專利名稱：在重組酵母中生產(chǎn)二羧酸的制作方法
在重組酵母中生產(chǎn)二羧酸本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的重組酵母，所述核苷酸序列編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn) 化為延胡索酸的酶，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)二羧酸的方法。二羧酸例如延胡索酸和琥珀酸是大量化學(xué)品的潛在前體。例如，琥珀酸可以被轉(zhuǎn) 化為1，4_ 丁二醇(BD0)、四氫呋喃和丁酸內(nèi)酯。衍生自琥珀酸的另一產(chǎn)物是通過連接 琥珀酸和BD0制造的聚酯聚合物。琥珀酸主要通過丁烷氫化的石油化學(xué)方法生產(chǎn)。這些方法被認(rèn)為對(duì)環(huán)境有害，并 且昂貴。琥珀酸的發(fā)酵生產(chǎn)可以是生產(chǎn)琥珀酸的一種有吸引力的替代性方法，其中可以使 用可再生的原料作為碳源。已知大量不同的細(xì)菌如Escherichia coli和瘤胃細(xì)菌Actinobacillus、 Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia 或 Succinimonas sp.能生產(chǎn)玻拍酸。對(duì) 這些細(xì)菌菌株的代謝改造提高了琥珀酸產(chǎn)率和/或生產(chǎn)力，或者減少了副產(chǎn)物形成。W02007/061590公開了用于生產(chǎn)蘋果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脫羧酶陰性酵母， 用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶和蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MAE)對(duì)所 述酵母加以轉(zhuǎn)化。盡管琥珀酸的發(fā)酵生產(chǎn)有所改進(jìn)，但是仍然需要用于發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的改進(jìn)的微 生物。本發(fā)明的一個(gè)目的是用于生產(chǎn)二羧酸如延胡索酸和琥珀酸的替代性酵母。根據(jù)本發(fā)明用編碼下述核苷酸序列的重組酵母實(shí)現(xiàn)了這一目的，所述核苷酸序列 編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的異源酶。驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過根據(jù)本發(fā)明的重組酵母，生產(chǎn) 出的二羧酸如延胡索酸和/或蘋果酸的量與野生型酵母相比有所提高。在本文中使用時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的重組酵母被定義為下述細(xì)胞，所述細(xì)胞含有天然 不存在于所述酵母中的核苷酸序列和/或蛋白質(zhì)，或所述細(xì)胞經(jīng)天然不存在于所述酵母中 的核苷酸序列和/或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化或遺傳修飾，或者其含有內(nèi)源核酸序列(或蛋白質(zhì))的額 外一個(gè)或多個(gè)拷貝。野生型酵母在本文中被定義為重組酵母的親本酵母。優(yōu)選地，編碼酶的核苷酸序列表達(dá)后，催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的酶在胞質(zhì)溶 膠中有活性。催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的酶優(yōu)選地具有延胡索酸酶活性，優(yōu)選地所述酶為EC 4. 2. 1. 2的延胡索酸酶。催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的酶可以來自于任何合適的起源，例如細(xì)菌、酵母、真 菌、原生動(dòng)物或植物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶來自于Rhizopus oryzae。顯示Rhizopus oryzae的異源fumR基因在Aspergillus niger中的表達(dá)在氧受 限的條件下不導(dǎo)致琥珀酸生產(chǎn)(PhD thesis, 2006 ff. A. de Jongh, Biocentrum Technical University of Denmark)。令人驚訝的是，表達(dá)本發(fā)明的異源延胡索酸酶的酵母在氧受限 的條件下生產(chǎn)與野生型酵母相比更大量的琥珀酸。用于表示給定(重組)核酸或多肽分子和給定宿主生物或宿主細(xì)胞之間相互關(guān)系 時(shí)，術(shù)語“同源的”被理解為表示天然情況下所述核酸或多肽分子即由相同物種的宿主細(xì)胞或生物生產(chǎn)，優(yōu)選由相同品種或菌株的宿主細(xì)胞或生物生產(chǎn)。關(guān)于核酸(DNA或RNA)或蛋白質(zhì)使用時(shí)，術(shù)語“異源的”是指下述核酸或蛋白質(zhì)，所 述核酸或蛋白質(zhì)不作為其出現(xiàn)的生物、細(xì)胞、基因組或DNA或RNA序列的一部分天然存在， 或者存在于與其天然存在不同的細(xì)胞或基因組或DNA或RNA序列中的一個(gè)或多個(gè)位置中。 