(lái)。在葡萄糖和木糖的濃縮混合物中、在與方法有關(guān)的條件下 進(jìn)行篩選也是重要的，因?yàn)橐郧暗膶?shí)驗(yàn)已經(jīng)表明滲透壓和乙酸鹽以協(xié)同方式抑制生長(zhǎng)。最
后，控制pH也是至關(guān)重要的，因?yàn)檎嬲囊种苹衔锸且宜猁}，并且如果不控制pH，質(zhì)子化
物質(zhì)對(duì)非質(zhì)子化物質(zhì)的比率將顯著提高，這是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞酸化生長(zhǎng)培養(yǎng)基。例如，如果PH 從5. 8降至4. 8，乙酸濃度將提高5倍，因?yàn)樵撊跤袡C(jī)酸的pKA是 4. 8。圖3限制兩種不同濃度的乙酸鹽對(duì)ZW801-4的生長(zhǎng)速率和生物質(zhì)終產(chǎn)量的抑制效 應(yīng)，使用該菌株生成所述文庫(kù)。這些實(shí)驗(yàn)使用乙酸鉀，并且下文給定的終濃度是基于以克每 升加入的鹽的乙酸鹽組分。控制PH的生物反應(yīng)器包含mRM3S培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物， 2g/LKH2P04, lg/L MgSO4, 5mM 山梨醇)加上 100g/L 的葡萄糖，90g/L 的木糖和 5g/L 或 6g/L 的乙酸鹽；PH5. 8，溫度30°C，以150rpm進(jìn)行攪拌。基于圖3和其它實(shí)驗(yàn)顯示的結(jié)果，選擇 5g/L的乙酸鹽進(jìn)行文庫(kù)篩選，因?yàn)樵撘种苿舛葷M足上述的兩個(gè)原則。為了富集抗乙酸鹽突變體，使用以下規(guī)程。將文庫(kù)甘油原液(0D_ = 4. 3;
7. 1 X 108Specrcfu/ml)的等分試樣(2mL)加入20mL的SM培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4, lg/L MgS04，75g/L葡萄糖，25g/L木糖，初始pH5. 8)中，并且將該培養(yǎng)物在30°C培養(yǎng) 1.5小時(shí)。在恢復(fù)期后，離心收獲細(xì)胞并重懸于2. OmL的相同生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然后將細(xì)胞懸
浮液( 7X IO6Speclr cfu)的等分試樣(10 μ L)接種到15mL的mRM3S培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基 包含100g/L葡萄糖，90g/L木糖，和有助于最小化pH變化的4g/L碳酸氫鉀；在加入細(xì)胞前 用濃磷酸將初始PH調(diào)節(jié)到5. 8，初始0D_是 0. 0025。這是用于突變體富集方法的種子培養(yǎng)物。它在30°C下生長(zhǎng)至0D_為 0. 5，然后將7. 5mL培養(yǎng)物接種到控制pH的生物反 應(yīng)器中。150mL的最終培養(yǎng)物包含mRM3S培養(yǎng)基加上100g/L的葡萄糖，90g/L的木糖，5g/L 的乙酸鹽，并且通過(guò)自動(dòng)加入KOH將pH保持在5. 8。在30°C下生長(zhǎng) 24小時(shí)后，將培養(yǎng)物 的等分試樣(0D_ 0. 5)轉(zhuǎn)移到其中包含具有相同組合物的新生長(zhǎng)培養(yǎng)基的新生物反應(yīng) 器中，初始0D_為 0.02。基本如上所述另外重復(fù)這一步驟六次。通常每隔24-36小時(shí)轉(zhuǎn) 移細(xì)胞一次，反應(yīng)器中的初始OD是 0. 02至 0. 03。因此，在兩次轉(zhuǎn)移期間有至少五代。 在第七輪突變體富集程序后，制備培養(yǎng)物的甘油原液用于進(jìn)一步的表征。圖4A顯示具有高糖和乙酸鹽的控制pH的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)在第七 次轉(zhuǎn)移后用富集的突變體培養(yǎng)物進(jìn)行。該實(shí)驗(yàn)的對(duì)照物是親本菌株ZW801-4。種子培養(yǎng)物 在30°C下在SM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至0D_為 4. 5，并且用10%的種菌開(kāi)啟生物反應(yīng)器。最終的 150mL培養(yǎng)物包含mRM3S培養(yǎng)基加上100g/L葡萄糖，90g/L木糖和6g/L乙酸鹽。在150rpm 下攪拌，分別將PH保持在5. 8，將溫度保持在30°C。在不同時(shí)間將1. OmL的培養(yǎng)物等分試樣 取出，使用配備折射指數(shù)檢測(cè)器(Hewlett-Packard，Palo Alto, CA)的HP 1100進(jìn)行HPLC 分析，以測(cè)定發(fā)酵肉湯中存在的葡萄糖、木糖、和乙醇的濃度。在HPLC分析之前，離心移除 細(xì)胞并通過(guò)0. 22 μ m的乙酸纖維素Spin-X離心管過(guò)濾器(Costar，catalog number 8160) 過(guò)濾上清液以除去小顆粒。在AminexHPX-87H柱(Bio-Rad)上分離化合物，該柱子在55°C 下，在等度條件下使用0. 6mL/min的流速并使用0. OlN H2SO4作流動(dòng)相。使用已知濃度的可 靠標(biāo)準(zhǔn)品定量受關(guān)注的峰值，結(jié)果用g/L表示。圖4A提供的結(jié)果顯示富集的突變體文庫(kù)培養(yǎng)物在發(fā)酵晚期具有較快的木糖利用 速度和較快的乙醇生產(chǎn)速度。注意這發(fā)生在消耗完所有葡萄糖后，并且乙醇濃度接近毒性 水平。然而，到兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的末期培養(yǎng)物已經(jīng)消耗了所有糖并制備了相同量的乙醇。當(dāng)使用 濃度略高的糖(105g/L葡萄糖和100g/L木糖)和較多乙酸鹽(9g/L)重復(fù)該實(shí)驗(yàn)時(shí)，能觀 察到相似的現(xiàn)象(圖4B)，因此證實(shí)該結(jié)果是可復(fù)制的。實(shí)施例3突變株的基因表征為了了解在選擇過(guò)程中富集了何種類型的突變體，在第二次生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)(圖 4B)期間從文庫(kù)培養(yǎng)物中分離單菌落。在24小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)移除培養(yǎng)物的等分試樣，細(xì) 胞在包含MMG培養(yǎng)基(50g/L的葡萄糖，10g/L的酵母提取物，5g/L的蛋白胨，2. 5g/L的 (NH4) 2S04,0. 2g/L的K2HPO4,和ImM的MgSO4)的瓊脂板上生長(zhǎng)。在厭氧條件下，在30°C培養(yǎng) 48小時(shí)后，隨機(jī)選擇十七種所得菌落進(jìn)行DNA序列分析以測(cè)定轉(zhuǎn)座子插入的位點(diǎn)。使用以 下方法進(jìn)行該分析。將所述菌落在50 μ L水中稀釋，并且使用GenomiPHI擴(kuò)增試劑盒(GE Healthcare LifeSciences Cat. No. 25-6600-1)擴(kuò)增基因組 DNA。簡(jiǎn)而言之，將 IyL細(xì)胞 懸浮液加入到9 μ L Lysis試劑中，并且將混合物加熱至95°C，保持3分鐘，然后立即冷卻至 4°C。接下來(lái)將9mL酶緩沖液和1 μ L Phi 29DNA聚合酶加入溶解樣本中。在30°C擴(kuò)增18 小時(shí)后，在65°C加熱滅活聚合酶10分鐘，然后將樣本立即冷卻至4°C。然后向擴(kuò)增樣本(SyL)的等分試樣中加入16mL的BigDye v3. ISequencing Reagent(PN#4337457 Applied Biosystems, Foster City, CA)、 1 μ L 的 Thermofidelase(Fidelity Systems， Gaithersburg，MD)、12 μ L 的分子生 物級(jí)水(Mediatech，Inc.