專利名稱：被改造以產(chǎn)生異丙醇的微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了代謝性修飾(Metabolically-modified)的微生物和產(chǎn)生該微生物 的方法。本發(fā)明還提供了通過將適當?shù)牡孜锱c代謝性修飾的微生物和來自該微生物的酶制 劑接觸而產(chǎn)生生物燃料的方法。
背景技術(shù)：
出于經(jīng)濟和環(huán)境的考慮，預期對于作為汽油替代物的生物燃料的需求會增加。常 見的生物燃料——乙醇——并不理想，因為其能量密度低于汽油，并且必須以有限的濃度 范圍與汽油混合以便用作運輸燃料。乙醇也是吸濕性的和腐蝕性的，從而引起儲存和配送 系統(tǒng)方面的問題。異丙醇與1-丁醇一樣對乙醇具有優(yōu)勢；增加的優(yōu)勢是，由于其分支的碳 鏈，異丙醇的辛烷值高于1-丁醇。1-丁醇作為發(fā)酵產(chǎn)物而生產(chǎn)，并且用作發(fā)動機燃料，但異 丙醇從未以高收率從可再生資源中生產(chǎn)并且從未被認為是汽油替代品，即使其已經(jīng)被用作 發(fā)動機添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本文提供了代謝性修飾的微生物，其包括用于產(chǎn)生生物燃料諸如異丙醇的重組生 物化學途徑。還提供了使用本文所述的微生物生產(chǎn)生物燃料的方法。本發(fā)明提供了一種重組微生物，包括從適當?shù)奶嫉孜锏陌l(fā)酵生產(chǎn)異丙醇的生物化 學途徑，所述生物化學途徑包括乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶，其中所述微生物包括至少一種 與相應的親代微生物相比異源的多肽。在一個實施方案中，該微生物包括與親代微生物相 比具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽表達升高，其中所述重組微生物從包括乙酰輔 酶A的底物產(chǎn)生包括乙酰乙酰輔酶A的代謝物。在一個實施方案中，具有乙酰輔酶A乙?；?轉(zhuǎn)移酶活性的多肽由atoB基因或其同源物，或fadA基因或其同源物編碼。在另一個實施方 案中，具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽由與SEQ ID NO :1中所示的序列具有至少 約50%同一性的多核苷酸編碼。atoB基因或fadA基因可來自埃希桿菌屬。在一個實施方案 中，所述微生物是重組大腸桿菌(E. coli)。還在進一步的實施方案中，具有乙酰輔酶A乙酰 基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽由thl基因或其同源物編碼。在一個實施方案中，thl基因來自梭菌屬 (genus Clostridium)。還在另一個實施方案中，微生物包括與親代微生物相比具有乙酰乙 酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶活性的多肽表達升高，其中該重組微生物從包括乙酰乙酰輔酶A的底物產(chǎn) 生包括乙酰乙酸的代謝物。在進一步的實施方案中，乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶由atoAD基因或 其同源物編碼(例如，atoD包括SEQ ID NO :3中所示的序列)。在一個實施方案中，atoD包 括與SEQ ID NO :3至少50%、60%或70%或更高相同的序列。在另一個實施方案中，atoAD基因來自大腸桿菌。還在另一個實施方案中，微生物包括與親代微生物相比具有乙酰乙酸 脫羧酶活性的多肽表達升高，其中該重組微生物從包括乙酰乙酸的底物產(chǎn)生包括丙酮的代 謝物。在另一個實施方案中，微生物包括由adc基因或其同源物編碼的乙酰乙酸脫羧酶。 在一個實施方案中，adc基因來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、溶纖維 丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)、熱角軍H高溫厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum)和艱難梭菌(Clostridium difficile)。在具體的實施方案中， 該微生物是丙酮丁醇梭菌。還在另一個實施方案中，乙酰乙酸脫羧酶包括與SEQ ID NO 5至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99. 5%相同的序列。在另一個實施方案中，微生 物包括與親代微生物相比具有仲醇脫氫酶活性的多肽表達升高，其中該重組微生物從包括 丙酮的底物產(chǎn)生包括異丙醇的代謝物。在一個實施方案中，具有仲醇脫氫酶活性的多肽由 adh或sadh基因或其同源物編碼。還在另一個實施方案中，adh基因來自布氏熱厭氧桿菌 (T.brockii)或拜氏梭菌(C.beijerinckii)0還在進一步的實施方案中，adh或sadh包括 與SEQ ID N0:7或9至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99.5%相同并具有醇脫氫酶 活性的序列。在一個實施方案中，微生物包括乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn) 移酶、乙酰乙酸脫羧酶和adh (仲醇脫氫酶)的表達或增加的表達。本發(fā)明還提供了一種重組微生物，其包括從適當?shù)奶嫉孜锏陌l(fā)酵產(chǎn)生異丙醇的重 組生物化學途徑，其中該重組生物化學途徑包括乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸脫羧酶和adh (仲醇脫氫酶)的升高表達。本發(fā)明進一步提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，該微生物將適當?shù)奶嫉孜镛D(zhuǎn)變 為異丙醇，該方法包括用編碼具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、乙酰 乙酸脫羧酶和adh(仲醇脫氫酶)活性的多肽的一種或多種多核苷酸轉(zhuǎn)化微生物。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生異丙醇的方法，該方法包括在生物體中誘導thl或atoB基 因、CtfAB或atoAD基因或操縱子、adc基因、adh(仲醇脫氫酶)基因、或其任何組合的過度 表達，其中該生物體當在適當?shù)奶嫉孜锏拇嬖谙屡囵B(yǎng)時產(chǎn)生異丙醇。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生異丙醇的方法，該方法包括在產(chǎn)生異丙醇的條件下培養(yǎng)上 述的微生物。本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生異丙醇的方法，該方法包括(i)誘導生物體中thl或 atoB基因的過度表達；(ii)誘導生物體中CtfAB或atoAD基因的過度表達；(iii)誘導生物 體中adc基因的過度表達；(iv)誘導生物體中adh基因的過度表達；或(ν)誘導⑴、(ii)、 (iii)和(iv)的過度表達。本發(fā)明提供了一種重組載體，包括(i)編碼第一多肽的第一多核苷酸，該第一多 肽催化從包括乙酰乙酰輔酶A的底物向乙酰乙酸的轉(zhuǎn)變；(ii)編碼第二多肽的第二多核苷 酸，該第二多肽催化從包括乙酰乙酸的底物向丙酮的轉(zhuǎn)變；以及(iii)編碼第三多肽的第 三多核苷酸，該第三多肽催化從包括丙酮的底物向異丙醇的轉(zhuǎn)變。在一個實施方案中，該載 體可以是質(zhì)粒。在另一個實施方案中，該載體可以是表達載體。此外，該載體可用來轉(zhuǎn)化或 轉(zhuǎn)染宿主細胞(例如，微生物)。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化的微生物可用來產(chǎn)生異丙醇。本發(fā)明提供了一種重組微生物，包括至少一條促進葡萄糖向異丙醇轉(zhuǎn)變的異源核 酸序列。本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)在下面的附圖和說明中給出。從說明和附圖以及從權(quán)利要求中，其他特征、目的和優(yōu)勢將是顯而易見的。附圖簡要說明

圖1顯示產(chǎn)生異丙醇的代謝途徑。圖2顯示途徑基因的各種組合的最大異丙醇產(chǎn)量的比較。圖 3 顯示 TAll (pTA39/pTA36 :thl-atoAD-adc_adh (cb))產(chǎn)生異丙醇的時程。圖4顯示用于本發(fā)明的方法和組合物中的adh多核苷酸的序列(SEQ ID NO 7和 9)。詳細描述在本文中除非另外具體注明，使用的術(shù)語的定義為制藥學領(lǐng)域中所使用的標準定 義。除非上下文另外明確地指明，在說明書和所附的權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“一個”、 “一種”和“該”包括復數(shù)指代物。因此，例如，提到“一種底物”包括兩種或更多種該類底物 的混合物，等等。除非另外說明，使用“或”的含義是“和/或”。類似地，“包括”、“包含”和“含有” 是可互換的，不意在是限制性的。要進一步理解的是，在各實施方案的描述使用術(shù)語“包括”時，本領(lǐng)域技術(shù)人員
將理解，在一些特定的情況下，可選地，實施方案可使用語言“基本上由......組成”或
“由......組成”來描述。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員所普遍理解的相同含義。盡管在所公開的方法和組合物的實施中可使用與本文中所 述的相似或等效的任何方法和試劑，但現(xiàn)在示例性的方法和材料被描述。本文中所提到的所有出版物的全部內(nèi)容以引用方式合并入本文中用于說明和公 開在這些出版物中描述的方法學，其可與本文中的描述結(jié)合使用。上面和整篇文章中所討 論的出版物被提供，僅僅是因為他們在本發(fā)明申請日之前公開。本文中的任何內(nèi)容都不應 被解釋為承認因為在先公開而使本發(fā)明人無權(quán)占先于這些公開。1- 丁醇的天然生產(chǎn)物，諸如丙酮丁醇梭菌，也產(chǎn)生諸如丙酮、乙醇和丁酸的副產(chǎn)物 作為發(fā)酵產(chǎn)物。已經(jīng)開發(fā)了高產(chǎn)量ι-丁醇生產(chǎn)物來優(yōu)化收率和生產(chǎn)率。然而，這些微生物 的大多數(shù)相對地難以操作。用于這些微生物的遺傳工具不如用于用戶友好宿主諸如大腸 桿菌的遺傳工具那樣有效，并且對其生理學及其代謝調(diào)節(jié)理解較少，阻止了向高效率生產(chǎn) 的快速發(fā)展。此外，也沒有鑒定到從葡萄糖生產(chǎn)工業(yè)相關(guān)數(shù)量級的其他高級醇諸如異丙醇、 2-甲基1-丁醇、3-甲基1-丁醇和2-苯乙醇的天然微生物，盡管作為微生物副產(chǎn)物已經(jīng)被 鑒定到小量的這些高級醇。在各個實施方案中，本文中提供的代謝改造微生物(metabolically engineeredmicroorganism)包括用于生產(chǎn)包括異丙醇的醇類的生物化學途徑。在各個方 面，本文中提供的重組微生物包括與親代微生物相比至少一種靶酶表達升高。靶酶由來自 適當?shù)纳飦碓吹暮怂嵝蛄芯幋a，并從其表達。在一些方面，核酸序列是來自細菌或酵母來 源的基因。如在此使用的術(shù)語“代謝改造的”或“代謝改造”涉及合理的途徑設(shè)計，以及生物 合成基因、操縱子相關(guān)基因和這些核酸序列的控制元件的組裝，用于在微生物中產(chǎn)生所需 的代謝物，諸如醇。“代謝工程”可進一步包括通過使用遺傳工程改造和合適的培養(yǎng)條件調(diào)節(jié)和優(yōu)化轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)功能性質(zhì)來優(yōu)化代謝通量。生物合成基因可 以是與宿主(例如，微生物)異源的，或是由于來源于宿主外，或在內(nèi)源性宿主細胞中通過 誘變、重組和/或與異源表達控制序列相關(guān)聯(lián)而被修飾。合適的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)基PH、離 子強度、營養(yǎng)含量等條件；溫度條件；氧/CO2/氮含量條件；濕度條件；以及允許由宿主微生 物——即通過微生物的代謝作用——產(chǎn)生化合物的其他培養(yǎng)條件。對于可用作宿主細胞的 微生物，合適的培養(yǎng)條件是公知的。因此，通過將遺傳物質(zhì)導入至選擇的宿主或親代微生物中從而修飾或改變微生物 的細胞生理學和生物化學而產(chǎn)生代謝“改造的”或“修飾的”微生物。通過遺傳物質(zhì)的導入， 親代微生物獲得新的性狀，例如，產(chǎn)生新的或較大數(shù)量的細胞內(nèi)代謝物的能力。在說明性的 實施方案中，遺傳物質(zhì)導入親代微生物中產(chǎn)生新的或修飾的能力以產(chǎn)生醇諸如異丙醇。導 入親代微生物中的遺傳物質(zhì)包含編碼參與產(chǎn)生醇的生物合成途徑的一種或多種酶的基因 (一種或多種)，或基因的一部分，并且還包括用于表達這些基因和/或調(diào)節(jié)這些基因的表 達的其他元件，例如，啟動子序列。本文中提供的微生物被修飾從而以親代微生物中不能獲得的數(shù)量產(chǎn)生代謝物。 “代謝物”指由代謝產(chǎn)生的任何物質(zhì)或特定代謝過程中必需的物質(zhì)或參與特定代謝過程中 的物質(zhì)。代謝物可以是有機化合物，該化合物是代謝的起始物質(zhì)(例如，葡萄糖或丙酮酸)、 代謝的中間產(chǎn)物(例如，乙酰輔酶A)或代謝的終產(chǎn)物(例如，異丙醇)。代謝物可用來構(gòu)建 更復雜的分子，或它們可分解為更簡單的分子。中間代謝物可從其他代謝物合成，可能用于 制備更復雜的物質(zhì)，或分解成為更簡單的化合物，常常有化學能的釋放。代謝的終產(chǎn)物是其 他代謝物分解的最終結(jié)果。術(shù)語“生物合成途徑”還稱為“代謝途徑”，指用于將一種化學物種轉(zhuǎn)變(改變)為 另一種的一組合成代謝或分解代謝生化反應。如果多個基因產(chǎn)物并聯(lián)地或串聯(lián)地作用于相 同的底物，產(chǎn)生相同的產(chǎn)物，或作用于或產(chǎn)生相同的底物和代謝終產(chǎn)物之間的代謝中間產(chǎn) 物(即，代謝物)，則這些基因產(chǎn)物屬于同一“代謝途徑”。術(shù)語“底物”或“適當?shù)牡孜铩敝竿ㄟ^酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛟噲D轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪换衔锏?任何物質(zhì)或化合物。該術(shù)語不僅包括單一化合物，還包括化合物的組合，諸如含有至少一種 底物、或其衍生物的溶液、混合物和其他物質(zhì)。此外，術(shù)語“底物”不僅包括提供適合用作起 始物質(zhì)的碳源的化合物，諸如任何生物質(zhì)衍生糖，而且包括與如本文中所述的代謝改造微 生物相關(guān)的途徑中使用的中間代謝產(chǎn)物和代謝終產(chǎn)物?！吧镔|(zhì)衍生糖”包括，但不限于， 諸如葡萄糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的分子。術(shù)語生物質(zhì)衍生糖包括通常由微生物利用的 適當?shù)奶嫉孜?，諸如六碳糖，包括但不限于所有D或L型的葡萄糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜 糖、半乳糖和甘露糖，或六碳糖的組合，諸如葡萄糖和果糖，和/或六碳糖酸，包括但不限于 2_酮-L-古洛糖酸、艾杜糖酸(IA)、葡萄糖酸(GA)、6_磷酸葡萄糖酸、2-酮-D-葡萄糖酸 (2KDG)、5_酮-D-葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸鹽、2，5- 二酮-L-古洛糖酸、2，3-L- 二酮 基葡萄糖酸、脫氫抗壞血酸、異抗壞血酸(EA)和D-甘露糖酸。本文中提供的重組微生物可表達參與使用適當?shù)奶嫉孜锂a(chǎn)生異丙醇的途徑中的 多種靶酶。許多微生物可被修飾以包括適于產(chǎn)生異丙醇的重組代謝途徑。多種微生物可用作 編碼適合用于本文提供的重組微生物中的靶酶的遺傳物質(zhì)的“來源”。術(shù)語“微生物”包括
