專利名稱：包含放線菌甘油?；苌锟乖乃幬锝M合物,其提取方法以及其抗結核病的用途的制作方法
包含放線菌甘油?；苌锟乖乃幬锝M合物，其提取方法以及其抗結核病的用途本發(fā)明涉及放線菌甘油酰基衍生物抗原的治療用途，其提取方法以及其治療或預 防結核病的用途。據(jù)估計每年結核病引起200萬例死亡。該疾病的致病因子是一種細菌，結核分枝 桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，全世界每三個人中有一個被這種細菌感染。其由被 感染的人的噴嚏或咳嗽通過空氣傳播。該細菌可以以無活性狀態(tài)藏匿于受感染的人中，該 受感染的人永遠不會發(fā)展該疾病。然而，在特定條件下，如年老或免疫系統(tǒng)受抑制，該細菌 會變得有活性并引起活性結核病的發(fā)生。分枝桿菌的被膜似乎是分枝桿菌(Mycobacterium)屬的細菌毒力的重要部 分。事實上，多至分枝桿菌40%的干重由脂質組成。已經(jīng)顯示這些脂質參與了宿主免疫 應答的調(diào)制。一些脂質為對于CDl蛋白質刺激非常規(guī)的α βΤ細胞的抗原。大部分分 枝桿菌脂質抗原由⑶Ib同種型所呈遞。一大組結構上非常不同的分子都是這種情況， 如分枝菌酸，葡糖單分枝菌酸酯(monomycolate)，硫代甘油脂及磷脂酰肌肌醇甘露糖苷 (phosphatidyl-myo-inositol mannosides, PIM)0特異于幾種最豐富的分枝桿菌脂質的CDl限制性T細胞的存在強烈暗示著CDl蛋 白質在對結核分枝桿菌的宿主應答中是重要的。目前，有兩種對抗結核病的方式抗生素治療和疫苗接種。用于預防結核病的疫苗由牛結核桿菌(Mycobacterium bovis)物種的活減毒細菌 構成。以在20世紀初首先涉及它的兩位科學家將其命名為BCG(BacilluS of Calmette and Guerin)。顯著地，用于免疫接種的BCG的不同菌株在Behr Μ. A.等人Science (1999) 284 1520-1523中有所描述。除了其為活疫苗(這使之不能用于免疫抑制的患者)這一缺陷之外，其針對結 核病的保護作用是有爭議的。因此，根據(jù)不同研究，BCG在成人中的保護性效力范圍為從 0% _80%，此外，其不能針對肺結核——成人中最流行的疾病進行保護。此外，已經(jīng)在超過35個國家發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌的抗生素抗性菌株。因此，本發(fā)明的一個主題是提供治療和/或預防結核病的更有效方式。因此非常需要提供進一步的新的免疫原性化合物。顯著地，本發(fā)明提供了新抗原，已顯示其在體外刺激⑶1-限制性T淋巴細胞。所 述抗原為甘油單分枝菌酸酯衍生物，已經(jīng)從放線菌如分枝桿菌中分離出來。分枝菌酸衍生物的特征已經(jīng)有大量報道(Laval等人，Anal Chem2001, 73 (18) 4537-4544 ；Villeneuve M.等人，Biochim Biophys Acta2005,1715(2) 71-80 ；Villeneuve M.等人，Biochim Biophys Acta 2007,1768(7) 1717-1726 ；Watanabe M.等人， Microbiology 2001，147 (Pt7) :1825_1837)。這些化合物是已知的，盡管其治療用途還沒被公開或指出，這是本發(fā)明的一個目 的。此外，根據(jù)本發(fā)明的一個進一步的目的，其對應的乙?；问胶瓦€原形式以及這些化合 物的特異性(R)對映異構體是新型的。
更具體而言，本發(fā)明涉及下列通式(I)的化合物，及其對映異構體、非對映異構 體，其混合物，以及其治療用途 其中R為包含20-90個碳原子的α -烷基化、β -羥基化羧酸的殘基；R’代表氫原子或?；鶊F(_C( = 0)-烷基)，其中烷基包含1-10個碳原子；并且*表示不對稱碳原子。優(yōu)選地，甘油骨架的不對稱碳O顯示出(R)構象。優(yōu)選地，R為具有式 其中(I)通過----附著到R上；并且T代表甲基基團或者分支的或線性的C10-C60烴鏈，或其衍生物，其另外包含一個 或多個雙鍵、-(C = 0)-基團、環(huán)丙基和/或環(huán)氧基(印oxy)，和/或另外由一個或多個選自 0H、0甲基的基團所取代；#代表不對稱碳原子；nl, n2為相同的或不同的，獨立地代表整數(shù)。優(yōu)選地，nl為5-40，更優(yōu)選地5_30之間包含的整數(shù)；優(yōu)選地，n2為5-30 ；更優(yōu)選地10_20之間包含的整數(shù)；優(yōu)選地，兩個不對稱碳原子都顯示出(R)構象；優(yōu)選地，T選自甲基基團或者分支的或線性的C10-C60，優(yōu)選地為C15-C50烴鏈，其
任選地包含1-5個雙鍵，和/或代表下式的基團 其中X 選自 Y 選自 并且n3，n4為相同的或不同的，獨立地代表5-30之間包含的整數(shù)；優(yōu)選地n3代表 12-16之間包含的整數(shù)且η4選自11、13、15、17、18和19，條件是當Y 為-—C ( = 0) -OH 時，則 T 為-—(CH2) n3-X_C ( = 0) -OH0分枝菌酸衍生物由Laval 等人，Anal Chem 2001,73(18) 4537-4544 ；Villeneuve M.等人，Biochim Biophys Acta 2005,1715(2) 71-80 ；Villeneuve M.等人，Biochim Biophys Acta 2007,1768(7) 1717-1726 ；Watanabe M.等 K, Microbiology 2001， 147 (Pt7) 1825-1837 定性。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明涉及如上文定義的式(I)的化合物本身，其中 R，代表-C( = 0)-烷基基團。這些化合物可通過應用或采用任何一般使用的已知?；椒ǎ唧w而言是通過 與乙酸酐反應，由相應的上文描述的式(I)的相應化合物獲得。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明涉及如上文定義的式(I)的化合物本身，其 中 T 代表廣 Nch^Z^ch^/CH3其中Y 為'' ''對應的化合物在本文中稱為“還原的化合物”。
