專利名稱：用于生成重組克隆細(xì)胞系的方法和用于該方法的新試劑的制作方法
用于生成重組克隆細(xì)胞系的方法和用于該方法的新試劑本發(fā)明涉及生成重組克隆細(xì)胞系的方法以及用于該方法的新試劑。背景在研究細(xì)胞表面受體的藥理學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)特征中的主要要求是能夠利用以具體 的表達(dá)水平表達(dá)特定轉(zhuǎn)染的受體的重組細(xì)胞系。這些細(xì)胞系在篩選用于新治療劑的化合物 庫(kù)方面也具有極大的價(jià)值。傳統(tǒng)上，克隆細(xì)胞系的生成涉及繁瑣的過程(a)轉(zhuǎn)染；(b)表達(dá) 特定受體的細(xì)胞的抗生素抗性選擇以及最后(c)表達(dá)特定水平的細(xì)胞表面受體的細(xì)胞的 稀釋克隆(即，從單個(gè)細(xì)胞)。這一過程最費(fèi)力和耗時(shí)的方面是稀釋克隆和鑒定表達(dá)特定水 平的受體的克隆。這總是需要將所有的克隆系擴(kuò)增到有足夠數(shù)目的細(xì)胞用于待進(jìn)行的放射 配體結(jié)合的程度。這通常需要超過一百萬個(gè)細(xì)胞。在含有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)簽的表達(dá)重組形式的受體的細(xì)胞中，通過能夠利用 熒光活化細(xì)胞分選術(shù)(FACS)來鑒定表達(dá)特定水平的受體蛋白的細(xì)胞而使后一步驟變得較
各易ο然而，這一方法的缺點(diǎn)在于GFP標(biāo)簽?zāi)軌蚋淖兗?xì)胞表面受體的藥理學(xué)特征。因此 需要能夠在擴(kuò)增細(xì)胞系前鑒定表達(dá)特定水平的受體蛋白的單個(gè)細(xì)胞、而不影響細(xì)胞表面受 體的藥理學(xué)特征的方法。公開內(nèi)容簡(jiǎn)述按照本發(fā)明，提供了從細(xì)胞群生成以具體表達(dá)水平表達(dá)靶細(xì)胞表面受體的重組克 隆細(xì)胞系的方法，所述細(xì)胞群包含用編碼所述靶受體的cDNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染且表達(dá)所述 靶細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，該方法包括(c)用受體特異性熒光配體孵育細(xì)胞群(d)通過利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)熒光配體的特異性結(jié)合，從步驟(C)選擇表達(dá)靶細(xì) 胞表面受體的單個(gè)細(xì)胞。適宜地，步驟(C)提供了用結(jié)合靶細(xì)胞表面受體的受體特異性熒光配體對(duì)細(xì)胞群 進(jìn)行熒光標(biāo)記。優(yōu)選地，在步驟(d)中選擇的單個(gè)細(xì)胞適于克隆入克隆細(xì)胞系。優(yōu)選地，該 方法包括e)將從步驟(d)中選擇的單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增為克隆細(xì)胞系。優(yōu)選地，所述方法包括通過下述生成細(xì)胞群(a)用編碼靶受體的cDNA序列和抗生素選擇標(biāo)志物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；以及(b)對(duì)表達(dá)該特定細(xì)胞表面受體的那些細(xì)胞進(jìn)行抗生素抗性選擇從而生成細(xì)胞群。因此適宜地，本發(fā)明包括用于生成以具體表達(dá)水平表達(dá)靶細(xì)胞表面受體的重組克 隆細(xì)胞系的方法，該方法包括(a)用編碼靶受體的cDNA序列和抗生素選擇標(biāo)志物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；(b)對(duì)表達(dá)該特定細(xì)胞表面受體的那些細(xì)胞進(jìn)行抗生素抗性選擇從而生成細(xì)胞群(c)用受體特異性熒光配體孵育細(xì)胞群(d)通過利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)熒光配體的特異性結(jié)合，從步驟(C)選擇表達(dá)靶細(xì) 胞表面受體的單個(gè)細(xì)胞；以及
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(e)將選擇的細(xì)胞擴(kuò)增為克隆細(xì)胞系。優(yōu)選地，流式細(xì)胞術(shù)包括使用熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS )或熒光活化細(xì)胞分選 技術(shù)。在另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法獲得的重組克隆細(xì)胞系在篩選用于 新治療劑的化合物庫(kù)或者在研究細(xì)胞表面受體的藥理學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)特征中的用途。優(yōu)選 地，細(xì)胞系包含痕量的熒光配體。本文提及的痕量是指在將單個(gè)細(xì)胞克隆擴(kuò)增為細(xì)胞系后 仍保留的任何殘余量。痕量的熒光配體可以與細(xì)胞分離或可以仍結(jié)合于細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了與方法一起使用的試劑盒，其包含一套說明書連同用 于該方法的一種或多種熒光配體。在另一方面，本發(fā)明提供了已知和新的熒光配體在該方法中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法鑒定的配體用于選自GPCRs、配體門 控離子通道和酪氨酸激酶受體的藥物靶標(biāo)的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了新的熒光配體。在本發(fā)明中，我們已經(jīng)使用長(zhǎng)效熒光配體，其結(jié)合到細(xì)胞表面，諸如結(jié)合到GPCRs 以提供用于(FACS )分析和分選的可逆性熒光標(biāo)簽，這允許表達(dá)特定水平GPCR的細(xì)胞在單 細(xì)胞水平被鑒定和分離用于在細(xì)胞培養(yǎng)中的進(jìn)一步擴(kuò)增。隨著時(shí)間的過去，熒光配體會(huì)從 細(xì)胞分離。而且，當(dāng)選擇的細(xì)胞被擴(kuò)增為細(xì)胞集落時(shí)，大部分細(xì)胞不會(huì)被標(biāo)記。因此產(chǎn)生的 克隆細(xì)胞系是野生型受體。例如，經(jīng)由適當(dāng)?shù)拈g隔子與熒光團(tuán)BODIPY 630/650相聯(lián)的配體 提供了在細(xì)胞表面受體保留足夠長(zhǎng)時(shí)間以允許FACS 分選的分子。附圖簡(jiǎn)述下文通過實(shí)施例，參照附圖進(jìn)一步描述了本發(fā)明的實(shí)施方案，附圖中在

圖1中是用于本發(fā)明的方法的本發(fā)明的新熒光配體。在圖2中舉例說明了用于制備本發(fā)明的新熒光配體的過程。圖2c是適用于合成 Dl烷基、PEG或聚酰胺連接子化合物的總體示意圖，其通過取代相關(guān)氨基酸(Boc-AA-OH)來 制備。在圖3中，顯示了在抗生素抗性選擇前和FACS 分選前，N-{4-氮雜_3，7_ 二氧 代-7-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓基)苯基氨]庚 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼(bora) -3a, 4a- 二 氮 雜-S-引達(dá)省(indacene)-3-基)乙烯基)配體(IOnM)結(jié)合到表達(dá)人多巴胺Dl-受體的 CHO “細(xì)胞系”的共聚焦顯微圖像。紅色圖像(淺灰)顯示了結(jié)合熒光Dl-受體拮抗劑的細(xì) 胞，藍(lán)色圖像(深灰)顯示了細(xì)胞核的Hoechst染色。顯然，只有約20%的細(xì)胞表達(dá)人多巴 胺Dl受體。在圖4中，顯示了用熒光N-{4_氮雜-3，7_ 二氧代-7-[4_(8-甲氧基_3_甲基_2， 3,4,5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓-1-基)苯基氨]庚基} -6- {2-[4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二 氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨 基}己酰胺(顯示為淺灰的紅染色)標(biāo)記的表達(dá)多巴胺Dl受體的CHO細(xì)胞的共聚焦顯微 圖像。用H0echst33342(顯示為深灰的藍(lán)染色)染色細(xì)胞核。顯示了 FACS分選后表達(dá)中 等水平Dl-受體的細(xì)胞。發(fā)明詳述