，Herndon, VA)、和 3 μ L 的 10 μ M 引物SpecT-FOR (SEQID No 2 :GTGAAAGGCGAGATCACCAAGGTAGTC)或 SpecT-Rev (SEQ ID No 3 CTACCTCTGATAGTTGAGTCGATACTTCGG)。注意這些引物均與用于生成ZW801-4基因組敲除文 庫(kù)的轉(zhuǎn)座子部分的Sped-盒雜交，但是它們的取向相反。然后如下進(jìn)行熱循環(huán)測(cè)序反應(yīng) 96 0C 3分鐘，隨后進(jìn)行200個(gè)循環(huán)(95°C 30秒+55°C 20秒+60°C 2分鐘)，4°C貯存。在 測(cè)序之前，使用Edge Biosystem(Gaithersburg, MD)純化板移除未摻入的ddNTP。將全部 40-mL測(cè)序反應(yīng)混合物吸移到預(yù)離心的96孔純化板的一個(gè)孔中，所述板在Sorvall RT-7冷 凍離心機(jī)中，在5000x重力條件下離心5分鐘。然后將純化后的反應(yīng)物直接置于Applied Biosystems 3730DNA測(cè)序儀上，并用自動(dòng)堿基判定測(cè)序。引人注目的是，進(jìn)行測(cè)序的所有17種菌落均具有插入himA開(kāi)放閱讀框(運(yùn)動(dòng)發(fā) 酵單胞菌屬基因組(GenBank保藏號(hào)AE008692)從核苷酸#1138224至#1138565的反向互 補(bǔ)序列)的轉(zhuǎn)座子，并且鑒定了三個(gè)不同的插入事件。十一種菌落(包括AcR#3，參見(jiàn)下 文)在nt#l 138413具有轉(zhuǎn)座子插入序列，四種菌落在nt#l 138267具有插入序列，兩種菌落 在nt#l 138508具有插入序列。因此，所有三個(gè)插入事件發(fā)生在DNA的250bp片段中。在第 七輪突變體富集程序后65%的himA敲除突變體在nt#l 138413具有轉(zhuǎn)座子插入序列，這一 事實(shí)表明該事件可賦予比其它兩個(gè)插入事件更快的生長(zhǎng)速度或更高的存活能力。序列分析 也觀察到另一個(gè)令人感興趣的結(jié)果。雖然理論上Tn5轉(zhuǎn)座子能夠?qū)⑵渥陨硪詢蓚€(gè)方向插入 DNA，它從選擇方法中回收的所有三個(gè)插入事件中具有相同的取向，S卩，Pgap啟動(dòng)子指向與 himA開(kāi)放閱讀框相反的方向。上述測(cè)序結(jié)果清楚地表明圖4顯示的實(shí)驗(yàn)具有混合種群的細(xì)胞，而不是純化菌 株。因此，選擇AcR#3進(jìn)行進(jìn)一步表征himA表型，因?yàn)樵摼暝趎t#l 138413具有轉(zhuǎn)座子插 入序列，這是最頻繁的分離事件。實(shí)施例4himA基因失活在方法相關(guān)的K牛下對(duì)乙Il鹽抗件禾口發(fā)！^牛能前效應(yīng)AcR#3比ZW801-4對(duì)乙酸鹽的抗性更強(qiáng)用于突變體選擇方法的生長(zhǎng)培養(yǎng)基除了抑制水平的乙酸鹽之外還包含高濃度的 葡萄糖和木糖。因此在第七輪富集后觀察到的發(fā)酵性能改善(圖4)可能與滲透壓或在木糖 上較好的生長(zhǎng)有關(guān)，因?yàn)槟咎遣幌衿咸烟且粯尤菀桌?。也可能已?jīng)富集了的抗乙醇的突 變體，因?yàn)橥茰y(cè)它們?cè)谑褂玫膶?shí)驗(yàn)條件下也將生長(zhǎng)較快或者存活時(shí)間較長(zhǎng)。為了排除這些 其它的可能性并且了解himA基因失活是否真地賦予較高的乙酸鹽抗性，在以下條件下比 較菌株AcR#3和親本菌株ZW801-4。實(shí)驗(yàn)在33°C下，在搖瓶(在50mL管中有20mL培養(yǎng)物) 中進(jìn)行，并且生長(zhǎng)培養(yǎng)基包含10g/L酵母提取物，2g/L KH2PO4, lg/L MgSO4, IOmMKHCO3 (有助 于保持PH)，50g/L葡萄糖和0、8、或12g/L乙酸鹽，該乙酸鹽以鉀鹽的形式加入；乙酸鹽的 濃度基于鉀鹽的乙酸鹽組分決定。在加入細(xì)胞之前用磷酸將初始PH調(diào)節(jié)至5. 8，并且在往 復(fù)振蕩器上輕輕攪拌培養(yǎng)物(150rpm)。種子培養(yǎng)物在無(wú)乙酸鹽的相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至指數(shù) 期后期(0D_ 1. 4)，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)物的初始0D_是0. 03。必須注意到這些條件是在缺少乙酸 鹽情況下的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬生長(zhǎng)的理想條件，因?yàn)闊o(wú)滲透壓并以優(yōu)選的葡萄糖底物作為 碳源。此外，該實(shí)驗(yàn)中能生成的乙醇的最高濃度是< 25g/L，它對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬生長(zhǎng)僅 有較小效應(yīng)或無(wú)效應(yīng)。在缺少乙酸鹽的情況下，AcR#3和ZW801-4的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)相似，并且根據(jù)如圖5顯示的最終的0D_值，它們生產(chǎn)相同量的生物質(zhì)。然而AcR#3菌株(圖5B)具有比親本菌株 (圖5A)更高的乙酸鹽抗性。例如，ZW801-4生長(zhǎng)在8g/L乙酸鹽條件下幾乎完全停滯，然而 該抑制劑濃度僅對(duì)AcR#3具有可忽略不計(jì)的效應(yīng)。實(shí)際上，himA敲除突變體對(duì)12g/L乙酸 鹽的抗性高于ZW801-4對(duì)8g/L乙酸鹽的抗性。重復(fù)該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌颢@得相同的結(jié)果。重要的 是要記得，當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基的PH不受控制時(shí)乙酸鹽的抑制能力較強(qiáng)，如圖4所示的在生物反 應(yīng)器中的實(shí)驗(yàn)?zāi)菢印Ｔ跓o(wú)PH控制的搖瓶實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞酸化培養(yǎng)基并且乙酸/乙酸鹽的比率 顯著提高，如上所述該質(zhì)子化的物質(zhì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。因?yàn)殁涬x子可能至少部分地導(dǎo)致上述實(shí)驗(yàn)中觀察到的對(duì)兩種菌株的生長(zhǎng)抑制，其 它來(lái)源的乙酸鹽進(jìn)行測(cè)試是重要的。用于這組實(shí)驗(yàn)的條件與上述的那些條件相同，但是該 分析也包括乙酸鈉和乙酸銨。在所有情況下乙酸根陰離子的濃度是8g/L(如上文定義)。 圖6顯示了在43小時(shí)時(shí)間點(diǎn)不同培養(yǎng)物的最終0D_值。ZW801-4(圖6A)被8g/L的乙酸鹽 強(qiáng)烈抑制，無(wú)論使用的是哪種乙酸鹽。這一觀察結(jié)果清楚地指示在這些實(shí)驗(yàn)中的主要抑制 劑是乙酸，而乙酸鹽中的一價(jià)陽(yáng)離子在所使用的濃度下對(duì)生長(zhǎng)僅有較小效應(yīng)或無(wú)效應(yīng)。雖 然所有三種乙酸鹽也對(duì)AcR#3(圖6B)的生長(zhǎng)具有負(fù)面影響，當(dāng)乙酸鹽濃度僅為8g/L時(shí)，對(duì) 該菌株的抑制不顯著。圖5和圖6顯示的實(shí)驗(yàn)合在一起，提供了 AcR#3比親本菌株ZW801-4 乙酸鹽抗性更強(qiáng)的明確證據(jù)。