專利名稱：從人臍帶分離和保存前體細(xì)胞的優(yōu)化且確定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人臍帶分離和保存前體細(xì)胞的優(yōu)化且確定的方法。本發(fā)明中的“前提細(xì)胞”指能夠在表面和確定的生長培養(yǎng)基中粘附和擴(kuò)展/增殖 的一類細(xì)胞，其中培養(yǎng)物中的大部分細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶44、⑶73、⑶90和⑶105， 且大部分細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶14、⑶31、⑶34和⑶45的僅殘量表達(dá)，其中大部分 細(xì)胞能夠經(jīng)歷至18次擴(kuò)展/增殖期，保持約1. 7/24小時(shí)的恒定的翻倍因數(shù)，恒定的成纖維 細(xì)胞樣形態(tài)，及部分或終端分化為特定細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞 和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞)的能力。本發(fā)明的目標(biāo)給現(xiàn)有技術(shù)添加了穩(wěn)健的方法，其允許有關(guān)組織樣品加工的100% 的效力，且有關(guān)從每臍帶質(zhì)量分離的干細(xì)胞數(shù)及消耗時(shí)間的效力。作為本發(fā)明的基礎(chǔ)的技術(shù)革新基本上構(gòu)成為將細(xì)胞分離過程分為三個(gè)獨(dú)立的細(xì) 胞回收階段，及沿流程優(yōu)化多個(gè)技術(shù)參數(shù)。所述參數(shù)遠(yuǎn)未被現(xiàn)有技術(shù)所提及或定義。所述三階段回收方法基于從三個(gè)不同獨(dú)立來源隨分離過程解離的細(xì)胞的依次回 收階段1 回收能夠粘附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面的第一組細(xì)胞，在所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn) 行消化反應(yīng)。粘附在消化溫育期過后隨即發(fā)生，所述瓶仍保持水平位置，室溫下30分鐘，且 仍在消化溶液存在下。在培養(yǎng)條件下溫育所述粘附細(xì)胞，且使所述細(xì)胞經(jīng)歷擴(kuò)展和增殖至 匯合率接近100% ；階段2 階段1后，從通過離心所述消化溶液所得上清中回收第二組細(xì)胞。然后使 這些細(xì)胞在培養(yǎng)條件下溫育，并將能夠粘附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面的細(xì)胞經(jīng)歷擴(kuò)展和增殖至匯 合率接近100% ；階段3 從通過離心階段2所得沉淀中回收第三組細(xì)胞?？刹唤?jīng)粘附、擴(kuò)展和增殖 而將這些細(xì)胞冷凍保存。有關(guān)隨流程優(yōu)化的技術(shù)參數(shù)，這些是1.機(jī)械操作類型和初始臍帶條段尺寸，2.臍帶血管中有無血塊，3.酶的類型、單獨(dú)或組合作用、及消化溶液中酶的濃度，4.消化溶液的組成，5.消化反應(yīng)期間的pH變化，6.溫育時(shí)期/時(shí)間，7.攪拌類型(緩和或劇烈)，8.溫育氣氛類型(干或濕)，及9.冷凍保存期間的細(xì)胞密度。用于解離細(xì)胞回收的三階段方法與上述技術(shù)方面的優(yōu)化的組合產(chǎn)生了與在細(xì)胞 治療(基于細(xì)胞施用)中的用途更一致的方法。這是由于方法的穩(wěn)健性(100%效力)及由 于在相對(duì)短的時(shí)間段內(nèi)得到的高細(xì)胞產(chǎn)量。而且，還優(yōu)化了冷凍保存的方法，以最大化用于將來使用的細(xì)胞活力用新建立的方法可能在9天內(nèi)，在直接冷凍細(xì)胞條段后，且在大部分細(xì)胞兩次獨(dú) 立的單階段離體粘附和擴(kuò)展/增殖(P0末)后，從100%的經(jīng)處理臍帶樣品中得到相比現(xiàn) 有技術(shù)空前的約8. 6 (士0. 1) X 105細(xì)胞/克經(jīng)處理臍帶的產(chǎn)量。所述效力代表可從一個(gè)臍 帶(平均35cm長)得到共3.0X109細(xì)胞的可能性。相反，所述細(xì)胞的特征使得在35天內(nèi) (P6末)，用5. 0 X 105細(xì)胞/cm2恒定接種物經(jīng)6次傳代，從100%的經(jīng)處理臍帶條段中得到 例如平均7. 7X1015細(xì)胞。最后，所述效力代表用現(xiàn)有技術(shù)中已存在的相似流程得到相同細(xì) 胞數(shù)所需時(shí)間減少約56%。根據(jù)早先所述，為用相同的初始接種物得到接近1.0X1015細(xì) 胞的數(shù)量，最少需要 80 天(Harris et al.，2006 ；Can 禾口 Karahuseyinoglu，2007)。盡管專門開發(fā)用于細(xì)胞治療，所述新方法也適合用于創(chuàng)建的細(xì)胞庫，所述細(xì)胞 庫 待用于基因治療方案， 待成為藥理學(xué)和化妝組合物的基礎(chǔ)， 待產(chǎn)生細(xì)胞，所述細(xì)胞■用于生產(chǎn)分子或分子成分，■用于生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)支持用細(xì)胞層，及■用于通過基因操作生產(chǎn)細(xì)胞系。
背景技術(shù)：
前體細(xì)胞(干細(xì)胞、生殖細(xì)胞、未分化細(xì)胞、或原始細(xì)胞)是一類在顯著期間具有 自我再生能力，尤其是具有部分或終端分化為其他更特化的細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞。盡管胚胎前體細(xì)胞的巨大分化潛能，但它們在研究或/和治療應(yīng)用是有爭議的， 且已引起了嚴(yán)重的倫理學(xué)和安全問題。因此，此領(lǐng)域的研究已聚焦于替代性的非胚胎干細(xì) 胞(例如從骨髓、骨膜、骨小梁、脂肪組織、滑膜區(qū)域、骨骼肌、乳牙髓和終牙(definitive teeth)髓、及嗅粘膜得到的細(xì)胞)的鑒定和評(píng)估(Barry and Murphy, 2004 ； Roisen et al.，2001)。已證實(shí)從這些組織中分離的細(xì)胞有能力體外及體內(nèi)分化為尤其是軟骨細(xì)胞、 脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、星形細(xì)胞和肌腱細(xì)胞(tenocyte) (Carvalhal et al. ,2007 ；Majumdar et al.，1998 和 Pittenger et al.，1999)。所述分離自非胚胎來源， 且能夠分化為非造血特化細(xì)胞，源自三胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的前體細(xì)胞被稱為 間質(zhì)干細(xì)胞。利用間質(zhì)前體細(xì)胞的主要限制在臨床實(shí)踐期間(即細(xì)胞收獲期間)發(fā)生。收集間 質(zhì)細(xì)胞一定涉及對(duì)供體的侵入性方法(如手術(shù)操作(例如，從骨髓收集干細(xì)胞)，其甚至涉 及全身麻醉)。而且，由于間質(zhì)干細(xì)胞稀少，最終所得細(xì)胞數(shù)一般低。作為替代，臍帶組織已被描述為可能的成體前體細(xì)胞來源(Romanov et al., 2003)。例如，臍帶血已知是前體細(xì)胞的豐富來源，但主要是造血性質(zhì)的(血譜系)。因?yàn)殚g 質(zhì)干細(xì)胞以有限數(shù)量存在于臍帶血中，從該組織中分離這些細(xì)胞的嘗試受阻，并且，甚至是 使用甚高量血液的最成功的嘗試，相對(duì)經(jīng)處理組織樣品總數(shù)，也未超過60%的成功率。懷疑 終究仍在有關(guān)所分離細(xì)胞的來源上；即細(xì)胞來源是否真的是血液，或是胎兒組織(Chul-Wan et al.，2003 ；Bieback et al.，2004)。
其他報(bào)道描述了從其他間質(zhì)特性比臍帶血顯著更豐富臍帶組成組織中分離間質(zhì) 干細(xì)胞。這些方法中的一些例子基于臍帶基質(zhì)(也被稱為臍帶膠質(zhì)(Wharton’ s jelly) (Purchio et al.,1998 ；Mitchell et al. ,2003 ；Davies et al.,2004 ；Wang et al., 2006))、臍帶靜脈(Romanovet al.，2003 ；Auger et al. ,2005)、動(dòng)脈組織(Kadner et al.， 2004)、或其他襯組織(如羊膜(Phan et al.，2004))。詳細(xì)分析揭示，所述方案要么這樣要么那樣受限于所得細(xì)胞的特性，或所分離細(xì) 胞數(shù)方面的成功率和效率相當(dāng)不確定。實(shí)際上，這些方案的限制性特點(diǎn)必然導(dǎo)致所分離細(xì) 胞群的表型多樣性的喪失，主要由于不必要的聚焦于臍帶組織結(jié)構(gòu)內(nèi)的特定組織或幾何位 置。而且，最終可得到的實(shí)際干細(xì)胞數(shù)必然不確定。 因此，例如細(xì)胞研究公司提出方案，其僅基于羊膜為間質(zhì)干細(xì)胞來源，衍化出的細(xì) 胞已保藏為內(nèi)皮細(xì)胞系(Phan et al.，2004)。此外，至今所報(bào)道的方法中尚無表現(xiàn)出成功的經(jīng)處理組織樣品數(shù)方面的效力，以 足以可靠應(yīng)用于細(xì)胞治療方案。換言之，盡管從臍帶基質(zhì)分離間質(zhì)細(xì)胞的成功率高于從臍 帶血(或甚至骨髓)分離間質(zhì)細(xì)胞的成功率，但至今尚無方法保證經(jīng)處理組織樣品數(shù)方面 的100%的分離成功率，以使最終結(jié)果足以穩(wěn)健而用于細(xì)胞治療(Deryl和Weiss，2008)。而且，導(dǎo)入不必要的結(jié)構(gòu)操作步驟(如提取臍帶血管(Purchio etal. , 1998 ； Mitchell et al. ,2003 ；Davies et al. ,2004 ；Wang et al.，2006)、機(jī)械浸漬(Seyda et al.