8來自古細菌域、細菌域和真核生物域的原核和真核微生物物種，后者包括酵母和絲狀真菌、 原生動物、藻類或高等原生生物。術(shù)語“微生物細胞”和“微生物(microbes)”與術(shù)語微生 物互換使用。術(shù)語“原核生物”是本領(lǐng)域公知的，并且指不含有核或其他細胞器的細胞。原核生 物通常被分入兩個域——細菌域和古細菌域——中的一個域。古細菌域和細菌域的生物體 之間的定義差別基于16S核糖體RNA中核苷酸堿基序列的根本差異。術(shù)語“古細菌”指一類疵壁菌門(division Mendosicute)生物體，一般見于異 常環(huán)境中，并且通過幾個標準與原核生物的其余生物相區(qū)別，包括核糖體蛋白的數(shù)目和 細胞壁中缺少胞壁酸。基于ssrRNA分析，古細菌由系統(tǒng)發(fā)育不同的兩群組成泉古菌門 (Crenarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota)。基于其生理學，古細菌編為三類產(chǎn)甲 烷菌(methanogen)(產(chǎn)生甲烷的原核生物)；極端嗜鹽菌(extreme halophile)(在非 常高的鹽濃度([NaCl])下生活的原核生物)；以及極端(超)嗜熱菌(extreme (hyper) thermophilus)(在非常高的溫度下生活的原核生物)。除了使它們與細菌相區(qū)分的統(tǒng)一古 細菌特征(即，細胞壁中沒有胞壁質(zhì)，無酯連接膜脂等)以外，這些原生生物顯示獨特的結(jié) 構(gòu)或生物化學屬性，使其適應于其特殊的棲息地。泉古菌門主要由超嗜熱硫依賴型原核生 物(hyperthermophilicsulfur-dependent prokaryote)組成，而廣古菌門包含產(chǎn)甲燒菌禾口 極端嗜鹽菌。“細菌”或“真細菌(eubacteria)”指原核生物體的一個域。細菌包括如下至少 11個不同的群(1)革蘭氏陽性(革蘭氏+)細菌，其中有兩種主要的亞門(subdivision) (1)高G+C群(放線菌屬(Actinomycetes)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)、微球菌屬 (Micrococcus)等)，(2)低 G+C 群(桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridia)、乳酸菌 屬(Lactobacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、鏈球菌屬(Str印tococci)、支原體 屬(Mycoplasmas)) ； (2)變形菌(Proteobacteria)，例如，紫色光合+非光合革蘭氏陰 性細菌(包括最“常見的”革蘭氏陰性菌)；(3)藍細菌(Cyanobacteria)例如，產(chǎn)氧光 合菌(oxygenic phototrophs), (4)螺旋體(Spirochetes)及親緣種；(5)浮霉狀菌屬 (Planctomyces) ； (6)擬桿菌屬(Bacteroides)、黃桿菌屬(Flavobacteria) ； (7)衣原體 屬(Chlamydia) ； (8)綠色硫細菌(Green sulfurbacteria) ； (9)綠色非硫細菌(Green non-sulfur bacteria) (^W^BiM.jtn-M (anaerobic phototrophs)) ； (10)而畐身寸 微球菌(Radioresistant micrococci)及親緣細菌；(11)嗜熱棲熱袍菌(Thermotoga thermophiles)禾口嗜熱棲熱腔菌(Thermosiphothermophiles)?！案锾m氏陰性細菌”包括球菌(cocci)、非腸道桿菌(nonenteric rods)和腸 道桿菌(enteric rods)。革蘭氏陰性細菌屬包括，例如，奈瑟菌屬(Neisseria)、螺 菌屬(Spirillum)、巴氏桿菌屬(Pasteurella)、布魯氏菌屬(Brucella)、耶爾森氏菌 屬(Yersinia)、弗朗西斯菌屬(Francisella)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、博德特氏 菌屬(Bordetella)、埃希桿菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀桿菌 屬(Shigella)、克雷白桿菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、弧菌屬(Vibrio)、假 單胞菌屬(Pseudomonas)、擬桿菌屬(Bacteroides)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、產(chǎn)氣 桿菌屬(Aerobacter)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、固氮菌屬(Azotobacter)、螺方寵狀菌 屬(Spirilla)、沙雷氏菌屬(Serratia)、弧菌屬(Vibrio)、根瘤菌屬(Rhizobium)、衣原體屬(Chlamydia)、立克次體屬(Rickettsia)、密螺旋體屬(Tr印onema)、和梭形桿菌屬 (Fusobacterium)?！案锾m氏陽性細菌”包括球菌、無孢菌(nonsporulating rods)和產(chǎn)孢菌 (sporulating rods)。革蘭氏陽性細菌屬包括，例如，放線菌屬(Actinomyces)、桿菌 屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、丹毒絲菌 屬(Erysipelothrix) > ff lif M (Lactobacillus)、李其Jf 特菌屬(Listeria)、分枝桿菌 屬(Mycobacterium)、粘球菌屬(Myxococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、葡萄球菌屬 (Staphylococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)禾口鏈霉菌屬(Streptomyces)。術(shù)語“重組微生物”和“重組宿主細胞”在本文中互換使用，并且指已經(jīng)被遺傳修 飾以表達或過度表達內(nèi)源性核酸序列，或表達非內(nèi)源性序列諸如包括在載體中的那些序列 的微生物。核酸序列通常編碼如上所述的參與產(chǎn)生所需代謝物的代謝途徑的靶酶。因此， 本文所述的重組微生物已經(jīng)被遺傳改造以表達或過度表達以前不被親代微生物表達或過 度表達的靶酶。要理解，術(shù)語“重組微生物”和“重組宿主細胞”不僅指特定的重組微生物， 而且還指該微生物的子代或潛在的子代。“親代微生物”指用來產(chǎn)生重組微生物的細胞。術(shù)語“親代微生物”描述了天然存 在的細胞，即，沒有被遺傳修飾的“野生型”細胞。術(shù)語“親代微生物”還描述已經(jīng)被遺傳修 飾但沒有表達或過度表達靶酶——例如，參與產(chǎn)生所需代謝物諸如異丙醇的生物合成途徑 的酶——的細胞。例如，野生型微生物可被遺傳修飾以表達或過度表達第一靶酶諸如硫解 酶。此微生物可在被修飾以表達或過度表達第二靶酶的微生物的產(chǎn)生中用作親代微生物。 依次地，被修飾以表達或過度表達例如硫解酶和第二酶的微生物可被修飾以表達或過度表 達第三靶酶等。因此，親代微生物的作用是用作連續(xù)遺傳修飾事件的參照細胞。各次修飾 事件可通過將核酸分子導入?yún)⒄占毎衼韺崿F(xiàn)。導入作用促進了靶酶的表達或過度表達。 要理解，術(shù)語“促進”包括通過親代微生物中的例如啟動子序列的遺傳修飾來活化編碼靶酶 的內(nèi)源性核酸序列。要進一步理解，術(shù)語“促進”包括將編碼靶酶的外源性核酸序列導入親 代微生物中。在另一個實施方案中，提供了一種產(chǎn)生重組微生物的方法，該重組微生物將適當 的碳底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫惐肌Ｔ摲椒òㄓ镁幋a多肽的一個或多個重組核酸序列轉(zhuǎn)化微生物， 該多肽在碳源向終產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變中具有所需的酶功能。編碼用于生成代謝物的酶——包括其 同源物、變體、片段、相關(guān)的融合蛋白或功能等效物——的核酸序列，被用在引導這類多肽 在合適的宿主細胞諸如細菌或酵母細胞中表達的重組核酸分子中。要理解，不改變核酸分 子的編碼活性的序列的加入，諸如非功能或非編碼序列的加入，是基礎(chǔ)核酸的保守變異。酶 的“活性”是其催化產(chǎn)生代謝物的反應——即，發(fā)揮功能——的能力的量度，并且可表示為 反應的代謝物產(chǎn)生的速率。例如，酶活性可表示為每單位時間或每單位酶產(chǎn)生的代謝物的 量(例如，濃度或重量)，或以親和力或解離常數(shù)計。本文中可互換使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”或“多肽”，包括由稱為肽鍵的化學鍵連接在一 起的稱為氨基酸的化學構(gòu)件的一條或多條鏈?！懊浮笔侵溉炕虼蟛糠钟傻鞍踪|(zhì)組成的或多 或少特異性地催化或促進一個或多個化學或生物化學反應的任何物質(zhì)。術(shù)語“酶”還可指 催化性多核苷酸(例如，RNA或DNA)。“天然”或“野生型”蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、基因或細 胞是指天然存在的蛋白質(zhì)、酶、多核苷酸、基因或細胞。
如果編碼蛋白質(zhì)的核酸序列具有與編碼第二蛋白質(zhì)的核酸序列相似的序列，則該 蛋白質(zhì)與該第二蛋白質(zhì)具有“同源性”或與其“同源”。可選地，如果兩個蛋白質(zhì)具有“相似 的”氨基酸序列，則一個蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)具有同源性。(因此，術(shù)語“同源蛋白”被定義 為指兩個蛋白質(zhì)具有相似的氨基酸序列)。如本文使用的，當氨基酸序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%的同一性時，兩個蛋白質(zhì)(或所 述蛋白質(zhì)的區(qū))是基本上同源的。為了測定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的同一性百分 比，為了進行最優(yōu)比較，將這些序列進行比對(例如，為了進行最優(yōu)比對可在第一和第二氨 基酸或核酸序列的一個或兩個中導入空位(gap)，并且為了進行比較可忽略非同源序列)。 在一個實施方案中，為了進行比較而比對的參考序列的長度為該參考序列的長度的至少 30 %，典型地至少40 %，更典型地至少50 %，甚至更典型地至少60 %，并且甚至更典型地至 少70 %、80 %、90 %、100 %。然后比較在相應的氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或 核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄械囊粋€位置被與第二序列中相應位置的氨基酸殘基或核苷酸相同的 氨基酸殘基或核苷酸占用時，則所述分子在該位置處是相同的(本文中使用的氨基酸或核 酸“同一性”與氨基酸或核酸“同源性”等價)。兩條序列之間的同一性百分比是所述序列 共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)，同時考慮為了兩條序列的最優(yōu)比對而需要被導入的空位的 數(shù)目以及各空位的長度。當在提及蛋白質(zhì)或肽時使用“同源的”時，要認識到不相同的殘基位置經(jīng)常由于保 守氨基酸置換而不同?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是一個氨基酸殘基被具有含相似化學性質(zhì)(例 如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈(R基團)的另一氨基酸殘基置換。通常，保守氨基酸置換基本 上不改變蛋白質(zhì)的功能特性。在兩條或更多條氨基酸序列由于保守置換而彼此不同的情況 下，可向上調(diào)節(jié)序列同一性百分比或同源性程度以校正置換的保守性。用于進行此調(diào)節(jié)的 方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(見，例如，Pearson等人，1994，在此以引用方式合并入本 文中)。下列的六組各自含有彼此保守置換的氨基酸1)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T) ；2)天門 冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天門冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K) ；5) 異亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸㈧、纈氨酸(V)，以及6)苯丙氨酸(F)、酪氨 酸(Y)、色氨酸(W)0多肽的序列同源性，也稱為序列同一性百分比，典型地使用序列分析軟件來測 定° 見，例如，Genetics Computer Group (GCG), University of WisconsinBiotechnology Center (威斯康星大學生物技術(shù)中心)，910 University Avenue (910大學大街)， Madison(麥迪遜)，Wis.(威斯康星州)53705的序列分析軟件包。蛋白質(zhì)分析軟件使用 指定為各種置換、缺失和其他修飾作用包括保守氨基酸置換的同源性量度來匹配相似的序 列。例如，GCG包含諸如“Gap”和“Bestfit”的程序，它們可使用缺省參數(shù)來測定密切相關(guān) 的多肽諸如來自不同種屬的生物體的同源多肽之間或野生型蛋白質(zhì)及其突變蛋白之間的 序列同源性或序列同一性。見，例如，GCG 6. 1版。當將抑制性分子序列與含有來自不同生物體的大量序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，典 型的算法是計算機程序 BLAST (Altschul, 1990 ；Gish, 1993 ；Madden, 1996 ；Altschul, 1997 ； Zhang，1997)，特別是 blastp 或 tblastn(Altschul，1997)。用于 BLASTp 的典型參數(shù)為期