這些化合物可通過應用或采用任何一般使用的已知還原方法，由相應的上文描述的式(I)的相應化合物獲得。優(yōu)選地，該反應可通過NABH4處理的方式進行。根據(jù)另一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明涉及如上文定義的式(I)的化合物本身，其 中Cf顯示出(R)構象。本文的GroMM指的是甘油單分枝菌酸酯。根據(jù)一個進一步的實施方式，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含如上文定義的式I 的化合物。本發(fā)明進一步涉及藥物組合物，其特征在于其含有選自式I化合物的化合物的混 合物。本發(fā)明還涉及藥物組合物，其含有至少一種上文定義的化合物或上文定義的組合 物，其與藥學可接受載體聯(lián)合。例如，所述的藥物組合物為疫苗。進一步地，本發(fā)明還涉及一種或多種式I的化合物與一種或多種分枝桿菌脂質的 組合，如選自分枝桿菌磷脂、分枝桿菌脂聚糖、分枝桿菌糖脂和磷脂的化合物，以及包含這 些的藥物組合物。這些脂質在本領域是已知的，且在Nigou等人(2003)Biochimie，85，153-166中公開。出乎意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述組合顯示了協(xié)同活性，這從以下結果中清楚可見。具體而言藥學可接受載體包括脂質體。所述的藥物組合物用于治療和/或預防放線菌的感染，具體而言是分枝桿菌屬， 如結核分枝桿菌或皮膚分枝桿菌的感染。組合物還可包含疫苗佐劑。用于人個體或動物的疫苗佐劑對本領域技術人員已熟 知，例如可在“A compendium of vaccine adjuvantsand excipients，，(第 2 片反，Vogel 等 人)中找到這些鹽的列表。具體而言，疫苗佐劑顯著地包括例如鋁鹽或M59。本發(fā)明具體而言涉及上文定義的藥物組合物，其特征在于其以旨在通過口服或注 射途徑施用的形式。本發(fā)明更具體而言涉及上文定義的藥物組合物，特性在于其包含一種或多種其他 用于治療或預防結核病的產(chǎn)品，如BCG或分枝桿菌蛋白質或放線菌脂質。詞語“放線菌甘油?；苌铩敝傅氖前l(fā)現(xiàn)于棒狀桿菌屬(Cornybacterium)、 分枝桿菌屬(Mycobacterium)和諾卡氏菌屬(Nocardia，CMN))的細菌中，優(yōu)選地發(fā)現(xiàn) 于牛分枝桿菌BCG、結核分枝桿菌，恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)、胃分枝 桿菌(Mycobacterium gastri)、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)，偶發(fā)分枝桿 菌(Mycobacterium fortuitum)、蟾分枝桿菌(Mycobacteriumxenopi)、堪薩其Jf 分枝桿菌 (Mycobacterium kansasii)、谷氨酸棒桿菌(Cornybacterium glutamicum)禾口星狀諾卡氏 菌(Nocardia asteroids)中的脂質。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，所述的脂質為牛分枝桿菌 BCG抗原。用于治療或預防結核病的其他產(chǎn)品顯著地包括免疫調(diào)制劑如細胞因子，編碼結核 分枝桿菌抗原的DNA片段，活的結核分枝桿菌缺失突變體如缺失了毒力基因的突變體，或 活的重組BCG如表達結核分枝桿菌抗原的BCG。
如本文使用的，結核病指的是由細菌結核分枝桿菌引起的人中的疾病，還指動物 中相應的疾病。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明涉及產(chǎn)品，其包含-至少一種如上文定義的化合物，以及 -至少一種用于治療或預防結核病的其他產(chǎn)品，如BCG或分枝桿菌蛋白質，作為組合的制備物用于在治療或預防結核病中同時、分開或順序使用。本發(fā)明還涉及至少一種上文定義的化合物或上文提到的組合物，用于制備旨在用 于治療或預防結核病的藥物，顯著地為疫苗的用途。本發(fā)明還涉及上文定義的化合物，作為用于治療或預防結核病的藥物?？蛇x地，疫苗可包含例如上文所描述的疫苗佐劑。本發(fā)明涉及至少一種上文定義的化合物或根據(jù)上文定義的組合物作為免疫反應 激活劑，更優(yōu)選地作為炎性反應激活劑的用途。通過“免疫反應激活劑”，意指具有在體外或體內(nèi)激活免疫反應的組分或過程的能 力的化合物，具體而言是在免疫系統(tǒng)細胞，如τ淋巴細胞，B淋巴細胞，抗原呈遞細胞(APC)， 如樹突細胞或巨噬細胞，單核細胞或粒細胞。通過“炎性反應激活劑”意指具有在體外或體內(nèi)激活炎性反應(如血球滲出，毛細 管通透，巨噬細胞激活或發(fā)燒發(fā)生)的組分或過程的能力的化合物。本發(fā)明還涉及至少一種上文定義的化合物或上文定義的組合物的用途，以誘導T 淋巴細胞的激活，顯著地為CDl-限制性T淋巴細胞的激活。激活能在體外或體內(nèi)進行。T淋巴細胞的激活能通過幾種方法評估，如測量細胞增殖或細胞因子如 IFN-Y (干擾素-Y)、IL_2(白介素-2)、IL_4(白介素_4)、或TNF-α (腫瘤壞死因子α)、 或GM-CSF的生產(chǎn)。⑶1-限制性T淋巴細胞為由⑶1分子呈遞的抗原所激活的T淋巴細胞。本發(fā)明還涉及至少一種上文定義的化合物或上文定義的組合物誘導細胞因子如 IFN- y、TNF- α、IL-2、IL-4、或 GM-CSF 生產(chǎn)的用途。此生產(chǎn)的誘導能在體外或體內(nèi)完成。細胞因子如IFN- γ、TNF- α、IL-2, IL_4、或 GM-CSF的生產(chǎn)能例如通過免疫測定如ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)或EIA (酶免疫測定)進 行測量。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明涉及產(chǎn)生特異于式(I)的化合物的T細胞克隆的方 法，其特征在于其包括以下步驟1)將抗原呈遞細胞(APC)，顯著地為樹突細胞，與放線菌脂質制備物(結核分枝桿 菌脂質制備物除外)或式(I)的化合物一同孵育，2)將外周血單核細胞與加載有被膜抗原的APC相接觸以獲得增殖性T細胞，3)通過有限稀釋來克隆增殖性T細胞，并選擇與式(I)化合物接觸時釋放選自細 胞因子如IFN- y、TNF- α、GM-CSF, IL-2或IL-4的分子的克隆。優(yōu)選地，在步驟1)中，放線菌脂質制備物為牛分枝桿菌BCG脂質制備物。本發(fā)明進一步涉及如通過上文提到的方法獲得的T細胞克隆。這種T細胞克隆在 如Z5B71的實例中有所描述。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明涉及篩選產(chǎn)品，如從放線菌(如分枝桿菌屬，棒狀桿菌屬和諾卡氏菌屬)中提取的放線菌甘油?；苌锏姆椒ǎ涮卣髟谟谄浒ㄒ韵虏?驟