異源核酸或蛋白質(zhì)對(duì)引入它的細(xì)胞而言不是內(nèi)源的，而是得自另一細(xì)胞或合成生產(chǎn)或重組 生產(chǎn)的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母是包含下述核苷酸序列的酵母，所述核苷酸序列編碼 催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的酶，其中所述酶與SEQ ID N0:1或SEQ ID NO :3的氨基酸 序列、優(yōu)選與SEQ ID NO :3的氨基酸序列具有至少70%、75%，優(yōu)選至少80%、85%、90%、 92%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性，優(yōu)選所述酶包含 SEQ ID NO :3。序列同一性在本文中被定義為通過比較序列測(cè)定的兩條或更多條氨基酸(多肽 或蛋白質(zhì))序列或兩條或更多條核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系。通常，在被比較的序 列的整個(gè)長(zhǎng)度上比較序列。在本領(lǐng)域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之間的序列相 關(guān)度，根據(jù)情況通過這類序列串之間的匹配測(cè)定。測(cè)定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計(jì)為在測(cè)試的序列之間給予最大匹配。測(cè)定同一性的 方法被編碼于公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中。測(cè)定兩條序列之間同一性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序 方法包括BLASTP和BLASTN，公眾可從NCBI和其它來源(BLAST Manual, Altschul, S.，等， NCBI NLM NIHBethesda,MD 20894)獲得。使用BLASTP的氨基酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺 口開放11. 0，缺口延伸1，Blosum 62矩陣。使用BLASTP的核酸序列比較的優(yōu)選參數(shù)為缺 口開放11. 0，缺口延伸1，DNA完全矩陣(DNA同一性矩陣)。根據(jù)本發(fā)明編碼在胞質(zhì)溶膠中催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸的酶的核苷酸序列也可 以通過它們?cè)谥卸入s交條件或優(yōu)選嚴(yán)格雜交條件下與編碼SEQID NO :1或SEQ ID NO 3酶 的核苷酸序列雜交的能力來定義。嚴(yán)格雜交條件在本文中定義為下述條件所述條件允許 至少約25個(gè)、優(yōu)選約50個(gè)核苷酸、75或100個(gè)、優(yōu)選約200或更多個(gè)核苷酸的核酸序列，在 約65°C的溫度下，在包含約1M鹽的溶液(優(yōu)選6xSSC(氯化鈉、檸檬酸鈉))或具有與之相 當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的任何其它溶液中雜交，以及在65°C下，在包含約0. 1M或更少鹽、優(yōu)選0. 2x SSC的溶液或具有與之相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的任何其它溶液中洗滌。優(yōu)選地，雜交過夜進(jìn)行，即 至少進(jìn)行10小時(shí)，以及優(yōu)選地，洗滌進(jìn)行至少1小時(shí)，其中至少將洗滌溶液更換兩次。這些 條件通常會(huì)允許具有約90%或更多序列同一性的序列的特異性雜交。中度條件在本文中定義為下述條件，所述條件允許至少50個(gè)核苷酸、優(yōu)選約200 或更多個(gè)核苷酸的核酸序列，在約45°C的溫度下，在包含約1M鹽的溶液(優(yōu)選6xSSC)或 具有與之相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的任何其它溶液中雜交，以及室溫下，在包含約1M鹽的溶液(優(yōu) 選6xSSC)或具有與之相當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度的任何其它溶液中洗滌。優(yōu)選地，雜交過夜進(jìn)行，即 至少進(jìn)行10小時(shí)，以及優(yōu)選地，洗滌進(jìn)行至少進(jìn)行1小時(shí)，其中至少將洗滌溶液更換兩次。 這些條件通常會(huì)允許具有多達(dá)50%序列同一性的序列的特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 能夠調(diào)整這些雜交條件，從而特異性地鑒定同一性在50%和90%之間變化的序列。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中為RNA聚合酶 II)的模板的核酸序列?；虮晦D(zhuǎn)錄為mRNA，隨后被翻譯為蛋白質(zhì)。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚體，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知類似物，因 為它們能夠以類似于天然存在的核苷酸的方式與單鏈核酸雜交(例如肽核酸)。