，2006))使得已有方案難以標(biāo)準(zhǔn)化和重現(xiàn)，更無法保證用于細(xì)胞治療的足夠的細(xì)胞數(shù)。而且，過度組織操作誘導(dǎo)不期望(如果期望保持前體細(xì)胞表型)的細(xì)胞分化 (Gardner et al.，2000 ；Claes et al.，2002 ；Cullinane et al.，2003)。基于臍帶血管本身的方案也顯示出局限性，這些方案涉及復(fù)雜的動(dòng)脈或臍帶靜 脈提取，并將間質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能限制于內(nèi)皮下和內(nèi)皮細(xì)胞系(Romanov et al. ,2003 ； Auger et al. , 2005 ；Kadner et al. , 2004 ；Sarugaser et al. ,2005)。最后，不欠復(fù)雜的是基于臍帶膠質(zhì)(Wharton’ s jelly) (WJ)為間質(zhì)干細(xì)胞來源的 方案。這些報(bào)道不一致，也缺乏應(yīng)用方法學(xué)的定義和標(biāo)準(zhǔn)。因此，當(dāng)Purchio et al.，1998、 Mitchell et al.，2003 JPWanget al.，2006進(jìn)行復(fù)雜且難以重現(xiàn)的最初血管提取，處理留 存的組織用于細(xì)胞分離；Davies et al.，2004也移出臍帶血管，但相比使用留存的組織，他 們處理了仍連接在血管周圍的組織用于細(xì)胞分離，丟棄了第一種方案。不僅如此，所有作者 都異口同聲地肯定他們的方案基于僅WJ (Purchio et al. ,1998 ；Mitchell et al. ,2003 ； Davies et al. ,2004 ；Wang et al.，2006)。這些方法之間的差異無法分辨，且這兩種方案 中的既存組織的過度組織操作發(fā)掘隊(duì)前體表型維持的期望的影響，并威脅到通常群分離和 冷凍保存服務(wù)中分離的前體細(xì)胞的利用。現(xiàn)有技術(shù)中明顯漏掉了基于簡單、穩(wěn)健和確定的方案的方法，以使保證效力和效 率的重現(xiàn)。只要間質(zhì)干細(xì)胞可應(yīng)用于細(xì)胞治療，有必要向患者保證用于細(xì)胞分離的方法會(huì) 提供治療劑必要的質(zhì)量和數(shù)量。既然至今現(xiàn)有技術(shù)所述的方案缺乏保證，預(yù)期本發(fā)明會(huì)緩 解對(duì)具有上述特征的方法的需求。發(fā)明概述本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)增添具有特定間質(zhì)特征的從人臍帶分離的前體細(xì)胞的 篩選方法，所述方法基于通過特殊消化膠原(臍帶基質(zhì)(Wharton’ s jelly)的支持物質(zhì))的篩選策略。細(xì)胞釋放無需初始組織的機(jī)械操作即發(fā)生，保證了原細(xì)胞表型完整，且保持細(xì)胞活力。本發(fā)明中所述“機(jī)械操作”指浸漬和/或破碎臍帶的羊膜下、血管間、和血管周圍區(qū) 中的任意組織；及/或提取臍帶血管；及/或任意其他可干擾穩(wěn)定性，及由此干擾存在于臍 帶基質(zhì)(Wharton’ s jelly)中的表型和活力的機(jī)械作用，除缺去機(jī)械操作外，導(dǎo)入三個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞回收解離階段及沿過程的多個(gè)技術(shù)參數(shù) 的優(yōu)化使所述方法變得簡單、穩(wěn)健、在效力方面100%可靠，且在隨著時(shí)間所得細(xì)胞數(shù)方面 高效。結(jié)果，所述方法可應(yīng)用于細(xì)胞治療服務(wù)，及對(duì)分離所得間質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存(用于 將來使用)。根據(jù)導(dǎo)入各參數(shù)后所得總細(xì)胞產(chǎn)量評(píng)估導(dǎo)入用于細(xì)胞分離的依次的三階段過程 和優(yōu)化個(gè)技術(shù)特征(現(xiàn)有技術(shù)遠(yuǎn)未提及或以不確定的方式描述)的結(jié)果?？偧?xì)胞產(chǎn)量對(duì)應(yīng) 于在液氮汽相中直接冷凍而未經(jīng)歷粘附和擴(kuò)展/增殖期的小細(xì)胞部分，加上兩組之前從組 織消化隨即的第一粘附篩選階段和消化產(chǎn)物離心隨即的第二粘附階段分離的細(xì)胞。所述兩 組經(jīng)歷一個(gè)階段的粘附和擴(kuò)展/增殖，且一旦對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)物在任何傳代(P0末)前達(dá)到最 大匯合率就冷凍。本發(fā)明中所述“傳代(P)”指由于粘附細(xì)胞在確定的生長培養(yǎng)基中擴(kuò)展/增殖， 為同時(shí)增加粘附和擴(kuò)展表面、及生長培養(yǎng)基的總體積，通過在粘附細(xì)胞達(dá)到在生長表面接 近100%的匯合率(細(xì)胞密度)后，用胰蛋白酶消化所述粘附細(xì)胞來進(jìn)行重接種，以啟動(dòng)新 的擴(kuò)展/增殖期。本發(fā)明中所述“最大匯合率”指培養(yǎng)支持物的生長表面被單層細(xì)胞均勻覆蓋。包括三階段方法的3個(gè)依次的回收階段是階段1 在消化溶液仍存在的情況下回收能夠粘附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面的第一組細(xì) 胞，在所述細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行消化反應(yīng)。階段2 從消化溶液的離心回收能夠在由上清和培養(yǎng)基組成的溶液中粘附于另一 細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面的第二組細(xì)胞。階段3 從通過離心階段2所得沉淀中回收第三組細(xì)胞。所述細(xì)胞無需粘附和擴(kuò) 展/增殖而直接冷凍。所優(yōu)化的技術(shù)參數(shù)是1.消化溶液中的待用初始組織條段尺寸，保持組織質(zhì)量(g)、瓶底表面積(cm2)、消 化體積(ml)、和總瓶體積(ml)之間的約1 2 2 37的恒定比例，考慮到Icm人臍帶條 段的重量約lg。在除去羊膜后，測試了幾種類型的分段方法低(5cm條段)、中(2. 5cm條 段)、高(0.3cm條段)、和組織糜。在解剖刀的輔助下進(jìn)行全部分段，并用實(shí)際上同一條件 處理樣品。得出，當(dāng)使用2. 5cm條段時(shí)得到最佳產(chǎn)量(在PO末的總細(xì)胞/臍帶質(zhì)量/時(shí)間 方面)。2.組織血管(1個(gè)靜脈和2個(gè)動(dòng)脈)內(nèi)血塊的有無已知紅細(xì)胞裂解有毒性，降低 細(xì)胞的體外活力。因此，在進(jìn)行消化時(shí)，在有無血塊的情況下比較了細(xì)胞產(chǎn)量。對(duì)于后者，用 解剖刀在血管中縱切，以制作待去除所述塊的孔。得出，血塊對(duì)總細(xì)胞產(chǎn)量具有負(fù)面影響。3.酶的性質(zhì)、濃度和在組織消化步驟中使用的酶的單獨(dú)或組合作用在培養(yǎng)基存 在下，細(xì)胞直接粘附于培養(yǎng)瓶，無消化，且因此在缺少酶的情況下；用單種酶解離組織測試了 0. 075% (w/v)膠原酶II或2. 0% (w/v)鏈霉蛋白酶。因?yàn)閮H利用膠原酶II是最有 效的方法，就將此酶與其他酶組合，尤其與0. 125% (w/v)胰蛋白酶(在有無0. 260mM EDTA 的情況下)組合、與僅0. 5% (w/v)透明質(zhì)酸酶組合、且與0. 5% (w/v)透明質(zhì)酸酶和2. 0% (w/v)鏈霉蛋白酶的組合組合。通過0.075% (w/v)膠原酶II與0. 125% (w/v)胰蛋白酶 的組合作用得到最佳產(chǎn)量(在PO末的總細(xì)胞/臍帶質(zhì)量/時(shí)間方面)。此外，當(dāng)改變膠原 酶II的濃度(0. 0375%、0. 075%和0. 15% w/v)時(shí)，保持胰蛋白酶濃度0. 125% (w/v)，在 0. 260mM EDTA的存在下，證實(shí)，0.075% (w/v)的膠原酶II濃度提供最佳結(jié)果，保持之前優(yōu) 化的條件恒定。
4.消化溶液的成分測試了幾種酶消化溶液的成分，即補(bǔ)充有20% FBS和 青霉素/鏈霉素的α -Mem ；補(bǔ)充有EDTA (更具體為186mg/ml CaCl2 · 2H20、400mg/ml KCl、60mg/ml KH2P04、200mg/mlMgS04 · 7H20、8000mg/ml NaCl、350mg/ml NaHC03、90mg/ mlNaH2P04 ·7Η20、lOOOmg/ml 葡萄糖和 76mg/ml (0. 260mM) EDTA)的鹽緩沖溶液(如 HBSS)；補(bǔ) 充有5mM CaCl2的前述HBSS溶液；補(bǔ)充有5mM CaCl2的25mM HEPES緩沖液。補(bǔ)充有0. 260mM EDTA的鹽緩沖溶液(HBSS)產(chǎn)生最佳產(chǎn)量。5.監(jiān)控消化反應(yīng)期間pH變化隨著消化過程監(jiān)控pH，觀察到培養(yǎng)基的酸化。平 均情況為，當(dāng)使用0. 075% (w/v)的膠原酶II與0. 125% (w/v)胰蛋白酶的組合作用時(shí)，在 補(bǔ)充有0. 260mM EDTA的漢克斯鹽溶液(HBSS)中，初始pH為7. 2，在4小時(shí)溫育后降低至 6. 4，在16小時(shí)后降低至5. 9。培養(yǎng)基酸化可解釋為在長期培養(yǎng)(16小時(shí))中細(xì)胞分離缺乏 效率。盡管長期培養(yǎng)后消化會(huì)更完全，但培養(yǎng)基酸化會(huì)開始有害于細(xì)胞活力。溶液pH因此 被考慮為計(jì)算溫育時(shí)間時(shí)的參數(shù)，且決不能低于6. 4，此pH以下將有害于所述方法的有效 性(如通過對(duì)可分離的活細(xì)胞的計(jì)數(shù)所確定)。盡管在16小時(shí)時(shí)觀察到更完全的消化，發(fā) 現(xiàn)更長的時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力具有負(fù)面影響，并導(dǎo)致培養(yǎng)基顯著酸化。6.消化反應(yīng)的溫育時(shí)期/時(shí)間測試了幾個(gè)溫育時(shí)間(2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、和
