專利名稱：：由糖蜜生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及自糖蜜生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)的方法。
背景技術(shù)：
：自糖蜜大規(guī)模商業(yè)性生產(chǎn)燃料乙醇是本領(lǐng)域已知的。糖蜜是甘蔗或甜菜精煉的副產(chǎn)物。糖蜜是含有約50%蔗糖的深褐色甜漿。在蒸發(fā)自甘蔗或甜菜提取的汁液時(shí)，除水促進(jìn)糖以結(jié)晶形態(tài)分離。當(dāng)此糖結(jié)晶過(guò)程達(dá)到其極限并取出糖晶體時(shí)，剩余的深褐色稠漿稱作糖蜜。W096/13600披露了一種為了改進(jìn)發(fā)酵過(guò)程(如乙醇的發(fā)酵性生產(chǎn))中的原料利用，自液化和/或糖化淀粉、甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜中存在的不可發(fā)酵的糖類生產(chǎn)可發(fā)酵單糖的方法。US4，769，324涉及在能夠在含有糖蜜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和產(chǎn)生淀粉酶的酵母的存在下通過(guò)糖蜜發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)乙醇。BR-PI-990252-8-A披露了一種生產(chǎn)乙醇的工藝，其中通過(guò)蛋白酶或如葡聚糖酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、木聚糖酶、和酸性或堿性昆布多糖酶(laminarinase)等酶的酶法作用來(lái)使發(fā)酵酵母抗絮凝。需要進(jìn)一步改進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)制造工藝。發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用發(fā)酵生物自糖蜜生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中將糖蜜i)用a_淀粉酶和葡糖淀粉酶的組合處理，并ii)使用一種或多種發(fā)酵生物以107_101(1個(gè)細(xì)胞/mL發(fā)酵培養(yǎng)基的細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)酵。依照本發(fā)明，原料(feedstock)是糖蜜，即例如甘蔗或甜菜精煉的副產(chǎn)物。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示了糖蜜發(fā)酵期間的發(fā)酵期間的。Bx發(fā)展。圖2為同時(shí)糖化和發(fā)酵期間添加的含有酶混合物顯示了糖蜜發(fā)酵期間的PH發(fā)展。圖3為同時(shí)糖化和發(fā)酵期間添加的含有合物顯示了。Bx線性趨勢(shì)線。圖4為同時(shí)糖化和發(fā)酵期間添加的含有顯示了pH發(fā)展。圖5為同時(shí)糖化和發(fā)酵期間添加的含有顯示了糖蜜發(fā)酵期間的。Bx發(fā)展。圖6為同時(shí)糖化和發(fā)酵期間添加的含有顯示了。Bx線性趨勢(shì)線。圖7顯示了酶法預(yù)處理糖蜜30小時(shí)接著發(fā)酵6小時(shí)后的乙醇產(chǎn)量。圖8顯示了酶法預(yù)處理糖蜜30小時(shí)接著發(fā)酵10小時(shí)后的乙醇產(chǎn)量。圖9顯示了酶法預(yù)處理接著發(fā)酵6小時(shí)后的總還原糖(TRS)衰減作為生產(chǎn)率增a-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的兩種a-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶的酶混a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的兩種酶混合物a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的兩種酶混合物a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的兩種酶混合物frff.o圖10顯示了酶法預(yù)處理接著發(fā)酵10小時(shí)后的總還原糖(TRS)衰減作為生產(chǎn)率增frff.o圖11顯示了用酶混合物進(jìn)行的同時(shí)糖化和發(fā)酵期間的粘度。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了使用發(fā)酵生物自糖蜜生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物(尤其是乙醇)的方法。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖蜜經(jīng)受a-淀粉酶和葡糖淀粉酶的組合處理時(shí)，生產(chǎn)率得到提高。這是有利的，因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間能得以縮短。