-將加載有待篩選的產(chǎn)品(顯著地為提取自牛分枝桿菌BCG的甘油?；苌? 的樹突細胞與上文定義的T細胞克隆相接觸，-檢測選自細胞因子如IFN-γ、TNF-a、GM_CSF、IL_2或IL-4的分子，其由T細胞 克隆釋放。本發(fā)明還涉及用于從放線菌(如分枝桿菌屬、棒狀桿菌屬和諾卡氏菌屬)中提取 上文定義的化合物或上文定義的組合物的方法，其特征在于其包括以下步驟a.用甲醇和氯仿的混合物處理細菌以獲得氯仿/甲醇提取物，b.濃縮氯仿/甲醇提取物，之后是其在氯仿相(本文稱為脂質級分)和水相之間 的分配(partition),c.取走脂質級分。根據(jù)一個優(yōu)選的方面，所述的方法進一步包含以下附加的步驟d.蒸發(fā)大部分氯仿，之后向其中加入丙酮以獲得沉淀以及可溶性丙酮相，e.取丙酮不可溶相，之后將其濃縮，之后加入甲醇以獲得沉淀及甲醇不可溶相，f.取甲醇不可溶相，之后將其濃縮，并將濃縮的甲醇不可溶相應用到硅酸柱上，g.從上文提到的硅酸柱上用氯仿、甲醇及其混合物洗脫級分，所述的級分對應上 文定義的組合物，h.如果需要，純化從硅酸柱上洗脫的級分以獲得不同的制備物，其分別基本上只 含有一種上文定義的化合物。本發(fā)明還涉及可通過上述方法獲得的組合物和包含其的藥物組合物，以及如上所 述，所述組合物在制備用于預防或處理結核病的藥物中的用途，所述組合物作為免疫激活 劑的用途，所述的組合物誘導T淋巴細胞激活的用途，所述的組合物誘導產(chǎn)生細胞因子如 IFN- y、TNF- α、IL-2、IL-4、或 GM-CSF 的用途。附圖簡述

圖1顯示來自CMN組的多種細菌種的脂質級分的抗原性效力。脂質級分對Ζ5Β7Ι T細胞克隆的刺激通過IFN- y ELISA進行測量。條表示SD。谷氨酸棒狀桿菌(■)，諾卡氏菌屬(·)，牛分枝桿菌BCG(A)，結核分枝桿菌 H37Rv ( )，恥垢分枝桿菌(□)，偶發(fā)分枝桿菌(〇)，結核分枝桿菌H37Ra ( Δ )圖2顯示牛分枝桿菌BCG “甲醇可溶性”脂質庫的分級以及用Ζ5Β71 T細胞克隆 獲得的不同級分的反應性。(A)中顯示了通過硅色譜純化“甲醇不可溶”級分獲得的八個代表性級分(級分1， 3，5，10，18，19，28和34)的TLC分析。圈起來的化合物對應活性化合物。通過測量IFN-γ 釋放就對Ζ5Β71 T細胞克隆的刺激測試相同的級分(B)。條表示SD。圖3顯示牛分枝桿菌BCG GroMM(A)中以及牛分枝桿菌BCGGroMM皂化作用后獲得 的分枝菌酸(B)的陽性形式中MALDI-Tof-MS分析。星號對應污染物。(C)中的表詳細描述 了不同預期的分枝菌酸類型和對應GroMM的鈉加合物的計算質量。圖4代表了由1H NMR分析(δ 1H -O. 7-5. 4)確定的牛分枝桿菌BCGGroMM的結構 (A)。特異性GroMM質子信號注釋為a-k，并指定為牛分枝桿菌BCG GroMM主要形式的結構，即，通過氧代分枝菌酸(ketomycolic acid)的酯化，在(B)中顯示。nl = 19、21或23 ;n2 和 n4 = 15,17 或 19 ；n3 = 12-17。圖5顯示合成GroMM(A)中以及用于合成的結核分枝桿菌H37Rv分枝菌酸(B)的 陽性形式中MALDI-Tof-MS分析。星號對應污染物。(C)中的表詳細描述了不同預期的分枝 菌酸類型和對應GroMM的鈉加合物的計算質量。圖6表示由1H匪R分析(δ 1H 3. 0-4. 4)確定的合成Gro匪結構(B和C)，相比于 牛分枝桿菌BCG GroMM(D) 0牛分枝桿菌BCGGroMM主要形式的結構，S卩，通過氧代分枝菌酸 的酯化，在(A)中顯示。nl = 19、21或23 ；n2和n4 = 15、17或19 ；n3 = 12-17，甘油質子 信號注釋為a-c。(B)和(C)中顯示的結構分別對應于(S)-1-0-分枝酰-甘油(1-0-分枝酰-sn-甘 油)以及(R)-1-0-分枝酰-甘油(3-0-分枝酰-sn-甘油)。R對應于分枝菌酸。
圖7表示半合成的GroMM的生物學活性。在C32或C80s (S)-或s (R)-GroMM中， C32對應于棒狀桿菌酸，C80對應于分枝菌酸而⑶對應于(S)-1-0-分枝酰-甘油(1-0-分 枝酰-sn-甘油)，(R)對應于(R)-1-0-分枝酰-甘油(3-0-分枝酰-sn-甘油)。Z5B71 T 細胞克隆釋放的IFN- γ通過ELISA進行測量。條表示SD。圖8表示Gro匪的⑶Ib-限制性以及⑶Ie-不依賴性的呈遞，使用THP-I轉染的細 胞(A)和 CDla-c 抗體(B)。在(C)中，使用了 THP-l_CDlb( ■)和 THP-l-CDlb-CDle ( ·) 細胞。Z5B71 T細胞克隆釋放的TNF-α (Α和B)或IFN-γ (C)通過ELISA進行測量。條表 示SD。圖9表示特異于Ac2SGL(A), PIM6⑶及Gro匪(C)以及感染了活的結核分枝桿菌 (D)的CDlb-限制性T細胞對用熱滅活結核分枝桿菌沖擊(pulse)的DC細胞的識別。Z5B71 T細胞克隆釋放的IFN- γ通過ELISA進行測量。條表示SD。圖10表示對PPD-陰性和PPD-陽性供體的Gro匪的反應性在自體的表達OTl 的DC存在下，用GroMM刺激人供體的PBMC。六天后，收集培養(yǎng)物上清液并通過ELISA確定 IFN-Y濃度(A)在原初(naive ) (η = 10)，BCG免疫的(22)或隱性感染(η = 19)的健 康供體及TB患者(η= 11)之間比較對Gro匪的反應性。(B)為研究限制元素，在十名PPD 陽性健康供體中，在有或無CDlb阻斷抗體的情況下測試GroMM的反應性。黑圈顯示了個體 供體，水平條代表每組的平均。圖11表示從牛分枝桿菌BCG的GroMM純化方案(A)。純化后是脂質級分抗原性效 力(B和C)。Ζ5Β71 T細胞克隆釋放的IFN-Y通過ELISA進行測量。條表示SD。脂質級分 指的是氯仿相。圖12表示(S)-I-O-分枝酰-甘油(1-0-分枝酰-sn-甘油)和(R)-I-O-分枝 酰-甘油(3-0-分枝酰-sn-甘油)的合成方案。圖13表示獲自牛分枝桿菌BCG的分枝桿菌產(chǎn)品以及獲自還原反應的對應還原產(chǎn) 品的生物學活性。