本文提及的流式細(xì)胞術(shù)是單個(gè)細(xì)胞的快速連續(xù)的分析，通常使用激光和熒光標(biāo) 記。這能夠用于鑒定具有特定熒光強(qiáng)度(在特定的熒光波長(zhǎng))的單個(gè)細(xì)胞，然后可以將這 些細(xì)胞分選為具有特定水平熒光強(qiáng)度的群或分選為多孔板中的單個(gè)細(xì)胞。本文提及的熒光 活化細(xì)胞分選儀(FACS )或熒光活化細(xì)胞分選技術(shù)是指基于每個(gè)細(xì)胞的具體光散射和熒 光特征能夠每次一個(gè)細(xì)胞地將生物細(xì)胞的懸浮液分選到兩個(gè)或多個(gè)容器的儀器或技術(shù)。本文提及的野生型細(xì)胞系是指屬于天然存在類型的細(xì)胞系以及天然存在的或從 天然存在的細(xì)胞克隆的。本文提及的細(xì)胞培養(yǎng)是指用于促進(jìn)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和繁殖的合成培養(yǎng)。本文提及的熒光配體是指其藥理學(xué)特性已知的配體，其與熒光部分相聯(lián)但仍然保 持它的藥理學(xué)特性，例如，對(duì)結(jié)合到細(xì)胞表面受體的結(jié)合親和力和功能活性。本文提及的長(zhǎng) 效配體是指保持結(jié)合充足時(shí)間以能夠進(jìn)行上文定義的鑒定和分選的配體。本文提及的可逆性熒光配體是指結(jié)合到細(xì)胞表面受體一段時(shí)間并最終與其分離 的配體。合適的結(jié)合是持續(xù)足以允許通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分選的一段時(shí)間。本文提及的具體或特定水平的表達(dá)是指具體的統(tǒng)一水平的表達(dá)。表達(dá)水平表示為 熒光亮度或熒光強(qiáng)度。在流式細(xì)胞術(shù)過程中，可以應(yīng)用濾波器來區(qū)分分別顯示低、中或高水 平強(qiáng)度的細(xì)胞。因?yàn)閺?qiáng)度的絕對(duì)值依賴于每個(gè)單獨(dú)的實(shí)例，在每一實(shí)例中基于相對(duì)尺度來 評(píng)估，因此不能獲得強(qiáng)度的絕度值。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是鑒定表達(dá)受體蛋白的單 個(gè)細(xì)胞，所述受體蛋白的表達(dá)水平對(duì)應(yīng)于低、中等或高熒光強(qiáng)度，即在最低20-40%內(nèi)、更優(yōu) 選地最低33%的強(qiáng)度，中等20-40%、更優(yōu)選地33%的強(qiáng)度或者最高20_40%、更優(yōu)選地最 高33%的強(qiáng)度。優(yōu)選地，結(jié)合樣品中所有單個(gè)細(xì)胞來確定強(qiáng)度。本發(fā)明能夠利用不使細(xì)胞表面受體減活化的(可逆結(jié)合的)熒光配體，生成以具 體水平表達(dá)靶細(xì)胞表面受體的重組克隆細(xì)胞系。GFP標(biāo)記是當(dāng)受體表達(dá)時(shí)受體的永久性部 分。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于能夠利用熒光配體表達(dá)和監(jiān)測(cè)天然的或野生型的未修飾的受體。在 本發(fā)明的情形下，不管配體是否可逆性結(jié)合，即不管它是否從受體分離，擴(kuò)增的細(xì)胞系與天 然的或野生型受體是相同的。在GFP標(biāo)記的情形下，終產(chǎn)物是包含帶GFP標(biāo)簽的受體的細(xì) 胞系。優(yōu)選地，細(xì)胞表面受體選自G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、配體門控離子通道和酪氨酸 激酶受體。G蛋白偶聯(lián)受體是跨細(xì)胞膜7次的單鏈蛋白。N-末端在細(xì)胞外，且C末端位于受 體蛋白的胞質(zhì)側(cè)。這些受體主要通過與異三聚體的G蛋白的相互作用來介導(dǎo)它們的效應(yīng)。優(yōu)選地，GPCR選自腺苷受體、腎上腺素受體、毒蕈堿受體、組胺受體、阿片受 體、大麻類受體、趨化因子受體、α -腎上腺素受體、GABA受體、前列腺素類受體、5-ΗΤ(血清 素)受體、興奮性氨基酸受體(例如，谷氨酸)、多巴胺受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)激肽受 體、血管緊張素受體、催產(chǎn)素受體、白三烯受體、核苷受體(嘌呤和嘧啶)、鈣敏感受體、促甲 狀腺激素受體、神經(jīng)降壓素受體、加壓素受體、嗅覺受體、核堿基受體(例如，腺苷)、溶血磷 脂酸受體、鞘脂受體、酪胺受體(痕量胺)、游離脂肪酸受體以及環(huán)腺苷受體等。最優(yōu)選地， GPCR選自大麻類、代謝型谷氨酸、多巴胺和毒蕈堿型乙酰膽堿受體，最優(yōu)選為CBnmGli^Dl 禾口 M30離子通道可以通過門控，即開放和關(guān)閉通道的門控來分類。電壓門控離子通道的激活/失活依賴于跨質(zhì)膜的電壓梯度，而配體門控離子通道的激活/失活取決于配體與通 道的結(jié)合。配體門控離子通道由在質(zhì)膜組織的7個(gè)亞單位組成以形成轉(zhuǎn)運(yùn)陽(yáng)離子或陰離子 能夠移動(dòng)通過的孔。配體結(jié)合位點(diǎn)通常位于亞單位之間的界面。并非所有的離子通道都是受體。因此，顯然本發(fā)明適用于那些是受體，即識(shí)別激素 的離子通道。優(yōu)選地，配體門控離子通道選自cys-環(huán)受體GABAa，GABAc，氨基乙酸(GIyR)， 血清素(5-HT)，煙堿乙酰膽堿(nAChR)受體，離子型谷氨酸門控受體GIuR，ΚΑ, NRl, NR2和 NR3，以及ATP-門控的Ρ2Χ受體等。酪氨酸激酶受體(例如那些與多種生長(zhǎng)因子和胰島素有關(guān)的受體)通常作為二聚 體發(fā)揮作用，并具有朝向細(xì)胞外的配體結(jié)合位點(diǎn)以及細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶酶活性。信號(hào)傳導(dǎo) 的介導(dǎo)是酪氨酸殘基磷酸化以及蛋白磷酸化事件級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)的結(jié)果。酪氨酸激酶還可以分為受體(RTK)和非受體型。優(yōu)選地，酪氨酸激酶受體選自EGF 受體、胰島素受體、PDGF受體、NGF受體、FGF受體、VEGF受體、HGF受體、Trk受體和TIE受 體。優(yōu)選地，熒光配體包含與上述受體的任一種特異性的配體偶聯(lián)的任何熒光團(tuán)。更 優(yōu)選地，熒光配體選自W02004088312和W02006032926 (其內(nèi)容通過引用的方式并入本文) 中公開的那些和選自結(jié)合合適的熒光團(tuán)的如下文所定義的新配體連接子，更優(yōu)選地結(jié)合下 文所示的 BODIPY 630-650。在W02004088312中，我們公開了多種G蛋白偶聯(lián)受體的熒光配體(激動(dòng)劑和拮抗 劑)。利用共聚焦顯微鏡，我們已經(jīng)能夠顯示，這些選擇性地與單個(gè)活細(xì)胞中的膜受體結(jié)合。 此外，使用熒光相關(guān)光譜法(FCS)，我們已經(jīng)能夠定量評(píng)價(jià)這種在單個(gè)活細(xì)胞膜的小微結(jié)構(gòu) 域中結(jié)合的特征。更優(yōu)選地，通過如在W02006032926中綜述的用于確定熒光配體的功能應(yīng)答或藥 理學(xué)特性的W02004088312的方法學(xué)來鑒定用于本發(fā)明的方法的熒光配體，所述方法學(xué)包 括 a)利用用于生物應(yīng)答的傳感器弓I發(fā)細(xì)胞或細(xì)胞材料b)隨后與熒光配體接觸其中熒光配體的結(jié)合以及其相關(guān)的生物應(yīng)答在同一細(xì)胞中檢測(cè)或監(jiān)測(cè)，并明顯不 同從而允許分別讀數(shù)，以及其中如果結(jié)合的話，因此檢測(cè)到是熒光配體的熒光；如果維持來 自細(xì)胞或細(xì)胞材料的相關(guān)的可測(cè)量的生物應(yīng)答，這提示熒光配體是潛在的激動(dòng)劑，或者如 果來自細(xì)胞或細(xì)胞材料的相關(guān)的可測(cè)量的生物應(yīng)答減弱或消失，這提示熒光配體是潛在的 中性拮抗劑或反向激動(dòng)劑。優(yōu)選地，熒光配體包含一個(gè)或多個(gè)配體部分，其通過維持配體活性的連接位點(diǎn)的 連接子與一個(gè)或多個(gè)熒光部分連接。優(yōu)選地，本發(fā)明的或用于本發(fā)明的熒光配體中，GPCR的配體部分選自作為以下受 體的配體有效的任何化合物腺苷受體、腎上腺素受體、毒蕈堿受體、組胺受體、阿片受 體、大麻類受體、趨化因子受體、α -腎上腺素受體、GABA受體、前列腺素類受體、5-ΗΤ (血清 素)受體、興奮性氨基酸受體(例如，谷氨酸)、多巴胺受體、蛋白酶激活受體、神經(jīng)激肽受 體、血管緊張素受體、催產(chǎn)素受體、白三烯受體、核苷受體(嘌呤和嘧啶)、鈣敏感受體、促甲 狀腺激素受體、神經(jīng)降壓素受體、加壓素受體、嗅覺受體、核堿基受體(例如，腺苷)、溶血磷脂酸受體、鞘脂受體、酪胺受體(痕量胺)、游離脂肪酸受體以及環(huán)腺苷受體等，優(yōu)選地作為 用于GPCR受體的配體，例如a)腺苷受體拮抗劑b)腺苷受體激動(dòng)劑c) β _腎上腺素受體激 動(dòng)劑以及d) β -腎上腺素受體拮抗劑。優(yōu)選地，配體是非肽配體。熒光部分可以是WO 2004088312所述的任何部分。優(yōu)選地，熒光部分是任一紅、 綠、近紅外、藍(lán)等染料或其他類型的染料。適宜地，熒光配體選自特別包括如下在內(nèi)的染料 熒光素，包括FITC的熒光素衍生物，以及熒光素樣分子諸如俄勒P^iTM(0regon Green ) 和其衍生物、德克薩斯紅TM(TeXaS redTM)、7-硝基苯-2-氧雜-1，3-二唑(NBD)和其衍 生物、香豆素和其衍生物、萘包括丹磺酰氯衍生物或其類似物或衍生物、Cascade Blue , EvoBlue和其熒光衍生物、芘和吡啶噁唑衍生物、花青染料、dyomics(DY染料和ATTO染 料)和其熒光衍生物、Alexafluor染料和衍生物、BDI染料包括可商購(gòu)的Bodipy 染料、 赤蘚紅、曙紅、FITC、芘、蒽、吖啶、熒光藻膽蛋白和它們的結(jié)合物與熒光素化微珠、若丹明 和其熒光衍生物包括Rhodamine Green 包括四甲基若丹明、X-若丹明和德克薩斯紅衍生 物以及Rhodol Green ,與氨基偶聯(lián)，利用異氰酸酯、琥珀酰亞胺脂或雙氯三嗪基_反應(yīng)基 團(tuán)以及其他紅、藍(lán)或綠色熒光染料特別是紅色染料，如在Buschmarm V等，Bioconjugate Chemistry (2002)，ASAP論文中所評(píng)論的。優(yōu)選的BODIPY (4,4- 二氟~4~硼-3a,4a- 二氮雜—s—引達(dá)省)熒光團(tuán)包括跨 越可見光譜的那些并包括在 U. S. Pat. No. 4，774，339 ；U. S. Pat. No. 5，187，288 ；U. S. Pat. No. 5，248，782 ；U. S. Pat. No. 5，274，113 ；U. S. Pat. No. 5，433，896 ；U. S. Pat. No. 5，451，663 中列出的那些。