16小時(shí))。得出，4小時(shí)溫育時(shí)間產(chǎn)生最佳產(chǎn)量。7.消化反應(yīng)溫育期間的振蕩類型(溫和或劇烈)用溫和或劇烈振蕩速率定軌振 蕩水浴來進(jìn)行溫育，所述振蕩速率分別由100振蕩/分鐘(opm)和140振蕩/分鐘(opm) 組成。IOOopm的溫和振蕩導(dǎo)致在細(xì)胞產(chǎn)量方面更佳的結(jié)果。8.酶消化的溫育氣氛(干或濕)于37°C在兩種環(huán)境下進(jìn)行溫育干或濕。為此 測試，在浸漬的定軌振蕩器(其中熱交換通過水和飽和空氣發(fā)生)中或在干室(其中熱交 換通過干空氣發(fā)生)中平行處理組織樣品。在干室中溫育導(dǎo)致更佳的細(xì)胞產(chǎn)量。9.在經(jīng)歷一個(gè)階段粘附和擴(kuò)展/增殖后細(xì)胞冷凍保存效率中細(xì)胞密度的影響在 PO末，在液氮汽相中以不同密度(細(xì)胞/ml)，在由10% 二甲基亞砜(DMSO)和90%胎牛血 清(FBS)組成的溶液中冷凍Iml細(xì)胞懸液。測定了解凍后各條件下的細(xì)胞活力(活細(xì)胞/ 總細(xì)胞)和細(xì)胞恢復(fù)(解凍后計(jì)數(shù)的活細(xì)胞/冷凍保存前計(jì)數(shù)的活細(xì)胞)。所得結(jié)果顯示 3X IO6細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度最可能保證冷凍保存后所測試條件下活細(xì)胞的適當(dāng)保持和恢
Μ. ο一般而言，假定上述優(yōu)化，本發(fā)明基于從人臍帶分離細(xì)胞的篩選方法，其中各臍帶 的血被除去，并被運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室含葡萄糖和抗生素的鹽緩沖液中，始終在無菌環(huán)境中，如在 48小時(shí)內(nèi)處理，則優(yōu)選在室溫下。對(duì)于更長時(shí)間儲(chǔ)存，則可推薦2°C 8°C之間的溫度。
下列步驟(包括處理臍帶及分離前體細(xì)胞)在無菌條件下，在豎通層流通風(fēng)櫥室 (vertical flux laminar flow hood chamber)中進(jìn)行。首先，剝離羊膜，且用新鹽溶液洗滌臍帶，其中所述羊膜為襯結(jié)構(gòu)，所述羊膜已在 組織收集期間與空氣接觸，并因此更易被微生物污染。一般而言，為分離期望前體細(xì)胞，所述方法始于以確定尺寸分段，所述尺寸源于優(yōu) 化的組織分段，其不涉及組織的機(jī)械操作，如可應(yīng)用，包括任意提取除臍帶內(nèi)的血塊之外的 器官的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
從臍帶組織釋放細(xì)胞受針對(duì)臍帶基質(zhì)的酶消化促進(jìn)，遵守組織質(zhì)量(g)、附 著組織消化瓶表面(cm2)、消化溶液體積(ml)、和消化瓶總體積(ml)之間已建立的約 1:2:2: 37的比例關(guān)系；考慮Icm臍帶條段平均重lg。為用酶消化處理，使用酶的特定組合，以特定濃度，在確定組成的溶液中，在溫育 期間，以特定最小PH，及振蕩類型和溫育氣氛也特選。解離細(xì)胞的回收在3個(gè)階段進(jìn)行，其中第一階段回收一組能夠粘附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶 (在其中進(jìn)行組織消化反應(yīng))表面的細(xì)胞。粘附在消化溫育期過后隨即發(fā)生，于室溫下使瓶 仍保持水平位置站立10 120分鐘之間，優(yōu)選30分鐘。在第二階段，在階段1后，從消化 溶液離心得到的上清中回收新的一組細(xì)胞。在階段1和2中，將細(xì)胞在培養(yǎng)條件下溫育，能 夠粘附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面的細(xì)胞經(jīng)歷一個(gè)階段的擴(kuò)展/增殖至達(dá)到近100%的匯合率。最 后在步驟3，從階段2中離心得到的沉淀中回收一組細(xì)胞，并不經(jīng)歷任何輪的粘附和擴(kuò)展/ 增殖而直接冷凍保存。優(yōu)化依次細(xì)胞回收及全部其他上述優(yōu)化因素，由此所述方法在所選和所分離細(xì)胞 數(shù)方面表現(xiàn)出100%效力和最高效率。反過來，得到的細(xì)胞群可通過細(xì)胞能夠在表面和確 定的生長培養(yǎng)基中粘附和擴(kuò)展/增殖來鑒定，其中培養(yǎng)物中的大部分細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo) 記物⑶44、⑶73、⑶90和⑶105，且大部分細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶14、⑶31、⑶34和 CD45的僅殘量表達(dá)，其中大部分細(xì)胞能夠經(jīng)歷至18次擴(kuò)展/增殖期，保持約1. 7/24小時(shí)的 恒定的翻倍因數(shù)，恒定的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，及部分或終端分化為特定細(xì)胞(如成骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)的能力。此外，本發(fā)明涉及用于經(jīng)歷一輪粘附和擴(kuò)展/增殖的細(xì)胞的冷凍保存的細(xì)胞密度 (細(xì)胞/體積)的優(yōu)化，以有助于最大化將來使用的細(xì)胞活力方面的效率。用新方法可在直接冷凍細(xì)胞條段后，且在兩次獨(dú)立的離體粘附和擴(kuò)展/增殖期后 (P0末)，在9天內(nèi)，從每臍帶樣品中得到相比現(xiàn)有技術(shù)空前的約8. 6 (士0. 1) X IO5細(xì)胞/克 臍帶的產(chǎn)量。所述效力代表可從一個(gè)臍帶(回收后平均35cm長，約35g)得到共3.0X109 細(xì)胞的可能性。相反，因?yàn)樗蛛x的間質(zhì)干細(xì)胞一般表現(xiàn)出1.7/24小時(shí)的翻倍因數(shù)，在具 有175cm2的生長表面的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的7輪(6次傳代，P6)粘附和擴(kuò)展/增殖期間，使用 5. 0 X IO5細(xì)胞/cm2恒定接種物，可在35天內(nèi)得到平均7. 7 X IO15細(xì)胞。這代表用現(xiàn)有技術(shù)中 所述相似流程得到相同細(xì)胞數(shù)所需時(shí)間減少約56%，其中為用相同的5. OX IO5細(xì)胞/cm2的 初始接種物達(dá)到相同細(xì)胞數(shù)，需要80天(Harris et al.，2006 ；Canand Karahuseyinoglu, 2007)。盡管新方法被開發(fā)主要用于細(xì)胞治療方案，但其也適于其他方面，例如細(xì)胞儲(chǔ) 蓄、基因治療方案、藥物和化妝組合物、分子或分子化合物的生產(chǎn)、細(xì)胞培養(yǎng)支持用細(xì)胞層的生產(chǎn)、及通過基因操作的細(xì)胞系生產(chǎn)。附圖簡述

圖1 臍帶基質(zhì)衍生細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。細(xì)胞用連接于PE或FITC的抗 CD44(97%陽性細(xì)胞)、CD73(99%陽性細(xì)胞)、CD90(97%陽性細(xì)胞)和CD105(95%陽性細(xì) 胞)(均為間質(zhì)基底細(xì)胞的陽性標(biāo)記物)的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記。圖2:臍帶基質(zhì)衍生細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果。細(xì)胞用連接于PE或FITC的抗已知 為間質(zhì)細(xì)胞系的陰性標(biāo)記物的抗原(CD14(單核細(xì)胞系(< 陽性細(xì)胞))、CD34(特異于 造血細(xì)胞系(1.2%陽性細(xì)胞))、⑶31 (內(nèi)皮標(biāo)記物(1%陽性細(xì)胞))和⑶45(全白細(xì)胞標(biāo) 記物(1. 陽性細(xì)胞)))的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記。圖3 細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞粘附和擴(kuò)展/增殖后細(xì)胞冷凍保存效率的影響A 不同細(xì)胞密度的解凍后活力(活細(xì)胞/總細(xì)胞X 100% )。B 細(xì)胞恢復(fù)(解凍后回收的活細(xì)胞/初始冷凍活細(xì)胞數(shù))。用3 X 106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度得到所測條件(含1ml細(xì)胞懸液和0. 5ml液上空 間的1. 5ml無菌冷凍管)的最佳結(jié)果。圖4:體外擴(kuò)展解凍細(xì)胞。所觀察到的翻倍因數(shù)是1.7/24小時(shí)，近似于這些細(xì)胞 冷凍保存前的翻倍因數(shù)。在解凍后36小時(shí)觀察到80 90%的匯合率(24小時(shí)后更換培養(yǎng) 基)A 解凍后12小時(shí)(培養(yǎng)基更換前)的前體細(xì)胞。B :解凍后36小時(shí)的前體細(xì)胞(24 小時(shí)后進(jìn)行培養(yǎng)基更換)。標(biāo)尺100 u m。圖5 分離的前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。A 正常生長培養(yǎng)基中對(duì)照細(xì)胞(非分化細(xì)胞)的細(xì)胞形態(tài)。B 成骨分化將細(xì)胞接種于成骨分化培養(yǎng)基中，并保持3周，后用堿性磷酸酶染 色。C 脂肪形成分化將脂肪形成分化培養(yǎng)基加于完全匯合的細(xì)胞培養(yǎng)物上，且保持 細(xì)胞3周，后用油-0-紅染色。D 軟骨形成分化將細(xì)胞重懸，并在離心管中的軟骨形成分化培養(yǎng)基中保持4周。