多核苷酸 可以是天然或異源的結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的全長(zhǎng)或亞序列。除非另有說明，該術(shù)語包括特 定的序列及其互補(bǔ)序列。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，表示氨基酸殘基的多聚體。 該術(shù)語適用于下述氨基酸多聚體，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸 的人工化學(xué)類似物，還適用于天然存在的氨基酸多聚體。天然存在的氨基酸的這類類似物 的關(guān)鍵特征是，當(dāng)摻入蛋白質(zhì)中時(shí)，蛋白質(zhì)與下述抗體特異反應(yīng)，所述抗體針對(duì)相同但是完 全由天然存在的氨基酸組成的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”也包括修飾， 所述修飾包括但不限于糖基化、脂質(zhì)結(jié)合、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的Y "羧基化、羥基化和 ADP-核糖基化。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“酶”被定義為在細(xì)胞例如酵母細(xì)胞中催化(生物)化學(xué)反 應(yīng)的蛋白質(zhì)。為了提高引入的酶在本發(fā)明的酵母中以活性形式表達(dá)的可能性，可以改變相應(yīng) 的編碼核苷酸序列，從而使其密碼子選擇針對(duì)選用的酵母細(xì)胞而優(yōu)化。用于密碼子優(yōu)化 的若干方法是本領(lǐng)域已知的。針對(duì)酵母優(yōu)化核苷酸序列密碼子選擇的一種優(yōu)選的方法是 W02008/000632中公開的密碼子對(duì)優(yōu)化技術(shù)。密碼子對(duì)優(yōu)化是在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)多肽的一 種方法，其中在其密碼子使用方面(特別是使用的密碼子對(duì))，對(duì)編碼多肽的核苷酸序列進(jìn) 行了修飾、，從而獲得編碼多肽的核苷酸序列提高的表達(dá)和/或提高的多肽生產(chǎn)。密碼子對(duì) 被定義為編碼序列中兩個(gè)相繼三聯(lián)體(密碼子)的集合。通常，編碼酶(例如催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸)的核苷酸序列與使得相應(yīng)核苷 酸序列在本發(fā)明酵母中充分表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接，從而賦予酵母生產(chǎn)延胡索酸和/ 或琥珀酸的能力。在本文中使用時(shí)，“可操作地連接”是指處于功能性關(guān)系中的多核苷酸元件(或編 碼序列或核酸序列)的連接。當(dāng)核酸序列被放置為與另一核酸序列處于功能性關(guān)系時(shí)，其 是“可操作地連接”的。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子能影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則其與編碼序 列可操作地連接。在本文中使用時(shí)，術(shù)語“啟動(dòng)子”是指下述核酸片段，其發(fā)揮控制一個(gè)或多個(gè)基因 轉(zhuǎn)錄的功能，就轉(zhuǎn)錄方向而言位于基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的上游，并且在結(jié)構(gòu)上通過DNA-依賴型 RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它DNA序列的存在而被識(shí) 別?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大部分環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是 在環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。能夠用于實(shí)現(xiàn)編碼酶(例如催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的酶)的核苷酸序列表達(dá) 的啟動(dòng)子對(duì)編碼待表達(dá)的酶的核苷酸序列而言可以不是天然的，即對(duì)與之可操作地連接的 核苷酸序列(編碼序列)而言異源的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述啟動(dòng)子對(duì)宿主細(xì)胞而言是同源 的，即內(nèi)源的。本文上下文中合適的啟動(dòng)子既包括組成型又包括誘導(dǎo)型的天然啟動(dòng)子以及經(jīng)改 造的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。真核宿主細(xì)胞中合適的啟動(dòng)子可以是 GAL7、GAL10 或 GAL 1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、EN0、TPI和A0X1。其它合適的啟動(dòng)子包括？0(、6 01、？61(1、1￡ 1和TDH。通常，編碼酶的核苷酸序列包含終止子。本發(fā)明中可以使用在真核細(xì)胞中有功能 的任何終止子。