圖14表示獲自BCG的分枝桿菌產(chǎn)品與多種脂質的混合物的生物學活性。分枝桿 菌脂質LAM(脂阿拉伯甘露聚糖)，LM(脂甘露聚糖，lipomannan)，PIM2和PIM6(包含2或 6個甘露糖單位的磷脂酰肌肌醇甘露糖苷)。磷脂PS 磷脂酰絲氨酸，PE 磷脂酰乙醇胺， PC 磷脂酰膽堿，PI 磷脂酰肌醇。實施例材料和方法試劑。L-l，3-0-異丙叉-sn-甘油及D-l，2-0-異丙叉-sn-甘油，甘油三棕櫚酸 酯，1，2 二棕櫚酰-sn-甘油和單棕櫚酰甘油購自Sigma。心肌磷脂從牛分枝桿菌BCG脂質 提取物中純化得來，如Gilleron等人(2001) J Biol Chem 276，34896-904中描述的。細菌菌株和培養(yǎng)條件。星狀諾卡氏菌及谷氨酸棒狀桿菌分別在Luria Broth和心 腦浸出液培養(yǎng)基中于32°C下懸浮生長2-3天。分枝桿菌在Sauton培養(yǎng)基上于37°C下以表 面生物膜生長4-8周。從培養(yǎng)基中收獲并分離細胞，室溫下置于氯仿/甲醇(2 l，v/v) 中以滅活細菌。細胞培養(yǎng)。通過電穿孔，使用BCMGS-Neo和-Hygro載體以人⑶1A、或⑶1B、或 ⑶1C的cDNA轉染或人⑶1B和⑶1E的cDNA雙轉染人早幼粒細胞THP-1。細胞在補充有 10%胎牛血清(FCS)、10mM HEPES、2mM超谷氨酰胺11、1^11非必需氨基酸、11111丙酮酸鈉(均 來自Cambrex，布魯塞爾，比利時)和100 y g/ml卡那霉素(Invitrogen，巴塞爾，瑞士)的 RPMI-1640中生長。DC分離自健康供體的外周血單核細胞(PBMC)，通過將其在存在重組 IL-4 和 GM-CSF 下培養(yǎng)，如 Porcelli 等人(1992)，Nature 360，593-7 先前描述的。如 De Libero (1997)，ed. Butcher, N. F. a. G. (IRL, Oxford)，pp. 123-40 描述的，產(chǎn)生 T 細胞克隆， 并在補充有5% AB人血清(瑞士紅十字)、10mM HEPES、2mM超谷氨酰胺II、MEM非必需氨基 酸、ImM丙酮酸鈉、100ii g/ml卡那霉素和100單位/ml人重組IL-2的RPMI-1640中生長。T細胞激活測定。在加入T細胞(105/孔，一試三份)之前，將DC(3xl04/孔)或 ⑶1轉染的THP-1細胞(3xl04/孔)與不同濃度的經(jīng)超聲的抗原一起在含有10%FCS的 RPMI-1640中37°C下孵育2小時。孵育36小時后收集上清液，并使用酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)試劑盒(IFN- y 來自 Instrumentation Laboratory, Schlieren，瑞士；TNF-a 來 自BD Pharmingen,巴塞爾，瑞士)測量細胞因子釋放。數(shù)據(jù)表示為一試三份的平均pg/ml 士 標準差(SD)。⑶1限制性的分析。加入T細胞之前30分鐘，通過以lOyg/ml使用以下單克隆 抗體(mAb)抑制T細胞激活來研究CD1限制性0KT6(抗-CDla，美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type CultureCollection)ATCC CRL-8019)，WM-25(抗-CDlb ;Immunokontakt， 盧加諾，瑞士)，L161 (抗-CDlc ; Instrumentation Laboratory)，W6-32 (抗-I 類 MHC，ATCC) 及 L243 (抗-II 類 MHC，ATCC)?？?TCRV y 9 (B3)mAb 用作不相關 mAb。結核分枝桿菌對DC的沖擊和感染。結核分枝桿菌在80°C下20分鐘以被殺死， 在加入T細胞(105/孔，一試三份)前，在含有10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中37°C下與 DC(3xl04/孔)一起孵育 2 小時。按 De Libero 等人(2005) Immunity 22，763-72 先前所描 述的感染DC，并通過ELISA監(jiān)視IFN- y釋放。用于產(chǎn)生T細胞克隆的脂質級分。以先前獲得的牛分枝桿菌BCG富含PIM2的級 分產(chǎn)生 Z5B71T 細胞克隆，Gilleron 等人(2001) J BiolChem 276，34896-904。簡言之，將牛 分枝桿菌BCG細胞懸浮于氯仿/甲醇(1 1，v/v)中，并過濾四次。濃縮氯仿/甲醇提取 物并構成脂質級分，其進一步在水和氯仿之間分配。蒸發(fā)氯仿相并將其懸浮于最小體積的 氯仿中。4°C下加入丙酮過夜使之形成沉淀，離心(3，000g，4°C，15分鐘)而產(chǎn)生“丙酮可溶性”相以及“丙酮不溶性”相。將“丙酮可溶性”相應用到QMA-Spherosil M(BioSepra SA， Villeneuve-la-Garorme，法國)柱，用氯仿、氯仿/甲醇(1 1，v/v)、甲醇進行連續(xù)洗脫， 以洗脫中性化合物，然后以含0.1M醋酸銨的氯仿/甲醇(1 2，v/v)洗脫負電化合物(如 PIM2)。來自幾種放線菌的脂質級分。從幾種放線菌物種制備不同的脂質級分(如上文描 述的)，并針對Z5B71T細胞克隆進行測試來自恥垢分枝桿菌、結核分枝桿菌H37Ra、偶發(fā)分 枝桿菌、龜分枝桿菌(M. chelonae)、蟾分枝桿菌、星狀諾卡氏菌和谷氨酸棒狀桿菌的脂質級 分，來自恥垢分枝桿菌、結核分枝桿菌H37Rv、胃分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌和 牛分枝桿菌BCG的“丙酮可溶性”相，以及來自結核分枝桿菌H37Rv、胃分枝桿菌、堪薩斯分 枝桿菌、海分枝桿菌和牛分枝桿菌BCG的“丙酮不可溶”相。從牛分枝桿菌BCG純化Gro匪。對按上文描述獲得的來自牛分枝桿菌BCG的“丙 酮可溶性”級分進行甲醇沉淀，得到“甲醇可溶性”及“甲醇不溶性”級分?！凹状疾蝗苄浴?級分(150mg)在硅酸柱(1. 3x23cm)上進行分級，用7x175ml氯仿(1-7級分)、8x200ml的 氯仿 _ 甲醇(95 5，v/v) (8-15 級分)、9x225ml 氯仿-甲醇(9 1，v/v) (16-24 級分)、 7x175ml 氯仿-甲醇(85 15，v/v) (25-31 級分)和 7x175ml 氯仿-甲醇(7 3，v/v) (32-38級分)進行洗脫。