然后將細(xì)胞用阿辛藍(lán)和蘇木精染色。標(biāo)尺100iim。圖6 分離的前體細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。A 正常生長培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FBS和青霉素/鏈霉素的a -MEM)中對(duì)照 細(xì)胞(非分化細(xì)胞)的細(xì)胞形態(tài)。B 心肌形成分化后的細(xì)胞形態(tài)。C:用DAPI和抗肌鈣蛋白T (心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記物)的抗體標(biāo)記的對(duì)照細(xì)胞(非 分化細(xì)胞)。僅觀察到DAPI標(biāo)記的核。D 用DAPI和抗肌鈣蛋白T的抗體標(biāo)記的分化細(xì)胞?？杉嬗^察到DAPI標(biāo)記的核和 肌鈣蛋白T標(biāo)記的細(xì)胞骨架。圖7 分離的前體細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)細(xì)胞。A 正常生長培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10% FBS和1 %青霉素/鏈霉素的a -MEM)中對(duì)照 細(xì)胞(非分化細(xì)胞)的細(xì)胞形態(tài)。B 神經(jīng)膠質(zhì)/神經(jīng)分化后的細(xì)胞形態(tài)。C 用DAPI和抗0 -微管蛋白III (特異性神經(jīng)元蛋白)抗體標(biāo)記的對(duì)照細(xì)胞(非分化細(xì)胞)。僅觀察到DAPI標(biāo)記的核。D 用DAPI和抗0 -微管蛋白III抗體標(biāo)記的分化細(xì)胞?？杉嬗^察到DAPI標(biāo)記的 核和微管蛋白III標(biāo)記的細(xì)胞骨架。發(fā)明詳述在應(yīng)用所述方法前，應(yīng)從血中分離人臍帶，并于以下溫度在無菌閉合的受體中運(yùn) 輸至實(shí)驗(yàn)室設(shè)備， 所述溫度為■如果在收集后72小時(shí)的時(shí)期內(nèi)處理，則優(yōu)選為室溫，或■如果在收集后48 144小時(shí)的時(shí)期內(nèi)處理，則為2 8°C，優(yōu)選為4°C ； 所述收集為不用或優(yōu)選用無菌鹽溶液收集，所述鹽溶液如HBSS ； 所述無菌閉合的受體是■干燥的，或■優(yōu)選被浸入含以下成分的無菌溶液中186 u g/mlCaCl2 2H20、400 u g/ml KC1、 60 u g/ml KH2P04、200 u g/mlMgS04 7H20、8000 u g/ml NaCl、350 u g/ml NaHC03、90 u g/ mlNaH2P04 7H20,2000 u g/ml葡萄糖、及青霉素和鏈霉素的等摩爾混合物；所述鹽溶液可補(bǔ)充有營養(yǎng)物和抗生素，例如lg/1葡萄糖、100U/ml青霉素和 100 u g/ml鏈霉素。所述方法應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行，所述無菌環(huán)境如層流通風(fēng)櫥內(nèi)。用漢克斯鹽緩沖 溶液(HBSS)洗滌臍帶3次，并在無菌鑷子的輔助下去除臍帶周圍的羊膜。然后在解剖刀的輔助下將所述臍帶橫向分段為約2. 5cm的條段。考慮到人臍帶的 平均密度(接近lg/cm)，各條段對(duì)應(yīng)約2. 5g的組織。如果這些條段中存在血塊，則應(yīng)在解剖刀的輔助下去除。在下列步驟中，各自處理 各組7個(gè)2. 5g無血塊的條段。通過解離各組7個(gè)條段來得到細(xì)胞，所述解離在無菌且密封的含緩沖pH的消化 溶液的瓶中，通過濃度0. 075% (重量/總消化體積)的膠原酶II與濃度0. 125% (重量 /總消化體積)的胰蛋白酶的組合作用來進(jìn)行，保持組織質(zhì)量、瓶底表面積、消化體積、和總 瓶體積之間的約1 2 2 37的恒定比例，且其中所述瓶在確定的溫育時(shí)間、溫度、加熱 環(huán)境、環(huán)境濕度和攪拌條件下溫育；更具體地， 從一組7個(gè)各約2. 5cm(2. 5g)的臍帶條段開始，從血塊中游離出； 使用35ml的消化溶液體積； 在不通氣且閉合的培養(yǎng)瓶中，所述不通氣且閉合的培養(yǎng)瓶如總體積650ml的 T175，且消化期間615ml的液上空間減去消化物下7個(gè)條段的浸沒體積； 其中所述消化溶液除酶外，由下列成分組成186 u g/mlCaCl2 2H20、400 u g/ml KC1、60 u g/ml KH2P04、200 u g/mlMgS04 7H20、8000 u g/ml NaCl、350 u g/ml NaHC03、90 u g/ mlNaH2P04 7H20、1000 u g/ml 葡萄糖、禾口 76 u g/ml (0. 260mM) EDTA ； 保持pH為6. 4或更高；且 其中所述酶反應(yīng)于37°C恒定溫度下在閉合干燥的溫育箱中在100振蕩/分鐘 (opm)的恒定速率攪拌下溫育4小時(shí)。
以三個(gè)階段(三階段法)進(jìn)行從組織解離得到的細(xì)胞的回收。在第一階段，從解離組織回收細(xì)胞，更具體通過于室溫下在發(fā)生消化的瓶中靜置 水平溫育5 300分鐘(優(yōu)選30分鐘)的時(shí)間來回收細(xì)胞。將消化上清通過用移液器移 溶液來轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，避免吸出任何未消化組織。除去全部未消化組織。這里，向 所述消化瓶中加入35ml體積的補(bǔ)充有脫氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10% 胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述不通氣的瓶蓋替換為含通氣蓋的濾膜，并于37°C下在 含7% C02的濕潤氣氛中溫育。應(yīng)每72小時(shí)更換總培養(yǎng)基，以促進(jìn)水平溫育期(篩選期) 間粘附的細(xì)胞生長，至達(dá)到最大表面匯合率。在第二回收階段，通過于室溫下對(duì)所述50ml離心管中的消化上清以350g離心10 分鐘來回收細(xì)胞。在離心后，將35ml上清轉(zhuǎn)移到具有含通氣蓋的濾膜的靜置培養(yǎng)瓶(T175)； 并加入35ml補(bǔ)充有脫氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10%胎牛血清(FBS)的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基。于37°C下在含7% C02的濕潤氣氛中溫育所述培養(yǎng)瓶，每72小時(shí)更換總培養(yǎng) 基，以促進(jìn)粘附和擴(kuò)展/增殖，至達(dá)到最大表面匯合率。從第一和第二階段回收的細(xì)胞群在第一輪粘附和擴(kuò)展/增殖(P0末)后冷凍保 存。這在于直接在0.5ml含期望總細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸液與相同體積的含10%二甲基亞砜 (DMS0)的胎牛血清(FBS)溶液的混合物的液氮汽相中冷凍，以在1. 5ml無菌冷凍管(因此 含1. 0ml細(xì)胞懸液和0. 5ml液上空間)中得到約3X 106細(xì)胞/ml的終濃度。第三且最后階段的細(xì)胞回收在于直接冷凍保存由之前所述的消化上清離心得到 的細(xì)胞沉淀，將所述細(xì)胞沉淀重懸于2ml由含10%二甲基亞砜(DMS0)的胎牛血清(FBS)組 成的溶液中，用控速冷凍器以1°C /分鐘的溫度下降速度在2. 5ml含2ml細(xì)胞懸液和0. 5ml 液上空間的無菌冷凍管中冷凍至-80°C?？筛鶕?jù)需要通過在37°C水浴中快速解凍來恢復(fù)冷凍保存的細(xì)胞，然后將細(xì)胞于相 同溫度下，以1 10的稀釋倍數(shù)重懸于培養(yǎng)基中?？捎?.0 X103細(xì)胞/cm2 2.0 X104細(xì) 胞/cm2之間的免疫接種密度進(jìn)行隨后的擴(kuò)展循環(huán)，每72小時(shí)更換總培養(yǎng)基。細(xì)胞一般表 現(xiàn)出1.7/24小時(shí)的翻倍因數(shù)。
實(shí)施例^MM 1 優(yōu),仆漸j戒t藥作禾nl段尺寸的類型禾口量優(yōu)化了機(jī)械操作類型和初始組織片段的尺寸，保持組織質(zhì)量(g)、消化瓶底表面積 (cm2)、消化體積(ml)、和總瓶體積(ml)之間的約1 2 2 37的恒定比例，考慮lcm人 臍帶條段重約lg。在除去羊膜后，測試了幾種類型的臍帶分段低(5cm條段)；中(2.5cm 條段)；高(0.3cm條段)；及組織糜。所有分段均在解剖刀的輔助下進(jìn)行，并用實(shí)質(zhì)相同的 條件處理樣品。得出，當(dāng)使用2. 5cm條段時(shí)，得到在P0末總細(xì)胞/臍帶質(zhì)量/時(shí)間方面的 最佳產(chǎn)量。表1總結(jié)了得到的定量結(jié)果。表1 分段優(yōu)化細(xì)胞產(chǎn)量 注釋+++ =優(yōu)，++ =甚良，+ =良，-=合理，—=差，0 =不成功t施徹丨2 有關(guān)臍帶血管(1個(gè)靜脈和2個(gè)動(dòng)脈)內(nèi)有無血塊的優(yōu)化已知紅細(xì)胞裂解有毒性，降低細(xì)胞體外活力。因此，比較了在有無血塊的情況下進(jìn) 行消化時(shí)的細(xì)胞產(chǎn)量。對(duì)于后一實(shí)驗(yàn)，在解剖刀的輔助下除去血塊。得出，血塊對(duì)P0末總 細(xì)胞/臍帶質(zhì)量/時(shí)間方面的產(chǎn)量具有負(fù)面作用。表2總結(jié)了所得定量結(jié)果。表2 血塊對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的影響 實(shí)施例3 有關(guān)消化溶液中的酶性質(zhì)、單獨(dú)或組合的酶作用、及酶濃度的優(yōu)化為最大化具有期望特征的分離自初始組織的細(xì)胞數(shù)方面的產(chǎn)量，有關(guān)酶消化采用 了兩個(gè)初始方法在存在培養(yǎng)基、無消化，因此缺乏酶的情況下細(xì)胞直接粘附到培養(yǎng)瓶，并 用單個(gè)酶0. 075% (w/v)膠原酶II或2. 0% (w/v)鏈霉蛋白酶解離組織。由于僅利用膠原酶II是最有效的方法，就將此酶與其他酶組合，尤其是與 0. 125% (w/v)胰蛋白酶(在有無0. 260mM EDTA的情況下)組合、與僅0. 5% (w/v)透明質(zhì) 酸酶組合、且與0.5% (w/v)透明質(zhì)酸酶和2.0% (w/v)鏈霉蛋白酶的組合組合。為此測試，使用了優(yōu)化的2. 5cm的條段尺寸，且保持了組織質(zhì)量(g)、瓶底表面積 (cm2)、消化體積(ml)、和總瓶體積(ml)之間的約1 2 2 37的恒定比例。結(jié)果顯示，通過0. 075% (w/v)膠原酶II與0. 125% (w/v)胰蛋白酶的組合作用 得到在P0末總細(xì)胞/臍帶質(zhì)量/時(shí)間方面的最佳產(chǎn)量。此外，當(dāng)改變膠原酶II的濃度 (0. 0375%、0. 075%和 0. 15% w/v)時(shí)，保持胰蛋白酶濃度 0. 125% (w/v)，在 0. 260mM EDTA 的存在下，證實(shí)，0.075% (w/v)的膠原酶II濃度提供最佳結(jié)果，表3定量總結(jié)了這些結(jié)果。表3 酶性質(zhì)、組合作用和濃度對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的影響。