該組中優(yōu)選的成員選自如在上述專利中描述的任何雜芳基取代的B0DIPY 染料，這些專利的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。更優(yōu)選地，熒光配體包含熒光素、德克薩斯紅 、Cy5.5或Cy5或其類似物、B0DIPY 630/650 和其類似物、DY-630，DY-640、DY-650 或 DY-655 或其類似物、ATTO 655 或 ATTO 680 或其類似物、EvoBlue 30或其類似物、Alexa 647或其類似物。適宜地，熒光部分衍生自任一以上可商購(gòu)的熒光團(tuán)，包括或經(jīng)修飾包括促進(jìn)與配 體連接的反應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選地，本發(fā)明的熒光配體通過如下設(shè)計(jì)熒光和配體部分的連接位點(diǎn)、連接方 法，即連接子的性質(zhì)和長(zhǎng)度以及其化學(xué)計(jì)量即1 1，2 1,1 2等，從而配體的結(jié)合和功 能保留在熒光配體內(nèi)，且藥理特性是已知的，從而結(jié)合和功能的調(diào)節(jié)是已知的。優(yōu)選地，熒光配體具有下式LigJL L Jfi FI包括其鹽，其可以作為外消旋物存在或作為它的旋光異構(gòu)體之一存在，其中Lig包含配體部分，F(xiàn)I包含熒光部分且L包含如上文定義的以及如 W02004088312和WO 2006032926中定義的連接子，并且其中Jfi和Jl包含如W02004088312 和TO2006032926 (其中Jt是Jfi)中定義的連接位點(diǎn)或連接官能度(functionality), W02004088312和W02006032926的內(nèi)容通過引用的方式并入本文。用于本發(fā)明的熒光配體可以是具有下式的新熒光配體LigJL L Jfi FI其中1，L，Jfi和FI如上文所定義的，以及Lig3 是-X (Z) Ar1 (Y-Ar2) a
其中X選自C，CH或NZ選自H，= 0，CV6烷(氧)基或連接X和Ar2的單鍵Y選自諸如-OCH2-的C^6烷氧基、單鍵、Cp6烷基、CV6胺基、Cp6羰基、-NHC( = 0)-、 含有1，2或3個(gè)N原子的5-7元含N飽和雜環(huán)a是整數(shù)1或2々!·1是5或6元的(雜)芳香族，其中雜原子是^▲! 1任選地被(1_8烴基、商、0!1等 取代，更優(yōu)選地選自以下結(jié)構(gòu)其中η選自0和1;且Ar2是6元芳香族，任選地被烴基、鹵、OH等取代，更優(yōu)選地選自以下結(jié)構(gòu)其中m選自0、1和2，且R是C1^烴基、鹵、OH等。優(yōu)選地，L是L3,并且選自Ch2烷基，((V6烷氧基)^CH2烷基，酰胺和聚酰胺部 分包括(C^12 烷基 NHCOCV12 烷基)^、(C^12 烷基 CONHCV12 烷基)^、(COC1^12 烷基 NH) ^50, (NHCV12烷基CO) ^50, 5-7環(huán)化雜環(huán)CV12烷(氧)基，C1^12烷(氧)基-5-7環(huán)化雜環(huán)和C1^2 烷(氧)基5-7環(huán)化雜環(huán)Ch2烷基，其中1-3個(gè)雜原子、優(yōu)選1或2個(gè)雜原子選自N，0和 S。更優(yōu)選地，L3選自上述，其中烷(氧)基是甲(氧)基、乙(氧)基、丙(氧)基、丁(氧)基、戊(氧)基、己 (氧)基、庚(氧)基、辛(氧)基、任(氧)基、癸(氧)基、十一烷(氧)基、十二(氧) 基；雜環(huán)環(huán)包含6個(gè)環(huán)原子，更優(yōu)選地選自哌嗪基、哌啶基、1，4 二氧雜環(huán)己烷、1，4- 二 噻烷、嗎啉和硫代嗎啉；((V6烷氧基hi是(乙氧基)、(乙氧基乙氧基)、(甲氧基)、(甲氧基甲氧基)
13或其組合；酰胺和聚酰胺部分是(CO乙烯基NH) C2_4烷基NHCO C2_4烷基，C2_4烷基⑶NH C2_4 烷基，最優(yōu)選地選自CO乙烯基NH，C2烷基NHCO C2烷基，C2烷基NHCO C4烷基，C4烷基NHCO C2烷基，C2烷基CONH C2烷基，C2烷基CONH C4烷基和C4烷基CONH C2烷基。優(yōu)選地，Jl和Jfi選自NH，CO, 5-7環(huán)化雜環(huán)，其中2_3個(gè)雜原子，優(yōu)選2個(gè)雜原子選 自N和0。優(yōu)選地，5-7環(huán)化雜環(huán)選自哌嗪和1，4 二氧雜環(huán)己烷。優(yōu)選地，Jl和Jfi都是NH， 一個(gè)是NH且另一個(gè)為⑶，或者一個(gè)為NH且另一個(gè)為5-7環(huán)化雜環(huán)。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明的新熒光配體選自部分在本文附圖1中示出的以下化合 物M,型配體N-{2-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]丁基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{8-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{2-[2-(2-(4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯 并二氮雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二 氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4_硼-3a，4a- 二氮雜_s_引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯 氧基]乙酰氨基}己酰胺Dl-型配體N- {3-氧代-3-[4- (8-甲氧基_3_甲基2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮雜卓基) 苯基氨]丙基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {5-氧代-5-[4- (8_甲氧基_3_甲基_2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮雜卓基) 苯基氨]戊基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {6-氧代-6-[4- (8_甲氧基_3_甲基_2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮雜卓基) 苯基氨]己基} -6- {2-[4- (2- (4) 4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {8-氧代-8-[4- (8_甲氧基_3_甲基_2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮雜卓基) 苯基氨]辛基} -6- {2-[4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺
N-{4-氮雜-3，7-二氧代-7-[4-(8-甲氧基 _3_ 甲基 _2，3，4，5_ 四氫-1H-3-苯 并氮雜卓-1-基)苯基氨]庚基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二氟-4，4a- 二氫_5_(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-氮雜-3，7-二氧代-7-[4-(7-溴代-8-甲氧基 _3_ 甲基 _2，3，4，5_ 四 氫-1H-3-苯并氮雜卓-1-基)苯基氨]庚基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺mGluR5~ 型配體N-{3-氮雜-4-氧代4-[2_氯_6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]丁 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{5-氮雜-6-氧代-6-[2-氯_6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]己 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{9-氮雜-10-氧代-10-[2-氯_6-(3_氯芐氧基)卩比啶-4-基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{9-氮雜-3，6-二氧雜-10-氧代-10-[2-氯-6-(3-氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4，7_ 二氮雜-3，8-二氧代-8-[2_氯-6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]辛 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4，9_ 二氮雜-3，10-二氧代-10-[2-氯-6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{6，9_ 二氮雜-5，10-二氧代-10-[2-氯-6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺CBl-型配體N- {3-氮雜-4-氧代-4- [5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二 氯苯基)-4-甲基-IH-吡 唑-3-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {5-氮雜-6-氧代-6- [5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二 氯苯基)-4-甲基-IH-吡 唑-3-基]己基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {9-氮雜-10-氧代-10- [5- (4-氯苯基)-1- (2,4- 二氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基]-癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a,4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {2- [4- (1-氧代-1- (5- (4-氯苯基)(2，4- 二 氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {4- [4- (1-氧代-1-(5- (4_ 氯苯基)(2，4- 二 氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)-哌嗪-1-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {8- [4- (1-氧代-1-(5- (4_ 氯苯基)(2，4- 二 氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫 _5_ (噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{9-氮雜-3，6_ 二氧雜-10-氧代-10-[5-(4_ 氯苯基)-1-(2，4_ 二氯苯 基)-4-甲基-IH-吡唑-3-基]癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a_ 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼-3ai4a- 二氮雜-S-弓丨達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{3，6-二氧雜-8-[4-(l-氧代-1-(5_(4_ 氯苯基)(2，4_ 二氯苯基)_4_ 甲 基-IH-吡唑-3-基)甲基)哌嗪-1-基]辛基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二 氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨 基}己酰胺N-{4,9- 二氮雜-3，10- 二氧代-10_[5-(4-氯苯基)-1-(2，4_ 二氯苯 基)-4-甲基-IH-吡唑-3-基]癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a_ 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺。熒光配體可以具有親和力以使它能夠永久地、半永久地或暫時(shí)地結(jié)合，并可以在 細(xì)胞系擴(kuò)增前或擴(kuò)增中保持結(jié)合或分離。在本發(fā)明特別的優(yōu)勢(shì)中，熒光配體半永久地或暫 時(shí)地結(jié)合充足的時(shí)間段以允許通過如上文所述的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行結(jié)合和分選。適宜地，這 一時(shí)間段可以是秒級(jí)的，更優(yōu)選是分鐘級(jí)的，最長(zhǎng)達(dá)1小時(shí)。適宜地，結(jié)合30分鐘到1小時(shí) 的時(shí)間段。如上文所述的，流式細(xì)胞術(shù)通常利用激光和熒光標(biāo)記對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速連 續(xù)分析，并鑒定具有特定熒光強(qiáng)度(在特定熒光波長(zhǎng)下)的單個(gè)細(xì)胞，然后能夠?qū)⑦@些 細(xì)胞分選為具有特定水平的熒光強(qiáng)度的群體或分選為在多孔板中的單個(gè)細(xì)胞。例如， Beckman-Coulter Epics Altra是裝配有3種激光的細(xì)胞計(jì)數(shù)分選儀，允許用紫外或紫、藍(lán) 和紅光激發(fā)。激光束能夠被對(duì)齊以同時(shí)沖擊細(xì)胞，或者它們能夠被偏移以使來自每一激光 的熒光能夠在時(shí)間上分離。有8個(gè)檢測(cè)器，允許分析6種顏色和散射參數(shù)。如果需要的話， 利用靜電偏轉(zhuǎn)機(jī)制，利用這一強(qiáng)大的分析能力能夠分選鑒定的細(xì)胞。每秒鐘5000個(gè)以上細(xì) 胞的分析/分選率是可能的，并且然后可以將分選的細(xì)胞置于微板的孔中。該儀器裝有自 動(dòng)臂從而允許規(guī)定數(shù)目的特定細(xì)胞類型的程控沉積，例如沉積到96孔板的每孔中。分選純度應(yīng)該為99%。在本發(fā)明的特別優(yōu)勢(shì)中，熒光配體能夠用于既監(jiān)測(cè)表達(dá)特定細(xì)胞表面受體(參見 下文的實(shí)施例1)的細(xì)胞群的同質(zhì)性，還能提供用于基于細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞分選的熒光信號(hào)。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括鑒定適合用于選自GPCRs、配體門控離子通道和酪氨酸 激酶受體的藥物靶標(biāo)的配體。該方法還包括隨后在鑒定的配體存在和不存在的情況下，篩 選針對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞系的化合物或化合物庫(kù)。細(xì)胞或細(xì)胞材料可以包含一種或多種細(xì)胞、細(xì)胞提取物、細(xì)胞勻漿液、純化的或再 生的蛋白、重組蛋白或合成的蛋白等，并包括靶受體。包含細(xì)胞材料的樣品可以衍生自植 物、動(dòng)物、真菌、原生生物、細(xì)菌、古生菌(archae)或衍生自所述生物體的細(xì)胞系。用于制備 樣品的動(dòng)物或植物細(xì)胞可以是健康的或機(jī)能不良的，并任選地用于診斷諸如白血病或癌癥 的疾病。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，樣本包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、其提取物和勻漿液。優(yōu)選地，樣本包括活細(xì)胞材料，更優(yōu)選地包括個(gè)別細(xì)胞或亞細(xì)胞區(qū)室，最優(yōu)選地包 括活細(xì)胞中的GPCR、配體門控離子通道和酪氨酸激酶受體，包括這些蛋白的膜，可溶性受體 或者通道或者GPCR陣列?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)細(xì)胞或通過在細(xì)胞中表達(dá)蛋白以已知方式獲得細(xì) 胞材料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞材料是表達(dá)如上文定義的GPCR、配體門控離子通道或 酪氨酸激酶受體的細(xì)胞，更優(yōu)選地是表達(dá)相同這些的CHO細(xì)胞。細(xì)胞材料可以在與熒光配體接觸前加上標(biāo)簽，例如通過帶上GFP標(biāo)簽，例如帶GFP 標(biāo)簽的GPCR、帶GFP標(biāo)簽的(配體門控)離子通道和帶GFP標(biāo)簽的酪氨酸激酶受體或熒光 抗體靶向的天然受體或配體門控離子通道，從而使細(xì)胞受體或離子通道顯現(xiàn)，并覆蓋有熒 光配體?？梢栽谀颖局谢蛟诒粍×曳稚⒌募?xì)胞樣本(中提供受體，例如諸如被劇烈分散 的細(xì)胞中的A1-AR的內(nèi)源性受體。腺苷受體結(jié)合位點(diǎn)位于受體口袋內(nèi)的深處，從而帶有連 接子的熒光配體是優(yōu)選的熒光拮抗劑或激動(dòng)劑。盡管在修飾配體和保持拮抗劑結(jié)合活性方 面有相當(dāng)大的自由度，但保持激動(dòng)劑活化活性，即活化受體結(jié)合功能方面是較困難的。在本發(fā)明特別的優(yōu)勢(shì)中，熒光配體適合與FCS聯(lián)用以能夠在單分子水平研究配 體-受體結(jié)合。因?yàn)楸槐O(jiān)測(cè)的事件的性質(zhì)，F(xiàn)CS用于研究溶液中分子相互作用的熱力學(xué)和 動(dòng)力學(xué)特征是理想的。本發(fā)明的另一特別的優(yōu)勢(shì)在于FCS方法能夠適用于利用光子計(jì)數(shù)熒 光強(qiáng)度測(cè)量法來監(jiān)測(cè)單分子水平的配體-受體結(jié)合。這排除了分子在共聚焦體積內(nèi)移動(dòng)的 任何要求。利用顯示低背景熒光的配體，不需要在進(jìn)行共聚焦顯微鏡檢查或FCS前通過洗滌 去除未結(jié)合的配體。因此以時(shí)間和濃度依賴方式隨時(shí)間測(cè)量熒光是可能的。共聚焦顯微鏡法(CSLM)允許通過細(xì)胞的截面的可視化，所述細(xì)胞在細(xì)胞邊緣顯 示了表明膜受體結(jié)合的熒光團(tuán)的濃度。如本領(lǐng)域已知的，可視化屬于特別的平面聚焦，以使 可以觀察到通過單個(gè)細(xì)胞的“薄片(slice)”?？梢赃x擇不同顏色的通道以使不同熒光團(tuán)類 型可視化。FCS是無創(chuàng)技術(shù)，其通過在統(tǒng)計(jì)學(xué)上分析熒光種類的光子發(fā)射模式經(jīng)由非常小的 激發(fā)體積(< IO15I)分析熒光種類的擴(kuò)散特征。因此，能夠?qū)⒖焖贁U(kuò)散的游離配體與緩慢 擴(kuò)散的受體結(jié)合的配體區(qū)分開，并同時(shí)當(dāng)體積局限于細(xì)胞膜時(shí)進(jìn)行定量。優(yōu)選地，結(jié)合FCS的方法包括在< 10_151的共聚焦體積中測(cè)量熒光強(qiáng)度的波動(dòng)。這些波動(dòng)的統(tǒng)計(jì)分析給出了 關(guān)于擴(kuò)散速度(即，質(zhì)量)和存在的熒光分子的濃度的信息。因此，能夠在單個(gè)細(xì)胞上同時(shí) 定量游離配體(快速擴(kuò)散)和結(jié)合的配體(緩慢擴(kuò)散)。FCS(熒光相關(guān)光譜)使粒子熒光發(fā)射波動(dòng)與諸如粒子質(zhì)量和濃度相關(guān)聯(lián)以用于 溶液中分子相互作用的研究。FCS經(jīng)由通過緊聚焦激光束的分析實(shí)質(zhì)上監(jiān)測(cè)微觀檢測(cè)體積 (10_151)的帶熒光標(biāo)簽分子的自發(fā)熒光強(qiáng)度波動(dòng)。