專利名稱：用于診斷、預(yù)防和/或護理特征為β-淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物器官和組織中異 ...的制作方法
用于診斷、預(yù)防和/或護理特征為β -淀粉和/或淀粉樣物 質(zhì)在人和/或動物器官和組織中異常沉積的人和/或動物 病理的產(chǎn)物及它們的應(yīng)用、和用于確定這種病理風(fēng)險的篩選方法
阿爾茨海默氏病是老人癡呆的最普通的形式。其為退化性疾病，臨床特征為認(rèn)知 功能的不斷下降，神經(jīng)病理學(xué)特征為β-淀粉質(zhì)(Αβ)和τ蛋白的不溶性聚集體在大腦皮 層和皮質(zhì)下灰質(zhì)中的積累。Αβ以細(xì)胞外淀粉質(zhì)的形式沉積在神經(jīng)纖維網(wǎng)(老年斑)中和腦 血管(嗜剛果紅血管病)中，而τ形式的蛋白形成異常神經(jīng)元內(nèi)間絲(神經(jīng)元纖維變性) (Love S. Neuropathologicalinvestigation of dementia -.a guide for neurologists. J NeurolNeurosurg Psychiatry 76, Suppl 5 :v8_14,2005)(圖 1)。
在95%的情況下，阿爾茨海默氏病是偶發(fā)性的，而在約5%的情況下其具有家族 特征并且和下列3種基因的突變有關(guān)染色體14上的早老素1 (PSEN 1)、染色體1上的早 老素2(PSEN 2)、和染色體21上的β-淀粉質(zhì)前體(ΑΡΡ)。在這些情況下，所述疾病通常比 偶發(fā)性形式更早發(fā)作，并且以高滲透性常染色體顯性類型的機理來傳播。
AD的發(fā)病原理仍未完全理解，但是在最近十幾年，“淀粉質(zhì)瀑布”假說(Wilquet et al. Amyloid-beta precursor proteinprocessing in neurodegeneration.Curr Opin Neurobiol 14 :582-8,2004 ；Lee et al.Perspectives on the amyloid-beta cascadehypothesis. J Alzheimers Dis 6 :137-45，2004)日益被證實，其在家族(FAD)和 偶發(fā)性形式中都將核心作用歸因于Αβ。
A β通過稱為“淀粉質(zhì)源途徑”的分解代謝途徑衍生自其β -APP前體(圖幻。這 種途徑通過兩種蛋白酶(β-分泌酶和Y-分泌酶)來提供用于蛋白的分子上游和下游 的裂解。β -分泌酶(BACE)的切斷產(chǎn)生長的可溶性N-末端片段(sAPP β )和99個氨基酸 的C-末端肽(C99)。其進一步被Y-分泌酶切成對應(yīng)于A β和小的C-末端肽(Al⑶)的兩 個片段(Selkoe DJ. Deciphering thegenesis and fate of amyloid β -protein yields novel therapies forAlzheimer disease. J Clin Invest 110 :1375-81,2002)。事實 上，Y-分泌酶具有兩個主要的裂解位點，其導(dǎo)致形成“短”和“長”形式的Αβ (Αβ1-40和 Αβ 1-42)，在正常條件下它們的比例為10 1。類似地，BACE可在肽的不同點發(fā)揮作用，從 而在N-末端區(qū)域產(chǎn)生截短形式(例如A β 11-40、Αβ 11-42和A β 3_42)，這通常導(dǎo)致AD增 力口(Liu et al. Characterization of Aβ ll_40/42peptidedeposition in Alzheimer' s disease and young Down' s syndromebrains implication of Alzheimer' s disease. Acta Neuropathol 112 :163-74,2006)。由于蛋白被另一種蛋白酶(α -分泌酶)在Αβ殘 基16-17切斷，因此β APP可進行稱為“非淀粉質(zhì)源”的可選擇的分解代謝途徑。因此，后 面酶的作用排除淀粉質(zhì)的形成。
淀粉質(zhì)瀑布假說由多個證據(jù)支持
· AD 的基因 APP 決定家族形式突變(Rademakers et al.，Genetics of Early-Onset Alzheimer Dementia. Scientific WorldJournal 16:497-519,2003)；
基因APP的額外拷貝的存在(這在唐氏綜合癥中證實)足以確定AD的臨床病理學(xué)描述；
· AD的大多數(shù)遺傳決定形式與Αβ的產(chǎn)生增加、Αβ42/Αβ40比例增大有關(guān) (Kahle et al. Attack on 淀粉質(zhì)· EMBO Rep 4 :747-51,2003)；