發(fā)現(xiàn)5-8級分含有GroMM，并將其合并。純化物在覆鋁的硅膠板(Alugram Sil G ；Macherey-Nagel)上通過TLC進行檢查， 使用氯仿/甲醇(95 5，v/v)作為遷移溶劑。用溶于85%&H2S04的0.2%蒽酮(9，10_ 二 氫-9-加氧-蒽)(Sigma)檢測糖脂。GroMM乙?；?。在200 ii g的GroMM上實現(xiàn)全乙?；?peracetylation)，將上述 GroMM溶解于乙酸酐/無水吡啶(1 1, v/v)中并在80°C加熱30分鐘。反應混合物在氮 氣流下干燥，并溶于氯仿中用于MALDI-Tof-MS分析。為選擇性乙酰化GroMM羥基官能團， 將16 ill乙酸酐加入溶于150 u 1吡啶的10mg Gro匪中，在0°C下放置3小時。用CHC13提 取單-和二 -乙?；腉roMM，并在硅柱上進行純化，用CHC13和CHC13/CH30H (95/5，v/v)進 行連續(xù)洗脫。通過MALDI-Tof-MS以及NMR分析確定乙酰取代物的數(shù)量及其在Gro匪上的 位置。GroMM 皂化。將 800 ii 1 的 20% 甲氧乙醇/K0H(7 1，v/v)加至 500 ii g 的 GroMM。 然后在爐子中以100°c加熱混合物3小時。在冷卻以及用pH3硫酸水溶液進行酸化之后，分 枝菌酸用二乙醚酯(v/v)提取三次。合并乙醚相，用水洗滌五次，在氮氣流下干燥。將分枝 菌酸重新溶解于100 ill氯仿中，用于MALDI-Tof-MS分析。GroMM 還原。純化自 BCG 的 lmg GroMM 與 1，3mg 的 NaBH4 在 140 ii 1 THF 中反應， 在室溫下攪拌15分鐘。通過加入乙酸終止反應。蒸發(fā)反應混合物，加二氯甲烷攪拌并用水 洗滌兩次。Gro匪合成。在氬氣下于水性溶劑中進行反應。1-0-(4-甲苯磺?；?-2，3-0， 0-異丙叉-sn-甘油(Sowden 等人(1942) J Am Chem Soc42，1291-3)在 0°C下將 p-甲苯磺 酰氯(0. 3g，1. 57mmol)加入溶于無水吡啶(0.8ml)的2，3-0，0-異丙叉-sn_甘油(230mg， 1. 74mmol)。室溫下24小時后，將二乙醚加至反應混合物，并使用冷的1M鹽酸、水、飽和碳 酸氫鈉和水順序洗滌有機相。乙醚提取物在硫酸鎂上進行干燥并濃縮。在硅膠上進行色譜 (用石油醚/乙酸乙酯4/1，v/v進行洗脫)得到產(chǎn)品(大約100mg，0.35mmol)。以相同的方式從1，2-0，0-異丙叉-sn-甘油中獲得3-0- (4甲苯磺?；?_1，2_0，0-異丙叉-甘油。分枝菌鉀(potassium mycolates)根據(jù) Laval 等人(2001)在 AnalChem 73， 4537-44中描述的方法，從結核分枝桿菌H37Rv細胞中釋放分枝菌酸(由M. A. Laneelle, IPBS, Toulouse惠贈)。用10mM鹽酸和5M氫氧化鉀連續(xù)洗滌溶于氯仿中的分枝菌酸，而獲 得分枝菌鉀。在用氯仿提取之后，分枝菌鉀在硫酸鎂上進行干燥并濃縮。1-0-分枝酰 _2，3-0，0-異丙叉-sn-甘油(Defaye 等人(1956)Bull SocChim Biol (Paris) 38，1301-4)將分枝菌鉀(8mg，大約6 y mol)加至溶于無水二甲基亞砜 (0.150ml)的 1-0-(4 甲苯磺?；?-2，3-0，0-異丙叉-sn-甘油(2mg,7umol)中，在 135°C 下攪拌3天。反應混合物用1M鹽酸進行酸化并用二乙醚進行提取。然后用水洗滌乙醚提 取物，在硫酸鎂上進行干燥并濃縮。在硅膠上進行色譜(用石油醚/乙酸乙酯5/1，v/v洗 脫)得到產(chǎn)品(大約*!^』』!!!!!“)。以相同的方式從3-0-(4甲苯磺?；?-1，2-0，0-異 丙叉_甘油中獲得3-0-分枝酰-1，2-0，0-異丙叉-sn-甘油。1-0-分枝酰-sn-甘油(GroMM) (Sowden 等人(1942) J Am ChemSoc 42，1291-3) 將100 ill濃縮的鹽酸(d= 1.017)加至溶于二乙醚(0. lml)的1-0-分枝酰-2，3-0，0-異 丙叉-sn-甘油GmgJ.gymol)中。在室溫下攪拌10分鐘后，將水加至反應混合物，并用 二乙醚提取產(chǎn)品Omgd^iimol)。乙醚提取物在硫酸鎂上進行干燥并濃縮。不必須進行補 充純化。使用3-0-分枝酰-1，2-0，0-異丙叉-sn-甘油也獲得3-0-分枝酰-sn-甘油。MALDI-Tof-MSo MALDI-Tof-MS 分析是在 4700 蛋白質組分析儀(具有 Tof-Tof Optics, Applied Biosystems)上用反射器模式進行的。用來自Nd: YAG激光器的脈沖UV光 (355nm)的輻射實現(xiàn)電離。GroMM樣品通過該設備進行分析，在20kV下以正離子模式進行， 使用的提取延遲時間設定為20ns。一般地，加合100-250的激光發(fā)射的光譜以獲得最終光 譜。HABA(2-[4-羥基-苯偶氮基]-苯甲酸)基質(Sigma-Aldrich)以乙醇/水(1 1， v/v)中 10mg/ml的濃度使用。然后，將0. 5 ill樣品溶液及0. 5 yl基質溶液加到靶標上， 用微量吸頭混合，在輕柔的熱空氣氣流中進行干燥。在兩點上以分枝桿菌PIM對測量進行 外部校準。核磁共振(匪R)分析。以裝有Origin200 SGI 的 Avance DMX500質譜儀(Bruker)， 使用 Xwinnmx 2.6來記錄匪1 譜。將 GroMM 溶于 CDC13_CD30D，(9 1，v/v)并在 298K 下 于200x5mm 535-PP NMR管中進行分析。質子化學位移表示為來自氯仿信號的每百萬低場 的部分(Sh/TMS 7.27)。所有涉及所使用的相關光譜學和同核Hartmarm-Hahn譜序列以及 實驗步驟的細節(jié)都按先前描述的(Gilleron等人(2003) J Biol Chem 278，29880-9)。來自結核病患者和健康供體的淋巴細胞對Gro匪的識別。得到知情同意后，從 健康供體和結核病患者的血液中純化得到PBMC。所有本研究中包括的患者都患有被證明 是肺結核的培養(yǎng)物，并在供血時已經(jīng)用抗結核病藥物處理2-8周。PBMC(105/孔)與自體 DC(2xl04/孔)在lOyg/ml GroMM存在或不存在的情況下一起培養(yǎng)。6天后收集上清液并 用夾心ELISA就IFN- y的存在情況進行測試。