專利名稱：含艱難梭菌類毒素a和b的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括艱難梭菌(Clostridium difficile)類毒素的組合物及相應(yīng)方法。
背景技術(shù)：
艱難梭菌(C. difficile)類毒素A和B是造成艱難梭菌相關(guān)性疾病(CDAD)的原 因，該疾病表現(xiàn)為院內(nèi)感染腹瀉和假膜性結(jié)腸炎(Kuijper et al. ,Clinical Microbiology and Infection 12(Suppl. 6) :2-18,2006 ；Drudy et al. , International Journal of Infectious Diseases 11(1) 5-10,2007；ffarny et al. ， Lancet 366(9491) :1079_1084， 2005 ；Dove et al. , Infection and Immunity 58(2) :480-488,1990；Barroso et al., NucleicAcids Research 18(13) :4004，1990)。用甲醛處理毒素得到相應(yīng)的完全滅活并保 留至少部分免疫原性的類毒素A和B(Torres et al.，Infectionand Immunity 63(12) 4619-4627，1995)。已經(jīng)證實(shí)，采用兩種類毒素接種疫苗對(duì)倉鼠、健康成人和復(fù)發(fā)CDAD 患者是有效的(Torres et al.，Infection and Immunity 63(12) :4619_4627，1995 ; Kotloff et al., Infectionand Immunity 69(2) :988_995,2001 ;Sougioultzis et al., Gastroenterologyl28(3) :764-770,2005 ；Torres et al. , Vaccine Research 5(3) 149-162,1996)。此外，施用游離的和鋁鹽(佐劑)結(jié)合的類毒素引起適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答 (Torres et al. , Vaccine Research 5(3) :149_162,1996 ;Giannascaet al. , Infection and Immunity 67(2) :527_538，1999)。同時(shí)施用兩種類毒素比僅施用單個(gè)蛋白更有效(Kim et al. , Infection and Immunity55 (12) =2984-2992,1987) 因此所述 A 和 B 都是疫苗開 發(fā)的候選物。其構(gòu)象完整性的改善和/或其聚集傾向的減少對(duì)得到最佳保存穩(wěn)定性是可取 的。發(fā)明_既述本發(fā)明提供組合物，例如藥物組合物(如疫苗組合物)，其包括艱難梭菌的毒素或 類毒素(例如艱難梭菌毒素A和/或B的類毒素；和類毒素A和B以如5 1至1 5，例 如3 2(A B)比率存在)，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，相對(duì)于沒有所述一種 或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，所述賦形劑減少或延遲所述毒素和/或類毒素聚 集，和/或增加所述毒素或類毒素的熱穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施例中，相對(duì)于沒有所述一種或多 種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑減少或延遲所 述毒素和/或類毒素聚集50%或更多。在另一實(shí)施例中，相對(duì)于沒有所述一種或多種藥學(xué) 上可接受的賦形劑的組合物，所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑增加所述毒素和/或 類毒素的熱穩(wěn)定性0.5°C或更多。任選地，本發(fā)明的組合物可包括佐劑(例如鋁化合物，例 如氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸羥鋁化合物)。所述組合物可以是液體形式，凍干、噴霧干燥或泡 沫干燥的干粉形式。所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是，例如選自緩沖劑、張度劑、簡(jiǎn)單 糖、糖、糖聚合物、氨基酸、寡肽、聚氨基酸、多元醇及其醚、洗滌劑、脂質(zhì)、表面活性劑、抗氧 化劑、鹽、人血清白蛋白、明膠、甲醛或其組合。在各種實(shí)施例中，(i)所述緩沖劑選自濃度
45-100mM的檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸、組氨酸、碳酸鹽和重碳酸鹽；(ii)所述張度劑是濃 度l-50mM的甘露醇；(iii)所述糖選自濃度1-30%的山梨醇、海藻糖和蔗糖；(iv)所述氨 基酸、寡肽或聚氨基酸濃度最高達(dá)100mM;(v)所述多元醇選自甘油、聚乙二醇及其分子量 200-10，000的醚，濃度最高達(dá)20% ； (vi)所述洗滌劑和脂質(zhì)選自濃度最高達(dá)0.5%的脫氧 膽酸鈉、吐溫20、吐溫80和普朗尼克；(vii)所述糖聚合物選自葡聚糖和纖維素；(viii)所 述鹽選自最高達(dá)150mM的氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂和醋酸鎂；以及(ix)0.001-0. 02%的甲這樣的賦形劑的具體例子包括列于表1、表2、表8或表9中的賦形劑。在其它實(shí)施 例中，所述組合物包括檸檬酸鈉或檸檬酸鉀，和/或磷酸鈉或磷酸鉀，任選地和蔗糖和/或 甲醛相組合。因此，在各種實(shí)施例中，所述組合物包括艱難梭菌類毒素A和B，5-100mM(例 如10-30mM，或20mM)檸檬酸鈉或檸檬酸鉀(或磷酸鹽)，2_20 % (例如2_10 %或5 % )蔗 糖，和彡0.020% (例如0.016% )甲醛，pH 5. 5-8. 5 (例如6.5-8. 0或7. 5)。在其它實(shí)施 例中，采用山梨醇、右旋糖和/或吐溫80的組合。本發(fā)明還提供制備包括艱難梭菌毒素或類毒素，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的 賦形劑的組合物的方法，相對(duì)于沒有所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，所 述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑減少或延遲所述毒素和/或類毒素的聚集，和/或增 加所述毒素或類毒素的熱穩(wěn)定性。這些方法包括提供艱難梭菌的毒素或類毒素，并將所述 艱難梭菌的毒素或類毒素與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如本文所述的賦形劑相 混合。如本文所述，所述組合物可以以液體形式或凍干保存。本發(fā)明進(jìn)一步提供誘導(dǎo)受試者對(duì)艱難梭菌免疫應(yīng)答的方法，其包括將本文所述的 組合物施用于所述受試者。在一個(gè)實(shí)施例中，所述患者尚未患有，但有罹患艱難梭菌疾病的 風(fēng)險(xiǎn)，在另一實(shí)施例中，所述患者患有艱難梭菌疾病。此外，本發(fā)明包括本發(fā)明的所述組合 物在誘導(dǎo)受試者對(duì)艱難梭菌免疫應(yīng)答，或在制備用于此目的的制劑中的用途。本發(fā)明有一些優(yōu)勢(shì)。例如本文所述賦形劑的使用可導(dǎo)致增加的艱難梭菌類毒素A 和B的物理穩(wěn)定性，和/或降低或延遲的聚集，這對(duì)包括所述類毒素的藥物(例如疫苗)的 制備是重要的。進(jìn)一步地，使用本發(fā)明所述的比率(例如3 2, A B)，并在施用前(而 非在保存疫苗的配置中)加入佐劑，可導(dǎo)致增加的免疫原性。本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)由以下詳細(xì)說明、附圖和權(quán)利要求是顯而易見的。附圖簡(jiǎn)述