·Αβ、特別是“長”的42-殘基形式表現(xiàn)出強的聚集為低聚物以形成淀粉質(zhì)原 纖維(其表示老年斑的主要要素)的趨勢(Armstrong RA. Plaques and tangles and thepathogenesis ofAlzheimer' s disease. Folia Neuropathol44 :1-11,2006)；
·Αβ、特別是42氨基酸形式是神經(jīng)毒性的(Butterfield et al. Amyloid beta-peptide(1~42)contributes the oxidative stressand neurodegeneration found in Alzheimer disease brain. Brain Pathol 14 :426-32,2004)；
轉(zhuǎn)基因鼠(與AD關(guān)聯(lián)的APP基因的載體)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累 β-淀粉質(zhì)，并且表現(xiàn)出行為-認(rèn)知范圍的缺陷，這取決于年齡而加重(Kurt et al. Neurodegenerativechanges associated with beta-amyloid deposition in thebrains of mice carrying mutant amyloid precursor proteinand mutant preseniIin-ltransgenes Exp Neurol 171 :59-71,2001)；
針對表達人APP的轉(zhuǎn)基因鼠的Αβ的變異降低了淀粉質(zhì)斑的形成，并且改 善了 其神經(jīng)學(xué)缺陷(Lemere et al. Amyloid-beta immunization in Alzheimer’ s diseasetransgenic mouse models and wildtype mice. NeurochemRes 28:1017—27, 2003)。
關(guān)于遺傳決定形式，約80%的家族AD情況與PSEN 1和PSEN 2突變關(guān)聯(lián)(Rocchi et al. Causative and susceptibility genesfor Alzheimer' s disease -.a review. Brain Res Bull 61 :1-24,2003) 0兩種早老素都涉及Αβ (其為Y-分泌酶的大分子 絡(luò)合物的部分)的產(chǎn)生，并且它們的突變情況涉及Αβ (上述所有Αβ 1-42)產(chǎn)生的增 加，這具有形成神經(jīng)毒性聚集體的高的趨勢。約5%的FAD由位于APP基因上的突變引 起(Rocchi et al. Causative andsusceptibility genes for Alzheimer' s disease a review. Brain ResBull 61 :1-24，2003)(圖2)。這些突變中的一些通過利于在二級 β-片層結(jié)構(gòu)富集Αβ構(gòu)象來發(fā)揮它們的病原作用，結(jié)果是溶解度和針對聚集的趨勢降 低。另一方面，其他突變干擾APP的加工，原因在于它們位于分泌酶發(fā)揮作用的分子位點 處(例如“瑞典型突變”KM670/671NL)。仍有其他者利用完全未知的機理來引起長的和 不溶形式的Αβ (Αβ1-42和Αβ1-43)的生產(chǎn)積累。在與APP或早老素突變關(guān)聯(lián)的AD情 況中，Αβ 1-42增加直到其占分泌的Αβ肽的15-40%為止，而在正常條件下其只占其的 5-10% (Rocchi et al. Causative and susceptibility genes forAlzheimer's disease a review. Brain Res Bull 61 1-24,2003 ；Lleoet al.Clinical, Pathological, and Biochemical Spectrum ofAlzheimer Disease Associated with PS—lMutations. Am J GeriatrPsychiatry 12 :146-56. 2004)。
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是提供用于診斷、和/或預(yù)防、和/或護理特征為β -淀粉物質(zhì) 和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物組織和/或器官中異常沉積的人和/或動物病理的產(chǎn)物 及它們的應(yīng)用、和用于確定這種病理風(fēng)險的篩選方法。
根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)以及其他目的通過下列記錄的獨立權(quán)利要求中所揭示的 內(nèi)容而獲得。