在自體單核細胞分化成DC的2天中，PBMC 放置在37°C下補充的RPMI 1640培養(yǎng)基(見上文)中。與Gro匪平行，PBMC用10 y g/ml PPD (Chiron)和重組ESAT6 (Lionex)進行刺激。有應答的健康供體(在對PPD應答時至少 釋放250pg/ml IFN-y)被評分為BCG免疫。對兩種抗原都有應答的供體被認為是隱性結 核分枝桿菌感染的。那些對PPD不應答的評分為PPD-陰性。對于各自的實驗，在GroMM前30分鐘加入CDlb-和CDlc-阻斷抗體(BCDlb3. 1和F10-各10 u g/ml)的混合物以阻斷CD1呈遞。結果脂質反應性T細胞克隆的定性為了鑒定結核分枝桿菌⑶1-限制性T細胞脂質抗原的全部(r印ertoire)，開發(fā)了 一項策略，其基于受根據(jù)其極性和電荷的三種不同粗分枝桿菌脂質級分刺激的T細胞系的 產(chǎn)生(Gilleron等人(2004)J Exp Med 199,649-59) 從這些衍生自一名高度PPD-反應 性健康供體的PBMC的細胞系，通過有限稀釋建立了 T細胞克隆，對10個被發(fā)現(xiàn)為CD1-限 制性的單克隆進行進一步研究。這些克隆中的一個(叫做Z5B71)，為⑶4+，對其進行研究。 其是針對富含磷酰胺-肌-肌醇二甘露糖苷(PIM2)的級分而獲得的，所述級分獲自牛分枝 桿菌BCG細胞壁提取物。該克隆對來自不同分枝桿菌物種(牛分枝桿菌BCG、恥垢分枝桿 菌、胃分枝桿菌、海分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、蟾分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌及結核分枝桿菌 H37Ra)以及來自谷氨酸棒狀桿菌和星狀諾卡氏菌的脂質提取物起反應(圖1)。這樣，被識 別的脂質抗原明顯地廣泛分布于分枝桿菌屬，還在CMN組的細菌中存在。有趣的是，在所測 試的脂質提取物中，來自牛分枝桿菌BCG的似乎是最具刺激性的，暗示此抗原在這些細菌 中更豐富。純化刺激Z5B71細胞的脂質抗原使用牛分枝桿菌BCG脂質提取物進行脂質抗原的純化，因為其顯示了最強的刺激 活性，也因為該種屬的細胞被膜中的糖脂多樣性低于結核分枝桿菌的。脂質提取物通過丙 酮(已知沉淀磷脂的試劑)沉淀進行分配。“丙酮可溶性”和“丙酮不溶性”級分(圖11A) 刺激Z5B71T細胞克隆(圖11B)，這暗示了 i)該抗原不是偏好于分配在一個級分中或ii) 具有共同表位的不同抗原被這些T細胞識別。由于在“丙酮不溶性”級分上觀察到更強的反 應性，此級分進一步用甲醇進行沉淀。再一次地，Z5B71 T細胞對兩相都有反應(圖11C)， 盡管“甲醇不溶性”級分的應答更高。然后在硅膠柱上對“甲醇不溶性”級分進行分級，用含有增加量的甲醇的氯仿進行 洗脫(圖11A)。Z5B71 T細胞由5-9級分進行刺激(圖2B)，用氯仿或氯仿/甲醇(95/5， v/v)進行洗脫。當由TLC分析時，活性級分似乎含有均質產(chǎn)品(圖2A)。合并5-9級分，并 通過MALDI-Tof-MS和NMR進一步分析所得的級分。一種新型分枝桿菌脂質抗原的化學特征陽性模式MALDI質譜顯示了指定于陽離子化鈉分子離子[M+Na]+的峰的復雜模式 (圖3A)。整塊上的主峰為28個質量單位遠，暗示著不同分子物類間兩個甲基單位的差異， 可能是脂肪酸長度的異質性的結果。為證實該設想，產(chǎn)品在堿性條件下羥基化，通過GC(數(shù) 據(jù)未顯示)和MALDI-Tof-MS (圖3B)分析脂肪酸。陽性模式MALDI譜突出顯示了一系列分枝 菌酸特征性的峰(Laval等人，(2001)AnalChem. 73(18) :4537_44)。根據(jù)多種化學官能團在 部分分枝菌酸鏈(meromycolic chain)上的存在情況，將分枝菌酸細分為a-分枝菌酸、甲 氧分枝菌酸及氧代分枝菌酸(Daffe 和 Draper (1998) Adv. Microb. Physiol 39 131-203)。 結核分枝桿菌含有的a-分枝菌酸/氧合分枝菌酸(甲氧分枝菌酸+氧代分枝菌酸)比 率為1/1，而牛分枝桿菌BCG主要含有氧代分枝菌酸(Watanabe等人(2001)MiCrObiOlOgy 147,1825-37) o 與這些數(shù)據(jù)一致，m/z 1232、1260、1274、1288 和 1302 處的峰(圖 3B)指定為氧代分枝菌酸的[M+Na]+形式(圖3C)。原初產(chǎn)品及堿處理后所得的分枝菌酸之間的質量差異(A74amu)暗示分枝菌酸 將甘油殘基酯化。該分子的全乙酰化以及對反應產(chǎn)品的MALDI MS(未顯示)分析證明了分 子上乙醇官能團的數(shù)量。126質量單位的取代證明來有三個乙醇官能團的存在。然后，指定 新型抗原為甘油單分枝菌酸酯(GroMM)，這進一步得到ID NMR分析的支持(圖4A)。根 據(jù)發(fā)表的研究(Watanabe 等人(2001)Microbiology 147，1825-37 ；Schroeder 等人(2001) Bioorg Chem 29，164-77 ;Quemard等人(1997)Eur J Biochem 250，758-63指定了分枝菌酸 典型的共振。能容易地解釋部分分枝菌酸鏈上的一些質子在C0SY譜(未顯示)上共同關 聯(lián)的質子d( 5 2. 31)和e( S3. 53，多重譜線)分別指定為攜帶a _鏈和羥基基團的亞 甲基。也在C0SY譜上共同關聯(lián)的j( 5 2. 41，多重譜線)和k(S 0.92，雙重譜線)分別指定 為在部分分枝菌酸鏈末端級分攜帶一個甲基基團的亞甲基，以及此甲基。信號1 ( S 0. 75，三 重譜線)指定為a _鏈和部分分枝菌酸鏈的末端甲基基團的質子。在C0SY譜上共同關聯(lián)的 5-0.46、5 0. 44和S 0.52 (標記為h)處的多重譜線，為環(huán)丙烷基官能團質子的特征信號。 5ppm(6 5. 16的g和54. 83的f)周圍的信號對應烯基的質子，表明一小部分的分枝菌酸含 有乙烯基。在H0HAHA譜上共同關聯(lián)(未顯示)的質子a(S4. 11、4. 06和3. 99)，b ( S 3. 75) 及c( S 3. 47)，指定為甘油質子。然而，質子a被劃分為兩種獨立的系統(tǒng)，al ( S 4. 11和3. 99) 及a2 ( S 4. 06)，對合成的GroMM類似物的NMR分析使對其確切的指定變得可能。半合成的GroMM(sGroMM)是免疫原性的為了證實抗原的結構，使用分離自結核分枝桿菌H37Rv的分枝菌酸化學合成了 GroMM類似物(圖12)。