圖1.存在20%海藻糖(□ )、20%蔗糖(■ )、10%山梨醇(〇)、10%右旋糖 ( )、20%甘油(A)、0.05%吐溫80(A)、0. 普朗尼克F68(0)時(shí)，對(duì)類毒素A(x)結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定性的溶質(zhì)效應(yīng)研究。(a) 208nm的CD信號(hào)；(c) ANS發(fā)射強(qiáng)度；(d) ANS發(fā)射峰位置；和 (b)DSC熱分析圖。熱示蹤代表2次測(cè)量的均值，這里每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有小于0.5的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2.存在20%海藻糖(□ )、20%蔗糖(■ )、10%山梨醇(〇)、10%右旋糖 ( )、20%甘油(A)、0. 05%吐溫80( ▲)、() 普朗尼克F68(0)時(shí)，對(duì)類毒素B(x)結(jié) 構(gòu)穩(wěn)定性的溶質(zhì)效應(yīng)研究。(a) 208nm的⑶信號(hào)；(c) ANS發(fā)射強(qiáng)度；(d) ANS發(fā)射峰位置；和 (b)DSC熱分析圖。熱示蹤代表2次測(cè)量的均值，這里每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有小于0. 5的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖3.存在10%山梨醇和0.05%吐溫80(口)，10%右旋糖和0.05%吐溫80(_)， 10%山梨醇、10%右旋糖和0. 05%吐溫80 (〇)，10%右旋糖和10%山梨醇( ))時(shí)，對(duì)類毒素A(x)熱穩(wěn)定性的溶質(zhì)組合的效應(yīng)研究(a) 208nm處CD信號(hào)監(jiān)測(cè)和(b)0D350nm。熱示 蹤代表2次測(cè)量的均值，其中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有小于0. 5的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖4.存在10%山梨醇和0.05%吐溫80(口)，10%右旋糖和0.05%吐溫80(_)， 10%山梨醇、10%右旋糖和0.05%吐溫80(〇)，10%右旋糖和10%山梨醇( ))時(shí)， 對(duì)溶質(zhì)組合及其對(duì)類毒素B(x)熱穩(wěn)定性的作用的研究。(a)208nm處CD信號(hào)監(jiān)測(cè)和(b) 0D350nm。熱示蹤代表2次測(cè)量的均值，這里每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有小于0. 5的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5.存在10%右旋糖(_)、10%山梨醇(〇)、10%右旋糖和10%山梨醇( )) 時(shí)，對(duì)作為溫度函數(shù)的吐溫80 ( 口 )的性質(zhì)研究0. 05%吐溫80(a)和0. 吐溫80(b)的 208nm CD 信號(hào)；0. 05% 吐溫 80 (c)和 0. 吐溫 80(d)的 0D 350nm ;0. 05% 吐溫 80 (e)和 0.1%吐溫80(f)的基于MSD數(shù)(實(shí)心正方形)和基于對(duì)數(shù)正態(tài)數(shù)(實(shí)心菱形)的水力學(xué) 直徑?？紤]到DLS測(cè)量的性質(zhì)，> lym的大小不準(zhǔn)確。熱示蹤代表2次測(cè)量的均值，其中 每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有小于0. 5的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖6.存在山梨醇和0.05%吐溫80(令)，右旋糖和0.05%吐溫80(_)，山梨醇、 右旋糖和0. 05%吐溫80(A)，山梨醇、右旋糖和0. 吐溫80 (x)，山梨醇和右旋糖( ) 時(shí)，用類毒素A(a)和類毒素B(b)的CD 208nm信號(hào)監(jiān)測(cè)溶質(zhì)濃度對(duì)熱轉(zhuǎn)變中點(diǎn)(Tm)的影 響的研究。圖7.作為溫度函數(shù)的類毒素A(a-c)和類毒素B(d_f)的水力學(xué)直徑，這里實(shí)心正 方形代表基于MSD數(shù)的直徑，實(shí)心菱形代表基于對(duì)數(shù)正態(tài)數(shù)的直徑?？紤]到DLS測(cè)量的性 質(zhì)，> lPm的大小不準(zhǔn)確。(a、d)僅蛋白；(b、e)存在10%山梨醇和10%右旋糖的蛋白； (c、f)存在10%山梨醇、10%右旋糖和0.05%吐溫80的蛋白。熱示蹤代表2次測(cè)量的均 值，這里每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)有小于0. 5的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖8. Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)結(jié)合研究存在2M NaCl時(shí)類毒素A ( O ) 和類毒素的(a)吸附等溫線和(b)解吸等溫線。圖9.通過pH范圍5. 5至7. 5的圓二色性(⑶)光譜對(duì)類毒素A 二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究。圖10.通過pH范圍5. 5至7. 5的圓二色性(⑶)光譜對(duì)類毒素B 二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究。圖11.通過pH范圍5. 5至8. 0圓二色性(⑶)光譜對(duì)類毒素A解鏈溫度的研究。圖12.通過pH范圍5. 0至7. 5圓二色性(⑶)光譜對(duì)類毒素B解鏈溫度的研究。圖13.固定保存溫度時(shí)，隨時(shí)間在不同pH值時(shí)的聚集研究。圖14. 37°C下，隨時(shí)間類毒素A的鹽依賴性聚集研究。圖15. 37°C下，隨時(shí)間類毒素B的鹽依賴性聚集研究。圖16.疫苗制劑的凍干法參數(shù)研究。詳述本發(fā)明提供包含艱難梭菌毒素和/或類毒素，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的為 所述組合物提供有益屬性的賦形劑的組合物。例如，并如下進(jìn)一步所述，本發(fā)明的組合物中 包括的賦形劑可以增加所述組合物的一種或多種類毒素成分的穩(wěn)定性，和/或減少或延遲 所述類毒素的聚集。可包括在本發(fā)明的所述組合物中的艱難梭菌類毒素可以使用任意一些本領(lǐng)域已 知方法制備。例如，可以使用包括用甲醛滅活的方法(見例如Kotloff et al.，Infection and Immunity 69(2) :988_995，2001)。優(yōu)選地，所述組合物包括類毒素A和類毒素B，但僅包括這些類毒素之一的組合物還可以包括在本發(fā)明中。能用作毒素來源的典型艱難梭 菌菌株是ATCC 43255 (VPI 10463)。所述類毒素可以以各種比率出現(xiàn)在所述組合物中，例 如5 1(A B)至1 5(A B)。在具體實(shí)施例中，所述比率可以是2 1、3 1，或 3 2(A B)。本發(fā)明所述組合物中類毒素的總量可以是，例如100ng-lmg、100ng-500iig、 1-250 ii g、10-100 ii g、25-75 ii g或50 ii g。所述組合物可任選地以一個(gè)單位劑量保存在小 瓶中。本發(fā)明的所述組合物包括一種或多種化合物，例如緩沖劑(檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘 氨酸、組氨酸、碳酸鹽、重碳酸鹽；5-100mM;可使用的檸檬酸鹽的例子包括鈉、鉀、鎂和鋅)； 張度劑(例如甘露醇；5-100mM)；糖，如糖或糖醇(例如山梨醇、海藻糖或蔗糖；1-30% )或 糖聚合物(例如右旋糖酐和纖維素)；氨基酸、寡肽或聚氨基酸(最高達(dá)100mM)；多元醇 (例如甘油、聚乙二醇或其醚，分子量200-10，000，并且濃度最高達(dá)20% )；洗滌劑、脂質(zhì)或 表面活性劑(例如吐溫20、吐溫80或普朗尼克，濃度最高達(dá)0. 5% )；抗氧化劑；鹽(例如 氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂或醋酸鎂，最高達(dá)150mM)；白蛋白(例如人血清白蛋白)；明膠；甲 醛(0. 001-0. 02% )；或其組合?？捎糜诒景l(fā)明組合物的賦形劑的例子包括列于下面表1、2、8和9的賦形劑。在 各種實(shí)施例中，所述賦形劑可以是引起以下結(jié)果的賦形劑(i)增加的熱穩(wěn)定性(例如至少 0. 5°C，例如0. 5-5°C、1-4°C或2-3°C )，如通過例如下述檢測(cè)測(cè)量的(例如差示掃描量熱儀 (DSC))，和/或(ii)增加或延遲類毒素A、類毒素B，或類毒素A和類毒素B兩者聚集，例如 50%或更多(例如60%或更多，70%或更多，80%或更多，90%或更多，95%或更多，98%或 更多，99%或更多，或100%)，如例如通過下述分析測(cè)量的。