不受任何理論限制，認(rèn)為a-淀粉酶和葡糖淀粉酶處理導(dǎo)致發(fā)酵培養(yǎng)基中的粘度和/或密度降低。這樣，發(fā)酵生物的細(xì)胞膜上發(fā)酵培養(yǎng)基中可發(fā)酵糖的流入得到促進(jìn)。這可導(dǎo)致糖變成發(fā)酵產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率增加，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間縮短因而生成率更高。一種備選的或額外的理論是細(xì)胞濃度和/或細(xì)胞存活力升高。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)在進(jìn)行發(fā)酵之前預(yù)處理糖蜜時(shí)，可獲得產(chǎn)量改進(jìn)。本發(fā)明涉及使用發(fā)酵生物自糖蜜生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，其中將糖蜜i)用a_淀粉酶和葡糖淀粉酶的組合處理，并ii)使用一種或多種發(fā)酵生物以107_101(1個(gè)細(xì)胞/mL發(fā)酵培養(yǎng)基的細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)酵。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞計(jì)數(shù)為lCf-lCT個(gè)細(xì)胞/mL發(fā)酵培養(yǎng)基，尤其是約109個(gè)細(xì)胞/mL發(fā)酵培養(yǎng)基。濃縮的糖蜜具有約80%的。Bx。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，在水中稀釋糖蜜，使得本發(fā)明方法期間的糖蜜具有約1_35%、優(yōu)選16-25%、優(yōu)選約18-22%范圍內(nèi)的。Bx。在高重力方法中，°Bx在25-35、優(yōu)選27-32°Br范圍內(nèi)。Brix(°Bx)是液體(例如水)中溶解的固體(例如蔗糖)對(duì)水的質(zhì)量比的量度。它可以用測(cè)量液體比重的裝置(例如糖量計(jì))來(lái)測(cè)量。例如，25°Bx的溶液為25%(w/w)，25克蔗糖每100克液體，即100克溶液中有25克蔗糖和75克水。步驟i)中的酶處理和步驟ii)中的發(fā)酵可以依次或同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在各步驟依次進(jìn)行的情況中，酶處理步驟i)是作為預(yù)處理步驟進(jìn)行的，優(yōu)選在對(duì)所述酶合適的條件下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟i)是在20-70°C、優(yōu)選40-60°C、優(yōu)選45-55°C范圍內(nèi)的溫度進(jìn)行的。處理期間的pH優(yōu)選在4-6范圍內(nèi)。步驟i)中的預(yù)處理可以進(jìn)行1-10天，接著發(fā)酵1-80小時(shí)、優(yōu)選1-70小時(shí)或1-15小時(shí)、如1-10小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖蜜(°Br為80%左右)在中間罐(surgetank)中于40-60°C在4-6范圍內(nèi)的pH預(yù)處理1-10天。此后將預(yù)處理后的糖蜜以16-24%范圍內(nèi)的。Br、pH3-6、在30-36°C的溫度發(fā)酵1-18小時(shí)或1-15小時(shí)。當(dāng)本發(fā)明的方法作為同時(shí)步驟i)和步驟ii)方法進(jìn)行時(shí)，所使用的溫度范圍對(duì)于發(fā)酵生物是合適的，優(yōu)選最佳的。所述溫度取決于所討論的發(fā)酵生物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述溫度在25-60°C范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易地確定合適的或最佳的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，處理時(shí)間在約1-96小時(shí)、優(yōu)選5-72小時(shí)的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖蜜(°Br為16-24%)于30_36°C范圍內(nèi)的溫度、pH3-6發(fā)酵6-96小時(shí)。如果本發(fā)明的方法是使用酵母(如酵母屬(Saccharomyces)的菌株，優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株)作為發(fā)酵生物的乙醇生產(chǎn)方法，那么該方法可優(yōu)選在25-40°C、優(yōu)選28-36°C、尤其是30-34°C范圍內(nèi)的、如32°C左右的溫度進(jìn)行。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法期間還存在蛋白酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟i)中的酶處理期間或在同時(shí)酶處理和發(fā)酵期間添加所述蛋白酶。