通過MALDI-MS對結核分枝桿菌H37Rv分枝菌酸的分析(圖5B)顯 示了 m/z 1248、1276、1304和1332處的甲氧分枝菌酸的[M+Na]+形式為主要類型。也觀察 到了對應于氧代分枝菌酸(峰在m/z 1260、1288、1302和1316處)以及a -分枝菌酸(峰 在m/z 1160、1188和1216處)的離子，其豐度較低，如Laval等人(2001)Anal Chem 73， 4537-44之前描述的。使用(R)-及(S)_異丙叉-甘油開始化學合成，由P-甲苯-磺酰基激活(Sowden 等人(1942) J Am Chem Soc 42，1291-3)(圖12)。分枝菌酸對甘油的酯化是通過在分枝 菌鉀存在下加熱(R)或(S)_異丙叉-甘油而實現(xiàn)(Defaye等人(1956)Bull Soc Chim Biol (Paris) 38，1301-4)。然后將兩種異丙叉-分枝酰-甘油同種型在酸性條件下去保 護，得到合成的(R)_ 或(S)-GroMM(分別為 s(R)_GroMM 和 s(S)-GroMM)。兩種 sGroMM 的 MALDI質譜(圖5A)與具有結核分枝桿菌H37Rv分枝菌酸的Gro匪的預期質量分布一致 (圖5C)。然后兩種sGroMM通過ID1!! NMR(圖6B和C)進行分析。對1_0_分枝酰-sn_甘 油(s (S) -GroMM)的分析顯示了 4. 05ppm處的a質子(指定為al)(圖6B)，而對3_0_分枝 酰_sn-甘油(s(R)-GroMM)的分析顯示了 4. 00和4. 12ppm處的a質子(指定為a2)(圖 6C)。這些數(shù)據(jù)使得之后能解釋天然GroMM譜上甘油質子a的整體(massif)復雜性，其對 應著兩種同種型的混合物(圖6D)。從al和a2共振的強度(圖6D)，可推論天然GroMM由 兩種立體異構體以相同比例組成。s (R) -GroMM比s (S) -GroMM更有效地刺激Z5B71 T細胞，而純化的天然化合物具有 中等活性(圖7)。綜合而言，NMR分析和T細胞反應性證實了天然抗原的結構。GroMM由⑶lb呈遞且不需要⑶le的存在
Gro匪的⑶1限制元素是通過使用一組⑶-1轉染的APC刺激T-細胞而進行研究 的。只有表達CDlb的細胞能夠刺激T細胞(圖8A)。而且，CDlb限制進一步得到阻斷實驗 的支持，其中只有抗-CDlb mAb能夠抑制克隆的反應性(圖8B)。由于先前證明CDle能幫 助分枝桿菌脂質的呈遞(de la Salle等人，(2005) Science 310(5752) 1321-4)，還用表達 ⑶lb和⑶le兩者，或僅⑶lb的APC測試Gro匪的抗原性，以研究⑶le可能的參與情況。 兩種APC都誘導了非常類似的T細胞應答(圖8C)，因此排除了⑶le參與Gro匪呈遞。受感染細胞中的GroMM免疫原性一個重要的問題是分枝桿菌脂質抗原在感染期間，S卩，當其從居留在吞噬體中的 細菌的細胞壁中釋放時，是否維持其抗原性。這通過使用DC進行研究，其用熱滅活結核分 枝桿菌沖擊或用活的細菌感染。用熱滅活細菌沖擊的DC用于刺激識別三種不同結核分枝 桿菌脂質抗原的三個 T 細胞克隆，即 GroMM(Z5B71)、Ac2SGL (Z4B27)和 PIM6(Z5B11)。A。2SGL 和PIM6-反應性細胞(de la Salle 等人(2005) Science 310，1321-4 ;Gilleron 等人(2004) J Exp Med 199,649-59)在之前有描述。高劑量熱滅活細菌(100iig/ml)誘導了強烈的T 細胞應答(圖9A-C)，證實了所有三種脂質在與細菌細胞壁結合時可用于CDlb加載。當用 活的結核分枝桿菌感染APC時GroMM也是高度免疫原性的，顯示GroMM在感染過程中由DC 呈遞(圖9D)。來自PPD-陽性的健康供體的T細胞對Gro匪的識別為直接測試人供體外周血中的T細胞是否識別新型脂質化合物，從結核病患者(n =11)、PPD-陰性(n = 10)和BCG免疫的(n = 22)以及隱性結核分枝桿菌感染的(n = 19) 健康供體中收集血液樣品，并在GroMM刺激后測量IFN-Y釋放。顯著的應答僅僅在BCG免 疫的或隱性感染的健康供體中觀察到(平均值分別為73pg/ml和117pg/ml ；圖10A)。盡管 來自結核病患者的PBMC有力地對PPD(數(shù)據(jù)未顯示)應答，但GroMM沒有在該供體群中誘導 出背景水平以上的IFN-Y分泌。類似地，沒有在原初PPD-陰性供體中觀察到應答。Gro匪 誘導的IFN- y分泌是⑶1限制的，因為與MHC-I阻斷抗體(數(shù)據(jù)未顯示)相反，直接針對1 型⑶1分子的阻斷抗體消除了反應性(圖10B)。因此，Gro匪特異性、⑶1-限制性T細胞 在人供體外周血中的存在代表了分枝桿菌誘導的T細胞記憶。然而，這僅適用于健康供體， 而有活性結核病的患者不能識別GroMM。還原的化合物的活性增加為測試還原的化合物的活性，通過測量Gro匪和還原Gro匪的IFN_ y釋放而對 Z5B71 T細胞克隆的刺激進行測量。圖13中顯示的結果示例說明了還原的GroMM的活性增 加。分枝桿菌Gro匪與脂質的組合的協(xié)同活性為測試脂質是否強化分枝桿菌Gro匪的活性，對于多種分枝桿菌脂質(A)或磷脂 (B)，通過測量兩種試劑單獨或組合的IFN-Y釋放而對Z5B71 T細胞克隆的刺激進行測量。 圖14中顯示的結果說明了協(xié)同效應。
權利要求
藥物組合物，其包含至少一種具有式(I)的化合物及其對映異構體、非對映異構體，其混合物其中R為包含20-90個碳原子的α-烷基化、β-羥基化羧酸的殘基；R’代表氫原子或?；鶊F(-C(＝O)-烷基)，其中烷基包含1-10個碳原子；并且*表示不對稱碳原子。FPA00001139353800011.tif
2.根據(jù)權利要求1的藥物組合物，其中R為具有式 其中⑴通過一一附著到R上；并且T代表甲基基團或者分支的或線性的C10-C60烴鏈，其任選地包含一個或多個雙 鍵、-(C = 0)-基團、環(huán)丙基和/或環(huán)氧基，和/或任選地由一個或多個選自0H、0甲基的基 團所取代；^"代表不對稱碳原子；η 1，π2為相同的或不同的，獨立地代表整數(shù)。
3.根據(jù)權利要求2的藥物組合物，其中nl為5-40之間包含的整數(shù)。
4.根據(jù)權利要求2或3的藥物組合物，其中π2為5-30之間包含的整數(shù)。