包括類毒素聚集物的組合物也 包括在本發(fā)明中。因此，典型的賦形劑和緩沖劑包括檸檬酸鈉(例如0. 01-0. 2M，例如0. 02-0. 1M)、 蔗糖(例如1-20%或5-10% )、山梨醇(例如4-20%或5-10% )、海藻糖(例如4-20%或 5-10% )、吐溫80(例如0. 05-0. 1% )、二乙醇胺(例如0. 3M)、組氨酸(例如0. 02-0. 3M)、 胍(例如0. 3M)、葡萄糖(例如5-20 % )、甘油(例如20 % )、白蛋白(例如1-2. 5% 乳糖(例如10-20%)、甘露醇(例如10%)、蔗糖(例如5-20% )、普朗尼克F-68(例如 0. 1 % )、2-羥丙基3 -CD (例如5-10 % )、右旋糖苷T40 (例如0. 03-0. 08mg/ml)、玻雷吉(例 如0. 01-0. 1% )、賴氨酸(例如0. 3M)、吐溫20(例如0. 01-0. 05% ),以及天冬氨酸(例如 0. 15M)(見表1、2、8和9)。這些賦形劑可以以表中所列濃度用于本發(fā)明?；蛘?，正如本領(lǐng) 域中所理解的，所述量可以變化例如0. 1-10倍。其它本領(lǐng)域已知的糖、糖醇、表面活性劑和 氨基酸也可包括在本發(fā)明的組合物中。所述賦形劑和緩沖劑可以單獨(dú)或組合使用。作為組合的例子，所述組合物可以包 括已經(jīng)證明對(duì)類毒素穩(wěn)定性有益的檸檬酸鈉和蔗糖。這些組分的量可以是，例如10-30mM、 15-25mM或20mM檸檬酸鈉；和1-20%或5-10%蔗糖。除了這些組分，這樣的組合物可包括 少量甲醛，例如0. 001-0. 020,0. 01-0. 018或0. 16%甲醛。這樣的組合物的pH值可以是例 如5. 5-8. 0或6. 5-7. 5，所述組合物可以在例如2_8°C，以液體或凍干形式保存。在此組合 物的變化中，檸檬酸鈉可用磷酸鈉(10-30mM、15-25mM或20mM)替代，和/或蔗糖可用山梨 醇(例如4-20%或5-10% )或海藻糖(4-20%或5-10% )替代。所述組合物的其它變化 包括在本發(fā)明中，并包括使用本文所列其它組分。基于以上，本發(fā)明的典型組合物包括20mM檸檬酸鈉、5%蔗糖和0. 016%甲醛，pH 7. 5。在另一實(shí)施例中，所述組合物包括山梨醇、右旋糖和吐溫80，此為已證實(shí)對(duì)聚集和 穩(wěn)定性有益的組合(見下)。這些組分的量可以是，例如5-15%、8-12%或10%山梨醇； 5-15%、8-12%或 10%右旋糖；以及 0.01-1 %、0. 025-0. 5%或 0.05-0. 吐溫 80。其中 這些組合物為10% (山梨醇和右旋糖)以及0.05-0. 1% (吐溫80)的具體實(shí)施例見下述。 在另一實(shí)施例中，所述賦形劑是右旋糖(10% )和山梨醇(10% )。本發(fā)明的組合物可以液體或干燥形式保存，后者包括例如凍干粉末形式、凍干形 式、噴霧干燥形式和泡沫干燥形式。因此，除了一種或多種賦形劑，如上所述，本發(fā)明的所述 組合物可包括可用例如含有NaCl (例如150mM)的磷酸鈉(例如5mM)緩沖的液體介質(zhì)(例 如鹽水或水)。本發(fā)明所述組合物的典型pH范圍是5-10，例如5-9、5-8、5. 5-9,6-7. 5或 6.5-7。進(jìn)一步地，所述組合物可包括一種或多種穩(wěn)定劑。在其它實(shí)施例中，所述組合物是 凍干形式，并且這樣的組合物在施用前，可通過使用液體介質(zhì)復(fù)溶(例如鹽水或水)。除了上述的類毒素或毒素抗原以及賦形劑外，本發(fā)明的組合物可任選地包括一種 或多種佐劑。可用于本發(fā)明的佐劑包括鋁化合物，例如氫氧化鋁、磷酸鋁和磷酸羥鋁?？?原可使用標(biāo)準(zhǔn)方法，用鋁化合物沉淀，或吸附到鋁化合物上。作為具體實(shí)施例，可使用明礬 (例如 Rehydragel LV , Reheis, Inc. , Berkeley Heights, Newjersey ；最高達(dá)例如 2mg A10H/ 劑，例如約 l. 5mg A10H/ 劑；Alhydrogel (例如Alhydrogel 2% ；(氫氧化鋁佐 齊[J))，Brenntag Biosectror, Frederickssund, Denmark(A10H3))。使用的鋁的量可以是例 如 100-850 u g/ 劑、200-600 u g/ 劑或 300-600 y g/ 劑。本發(fā)明包括的一種配制方法涉及臨用前，將所述類毒素和賦形劑配制在一起，然 后加入佐劑，例如明礬佐劑。如下進(jìn)一步所述，此方法已經(jīng)被證實(shí)增加免疫原性。在另一方 法中，所述佐劑在保存(或者液體或者凍干形式)前，包括在制劑中?？捎糜诒景l(fā)明組合物 和方法中的另外的佐劑包括 RIBI (ImmunoChem, Hamilton, MT)，QS21 (Aquila)，Bay (Bayer) 禾口聚憐嚷(Polyphosphazene) (VirusResearch Institute, Cambridge, MA ；W0 95/2415)。本發(fā)明還包括制備本文所述的組合物的方法，其包括如通過Kotloff et al., Infection and Immunity 69(2) :988_995，2001所述的類毒素制備，并使用藥物配制的標(biāo) 準(zhǔn)方法將所述類毒素與本文所述的一種或多種賦形劑混合。如上所述，所述組合物可以以 液體或凍干形式保存。凍干可使用標(biāo)準(zhǔn)方法(見例如下面的實(shí)施例)進(jìn)行，并且在施用前， 凍干材料可在有或沒有佐劑的無菌液體(如包括任意所需賦形劑的水、鹽水或溶液)中復(fù) 溶。進(jìn)一步地，本發(fā)明包括所述組合物在預(yù)防和治療艱難梭菌感染或疾病中的用途。 因此，本發(fā)明包括施用本發(fā)明的組合物以預(yù)防或治療艱難梭菌相關(guān)性疾病，例如復(fù)發(fā)CDAD， 以及CDAD特征包括腹瀉(例如院內(nèi)感染腹瀉)和假膜性結(jié)腸炎。正如本領(lǐng)域所知，CDAD常 常與用抗生素治療患者，例如住院患者有關(guān)。因此，本發(fā)明的治療方法可用于治療這樣的患 者。此外，根據(jù)本發(fā)明的治療可與抗生素(萬古霉素和/或滅滴靈)治療和/或被動(dòng)免疫 治療合用(見例如美國專利號(hào)6，214，341)。本發(fā)明的施用方法還可用于生成用于患者被動(dòng) 免疫的艱難梭菌免疫球蛋白(見例如美國專利號(hào)6，214，341)。本發(fā)明還包括鑒別可用于生成包括具有改善性質(zhì)的艱難梭菌毒素或類毒素的組 合物的賦形劑的方法。這些方法包括篩選檢測(cè)，例如下面進(jìn)一步描述的那些，這有利于鑒別
8導(dǎo)致減少或延遲組合物的一種或多種毒素和/或類毒素聚集，和/或增加組合物的一種或 多種毒素和/或類毒素穩(wěn)定性的條件。這些方法包括如下進(jìn)一步所述的聚集檢測(cè)和穩(wěn)定性 檢測(cè)。此外，本發(fā)明包括使用其它的鑒別可取制劑的檢測(cè)，包括溶解度、免疫原性和粘性檢 測(cè)。本發(fā)明的組合物可通過例如經(jīng)皮(例如肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi))途徑，以經(jīng)本 領(lǐng)域熟練技術(shù)人員確定合適的量和方案給藥。例如，可施用100ng-lmg、100ng-500iig、 1-250 u g、10-100 u g、25-75 y g或50 y g類毒素。對(duì)于預(yù)防或治療目的，疫苗可以施用例 如1、2、3或4次。當(dāng)給予多劑量時(shí)，所述劑量可與另一劑量隔開例如一周至一個(gè)月。在另 一實(shí)施例中，四個(gè)劑量每個(gè)50 u g可以在任意8周時(shí)間內(nèi)肌內(nèi)給藥。實(shí)施例I為鑒別增強(qiáng)艱難梭菌類毒素A和B物理穩(wěn)定性的條件，篩選穩(wěn)定性化合物。不同 濃度以及幾種組合的30 GRAS(通常被認(rèn)為是安全的)化合物的篩選分兩部分進(jìn)行。首先， 高通量聚集分析用于篩選應(yīng)激條件下(PH 5-5. 5下類毒素55°C孵育55或75分鐘)延遲 或防止類毒素聚集的化合物。進(jìn)一步研究穩(wěn)定兩種蛋白的化合物其在導(dǎo)致可能類天然折疊 態(tài)(PH 6.5)的條件下延遲解折疊的能力。Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)表面上類毒素 的熱穩(wěn)定性用DSC監(jiān)測(cè)，在某些賦形劑存在時(shí)也顯示明顯改善。進(jìn)一步研究有效抑制兩種 類毒素聚集的化合物其增加蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的能力。