AcR#3 bK ZW801-4在高糖加乙酸鹽餛合物中表現(xiàn)麼好當(dāng)在與用于“混合種群”突變體相同的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)試AcR#3時(shí)(圖4B)，它的表 現(xiàn)勝過(guò)ZW801-4，并且在兩種培養(yǎng)物之間的差異比較早實(shí)驗(yàn)中的差異更大(圖7)。與以前 的結(jié)果一致，所述改善僅僅在發(fā)酵后期，在消耗了所有葡萄糖并僅有木糖作剩余碳源后是 明顯的。實(shí)際上，圖7顯示的時(shí)間段接近的檢查揭示AcR#3的葡萄糖利用和乙醇生產(chǎn)的初 始速率些微較慢。然而，在發(fā)酵后期，在消耗了所有葡萄糖后，根據(jù)木糖利用曲線的斜率，明 顯地看出AcR#3能夠以比ZW801-4更快的速率將木糖轉(zhuǎn)化成乙醇。在上述實(shí)驗(yàn)中不能評(píng)估AcR#3的全部潛力，因?yàn)槭褂玫臈l件下，甚至對(duì)照菌株也 能夠在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诶盟刑?。為了消除這一限制，使用較嚴(yán)苛的條件再次測(cè)試AcR#3和 ZW801-4。溫度從30°C升溫至33°C，并且使用更高濃度的葡萄糖和木糖。種子培養(yǎng)物在30°C 下在SM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD6tltl為 4. 4，并且用10%的種菌開(kāi)啟生物反應(yīng)器。最終的150mL 培養(yǎng)物包含mRM3S培養(yǎng)基加上126g/L葡萄糖，107g/L木糖和10g/L乙酸鹽。在150rpm下 攪拌，分別將PH保持在5. 8，將溫度保持在33°C。ZW801-4進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，AcR#3進(jìn)行兩 次平行實(shí)驗(yàn)，表1給出了葡萄糖、木糖、乙酸鹽、和乙醇的終點(diǎn)值(67小時(shí))(平均值士SE)。 如實(shí)施例2所述進(jìn)行發(fā)酵肉湯的HPLC分析，表中所有化合物的濃度以g/L表示。在這些較 嚴(yán)苛條件下AcR#3比親本菌株ZW801-4消耗多 10%的木糖并生產(chǎn)多 4%的乙醇。表1 在控制pH的發(fā)酵罐中的木糖、乙醇、和木糖醇的終點(diǎn)倌，其中ZW801-4和 AcR#3菌株在高糖和乙酸鹽中生長(zhǎng)。
菌株葡萄糖木糖乙·駿鹽乙醇ZW801-4027. 1±1. 410.8±0. 190. 3±0. 3 AcR#3比ZW801-4在100%樽擬水解產(chǎn)物中表現(xiàn)更好在存在一定濃度銨離子和乙酸根離子的情況下評(píng)估AcR#3和ZW801-4的性能， 期望所述銨離子和乙酸根離子存在于使用氫氧化氨預(yù)處理方法制備的生物質(zhì)水解產(chǎn)物 中。這是一個(gè)關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗呀?jīng)預(yù)測(cè)在氫氧化銨預(yù)處理的玉米秸稈水解產(chǎn)物發(fā)酵 期間的銨離子的濃度可能超過(guò)180mM，而高濃度的銨離子抑制運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬的生長(zhǎng) (Agrawal (1989) Biotechnology and Bioengineering 34 :278_281)。用于這些實(shí)驗(yàn)的合成 100 %模擬水解產(chǎn)物100 % MH)培養(yǎng)基包含5g/L酵母提取物，15mM (NH4) 2HP04,160mM乙酸銨， lg/L MgSO4和IOmM山梨醇(pH5. 8)。因此，在加入種子培養(yǎng)物后，在100% MH中的乙酸鹽 和銨離子終濃度分別為 9. 5g/L和190mM。該實(shí)驗(yàn)在控制pH的生物反應(yīng)器中進(jìn)行。種子 培養(yǎng)物在30°C下在SM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD6tltl為 4. 4，并且用10%的種菌開(kāi)啟生物反應(yīng)器。 最終的150mL培養(yǎng)物包含100% MH加上110g/L葡萄糖和90g/L木糖。在150rpm下攪拌， 分別將PH保持在5. 8，將溫度保持在33°C。在不同時(shí)間移除等分試樣用于發(fā)酵肉湯的HPLC 分析，該分析使用如實(shí)施例2所述的相同方法。來(lái)自同時(shí)進(jìn)行的一對(duì)代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯 示于圖8 在8A中的是ZW801-4，在8B中的是AcR#3。與以前的觀察結(jié)果一致，當(dāng)葡萄糖是僅有的供代謝的糖時(shí)，AcR#3菌株的乙醇生產(chǎn) 速率不增加。然而，AcR#3的優(yōu)異性能在當(dāng)木糖是僅有碳源時(shí)的發(fā)酵后期表現(xiàn)的非常明顯。 到那時(shí)候ZW801-4已經(jīng)消耗了所有葡萄糖，乙醇濃度已經(jīng)> 65g/L，該乙醇濃度甚至是運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌屬的殺菌濃度。高濃度的乙酸鹽和銨離子增加了該嚴(yán)苛環(huán)境，它們都能加強(qiáng)乙 醇的毒性。因?yàn)橐掖己砍掷m(xù)增加，木糖代謝變得越來(lái)越慢，最后停滯。AcR#3也發(fā)生了相 同的一幕，但是持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)了。因?yàn)锳cR#3對(duì)乙酸鹽有較高的抗性，與ZW801-4相比，它 能夠在毒性環(huán)境下存活更長(zhǎng)的時(shí)間，并且因此實(shí)際上能夠消耗生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所有木糖并 生產(chǎn)更多的乙醇。重復(fù)兩種菌株用100% MH進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)兩次或更多次，結(jié)果實(shí)際上是相同的。表2 中給出了三個(gè)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中使用了葡萄糖、木糖、乙酸鹽和乙醇的終點(diǎn)值(48小 時(shí))；所有濃度以g/L表示(平均值士 SE)。用獨(dú)立生長(zhǎng)的種子培養(yǎng)物接種所有六個(gè)生物反 應(yīng)器。在100% MH中，AcR#3比ZW801-4多消耗 14g/L的木糖，這使得乙醇最終滴定量從 82g/L提高到91g/L，該增長(zhǎng)率超過(guò)了 10%。這些結(jié)果甚至比表1給出的高糖加乙酸鹽實(shí)驗(yàn) 中獲得的那些結(jié)果更高。當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在銨離子和乙酸鹽時(shí)，脅迫水平提升到甚至更 高的水平，并且himA基因失活的有益效果變得較為明顯。像AcR#3這樣的具有較高乙酸鹽 抗性的菌株明顯地對(duì)環(huán)境中的其它抑制劑較有耐受性，像乙醇和銨離子。表2:在控吿丨丨油的發(fā)酵罐中的葡萄_、^_、乙醇、禾口乙_鹽的終點(diǎn)倌，1；中 ZW801-4和AcR#3菌株在100%樽擬水解產(chǎn)物中牛長(zhǎng)。 實(shí)施例5在ZW801-4中牛成敲除himA基因的自殺構(gòu)津體雖然迄今所得的結(jié)果有力地表明AcR#3的抗乙酸鹽表型由中斷himA基因產(chǎn)生，但 有兩個(gè)其它因素可能潛在地對(duì)其產(chǎn)生作用。如實(shí)施例1所述，用于生成ZW801-4基因組敲 除/超表達(dá)文庫(kù)的轉(zhuǎn)座子包含Sped-盒和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬Pgap啟動(dòng)子。這些元件取向 相反，并且它們?cè)谵D(zhuǎn)座期間都插入himA開(kāi)放閱讀框中。