添加所述蛋白酶可以是為了在發(fā)酵期間使發(fā)酵生物(尤其是酵母)抗絮凝。鐘術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵生物”指任何適合于在期望的發(fā)酵方法中使用的生物體。合適的發(fā)酵生物依照本發(fā)明能夠發(fā)酵，即將優(yōu)選DP"糖(如尤其是葡萄糖、果糖和麥芽糖)直接或間接轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)。通常將發(fā)酵生物添加至醪液(mash)。發(fā)酵生物的例子包括真菌生物體，如酵母或絲狀真菌。優(yōu)選的酵母包括酵母屬菌種，特別是釀酒酵母的菌株。商業(yè)上可得到的酵母包括例如REDSTAR/LesaffreEthanolRed(可由RedStar/Lesaffre,USA得至lj)、FALI(可由Fleischmann，sYeast,USA得到)、SUPERSTART(可由Alltech得到)、GERTSTRAND(可由GertStrandAB,Sweden得到)和FERMIOL(可由DSMSpecialties得到)。優(yōu)選用于乙醇生產(chǎn)的酵母包括例如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬。依照本發(fā)明優(yōu)選的酵母是酵母屬菌種，特別是釀酒酵母或面包酵母(bakersyeast)。Mi^本發(fā)明的方法可任選包括回收發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)；從此，可以將發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)與發(fā)酵材料分開(kāi)并純化。發(fā)酵后，可以蒸餾醪液以提取例如乙醇。通過(guò)本發(fā)明的方法能獲得純度高至例如約96vol.%的乙醇。如此，在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟ii)中的發(fā)酵和蒸餾步驟可以同時(shí)和/或分開(kāi)/依次進(jìn)行；任選然后是一個(gè)或多個(gè)加工步驟以進(jìn)一步精煉發(fā)酵產(chǎn)物(例如乙醇)。酶a-淀粉酶依照本發(fā)明，在本發(fā)明的方法中可使用任何a-淀粉酶。優(yōu)選的a-淀粉酶是微生物的，如細(xì)菌或真菌來(lái)源的。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選的a-淀粉酶是酸性a-淀粉酶，例如真菌酸性a-淀粉酶或細(xì)菌酸性a-淀粉酶。術(shù)語(yǔ)“酸性a-淀粉酶”指如下的a-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，其在本發(fā)明的方法中使用時(shí)在3-7、優(yōu)選3.5-6、或更優(yōu)選4_5范圍內(nèi)的PH具有最佳活性。細(xì)菌a-淀粉酶在一個(gè)實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶是芽孢桿菌屬(Bacillus)來(lái)源的。芽孢桿菌屬a-淀粉酶可優(yōu)選源自地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)或嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的菌株，但是也可以源自其它芽孢桿菌屬菌株。所涵蓋的a-淀粉酶的具體例子包括W099/19467中SEQIDNO:4所示地衣芽孢桿菌a-淀粉酶、TO99/19467中SEQIDNO:5所示解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶和W099/19467中SEQIDNO:3所示嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶(通過(guò)提述將所有序列并入本文)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶可以是與W099/19467中SEQIDNO:1、2或3所示任何序列具有至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%、如至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性程度的酶。芽孢桿菌屬a-淀粉酶還可以是變體和/或雜合物，尤其是W096/23873；W096/23874；W097/41213；W099/19467；W000/60059；和W002/10355任一中所記載的(通過(guò)提述將所有文件并入本文)。具體涵蓋的淀粉酶變體是美國(guó)專利No.6，093，562;6，297，038；或6，187，576中所披露的(通過(guò)提述并入本文)，而且包括在位置R179至G182中刪除一個(gè)或兩個(gè)氨基酸的嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶(BSGa-淀粉酶)變體，優(yōu)選W01996/023873中披露的雙重刪除-參見(jiàn)例如第20頁(yè)第1_10行(通過(guò)提述并入本文)，優(yōu)選對(duì)應(yīng)于與W099/19467中披露的SEQIDNO:3所示野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比的A(181-182)或使用W099/19467中的SEQIDNO:3的編號(hào)刪除氨基酸R179和G180(通過(guò)提述將該參考文獻(xiàn)并入本文)。