5.根據(jù)權利要求2，3或4的藥物組合物，其中T選自 -甲基基團；或，-分支的或線性的C10-C60，其任選地包含1-5個雙鍵；或 -具有下式的基團 其中 X選自 并且n3，n4為相同的或不同的，獨立地代表5-30之間包含的整數(shù)，條件是當Y 為-—C ( = 0) -OH 時，則 T 為-—(CH2) n3-X-C ( = 0) -OH。
6.根據(jù)權利要求5的藥物組合物，其中π3代表了12-16之間包含的整數(shù)。
7.根據(jù)權利要求5或6的藥物組合物，其中n4選自11、13、15、17、18和19。
8.根據(jù)以上權利要求中任何一項的藥物組合物，其包含如以上權利要求中任何一項中 定義的式(I)的至少兩種不同化合物。
9.根據(jù)以上權利要求中任何一項的藥物組合物，其包含如以上權利要求中任何一項中 定義的式(I)的化合物的混合物。
10.根據(jù)以上權利要求中任何一項的藥物組合物，其特征在于其以旨在用于口服或可 注射途徑施用的形式存在。
11.根據(jù)以上權利要求中任何一項的藥物組合物，其特征在于其包含一種或多種用于 治療或預防結核病的其他產(chǎn)品。
12.根據(jù)權利要求11的藥物組合物，其中用于治療或預防結核病的所述產(chǎn)品選自BCG 或分枝桿菌脂質。
13.根據(jù)權利要求11的藥物組合物，其中所述分枝桿菌脂質選自分枝桿菌磷脂，分枝 桿菌脂聚糖、分枝桿菌糖脂和磷脂。
14.根據(jù)權利要求11、12或13的藥物組合物，其作為組合制備物用于在治療或預防結 核病中同時、分開或順序使用。
15.根據(jù)以上權利要求中任何一項的藥物組合物，其為疫苗。
16.式(I)的化合物及其對映異構體，非對映異構體，其混合物 其中R’代表氫原子或酰基基團(-C ( = 0)-烷基)，其中烷基包含1-10個碳原子； *表示不對稱碳原子；并且 R為具有式 其中⑴通過一一附著到R上； ^"代表不對稱碳原子；η 1，π2為相同的或不同的，獨立地代表整數(shù)；且 T為具有下式的基團 其中n3, n4為相同的或不同的，獨立地代表5_30之間包含的整數(shù)。 X選自
17.式(I)化合物及其對映異構體、非對映異構體，其混合物 其中R為包含20-90個碳原子的α -烷基化β -羥基化羧酸的殘基； R’代表?；鶊F(-C( = O)-烷基)，其中烷基包含1-10個碳原子；并且 *表示不對稱碳原子。
18.權利要求17的化合物，其中R為具有式 其中⑴通過一一附著到R上；且T代表甲基基團或者分支的或線性的C10-C60烴鏈，其任選地包含一個或多個雙 鍵、-(C = 0)-基團、環(huán)丙基和/或環(huán)氧基，和/或任選地由一個或多個選自0Η、0甲基的基 團所取代；^"代表不對稱碳原子；η 1，π2為相同的或不同的，獨立地代表整數(shù)。
19.根據(jù)權利要求16、17或18的化合物，其中nl為5_40之間包含的整數(shù)，n2為5_30 之間包含的整數(shù)。
20.根據(jù)權利要求18或19的化合物，其中T選自 -甲基；或-分支的或線性的C10-C60，其任選地包含1-5個雙鍵；或 -具有下式的基團 其中 X選自 并且π3，η4為相同的或不同的，獨立地代表5-30之間包含的整數(shù)，條件是當Y 為-—C ( = 0) -OH 時，則 T 為-—(CH2) n3-X-C ( = 0) -OH。
21.根據(jù)權利要求16或20的化合物，其中n3代表12-16之間包含的整數(shù)，n4選自11、 13、15、17、18 和 19。
22.如在權利要求1-15中任何一項中定義的化合物，其特征在于式(I)中Cf顯示出 (R)構象。
23.至少一種如權利要求1-22中任何一項定義的式(I)的化合物在制備旨在用于治療 或預防結核病的藥物中的用途。
24.如權利要求1-22中任何一項定義的化合物，作為藥物用于治療或預防結核病。
25.至少一種如權利要求1-22中任何一項定義的化合物作為免疫反應激活劑的用途。
26.至少一種如權利要求1-22中任何一項定義的化合物誘導T淋巴細胞激活的用途。
27.至少一種如權利要求1-22中任何一項定義的化合物誘導IFN-γ、TNF-α、IL-2、 IL-4、或GM-CSF生產(chǎn)的用途。
28.用于產(chǎn)生特異于如權利要求1-22中任何一項定義的式(I)的化合物的T細胞克隆 的方法，其特征在于其包括以下步驟1)將抗原呈遞細胞(APC)，顯著地為樹突細胞，與放線菌脂質制備物(結核分枝桿菌脂 質制備物除外)或式(I)的化合物一起孵育。2)將外周血單核細胞與加載有被膜抗原的APC相接觸以獲得增殖性T細胞，3)通過有限稀釋來克隆增殖性T細胞并選擇與式(I)化合物接觸時釋放選自細胞因子 如 IFN- y、TNF- α、GM-CSF, IL-2 或 IL-4 的分子的克隆。
29.根據(jù)權利要求28的方法，其中在步驟1)中，放線菌脂質制備物為牛分枝桿菌BCG 脂質制備物。
30.通過根據(jù)權利要求29的方法可獲得的T細胞克隆。
31.用于篩選產(chǎn)品的方法，其特征在于其包括以下步驟-將加載有待篩選的產(chǎn)品的樹突細胞與根據(jù)權利要求30的T細胞克隆相接觸，-檢測選自細胞因子如IFN-γ、TNF-a、GM_CSF、IL_2或IL-4的分子，其由T細胞克隆 釋放。
32.用于從放線菌中提取如權利要求1-22中任何一項定義的化合物的方法，其特征在 于其包括以下步驟a.用甲醇和氯仿混合物處理細菌以獲得氯仿/甲醇提取物，b.濃縮氯仿/甲醇提取物，之后是其在氯仿相(本文稱為脂質級分)和水相之間的分配，c.取走脂質級分。
33.根據(jù)權利要求32的方法，其進一步包含以下附加的步驟d.蒸發(fā)大部分氯仿，之后向其中加入丙酮以獲得沉淀以及可溶性丙酮相，e.取丙酮不可溶相，之后將其濃縮，之后加入甲醇以獲得沉淀及甲醇不可溶相，f.取甲醇不可溶相，之后將其濃縮，并將濃縮的甲醇不可溶相應用到硅酸柱上，g.從上文提到的硅酸柱上用氯仿、甲醇及其混合物洗脫級分，所述的級分對應上文定 義的組合物，h.如果需要，純化從硅酸柱上洗脫的級分以獲得不同的制備物，其分別基本上只含有 一種上文定義的化合物。
34.通過根據(jù)權利要求32或33的方法可獲得的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及放線菌甘油單分枝菌酸酯衍生物作為抗原的治療用途，其提取方法及其用于治療或預防結核病的用途。
文檔編號C12Q1/18GK101868247SQ200880116784
公開日2010年10月20日 申請日期2008年10月13日 優(yōu)先權日2007年10月12日
發(fā)明者E·萊爾, G·德里貝羅, G·普佐, J·普蘭迪, M·基勒隆, S·斯滕格 申請人:國家科研中心