注釋+++ =優(yōu)，++ =甚良，+ =良，-=合理，一=差，0 =不成功實(shí)施例4 酶溶液的化學(xué)成分的優(yōu)化測試了幾種酶消化溶液的成分，S卩補(bǔ)充有20% FBS和青霉素/鏈霉素的 a -Mem ；補(bǔ)充有 EDTA(更具體為 186mg/ml CaCl2 2H20、400mg/ml KCl、60mg/ml KH2P04、 200mg/ml MgS04 7H20、8000mg/mlNaCl、350mg/ml NaHC03、90mg/ml NaH2P04 7H20、lOOOmg/ ml葡萄糖和76mg/ml (0. 260mM)EDTA)的鹽緩沖溶液(如HBSS)；補(bǔ)充有5mM CaCl2的前述 HBSS溶液；補(bǔ)充有5mM CaCl2的25mMHEPES緩沖液。為此測試，保持之前優(yōu)化的條件，即由0. 075% (w/v)膠原酶II與0. 125% (w/v) 胰蛋白酶組成的酶組合。補(bǔ)充有0. 260mM EDTA的鹽緩沖溶液(HBSS)得到最佳結(jié)果。表4 酶溶液的成分對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的影響。 注釋+++ =優(yōu)，++ =甚良，+ =良，-=合理，—=差，0 =不成功實(shí)施例5 酶消化溫育時(shí)間和DH變化的優(yōu)化測試了幾個(gè)溫育時(shí)間(2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、和16小時(shí))。從所得結(jié)果來看，最佳 溫育時(shí)間是4小時(shí)。盡管在16小時(shí)時(shí)觀察到更完全的消化，發(fā)現(xiàn)更長時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力有負(fù) 面影響，導(dǎo)致培養(yǎng)基顯著酸化。表5定量總結(jié)了所得結(jié)果。表5 溫育時(shí)間和酶消化溶液的pH 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的影響。
注釋+++ =優(yōu)，++ =甚良，+ =良，-=合理，一=差，0 =不成功
實(shí)施例6 消化期間振蕩樽式(溫和對(duì)劇烈)的優(yōu)化在定軌振蕩水浴中用溫和(lOOopm)或劇烈(140opm)振蕩速率進(jìn)行了酶消化溶液 的溫育。lOOopm的溫和振蕩得到細(xì)胞產(chǎn)量方面最佳的結(jié)果。表6定量總結(jié)了所得結(jié)果。表6 振蕩速率對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的影響。 注釋+++ =優(yōu)，++ =甚良，+ =良，-=合理，—=差，0 =不成功實(shí)施例7 酶消化期間溫育氣氛的優(yōu)化(干對(duì)濕)于37°C在兩種環(huán)境下進(jìn)行酶消化溶液的溫育干或濕。為此測試，在浸漬的定軌 振蕩器(其中熱交換通過水和飽和空氣發(fā)生)中或在干室(其中熱交換通過干空氣發(fā)生) 中平行處理組織樣品。在干室中溫育導(dǎo)致更佳的細(xì)胞產(chǎn)量。表7定量總結(jié)了所得結(jié)果。表7 溫育環(huán)境對(duì)細(xì)胞產(chǎn)量的影響。 注釋+++ =優(yōu)，++ =甚良，+ =良，-=合理，—=差，0 =不成功實(shí)施例8 冷凍保存期間的細(xì)胞密度的優(yōu)化為評(píng)估細(xì)胞密度對(duì)冷凍保存后細(xì)胞恢復(fù)的影響，將細(xì)胞于P1末，在含0. 5ml細(xì)胞 懸液和相同體積的由FBS (90% )和DMS0(10% )組成的溶液的1. 5ml冷凍管中，以跨IX 106 細(xì)胞/ml和10X 106細(xì)胞/ml之間的不同密度，在液氮汽相中冷凍。將細(xì)胞冷凍保存至少30天，然后通過將所述冷凍管置于保持在37°C的水浴中來 解凍。將解凍的細(xì)胞重懸于之前加熱至37°C的10ml培養(yǎng)基中。對(duì)總細(xì)胞和活細(xì)胞進(jìn)行計(jì) 數(shù)，并隨后以1 10的稀釋倍數(shù)接種于組織培養(yǎng)瓶(NUNC)中。24小時(shí)后，將所述培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，并如上所述保持細(xì)胞。為測定最佳細(xì)胞冷凍保存密度，測定了各條件下的解凍后細(xì)胞活力(活細(xì)胞/總 細(xì)胞)和細(xì)胞恢復(fù)(解凍后計(jì)數(shù)的活細(xì)胞/冷凍保存前計(jì)數(shù)的活細(xì)胞)。所得結(jié)果顯示， 3X 106細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度最可能保證冷凍保存后所測試條件下活細(xì)胞的適當(dāng)保持和恢復(fù) (含1ml細(xì)胞懸液和0. 5ml液上空間的1. 5ml冷凍管)。監(jiān)控了解凍后細(xì)胞的體外擴(kuò)展能力。細(xì)胞一般表現(xiàn)出1.7翻倍/天的翻倍因數(shù)， 類似于冷凍保存前觀察到的值(圖4)。實(shí)施例9 使用所津立的方法從人臍帶分離前體細(xì)胞獲得倫理委員會(huì)收集臍帶的指示的批準(zhǔn)及產(chǎn)婦的知情同意后，于生產(chǎn)后收集多個(gè) 臍帶。從胎盤分離臍帶，去掉血，并在含無菌鹽溶液(補(bǔ)充有營養(yǎng)素和抗生素(例如lg/L 葡萄糖、100U/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素)的HBSS)的無菌閉合的瓶中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。
運(yùn)輸至所述設(shè)備在室溫下進(jìn)行。所述方法在層流通風(fēng)櫥內(nèi)的無菌環(huán)境中進(jìn)行。用漢克斯鹽緩沖溶液(HBSS)洗滌各臍帶3次，用無菌鑷子除去圍繞臍帶的羊膜。然后將各臍帶在解剖刀的輔助下橫向分段為2. 5cm條段?？紤]到人臍帶的平均線 性密度(lg/cm)，各條段對(duì)應(yīng)約2.5g組織。這些條段中，在解剖刀的輔助下除去確定的血 塊。各自處理各組7個(gè)2. 5g的無血塊的條段。通過解離各組7個(gè)條段來得到細(xì)胞，所述解離在無菌且密封的含緩沖pH的消化 溶液的瓶中，通過濃度0. 075% (重量/總消化體積)的膠原酶II與濃度0. 125% (重量 /總消化體積)的胰蛋白酶的組合作用來進(jìn)行，保持組織質(zhì)量、瓶底表面積、消化體積、和總 瓶體積之間的約1 2 2 37的恒定比例。所述瓶在確定的時(shí)間、溫度、加熱環(huán)境、環(huán)境 濕度和攪拌條件下溫育；更具體地， 從一組7個(gè)各約2. 5g的臍帶條段開始，從血塊中游離出； 使用35ml的消化溶液體積； 在不通氣且閉合的培養(yǎng)瓶中，所述不通氣且閉合的培養(yǎng)瓶如總體積650ml的 T175，且消化期間615ml的液上空間減去消化物下7個(gè)條段的浸沒體積； 其中所述消化溶液除酶外，由下列成分組成186mg/mlCaCl2 2H20、400mg/ ml KCl、60mg/ml KH2P04、200mg/mlMgS04 7H20、8000mg/ml NaCl、350mg/ml NaHC03、90mg/ mlNaH2P04 7H20、lOOOmg/ml 葡萄糖、和 76mg/ml (0. 260mM) EDTA ； 保持pH為6. 4或更高。其中所述酶反應(yīng)于37°C恒定溫度下在閉合干燥的溫育箱中在100振蕩/分鐘 (opm)的恒定速率攪拌下溫育4小時(shí)。以三個(gè)階段進(jìn)行從組織解離得到的細(xì)胞的回收。在第一階段，從解離組織回收細(xì)胞，更具體通過于室溫下在發(fā)生消化的瓶中靜置 水平溫育5 300分鐘(優(yōu)選30分鐘)的時(shí)間來回收細(xì)胞。將消化上清通過用移液器移 溶液來轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，避免吸出任何未消化組織。除去全部未消化組織。這里，向 所述消化瓶中加入35ml體積的補(bǔ)充有脫氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10% 胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所述不通氣的瓶蓋替換為含通氣蓋的濾膜，并于37°C下在 含7% C02的濕潤氣氛中溫育。應(yīng)每72小時(shí)更換總培養(yǎng)基7天，以促進(jìn)水平溫育期間粘附 的細(xì)胞生長，至達(dá)到最大表面匯合率。在第二回收階段，通過于室溫下對(duì)所述50ml離心管以350g離心10分鐘來回收細(xì) 胞，并在離心后，將35ml上清體積轉(zhuǎn)移到具有含通氣蓋的濾膜的靜置培養(yǎng)瓶(如T175)；向 所述培養(yǎng)瓶中加入35ml補(bǔ)充有脫氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10%胎牛血 清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；于37°C下在含7% C02的濕潤氣氛中溫育所述培養(yǎng)瓶，每72小時(shí) 更換總培養(yǎng)基，以促進(jìn)粘附和擴(kuò)展/增殖，至達(dá)到最大表面匯合率。