在本發(fā)明的另外方面，提供了上文定義的新熒光配體。優(yōu)選地，新熒光配體具有如 上文定義的下式Lig3JJJTFI。更優(yōu)選地，新熒光配體選自本文所附圖1中列出的化合物并如上文所述。本發(fā)明 的另外方面如上文所定義。在本發(fā)明的方法或者如上文所定義的用于該方法的試劑盒中，熒光配體優(yōu)選與它 的受體結(jié)合方面的信息有關(guān)，以便選擇用于克隆細(xì)胞系的合適熒光配體，建立所述克隆細(xì) 胞系是期望的。在由本發(fā)明的方法獲得的重組細(xì)胞系的優(yōu)選應(yīng)用中，通過細(xì)胞系中的細(xì)胞的統(tǒng)一 表達(dá)水平，可以篩選化合物庫(kù)并直接比較結(jié)果，或者可以研究受體結(jié)合并直接比較藥理學(xué) 和信號(hào)傳導(dǎo)特征。在本發(fā)明的另一方面，提供了已知或新熒光配體在本發(fā)明的方法中的用途，如上 文所定義的或如在W02004088312或W02006032926或其他出版物中所定義的，其內(nèi)容通過 引用的方式并入本文。在本發(fā)明的另一方面，提供了通過本發(fā)明的方法鑒定的配體用于選自GPCR、配體 門控離子通道和酪氨酸激酶受體的藥物靶標(biāo)。在本說明書的描述和權(quán)利要求書中，詞語“包含”和“含有”以及這些詞語的變型， 例如“包含(comprising)”和“包含(comprises) ”意味著“包括但不局限于”，并不意在(以 及沒有)排除其他部分、添加物、組分、整數(shù)或步驟。在本說明書的描述和權(quán)利要求書中，單數(shù)包括復(fù)數(shù)，除非上下文另有要求。特別 是，如果使用了不定冠詞，應(yīng)理解為本說明書包括復(fù)數(shù)以及單數(shù)，除非上下文另有要求。結(jié)合本發(fā)明的特定方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├枋龅奶卣鳌⒄麛?shù)、特性、化合物、化學(xué) 部分或基團(tuán)應(yīng)理解為適用于本文描述的任何其他方面、實(shí)施方案或?qū)嵤├桥c之相互 矛盾。讀者的關(guān)注涉及與本申請(qǐng)有關(guān)的在本說明書之前或與之同時(shí)提交的所有文章和 文獻(xiàn)，這些與本說明是都是公眾能夠檢索到的，所有這些文章和文獻(xiàn)的內(nèi)容都通過引用的 方式并入本文。本說明書公開的所有特征(包括任一所附的權(quán)利要求、摘要和附圖)，和/或本文 公開的任一方法或過程的步驟都可以以任一組合方式組合，除了這些特征和/或步驟中的 至少一些是相互排斥的組合。除非另外特別地指明，本說明書公開的每一特征(包括任一所附的權(quán)利要求、摘 要和附圖)可以通過用作相同、等同或相似的目的可選的特征取代。因此，除非另外特別地 指明，公開的每一特征僅是一類系列的等同或相似特征的一個(gè)實(shí)例。本發(fā)明并不限于任一前述實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。本發(fā)明延至任一新的本發(fā)明公開的特
18征或本發(fā)明公開的特征的任一新組合(包括任一隨附的權(quán)利要求、摘要和附圖)，或者延至 任一新的本文公開的方法或過程的步驟或這些步驟的任一新組合?，F(xiàn)在參照附圖和實(shí)施例以非限定方式示例本發(fā)明。實(shí)施例1-新熒光配體的合成使用所附的示意圖(圖2a_d)顯示的方法合成前文所述的化合物并對(duì)其進(jìn)行分析 (下文給出的數(shù)據(jù))實(shí)施例la_M3熒光配體的制備-參見示意圖2a11_(氯代乙?；?-5，ll-二氫-6H-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮雜卓_6_酮 (1)合成(3)的總體過程將無水乙腈中的胺連接子⑵(1. 3當(dāng)量)和N，N 二異丙基乙胺(3當(dāng)量)溶液加 到11-(氯代乙酰基)-5，11_ 二氫-6H-吡啶并[2，3-b][l，4]苯并二氮雜卓-6-酮⑴(1 當(dāng)量)中，將反應(yīng)物在氮?dú)庀掠?5°C加熱16-18小時(shí)。過濾反應(yīng)混合物，將濾液減壓脫水， 并通過快速柱色譜或硅膠制備薄層色譜法、利用溶于二氯甲烷中的5-15%甲醇作為洗脫劑 來純化粗化合物以得到受保護(hù)的胺。11-{[4-(2-芐氧基羰基氨乙基)哌嗪-1-基]乙?；鶀-5，11_ 二氫-6H-吡啶并 [2，3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(3a)11-{[4-(4-芐氧基羰基氨丁基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氫-6H-吡啶并 [2，3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(3b)m/z (TOF ES+)測(cè)得值為 543 (MH+，100% ) 11-{[4-(8_疊氮基辛基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氫-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(3c)11-[(4-{2-[2(2_疊氮基乙氧基)乙氧基]乙基}哌嗪-1-基)乙?；鵠_5，11-二 氫-611-吡啶并-[2，3-13]-[1，4]苯并二氮雜卓-6-酮(3d)合成⑷的總體過程向溶于甲醇的氨基甲酸芐酯或疊氮化物(3) (1當(dāng)量)溶液中加入甲酸銨(5當(dāng) 量)，隨后加入10%鈀碳(100w/w%，與氨基甲酸芐酯或疊氮化物)。在室溫下攪拌反應(yīng)混 合物3小時(shí)，通過硅藻土過濾并將濾液用二氯甲烷洗滌(x3)。將濾液減壓脫水，并在得到的 殘?jiān)屑尤腼柡偷奶妓釟溻c水溶液，然后將其用二氯甲烷提取(x4)。將合并的有機(jī)提取物 通過無水硫酸鎂干燥并減壓脫水以得到不需進(jìn)一步純化即可使用的胺類(4)。11-{[4-(2_氨基乙基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氫-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(4a)ll-{[4_(4-氨基丁基)哌嗪-1-基]乙?；鶀-5，11_ 二氫-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(4b)ll-{[4_(8-氨基辛基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氫-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(4c)11-[(4-{2-[2(2_氨基乙氧基)乙氧基]乙基}哌嗪-1-基)乙?；鵠_5，11-二 氫-6H-吡啶并_[2，3-b]-[l，4]苯并二氮雜卓-6-酮(4d)合成(5)的總體過程
將BODIPY 630/650-X，SE(l當(dāng)量)和胺(4) (3_4當(dāng)量)溶解在二氯甲烷中并避光 攪拌2-5h。將溶劑減壓蒸發(fā)并通過硅膠制備薄層色譜法、利用15 85甲醇/ 二氯甲烷作 為洗脫劑來純化粗混合物以得到藍(lán)色固體樣的化合物(5)。^{2-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6_二氫-1111-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-s-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺(5a)m/z (TOF ES+)測(cè)得值為 926(MH+,90% )，129(100)。^{4-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6_二氫-1111-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]丁基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氫-5-(噻 吩-2-基)_4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺(5b)m/z (TOF ES+)測(cè)得值為 954 (MH+，100% ) N-{8-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-11H-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-s-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺(5c)m/z (TOF ES+)測(cè)得值為 1010 (MH+，100% ) N-{2-[2-(2-(4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-11H-吡啶并[2，3_b][l，4]苯 并二氮雜卓-11-基)乙基)_哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二 氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4_硼-3a，4a- 二氮雜-S-引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯 氧基]乙酰氨基}己酰胺(5d)m/z (TOF ES+)測(cè)得值為1014 (MH+，100% )。實(shí)施例lb-Dl熒光配體的制備_參見示意圖2b 8-甲氧基-7-溴-3-甲基-l-(4'-硝基苯基)-2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮 雜卓。向溶于CHCl3(2mL)和THF(2mL)的8-甲氧基-3-甲基-1-(4'-硝基苯基)-2， 3,4,5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓(Neumeyer, J. L ；Baindur, N. ；Yuan, J. ；Booth, G.； Seeman, P. ；Nizniki, H. B. J. Med. Chem. 1990，33，521) (109mg, 349 u mol)溶液中加入溴 (54ia，1.05mmOl)。將反應(yīng)物在室溫?cái)嚢?小時(shí)，然后通過加入10%焦亞硫酸鈉的水溶 液(10ml)終止反應(yīng)。并將該水溶液用CH2Cl2(3x20mL)提取。將合并的有機(jī)提取物通過無 水MgS04干燥并減壓脫水。通過自動(dòng)硅膠柱色譜、利用梯度Me0H/CH2Cl2(0 100 MeOH/ 012(12至5 95 Me0H/CH2Cl2)作為洗脫劑對(duì)該粗混合物進(jìn)行部分純化，隨后通過硅膠PTLC、利用3 97Me0H/CH2ClJt為洗脫劑進(jìn)行第二次純化以得到作為本白色固體的標(biāo)題 化合物(61mg，45%)。NMR(400MHz, CDC13)2. 34 (3H, s, NCH3)，2. 43-2. 52 (1H，m, CHH)，