11望值10(缺省)；過濾seg(缺省)；空位開放罰分(Costto open a gap) :11(缺省)；空 位延伸罰分(Cost to extend a gap) :1(缺省)；最大比對100 (缺省)；字長11(缺省)； 描述編號100(缺省)；罰分矩陣(Penalty Matrix) :BL0WSUM62。當搜索含有來自大量不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫時，典型地比較氨基酸序列。使 用氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫搜索可通過本領(lǐng)域已知的blastp以外的算法來測量。例如，多肽序 列可使用FASTA進行比較，F(xiàn)ASTA是GCG 6. 1版中的一個程序。FASTA提供查詢序列和搜索 序列之間的最佳重疊區(qū)的比對和序列同一性百分比(Pearson，1990，在此以引用方式合并 入本文中)。例如，氨基酸序列之間的序列同一性百分比可使用FASTA、采用其缺省參數(shù)(字 長為2，以及PAM250打分矩陣)來測定，F(xiàn)ASTA在GCG 6. 1版中提供，該軟件在此以引用方 式合并入本文中。要理解，上面所述的核酸序列包括“基因”，并且上述的核酸分子包括“載體”或“質(zhì) ?！?。例如，編碼酮硫解酶(keto thiolase)的核酸序列可由atoB基因或其同源物、或fadA 基因或其同源物編碼。因此，術(shù)語“基因”，也稱為“結(jié)構(gòu)基因”指編碼特定氨基酸序列的核 酸序列，包括編碼一種或多種蛋白質(zhì)或酶的全部或部分，并且可包括調(diào)控(非轉(zhuǎn)錄)DNA序 列，諸如啟動子序列，其決定例如基因表達所處的條件。基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)可包括非翻譯區(qū)，包 括內(nèi)含子，5'-非翻譯區(qū)(UTR)和3' -UTR，以及編碼序列。術(shù)語“核酸”或“重組核酸”指 多核苷酸諸如脫氧核糖核酸(DNA)，以及在適當時，指核糖核酸(RNA)。術(shù)語“表達”就基因 序列而言，指基因的轉(zhuǎn)錄，以及，在適當時，指得到的mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯為蛋白質(zhì)。因此，從上 下文將很清楚，蛋白的表達由開放閱讀框序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯而產(chǎn)生。術(shù)語“操縱子”指從共同啟動子、作為單個轉(zhuǎn)錄單位被轉(zhuǎn)錄的兩個或多個基因。在 一些實施方案中，包括操縱子的基因是鄰近基因。要理解，整個操縱子的轉(zhuǎn)錄可通過修飾 共同啟動子而被修飾(即，增加、減少或去除)?？蛇x地，操縱子中的任何基因或基因組合 可被修飾以改變編碼多肽的功能或活性。修飾作用可導致編碼多肽的活性增加。此外， 修飾作用可將新的活性賦予編碼多肽。示例性的新活性包括利用替代底物(alternative substrate)和/或在更替的環(huán)境條件中發(fā)揮作用的能力?！拜d體”是核酸可在生物體、細胞或細胞組分之間傳播和/或傳遞所借助的任何方 式。載體包括病毒、噬菌體、原病毒(pro-virus)、質(zhì)粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、和人工染色體諸如 YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌人工染色體)以及PLAC(植物人工染色體)等，其是“附 加體”，g卩，自主復制或可整合進宿主細胞的染色體中。載體還可以是裸RNA多核苷酸、裸 DNA多核苷酸、在同一條鏈內(nèi)由DNA和RNA組成的多核苷酸、聚賴氨酸偶聯(lián)的DNA或RNAJt 偶聯(lián)的DNA或RNA、脂質(zhì)體偶聯(lián)的DNA等，或者本質(zhì)上不是附加型的(印isomal)，或其可以 是包括上述多核苷酸構(gòu)建體的一種或多種的生物體，諸如農(nóng)桿菌或細菌?！稗D(zhuǎn)化”指載體導入至宿主細胞中的過程。轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)導，或轉(zhuǎn)染)可通過許多方 式包括電穿孔、微注射、基因槍(或微彈轟擊介導的遞送)或農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化中的任何一 種來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，由于遺傳密碼的簡并性，許多其核苷酸序列不同的DNA 化合物可用來編碼本發(fā)明的指定氨基酸序列。編碼上述生物合成酶的天然DNA序列在本文 中僅被引用來說明本發(fā)明的實施方案，并且本發(fā)明包括編碼在本發(fā)明的方法中使用的酶的 多肽和蛋白質(zhì)的氨基酸序列的任何序列的DNA化合物。以類似的方式，多肽可典型地容忍
12在其氨基酸序列中一個或多個氨基酸置換、缺失和插入，而不喪失或明顯地喪失所需的活 性。本發(fā)明包括具有可選氨基酸序列的此類多肽，并且由本文中顯示的DNA序列編碼的氨 基酸序列僅說明本發(fā)明的實施方案。本發(fā)明提供編碼一個或多個靶酶的核酸分子，其具有重組DNA表達載體或質(zhì)粒形 式，如下面更詳細的說明。通常，此類載體可在宿主微生物的胞質(zhì)中復制或整合進宿主微生 物的染色體DNA中。在任一種情況下，載體可以是穩(wěn)定載體(即，即使僅采用選擇壓力，載 體經(jīng)多次細胞分裂后仍存在)或瞬時載體(即，隨著細胞分裂次數(shù)的增加，載體逐漸地被宿 主微生物遺失)。本發(fā)明提供分離的(即，非純的，但在制劑中以自然界中未發(fā)現(xiàn)的豐度和 /或濃度存在)和純化的(即，基本上不含有污染物質(zhì)或基本上不含有在自然界中與相應 DNA 一起存在的物質(zhì))形式的DNA分子。包括此類核酸的重組表達載體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語表達載體指可被導入 至宿主微生物或無細胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)中的核酸。表達載體可永久地或暫時地維持在微生 物中，或是作為染色體的一部分或是微生物中或任何的細胞區(qū)室中的其他DNA，諸如胞質(zhì)中 的復制型載體。表達載體還包括驅(qū)動RNA表達的啟動子，其典型地在微生物或細胞提取物 中被翻譯成多肽。為了有效地從RNA翻譯為蛋白質(zhì)，表達載體還典型地含有位于要表達的 基因的編碼序列的起始密碼子上游的核糖體結(jié)合位點序列。其他元件，諸如增強子、分泌信 號序列、轉(zhuǎn)錄終止序列，以及含有載體的宿主微生物可通過其而被鑒定和/或選擇的一種 或多種標志基因，也可存在于表達載體中。使用選擇標記，即，賦予抗生素抗性或敏感性的 基因，并且當細胞在合適的選擇性培養(yǎng)基中生長時賦予轉(zhuǎn)化細胞以選擇性表型。表達載體的各種成分可變化很大，取決于載體的使用目的以及載體預期在其中復 制或驅(qū)動表達的(多種)宿主細胞。適于在大腸桿菌、酵母、鏈霉菌和其他常用細胞中表達 基因和維持載體的表達載體成分是公知的并可從商業(yè)渠道獲得。例如，用于包含在本發(fā)明 的表達載體中的合適啟動子包括在真核或原核宿主微生物中發(fā)揮作用的那些啟動子。啟動 子可包括允許調(diào)控與宿主微生物的生長相關(guān)的表達的調(diào)控序列或響應于化學或物理刺激 使基因的表達開啟或關(guān)閉的調(diào)控序列。對于大腸桿菌和某些其他的細菌宿主細胞，可使用 來源于生物合成酶、賦予抗生素抗性的酶和噬菌體蛋白的基因的啟動子，包括，例如，半乳 糖啟動子、乳糖(Iac)啟動子、麥芽糖啟動子、色氨酸(trp)啟動子、β-內(nèi)酰胺酶(bla)啟 動子、λ噬菌體PL啟動子和Τ5啟動子。另外，還可使用合成啟動子，諸如tac啟動子(美 國專利號4，551，433)。對于大腸桿菌表達載體，包含大腸桿菌復制起點是有用的，諸如來自 pUC.plP.pl 禾口 pBRo因此，重組表達載體含有至少一種表達系統(tǒng)，依次地，該表達系統(tǒng)由可操作地與啟 動子連接的至少一部分PKS和/或其他生物合成基因編碼序列以及任選的可在相容的宿主 細胞中操作以實現(xiàn)該編碼序列的表達的終止序列組成。宿主細胞通過用本發(fā)明的重組DNA 表達載體轉(zhuǎn)化而被修飾以包含表達系統(tǒng)序列作為染色體外元件或整合進染色體中。如前所述，術(shù)語“宿主細胞”與術(shù)語“重組微生物”可互換使用，并且包括適于產(chǎn)生 異丙醇并易于用核酸構(gòu)建物諸如載體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的任何細胞類型。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，修飾編碼序列以增強其在特定宿主中的表達會是有 利的。遺傳密碼冗余，具有64種可能的密碼子，但大多數(shù)生物體典型地使用這些密碼子的 子集。在物種中最常利用的密碼子稱為最優(yōu)密碼子，并且那些不十分經(jīng)常利用的密碼子被歸為稀有密碼子或低利用率密碼子(low-usagecodon)。密碼子可被置換以反映宿主的優(yōu)選 密碼子使用，該過程有時稱為“密碼子優(yōu)化”或“控制物種密碼子偏好性”?？芍苽浜刑囟ㄔ嘶蛘婧怂拗鲀?yōu)選的密碼子的優(yōu)化編碼序列(還參見，Murray 等人，(1989) Nucl. Acids Res. 17 :477_508)，例如，以增加翻譯速率或產(chǎn)生具有所需特性的 重組RNA轉(zhuǎn)錄物，如與由非優(yōu)化序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物相比較長的半衰期。翻譯終止密碼子也 可被修飾以反映宿主偏好性。例如，釀酒酵母(S. cerevisiae)和哺乳動物的典型終止密碼 子分別為UAA和UGA0對于單子葉植物典型的終止密碼子為UGA，而昆蟲和大腸桿菌常常使 用UAA作為終止密碼子(Dalphin等人，(1996) Nucl. Acids Res. 24 :216_218)。用于優(yōu)化在 植物中表達的核苷酸序列的方法學在例如，美國專利號6，015，891和本文中引用的參考文 獻中提供。本發(fā)明的核酸可使用cDNA、mRNA或可選地，基因組DNA作為模板和合適的寡核苷 酸引物根據(jù)標準的PCR擴增技術(shù)和下面實施例部分中所述的那些步驟來擴增。如此擴增的 核酸可被克隆進合適的載體中，并且通過DNA序列分析來表征。此外，可通過標準的合成技 術(shù)，例如，使用自動DNA合成儀來制備對應于核苷酸序列的寡核苷酸。還要理解，編碼與本文所述的酶同源的多肽的分離的核酸分子可通過將一個或多 個核苷酸置換、添加、或缺失引入編碼特定多肽的核苷酸序列中而生成，使得一個或多個氨 基酸置換、添加或缺失被引入編碼蛋白中。突變可通過標準技術(shù)——諸如位點定向誘變和 PCR介導的誘變——而被引入核酸序列中。與那些其中可能需要進行非保守氨基酸置換 (見上)的位置相反，在一些位置中優(yōu)選進行保守氨基酸置換?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是這樣 的置換，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基 的家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)被確定。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨 酸、組氨酸)、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈 的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非 極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、 色氨酸)、具有β-支化側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè) 鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。在另一實施方案中，提供了產(chǎn)生異丙醇的方法。該方法包括在適當?shù)孜锏拇嬖谙?并在適合于底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫惐嫉臈l件下培養(yǎng)如本文中所提供的重組微生物。由本文中提供 的微生物所產(chǎn)生的醇可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法來檢測。此類方法包括質(zhì)譜測 定法。適合于生長和維持本文中提供的重組微生物的培養(yǎng)條件描述在下面的實施例中。普 通技術(shù)人員將認識到這些條件可被修改以適應各種微生物的要求。如前面所討論的，描述本文中使用的分子生物學技術(shù)，包括載體、啟動子的應用 和許多其他相關(guān)主題的普通教材包括Berger和Kimmel，Guide toMolecular Cloning Techniques (分子克隆技術(shù)指南)，Methods in Enzymology 152 卷，(Academic Press, Inc.，San Diego, Calif.) ( " Berger " ) ；Sambrook 等 人’ MolecularCloning__A Laboratory Manual (分子克隆-實驗室手冊)，第 二版，1-3 卷，ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. ,1989( " Sambrook ")禾口 CurrentProtocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學實驗指南)，F(xiàn). M. Ausubel等人主編，Current Protocols (實驗室指南)，a joint venture between Greene PublishingAssociates,