因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬Pgap啟動(dòng)子 是一個(gè)強(qiáng)組成型啟動(dòng)子，它可能已經(jīng)改變了接近himA轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的基因的表達(dá)水平。 AcR#3的至少部分抗乙酸鹽表型也可能是由其它基因中的自發(fā)突變產(chǎn)生，所述其它基因也 可能已經(jīng)使得文庫(kù)突變體富集過(guò)程(實(shí)施例2)期間的生長(zhǎng)加快。為了排除這些可能性并 了解himA基因失活是否單獨(dú)導(dǎo)致AcR#3的較高乙酸鹽抗性，我們?cè)O(shè)計(jì)了自殺構(gòu)建體用于敲 除ZW801-4中的himA基因。如下文詳述，該非復(fù)制質(zhì)粒具有一個(gè)抗奇放線菌素盒，但是不 包含Pgap啟動(dòng)子。本發(fā)明中用于敲除ZW801_4( “pHimA”)中的himA基因的自殺構(gòu)建體基本上來(lái)源 于另一個(gè)自殺構(gòu)建體(“pLDHSp-9ffff”)，該構(gòu)建體前文用于通過(guò)宿主介導(dǎo)的、雙交換的同源 重組，并使用抗奇放線菌素基因作選擇性標(biāo)記，插入失活運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中的D-乳酸脫 氫酶基因。pLDHSp-9ffff也來(lái)源于許多以前生成的其它構(gòu)建體。所有這些構(gòu)建體的初始前體 是可商購(gòu)獲得的質(zhì)粒載體pNEB193(New England Biolabs#N3051S)。選擇這一質(zhì)粒是因?yàn)?它能在大腸桿菌中復(fù)制，但是它不能在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中復(fù)制。在himA敲除構(gòu)建體生成 過(guò)程中涉及的所有步驟和中間體在下文按時(shí)間先后順序描述，從質(zhì)粒PNEB193開(kāi)始。構(gòu)津DLDH193pNEB193用SbfI和AscI進(jìn)行雙重消化以插入下文所述的DNA片段中。限制性位 點(diǎn)是唯一的，并且位于質(zhì)粒的多克隆區(qū)域中。用Sbfl/AscI線性化的pNEB193質(zhì)粒DNA片 段使用Qiagen’ s QIAQuick純化試劑盒(目錄號(hào)#28104)，按照制造商規(guī)程進(jìn)行純化。被 克隆到pNEB193中的DNA插入序列是2268bp片段，該片段從分離自菌株ZWl (ATCC#31821) 的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬基因組DNA中使用Qiagen'sBlood & Cell Culture Maxi試劑盒(目 錄號(hào)#13362)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于PCR擴(kuò)增該片段的合成寡核苷酸是引物1和2。引物 1 (SEQ ID NO 4)CTACTCATTTcctgcaggTGGTAACTCATTGCGCGCTC引物 2 (SEQ ID NO :5)CATCTTACTggcgcggccAAAAATCTGCGGCTGACATAC用下劃線標(biāo)示的引物1(正向引物)的堿基在編碼磷酸甘油變位酶(Pgm)的開(kāi) 放閱讀框的3’末端與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬基因組(GenBank保藏號(hào)AE008692)的核苷酸 1262739-1262720雜交，然而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5，末端的SbfI位點(diǎn)。用下劃線標(biāo)示 的引物2 (反向引物)的堿基與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬基因組的核苷酸1260490-1260472雜交，該核苷酸序列位于編碼醇脫氫酶I (adhl)的開(kāi)放閱讀框的上游，然而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到 引物5，末端的AscI位點(diǎn)。因此是PCR擴(kuò)增靶標(biāo)的2268bp的DNA片段由起始于SbfI位點(diǎn) 并終止于AscI位點(diǎn)的以下元件組成(a)pgm基因的3’末端，(b)編碼D-乳酸脫氫酶的全 Idh基因，和(c) adhl基因的5，非翻譯區(qū)。用SbfI和AscI切割PCR產(chǎn)物，將所得DNA片段 連接到如上文所述的用Sbfl/AscI線性化的pNEB193載體中。將連接反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化 大腸桿菌JMllO并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于包含氨芐青霉素(100yg/mL)的LB培養(yǎng)基上。包含具 有正確尺寸插入序列的抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化子最初通過(guò)PCR，使用重懸菌落(“菌落PCR”) 以及引物1和2進(jìn)行鑒定。隨后用SbfI和AscI對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性消化分析和通過(guò)用 抗氨芐青霉素轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR生成的2268bp的片段的DNA序列分析來(lái)確認(rèn)陽(yáng)性克隆。 選擇用于進(jìn)一步操縱的質(zhì)粒稱為PLDH193。構(gòu)津dLDHTc139#7質(zhì)粒pLDH193具有唯一的NcoI位點(diǎn)，該位點(diǎn)大約位于Idh開(kāi)放閱讀框的中間。該 位點(diǎn)用于插入賦予四環(huán)素抗性的DNA片段。用于該操縱的抗四環(huán)素盒(Tcr-盒)通過(guò)PCR 生成，所述PCR使用質(zhì)粒pACYC184 (GenBank保藏號(hào)X06403)作為DNA模板并使用引物3和 4作為PCR引物。引物3 (SEQ ID NO 6)ACTCATTTccatggCGATCGCACTATgcgggccgc AATGTAGCACCTGAAG TCAGCC引物4 (SEQ ID NO :7)ATCTCACTccatRRCCGGCCAACTAttaatt aaGAATTGATTGGCTCCAATT CTTG引物3(正向引物)的用粗體下劃線標(biāo)示的堿基雜交到四環(huán)素抗性基因啟動(dòng)子的 上游。引物3也具有三個(gè)加到其5’末端的限制性位點(diǎn)(NcoI、AsiSI、和NotI)。NcoI位點(diǎn) 以正常小寫字母表示。AsiSI位點(diǎn)用細(xì)線進(jìn)行下劃線標(biāo)示。Not I位點(diǎn)以斜體小寫字母表 示。引物4(反向引物)的用粗體下劃線標(biāo)示的堿基雜交到四環(huán)素抗性基因的終止密碼子 上游，并且該引物也具有三個(gè)加到其5’末端的限制性位點(diǎn)(NcoLFseljPPacI)。類似于 上述的標(biāo)簽，NcoI位點(diǎn)以正常小寫字母表示，F(xiàn)seI位點(diǎn)用細(xì)線進(jìn)行下劃線標(biāo)示，PacI位點(diǎn) 以斜體小寫字母表示。用引物3和4生成的1448bp的IV-盒用NcoI切割，并且通過(guò)制備 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化。然后將所得DNA片段連接到唯一的NcoI位點(diǎn)上，該位點(diǎn)存在于 質(zhì)粒pLDH193的Idh開(kāi)放閱讀框中。為了最小化無(wú)插入序列的載體再環(huán)化的可能性，在連 接之前用小牛腸堿性磷酸酶使NcoI消化的PNEB193脫磷酸。