從第一和第二階段回收的細(xì)胞群在第一輪擴(kuò)展循環(huán)末(P0末)冷凍保存。這在于 直接在0.5ml含期望總細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸液與相同體積的含10%二甲基亞砜(DMS0)的胎牛 血清(FBS)溶液的混合物的液氮汽相中冷凍，以在1. 5ml無菌冷凍管(含1. 0ml細(xì)胞懸液 和0. 5ml液上空間)中得到約3X106細(xì)胞/ml的終濃度。第三且最后階段的從解離組織的細(xì)胞回收在于直接冷凍保存通過消化上清離心得到的細(xì)胞沉淀，將所述細(xì)胞沉淀重懸于2ml由含10%二甲基亞砜(DMS0)的胎牛血清 (FBS)組成的溶液中，用控速冷凍器以1°C /分鐘的溫度下降速度在2. 5ml含2ml細(xì)胞懸液 和0. 5ml液上空間的無菌冷凍管中冷凍至_80°C。31天后，通過在37°C水浴中快速解凍來恢復(fù)冷凍保存的細(xì)胞。然后于相同溫度， 以1 10的稀釋倍數(shù)將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中。可用5.0 X103細(xì)胞/cm2 2.0 X104細(xì)胞/ cm2之間的免疫接種密度進(jìn)行隨后的擴(kuò)展步驟，每72小時(shí)更換總培養(yǎng)基。細(xì)胞一般表現(xiàn)出 1. 7翻倍/天的生長速率18次傳代。實(shí)施例10 分離的前體細(xì)胞的間質(zhì)表型的確定除在前體間質(zhì)細(xì)胞用選擇培養(yǎng)基中粘附和增殖的能力外，還通過流式細(xì)胞術(shù)表征 了分離的細(xì)胞的P1末。當(dāng)細(xì)胞在P1末達(dá)到80% 90%的匯合率，移除培養(yǎng)基，并用磷酸鹽緩沖液(無 Ca2+和Mg2+)的洗滌細(xì)胞表面。加入0. 25%的胰蛋白酶，且細(xì)胞一離開瓶表面就加入2體積 的培養(yǎng)基。然后將細(xì)胞懸液以350g離心10分鐘，除去上清。將含細(xì)胞的沉淀重懸于阻斷 溶液(含0.2% BSA的dPBS)中，至達(dá)到2 X106細(xì)胞/ml 10 X106細(xì)胞/ml之間的終細(xì) 胞濃度。于室溫下溫育10分鐘后，將100 yl細(xì)胞懸液加入各含綴合熒光標(biāo)記物(藻紅蛋 白(PE)或異硫氰酸熒光素(FITC))的第一抗體的管中。振蕩細(xì)胞懸液，并在冰中避光溫育 20 40分鐘。此過程后，將1.5ml dPBS加入各管中，重懸細(xì)胞，并以350g離心5分鐘。除 去上清，將含細(xì)胞的沉淀重懸于500 iUl %的多聚甲醛中。將細(xì)胞懸液儲(chǔ)存于4°C待用。在BD Biosciences公司的FACScalibur中進(jìn)行流式 細(xì)胞術(shù)，檢測⑶44、⑶73、⑶90和⑶105表面抗原作為間質(zhì)細(xì)胞的陽性標(biāo)記物。為此，使用 了綴合FITC或PE的第一抗體(圖1)。研究了陰性標(biāo)記物⑶14、⑶31、⑶34和⑶45表便 抗原的存在情況。這些特異于造血細(xì)胞(⑶34)、單核細(xì)胞(⑶14)、內(nèi)皮細(xì)胞(⑶31)和全白 細(xì)胞(⑶45)系，且所有這些抗體均綴合FITC (圖2)。如預(yù)期，絕大部分分離的間質(zhì)細(xì)胞呈 ⑶44、⑶73、⑶90和⑶105陽性，及呈對(duì)所述陰性標(biāo)記物陰性或殘量陽性。實(shí)施例11 分離的細(xì)胞的前體表型的證實(shí)骨形成分化根據(jù)本發(fā)明詳述，從人臍帶條段中分離的前體細(xì)胞表現(xiàn)出分化為不同特化的細(xì)胞 類型的能力。在此實(shí)施例中，證實(shí)了這些細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力。將細(xì)胞于P3以2.0X104細(xì)胞/cm2的密度接種于含補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS)、 10mM 0 -甘油磷酸、100U/ml青霉素、100 u g/ml鏈霉素、50 u g/ml抗壞血酸_2_磷酸酯、 lOOnM地塞米松的a-Mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和超谷氨酰胺)的 骨形成分化培養(yǎng)基中(Hung et al.，2002)。每周更換整個(gè)培養(yǎng)基3周，此后進(jìn)行使用茜素紅和堿性磷酸酶的特異性染色步 驟，兩種染色均呈陽性。對(duì)于茜素紅染色，從組織培養(yǎng)瓶中小心吸出培養(yǎng)基，并于室溫下用 4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞，并用特異性染色溶液(茜素紅S，40mM，pH4. 2)于室溫下溫育15 分鐘。除去茜素紅S溶液，并用水小心洗滌細(xì)胞(Kotobuki et al.，2006)。在堿性磷酸酶(Sigma-Aldrich)測試中，也于室溫下用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞 10分鐘。然后用PBS洗滌細(xì)胞，并浸于2. 5ml檸檬酸溶液中溫育30秒鐘。然后除去檸檬酸溶液，并用去離子水(milliQ)洗滌細(xì)胞，并用染色溶液(中性紅)溫育2分鐘。然后除去所述溶液，用水小心洗滌細(xì)胞(Shim，et al.，2004)。測試對(duì)于骨形 成分化為陽性(圖5)。實(shí)施例12 分離的細(xì)胞的前體表型的證實(shí)脂肪形成分化為將細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，將細(xì)胞于P3以2.0X104細(xì)胞/cm2的密度鋪種于含補(bǔ) 充有10% FBSU00U/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素的a -Mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含脫氧核糖 核苷酸、核糖核苷酸和超谷氨酰胺)中，并在此培養(yǎng)基中保持。當(dāng)匯合時(shí)，將所述培養(yǎng)基更 換為由含10% FBSUOOU/ml青霉素、100 y g/ml鏈霉素、10 y g/ml胰島素、200 y M吲哚美 辛、0. 5mM異丁基-1-甲基黃嘌呤和1 P M地塞米松的DMEM-LG組成的脂肪形成分化培養(yǎng)基 (Shih et al. ，2005)。3周間每周更換2次整個(gè)培養(yǎng)基，此后進(jìn)行使用油紅0的特異性染色測定，并證 實(shí)了脂肪形成分化。為此，從組織培養(yǎng)瓶(NUNC)中通過吸液小心移除培養(yǎng)基，并于室溫下 用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞10分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞，并于室溫下與經(jīng)過濾的油紅0溶液 (2 3)溫育至少10分鐘。然后除去油紅0溶液，并用水小心洗滌細(xì)胞(Do,et al.，2006)。 測試對(duì)于脂肪形成分化為陽性(圖5)。_仿丨丨13 &細(xì)麵白_本表雜賄麟蘭邏對(duì)于軟骨形成分化，重懸細(xì)胞至1. 1 X 106細(xì)胞/ml的終密度，并置于15ml的圓錐 形管中，以形成軟骨球。所用培養(yǎng)基是由含F(xiàn)BS、6. 25ii g/ml胰島素、lOng/mlTGFM和 50 uM抗壞血酸-2-磷酸酯的DMEM-LG組成的軟骨形成分化培養(yǎng)基(Shih et al.，2005)。每周特別小心更換(以不干擾軟骨球)整個(gè)培養(yǎng)基2次4周，此后，用阿辛藍(lán)和蘇 木精進(jìn)行特異性染色測定，并證實(shí)了軟骨形成分化。為此，通過吸液從管中移除整個(gè)培養(yǎng) 基，并用PBS洗滌軟骨球。然后將軟骨球浸于瓊脂中，并在液氮汽相中冷凍。在切片機(jī)的輔助下，將瓊脂切成5 ym厚的組織切片。將這些切片于室溫下用 阿辛藍(lán)溫育5分鐘，并用PBS洗滌。將固定于顯微鏡載玻片上的制劑轉(zhuǎn)移到蘇木精溶液，并 于室溫下溫育5分鐘。通過最后一步洗滌步驟用PBS除去蘇木精(Okada，et al.，2005)。 測試結(jié)果對(duì)軟骨形成分化呈陽性(圖5)。實(shí)施例14 分離的細(xì)胞的前體表型的證實(shí)心肌形成分化發(fā)生心肌形成分化18天，期間使用不同的培養(yǎng)基(Lee et al.，2004)。將細(xì)胞以 3000細(xì)胞/cm2的密度鋪種于包被鳥氨酸的16孔室玻片上。將細(xì)胞鋪種于由補(bǔ)充有10% FBSU00U/ml青霉素和100 u g/ml鏈霉素的a -Mem基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含脫氧核糖核苷酸、核糖 核苷酸和超谷氨酰胺)組成的培養(yǎng)基C0中。鋪種后24小時(shí)，將培養(yǎng)基替換為由補(bǔ)充有10% FBS、100U/ml 青霉素、100ii g/ml 鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、10ng/ml 0-FGF 和 10yM 5-氮 胞苷的DMEM-LG組成的另一培養(yǎng)基(培養(yǎng)基C1)。將細(xì)胞鋪種于培養(yǎng)基C1中后24小時(shí)，進(jìn) 行第二次培養(yǎng)基替換至培養(yǎng)基C2。培養(yǎng)基C2由補(bǔ)充有10% FBS、100U/ml青霉素、100 u g/ ml鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺和lOng/ml ^ -FGF的DMEM-LG基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成。將細(xì)胞保持于 培養(yǎng)基C2中2周，每72小時(shí)更換培養(yǎng)基。平行地，將對(duì)照(非分化)細(xì)胞以5000細(xì)胞/cm2的密度鋪種和保持于培養(yǎng)基0中。 分化階段后，用抗典型肌肉蛋白(心臟肌鈣蛋白T，特異于心肌細(xì)胞)的第一抗體進(jìn)行免疫 熒光測定。為定位測定用細(xì)胞，用特異于核酸的熒光染料(DAPI)染色細(xì)胞核。如預(yù)期，僅 經(jīng)心肌形成分化步驟的細(xì)胞(已顯示典型的心肌細(xì)胞形態(tài))產(chǎn)生熒光信號(hào)(圖6D)。