優(yōu)選的終止子得自宿主細(xì)胞的天然基因。合適的終止子序列是本領(lǐng)域公知 的。優(yōu)選地，這類終止子與下述突變組合，所述突變防止本發(fā)明宿主細(xì)胞中無義介導(dǎo)的mRNA 衰退(見例如 Shirley 等，2002，Genetics 161 :1465_1482)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，過量表達(dá)編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的酶(例如 延胡索酸酶)的核苷酸序列，從而通過根據(jù)本發(fā)明的重組酵母實(shí)現(xiàn)提高的延胡索酸和/或 琥珀酸生產(chǎn)。本領(lǐng)域可獲得多種手段用于在本發(fā)明的酵母細(xì)胞中過量表達(dá)編碼酶的核苷酸序 列。具體地，可以通過提高細(xì)胞中編碼酶的基因的拷貝數(shù)，例如通過在細(xì)胞的基因組中整合 額外的基因拷貝，通過表達(dá)來自著絲粒載體、來自附加體多拷貝表達(dá)載體的基因，或者通過 引入包含多拷貝基因的(附加體)表達(dá)載體，來過量表達(dá)編碼酶的核苷酸序列。優(yōu)選地，用 (強(qiáng))組成型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的酶的過量表達(dá)。核酸構(gòu)建體可以是質(zhì)粒，例如低拷貝質(zhì)粒或高拷貝質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明的酵母可包 含單個(gè)、但是優(yōu)選地包含多個(gè)拷貝的編碼延胡索酸酶的核苷酸序列，例如通過多拷貝的核 苷酸構(gòu)建體來實(shí)現(xiàn)。核酸構(gòu)建體可以保持為附加體，并因此包含用于自主復(fù)制的序列，例如常染色 體復(fù)制序列序列。合適的附加體核酸構(gòu)建體可例如基于酵母或pKDl質(zhì)粒(Gleer 等，1991，Biotechnology 9:968-975)或 AMA 質(zhì)粒(Fierro 等，1995，Curr Genet. 29 482-489)?；蛘撸梢詫⒚糠N核酸構(gòu)建體以一個(gè)或多個(gè)拷貝整合進(jìn)酵母細(xì)胞的基因組中。進(jìn) 入細(xì)胞基因組的整合可以通過非同源重組隨機(jī)發(fā)生，但是優(yōu)選地，可以如本領(lǐng)域所公知的， 通過同源重組將核酸構(gòu)建體整合進(jìn)細(xì)胞的基因組中(見例如W090/14423、EP-A-0481008、 EP-A-0635 574 和 US 6，265，186)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在編碼核苷酸序列表達(dá)后，催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索 酸的酶在胞質(zhì)溶膠中有活性。就真核細(xì)胞對(duì)延胡索酸和/或琥珀酸的高生產(chǎn)力而言，酶的 胞質(zhì)溶膠活性是優(yōu)選的。編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸的酶的核苷酸序列可包含過氧化物酶體或線粒體 靴向信號(hào)，例如通過 Schliiter 等，Nucleic acid Research 2007，Vol25，D815-D822 公開 的方法所確定的。在酶包含靶向信號(hào)的事件中，優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母包含截短形式的 酶，其中所述靶向信號(hào)被去除。根據(jù)本發(fā)明的酵母優(yōu)選地屬于Saccharomyces、Pichia、Kluyveromyces或 Zygosaccharomyces 屬之一。更優(yōu)選地，真核細(xì)胞是 Saccharomycescerevisiae、 Saccharomyces uvarum、Saccharomyces bayanus、Pichiastipidis、Kluyveromyces marxianus、K. lactis、K. thermotolerans 或 Zygosaccharomyces bailii。優(yōu)選地，酵母是Saccharomyces cerevisiae,優(yōu)選是包含 SEQ ID NO 4 的 Saccharomyces cerevisiae。除了編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的本發(fā)明酶的核苷酸序列以外，根據(jù)本發(fā)明 的重組酵母可包含其它遺傳修飾，例如同源核苷酸序列中的突變、缺失或斷裂，和/或用編 碼同源或異源的下述酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化，所述酶在細(xì)胞中催化反應(yīng)，導(dǎo)致提高的朝向延