將連接反應(yīng)混合物導(dǎo)入大腸 桿菌JMllO并將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于包含20 μ g/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上。包含具有正確插入序 列的質(zhì)粒的抗四環(huán)素轉(zhuǎn)化子通過(guò)用NcoI、AsiSI、NotI, FseI、和PacI進(jìn)行的限制性消化分 析來(lái)鑒定，并且通過(guò)使用合適引物的PCR分析確認(rèn)IV盒的取向。圖9A顯示了選擇用于進(jìn) 一步操縱的質(zhì)粒的環(huán)狀示意圖(命名為pLDHTcl39#7)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用宿主介 導(dǎo)的、雙交換的同源重組并在用作選擇性標(biāo)記的四環(huán)素上生長(zhǎng)，將該自殺構(gòu)建體成功用于 在ZWl中對(duì)D-乳酸脫氫酶基因的插入失活(“中斷”或“敲除”)。構(gòu)建pLDHTcl39#7_9ffff已經(jīng)證明能使用pLDHTcl39#7來(lái)“敲除”ZWl中的D-乳酸脫氫酶基因，然后修飾該構(gòu)建體以便它將可能使用Cre重組酶在基因中斷后從染色體中移除選擇性標(biāo)記。為了達(dá)到 該目標(biāo)，利用四個(gè)側(cè)接IV-盒的唯一限制性位點(diǎn)，稱為在5’末端的AsiSI和NotI以及在 3，末端的PacI和Fsel，將兩個(gè)野生型IoxP位點(diǎn)(Lee和Saito, 1998)加到pDHTcl39#7上。 第一個(gè)IoxP位點(diǎn)在用兩種酶切割構(gòu)建體后，插入質(zhì)粒pLDHTcl39#7的AsiSI和NotI位點(diǎn) 之間，并且純化所得大DNA片段。插入該位置的IoxP位點(diǎn)從兩種合成寡核苷酸(Oligos 5 和6)中生成，所述寡核苷酸均在它們的5’末端進(jìn)行了磷酸化。寡核苷酸5 (SEQ ID NO 8)cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc寡核苷酸6(SEQ ID NO 9)ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat寡核苷酸5和6彼此互補(bǔ)，當(dāng)它們一起退火形成全長(zhǎng)雙鏈野生型IoxP位點(diǎn)時(shí)，該 位點(diǎn)在兩端具有單鏈突出端，它允許DNA片段在pLDHTc 139#7的AsiSI和NotI位點(diǎn)之間 連接。在寡核苷酸5和6中的大寫字母對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)野生型IoxP位點(diǎn)，而小寫字母指示用于 將雙鏈DNA片段連接到pLDHTcl39#7的AsiSI和NotI位點(diǎn)中的核苷酸。連接反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于包含20 μ g/mL四環(huán) 素的LB培養(yǎng)基上。包含具有IoxP位點(diǎn)的質(zhì)粒的抗四環(huán)素轉(zhuǎn)化子通過(guò)限制性消化分析、使 用合適引物的菌落PCR、以及對(duì)相關(guān)區(qū)域的DNA序列分析來(lái)鑒定，其中IoxP位點(diǎn)正確插入 pLDHTc 139#7的AsiSI和NotI位點(diǎn)。選擇用于進(jìn)一步操縱的質(zhì)粒稱為pLDHTcl39#7_9W。接下來(lái)，在用兩種酶切割質(zhì)粒并純化所得大載體片段之后，將第二個(gè)野生型IoxP 位點(diǎn)插入在pLDHTc 139#7-9W中的Tclr-盒的另一端的PacI和FseI位點(diǎn)之間。插入該位置 的IoxP位點(diǎn)也從兩種合成寡核苷酸(Oligos 7和8)中生成，所述寡核苷酸均在它們的5’ 末端進(jìn)行了磷酸化。寡核苷酸7 (SEQ ID NO 10)taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg寡核苷酸8 (SEQ ID NO 11)ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat寡核苷酸7和8彼此互補(bǔ)，當(dāng)它們雜交形成全長(zhǎng)雙鏈野生型IoxP位點(diǎn)時(shí)，該位點(diǎn) 在兩端具有單鏈突出端，它允許DNA片段在pLDHTc 139#7-9ff的PacI和FseI位點(diǎn)之間連接。 在寡核苷酸7和8中的大寫字母對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)IoxP位點(diǎn)，而小寫字母指示用于將雙鏈DNA片 段連接到pLDHTc 139#7-9W的PacI和FseI位點(diǎn)中的核苷酸。連接反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞置于包含20 μ g/mL四環(huán) 素的LB培養(yǎng)基上。包含具有IoxP位點(diǎn)的質(zhì)粒的抗四環(huán)素轉(zhuǎn)化子通過(guò)限制性消化分析、 使用合適引物的菌落PCR、以及對(duì)相關(guān)區(qū)域的DNA序列分析來(lái)鑒定，其中野生型IoxP位點(diǎn) 正確插入pLDHTc 139#7-9W的PacI和FseI位點(diǎn)。將經(jīng)選擇用于進(jìn)一步操縱的質(zhì)粒稱為 pLDHTc 139#7-9ffff,圖9B顯示了該構(gòu)建體的環(huán)狀示意圖。構(gòu)建pLDHSp_9ffffpLDHSp-9ffff與pLDHTc 139#7-9ffff相同，不同的是在后者中的抗四環(huán)素盒用賦予 奇放線菌素抗性的DNA片段取代(即Sped-盒)。后者通過(guò)PCR生成，所述PCR使用質(zhì)粒 pHP15578(如Cahoon等人所述，2003)作模板，以及引物9和10進(jìn)行PCR擴(kuò)增。pHP15578包含Sped盒的全核苷酸序列，包括其啟動(dòng)子，它基于編碼3’(9)-0_核苷酸轉(zhuǎn)移酶的 Tranposon Tn7 aadA 基因(GenBank 保藏號(hào) X03403)的公布序列。引物9 (SEQ ID NO 12)ATAAAAgcgggccgcAGCACAGGATGA引物 10 (SEQ ID NO 13)GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG引物9(正向引物)的用下劃線標(biāo)示的堿基與Sped盒的啟動(dòng)子上游雜交(GenBank 保藏號(hào)X03043的nts 6_17)，而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5’末端的NotI位點(diǎn)。引物 10 (反向引物)的用下劃線標(biāo)示的堿基與Sped盒的終止密碼子下游的約130種堿基雜交 (GenBank保藏號(hào)X03043的nts 1006-1019)，而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5，末端的PacI位 點(diǎn)。PCR生成的1040bp的Speclr盒用NotI和PacI進(jìn)行雙重消化，所得DNA片段通過(guò)瓊脂糖 凝膠純化。也用相同的兩種限制性酶切割質(zhì)粒pLDHTcl39#7-9ffff以移除Tclr-盒，并且通過(guò) 瓊脂糖凝膠電泳純化所得大載體片段。然后將PCR產(chǎn)物和載體片段連接到一起，并且使用 電穿孔將轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物導(dǎo)入大腸桿菌DHlOB中。將轉(zhuǎn)化子置于包含奇放線菌素(200 μ g/ mL)的LB培養(yǎng)基上并在37°C下生長(zhǎng)。