甚至更優(yōu)選的是芽孢桿菌屬a-淀粉酶，尤其是嗜熱脂肪芽孢桿菌a-淀粉酶，與W099/19467中披露的SEQIDNO3所示野生型BSGa-淀粉酶氨基酸序列相比，其具有與A(181-182)對(duì)應(yīng)的雙重刪除且進(jìn)一步包含N193F取代(也稱作I181*+G182*+N193F)。細(xì)菌雜合a-淀粉酶具體涵蓋的雜合a-淀粉酶包括地衣芽孢桿菌a-淀粉酶的445個(gè)C端氨基酸殘基(W099/19467的SEQIDNO4所示)和源自解淀粉芽孢桿菌的a-淀粉酶的37個(gè)N端氨基酸殘基(W099/19467的SEQIDNO5所示)，其中具有下列取代中的一個(gè)或多個(gè)(尤其所有):G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用TO99/19467的SEQIDNO:4中的地衣芽孢桿菌編號(hào)方式)。還優(yōu)選具有一個(gè)或多個(gè)下列突變(或其它芽孢桿菌屬a-淀粉酶主鏈中的相應(yīng)突變):H154Y，A181T，N190F,A209V和Q264S和/或位置176和179之間缺失兩個(gè)殘基、優(yōu)選缺失E178和G179(使用W099/19467的SEQIDNO:5編號(hào)方式)的變體?？梢砸员绢I(lǐng)域公知的濃度添加細(xì)菌a-淀粉酶。當(dāng)以KNU單位(在下文“材料和方法”部分中描述)測(cè)量時(shí)，a-淀粉酶活性優(yōu)選在0.5-50KNU/L發(fā)酵培養(yǎng)基、如1-25KNU/L發(fā)酵培養(yǎng)基、或更優(yōu)選2-10KNU/L發(fā)酵培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。真菌a-淀粉酶真菌a-淀粉酶包括源自曲霉屬(Aspergillus)的菌株，如源自米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)禾口川地曲霉(Aspergi1luskawachii)的菌株的a-淀粉酶。優(yōu)選的酸性真菌a-淀粉酶包括Fimgamyl樣a-淀粉酶，其是源自曲霉屬、優(yōu)選米曲霉的菌株。依照本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“Fungamyl樣a-淀粉酶”指與W096/23874中SEQIDNO10所示氨基酸序列的成熟部分展現(xiàn)出高度同一性，即至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、甚至至少99%或甚至100%同一性的a-淀粉酶。其它優(yōu)選的酸性a-淀粉酶源自黑曲霉的菌株。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酸性真菌a-淀粉酶是來(lái)自黑曲霉的，在Swiss-prot/TeEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中在主登錄號(hào)P56271下披露為“AMYAASPNG”且記載于W089/01969(實(shí)施例3)。一種源自黑曲霉的商業(yè)上可得到的酸性真菌a"淀粉酶是SP288(可由NovozymesA/S，Denmark得到)。其它涵蓋的野生型a-淀粉酶包括那些源自根毛霉屬(Rhizomucor)和亞灰樹(shù)花菌屬(Meripilus)的菌株，優(yōu)選微小根毛霉(Rhizomucorpusillus)(W02004/055178，通過(guò)提述并入)或大型亞灰樹(shù)花菌(Meripilusgiganteus)的菌株。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述a-淀粉酶源自川地曲霉且披露于Kaneko等J.Ferment.Bioeng.81292-298(1996)"Molecular-cloninganddeterminationofthenucleotide-sequenceofageneencodinganacid-stablealpha-amylasefromAspergilluskawachii"；并進(jìn)一步作為EMBL:#AB008370披露。所述真菌a-淀粉酶還可以是包含淀粉結(jié)合域(SBD)和a-淀粉酶催化域的野生型酶(即非雜合)，或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述野生型a-淀粉酶源自川地曲霉的菌株。真菌雜合a-淀粉酶在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述真菌酸性a_淀粉酶是雜合a-淀粉酶。真菌雜合a-淀粉酶的優(yōu)選例子包括W02005/003311或美國(guó)專利發(fā)明者埃德·M·博丁,小亞多托·德阿拉梅達(dá),維維安·佩雷拉德索扎,費(fèi)邊·B·奧默羅德申請(qǐng)人:諾維信公司;諾維信北美公司