棚列is 躺_胞』白_本表_賄-.m^M^ / mmm^t發(fā)生神經(jīng)形成分化12天，期間使用不同的培養(yǎng)基(Lee et al.，2004)。將細(xì)胞以 3000細(xì)胞/cm2的密度鋪種于包被鳥氨酸的16孔室玻片上。將細(xì)胞鋪種于由補(bǔ)充有10% FBSU00U/ml 青霉素、100 u g/ml 鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、5ng/ml ^ _FGF、0. 5uM 視黃酸和ImM 2-巰基乙醇的IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基m)中。鋪種3天后，將培養(yǎng)基m替換為含補(bǔ)充有10% FBS、100U/ml青霉素、100iig/ml 鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、ImM環(huán)腺苷酸(cAMP)和100 u M抗壞血酸_2_磷酸酯的IMDM基 礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基N2。鋪種3天后，將培養(yǎng)基N2替換為含補(bǔ)充有10% FBS、100U/ml青霉素、100iig/ml 鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、ImM環(huán)腺苷酸(cAMP)和10yM氫化可的松的IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的
培養(yǎng)基N3。最后，鋪種3天后，將培養(yǎng)基N3替換為含補(bǔ)充有10% FBS、100U/ml青霉素、 100ii g/ml 鏈霉素、2mM L-谷氨酰胺、20ng/ml FGF-1、10ng/ml SHHU0ng/ml NGF、25ng/ml 玻連蛋白、100 uM抗壞血酸-2-磷酸酯、100 u M異丁基甲基黃嘌呤、10 u M福司柯林和20nM PMA的IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基N4。平行地，將對(duì)照(非分化)細(xì)胞以5000細(xì)胞/cm2的密度鋪種和保持于培養(yǎng)基N0 中(見心肌形成分化步驟)。分化階段后，用抗微管蛋白(III型，特異于神經(jīng)細(xì)胞)的第一抗體免疫熒光 測定。為定位測定用細(xì)胞，將細(xì)胞核用特異于核酸的熒光染料(DAPI)染色細(xì)胞核。如預(yù)期， 僅經(jīng)神經(jīng)形成/神經(jīng)膠質(zhì)分化步驟的細(xì)胞(已顯示出典型的神經(jīng)膠質(zhì)形態(tài)(圖7B))產(chǎn)生 熒光信號(hào)(圖7D)。參考文獻(xiàn)Auger F. A. , Germain L. , Remy-Zolghadri M. and C. J. Hayward(2005). Method of isolating cells from umbilical cord. W02005001081.Barry F. P. and J. M. Murphy (2004) Mesenchymal stem cells :clinical applications and biological characterization. Int. J. Biochem. & Cell Biol. 36 568-584.Can A. and S. Karahuseyinoglu (2007). Concise review :humanumbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived stemcells. Stem Cells(on line -www. 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權(quán)利要求
從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其在經(jīng)處理樣品方面100％有效，其比先前現(xiàn)有技術(shù)所述產(chǎn)生更高細(xì)胞數(shù)，其時(shí)間和成本有效，并因而更有利于工業(yè)應(yīng)用，且其特征在于依次包括(A)回收步驟，其中所述人臍帶從血中分離，并于以下溫度在無菌閉合的受體中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，●所述溫度為■如果在收集后72小時(shí)的時(shí)期內(nèi)處理，則優(yōu)選為室溫，或■如果在收集后48～144小時(shí)的時(shí)期內(nèi)處理，則為2～8℃，優(yōu)選為4℃；●所述無菌閉合的受體是■干燥的，或■優(yōu)選被浸入含以下成分的無菌溶液中186μg/mlCaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、90μg/mlNaH2PO4·7H2O、2000μg/ml葡萄糖、及青霉素和鏈霉素的1％等摩爾混合物；(B)三次臍帶洗滌步驟，用含下列成分的溶液洗滌臍帶三次186μg/ml CaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、和90μg/mlNaH2PO4·7H2O；(C)外膜(羊膜)去除步驟，在無菌鑷子的輔助下進(jìn)行；(D)分段步驟，其中所述臍帶在解剖刀的輔助下沿其縱軸被橫向分段，以產(chǎn)生約2.5cm長的條段；(E)由(D)得到的條段的血塊消除步驟，其中在解剖刀的輔助下在鑒定出血塊的位置制作切口，并從該切口消除血塊；(F)分組步驟，其中由(E)得到的條段合并每7個(gè)成組，在下列步驟中各自處理；(G)由(F)得到的各組7個(gè)條段的細(xì)胞解離步驟，在無菌且密封的含緩沖pH的消化溶液的瓶中，通過濃度0.075％(重量/總消化體積)的膠原酶II與濃度0.125％(重量/總消化體積)的胰蛋白酶的組合作用來進(jìn)行，保持組織質(zhì)量(g)、瓶底表面積(cm2)、消化體積(ml)、和總瓶體積(ml)之間的約1∶2∶2∶37的恒定比例，且其中所述瓶在確定的溫育時(shí)間、溫度、熱擴(kuò)散、環(huán)境濕度和攪拌條件下溫育；更具體地，●從一組7個(gè)各約2.5cm(2.5g)的臍帶條段開始，從血塊中游離出；●使用35ml的消化溶液體積；●在不通氣且閉合的培養(yǎng)瓶中，所述不通氣且閉合的培養(yǎng)瓶如總體積650ml的T175，且消化期間615ml的液上空間減去消化物下7個(gè)條段的浸沒體積；●其中所述消化溶液除酶外，由下列成分組成186μg/mlCaCl2·2H2O、400μg/ml KCl、60μg/ml KH2PO4、200μg/mlMgSO4·7H2O、8000μg/ml NaCl、350μg/ml NaHCO3、90μg/mlNaH2PO4·7H2O、1000μg/ml葡萄糖、和76μg/ml(0.260mM)EDTA；●保持pH為6.4或更高；且●其中所述酶反應(yīng)于37℃恒定溫度下在閉合干燥的溫育箱中在100振蕩/分鐘(opm)的恒定速率攪拌下溫育4小時(shí)；(H)第一細(xì)胞回收階段，其中細(xì)胞如(G)中所述從所述組織中解離出，●通過于室溫下在發(fā)生消化的瓶中靜置水平溫育5～300分鐘的時(shí)間來回收細(xì)胞，所述溫育時(shí)間優(yōu)選為30分鐘，●隨后將消化上清通過用移液器移溶液來轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，避免吸出任何未消化組織；●隨后從所述消化瓶中除去全部未消化組織；●向所述消化瓶中加入35ml體積的補(bǔ)充有脫氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；且●其中所述不通氣的瓶蓋替換為含通氣蓋的濾膜；●隨后于37℃下在含7％CO2的濕潤氣氛中溫育，每72小時(shí)更換培養(yǎng)基，以促進(jìn)粘附和細(xì)胞生長/增殖，至達(dá)到最大表面匯合率；(I)第二細(xì)胞回收階段，其中細(xì)胞如(G)中所述從所述組織中解離出，并含于如(H)中所述得到的消化上清中，●通過于室溫下對(duì)(H)中的50ml離心管以350g離心10分鐘來回收細(xì)胞；●在離心后，將35ml上清體積轉(zhuǎn)移到靜置培養(yǎng)瓶，所述靜置培養(yǎng)瓶如T175，具有含通氣蓋的濾膜；●向同一培養(yǎng)瓶中加入35ml補(bǔ)充有脫氧核糖核苷、核糖核苷、谷氨酰胺、抗生素和10％胎牛血清(FBS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；●于37℃下在含7％CO2的濕潤氣氛中溫育所述培養(yǎng)瓶，每72小時(shí)更換培養(yǎng)基，以促進(jìn)粘附和細(xì)胞生長/增殖，至達(dá)到最大表面匯合率；(J)第三細(xì)胞回收階段，其中細(xì)胞如(G)中所述從所述組織中解離出，●細(xì)胞被回收為細(xì)胞沉淀，所述細(xì)胞沉淀通過離心如(I)所述的消化上清而得到，●將所述細(xì)胞沉淀重懸于2ml由含10％二甲基亞砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)組成的溶液中，并●直接用控速冷凍器以1℃/分鐘的溫度下降速度在2.5ml含2ml細(xì)胞懸液和0.5ml液上空間的無菌冷凍管中冷凍至-80℃；(K)如(H)和(I)所述得到的細(xì)胞群的冷凍階段，在細(xì)胞培養(yǎng)物達(dá)到最大表面匯合率后，直接在0.5ml細(xì)胞懸液和0.5ml含10％二甲基亞砜(DMSO)的胎牛血清(FBS)溶液的混合物的液氮汽相中冷凍，從而使1.5ml最終含1.0ml細(xì)胞懸液和0.5ml液上空間的無菌冷凍管中的最終細(xì)胞密度為約3×106細(xì)胞/ml。