包含具有正確尺寸插入序列的質(zhì)粒的抗奇放線菌素 轉(zhuǎn)化子通過(guò)用NotI和PacI限制性消化分析進(jìn)行鑒定，并且將選擇用于進(jìn)一步操縱的質(zhì)粒 稱為pLDHSp-9ffff ；圖9C顯示該構(gòu)建體的環(huán)狀示意圖。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pLDHSp-9ffff用于敲除在ZWl中的D-乳酸脫氫酶基因，該方 法使用宿主介導(dǎo)的雙交換同源重組并在奇放線菌素上生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。通過(guò)在自殺構(gòu)建體中 側(cè)接Sped-盒的兩個(gè)DNA片段將雙交換事件定向于Idh基因。這些片段的其中一個(gè)(下 文稱作5，Idh側(cè)接DNA)位于Speclr-盒的上游，并且位于SbfI和AsiSI位點(diǎn)之間。這種 IlOObp的DNA片段的核苷酸序列與編碼pgm基因3’末端和Idh開(kāi)放閱讀框的約前半部分 的ZWl染色體DNA相同。其它DNA片段(下文稱作3，Idh側(cè)接DNA)位于Speclr-盒的反 向末端，并且位于FseI和AscI位點(diǎn)之間。3，Idh側(cè)接DNA(也長(zhǎng) IlOObp)的核苷酸序列 與編碼Idh基因另外一半和adhl基因的5，非翻譯區(qū)的染色體DNA相同。當(dāng)5，和3，Idh 側(cè)接DNA片段與它們的染色體副本相互作用并發(fā)生同源重組時(shí)，雙交換事件發(fā)生。這一現(xiàn) 象基本上是不可逆的并且完全由宿主酶機(jī)器介導(dǎo)，它通過(guò)將側(cè)接兩種野生型IoxP位點(diǎn)的 Sped-盒插入開(kāi)放閱讀框的中間來(lái)失活染色體Idh基因。因?yàn)樽詺?gòu)建體不能在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵 單胞菌屬中復(fù)制，用pLDHSp-9ffff生成穩(wěn)定的抗奇放線菌素菌落的僅有方法是通過(guò)同源重 組的雙交換事件(除了發(fā)生頻率極低的自發(fā)抗藥突變之外)。構(gòu)建 pHimA為了生成himA基因的敲除構(gòu)建體，pLDHSp-9ffff中的Idh側(cè)接DNA用himA側(cè)接DNA 置換以將選擇性標(biāo)記和雙交換事件定向到染色體himA基因。需要四個(gè)DNA片段進(jìn)行如下 文所述的操縱。片段1來(lái)源于pLDHSp-9ffff(圖9C)，通過(guò)用四種不同的限制性酶切割質(zhì)粒獲得 NotI、BsaI、SbfI 禾口 AscI。NotI 在 nt 2647 切割 pLDHSp-9ffff，BsaI 在 nt 1816 切割質(zhì)粒。 在用四種限制性酶完全消化質(zhì)粒DNA后，通過(guò)電泳，使用1 %的瓊脂糖凝膠和Zymoclean凝 膠 DNA 回收試劑盒(目錄號(hào) #D4001，Zymo Research)純化 2666bp 的 SbfI-AscI DNA 片段。 該片段稱為片段1，它包含一個(gè)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中無(wú)功能的大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)和一種賦予大腸桿菌氨芐青霉素抗性的基因。片段2也來(lái)源于pLDHSp-9ffff。用FseI和AsiSI雙重消化質(zhì)粒，通過(guò)電泳，使用
的瓊脂糖凝膠和Zymoclean凝膠DNA回收試劑盒(目錄號(hào)#D4001，Zymo Research)純化所 得1105bp的FseI-AsiSI DNA片段。該片段稱為片段2，它包含側(cè)接兩個(gè)野生型IoxP位點(diǎn) 的Sped-盒，在片段的兩端各有一個(gè)該位點(diǎn)。片段3包含3，himA側(cè)接DNA。通過(guò)PCR使用引物A和B生成 1. 12Kbp的片段 3。PCR擴(kuò)增的模板是使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(目錄號(hào)#A1125，Promega)分離 自 ZW658 (ATCC#PTA-7858)的基因組 DNA。引物 A (SEQ ID NO 14)CTACTCATcctgcaggTTTAATGAATGAGCGGATGCTG引物B (SEQ ID NO 15)CATCTTACTgcgatcgcTGACTTTCCGTGCCAGCCAG引物A(正向引物)的用下劃線標(biāo)示的堿基與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬基因組(GenBank 保藏號(hào)AE008692)的核苷酸1137154-1137175雜交，該核苷酸序列位于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶 蛋白家族的推定成員的編碼區(qū)中間(Seo等人，Nat. Biotechnol. 23 (1)，63-68 (2005))，即 himA基因的下游，而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5’末端的SbfI位點(diǎn)。引物B(反向引物) 的用下劃線標(biāo)示的堿基在himA開(kāi)放閱讀框的3’末端與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬基因組的核苷酸 1138276-1138257雜交，而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5’末端的AsiSI位點(diǎn)。圖IOA顯示引 物A和B的染色體結(jié)合位點(diǎn)以及生成的PCR產(chǎn)物(片段3)。PCR產(chǎn)物用SbfI和AsiSI進(jìn) 行雙重消化，然后如上所述將所得1123bp的DNA片段通過(guò)瓊脂糖凝膠純化。片段4包含5，himA側(cè)接DNA。通過(guò)PCR使用引物C和D生成 1. 16Kb的片段4。 PCR擴(kuò)增的模板是使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(目錄號(hào)#A1125，Promega)分離自 ZW658 (ATCC#PTA-7858)的基因組 DNA。引物 C(SEQ ID NO 16)TCACTCATRRCCRRCCGGGATATCAGCTTGCATGCTC引物 D (SEQ ID NO 17)CATCTTACTrrrrcrrcrrccGATATGCTGCCTTCCGAAGTG引物C(正向引物)的用下劃線標(biāo)示的堿基在himA開(kāi)放閱讀框的5’末端與運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌屬基因組的核苷酸1138510-1138530雜交，而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5’末端 的FseI位點(diǎn)。引物D(反向引物)的用下劃線標(biāo)示的堿基在推測(cè)編碼雙組分響應(yīng)調(diào)節(jié)子的 基因的3，末端與himA基因的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬基因組上游的核苷酸1139668-1139648雜 交(Seo等人，Nat. Biotechnol. 23(1) ,63-68(2005))，而小寫字母對(duì)應(yīng)于加到引物5，末端 的AscI位點(diǎn)。圖IOA顯示引物C和D的染色體結(jié)合位點(diǎn)以及生成的PCR產(chǎn)物(片段4)。 PCR產(chǎn)物用FseI和AscI進(jìn)行雙重消化，然后將所得1159bp的DNA片段通過(guò)1 %的瓊脂糖 凝膠純化。圖IOB示出上述四個(gè)DNA片段然后經(jīng)過(guò)4路連接反應(yīng)裝配成himA敲除構(gòu)建體 pHimA。