為鑒別佐劑結(jié)合類毒素的穩(wěn)定劑，進(jìn) 一步研究選定賦形劑其增加佐劑結(jié)合類毒素?zé)岱€(wěn)定性的能力。綜上所述，本研究已得到關(guān) 于一系列能用于設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)物理穩(wěn)定性的藥物制劑的條件(溫度和溶質(zhì))下，游離的和 佐劑結(jié)合的類毒素性能的信息。實(shí)驗(yàn)材料和方法材料使用前述的方法，制備高純化形式的類毒素A和B(Kotloff etal.，Infection and Immunity 69(2) =988-995, 2001) 分別使用濃度lmg/mL時(shí)，類毒素A吸收單位1. 173，類 毒素B吸收單位0. 967，通過280nm的UV吸收確定蛋白濃度。所有用到的試劑都是分析 級(jí)的，從 Sigma (St. Louis, M0)購買。含有 150mM NaCl 的磷酸鈉緩沖劑(5mM、pH 5. 0、5. 5 和6. 5)用于賦形劑篩選研究。含有150mM NaCl的磷酸鈉緩沖劑(5mM、pH 6. 5)用于振 蕩和佐劑研究。對(duì)于緩沖交換，蛋白在冷藏室溫度下使用Slide-A-Lyzer 透析盒，lOkDa MWC0(Pierce, Rockford, IL)透析。賦形劑篩選研究聚集分析。篩選有58種濃度變化和幾種組合的大約30種GRAS (通常認(rèn)為是安全 的)化合物其抑制類毒素聚集的能力。蛋白的聚集使用96孔板讀取器(Spectra Max M5， Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，通過350nm處光密度測(cè)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。55°C時(shí)，對(duì)類毒 素A(1.2mg/ml)于pH 5. 5，對(duì)類毒素B (0. 5mg/ml)于pH 5.0進(jìn)行聚集檢測(cè)。在這些條件 下，蛋白部分解折疊并自發(fā)結(jié)合。因此，干擾這兩種過程的賦形劑的任何穩(wěn)定性影響可能被 檢測(cè)到。蛋白加到含有處于相應(yīng)PH值的賦形劑的96孔板的孔中，如果是類毒素A，則樣品 55°C孵育75分鐘，類毒素B孵育55分鐘。溶液的光學(xué)密度在350nm處每5分鐘監(jiān)測(cè)。同 時(shí)檢測(cè)沒有加入的化合物并且僅緩沖劑和賦形劑(空白)的蛋白溶液對(duì)照。數(shù)據(jù)分析前， 對(duì)于本身的緩沖劑-賦形劑性能，通過減去空白校正測(cè)量值。每個(gè)樣本求值三次。聚集的
9抑制百分比采用下面的表達(dá)式計(jì)算 這里A0D35Q(E)代表賦形劑存在時(shí)蛋白0D 350nm的變化，A0D35Q(C)代表沒有 賦形劑時(shí)蛋白 0D 350nm 的變化(Peek et al. , Journal of Pharmaceutical Sciences 96(1) 44-60,2006)。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究。研究類毒素溶液，在濃度0. 2mg/ml時(shí)進(jìn)行⑶測(cè)量，在0. lmg/ml 時(shí)進(jìn)行熒光和UV吸收分析。在此范圍內(nèi)，未見濃度依賴性。每個(gè)樣本重復(fù)求值兩次，以確 保測(cè)量的重現(xiàn)性。遠(yuǎn)UV圓二色(CD)譜。使用配有6-位置Peltier溫控儀的Jasco J-810分光偏 振計(jì)得到⑶譜。⑶譜得自260-190nm，掃描速度20nm/分鐘，累積為2，2秒響應(yīng)時(shí)間。采 用15°C/小時(shí)的溫度斜坡，在溫度范圍10至85°C每0.5°C監(jiān)測(cè)208nm的⑶信號(hào)，研究蛋白 (密封小管內(nèi)，光徑0. lcm)的熱轉(zhuǎn)化(熔化曲線)。CD信號(hào)通過Jasco Spectral Manager 軟件轉(zhuǎn)化為摩爾橢圓率。使用Origin軟件，從熔化曲線的S型擬合獲得熱轉(zhuǎn)化中點(diǎn)溫度ANS熒光光譜。通過外源探針8-苯胺基-1-萘磺酸鹽(ANS)的熒光發(fā)射監(jiān)測(cè)蛋 白上非極性位點(diǎn)的可接近性。每個(gè)樣本含有比蛋白過量20倍摩爾量的ANS。372nm ANS激 發(fā)后，采集400至600nm的發(fā)射光譜，步長(zhǎng)2nm，積分時(shí)間1秒。在10至85°C溫度范圍內(nèi)， 每2. 5°C采集發(fā)射光譜，5分鐘平衡。從原始發(fā)射光譜減去每個(gè)相應(yīng)pH值的ANS緩沖基線。 使用Origin軟件，從多項(xiàng)式擬合得到發(fā)射光譜的峰位置。高分辨率UV吸收光譜。使用Agilent 8453紫外可見分光光度計(jì)得到高分辨率UV 吸收光譜。在10至85°C范圍內(nèi)，每個(gè)溫度孵育5分鐘(足以達(dá)到平衡)，通過每2. 5°C監(jiān)測(cè) 350nm處0D值研究蛋白聚集。動(dòng)態(tài)光散射。PH6.5時(shí)蛋白(單獨(dú)的或有賦形劑存在時(shí))的平均水力直徑， 采用動(dòng)態(tài)光散射儀(Brookhaven Instrument Corp.，Holtzille，NY)分析。該儀器配 備50mW的二極管泵激光器(入=532nm)，與入射光成90°角監(jiān)測(cè)散射光。使用數(shù)字 自相關(guān)儀(BI-9000AT)生成自相關(guān)函數(shù)。使用累積量法(基于對(duì)數(shù)正態(tài)分布數(shù))，通過 Stokes-Einstein方程從擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算水力直徑。這些數(shù)據(jù)適合非負(fù)約束最小二乘算法，產(chǎn) 生多重模態(tài)分布(MSD)。該儀器配有溫控循環(huán)水浴RTElll(Neslab，Newington, NH)，在10 至85°C的溫度范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)水力直徑。差示掃描量熱法(DSC)。DSC使用帶自動(dòng)進(jìn)樣器的MicroCalVPDSC(MicroCal，LLC ； Northampton, MA)進(jìn)行。用60°C /小時(shí)的掃描速率，得到10_90°C的僅類毒素(0. 5mg/ml) 或賦形劑存在下的類毒素(0.5mg/ml)的熱譜圖。每次掃描開始前，填充細(xì)胞在10°C平衡 15分鐘。分析前從每個(gè)蛋白掃描扣除僅緩沖劑的熱譜圖。振蕩研究。在有或沒有賦形劑時(shí)研究濃度0.4mg/ml時(shí)的類毒素溶液。蛋白樣 品(0.4ml)置于 1.5ml 離心管中，在旋轉(zhuǎn)器(Thermomixer R, Eppendorf AG, Hamburg, Germany)中恒定溫度4°C，300rpm振蕩72小時(shí)。旋轉(zhuǎn)前和旋轉(zhuǎn)后測(cè)量蛋白濃度和0D350nm， 評(píng)估管壁吸附和聚集。樣品4°C，10，000xg速度離心10分鐘，測(cè)量上清的濃度和0D 350nm, 以檢測(cè)不溶性聚集體的形成。蛋白結(jié)構(gòu)通過⑶評(píng)價(jià)。每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量?jī)纱巍?br> 佐劑研究吸附至氫氧化鋁辦(氫氧化鋁佐劑)。類毒素吸附到不同濃度 (0. 025-lmg/ml) Alhydrogel⑥(Brenntag Biosectror, Frederickssund, Denmark ；氧氧化
鋁佐劑)的能力通過建立結(jié)合等溫線測(cè)定。冰箱溫度下，o.4mg/ml Alhydrogel (氫氧化 鋁佐劑)存在下的蛋白溶液在立式圓筒形試管旋轉(zhuǎn)器旋轉(zhuǎn)20分鐘。樣品14，OOOxg離心30 秒，以沉淀佐劑。上清中剩余蛋白的濃度值用于建立結(jié)合曲線。賦形劑存在下，蛋白結(jié)合到 Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)的能力用同樣的步驟測(cè)定。在這種情況下，Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)加到蛋白——賦形劑溶液中。類毒素從Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)解吸附。在2M NaCl存在下，評(píng)價(jià)所述 類毒素蛋白從J/；^辦oge嚴(yán)(氫氧化鋁佐劑)解吸附。類毒素Alhydrogel (氫氧化鋁佐 劑)沉淀如上所述制備。加入NaCl溶液前，用緩沖劑(pH 6.5)洗滌沉淀，去除上清中存在 的蛋白。Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)溶液于冰箱溫度下在立式圓筒形試管旋轉(zhuǎn)器中旋 轉(zhuǎn)20分鐘。樣品14，OOOxg離心30秒，以沉淀賦形劑。上清中蛋白的濃度用于建立解吸附 等溫線O類毒素結(jié)合到乂/；1；；辦0識(shí)/ (氫氧化鋁佐劑)的穩(wěn)定性。結(jié)合到Alhydrogel