2.60-2. 73 (2H, m, CH2)，2. 80-2. 96 (2H, m, CH2)，3. 03-3. 13 (1H, m, CHH)，3. 62 (3H, s, 0CH3)，
3.33 (1H, br d, J = 6. 5，CHCH2)，6. 21 (1H, s, CH)，7. 29 (1H, s, CH)，7. 30 (2H, d，J = 9. 1， CH)，8. 16 (2H, d, J = 9. 1，CH)。 8-甲氧基-7-溴-3-甲基-1-(4‘-氨基苯基)_2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜 卓。向溶于Et0H(2mL)和濃縮的氨水(2mL)的8-甲氧基-7-溴-3-甲基_1_(4'-硝基 苯基)-2，3，4，5_ 四氫-1H-3-苯并氮雜卓(37mg,94. 6umol)溶液中加入 Na2S204(165mg， 946 u mol)，并將該混合物在室溫?cái)嚢?小時(shí)。將反應(yīng)物減壓濃縮并將CH2C12 (5mL)加入到用 濃縮的HCL將pH調(diào)到8的水溶液中。分層，并用CH2C12(3x 5mL)提取水溶液，將合并的有機(jī) 提取物用無水MgS04干燥并減壓脫水以得到作為本白色固體的標(biāo)題化合物(15mg，44% )。 MS (TOF ES+)363(MH+, 100% ) ,361(93)。 8-甲氧基-3-甲基-1_(4'-氨基苯基)-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓。向 溶于Me0H(10. 8mL)的8-甲氧基-3-甲基-1-(4‘-硝基苯基)-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯 并氮雜卓(501mg,968umol)溶液中加入H20 (1. 2mL)，隨后加入10% Pd/C(250mg) 0將反應(yīng) 瓶暫時(shí)抽為真空，然后通過氣球加入氫氣；然后在室溫下攪拌該混合物17小時(shí)。將該反應(yīng) 混合物通過硅藻土(celtie)過濾，并將濾液用CH2C12(2x 15mL)洗滌。將溶劑減壓蒸發(fā)以 得到作為深橙色固體的標(biāo)題化合物(395mg,87% ) NMR(400MHZl CDC13) 2. 34-2. 48 (1H， m, CHH)，2. 43 (3HlS, NCH3)，2. 76-2. 90 (2H, m, CH2)，2. 91-3. 05 (1H, m, CHH)，3. 09-3. 27 (2H, m, CH2)，3. 65(3H，s，0CH3)，4. 30(lH,br d, J = 8. 4，CHCH2)，6. 29(lH，d，J = 2. 5，CH)，6. 63 (1H, dd，J = 8. 2，2. 6，CH)，6. 66-6. 73 (2H, m)，6. 94-6. 99 (2H, m)，7. 04 (1H, d，J = 8. 2，CH); MS (TOF ES+) 283 (MH+，100% ) 8-甲氧基-3-甲基-1_{[(4'-氨基苯基)-3_氧代丙基氨基]-3-氧代丙 基-氨基甲酸叔丁酯}_2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮雜卓。向溶于CH2Cl2(3mL)的 Boc-0-Ala-0-Ala-0H(454mg，1. 75mmol)溶液中相繼加入 DCC (360mg，1. 75mmol)、 DMAP(213mg, 1. 75mmol)和EtsN(243 u L，1. 75mmol)。將該混合物攪拌15分鐘，然后加入溶 于CH2Cl2(3mL)的8-甲氧基-3-甲基-1-(4‘-氨基苯基)-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮 雜卓(248mg，880 u mol)溶液，將這一混合物在室溫下攪拌14小時(shí)。將混合物通過硅藻土過 濾，用CH2C12(2x 10mL)洗滌并將過濾液減壓脫水。通過自動(dòng)硅膠柱色譜法、利用梯度MeOH/ CH2C12 (5 95Me0H/CH2Cl2至25 75Me0H/CH2Cl2)作為洗脫劑來部分純化粗混合物，然后 將得到的紅色油狀物通過利用(15 85Me0H/CH2Cl2)作為洗脫劑的硅膠柱色譜來純化以得 到作為紅色固體的標(biāo)題化合物(209mg,45% )。iHNMRQOOMHz，CDC13) 1. 43 (9H，s，C (CH3) 3) 2. 33-2. 43(3H，m)，2. 39 (3HlS, NCH3), 2. 60(2H，t，J = 5. 7，CH2)，2. 79(lH，dd，J = 14. 4,7. 7 CHH)，2. 87 (2H, brt, J = 8. 7, CH2)，3. 06 (2H, br d, J = 12. 7，CH2)，3. 40 (2H, dd, J = 12. 1 6. 0，CH2NH)，3. 62(2H，dd，J = 12. 1,6. 0，CH2NH)，3. 66 (3H，s，0CH3)，4. 30(lH,br d，J = 8. 0 CHCH2)，5. 15 (1H, br s，NH)，6. 25 (1H, d, J = 2. 4，CH)，6. 42-6. 52 (1H, br m, NH)，6. 64 (1H dd，J = 8. 4，2. 4，CH)，7. 05 (1H, d, J = 8. 4，CH)，7. 14 (2H, d，J = 8. 0，2x CH)，7. 53 (2H, d J = 8. 0，2xCH)，8. 06(lH,br s，NH) ；HRMS (T0F ES+) C29H4IN405 的計(jì)算值525. 3077。測(cè)得值 525. 3030 (MH+)。
8-羥基-3-甲基-1_{[(4'-氨基苯基)-3_氧代丙基氨基]-3-氧代丙基氨 基}-2，3，4，5_四氫-1H-3-苯并氮雜卓二氫溴酸鹽。向溶于CH2Cl2(1.2mL)的8-甲氧 基-3-甲基-1- {[ (4 ‘-氨基苯基)-3-氧代丙基氨基]-3-氧代丙基-氨基甲酸叔丁酯} -2， 3,4,5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓(32mg，61. liimol)的冰冷(_78°C )溶液中加入三溴化硼(611 u 1,611 u mol ；1M，溶于CH2C12)，使反應(yīng)混合物回到室溫并在N2下攪拌3小時(shí)。然后 將混合物冷卻到_78°C，用MeOH(lmL)終止反應(yīng)，并將溶劑減壓蒸發(fā)以得到作為淺褐色固 體的標(biāo)題化合物(29mg，定量的)。MS (TOF ES+) 411 (MH+, 20% ), 340 ([MH-^ Ala]+, 50% ), 269([MH-2 3 Ala].，100% )
MAB-3-氧代氨基丙基-3-氧代氨基丙基-X-BY630。向 B0DIPY630/650-X， SE(0. 95mg,1.44umol)和8-羥基-3-甲基-1-{[ (4 ‘-氨基苯基)_3_氧代丙基氨 基]-3-氧代丙基氨基} -2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓二氫溴酸鹽(5. 3mg, 9. 27 u mol) 中加入溶于無水DMF(lmL)的DIPEA(3. 5iU，20. 2iimol)溶液，并將該溶液避光攪拌2小 時(shí)。將溶劑減壓蒸發(fā)，通過硅膠PTLC、利用(15 85 MeOH/CH2CI2)作為洗脫劑來純化該粗 混合物以得到作為藍(lán)色固體的標(biāo)題化合物(0. 33mg 21% )0 MS (T0FES+) 956 (MH+, 100% )。
Br-MAB-3-氧代氨基丙基 _3_ 氧代氨基丙基-X-BY630。HRMS(T0F ES+) C52H56BBrF2N706S 的計(jì)算值1034. 3257。測(cè)得值1034. 3292 (MH+)。
MAB-3-氧代氨基丙基-X-BY630。MS (TOF ES+) 885 (MH+，100% ) MAB-5-氧代氨基戊基-X-BY630。MS (TOF ES+)913(MH+, 100% ) MAB-6-氧代氨基己基-X-BY630。MS (TOF ES+) 927 (MH+，100% )
MAB-8-氧代氨基辛基-X-BY630。MS (TOF ES+) 955 (MH+，100% ) 實(shí)施例lc-mGluR5熒光配體的制備-參見示意圖2c _5] 實(shí)施例ld-CBl熒光配體的制各-參見示意圖2d實(shí)施例2用如在實(shí)施例1中制備的新的熒光多巴胺D1受體拮抗劑N-{4-氮雜-3，7-二氧 代-7-[4-(8-甲氧基-3-甲基_2，3，4，5_四氫-1H_3-苯并氮雜卓-1-基)苯基氨]庚 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)篩選表達(dá)人多巴胺D1受體的混合群細(xì)胞系。從圖3可以清楚看 到，只有約20%的細(xì)胞標(biāo)記有熒光D1受體拮抗劑，這表明僅20%的細(xì)胞在它們的細(xì)胞表 面表達(dá)D1受體。利用FACS細(xì)胞分選，將這些細(xì)胞分選和分離為表達(dá)低、中等、高水平多巴 胺D1受體的細(xì)胞群。圖4顯示了分選后獲得的中等表達(dá)水平的細(xì)胞群。然后能夠用諸如 Beckman-Coulter Altra的細(xì)胞分選儀將個(gè)別細(xì)胞置于96孔板的單個(gè)孔中。