該反應(yīng)使用的片段1-4的摩爾比為大約1 1 1 1。連接反應(yīng)混合物的等分試 樣通過(guò)電穿孔進(jìn)入大腸桿菌DHlOB中，并且將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于LB培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基包含 氨芐青霉素(lOOyg/mL)和奇放線菌素(lOOyg/mL)；平板在37°C下培養(yǎng)。包含具有正確尺寸插入序列的氨芐青霉素和奇放線菌素的雙抗轉(zhuǎn)化子最初通過(guò)菌落PCR，使用兩對(duì)不同 引物進(jìn)行鑒定引物A/引物B，和引物C/引物D。隨后用SbfI和AscI對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行限 制性消化分析和來(lái)自PCR陽(yáng)性克隆的pHimA質(zhì)粒DNA的DNA序列分析來(lái)確認(rèn)陽(yáng)性克隆。為了獲取轉(zhuǎn)化運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬所需的未經(jīng)甲基化的質(zhì)粒DNA，將pHimA導(dǎo)入大 腸桿菌SCSllO中(dcm-，dam-)，并且將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于LB培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基包含氨芐青 霉素(100yg/mL)和奇放線菌素(100 μ g/mL)；在37°C下生長(zhǎng)。用于該操縱的化學(xué)感受態(tài) 細(xì)胞獲取自Stratagene (目錄號(hào)200247)，并且按照制造商的規(guī)程進(jìn)行操作。重要的是注意 到使用未經(jīng)甲基化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化來(lái)源于ZM4的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬菌株是成功的關(guān)鍵，因 此分離自大腸桿菌野生型菌株的甲基化質(zhì)粒DNA (如DH10B)用于被宿主的抑制/修飾體系 破壞。在最后的步驟中，質(zhì)粒DNA分離自其中一個(gè)SCSllO轉(zhuǎn)化子，該分離方法使用QIAGEN Plasmid Maxi試劑盒(目錄號(hào)12162)，DNA終濃度是 2 μ g/mL。實(shí)施例6牛成801_4himA敲除突變體為了失活ZW801-4中的himA基因，基本如US 5，514，583所述使用電穿孔將未甲 基化的pHimA質(zhì)粒DNA(它不在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬中復(fù)制)導(dǎo)入ZW801-4中。簡(jiǎn)而言之， 50mL的轉(zhuǎn)化反應(yīng)包含在10% (ν/ν)甘油中的 IOltl種細(xì)胞/mL和 0. 5 μ g的未甲基化質(zhì) 粒DNA，該DNA如實(shí)施例5所述從大腸桿菌SSCllO中分離。對(duì)照反應(yīng)進(jìn)行相同處理，但是不 接受任何質(zhì)粒DNA。電穿孔儀的設(shè)置是1. 6kv/cm，200Q，25μ F，試管間隙寬度為0. Icm0在 電穿孔之后，轉(zhuǎn)化反應(yīng)用LOmL的MMG培養(yǎng)基稀釋(50g/L的葡萄糖，10g/L酵母的提取物， 5g/L 的蛋白胨，2. 5g/L 的(NH4)2SO4jO. 2g/L K2HPO4，和 ImM MgSO4)，并且允許細(xì)胞在 30°C下 恢復(fù) 3小時(shí)。然后在室溫下，在無(wú)菌的1.5mL微量離心管中離心收獲細(xì)胞(13，000Xg，5 分鐘)，小心地移除上清液。將細(xì)胞沉淀物重懸于200 μ 1的液體MMG培養(yǎng)基中，并且將細(xì) 胞懸浮液的25-、50_和IOOmL等分試樣置于MMG培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基包含1. 5%的瓊脂和 200 μ g/mL的奇放線菌素。平板在30°C的厭氧室中培養(yǎng)，在48-72小時(shí)后在所有試驗(yàn)平板 上有至少100種菌落。相反的是，對(duì)照反應(yīng)僅僅產(chǎn)生一種菌落，它在接種IOOmL細(xì)胞懸浮液 的平板上。選擇來(lái)源于用PHimA敲除構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的兩種抗奇放線菌素菌落厭氧如下所述的 進(jìn)一步操縱。在我們的實(shí)驗(yàn)室中以前用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌屬和類似于pHimA的自殺構(gòu)建體進(jìn)行 的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)揭示在染色體和質(zhì)粒DNA之間的初始相互作用是單交換事件，該事件發(fā)生在兩 種側(cè)接DNA序列的其中一種上，并且該單交換事件最終導(dǎo)致雙交換事件。雙交換事件的轉(zhuǎn) 變通常非常迅速，通常在液體或固體培養(yǎng)基的一系列轉(zhuǎn)移后發(fā)生，所述培養(yǎng)基包含自殺構(gòu) 建體的選擇性試劑，在這一事例中是奇放線菌素。為了有利于本發(fā)明的雙交換事件并且排 除單交換和雙交換事件獲得“混合種群”的可能性，將上述的兩個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)化子接種到MMG平 板上，該平板包含200mg/mL的奇放線菌素。在厭氧條件下，在33°C培養(yǎng)30小時(shí)后，通過(guò)將 細(xì)胞劃線接種在包含相同生長(zhǎng)培養(yǎng)基的新瓊脂板上，從兩片菌斑中分離單種菌落。在厭氧 條件下，在33°C培養(yǎng)30小時(shí)后，將來(lái)自每個(gè)初始初級(jí)轉(zhuǎn)化子的一種菌落接種到新MMG平板 上，該平板包含奇放線菌素(200 μ g/mL)，并且這兩種菌株如下所述進(jìn)行進(jìn)一步表征。使用三對(duì)不同的引物，使用菌落PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)雙交換事件不發(fā)生以及分離的每 種菌株由同系種群細(xì)胞組成。第一對(duì)引物是GTTCTGCGCCTGTTATTCTG(SEQ ID N0:18)和CTACCTCTGATAGTTGAGTCG (SEQ ID NO 19)，如果在自殺構(gòu)建體中的5，himA側(cè)接DNA與其染 色體副本發(fā)生單交換事件的話，該引物對(duì)僅能生成尺寸正確的PCR產(chǎn)物。同樣地，第二對(duì)引 物是GATATTCCAGTGCTGATCGAC(SEQ ID NO :20)和 CTACGTGAMGGCGAGATCAC(SEQ ID NO 21), 如果在自殺構(gòu)建體中的3’himA側(cè)接DNA與其染色體副本發(fā)生單交換事件的話，該引物對(duì)僅 能生成尺寸正確的PCR產(chǎn)物。最后，第三對(duì)引物是GATCAGGTAGGTGTGCTCTA(SEQ ID NO 22) 和GCATCAGAGAGCATACTGCT (SEQ ID NO 23)，如果在正確位點(diǎn)發(fā)生雙交換事件的話，該引物 對(duì)僅能生成尺寸正確的PCR產(chǎn)物。如果它們也以污染物形式存在的話，這對(duì)引物也能檢測(cè) 痕量未中斷的himA基因拷貝和/或單交換事件。因?yàn)槭軝z查的兩種himA敲除突變體用三 組不同引物產(chǎn)生期望的結(jié)果，并且結(jié)果是不能區(qū)分的，僅僅選擇它們中的一組進(jìn)行進(jìn)一步 表征。這一菌株下文稱為“Z801-4: AhimA”。