6胡索酸和/或琥珀酸的通量。例如可有利地引入、遺傳修飾和/或過量表達(dá)下述異源和/ 或同源核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼i)催化磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸轉(zhuǎn)化成草酰乙 酸的酶；ii)催化從草酰乙酸轉(zhuǎn)化成蘋果酸的蘋果酸脫氫酶；或iii)催化延胡索酸轉(zhuǎn)化成 琥珀酸的延胡索酸還原酶。優(yōu)選地，i)、ii)和iii)的酶在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。胞質(zhì)溶膠表 達(dá)可以如本文之前所述，通過線粒體或過氧化物酶體靶向信號(hào)的缺失或修飾來實(shí)現(xiàn)。另外， 如上文所述的分子DNA技術(shù)(例如過量表達(dá)和密碼子優(yōu)化)也適用于這些核苷酸序列?？梢杂么呋疌3到C4碳分子反應(yīng)的任何合適的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或遺傳修飾酵母， 所述反應(yīng)例如為磷酸烯醇丙酮酸(PEP，C3)到草酰乙酸(0AA，C4)和丙酮酸(C3)到0AA或 蘋果酸。合適的酶是催化PEP轉(zhuǎn)化成0AA的PEP羧激酶(EC 4. 1. 1. 49，EC 4. 1. 1. 38)和 PEP羧化酶(EC 4. 1. 1. 31)；催化丙酮酸反應(yīng)成為0AA的丙酮酸羧化酶(EC 6. 4. 1. 1.)；或 催化丙酮酸反應(yīng)成為蘋果酸的蘋果酸酶(EC 1. 1. 1. 38)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母中的內(nèi)源延胡索酸酶活性被降低，例如通過缺失，斷裂 或突變編碼酵母內(nèi)源延胡索酸酶的基因來實(shí)現(xiàn)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞還包含同源或異源的蘋果酸脫氫 酶(MDH)。優(yōu)選地，通過本文所述本領(lǐng)域已知的方法通過過量表達(dá)來提高蘋果酸脫氫酶的活 性。優(yōu)選地，如例如W02007/061590中所述，在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)MDH。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母是其中至少一種編碼醇脫氫酶的基因沒有功能的酵 母。無功能的醇脫氫酶在本文中用于描述下述酵母，其中通過突變、斷裂或缺失，例如通過 Gueldener 等 2002，Nucleic Acids Research, Vol. 30，No. 6，e23 所公開的方法，使編碼醇 脫氫酶的基因失活。優(yōu)選地，所述酵母是Saccharomyces cerevisiae，其中編碼醇脫氫酶的 一個(gè)或多個(gè)adhl和/或adh2基因失活。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母還包含至少一種編碼無功能的甘油-3-磷酸脫氫酶的 基因。無功能的甘油-3-磷酸脫氫酶在本文中用于描述下述酵母細(xì)胞，其中通過突變、斷裂 或缺失使編碼甘油-3-磷酸脫氫酶的基因失活，導(dǎo)致與野生型酵母相比甘油形成降低。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的酵母可以能夠在本領(lǐng)域已知的任何合適 的碳源上生長(zhǎng)，并將其轉(zhuǎn)化為二羧酸，例如延胡索酸和/或琥珀酸。酵母可以能夠直接轉(zhuǎn)化 植物生物質(zhì)、纖維素、半纖維素、果膠、鼠李糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、麥芽糖糊精、核糖、核 酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一種優(yōu)選的酵母細(xì)胞表達(dá)將纖維素轉(zhuǎn)化 為葡萄糖單體和將半纖維素轉(zhuǎn)化為木糖和阿拉伯糖單體的酶，例如纖維素酶(內(nèi)切纖維素 酶和外切纖維素酶)和半纖維素酶(例如內(nèi)切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能夠?qū)⒐z 轉(zhuǎn)化為葡糖醛酸和半乳糖醛酸的果膠酶，或?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化成葡萄糖單體的淀粉酶。酵母表達(dá) 這類酶的能力可已通過對(duì)酵母的遺傳修飾獲得。優(yōu)選地，酵母能夠轉(zhuǎn)化選自下組的碳源， 所述組由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉子糖(raffinose)和甘油組 成。在另一方面中，本發(fā)明涉及用于制備選自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，包 括在存在合適的發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)發(fā)酵根據(jù)本發(fā)明的酵母。合適的發(fā)酵培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人 員已知的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法中生產(chǎn)的二羧酸是琥珀酸。發(fā)現(xiàn)在生產(chǎn)選自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法中，使用根據(jù)本發(fā)明的酵母 是有利的，因?yàn)榕c野生型酵母相比能生產(chǎn)更高量的琥珀酸和/或延胡索酸。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酵母與野生型酵母相比，生產(chǎn)至少1. 1、優(yōu)選至少1. 