(氫氧化鋁佐劑)的類毒素的熱穩(wěn)定性使用MicroCalVP-AutoDSC (MicroCal，LLC, Northampton, MA)，用DSC監(jiān)測(cè)。通過上述步驟0. 5mg/ml類毒素結(jié)合到0. 4mg/
ml Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)。掃描速率60°C /小時(shí)，得到10至90°C的類毒素?zé)嶙V圖。 每次掃描前，樣品10°C平衡15分鐘。分析前，從每次蛋白/佐劑掃描中減去僅Alhydrogel
(氫氧化鋁佐劑)的熱譜圖。結(jié)果和討論賦形劑篩選研究為研究GRAS化合物預(yù)防/延遲聚集的能力，在應(yīng)激條件(在55°C孵育)下單獨(dú)孵 育類毒素，或在賦形劑存在下孵育類毒素。類毒素聚集以高通量方式，通過監(jiān)測(cè)孵育時(shí)間過 程中350nm處0D值變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。進(jìn)一步用濁度變化計(jì)算％聚集抑制，類毒素A總結(jié)于表 1，類毒素B總結(jié)于表2。類毒素A的高通量聚集分析發(fā)現(xiàn)，超過一半的賦形劑或者延遲或防止0D 350nm隨 時(shí)間增加，并使得聚集抑制90%或更多(表1)。在檢測(cè)的賦形劑中，2.5%白蛋白、2.5% a-環(huán)糊精、0. 吐溫80、0. 3M組氨酸和0. 3M賴氨酸導(dǎo)致突然的高0D 350nm值，這表明類 毒素A在這些條件下是不溶的。類毒素A的聚集在16種其它賦形劑存在時(shí)也明顯增加，其 中25和50mM精氨酸/谷氨酸鹽混合物、0. 3M精氨酸和0. 3M脯氨酸尤其作用大。15種賦形劑存在下，類毒素B被抑制90%或更多(表2)。0. 3M組氨酸或0. 2M檸 檬酸鈉的存在引起突然的高0D 350nm。其它20種化合物在監(jiān)測(cè)時(shí)間過程中，更加逐步誘導(dǎo) 聚集。0. 015M氯化鈣、0. 15M抗壞血酸和0. 3M精氨酸存在時(shí)，觀察到非常高的0D350nm增 加。在許多情況下，同樣的賦形劑促進(jìn)兩種類毒素的聚集(表1和3)。相比之下，5%
112-羥丙基Y -⑶、0. 01 %和0. 1 %吐溫20、0. 15M天冬氨酸和0. 3M胍促進(jìn)僅類毒素B的聚 集。此外，0. 015M氯化鈣存在下類毒素B的聚集比類毒素A多得多。這可能與存在氯化鈣時(shí) 類毒素A的C端域的已知增加的熱穩(wěn)定性有關(guān)(Demarest et al.，Journal of Molecular Biology 346(5) :1197_1206，2005)。在其對(duì)溶質(zhì)誘導(dǎo)聚集的應(yīng)答中類毒素之間的相異可能 與相應(yīng)毒素之間的結(jié)構(gòu)差異性有關(guān)(Warny et al.，Lancet 366(9491) 1079-1084，2005 ； Just et al. , Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology 152 :23_47, 2005)。研究的化合物中沒有肌醇磷酸，表明觀察到的類毒素聚集不涉及自身催化裂解 (Reineke et al.，Nature (London, United Kingdom) 446(7134) :415_419，2007)。大多數(shù) 檢測(cè)的糖、洗滌劑和環(huán)糊精抑制類毒素的聚集。下面的賦形劑被發(fā)現(xiàn)有效抑制兩種類毒素 的聚集20%海藻糖、20%蔗糖、10%山梨醇、10%右旋糖和20%甘油。通過監(jiān)測(cè)加熱后ANS熒光、⑶信號(hào)變化和DSC，進(jìn)一步研究上述糖、山梨醇、甘油和 兩種表面活性劑(0. 05% /0. 吐溫80和0. 普朗尼克F-68)其穩(wěn)定pH 6. 5時(shí)蛋白質(zhì) 二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的能力(圖1和2)。存在20%蔗糖和20%海藻糖時(shí)，類毒素A更早開始二 級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而其余的賦形劑延遲熱轉(zhuǎn)化 2°C (圖la)。出人意料的是，類毒素B僅在存 在20%蔗糖時(shí)，表現(xiàn)出更早開始二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，而其余的賦形劑延遲熱轉(zhuǎn)化 1°C (圖2a)。 海藻糖和/或蔗糖存在時(shí)類毒素二級(jí)結(jié)構(gòu)變化開始早，可以通過溶質(zhì)穩(wěn)定部分解折疊態(tài)來 解釋。此外，不能排除類毒素通過多糖結(jié)合到其C端糖識(shí)別重復(fù)序列而部分解折疊的可能 性(Greco et al. , Nature Structural Molecular Biology 3(5) :460_461，2006)。在第 二個(gè)機(jī)制的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的情況下，海藻糖存在下兩種類毒素性能的差異可能與類毒素之間 的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)(類毒素A的C末端域有30個(gè)重復(fù)序列，類毒素B有19個(gè)重復(fù)序列Just et al. , Reviews of Physiology,Biochemistry andPharmacology 152 :23_47，2005) 0 有 趣的是注意到單糖(右旋糖)對(duì)這兩種類毒素的二級(jí)結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用。溫度誘導(dǎo)的兩種類 毒素的解折疊和ANS的相關(guān)結(jié)合不受所述化合物存在的影響(圖lb，2b)。洗滌劑對(duì)溫度 誘導(dǎo)的類毒素解折疊的作用用DSC監(jiān)測(cè)，并且似乎不明顯(圖lc、2c和表3)。這些觀察數(shù) 據(jù)表明，賦形劑沒有通過詳細(xì)描述的優(yōu)先排除機(jī)制強(qiáng)烈穩(wěn)定類毒素結(jié)構(gòu)，而是通過其它機(jī) 制抑制其聚集，如直接阻斷造成蛋白結(jié)合的蛋白/蛋白相互作用(Timasheff，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 99(15) :9721-9726, 2002 ；Timasheff, Advances in Protein Chemistry 51 (大分子相互作用的結(jié)合熱力學(xué)):355-432，1998)。為研究更有活性的物質(zhì)組合對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用，通過用CD監(jiān)測(cè)類毒素的熱轉(zhuǎn)化 并用0D350nm監(jiān)測(cè)聚集，鑒定從山梨醇、右旋糖和吐溫80的混合物得到的結(jié)果(圖3和4)。 加熱僅吐溫80(0. 05%或0. 1%)或山梨醇和/或右旋糖存在時(shí)的溶液，引起其膠團(tuán)結(jié)構(gòu)變 化，這通過CD信號(hào)減少和用0D350nm監(jiān)測(cè)的增加的光散射顯示(圖5)。賦形劑濃度對(duì)熱 轉(zhuǎn)化溫度有近似線性效應(yīng)(圖6)。這支持了賦形劑通過直接抑制蛋白結(jié)合而防止聚集的 假設(shè)。賦形劑對(duì)熱轉(zhuǎn)化的影響總結(jié)于表4和5。存在或不存在0.05%吐溫80時(shí)，10%右旋 糖和10%山梨醇的組合往往會(huì)最大程度地延遲兩種類毒素?zé)徂D(zhuǎn)化的中點(diǎn)(類毒素A為 4°C，類毒素B為 10°C )(圖3)。這可以通過或者協(xié)同效應(yīng)和/或更高總濃度的穩(wěn)定性化 合物解釋。在類毒素B的情況下，存在物質(zhì)的組合時(shí)，轉(zhuǎn)化的起始溫度并沒有延遲，但其熱 轉(zhuǎn)化的中點(diǎn)明顯推遲。這可能與兩種或多種賦形劑存在下類毒素B更多逐步的解折疊有 關(guān)。