2.權(quán)利要求1的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，衍化出 細(xì)胞群， 其中大部分細(xì)胞具有在適于間質(zhì)細(xì)胞的表面和培養(yǎng)基中粘 附和生長的能力， 其中大部分細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶44、⑶73、⑶90和⑶105，且 其中大部分細(xì)胞僅殘量表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶14、⑶31、⑶34和⑶45，且 其中大部分細(xì)胞表現(xiàn)出至18期粘附和擴(kuò)展/擴(kuò)增的擴(kuò)展能力，保持約1. 7/24h的生 長速率，保持成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，且 其中所述大部分細(xì)胞保持部分或終端分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的能力。
3.權(quán)利要求1和2的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，在9 天內(nèi)，在首次粘附和擴(kuò)展循環(huán)末(PO)產(chǎn)生共約8.6 (士0. DXlO5細(xì)胞/克臍帶。
4.以上權(quán)利要求的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，用恒 定細(xì)胞接種物，以全部5. OX IO3細(xì)胞/cm2的傳代(P)，在35天內(nèi)產(chǎn)生共約7. 7 X IO15細(xì)胞。
5.以上權(quán)利要求的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，用恒 定細(xì)胞接種物，以全部2. OX IO4細(xì)胞/cm2的傳代(P)，在65天內(nèi)產(chǎn)生共約2. 1 X IO17細(xì)胞。
6.以上權(quán)利要求的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，應(yīng)用 于細(xì)胞治療方案，所述細(xì)胞治療方案例如但不限于將所述細(xì)胞在分離后直接施用于患者的 方案， 其中所述細(xì)胞，■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間冷凍保存階段；■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間擴(kuò)展階段； 其中所述施用為通過全身或局部施用途徑例如靜脈內(nèi)施用途徑施用、通過局部注射 或腰椎穿刺施用， 其中所述細(xì)胞在施用于患者前不進(jìn)行任何分化。
7.權(quán)利要求6的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，使用細(xì) 胞的治療作用，所述治療作用源于它們作為其他細(xì)胞增殖、分化和移植效力的佐劑的活性，所述其他細(xì)胞例如但不限于一般而言任何前體細(xì)胞或干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì) 胞和配子前體細(xì)胞。
8.權(quán)利要求6的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，使用細(xì) 胞的治療作用，所述治療作用源于它們通過例如分子合成的免疫調(diào)節(jié)能力，所述分子例如但不限于細(xì)胞因子、趨化因子及其他生長因子。
9.權(quán)利要求6的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，使用細(xì) 胞的治療作用，所述治療作用源于它們一旦在生物體內(nèi)，就遷移到和/或粘附于病理患區(qū)的能力，所述病理患區(qū)例如但不限于存在腫瘤生長的區(qū)。
10.權(quán)利要求9的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，所述細(xì) 胞起到用于局部施用天然或合成的分子或分子化合物的載體的作用，所述分子或分子化合物例如但不限于蛋白質(zhì)、肽、小有機(jī)分子、寡糖、多糖、蛋白聚糖、 脂類，或上述的任意組合，前提是這些顯示出治療活性。
11.權(quán)利要求1 5的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，應(yīng) 用于細(xì)胞治療方案，所述細(xì)胞治療方案例如但不限于將所述細(xì)胞施用于患者的方案， 其中所述細(xì)胞，■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間冷凍保存階段；■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間擴(kuò)展階段； 其中所述施用為通過全身或局部施用途徑例如靜脈內(nèi)施用途徑施用、通過局部注射或腰椎穿刺施用， 其中所述細(xì)胞預(yù)先經(jīng)誘導(dǎo)體外分化成部分或終端分化的人體任意細(xì)胞類型， 所述部分或終端分化的人體任意細(xì)胞類型例如但不限于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪 細(xì)胞、心肌細(xì)胞、和神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞(squeletal muscle cells)、肌腱細(xì) 胞、成纖維細(xì)胞、毛囊細(xì)胞、內(nèi)分泌腺細(xì)胞和除神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之外的神經(jīng)細(xì)胞，源自下列上 皮的細(xì)胞結(jié)合上皮、皮膚上皮、角膜上皮、視網(wǎng)膜上皮、肝上皮、腎上皮、胰腺上皮、小腸上 皮、結(jié)腸上皮、膀胱上皮、子宮上皮、咽上皮、和喉上皮， ■所述神經(jīng)細(xì)胞包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；■所述除神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞之外的神經(jīng)細(xì)胞包括神經(jīng)前體細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞； ■所述神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞例如神經(jīng)元細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞。
12.權(quán)利要求6 11的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，應(yīng) 用于細(xì)胞治療方案，眷其中以自體或同種異體方式施用所述細(xì)胞， 所述細(xì)胞■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間冷凍保存階段； ■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間擴(kuò)展階段； ■經(jīng)歷或不經(jīng)歷中間分化過程。
13.權(quán)利要求1 5的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，開 發(fā)含完整細(xì)胞、細(xì)胞提取物或細(xì)胞成分的藥物組合物。
14.權(quán)利要求1 5的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于，使 用完整細(xì)胞、細(xì)胞提取物或細(xì)胞成分，用于產(chǎn)生哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用表面和/或表面層和/ 或支持物。
15.權(quán)利要求1 5的從人臍帶分離細(xì)胞的經(jīng)簡化和優(yōu)化的篩選方法，其特征在于， 以例如但不限于開發(fā)細(xì)胞系為目的，通過對(duì)所述細(xì)胞的基因操作來改變其表型， 所述表型如細(xì)胞粘附和/或擴(kuò)展和/或分化的能力。
全文摘要
本發(fā)明涉及從人臍帶分離和保存前體細(xì)胞的優(yōu)化且確定。在所處理樣品數(shù)方面除可重現(xiàn)外，且100％可靠，所述方法在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生比現(xiàn)有技術(shù)先前所述高且確定數(shù)的前體細(xì)胞，所述前體細(xì)胞是單次離體粘附和擴(kuò)展/增殖期后得到的細(xì)胞中的大部分(因此承諾細(xì)胞表型)。用此方法，可在直接冷凍細(xì)胞條段后，且在大部分細(xì)胞的一次離體擴(kuò)展/增殖期(P0末)后9天內(nèi)獲得約8.6(±0.1)×105細(xì)胞/克經(jīng)處理臍帶。反過來，所述細(xì)胞的特征使得，例如在35天后，從100％經(jīng)處理臍帶樣品中得到平均7.7×1015具有前體表型的細(xì)胞。因?yàn)楹唵?、穩(wěn)健且100％可靠，所述方法可在優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)規(guī)范(GMP)下在致力于人的細(xì)胞治療的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。而且，所述方法還應(yīng)用于藥學(xué)、化妝品和生物技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101868536SQ200880114557
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月4日
發(fā)明者H·J·索雷斯達(dá)克魯茲, J·M·希爾瓦桑圖斯, J·P·瑪丁斯, M·C·巴普提斯塔克爾豪, P·埃斯提利塔蒙提羅達(dá)克魯茲, R·I·岡查斯索雷斯, V·A·巴斯圖 申請人:美鼎琺爾產(chǎn)品制藥實(shí)驗(yàn)室股份公司