2,1. 3,1. 4,1. 5或至少2倍的琥 珀酸和/或延胡索酸。根據(jù)本發(fā)明的方法可以在需氧和缺氧的條件下進(jìn)行。優(yōu)選地，所述方法在缺氧條 件下或微需氧或氧受限的條件下進(jìn)行。缺氧發(fā)酵方法在本文中被定義為下述發(fā)酵方法，其 在無氧時(shí)進(jìn)行，或其中基本無氧(優(yōu)選地少于5、2. 5或lmmol/L/h)被消耗，并且其中有機(jī) 分子發(fā)揮電子供體以及電子受體兩種作用。氧受限的發(fā)酵方法是其中氧消耗受從氣體到液體的氧轉(zhuǎn)移限制的方法。氧限制程 度是通過進(jìn)入氣流的量和組成以及使用的發(fā)酵裝置的實(shí)際混合/質(zhì)量轉(zhuǎn)移性能決定的。優(yōu) 選地，在氧受限條件下的方法中，氧消耗速率至少約為5. 5mmol/L/h，更優(yōu)選地至少或約為 6mmol/L/h,甚至更優(yōu)選地至少或約為7mmol/L/h。根據(jù)本發(fā)明的用于生產(chǎn)二羧酸的方法可以在1和9之間的任何合適的pH下進(jìn)行。 優(yōu)選地，發(fā)酵液中的pH在2和7之間，優(yōu)選地在3和5之間。發(fā)現(xiàn)能夠在低pH下進(jìn)行根據(jù) 本發(fā)明的方法是有利的，因?yàn)檫@能防止細(xì)菌污染。另外，因?yàn)檠雍魉岷?或琥珀酸生產(chǎn)期 間的PH降低，將pH保持在期望水平需要更少量的滴定劑?？梢赃M(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的合適溫度在5°C和60°C之間，優(yōu)選地在10°C和50°C 之間，更優(yōu)選地在15°C和35°C之間，更優(yōu)選地在18°C和30°C之間。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知哪 些最適溫度適合用于發(fā)酵特定的酵母細(xì)胞。優(yōu)選地，通過本領(lǐng)域已知的合適方法，例如通過結(jié)晶或銨沉淀，從發(fā)酵液中回收二 羧酸例如延胡索酸和琥珀酸。優(yōu)選地，在根據(jù)本發(fā)明的方法中制備的二羧酸被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成期望的產(chǎn)物，例如 藥物、化妝品、食物、飼料或化學(xué)制品。在生產(chǎn)琥珀酸的情況下，琥珀酸可以被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成 聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(polybutylene succinate,PBS)或由其衍生的任何合適的 聚合物。遺傳修飾標(biāo)準(zhǔn)的遺傳技術(shù)例如宿主細(xì)胞中酶的過量表達(dá)、宿主細(xì)胞的遺傳修飾或雜交 技術(shù)是本領(lǐng)域已知的方法，例如如Sambrook和Russel(2001) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第三版)，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或 F. Ausubel 等編，"Currentprotocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience,NewYork(1987)中所述。用于真菌宿主細(xì)胞轉(zhuǎn) 化、遺傳修飾等等的方法從 EP-A-0 635 574、W0 98/46772、W0 99/60102 和 W0 00/37671、 W090/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635 574 和 US 6，265，186 中已知。附圖描述圖 1 :pGBS415SUS-01 的質(zhì)粒圖譜，其編碼用于在 Saccharomycescerevisiae 中表 達(dá)的來自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶。CP0表示密碼子對(duì)經(jīng)優(yōu)化。圖2 :pGBS416FUM-l的質(zhì)粒圖譜，其編碼用于在Saccharomycescerevisiae中表達(dá) 的來自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶。CP0表示密碼子對(duì)經(jīng)優(yōu)化。以下實(shí)施例僅用于闡述的目的，不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1使用E. coli DH10B作為克降載劑，在Saccharomyces cerevisiae中克降來自 Rhizopus oryzae的延胡索酸酶1. 1.表達(dá)構(gòu)建體使 用 SignalP 3.0 (http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/) Bendtsen, J.等(2004) Mol. Biol.，340 :783—795 禾口 TargetP 1. 1 (http: //www. cbs. dtu. dk/services/ TargetP/)Emanuelsson, 0.等(2007)NatureProtocols 2，953-971，針對(duì)信號(hào)序列的存在， 分析來自 Rhizopus oryzae 的延胡索酸酶[E. C. 4. 