存在穩(wěn)定性化合物時(shí)，類毒素A表現(xiàn)出明顯的聚集延遲(用0D350nm監(jiān)測(cè))(圖4a)。賦形劑存在或不存在時(shí)，類毒素的水力直徑也通過DLS監(jiān)測(cè)(圖7)。存在賦形劑時(shí)，類毒素 A表現(xiàn)出之前觀察的水力學(xué)直徑增加的延遲開始(圖7a_c)，而對(duì)類毒素B觀測(cè)到更小的作 用(圖7d_f)。這些觀察表明，這里檢測(cè)的可能疫苗賦形劑的特定組合通過優(yōu)先水合機(jī)制和 直接抑制蛋白結(jié)合來穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)。這種穩(wěn)定化合物的使用可能會(huì)增加儲(chǔ)存過程中類毒素 的物理穩(wěn)定性。振蕩研究振蕩對(duì)類毒素物理穩(wěn)定性的作用通過監(jiān)測(cè)蛋白吸附到保存小瓶的瓶壁、不溶性聚 集物的形成和蛋白熱穩(wěn)定性變化進(jìn)行研究。存在和不存在賦形劑時(shí)，蛋白濃度、0D350nm和 CD熔化的輕微變化表明，通過使用基于振蕩的應(yīng)力，類毒素沒有較大物理變化。佐劑研究佐劑結(jié)合等溫線顯示，在低濃度時(shí)類毒素有效結(jié)合至Alhydrogel (氫氧化鋁佐 劑)(圖8a)，在更高蛋白濃度時(shí)結(jié)合飽和(圖8a)。0. 5mg/ml的類毒素95%或更多結(jié)合到 Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)，其允許使用dsc直接監(jiān)測(cè)佐劑表面上蛋白的穩(wěn)定性。加 入2M NaCl后沒有類毒素吸附，表明如在蛋白/氫氧化鋁相互作用中觀察到的，類毒素與 Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)的相互作用并不僅僅是靜電相互作用(圖8b ;Gupta et al.，PharmaceuticalBiotechnology 6 :229_248，1995 ；Seeber et al.，Vaccine 9(3) 201-203,1991 ；White et al. ,Developments in Biologicals(Basel, Switzerland)103(P hysico-Chemical Procedures for the Characterization ofVaccines) :217_228，2000)。通過結(jié)合至Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)，類毒素A在其熱穩(wěn)定性方面，沒有表 現(xiàn)出可檢測(cè)的改變，而佐劑結(jié)合類毒素B顯示Tm下降 1. 4°C。大部分賦形劑存在時(shí)，結(jié)合 類毒素的Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)百分比略有減少(表6和7)。這表明，可能通過
與或者蛋白和/或佐劑間的直接相互作用，賦形劑部分地干擾類毒素結(jié)合至Alhydrogel
(氫氧化鋁佐劑)。賦形劑存在和不存在時(shí)，結(jié)合至Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)的蛋白 熱穩(wěn)定性，類毒素A的總結(jié)于表6，類毒素B的總結(jié)于表7。賦形劑的存在或者通過降低或 者通過增加轉(zhuǎn)化溫度，干擾佐劑結(jié)合類毒素的熱穩(wěn)定性。存在10%山梨醇時(shí)，兩種類毒素 都發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性降低，而10%山梨醇和10%右旋糖的存在降低了僅類毒素B的熱穩(wěn)定性。 此外，吐溫80只在佐劑結(jié)合類毒素B的情況下有穩(wěn)定作用。另一方面，右旋糖(10% )對(duì) 兩種類毒素有熱穩(wěn)定作用。有趣的是，這三種賦形劑(10%山梨醇、10%右旋糖和0. 05%或 0. 吐溫80)的組合往往會(huì)提高兩種佐劑結(jié)合類毒素的熱轉(zhuǎn)化3-4°C。結(jié)論穩(wěn)定劑篩選的系統(tǒng)辦法引起鑒別改善艱難梭菌類毒素A和B熱穩(wěn)定性的賦形劑。
選定賦形劑存在下，對(duì)Alhydrogel (氫氧化鋁)結(jié)合類毒素的研究，確定了得到佐劑結(jié)合
蛋白改善的物理穩(wěn)定性的條件。這項(xiàng)研究也產(chǎn)生在一系列可用于設(shè)計(jì)具有增強(qiáng)的保存穩(wěn)定 性的制劑的條件(溫度、溶質(zhì))下，有關(guān)類毒素物理性能的信息。實(shí)施例II研究艱難梭菌類毒素疫苗配制的其它變化，努力改善疫苗的穩(wěn)定性和免疫原性圖
13譜。最新產(chǎn)生的疫苗臨床前和臨床資料表明，增加的穩(wěn)定性和免疫原性圖譜對(duì)支持未來的 臨床研究將是重要的。pH確定帶來最大穩(wěn)定性的pH是配制改進(jìn)努力的一部分。研究在保存于65°C、5°C、 25°C和37°C最高達(dá)28天，pH范圍5. 5-7. 5的液體樣品進(jìn)行。采用下面的方法建立穩(wěn)定性 圖譜1.圓二色光譜(⑶)(二級(jí)結(jié)構(gòu)變化)2.圓二色光譜(⑶)(熔化溫度變化，TJ，以及3.分光光度法(0D35QJ和SEC-HPLC (聚集體形成)。類毒素A在pH6. 0以上以及類毒素B在檢測(cè)的整個(gè)pH范圍內(nèi)，在⑶譜內(nèi)未觀察到 二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化(圖 9 和圖 10 ；Salnikovaet al. , J. Pharm. Sci. 97(9) :3735_3752，2008)。 從CD測(cè)量獲得的熔點(diǎn)數(shù)據(jù)顯示，這兩種類毒素最高穩(wěn)定性的pH大于7. 0(圖11和圖12)。通過SEC-HPLC分析聚集體形成(％單體)和％回收面積時(shí)，在彡-60°C范圍內(nèi)， pH 6-7. 5范圍內(nèi)類毒素A和B聚集狀態(tài)幾乎無變化。但是，升高溫度時(shí)(尤其高于5°C) 時(shí)，在整個(gè)pH范圍內(nèi)聚集狀態(tài)的差異更明顯，越低的pH值趨向于越高的聚集水平變動(dòng)。 如 Salnikova et al.，J. Pharm. Sci. 97 (9) :3735_3752，2008 所述，這伴隨有更低 pH 值時(shí) 350nm處光密度的增加。評(píng)估固定保存溫度(彡-60°C )(圖13)下隨時(shí)間變化不同pH值的聚集時(shí)，結(jié)果再 次顯示聚集狀態(tài)在超低溫時(shí)非常穩(wěn)定，表明更低pH水平(<pH 7.0)時(shí)促進(jìn)聚集?？紤]到 這些數(shù)據(jù)，疫苗批量保存的名義PH設(shè)為7. 5。離子強(qiáng)度確定帶來最大穩(wěn)定性的離子強(qiáng)度也是配制改進(jìn)努力的一部分。用保持在_65°C、 5°C、25°C和37°C下，在20mM檸檬酸鈉緩沖液，pH 7. 25以及各種濃度(0_300mM)氯化鈉中 最高達(dá)28天的液體樣品進(jìn)行研究。還檢測(cè)了用5%蔗糖代替NaCl。用來建立穩(wěn)定性圖譜 的方法是SEC-HPLC、SDS-PAGE和可見外觀。通過SDS-PAGE或可見外觀，沒有可辨別的明顯差異。SEC-HPLC清楚地顯示更高鹽 濃度下類毒素B的聚集。類毒素A聚集似乎是時(shí)間和溫度依賴性的，唯一明顯影響在50mM 氯化鈉時(shí)可見。數(shù)據(jù)表明，應(yīng)添加0-50mM的氯化鈉或5%蔗糖，以實(shí)現(xiàn)類毒素的最大穩(wěn)定性 (圖14和圖15)。緩沖劑變化和賦形劑的添加進(jìn)行了初步研究，評(píng)估緩沖劑和賦形劑對(duì)類毒素穩(wěn)定性的作用。從HPLC-SEC得到 的數(shù)據(jù)證明，檸檬酸鈉緩沖液與作為賦形劑的山梨醇提供了通過隨時(shí)間變化類毒素回收百 分比所確定的最大穩(wěn)定性，如表8和表9所示。凍干制劑的評(píng)價(jià)為選擇第二階段臨床試驗(yàn)穩(wěn)定的凍干制劑，我們采用倉鼠免疫原性分析，因?yàn)樗?是顯示對(duì)與臨床免疫原性有關(guān)的產(chǎn)物變化最高敏感性的臨床前分析。初步研究數(shù)據(jù)引起基 于作為緩沖劑的檸檬酸鈉和作為穩(wěn)定賦形劑的山梨醇的賦形劑篩選研究。由于山梨醇制劑 中觀察到的低Tg’和長(zhǎng)凍干時(shí)間，所以蔗糖作為穩(wěn)定性賦形劑被引入以代替凍干制劑中的 山梨醇。基于平行研究的數(shù)據(jù)，二次凍干/賦形劑篩選研究也使用磷酸鉀緩沖液和海藻糖