實(shí)施例7himA基因滅活單獨(dú)導(dǎo)致AcR#3表型圖11示出了使用控制pH的生物反應(yīng)器，在100% MH中進(jìn)行的并列型ZW801-4和 ZW801-4: AhimA的比較。種子培養(yǎng)物在30°C下在SM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至OD6tltl為 4. 4，并 且用10%的種菌開(kāi)啟生物反應(yīng)器。最終的150mL培養(yǎng)物包含100% MH加上110g/L葡萄糖 和90g/L木糖。在150rpm下攪拌，分別將pH保持在5. 8，將溫度保持在33°C。在不同時(shí)間 從生物反應(yīng)器中取出等分試樣用于發(fā)酵肉湯的HPLC分析，該分析使用的方法如實(shí)施例2所 述。注意這些條件是與用于AcR#3和ZW801-4實(shí)驗(yàn)的確切相同的實(shí)驗(yàn)條件，如圖8和表2 所示(實(shí)施例4)。圖11給出的結(jié)果顯示21801-4::八}1111^(圖118)比 ZW801-4(圖 11A)在 100% MH中表現(xiàn)更好。經(jīng)過(guò)48小時(shí)，它已經(jīng)使用了生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的所有葡萄糖和木糖并生成 90g/L的乙醇。與之相反，親本菌株ZW801-4未使用所有的糖，并且在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诘陌l(fā)酵肉湯 中仍有 17g/L的殘余木糖。ZW801-4的最終乙醇滴定量也顯著較低(81g/L)。因此，在方 法相關(guān)的條件下himA基因失活導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量提高約10%，這實(shí)際上與使用相同實(shí)驗(yàn)條件 的AcR#3獲得的結(jié)果相同。雖然這些結(jié)果有力地證明AcR#3和ZW801-4:: AhimA是等同的 菌株，重要的是測(cè)試它們?cè)诓⒘行蛯?shí)驗(yàn)中的性能。100% MH也用于該比較，但是葡萄糖和木 糖的初始濃度都提高了 10%，因?yàn)閮煞N菌株都能使用在較早實(shí)驗(yàn)中的所有糖。種子培養(yǎng)物在30°C下在SM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至0D_為 4. 5，并且用10%的種菌開(kāi) 啟生物反應(yīng)器。最終的150mL培養(yǎng)物包含100% MH加上118g/L葡萄糖和98g/L木糖。在 150rpm下攪拌，分別將pH保持在5. 8，將溫度保持在33°C。在不同時(shí)間從生物反應(yīng)器中取 出等分試樣用于發(fā)酵肉湯的HPLC分析，該分析使用的方法如實(shí)施例2所述。表3示出了兩 種菌株的葡萄糖、木糖、乙酸鹽、乙醇和生物質(zhì)產(chǎn)量的最終值(0D_)。表3 在控制PH的發(fā)酵罐中的葡萄糖、木糖、乙醇、和乙酸鹽的終點(diǎn)倌，其中 ZW801-4: Δ himA和AcR#3菌株在具有高糖的100%模擬水解產(chǎn)物中生長(zhǎng)。
菌株小時(shí)數(shù)OD600葡萄糖木糖乙酸鹽乙醇ZW801-4: ΔhimA00. 48118. 298. 410. 03. 9 這一實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明himA基因失活單獨(dú)導(dǎo)致發(fā)酵性能改善，因?yàn)?ZW801-4: AhimA和AcR#3在測(cè)試系統(tǒng)中表現(xiàn)相同。當(dāng)使用與圖5所示實(shí)驗(yàn)相同的條件測(cè) 試這兩種菌株的乙酸鹽抗性時(shí)，它們也是無(wú)法區(qū)別的(圖12)。在AcR#3的himA基因中的 整合Pgap啟動(dòng)子和菌株經(jīng)受的延長(zhǎng)的突變體富集過(guò)程明顯地僅對(duì)所期望的himA表型具有 較小效應(yīng)或無(wú)效應(yīng)。
權(quán)利要求
從包含木糖的混合糖培養(yǎng)基生產(chǎn)乙醇的方法，所述方法包括(a)提供能夠利用木糖生產(chǎn)乙醇的重組發(fā)酵單胞菌屬菌株，所述菌株包含至少一種減少整合宿主因子α亞基蛋白(HimA)的表達(dá)的基因修飾；和(b)在包含木糖的混合糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述(a)的菌株，由此所述菌株利用木糖作為碳源來(lái)生產(chǎn)乙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)是在培養(yǎng)基中，在約25°C至約40°C的溫度范圍內(nèi) 進(jìn)行的，PH范圍介于約4. 5和7. 5之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述溫度介于約30°C和37°C之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述pH介于約5.8和7. 0之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述基因修飾是himA基因的修飾，所述修飾選自插入、 去除、突變、共抑制、和反義RNA表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述基因修飾使得所述himA基因不具備功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述基因修飾是通過(guò)同源重組導(dǎo)入所述himA基因中的 插入。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述重組發(fā)酵單胞菌屬菌株是ZW801-4: AhimA或菌 株AcR#3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含乙酸鹽，并且其中所述重組發(fā)酵單 胞菌屬菌株與其親本發(fā)酵單胞菌屬菌株相比生產(chǎn)的乙醇量提高，所述親本發(fā)酵單胞菌屬菌 株不發(fā)生減少himA表達(dá)的基因修飾。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述乙醇產(chǎn)量提高是由于所述發(fā)酵單胞菌屬菌株的乙酸 鹽抗性。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少約120g/L的混合糖，所述混合糖包含 木糖、糖醇、和至少約6g/L的乙酸鹽，所述糖醇選自山梨醇、甘露糖醇、半乳糖醇、核糖醇、 以及它們的混合物，其終濃度介于約2mM和約IOOmM之間。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述糖醇的濃度介于約5mM和約20mM之間。
全文摘要
通過(guò)篩選發(fā)酵單胞菌屬突變體文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)himA基因涉及乙酸鹽對(duì)發(fā)酵單胞菌屬性能的抑制效應(yīng)。將利用木糖的發(fā)酵單胞菌屬菌株進(jìn)一步工程化以減少himA基因的活性，發(fā)現(xiàn)其當(dāng)在包含木糖尤其是在存在乙酸鹽的混合糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，與親本菌株相比乙醇產(chǎn)量提高。
文檔編號(hào)C12P7/06GK101883861SQ200880113773
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者K·克諾克, L·陶, M·A·弗蘭登, M·張, P·G·凱米, P·V·維塔寧, Y·張, Y-C·仇 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司;可持續(xù)能源聯(lián)盟有限責(zé)任公司