14Inc. and John Wiley & Sons, Inc. , (1999 年增刊)(〃 Ausubel “)。足以引導技術(shù)人 員進行體外擴增方法的實驗方法的實例，包括聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應 (LCR)、Q β -復制酶擴增和其他RNA聚合酶介導的技術(shù)(例如，NASBA)，例如，用于產(chǎn)生本發(fā) 明的同源核酸的實驗方法，參見Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等人，(1987) 美國專利號 4,683,202 ;Innis 等人，主編(1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (PCR 實驗方法方法和應用指南)(Academic Press Inc. San Diego, Calif. )(〃 Innis" ) ；Arnheim & Levinson(Oct. 1，1990)C&EN 36-47 ;The Journal OfNIH Research (1991) 3 :81_94 ；Kwoh 等人，(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 1173 ；Guatelli 等人，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1874 ;Lomell 等人，(1989) J. Clin. Chem 35: 1826 ;Landegren 等人，(1988) Science 241 1077-1080 ；Van Brunt (1990) Biotechnology 8 :291-294 ;Wu 和 Wallace (1989) Gene 4 :560 ;Barringer 等人，(1990) Gene 89:117;以及 Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology 13 :563_564。用于克隆體外擴增的核酸的改良 方法描述在Wallace等人，美國專利號5，426，039中。用于通過PCR擴增大核酸的改良方 法概述在Cheng等人，(1994)Nature 369 :684_685和其中引用的參考文獻中，其中產(chǎn)生至 多40kb的PCR擴增子。技術(shù)人員將理解，基本上任何的RNA都可被轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合于限制性消 化、使用逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合酶的PCR擴充和測序的雙鏈DNA。見，例如，Ausubel、Sambrook和 Berger,均見前。因此，本發(fā)明提供了重組微生物，其產(chǎn)生異丙醇并包括與親代微生物相比，靶酶諸 如乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(例如，atoB)、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(例如，thl)、乙酰乙酰 輔酶A轉(zhuǎn)移酶(例如，atoAD)、輔酶A轉(zhuǎn)移酶(例如，ctfAB)、乙酰乙酸脫羧酶(例如，adc) 和仲醇脫氫酶(例如，sadh)或其任何組合的表達或升高表達。另外，與親代微生物相比， 所述微生物可包括破壞、缺失或敲除偏好使用乙酰輔酶A作為底物的醇/乙醛脫氫酶(例 如，adhE基因)的表達。其他的破壞、缺失或敲除可包括編碼選自由下列組成的組的多肽 或蛋白質(zhì)的一種或多種基因(i)催化NADH依賴性的丙酮酸向D-乳酸的轉(zhuǎn)變的酶；(ii) 促進催化延胡索酸和琥珀酸相互轉(zhuǎn)變的酶；(iii)氧轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(oxygen transcription regulator) ； (iv)催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴Ａ姿岬拿?；以?ν)催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴?輔酶A和甲酸的酶。在一個方面，微生物包括醇/乙醛脫氫酶和上面(i)-(iv)中的一種或 多種、但沒有(ν)的組合的破壞、缺失或敲除。如圖1中所示，乙酰乙酰輔酶A可由被代謝改造以表達或過度表達硫解酶或乙酰 輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶的重組微生物產(chǎn)生。因此，本文提供的重組微生物包括至少一種靶酶如酮硫解酶的表達升高。在其他 的方面，重組微生物可表達參與從適當碳底物的發(fā)酵產(chǎn)生異丙醇的途徑中的多種靶酶。多 種靶酶可包括酮硫解酶、乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、輔酶A轉(zhuǎn)移酶、 乙酰乙酸脫羧酶和仲醇脫氫酶或其任何組合。如前所述，在本發(fā)明中描述的靶酶通常產(chǎn)生代謝物。例如，酮硫解酶從包括乙酰輔 酶A的底物產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶A。另外，本發(fā)明中描述的靶酶由多核苷酸編碼。例如，酮硫 解酶可由atoB基因、多核苷酸或其同源物，或fadA基因、多核苷酸或其同源物編碼。atoB 基因或fadA基因可來自提供編碼適當?shù)拿傅倪m當?shù)暮怂嵝蛄械娜魏紊飦碓?。例如，atoB 基因或fadA基因可來自大腸桿菌或丙酮丁醇梭菌。
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在另一個方面，本文中提供的重組微生物包括與親代微生物相比，乙酰輔酶A乙 酰基轉(zhuǎn)移酶表達升高。該微生物從包括乙酰輔酶A的底物產(chǎn)生包括乙酰乙酰輔酶A的代謝 物。乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶可由thlA基因、多核苷酸或其同源物編碼。thlA基因或多核 苷酸可來自梭菌屬。在另一個方面，本文中提供的重組微生物包括與親代微生物相比，乙酰乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶表達升高。該微生物從包括乙酰乙酰輔酶A的底物產(chǎn)生包括乙酰乙酸的代謝物。乙 酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶可由atoAD基因、多核苷酸或其同源物編碼。atoAD可來自大腸桿菌。在另一個實施方案中，本文中提供的重組微生物包括與親代微生物相比，輔酶A 轉(zhuǎn)移酶表達升高。該微生物從包括乙酰乙酰輔酶A的底物產(chǎn)生包括乙酰乙酸的代謝物。輔 酶A轉(zhuǎn)移酶可由ctfAB基因、多核苷酸或其同源物編碼。ctfAB可來自梭菌。在另一個實施方案中，本文中提供的重組微生物包括與親代微生物相比，乙酰乙 酸脫羧酶表達升高。該微生物從包括乙酰乙酸的底物產(chǎn)生包括丙酮的代謝物。乙酰乙酸脫 羧酶可由adc基因、多核苷酸或其同源物編碼。乙酰乙酸脫羧酶可來自梭菌。在另一個實施方案中，本文中提供的重組微生物包括與親代微生物相比，仲 醇脫氫酶表達升高。該微生物從包括丙酮的底物產(chǎn)生包括異丙醇的代謝物。仲醇脫 氫酶可由sadh基因、多核苷酸或其同源物編碼。仲醇脫氫酶可來自梭菌或熱厭氧菌 (Thermoanaerobium)0本發(fā)明鑒定了可用于本發(fā)明的方法、組合物和生物體中的特定基因；然而，要認識 到，沒有必要與這些基因具有絕對的同一性。例如，在包括編碼多肽或酶的序列的特定基因 或多核苷酸中可進行變化并篩選活性。典型地這些變化包括保守突變和沉默突變(silent mutation)。這些修飾的或突變的多核苷酸和多肽可使用本領(lǐng)域已知的方法篩選功能酶活 性的表達。下表和本發(fā)明提供了具有本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的多核苷酸和多肽序列的基因 和各基因的同源物的非限制性實例。
酶示例性的基因異丙醇示例性的微生物乙酰輔酶A乙?；?轉(zhuǎn)移酶atoB+大腸桿菌，丙酮丁 醇梭菌乙酰乙酰輔酶A硫 解酶thl，thlA，thlB+大腸桿菌，丙酮丁 醇梭菌輔酶A轉(zhuǎn)移酶ctf，ctfA, ctfB+丙酮丁醇梭菌乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn) 移酶ato，atoA，atoD+大腸桿菌乙酰乙酸脫羧酶adc+丙酮丁醇梭菌
16 包括丙酮丁醇梭菌thl (乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶)、大腸桿菌atoAD (乙酰乙酰輔 酶A轉(zhuǎn)移酶)、丙酮丁醇梭菌adc (乙酰乙酸脫羧酶)和拜氏梭菌adh (仲醇脫氫酶)的組合 的過度表達的大腸桿菌的示例性收率數(shù)據(jù)為，在搖瓶中產(chǎn)生81. 6mM異丙醇，在生產(chǎn)階段中 的收率為 43. 5% (mol/mol)。本發(fā)明公開了一種重組微生物，包括提供高于野生型微生物的收率的生物合成途 徑。在一個實施方案中，親代微生物不產(chǎn)生異丙醇。例如，野生型大腸桿菌不產(chǎn)生可示蹤量 的異丙醇。還在另一個實施方案中，親代微生物僅產(chǎn)生痕量的異丙醇。在具體的實施方案 中，微生物是大腸桿菌。在另一個方面，培養(yǎng)物包括基本上同源(例如，約70-100%同源) 的微生物群。在另一個方面，培養(yǎng)物可包括各自具有不同的生物合成途徑的微生物的組合， 上述生物合成途徑產(chǎn)生可被在異丙醇的生產(chǎn)中培養(yǎng)的至少一種其它微生物所利用的代謝 物。本發(fā)明提供了在產(chǎn)生本文中所述的重組微生物中有用的各種基因、同源物和變 體的登錄號。要理解的是，本文中所述的同源物和變體是示例性的和非限制性的。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可使用各種數(shù)據(jù)庫獲得其他的同源物、變體和序列，包括，例如，美國國家生物 ^ Η^Φ^ (National Center for Biotechnologylnformation) (NCBI), ^ihKJjiW (World-Wide-Web)上訪問。乙醇脫氫酶(也稱為醛_醇脫氫酶)在大腸桿菌中由adhE編碼。adhE包括三 種活性醇脫氫酶(ADH)；乙醛/乙酰輔酶A脫氫酶(ACDH)；丙酮酸-甲酸裂解酶失活酶 (PFL失活酶)；PFL失活酶活性在鐵、NAD和輔酶A依賴性反應中催化丙酮酸-甲酸裂解 酶催化劑的淬滅。同源物在本領(lǐng)域中是已知的(見，例如，醛-醇脫氫酶(Polytomella sp. Pringsheim 198. 80) gi | 40644910 | emb | CAD42653. 2 | (40644910)；酸-醇脫氫酶(A 型 肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum A str. )ATCC 3502) gi 1148378348 | ref | YP_ 001252889. 1 (148378348)；醛-醇脫氫酶(鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis) C092) gi