權(quán)利要求
從細(xì)胞群生成以給定表達(dá)水平表達(dá)靶細(xì)胞表面受體的重組克隆細(xì)胞系的方法，所述細(xì)胞群包括用編碼靶受體的cDNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并表達(dá)所述靶細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，所述方法包括(c)用受體特異性熒光配體孵育所述細(xì)胞群(d)通過利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)所述熒光配體的特異性結(jié)合，從步驟(c)選擇表達(dá)所述靶細(xì)胞表面受體的單個(gè)細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(c)提供了用結(jié)合所述靶細(xì)胞表面受體的受體 特異性熒光配體對(duì)所述細(xì)胞群進(jìn)行的熒光標(biāo)記。
3.如權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(d)選擇的單個(gè)細(xì)胞適合用于 克隆入克隆細(xì)胞系。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其另外包括e)將從步驟(d)中選擇的單個(gè) 細(xì)胞擴(kuò)增為克隆細(xì)胞系。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其包括通過下述生成所述細(xì)胞群(a)用編碼所述靶受體的cDNA序列和抗生素選擇標(biāo)志物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；以及(b)對(duì)表達(dá)特定細(xì)胞表面受體的那些細(xì)胞進(jìn)行抗生素抗性選擇從而生成細(xì)胞群。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中流式細(xì)胞術(shù)包括使用熒光活化細(xì)胞分選 儀(FACS )或熒光活化細(xì)胞分選技術(shù)。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞表面受體選自G蛋白偶聯(lián)受體 (GPCRs)、配體門控離子通道和酪氨酸激酶受體。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中熒光配體包含與對(duì)任一上述定義的受體 特異的配體偶聯(lián)的任何熒光團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中熒光配體具有下式 Lig Jl L Jf1 Fl包括其鹽，其可以作為外消旋物存在或作為它的旋光異構(gòu)體之一存在， 其中Lig包含配體部分，F(xiàn)l包含熒光部分且L包含連接子，并且其中Jf1和1包含連接 位點(diǎn)或連接官能度，或者熒光配體具有下式 Lig3 Jl L3 Jf1 Fl其中叉、L、Jf1和Fl如以上所定義的，并且 Lig3 是-X (Z) Ar1 (Y-Ar2)a 其中X選自C，CH或NZ選自H，= 0，Cp6烷(氧)基或連接X和Ar2的單鍵Y選自諸如-OCH2-的CV6烷氧基、單鍵、CV6烷基、CV6胺、CV6羰基、-NHC ( = 0)-和含 有1，2或3個(gè)N原子的5-7元含N飽和雜環(huán) a是整數(shù)1或2八巧是5或6元的(雜)芳香族的，其中雜原子是^▲! 1任選地被(1_8烴基、鹵、0!1等取 代，并更優(yōu)選地選自以下結(jié)構(gòu) (CI)n其中η選自0和1 ；且Ar2是6元芳香族的，其任選地被C"烴基、鹵、OH等取代，并更優(yōu)選地選自以下結(jié)構(gòu) 其中m選自0、1和2，且R是Ci_8烴基、鹵、OH等；以及L是L3,并且選自CV12烷基，(Cp6烷氧基)^Ch2烷基，酰胺和聚酰胺部分包括 ((V12 烷基 NHCOCm 烷基)^、(C1^2 烷基 CONHCV12 烷基)H。、(COCV12 烷基 NH) ^、(NHC1^12 烷基CO) ^50, 5-7環(huán)化雜環(huán)CV12烷(氧)基，C1^12烷(氧)基-5-7環(huán)化雜環(huán)和C^12烷(氧) 基5-7環(huán)化雜環(huán)Cp12烷基，其中1-3個(gè)雜原子，優(yōu)選1或2個(gè)雜原子選自N、O和S。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其包括鑒定適合用于選自GPCR、配體門控離 子通道和酪氨酸激酶受體的藥物靶標(biāo)的配體，以及任選附加地，隨后在所鑒定的配體的存 在和不存在下篩選針對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞系的化合物或化合物庫(kù)。
11.具有式Lig3Jl L3Jf1 Fl的新熒光配體，其中JL, L，Jf1和Fl如以上所定義的，且Lig3 是-X (Z) Ar1 (Y-Ar2)a其中X選自C，CH或NZ選自H，= 0，Cp6烷(氧)基或連接X和Ar2的單鍵Y選自諸如-OCH2-的CV6烷氧基、單鍵、CV6烷基、CV6胺、CV6羰基、-NHC ( = 0)-和含 有1，2或3個(gè)N原子的5-7元含N飽和雜環(huán)a是整數(shù)1或2八巧是5或6元的(雜)芳香族的，其中雜原子是^▲! 1任選地被(1_8烴基、鹵、0!1等取 代，且更優(yōu)選地選自以下結(jié)構(gòu) 其中η選自0和1 ；且Ar2是6元芳香族的，其任選地被C"烴基、鹵、OH等取代，且更優(yōu)選地選自以下結(jié)構(gòu) 其中m選自0、1和2，且R是C^8烴基、鹵、OH等。
12.如權(quán)利要求11所述的配體，其中L3選自CV12烷基，(Cp6烷氧基^jCH2烷基，酰 胺和聚酰胺部分包括(Ch2烷基NHCOCV12烷基)U、(Ch2烷基CONHCH2烷基)^、(COC1^12 烷基NH) ^、(NHCh2烷基CO) ^50, 5-7環(huán)化雜環(huán)C^12烷(氧)基，C1^12烷(氧)基_5_7環(huán) 化雜環(huán)和CV12烷(氧)基5-7環(huán)化雜環(huán)Ch2烷基，其中1-3個(gè)雜原子，優(yōu)選1或2個(gè)雜原 子選自N、0和S。
13.如權(quán)利要求11或12所述的配體，其中L3如權(quán)利要求12中所定義的，其中烷(氧)基是甲(氧)基、乙(氧)基、丙(氧)基、丁(氧)基、戊(氧)基、己(氧) 基、庚(氧)基、辛(氧)基、任(氧)基、癸(氧)基、十一烷(氧)基或十二烷(氧)基；雜環(huán)環(huán)包含6個(gè)環(huán)原子，更優(yōu)選地選自哌嗪基、哌啶基、1，4 二氧雜環(huán)己烷、1，4- 二噻 烷、嗎啉和硫代嗎啉；(C1^6烷氧基)⑶是(乙氧基)、(乙氧基乙氧基)、(甲氧基)、(甲氧基甲氧基)或其 組合；酰胺和聚酰胺部分是(CO乙烯基NH) i_2、C2_4烷基NHCO C2_4烷基、C2_4烷基CONH C2_4烷 基，所述部分最優(yōu)選地選自CO乙烯基NH、C2烷基NHCO C2烷基、C2烷基NHCO C4烷基、C4烷 基NHCO C2烷基、C2烷基CONH C2烷基、C2烷基CONH C4烷基和C4烷基CONH C2烷基。
14.如權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)所述的熒光配體，其中叉和Jfi選自NH，CO,5-7環(huán)化雜 環(huán)，其中2-3個(gè)雜原子，優(yōu)選2個(gè)雜原子選自N和0。
15.熒光配體，其選自以下配體M,型配體N-{2-[4-(2-氧代 2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮雜卓-11-基)乙基)_ 哌嗪-I-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮雜 卓-11-基)乙基)_ 哌嗪-I-基]丁基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {8- [4- (2-氧代-2- (6-氧代-5，6- 二氫-1IH-吡啶并[2，3-b] [ 1，4]苯并 二氮雜 卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]辛基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜_s_弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{2-[2-(2-(4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氫-IlH-吡啶并[2，3_b] [1,4]苯并二氮 雜卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4， 4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜_s_弓|達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基] 乙酰氨基}己酰胺Dl-型配體N-{3-氧代-3-[4-(8-甲氧基-3-甲基2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓-1-基)苯 基氨]丙基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二氮 雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{5-氧代-5-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氫-1!1-3-苯并氮雜卓-1-基)苯 基氨]戊基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二氮 雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{6-氧代-6-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氫-1!1-3-苯并氮雜卓-1-基)苯 基氨]己基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮 雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{8-氧代-8-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氫-1!1-3-苯并氮雜卓-1-基)苯 基氨]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二氮 雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{4-氮雜-3，7-二氧代-7-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯 并氮雜卓-1-基)苯基氨]庚基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二氟-4，4a- 二氫_5_(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-氮雜-3，7- 二氧代-7-[4-(7-溴代-8-甲氧基-3-甲基_2，3，4，5_四 氫-1H-3-苯并氮雜卓-1-基)苯基氨]庚基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜_s_弓丨達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺mGluR5~型配體N- {3-氮雜-4-氧代-4- [2-氯-6- (3-氯芐氧基)吡啶 _4_ 基]丁基} _6_ {2- [4- (2- (4， 4-氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)_4_硼-3a，4a- 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}_己酰胺N- {5-氮雜-6-氧代-6- [2-氯-6- (3-氯芐氧基)吡啶_4_基]己基} _6_ {2- [4- (2- (4， 4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮雜-s_弓丨達(dá)省-3-基)乙烯基) 苯氧基]乙酰氨基}_己酰胺N-{9-氮雜-10-氧代-10-[2-氯-6-(3-氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{9-氮雜-3，6- 二氧雜-10-氧代-10-[2-氯_6_(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4, 7- 二氮雜-3，8- 二氧代-8-[2-氯_6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]辛 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4,9- 二氮雜-3，10- 二氧代-10-[2-氯_6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{6,9- 二氮雜-5，10- 二氧代-10-[2-氯_6-(3_氯芐氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮雜-s_ 弓 | 達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺 CBl-型配體N-{3-氮雜-4-氧代-4-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二氯苯基)-4_甲基-IH-吡 唑-3-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼 _3a，4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{5-氮雜-6-氧代-6-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二氯苯基)-4_甲基-IH-吡 唑-3-基]己基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二 氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {9-氮雜-10-氧代-10- [5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二氯苯基)-4-甲基-IH-吡 唑-3-基]-癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺Ν-{2-[4-(1-氧代-l-(5-(4-氯苯基)-l-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氫-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺Ν-{4-[4-(1-氧代-l-(5-(4-氯苯基)-l-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)-哌嗪-1-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺Ν-{8-[4-(1-氧代-l-(5-(4-氯苯基)-l-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氫 _5_ (噻吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮雜引達(dá)省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{9-氮雜-3，6- 二氧雜-10-氧代-10-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4_ 二氯苯 基)-4-甲基-IH-吡唑-3-基]癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a_ 二氫-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {3，6- 二氧雜-8- [4- (1-氧代-1- (5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二 氯苯基)-4-甲 基-IH-吡唑-3-基)甲基)哌嗪-1-基]辛基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二 氟-4,4a- 二 氫-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a，4a-二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨 基}己酰胺N-{4，9- 二氮雜-3，10- 二氧代-10-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲 基-IH-吡唑-3-基]癸基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二 氟-4，4a- 二 氫 _5_(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮雜-S-引達(dá)省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺。
16.通過權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法獲得的重組細(xì)胞系在篩選用于新治療劑 的化合物庫(kù)中或在研究細(xì)胞表面受體的藥理學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)特征中的用途。
17.利用通過權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法獲得的重組細(xì)胞系的治療方法。
18.與權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法一起使用的試劑盒，其包含一套說明書以及 用于所述方法的一種或多種熒光配體。
19.如以上定義的已知和新的熒光配體在權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法中的用途。
20.通過權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法鑒定的配體用于選自GPCR、配體門控離子 通道和酪氨酸激酶受體的藥物靶標(biāo)的用途。
全文摘要
從細(xì)胞群生成以給定表達(dá)水平表達(dá)靶細(xì)胞表面受體的重組克隆細(xì)胞系的方法，所述細(xì)胞群包括用編碼靶受體的cDNA序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染且表達(dá)所述靶細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，所述方法包括(c)用受體特異性熒光配體孵育所述細(xì)胞群，(d)通過利用流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)所述熒光配體的特異性結(jié)合，從步驟(c)選擇表達(dá)所述靶細(xì)胞表面受體的單個(gè)細(xì)胞；以及新的熒光配體。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101896604SQ200880118065
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者史蒂芬·約翰·希爾, 巴瑞·克拉姆, 理查德·約翰·米戴爾登 申請(qǐng)人:圣瑞細(xì)胞熒光技術(shù)有限公司