2. 1. 2]，GenBank 查詢號(hào) 469103。鑒定了蛋白質(zhì)最初23個(gè)氨基酸中推定的線粒體靶向序列。為了避免 S. cerevisiae中可能的到線粒體的靶向，從SEQ ID NO 1中去除最初23個(gè)氨基酸(SEQ ID N0:2是相應(yīng)的核苷酸序列)并再引入甲硫氨酸氨基酸，得到SEQ ID NO :3。針對(duì) S. cerevisiae，如PCT/EP2007/05594中所公開的，對(duì)SEQ ID NO 3進(jìn)行密碼子對(duì)方法。將 得到的序列SEQ ID N0:4置于組成型TDH 1啟動(dòng)子序列SEQ ID NO :5之后和TDH 1終止 子序列SEQ IDN0:6之前，并添加便利的限制性位點(diǎn)。將SEQ ID NO :4中的終止密碼子 修飾為TAAG。得到的序列在Sloningpuchheim，德國(guó))合成。用BamHI/NotI限制性消 化 S. cerevisiae 表達(dá)載體 pRS415(Sirkoski R. S.和 Hieter P, Genetics, 1989,122(1) 19-27)后，隨后在該載體中連接由延胡索酸(來源Rhizopus oryzae)合成基因構(gòu)建體組成 的BamHI/NotI限制性消化片段，創(chuàng)建表達(dá)構(gòu)建體pGBS415SUS_01 (

圖1)。使用連接混合物 轉(zhuǎn)化 E. coli DH lOB(Invitrogen)，得到酵母表達(dá)構(gòu)建體 pGBS415SUS-01 (圖 1)。將構(gòu)建體pGBS415SUS-01 轉(zhuǎn)化進(jìn) S. cerevisiae 菌株 CEN. PK113-6B (MATA ura3-52 leu2_112 trp1-289)> RWB066(MATA ura3_52 leu2_112 trpl-289 adhl::lox adh2::Kanlox)禾口 RWB064(MATA ura3_52 leu2_112 trpl-289adhl::lox adh2::lox gpdl::Kanl0X)。將轉(zhuǎn)化混合物涂布于補(bǔ)充有合適氨基酸的酵母氮基礎(chǔ)(YNB)w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。將轉(zhuǎn)化體接種進(jìn)補(bǔ)充有合適氨基酸的包含葡萄糖的Verduyn培 養(yǎng)基(Verduyn等，1992，Yeast. Jul ；8 (7) :501_17)中，并在搖瓶中于需氧、缺氧和氧受限的 條件下生長(zhǎng)。用于缺氧培養(yǎng)的培養(yǎng)基補(bǔ)充有溶于乙醇中的0.42g/l Tween 80和0.01g/l麥 角固醇(Andreasen 禾口 Stier, 1953，J. cell. Physiol, 41, 23-36 ；Andreasen 禾口 Stier, 1954， J. Cell. Physiol,43 =271-281)。所有酵母培養(yǎng)物在30°C下于250_280rpm的搖動(dòng)培養(yǎng)箱中 生長(zhǎng)。在不同的孵育時(shí)間取出培養(yǎng)物的小份試樣，離心并如下文所述通過HPLC分析培養(yǎng)基 的草酸、蘋果酸、延胡索酸和琥珀酸形成。1. 2HPLC 分析進(jìn)行HPLC來測(cè)定不同種類樣品中有機(jī)酸和糖的測(cè)定。PhenomenexRezex-RHM-單 糖柱上的分離原則基于使用反相機(jī)制的離子交換、離子排除和尺寸排除。檢測(cè)通過示差折 射系數(shù)(differential refractive index)和紫外檢測(cè)器進(jìn)行。實(shí)施例 2 在 Saccharomyces cerevisiae 中克隆來自 Rhizopus oryzae 的延胡索 酸酶。2. . 1表達(dá)構(gòu)建體以與實(shí)施例1. 1中所公開相似的方式，將來自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶(SEQ ID NO :4)連接進(jìn) S. cerevisiae 表達(dá)載體 pRS416(Sirkoski R. S.和 Hieter P, Genetics, 1989,122(1) 19-27)中。使用連接混合物轉(zhuǎn)化E. coliTOPIO (Invitrogen)，得到 酵母表達(dá)構(gòu)建體PGBS416FUM-1 (圖2)。2.2.轉(zhuǎn)化和微量滴定板(MTP' s)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建體pGBS416FUM-l 轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母菌株 CEN. PK1 13-5D (MATA ura3_52)中。 作為陰性對(duì)照，將空載體PRS416轉(zhuǎn)化進(jìn)菌株CEN.PK 113-5D中。將轉(zhuǎn)化混合物涂布在酵母 氮基(YNB)w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。