16122410 I ref I NP_405723. 1 (16122410)；醛-醇脫氫酶(假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis) IP 32953) gi | 51596429 | ref | YP_070620. 11 (51596429)；酸-醇脫氫 酶(鼠疫耶爾森氏菌 C092)gi|ll5347889|emb|CAL20810. 1 (115347889)；醛-醇脫氫酶 (假結(jié)核耶爾森氏菌 IP 32953) gi I 515897111 emb | CAH21341. 1 (51589711)；醛-醇脫氫酶 (大腸桿菌 CFT073) gi I 26107972 | gb | AAN80172. 11 AE016760_31 (26107972)；酸-醇脫氫酶 (田鼠型鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis biovar Microtus str.) 91001) gi | 45441777 ref |NP_993316. 1 (45441777)；醛-醇脫氫酶(鼠型鼠疫耶爾森氏菌 91001) gi | 45436639 gb|AAS62193. 1 (45436639)；醛-醇脫氫酶(產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens) ATCC 13124) gi 1110798574 I ref I ΥΡ_697219· 11 (110798574)；酸-醇脫氫酶(奧奈達希瓦 氏菌(Shewanella oneidensis)MR-l) gi | 24373696 | ref | NP_717739. 1 (24373696)；酸-醇 脫氫酶(A 型肉毒梭狀芽孢桿菌 ATCC 19397) gi 1153932445 I ref I YP_001382747. 1 (153932 445)；醛-醇脫氫酶(古典型鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis biovar Antiqua str.) E1979001)gi 1165991833 |gb IEDR44134. 1 (165991833)；酸-醇脫氫酶(Α 型肉毒梭狀芽孢桿菌 Hall ^ ) gi 1153937530 | ref | YP_001386298. 1 (153937530)；酸-醇脫氫酶(產(chǎn)氣莢 膜梭菌 ATCC 13124) gi 1110673221 |gb IABG82208. 1 (110673221)；醛-醇脫氫酶(A 型肉毒 梭狀芽孢桿菌 Hall 株)gi 1152933444 |gb| ABS38943. 1 (152933444)；醛-醇脫氫酶(東 方型鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis biovar Orientalis str.)F1991016) gi 1165920 640|gb|EDR37888. 1 (165920640)；醛-醇脫氫酶(東方型鼠疫耶爾森氏菌IP275)gi|l65 913933 |gb IEDR32551. 11 (165913933)；醛-醇脫氫酶(安哥拉鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis Angola) )gi 1162419116 | ref | YP_001606617. 11 (162419116)；酸-醇脫氫酶(肉毒 梭狀芽孢桿菌 F 型 Langeland 株(Clostridium botulinum F str. Langeland)) gi 115394 0830|ref |YP_001389712. 1 (153940830)；酸-醇脫氫酶(大腸桿菌 HS 株)gi 1157160746 ref |YP_001458064. 1 (157160746)；酸-醇脫氫酶(大腸桿菌 EM377A) gi | I57I55679 | r ef IYP_001462491. 11 (157155679)；醛-醇脫氫酶(小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌小腸結(jié)腸炎亞 種(Yersinia enterocolitica subsp. Enterocolitica)8081)gi1123442494|ref|YP_001 006472. 11 (123442494)；醛-醇脫氫酶(聚球藍細菌屬(Synechococcus sp.) JA_3_3Ab) gi|8660519l|ref |YP_473954. 1 (86605191)；醛-醇脫氫酶(單核細胞增生性李斯特菌 (Listeria monocytogenes str.)4b F2365)gi|46907864|ref|YP_014253. 11(46907864)； 酸-醇脫氫酶(糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) V583)gi I 29375484 I ref I NP_814638. 1 (29375484)；酸-醇脫氫酶(無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae) 2603V/R) gi | 2253 6238 I ref I NP_687089. 1 (22536238)；醛-醇脫氫酶(A 型肉毒梭狀芽孢桿菌 ATCC 19397) gi 1152928489 |gb IABS33989. 11 (152928489)；酸-醇脫氫酶(大腸桿菌 E24377A) gi 1157 077709 |gb IABV17417. 11 (157077709)；酸-醇脫氫酶(大腸桿菌 HS 株)gi 1157066426 |g b|ABV05681. 1 (157066426)；醛-醇脫氫酶(肉毒梭狀芽孢桿菌F型Langeland株)gi 152936726 |gb IABS42224. 1 (152936726)；醛-醇脫氫酶(鼠疫耶爾森氏菌 CA88-4125) g i 1149292312 |gb IEDM42386. 11 (149292312)；醛-醇脫氫酶(小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌小腸 結(jié)腸炎亞種 8081) gi 1122089455 |emb I CAL12303. 1 (122089455)；醛-醇脫氫酶(萊菌衣 藻(Chlamydomonas reinhardtii)) gi | 92084840 | emb | CAF04128. 11 (92084840)；酸-醇脫 氫酶(聚球藍細菌屬 JA-3-3Ab)gi I 86553733 |gb IABC98691. 1 (86553733)；醛-醇脫氫 酶(奧奈達希瓦氏菌 MR-l)gi I 24348056 |gb| AAN55183. 11 AE015655_9 (24348056)；醛-醇 脫氫酶(糞腸球菌 V583)gi I 29342944 |gb| AA080708. 1 (29342944)；醛-醇脫氫酶(單核 細胞增生性李斯特菌 4b F2365)gi I 46881133 |gb IAAT04430. 1 (46881133)；醛-醇脫氫酶 (單核細胞增生性李斯特菌 l/2a F6854) gi | 47097587 | ref | ZP_00235115. 1 (47097587)； 醛-醇脫氫酶(單核細胞增生性李斯特菌4b H7858) gi I 47094265 | ref | ΖΡ_00231973· 11 (4 7094265)；醛-醇脫氫酶(單核細胞增生性李斯特菌4b H7858) gi | 47017355 | gb | EAL08180 11 (47017355)；醛-醇脫氫酶(單核細胞增生性李斯特菌l/2a F6854) gi | 47014034 | gb EAL05039. 1 (47014034)；酸-醇脫氫酶(無乳鏈球菌 2603V/R) gi | 22533058 | gb | AAM9896 1. 11 AE014194_6 (22533058)ρ ；醛-醇脫氫酶(古典型鼠疫耶爾森氏菌E1979001) gi 11660 09278|ref |ZP_02230176. 1 (166009278)；醛-醇脫氫酶(東方型鼠疫耶爾森氏菌IP275) gi 1165938272 | ref | ZP_02226831. 1 (165938272)；醛-醇脫氫酶(東方型鼠疫耶爾森氏菌 F1991016)gi 1165927374 | ref | ZP_02223206. 11 (165927374)；酸-醇脫氫酶(安哥拉鼠疫 耶爾森氏菌)gi 1162351931 |gb| ABX85879. 11 (162351931)；醛-醇脫氫酶(假結(jié)核耶爾森
18氏菌 IP 31758) gi 1153949366 |ref I YP_001400938. 1 (153949366)；酸-醇脫氫酶(假結(jié)核 耶爾森氏菌 IP 31758) gi 1152960861 |gb IABS48322. 11 (152960861)；醛-醇脫氫酶(鼠疫 耶爾森氏菌 CA88_4125) gi 1149365899 | ref | ZP_01887934. 11 (149365899)；乙酸脫氫酶(乙 ?；?(大腸桿菌 CFT073) gi I 26247570 | ref | NP_753610. 11 (26247570)；醛-醇脫氫酶(包 括醇脫氫酶；乙醛脫氫酶(乙酰化)(EC 1. 2. 1. 10) (acdh)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶 (pfl 失活酶))(A 型肉毒梭狀芽孢桿菌 ATCC 3502) gi 1148287832 |emb I CAL81898. 1 (1482 87832)；醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶(ADH)；乙醛脫氫酶(乙?；?(ACDH)；丙酮酸-甲 酸-裂解酶失活酶(PFL 失活酶))gi I 71152980 |sp |P0A9Q7. 2 |ADHE_EC0LI (71152980)； 醛_醇脫氫酶(包括醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，以及丙酮酸_甲酸-裂解酶失活酶(胡蘿 卜軟腐歐文氏黑腐亞種(Erwinia carotovora subsp. Atros印tica) SCRI1043) gi | 501212 54|ref|YP_050421. 1| (50121254)；醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，以及丙 酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(胡蘿卜軟腐歐文氏黑腐亞種SCRI1043)gi I 49611780 Iemb CAG75229. 11 (49611780)；醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶(ADH)；乙醛脫氫酶(乙?；? (ACDH)) gi 119858620 | sp | P33744. 3 | ADHE_CL0AB (19858620)；酸-醇脫氫酶(包括醇脫 氫酶(ADH)；乙醛脫氫酶(乙酰化)(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶)) gi I 71152683 | sp |P0A9Q8. 2 | ADHE_EC057 (71152683)；醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶；乙醛 脫氫酶(乙?；?；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(艱難梭菌630) gi 1126697906 I ref I YP_ 001086803. 11 (126697906)；醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶；乙醛脫氫酶(乙?；?；丙酮 酸-甲酸-裂解酶失活酶(艱難梭菌 630) gi 1115249343 |emb I CAJ67156. 1 (115249343)； 醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(乙?；?(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂 解酶失活酶(PFL失活酶))(發(fā)光光桿狀菌Laumondii亞種(Photorhabdusluminescens subsp. Laumondii) TT01) gi | 37526388 | ref | NP_929732. 11 (37526388)；醛-醇脫氫酶 2 (包 括醇脫氫酶；乙醛脫氫酶)(釀膿鏈球菌Manfredo株(Sti^ptococcus pyogenes str. Manfredo)) gi 1134271169 | emb | CAM29381. 1 (134271169)；酸-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶 (ADH)和乙醛脫氫酶(乙?；?(ACDH)；丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶(PFL失活酶))(發(fā)光 光桿狀菌 Laumondii 亞種 TT01) gi | 36785819 | emb | CAE14870. 11 (36785819)；醛-醇脫氫酶 (包括醇脫氫酶和丙酮酸_甲酸-裂解酶失活酶(艱難梭菌630) gi 1126700586 | ref | ΥΡ_0 01089483. 11 (126700586)；醛-醇脫氫酶(包括醇脫氫酶和丙酮酸-甲酸-裂解酶失活酶 (艱難梭菌 630) gi 1115252023 I emb I CAJ69859. 11 (115252023)；醛-醇脫氫酶 2 (釀膿鏈球 菌 Manfredo 株)gi I 139472923 I ref I YP_001127638. 1 (139472923)；酸-醇脫氫酶 E (產(chǎn)氣 莢膜梭菌13型)gi 118311513 | ref | ΝΡ_563447· 11 (18311513)；醛-醇脫氫酶E (產(chǎn)氣莢膜梭 菌 13 型)gi 118146197 | dbj | BAB82237. 11 (18146197)；醛-醇脫氫酶，ADHEl (丙酮丁醇梭菌 ATCC 824) gi 115004739 | ref | NP_149199. 1 (15004739)；酸-醇脫氫酶，ADHEl (丙酮丁醇梭 菌 ATCC 824) gi 114994351 |gb| AAK76781. 11 AE001438_34 (14994351)；醛-醇脫氫酶 2(包 括醇脫氫酶(ADH)；乙醛 / 乙酰輔酶 A 脫氫酶(ACDH))gi|2492737|sp|Q24803. 1|ADH2_ ENTHI (2492737)；醇脫氫酶(腸炎沙門氏菌腸炎血清型Typhi株(Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhistr.)CT18)gi116760134|ref|NP_455751. 11(16760134)； 以及醇脫氫酶(腸炎沙門氏菌腸炎血清型Typhi株)gi 116502428 | emb | CAD08384. 11 (1650 2428))，與登錄號相關(guān)的各序列整體地以引用方式合并入本文中。