14進(jìn)行。從這些研究和之前的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，出現(xiàn)三種主要制劑——一種液體和兩種凍干的。在實(shí)時(shí)和加速條件下制備凍干制劑，并評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。類毒素A和B分開保存，以 便更密切地研究其單個(gè)穩(wěn)定性圖譜。_65、5或42°C儲(chǔ)存三個(gè)月后，從一種制劑(凍干，20mM 檸檬酸鹽、5%蔗糖、0.016%甲醛，pH7. 5)得到的外觀數(shù)據(jù)和倉鼠免疫原性數(shù)據(jù)如下。研究 開始時(shí)以及_65、5或42°C保存三個(gè)月后，觀察到制劑之間外觀上略有至沒有差別(表10和 表11)。此外，5°和42°C保存7個(gè)月的制劑之間，或有和沒有甲醛的相同制劑之間，倉鼠免 疫應(yīng)答沒有明顯不同。42°C保存是高應(yīng)激條件，因?yàn)樵诒４孢^程中觀察到?jīng)]有變化，結(jié)果意 味著制劑最有可能在較低溫度下穩(wěn)定相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間。但是，目的是估計(jì)保存期的數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì) 上的合理分析要求見到一些可量化的改變，這樣可能計(jì)算出速率。由于到今天為止沒有觀 察到變化，不能計(jì)算出真正的速率。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，我們打算使用保存于2-8°C，凍干的由 20mM檸檬酸鹽、5%蔗糖、0. 016%甲醛，pH 7. 5中的艱難梭菌A和B組成藥品制劑。使用表12中總結(jié)的凍干周期，制備本報(bào)告中詳述的穩(wěn)定性研究中使用的制劑。如 通過皮拉尼真空讀數(shù)降至等于壓力計(jì)真空讀數(shù)(圖16)確定的，此周期中產(chǎn)生的固體、白 色、漂亮的塊狀物只是幾乎完成初級(jí)干燥。對(duì)凍干周期作出以下關(guān)鍵改變，以解決這一問題 并創(chuàng)建更可調(diào)比例的過程1.擱板溫度降至_35°C，以確保藥物在初級(jí)干燥過程中以更大規(guī)模保持冷凍，2.初級(jí)干燥延長(zhǎng)至4000分鐘，以保證初級(jí)干燥在更大規(guī)模完成，以及3.真空增加至100mT，以加速干燥并允許更多可調(diào)比率的過程。轉(zhuǎn)移到Althea Technologies, Inc.的GMP臨床批次加工的凍干周期概述于表13。理化和生物特性概述實(shí)驗(yàn)確定的疫苗主要理化和生物學(xué)性質(zhì)總結(jié)如下?；瘜W(xué)上，疫苗分別由以3 2比率存在的艱難梭菌毒素A和B的非活性形式(類 毒素)組成。艱難梭菌毒素A和B分別是類似但結(jié)構(gòu)截然不同的308kDa和270kDa的大蛋白。物理上，疫苗以> 90%純度的溶液存在，沒有可檢測(cè)的聚集的跡象。生物化學(xué)上，在蛋白質(zhì)印跡分析中，疫苗的類毒素A和B對(duì)其相應(yīng)的毒素A或B特 異性抗體有免疫學(xué)反應(yīng)。生物學(xué)上，疫苗在倉鼠身上是免疫原性的，引起一致的和劑量依賴的血清抗體應(yīng) 答。疫苗類毒素A和B沒有細(xì)胞毒活性。如天然毒素A觀察到的，疫苗的類毒素A組分保 持某些受體結(jié)合活性。疫苗以凍干形式存在于由20mM檸檬酸鈉，pH 7. 5、5%蔗糖、0. 016%甲醛組成的 緩沖液中。產(chǎn)物在2-8°C保存。凍干篩選研究為篩選凍干制劑，采用倉鼠免疫原性進(jìn)行評(píng)價(jià)。凍干在FTSLyoStar II進(jìn)行。通 過降低擱板溫度低至足以使產(chǎn)物溫度低于Tg’而實(shí)現(xiàn)冷凍。通過打開真空并保持至游離水 已升華而開始初級(jí)干燥。擱板溫度隨后上升開始二級(jí)干燥，并通過脫去吸附水保持以進(jìn)一 步干燥產(chǎn)物。制劑在5、25和42°C的溫度條件時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定性研究。表1. GRAS賦形劑對(duì)類毒素A聚集的作用。延遲/防止聚集的化合物有正的％聚 集抑制值；誘導(dǎo)聚集的化合物有負(fù)的％聚集抑制值。
15
不確定度在士 的級(jí)別上。*高最初0D 350nm。表2. GRAS賦形劑對(duì)類毒素B聚集的作用。延遲/防止聚集的化合物有正的％聚
集抑制值；誘導(dǎo)聚集的化合物有負(fù)的％聚集抑制值。
不確定度在士 的級(jí)別上。*高最初0D350nm。表3.溶質(zhì)(洗滌劑)對(duì)類毒素A和B熱穩(wěn)定性的影響。熱穩(wěn)定性(Tm)由DSC監(jiān) 測(cè)。Tm是對(duì)應(yīng)于熱轉(zhuǎn)化最大峰位置的溫度。 表4.賦形劑對(duì)類毒素A的熱轉(zhuǎn)化溫度中點(diǎn)(Tm)的影響。熱轉(zhuǎn)化作為溫度的函數(shù) 通過208nm的⑶信號(hào)監(jiān)測(cè)。每次測(cè)量重復(fù)兩次，并有 0. 5°C的不確定度 表5.賦形劑對(duì)類毒素B熱轉(zhuǎn)化溫度中點(diǎn)(Tm)的影響。熱轉(zhuǎn)化作為溫度的函數(shù)通 過208nm的⑶信號(hào)監(jiān)測(cè)。每次測(cè)量重復(fù)兩次，并有 0. 5°C的不確定度。
表6.存在或不存在賦形劑(除另有指明外)時(shí)，結(jié)合至Alhydrogel (氫氧化鋁 佐劑)的類毒素A的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性(Tm)通過DSC檢測(cè)，Tm表示對(duì)應(yīng)于熱轉(zhuǎn)化峰位 置的溫度。測(cè)量每種條件下結(jié)合至佐劑的類毒素的百分比，不確定度為1%。每個(gè)條件重復(fù)
研究?jī)纱巍?br> 表7.存在或不存在溶質(zhì)(除另有指明外)時(shí)，結(jié)合至Alhydrogel (氫氧化鋁佐劑)的類毒素B的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性(Tm)通過DSC監(jiān)測(cè)。Tm表示對(duì)應(yīng)于熱轉(zhuǎn)化峰位置
的溫度。測(cè)量每種條件下結(jié)合至佐劑的蛋白的百分比，不確定度為1%。每個(gè)條件重復(fù)研究
兩次。
表 8 表 9類毒素B 2個(gè)月穩(wěn)定性 %類毒素回收 表10.不同溫度下保存后凍干制劑的外觀 表11.不同溫度下保存后凍干制劑的免疫原性(倉鼠中血清抗毒素A和B IgG效 價(jià))。
表 13. 以上引用的所有文獻(xiàn)的內(nèi)容都在此引作參考。本文使用的單數(shù)形式不排除表示相 應(yīng)的復(fù)數(shù)形式，除非上下文表明相反的意思。因此，例如如果權(quán)利要求寫明使用毒素、類毒 素或賦形劑，還可以解釋為包含使用超過一種毒素、類毒素或賦形劑，除非另有說明。其它 實(shí)施方案在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
包含艱難梭菌的毒素或類毒素，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，其中相對(duì)于沒有所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑增加所述毒素或類毒素的熱穩(wěn)定性，和/或減少或延遲所述毒素和/或類毒素的聚集。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中相對(duì)于沒有所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的 組合物，所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑減少或延遲所述毒素或類毒 素的聚集50% 或更多。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中相對(duì)于沒有所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑 的組合物，所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑增加所述毒素或類毒素的所述熱穩(wěn)定性 0. 5°C或更多。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌毒素A和B的類毒素。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述類毒素A和B在所述組合物中出現(xiàn)的比率為 5 1 (A B)至 1 5 (A B)。