將以下數(shù)量的各轉(zhuǎn)化體一式兩份(in duplo)接 種于96深孔MTP中250微升包含2%葡萄糖的Verduyn培養(yǎng)基(Verduyn等，1992，Yeast. Jul ；8 (7) 501-17)中，并在30°C、550rpm和80%的濕度下，在Infors微量培養(yǎng)板搖動(dòng)培 養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)12個(gè)pGBS416FUM-l (FUMR)和24個(gè)pRS416空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化體。3天后將 MTP孔中存在的25微升預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至含有Verduyn培養(yǎng)基的新的96深孔MTP中，所述 Verduyn培養(yǎng)基含有葡萄糖和CaC03(終濃度250微升總體積中葡萄糖10%，CaC03 1% w/ v)。在30°C、550rpm和80%濕度下在Infors微量培養(yǎng)板搖動(dòng)培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)3天和7天后， 將MTP以2000rpm離心2分鐘，使用Multimek 96 (Beckman)收獲200微升上清液，并如實(shí) 施例1. 2中所述通過HPLC分析上清液中琥珀酸的存在。結(jié)果展示于表1中。表 1.在 Saccaromyces cerevisae CEN.PK 113-5D 中插入來自 Rhizopusoryzae 的延胡索酸酶(FumR)對(duì)培養(yǎng)3天和7天后琥珀酸生產(chǎn)水平的影響。 表1中的結(jié)果顯示，引入并過量表達(dá)來自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶導(dǎo)致3 天的孵育后琥珀酸生產(chǎn)水平顯著提高至1. 13倍(p = 4. 71 E-7，學(xué)生t-檢驗(yàn))。孵育7天 后，引入并過量表達(dá)來自Rhizopus oryzae的延胡索酸酶導(dǎo)致琥珀酸生產(chǎn)水平顯著提高至 1. 56 倍(p = 4. 49 E-10,學(xué)生 t-檢驗(yàn))。
權(quán)利要求
包含下述核苷酸序列的重組酵母，所述核苷酸序列編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的異源酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酵母，其中在所述核苷酸序列表達(dá)后所述酶在胞質(zhì)溶膠中有活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的酵母，其中所述酶來自于Rhizopusoryzae。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的酵母，其中所述酶是延胡索酸酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的酵母，其中所述酶與SEQID NO 1或SEQ ID NO 3 具有至少70%的同一性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的酵母，其屬于Saccharomyces、Pichia、 Kluyveromyces、Zygosaccharomyces 之一的屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的酵母，其為包含SEQID NO :4的Saccharomyces cerevisiae。
8.用于生產(chǎn)選自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，所述方法包括在合適的發(fā)酵培養(yǎng) 基中發(fā)酵根據(jù)權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的酵母，其中生產(chǎn)出所述二羧酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述二羧酸被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為藥物、化妝品、食物、飼料 或化學(xué)制品。
10.使用酵母作為二羧酸生產(chǎn)者來生產(chǎn)選自延胡索酸和琥珀酸的二羧酸的方法，其中 使用延胡索酸酶提高二羧酸生產(chǎn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述提高是至少1.1倍。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的方法，其中所述延胡索酸酶在胞質(zhì)溶膠中有活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的重組酵母，所述核苷酸序列編碼催化蘋果酸轉(zhuǎn)化成延胡索酸的異源酶。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)二羧酸的方法，其中使用根據(jù)本發(fā)明的酵母。
文檔編號(hào)C12P7/46GK101896606SQ200880117128
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日
發(fā)明者吳亮, 瑞內(nèi)·維爾瓦爾, 科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉, 羅波圖斯·安東尼厄斯·戴維爾德 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司