乙酰乙酰輔酶A硫解酶(有時也稱為乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶)催化從兩分子的 乙酰輔酶A產(chǎn)生乙酰乙酰輔酶A。取決于使用的生物體，異源的乙酰乙酰輔酶A硫解酶(乙 酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶)可被改造用于在所述生物體中表達?？蛇x地，可過度表達天然乙 酰乙酰輔酶A硫解酶(乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶)。乙酰乙酰輔酶A硫解酶在大腸桿菌中 由thl編碼。乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶在丙酮丁醇梭菌中由atoB編碼。THL和AtoB同源 物和變體是已知的。例如，這些同源物和變體包括，例如，乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解 酶)(天藍色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor) A3 (2)) gi | 21224359 | ref | NP_630138. 1 ( 21224359)；乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(天藍色鏈霉菌A3 (2)) gi | 31690411 emb CAA19239. 1 (3169041)；乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(泊庫島食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2)gi 1110834428 | ref | YP_693287. 1 (110834428)；乙酰輔酶 A 乙?；D(zhuǎn)移 酶(硫解酶)(泊庫島食烷菌 SK2) gi I IlOM7539 I emb I CALl7Ol5. 11 (110647539)；乙酰輔酶 A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)NRRL 2338) gi 1133915420 | emb | CAM05533. 11 (133915420)；乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(紅色 糖多孢菌 NRRL 2338) gi 1134098403 I ref I YP_001104064. 1 (134098403)；乙酰輔酶 A 乙酰 基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(紅色糖多孢菌 NRRL 2338) gi 1133911026 I emb I CAMOl 139. 1 (133911 026)；乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(A型肉毒梭狀芽孢桿菌ATCC 3502) gi 1148290 632 I emb | CAL84761. 11 (148290632)；乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(銅綠假單孢菌 (Pseudomonas aeruginosa)UCBPP-PA14)gi1115586808|gb|ABJ12823. 11(115586808)；乙 酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(抗重金屬羅爾斯通氏菌(Ralstonia metallidurans) CH34) gi I 93358270 | gb | ABF12358. 11 (93358270)；乙酰輔酶 A 乙酰基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(抗 重金屬羅爾斯通氏菌CH34)gi I 93357190 |gb| ABF11278. 1 (93357190)；乙酰輔酶A乙酰 基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(抗重金屬羅爾斯通氏菌0134化丨|93356587^13|48 10675.1| (9335 6587)；乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶)(富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha) JMP134) gi I 72121949 |gb IAAZ64135. 1 (72121949)；乙酰輔酶 A 乙?；D(zhuǎn)移酶(硫解酶) (富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 JMP134) gi I 72121729 | gb | AAZ63915. 11 (72121729)；乙酰輔酶 A 乙?；?轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(富養(yǎng)羅爾斯通氏菌 JMP134)gi I 72121320 |gb| AAZ63506. 1 (72121320)； 乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(富養(yǎng)羅爾斯通氏菌JMP134) gi I 721210011 gb | AAZ631 87. 11 (72121001)；乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶(硫解酶)(大腸桿菌)gi | 2764832 | emb | CAA6 6099. 11 (2764832)，與登錄號相關(guān)的各序列整體地以引用方式合并入本文中。輔酶A轉(zhuǎn)移酶催化從乙酰乙酰輔酶A產(chǎn)生乙酰乙酸。取決于使用的生物體，異源的 輔酶A轉(zhuǎn)移酶可被改造用于在所述生物體中表達。可選地，可過度表達天然的輔酶A轉(zhuǎn)移 酶。輔酶A轉(zhuǎn)移酶在丙酮丁醇梭菌中由ctfAB編碼，并且ctfAB同源物和變體是已知的。例 如，此類同源物和變體包括，例如，輔酶A轉(zhuǎn)移酶(丙酮丁醇梭菌adhE、ctfA和CtfB基因) gi I 298080 I emb | X72831. 11 (298080)；丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 巨大質(zhì)粒 pSOLlgi 114994317
gb IAE001438. 3 | (14994317)，與登錄號相關(guān)的各序列整體地以引用方式合并入本文中。乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶催化從乙酰乙酰輔酶A產(chǎn)生乙酰乙酸。取決于使用的生 物體，異源的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶可被改造用于在所述生物體中表達?？蛇x地，可過度 表達天然的乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶。乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中由atoAB編碼。 atoAB同源物和變體是已知的。例如，此類同源物和變體包括(或可見于下列的基因組序
20列中)，例如，NC_010468 大腸桿菌 ATCC8739，gi 11700180611 ref | NC_010468. 1 (17001806 1) ；NC_009654海洋單胞菌屬(Marinomonas sp.) MWYLl gi 1152994043 | ref | NC_009654. 11 ( 152994043) ；NC_009454 ；Pelotomaculum thermopropionicum Si，完整基因組gi 114767633 5 I ref I NC_009454. 1 (147676335)；大腸桿菌APEC 01，完整基因組 gi 1117622295 | ref | NC_0 08563. 11 (117622295)；大腸桿菌 536，完整基因組 gi 1110640213 | ref | NC_008253. 11 (1106 40213)；大腸桿菌 UTI89，完整基因組 gi|91209055|ref |NC_007946. 1 (91209055)；大腸桿 菌 HS，完整基因組 gi 1157159467|ref |NC_009800. 1 (157159467)；拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB 8052，完整基因組 gi 1150014892 | ref | NC_009617. 1 (150014892)； 索氏志賀氏菌(Shigella sonnei) Ss046，完整基因組 gi | 74310614 | ref | NC_007384. 1 (74 310614)克氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri)ATCC BAA-895，完整基因組 gi 1157144296 ref |NC_009792. l| (157144296)；深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)ATCC 11170，完整 基因組 gi I 83591340 | ref | NC_007643. 11 (83591340)；大腸桿菌 CFT073，完整基因組 gi | 262 45917|ref |NC_004431. 1 (26245917)；鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium) LT2，完 整基因組8丨|16763390|儀。^_003197. 1 (16763390)；大腸桿菌ATCC 8739，完整基因組g i 1169752989 | gb | CP000946. 11 (169752989)；大腸桿菌 K-12 株 MG1655 亞株(Escherichia coli 8廿.1(-1281^8廿.]\^1655)，完整基因組81|49175990|儀€|_000913.2| (49175990)； 大腸桿菌 K-12 株 MG1655 亞株，完整基因組 gi | 48994873 | gb | U00096. 2 | (48994873)；海洋 單胞菌 MWYL1，完整基因組 gi 1150834967 |gb| CP000749. 1 (150834967)；拜氏梭菌 NCIMB 8052，完整基因組gi 1149901357 | gb | CP000721. 11 (149901357)；與登錄號相關(guān)的各序列整 體地以引用方式合并入本文中。乙酰乙酸脫羧酶催化乙酰乙酸脫羧形成丙酮和二氧化碳。取決于使用的生物體， 異源的乙酰乙酸脫羧酶可被改造用于在所述生物體中表達?？蛇x地，可過度表達天然的乙 酰乙酸脫羧酶。乙酰乙酸脫羧酶在丙酮丁醇梭菌中由acd編碼，并且ACD同源物和變體是已 知的。acd 的序列見 gi 115004705|ref |NC_001988. 2| (15004705)丙酮丁醇梭菌 ATCC 824 質(zhì)粒PS0L1 ；與登錄號相關(guān)的各序列整體地以引用方式合并入本文中。仲醇脫氫酶在NADH的存在下催化甲基酮還原為其相應的2_醇。取決于使用的生 物體，異源的仲醇脫氫酶可被改造用于在所述生物體中表達?？蛇x地，可過度表達天然的仲 醇脫氫酶?？捎糜诒景l(fā)明的方法和組合物中的仲醇脫氫酶在丙酮丁醇梭菌或大腸桿菌中由 adh(sadh)編碼。SADH同源物和變體是已知的。例如，赤紅球菌(Rhodococcus rubber), sadh基因和sudh基因見登錄號gi I 21615551 |emb IAJ491307. 1 (21615551)；似平滑念珠菌 (Candida metapsilosis)仲醇脫氫酶部分 sadh 基因，96144 株 gi | 47826366 | emb | AJ69811 5. 1 (47826366)；和近平滑念珠菌(Candida parapsilosis) SADH 基因，完整 cdsgi | 281540 8|dbj|AB010636. 1| (2815408)；與登錄號相關(guān)的各序列整體地以引用方式合并入本文中。適合于本文中提供的重組微生物的生長和維持的培養(yǎng)條件描述在下面的實施例 中。普通技術(shù)人員將認識到，這些條件可被修改以適應各種微生物的要求。在生產(chǎn)異丙醇 產(chǎn)物中有用的合適的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)基PH、離子強度、營養(yǎng)含量等條件；溫度；氧/CO2/ 氮含量；濕度；以及允許由宿主微生物——即通過微生物的代謝作用——產(chǎn)生化合物的其 他培養(yǎng)條件。對于可用作宿主細胞的微生物，合適的培養(yǎng)條件是公知的。在一個實施方案中，本發(fā)明的微生物可以表征為包括rrnBT14DlacZWJ16hsdR514DaraBADAH33 DrhaBADLD78 (從 XL-1 blue 轉(zhuǎn)導 F ‘以提供 laclq)、(atoB-ctfAB-adc)、 pTA30 (atoB-atoAD-adc)、pTA39 (thl-atoAD-adc)禾口 pTA41 (thl-ctfAB-adc)的大腸桿菌。