6.權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述類毒素A和B在所述組合物中出現(xiàn)的比率為 3 1 至 3 2，或 1 1(A B)。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。
9.權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述佐劑包含鋁化合物。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述鋁化合物是氫氧化鋁化合物。
11.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是液體形式。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物是凍干、噴霧干燥或泡沫干燥的干粉形式。
13.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑選自緩沖 齊 、張度劑、簡(jiǎn)單糖、糖、糖聚合物、氨基酸、寡肽、聚氨基酸、多元醇及其醚、洗滌劑、脂質(zhì)、表 面活性劑、抗氧化劑、鹽、白蛋白、明膠、甲醛或其組合。
14.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述緩沖劑選自檸檬酸鹽、磷酸鹽、甘氨酸、組氨 酸、碳酸鹽和重碳酸鹽，并且濃度為5-100mM。
15.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述張度劑是甘露醇，濃度為l-50mM。
16.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述糖選自山梨醇、海藻糖和蔗糖，濃度為 1-30%。
17.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述氨基酸、寡肽或聚氨基酸濃度最高達(dá)100mM。
18.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述多元醇選自甘油、聚乙二醇及其醚，分子量 200-10，000，濃度最高達(dá)20%。
19.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述洗滌劑和脂質(zhì)選自脫氧膽酸鈉、吐溫20、吐溫 80和普朗尼克，濃度最高達(dá)0.5%。
20.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述糖聚合物選自右旋糖酐和纖維素。
21.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述鹽選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂和醋酸鎂，最 高達(dá)150mM。
22.權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述甲醛的存在量為0.0-0. 02%。
23.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種賦形劑包含一種或多種表1、表2、 表8或表9所列的賦形劑。
24.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。
25.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含磷酸鈉或磷酸鉀。
26.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含蔗糖。
27.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含檸檬酸鈉或檸檬酸鉀和蔗糖。
28.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物包含磷酸鈉或磷酸鉀和蔗糖。
29.權(quán)利要求24至28中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含甲醛。
30.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌類毒素A和B、5-100mM 檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、2-20%蔗糖，以及彡0. 020%甲醛，pH 5. 5-8. 5。
31.權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌類毒素A和B、10-30mM 檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、2-10%蔗糖，以及彡0. 020%甲醛，pH 6. 5-8. 0。
32.權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌類毒素A和B、20mM檸檬 酸鈉、5%蔗糖，以及彡0. 016%甲醛，pH 7. 5。
33.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌類毒素A和B、5-100mM 磷酸鈉或磷酸鉀、2-20%蔗糖，以及彡0. 020%甲醛，pH 5. 5-8. 5。
34.權(quán)利要求33所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌類毒素A和B、10-30mM 磷酸鈉或磷酸鉀、2-10%蔗糖，以及彡0. 020%甲醛，pH 6. 5-8. 0。
35.權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物包含艱難梭菌類毒素A和B、20mM磷酸 鉀、5%蔗糖，以及彡0. 016%甲醛，ρΗ7· 5。
36.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種賦形劑包含山梨醇。
37.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種賦形劑包含右旋糖。
38.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種賦形劑包含吐溫80。
39.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述一種或多種賦形劑包含山梨醇、右旋糖和吐溫80。
40.制備包含艱難梭菌的毒素或類毒素以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合 物的方法，其中相對(duì)于沒有所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物，所述一種或 多種藥學(xué)上可接受的賦形劑增加所述毒素或類毒素的熱穩(wěn)定性，和/或減少或延遲所述毒 素和/或類毒素的聚集，所述方法包含提供艱難梭菌的毒素或類毒素，并將艱難梭菌的所 述毒素或類毒素與所述一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合。
41.在受試者中誘導(dǎo)對(duì)艱難梭菌免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含將權(quán)利要求1至39中 任一項(xiàng)的組合物施用于受試者。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述患者尚未患有，但有罹患艱難梭菌疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述患者患有艱難梭菌疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括艱難梭菌毒素和/或類毒素的組合物及相應(yīng)方法。本發(fā)明的組合物包括一種或多種增加所述毒素的穩(wěn)定性和/或減少所述毒素聚集的賦形劑。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101855336SQ200880116603
公開日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2008年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月14日
發(fā)明者C·R·米道夫, P·恰拉梅塔羅, R·法爾納 申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德生物制劑公司