實施例已經(jīng)對梭菌屬的幾個種進行了異丙醇產(chǎn)量的評價，包括52個拜氏梭菌菌株。這些 菌株的異丙醇最大產(chǎn)量為30mM。關(guān)于這些菌株的代謝調(diào)節(jié)的有限知識和基因操作的難度阻 礙了異丙醇產(chǎn)量的進一步提高。另一方面，大腸桿菌是對于代謝性改造研究最多和容易操 作的細菌之一。該細菌已經(jīng)顯示產(chǎn)生很高滴度的乙醇和許多其他的生物化學物質(zhì)。Bermejo 等人，(Appl. Environ. Microbiol. 64 1079-1085,1998)通過在來自丙酮 丁醇梭菌的thl啟動子的控制下引入來自丙酮丁醇梭菌ATCC824的四種基因(分別編碼乙 酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶和乙酰乙酸脫羧酶的thl、ctfAB和adc)， 已經(jīng)在大腸桿菌中產(chǎn)生了丙酮。此工程改造的大腸桿菌菌株產(chǎn)生的丙酮水平幾乎與丙酮丁 醇梭菌ATCC 824相同。然而，還沒有報道在大腸桿菌中產(chǎn)生異丙醇。本發(fā)明提供了一種改 造的合成途徑用于在包括大腸桿菌的微生物中產(chǎn)生異丙醇。生物合成異丙醇的策略利用以拜氏梭菌構(gòu)建的途徑模型，該途徑從乙酰輔酶 A(乙酰CoA)經(jīng)丙酮產(chǎn)生異丙醇(圖1)。首先，乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶將兩分子的乙酰 輔酶A縮合為一分子的乙酰乙酰輔酶A。下一步，乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶將輔酶A從乙酰 乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移至乙酸或至丁酸，形成乙酰乙酸，然后乙酰乙酸被乙酰乙酸脫羧酶轉(zhuǎn)變?yōu)?丙酮和CO2。伯-仲醇脫氫酶(之后稱為仲醇脫氫酶，SADH)在依賴NADPH的反應中將丙酮 轉(zhuǎn)變?yōu)楫惐?。為了?yōu)化途徑，在進行產(chǎn)生丙酮的初始步驟中，檢驗了天然大腸桿菌乙酰輔 酶A乙?；D(zhuǎn)移酶(由atoB編碼)和乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶(由atoAD編碼)。此外，在 進行產(chǎn)生異丙醇的最終步驟中比較了來自拜氏梭菌NRRL B593和布氏熱厭氧桿菌HTD4的 SADH(由adh編碼)的活性。這兩種SADH以前已經(jīng)在大腸桿菌中表達并被表征。表1顯示了在本研究中使用的菌株和質(zhì)粒。通過Pl轉(zhuǎn)導從大腸桿菌DH5 α Zl 引入IacItl的大腸桿菌B株(ATCC 11303)用作宿主菌株，并命名為ΤΑ11。丙酮途徑基因 thl、ctfAB、atoB、atoAD和adc的多種組合被克隆進受PLlacO1啟動子控制的ColEl來源 的質(zhì)粒(pSA40)。得到的質(zhì)粒命名為 pTA29 (atoB-ctfAB-adc)、pTA30 (atoB-atoAD-adc)、 pTA39 (thl-atoAD-adc)和pTA41 (thl-ctfAB-adc)(詳情見表1)。來自拜氏梭菌或布氏熱 厭氧桿菌的adh基因分別被克隆進受PjacO1控制的pl5A傳遞載體(pZA31-luc)以產(chǎn)生質(zhì) 粒PTA36和pTA18。丙酮途徑基因和異丙醇生成基因的各種組合被引入至TAll中進行評 價。對于異丙醇生成途徑的除atoB和thl基因之外的所有基因使用相同的核糖體結(jié) 合位點(RBS) (GAAGGAGATATACAT (SEQ ID NO 11), atoB 和 thl 基因使用表達構(gòu)建體的 RBS 被克隆至PJacO1啟動子的下游。使用的RBS的來源為pET-31b(+)質(zhì)粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)。除兩個adh基因以外的所有基因均從染色體DNA被PCR擴增，并驗證序 列。在為大腸桿菌進行密碼子優(yōu)化后由EpochBiolabsOtouston，TX)合成兩個adh基 因。下面的條件用于優(yōu)化。15%臨界值用于密碼子效率除了具有強的二級結(jié)構(gòu)的位 置(在此情況下使用較低頻率的密碼子來減輕此問題)以外，去除低于15%的任何密碼 子。使用內(nèi)建M-fold模塊(build-in M-fold module)來檢查二級結(jié)構(gòu)。避免莖環(huán)和假
22SD (Shine-Dalgarno)序列。通過此優(yōu)化改變堿基對的數(shù)目，對于拜氏梭菌為約290，而對于 布氏熱厭氧桿菌為240。限制性酶、磷酸酶(New England Biolabs, Ipswich，ΜΑ)、連接酶 (快速 DNA 連接試劑盒(rapid DNA ligation kit) ；Roche,Manheim, Germany)和 DNA 聚合 酶(KOD DNA 聚合酶，EMD Chemicals, San Diego, CA)用于克隆。由 Invitrogen (Carlsbad, CA)合成寡核苷酸。pTA29 (PLlacO1 :atoB-ctfAB_adc)-為 了 用 PJacOi 置換 pZE21_MCSl 的 P^etO1, pZE12-luc用AatII和Acc65I消化。純化較短的片段，并克隆進用相同的酶切 割的質(zhì)粒pZE21-MCSl中，建立pSA40。為了克隆atoB、ctfAB和adc，使用pSA40中的 Acc65I-SalI (atoB)、SalI-XmaI (ctfAB)和 XmaI-BamHI (adc)識別位點。AatII 和 AvrII 識別位點用來用氨芐青霉素抗性基因來置換卡那霉素抗性基因。為了克隆atoB，大腸桿菌 K-12MG1655 的基因組 DNA 用作模板，使用一對引物 TA15F(5，CGCGGTACCATGAAAAATTGTGTC ATCGTCAGTG 3，(SEQ ID NO: 12))和 TA 16R (5 ‘ CCGCGTCGACTTAATTCAACCGTTCAATCACCATC 3，(SEQ ID N0:13))，并且PCR產(chǎn)物用Acc65I和SalI消化。為了克隆ctfAB，丙酮丁醇梭 菌 ATCC824 (ATCC)的基因組 DNA 用作模板，使用一對引物 TA19F (5，CCGCGTCGACGAAGGAGATA TACATATGAACTCTAAAATAATTAGATTTG 3，(SEQ ID N0:14))和 TA4R(5，CGCCCCGGGCTAAACAGCC ATGGGTCTAAGTTCA 3，(SEQ ID NO :15))，且 PCR 產(chǎn)物用 SalI 和 XmaI 消化。為了克隆 adc, 丙酮丁醇梭菌ATCC824的基因組DNA用作模板，使用一對引物TA20F (5，CGCCCCGGGGAAGGAG ATATACATATGTTAAAGGATGAAGTAATTAAAC3，(SEQ ID N0:16))和 TA6R(5，CGCGGATCCTTACTTAA GATAATCATATATAACT 3，(SEQ ID NO 17))，且 PCR 產(chǎn)物用 XmaI 禾口 BamHI 消化。PTASO(PLlacC)1: :atoB-atoAD_adc) -為 了克隆 atoAD，大腸桿菌 K-12MG1655 的基 因組 DNA 用作模板，使用一對引物 TA21F(5，CCGCGTCGACGAAGGAGATATACATATGAAAACAAAATT GATGACATTAC 3，(SEQ ID NO: 18))和 TA 18R(5，CGCCCCGGGTCATAAATCACCCCGTTGCGTATTC 3，(SEQ ID N0:19))。PCR產(chǎn)物用Sail和XmaI消化，并克隆進用相同酶切割的質(zhì)粒pTA29 中。pTA39 (PlIbcO1 thl-atoAD-adc)-為 了克隆 thl，丙酮丁醇梭菌 ATCC824 的基因組 DNA用作模板，使用一對引物TA13F(5，CGCGGTACCATGAAAGAAGTTGTA ATAGCTAGTG 3，(SEQ ID NO :20))和 TA14R(5，CCGCGTCGACCTAG CACTTTTCTAGCAATATTGC 3，(SEQ IDNO :21))。PCR 產(chǎn)物用Acc65I和Sail消化，并克隆進用相同酶切割的質(zhì)粒pTA30中。pTA41 (PlIbcO1 thl-ctfAB-adc)-為 了克隆 thl，丙酮丁醇梭菌 ATCC824 的基因組 DNA用作模板，使用一對引物TA13F和TA14R。PCR產(chǎn)物用Acc65I和SalI消化，并克隆進用 相同酶切割的質(zhì)粒PTA29中。pTA18 (PlIbcO1 adh (布氏熱厭氧桿菌))_為了克隆adh (布氏熱厭氧桿菌)，布氏 熱厭氧桿菌HTD4的合成DNA (Epoch Biolabs)用作模板，使用一對引物TA7F(5，CGCGGTACC ATGAAAGGTTTTGCAATGCTGTCCA 3，(SEQ IDNO :22))和 TA8R(5，CGCTCTAGACTATGCTAAAATCAC CACTGGTTTAATT3，(SEQ ID NO :23))。PCR產(chǎn)物用Acc65I和XbaI消化并克隆進用相同酶切 割的質(zhì)粒pZE12-luc中，建立pTA8。為了用pl5A和卡那霉素抗性基因置換復制起點和氨芐 青霉素抗性基因，pZA31-luc用AatII和AvrII消化。純化較短的片段并克隆進用相同酶 切割的PTA8中以建立pTA18。為在大腸桿菌中表達，優(yōu)化合成DNA的密碼子使用，并且通過 用二級結(jié)構(gòu)預測程序檢查來避免莖環(huán)結(jié)構(gòu)。該序列顯示在補充資料中。
PTA36 (PlIbcO1 ::adh(拜氏梭菌))-為了克隆adh(拜氏梭菌)，帶有拜氏梭菌NRRL B593的合成DNA的質(zhì)粒(Epoch Biolabs)用Acc65I和SalI消化并克隆進用相同酶切割的 質(zhì)粒pZE12-luc中，建立pTA34。為了用pl5A和卡那霉素抗性基因置換復制起點和氨芐青 霉素抗性基因，pZA31-luc用AatII和AvrII消化。純化較短的片段并克隆進用相同酶切 割的質(zhì)粒中以建立PTA36。以與來自布氏熱厭氧桿菌的adh基因相同的方式優(yōu)化合成DNA 的密碼子使用(見，例如，圖4)。作為預培養(yǎng)培養(yǎng)基，制備含2%葡萄糖的SD-7(NH4Cl，7.0g/l ；KH2PO4,1. 5g/l ； Na2HPO4,1. 5g/l ；K2SO4,0. 35g/l ；MgSO4 ‘ 7H20，0. 17g/l，痕量元素，0. 8ml/l ；酵母提取物； 5g/l)，如(13)所述。含有 2 % 葡萄糖的 SD-8 (NH4Cl, 7. Og/Ι ；KH2PO4, 7. 5g/l ；Na2HPO4, 7. 5g/l ;K2S04,0 . 85，MgSO4 · 7Η20，0· 17g/l，痕量元素，0. 8ml/l ；酵母提取物；10g/l) (13) 培養(yǎng)基用于發(fā)酵。痕量元素溶液含有下列物質(zhì)(以每升5M HCl的克數(shù)計)=FeSO4 · 7H20， 40. 0 ；MnSO4 · H20,10. 0 ；Al2 (SO4) 3，28. 3 ；CoCl2 · 6H20,4. 0 ；ZnSO4 · 7H20, 2. 0 ；Na2MoO4 · 2H20 ； CuCl2 · 2H20,1. 0 ；和H3BO4,0. 5。在合適時加入抗生素；氨芐青霉素100 μ g/ml和氯霉素 40 μ g/mlο在試管中含有5ml SD-7培養(yǎng)基的預培養(yǎng)在旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm)上在37°C過夜 (17h)進行。250μ 1的過夜培養(yǎng)物接種在250ml帶擋板培養(yǎng)瓶中的25ml SD-8培養(yǎng)基中。 當OD6qq為 1.0 (3h)時，加入0. ImM IPTG用于誘導。細胞在37°C下在旋轉(zhuǎn)振蕩器(250rpm) 上生長 30. 5h 并在 0、3、6· 5,9. 5、12、24、28· 5 和 30. 5h 時收獲。使用葡萄糖分析試劑(Sigma Aldrich)測量葡萄糖。使用火焰離子化檢測器通過 氣相色譜定量各種醇。該系統(tǒng)由5890A型氣相色譜儀(Hewlett Packard, Avondale, PA) 和7673A型自動進樣器、采樣器和控制器(Hewlett Packard)組成。通過DB-WAX毛細管柱 (30m, 0. 32mm-i. d.，0. 50 μ m_ 膜厚度；AgilentTechnologies)進行醇化合物的分離。GC 烘 箱溫度初始地在40°C保持5min，并以15°C /min的梯度升高至120°C，然后以50°C /min的 梯度升高至230°C，并保持4min。氦氣用作載氣，入口壓力為9. 3psi。進樣器和檢測器維持 在225°C。0.5μ1培養(yǎng)肉湯上清液以分流注樣模式(1 15分流比)注入。1_丙醇用作內(nèi) 標。對于其他分泌的代謝物，過濾的上清液加至(20μ1)裝有自動采樣器 (AgilentTechnologies)禾口 BioRad(Biorad Laboratories,Hercules,CA)Aminex HPX87 柱 (5mM H2S04，0. 6ml/min，柱溫度為65°C )的Agilent 1100HPLC中。使用光二極管陣列檢測 器在210nm檢測有機酸(延胡索酸、乳酸、檸檬酸、丙酮酸、甲酸、蘋果酸、乙酸和琥珀酸)。在誘導后4h收獲的細胞在離心后用于酶測定。在缺氧條件下用0. Imm玻璃珠和 Mini Bead Beater 8(Biospec Product, OK)制備 50mM Tris 氯化物(pH8)中的粗制提取 物。通過用NADPH在25°C下在氬氣中還原丙酮(6. 7mM)來測定SADH活性。測定混合物含 有50mM Tris-Cl緩沖液(pH 7. 5)、ImM 二硫蘇糖醇和0. 2mM NADPH0 1單位活性為每分鐘 氧化 lymol NADPH0使用5種不同的基因組合用于產(chǎn)生異丙醇(圖2)。所有合成途徑從lllmM(20g/ 1)的初始葡萄糖濃度在缺氧條件下產(chǎn)生異丙醇。對于所有組合，在接種后12小時內(nèi)葡萄糖 被耗盡(用IPTG誘導后9小時)。如在圖2中顯示，帶有pTA39/pTA36的TAll產(chǎn)生最高量 的異丙醇。與異丙醇的產(chǎn)量相比，所有菌株產(chǎn)生的乙醇量均非常低(小于IOmM)。
24
圖3顯示使用TAll (pTA39/pTA36)發(fā)酵的時程。在葡萄糖耗盡(12h)后異丙醇濃 度下降。在24h時向培養(yǎng)物中加入葡萄糖(IllmM)將異丙醇的生產(chǎn)恢復至與第一生產(chǎn)階段 相同的速率，表明即使在14小時饑餓后途徑活性仍然是穩(wěn)定的。當葡萄糖被耗盡(30. 5h) 時，異丙醇的終濃度達到81. 6mM。在初始葡萄糖耗盡后丙酮濃度繼續(xù)增加，并隨著葡萄糖的 加入，丙酮濃度突然下降(圖3)。在由IPTG誘導后除了延胡索酸(最大濃度，386 μ M)以 外沒有有機酸的顯著積累。在葡萄糖饑餓期間異丙醇濃度降低而丙酮濃度升高。比較具有ρΤΑ36或ρΤΑ18的菌株的異丙醇產(chǎn)量。來自拜氏梭菌的SADH的氨基酸 序列與來自布氏熱厭氧桿菌的SADH的氨基酸序列具有76%的同一性和86%的相似性。然 而，ΤΑ11(ρΤΑ39/ρΤΑ18)比含有來自拜氏梭菌的adh的菌株(pTA39/pTA36)產(chǎn)生濃度較低 的異丙醇和濃度高得多的丙酮。為了進一步研究，測定了來自含有這兩種醇脫氫酶的培養(yǎng) 物(pTA18或pTA36)的粗制提取物中的酶活性。來自拜氏桿菌(pTA39/pTA36)的醇脫氫 酶活性(3. 08士0.36單位/mg蛋白質(zhì))的確大大地高于布氏熱厭氧桿菌(pTA39/pTA18) (0. 24士0. 08單位/mg蛋白質(zhì))，與較高的異丙醇產(chǎn)量相一致。當在菌株中缺少含adh的質(zhì)粒時，宿主由僅含有PTA39的TAll產(chǎn)生丙酮。在24h 時加入葡萄糖至lllmM，菌株以幾乎相同的生產(chǎn)速率繼續(xù)產(chǎn)生丙酮。細胞生長和乙醇濃度 顯示與在異丙醇生產(chǎn)試驗期間所觀察到的相似的趨勢。當葡萄糖耗盡(30. 5h)時，丙酮的 終濃度測定為148. 3mM。當在異丙醇生產(chǎn)中時，在IPTG誘導后除了延胡索酸(最大濃度 292 μ M)以外沒有有機酸的顯著積累。本發(fā)明證明了在大腸桿菌中生產(chǎn)異丙醇。在搖瓶培養(yǎng)中，含有ΡΤΑ39/ΡΤΑ36的 TAll株在30. 5h時產(chǎn)生81. 6mM異丙醇，在3 9. 5h之間的最大生產(chǎn)率為6. 9mM/h (0. 41g/ 1/h)。工程大腸桿菌超過了報道最好的拜氏梭菌NRRL B593菌株，后者產(chǎn)生的異丙醇為 30mM,最大生產(chǎn)率為 3mM/h ( 0. 18g/l/h) (4)。在接種后9. 5h時的異丙醇收率為43. 5% (mol異丙醇/mol葡萄糖)。該收率是由在3 9. 5h之間產(chǎn)生的異丙醇(44. 8mM)和消耗 的葡萄糖(103. OmM)來計算的摩爾收率=44. 8/103. 0 = 0. 435。該收率是非常令人鼓舞 的，因為使用該生產(chǎn)途徑從葡萄糖的最大理論收率為1 (mol異丙醇/mol葡萄糖)。異丙醇 生產(chǎn)的理論收率是基于圖1中顯示的途徑來計算的。1摩爾葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)?摩爾乙酰輔酶 A和2摩爾C02。然后2摩爾乙酰輔酶A縮合形成1摩爾異丙醇，損失了額外的1摩爾C02。結(jié)果顯示與含有拜氏梭菌CtfAB的菌株相比，含有atoAD的大腸桿菌產(chǎn)生較高濃 度的異丙醇。對于CtfAB，乙酸的Km(1200mM)比AtoAD(53. ImM)高得多。此乙酸親和力的 差異可能解釋了為何AtoAD是用于生產(chǎn)異丙醇的較好的酶。異丙醇生產(chǎn)顯示來自拜氏梭菌 的SADH的丙酮至異丙醇的轉(zhuǎn)換率大大高于布氏熱厭氧桿菌。的確，使用粗制提取物的醇脫 氫酶測定顯示來自拜氏梭菌的SADH從丙酮形成異丙醇的活性高于布氏熱厭氧桿菌。盡管 沒有排除表達水平的差異，但來自拜氏梭菌的SADH是在這些條件下生產(chǎn)異丙醇的較好選 擇。密碼子優(yōu)化可改變表達。普遍知道基因的GC含量影響表達效率。拜氏梭菌和布氏熱 厭氧桿菌中的GC含量分別為38%和44%。這些值不同于大腸桿菌K-12MG1655的平均GC 含量。Bermejo等人，見前，證明使用搖瓶的分批和葡萄糖流加培養(yǎng)用于在大腸桿菌中生 產(chǎn)丙酮，利用了來自丙酮丁醇梭菌(thl、ctfAB、adc)的重組丙酮途徑。該菌株在分批培養(yǎng) 中在接種后24h時產(chǎn)生約40mM丙酮，在葡萄糖流加培養(yǎng)中產(chǎn)生93mM丙酮。使用相同的培養(yǎng)基，相同的葡萄糖濃度和大腸桿菌B株的變型。然而，使用相同的基因構(gòu)建物(PTA41)的 分批產(chǎn)量為在12h時達到60. 3mM丙酮。在搖瓶中，含有pTA39的TAll株在約30h時達到 148. 3mM的最大濃度，和12. lmM/h(0. 70g/l/h) (3-9. 5h)的最大生產(chǎn)率。丙酮滴度也超過野 生型丙酮丁醇梭菌所產(chǎn)生的水平(90mM)。不進一步優(yōu)選菌株和發(fā)酵條件，在接種后12h時 的丙酮收率已經(jīng)為理論最大值的73. 5% (mol/mol)。此高收率表明在異丙醇的工業(yè)生產(chǎn)中 使用代謝工程大腸桿菌的極大潛力。 已經(jīng)描述了本發(fā)明的許多實施方案。然而，要理解的是，在不背離本發(fā)明的精神和 范圍的前提下可作出多種改動。因此，其他實施方案包含在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
2權(quán)利要求
一種重組微生物，包括從適當?shù)奶嫉孜锏陌l(fā)酵生產(chǎn)異丙醇的生物化學途徑，所述生物化學途徑包括乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶，其中所述微生物包括至少一種與相應的親代微生物相比異源的多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，包括與親代微生物相比具有乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn) 移酶活性的多肽表達升高，其中所述重組微生物從包括乙酰輔酶A的底物產(chǎn)生包括乙酰乙 酰輔酶A的代謝物。
3.如權(quán)利要求2所述的重組微生物，其中所述具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多 肽由與SEQ ID NO :30、66、68或66和68中所示的序列具有至少約50%同一性的多核苷酸編碼。
4.如權(quán)利要求2所述的重組微生物，其中所述具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多 肽由atoB基因或其同源物，或fadA基因或其同源物編碼。
5.如權(quán)利要求4所述的重組微生物，其中所述atoB基因或fadA基因來自埃希桿菌屬。
6.如權(quán)利要求5所述的重組微生物，其中所述埃希桿菌是大腸桿菌。
7.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述微生物是重組大腸桿菌。
8.如權(quán)利要求7所述的重組微生物，其中所述具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶活性的多 肽由與SEQ ID NO 32中所示的序列具有至少約50%同一性的多核苷酸編碼。
9.如權(quán)利要求7所述的重組微生物，其中所述具有乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多 肽由thl基因或其同源物編碼。
10.如權(quán)利要求9所述的重組微生物，其中所述thl基因來自梭菌屬。
11.如權(quán)利要求10所述的重組微生物，其中所述梭菌是丙酮丁醇梭菌。
12.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，包括與親代微生物相比具有乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移 酶活性的多肽表達升高，其中所述重組微生物從包括乙酰乙酰輔酶A的底物產(chǎn)生包括乙酰 乙酸的代謝物。
13.如權(quán)利要求12所述的重組微生物，其中所述乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶由atoAD基因 或其同源物編碼。
14.如權(quán)利要求13所述的重組微生物，其中所述atoAD基因來自大腸桿菌。
15.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，包括與親代微生物相比具有乙酰乙酸脫羧酶活 性的多肽表達升高，其中所述重組微生物從包括乙酰乙酸的底物產(chǎn)生包括丙酮的代謝物。
16.如權(quán)利要求15所述的重組微生物，其中所述乙酰乙酸脫羧酶由adc基因或其同源 物編碼。
17.如權(quán)利要求16所述的重組微生物，其中所述adc基因來自丙酮丁醇梭菌、溶纖維丁 酸弧菌、熱解糖高溫厭氧桿菌和艱難梭菌。
18.如權(quán)利要求17所述的重組微生物，其中所述微生物是丙酮丁醇梭菌。
19.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，包括與親代微生物相比具有仲醇脫氫酶活性的 多肽表達升高，其中所述重組微生物從包括丙酮的底物產(chǎn)生包括異丙醇的代謝物。
20.如權(quán)利要求19所述的重組微生物，其中所述具有仲醇脫氫酶活性的多肽由與SEQ ID NO :7或9任一個中所示的序列具有至少約50%同一性的多核苷酸編碼。
21.如權(quán)利要求19所述的重組微生物，其中所述具有仲醇脫氫酶活性的多肽由adh或 sadh基因或其同源物編碼。2
22.如權(quán)利要求21所述的重組微生物，其中所述ccr基因來自布氏熱厭氧桿菌或拜氏 梭菌。
23.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述適當?shù)奶嫉孜锇ㄆ咸烟恰?br> 24.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，其中所述重組微生物包括編碼催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn) 變?yōu)橐掖?、催化丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗帷⒋呋阴］o酶A和磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)檩o酶A和乙酰磷酸、催化 乙酰輔酶A和甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)檩o酶A和丙酮酸、或乙酰輔酶A的乙?；c3-甲基-2-氧代丁酸 (2-氧代異戊酸)的縮合的酶的基因中的一個或多個缺失或敲除。
25.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，進一步包括降低的乙醇脫氫酶活性、乳酸脫氫酶 活性、磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶活性或其任何的組合。
26.如權(quán)利要求25所述的重組微生物，其中所述敲除或破壞包括選自下列的缺失或破 壞adhE、ldhA、其任何組合，其任何同源物或天然存在的變體。
27.如權(quán)利要求1所述的重組微生物，包括乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸脫羧酶和adh(仲醇脫氫酶)的表達或增加的表達。
28.一種重組微生物，包括從適當?shù)奶嫉孜锏陌l(fā)酵產(chǎn)生異丙醇的重組生物化學途徑，其 中所述重組生物化學途徑包括乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙酸 脫羧酶和adh (仲醇脫氫酶)的表達升高。
29.如權(quán)利要求28所述的重組微生物，其中所述適當?shù)奶嫉孜锇ㄆ咸烟恰?br> 30.一種產(chǎn)生重組微生物的方法，所述重組微生物將適當?shù)奶嫉孜镛D(zhuǎn)變?yōu)楫惐迹?方法包括用一種或多種編碼具有乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶、乙酰乙 酸脫羧酶和adh (仲醇脫氫酶)活性的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化微生物。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述適當?shù)奶嫉孜锇ㄆ咸烟恰?br> 32.一種產(chǎn)生異丙醇的方法，所述方法包括在生物體中誘導thl或atoB基因、ctfAB或 atoAD基因或操縱子、adc基因、adh(仲醇脫氫酶)基因、或其任何組合的過度表達，其中所 述生物體當在適當?shù)奶嫉孜锏拇嬖谙屡囵B(yǎng)時產(chǎn)生異丙醇。
33.一種產(chǎn)生異丙醇的方法，所述方法包括(i)誘導生物體中thl或atoB基因的過度表達；(ii)誘導生物體中ctfAB或atoAD基因的過度表達；(iii)誘導生物體中adc基因的過度表達；(iv)誘導生物體中adh基因的過度表達；或(ν)誘導⑴、(ii)、(iii)和(iv)的過度表達。
34.如權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述適當?shù)奶嫉孜锇ㄆ咸烟恰?br> 35.一種重組載體，包括(i)編碼第一多肽的第一多核苷酸，所述第一多肽催化從包括乙酰乙酰輔酶A的底物 向乙酰乙酸的轉(zhuǎn)變；(ii)編碼第二多肽的第二多核苷酸，所述第二多肽催化從包括乙酰乙酸的底物向丙酮 的轉(zhuǎn)變；和(iii)編碼第三多肽的第三多核苷酸，所述第三多肽催化從包括丙酮的底物向異丙醇 的轉(zhuǎn)變。
36.如權(quán)利要求35所述的重組載體，其中所述第一多核苷酸編碼乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶或乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶。
37.如權(quán)利要求35所述的重組載體，其中所述第二多核苷酸編碼乙酰乙酸脫羧酶。
38.如權(quán)利要求35所述的重組載體，其中所述第三多核苷酸編碼仲醇脫氫酶。
39.如權(quán)利要求35所述的重組載體，其中所述載體包括丙酮丁醇梭菌thl(乙酰輔酶A 乙酰基轉(zhuǎn)移酶)、大腸桿菌atoAD (乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶)、丙酮丁醇梭菌adc (乙酰乙酸 脫羧酶)和拜氏梭菌adh (仲醇脫氫酶)基因或多核苷酸。
40.轉(zhuǎn)染進大腸桿菌中的權(quán)利要求35、36、37、38或39所述的重組載體。
41.如權(quán)利要求35所述的重組載體，其中所述載體是質(zhì)粒。
42.如權(quán)利要求35所述的重組載體，其中所述載體是表達載體。
43.一種重組宿主細胞，包括權(quán)利要求42所述的表達載體。
44.如權(quán)利要求43所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞產(chǎn)生異丙醇。
45.一種重組微生物，包括至少一條促進葡萄糖向異丙醇轉(zhuǎn)變的異源核酸序列。
全文摘要
本文提供了一種可用于生產(chǎn)生物燃料的代謝性修飾的微生物。
文檔編號C12P21/06GK101903530SQ200880119064
公開日2010年12月1日 申請日期2008年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者渥美正太, 花井泰三, 詹姆士·C·里奧 申請人:加利福尼亞大學董事會