本發(fā)明的其他特征由從屬權(quán)利要求限定。
本發(fā)明的另外特征和優(yōu)點從附
圖1-19支持的下列描述中更加清晰可見。
本發(fā)明涉及人APP基因的新型點狀突變的近期發(fā)現(xiàn)。所述突變的特征在于在人 APP基因￠876 的編碼序列的密碼子673處胞嘧啶被胸腺嘧啶置換，對應(yīng)于根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫的命名法的人APP770 (NM000484. 2)異構(gòu)體的核苷酸2212 (轉(zhuǎn)換c. 2212 > T)，這可 在網(wǎng)站上http: //w驟.ncbi. nlm. nih. gov.得到。為了本專利，通過淀粉樣物質(zhì)，旨在A β 的蛋白聚集體不再具有淀粉質(zhì)本身的染色和/或超微結(jié)構(gòu)特性。這種突變(其在蛋白序列 中引起ΑΡΡ770的673(Ala673Val)位處丙氨酸被纈氨酸置換，這對應(yīng)于A β的氨基酸殘基 2)在患者的純合性中進行鑒定，所述患者患有具有早老性發(fā)病的嚴(yán)重形式的癡呆癥?；颊?頭脊柱液的分析表明總τ蛋白和磷酸化τ明顯減少，這在阿爾茨海默氏病中觀察到。另 一方面，Aβ 1-40和Αβ 1-42的血漿水平相對于對照受試者增加，并且也相對于在雜合性方 面具有相同突變的患者增加。另外，相對于對照纖維原細(xì)胞，得自患者的皮膚活組織檢查的 纖維原細(xì)胞在它們的培養(yǎng)基中釋放較高量的Aβ 1-40和Αβ 1-42?？傊?，該數(shù)據(jù)(其詳細(xì)記 錄在下面示出的幾個實施例中)表明在純合性狀態(tài)下，突變Ala673Val和可描述為阿爾茨 海默氏病的癡呆癥相關(guān)聯(lián)，并且與APP基因的其他突變類似，通過增加A β生產(chǎn)來影響APP 的加工。
不同家族成員的基因?qū)W研究證實存在純合性的Ala673Val突變的另一家族攜帶 者。較之患者的這種相對年輕者經(jīng)歷神經(jīng)心理評價，這檢測到不同認(rèn)知功能折中的初始信 號。而且，基因?qū)W分析允許鑒定相同的雜合突變中的多個攜帶受試者，吃驚的是即使它們中 的一些年齡增長(壽命九十)，神經(jīng)學(xué)的進展方面仍沒有發(fā)展(圖4)。對從基因APP開始轉(zhuǎn) 錄的RNA進行的基因表達研究證實在這些受試者中，等位基因(即野生型和突變的)都被 轉(zhuǎn)錄。因此，雜合子中不存在疾病不可能是因為基因阻遏機理(“病理性”等位基因的轉(zhuǎn)錄 的抑制)。因此可假設(shè)與截至目前APP基因中所描述(全部常染色體顯性并且完全滲透) 的相反，Ala673Val突變具有常染色體隱性類型的表達。因而斷定一些明顯突發(fā)形式的AD 可能在基因?qū)W上以常染色體隱性傳播的形式產(chǎn)生。
為了研究該現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)，我們合成兩種A β 1 -40肽，一種野生型(DAEF RHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)，另一種在2位含有取代丙氨酸的纈氨酸 (DVEFRHDSGYEVHHQKL VFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)。所述兩種肽進行化學(xué)-物理和形態(tài)學(xué) 分析以評價它們的二級結(jié)構(gòu)、聚集動力學(xué)、以及聚集體的形態(tài)和性質(zhì)。這些研究表明突變的 肽傾向于形成比野生型更大的淀粉質(zhì)原纖維。非常吃驚的是，由等摩爾量的所述兩種肽構(gòu) 成的混合物就其本身而言不僅聚集少于突變的肽，而且還少于野生型肽。對于淀粉樣化的 這種“抑制”作用和臨床觀察是一致的，在所述臨床觀察中所述疾病專門地在Ala673Val突 變的純合子受試者中顯現(xiàn)，而在細(xì)胞水平(野生型和突變的)共表達兩種肽的雜合子沒有 生病。在該數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，甚至可認(rèn)為雜合子個體由于突變的Αβ肽在存在其對應(yīng)的野生 型的條件下具有較小的纖維原性傾向而可以避免阿爾茨海默氏病。
為了證實下列假設(shè)容納突變的Αβ的N-末端區(qū)域在聚集方面具有重要作用以 及Ala673Val突變具有抑制作用，對應(yīng)于A β的第一六種氨基酸合成兩種肽，一種具有野生 型序列(DAEFRH)，另一種在2位含有取代丙氨酸的纈氨酸(DVEFRH)。然后所述兩種六肽和 Αβ 1-40野生型共溫育，并且在隨后的時間內(nèi)進行檢查。研究證實兩種六肽抑制Αβ 1-40的自發(fā)原纖維形成傾向，并且突變的六肽的作用大于對應(yīng)的野生型。
該數(shù)據(jù)在AD和更多通常特征在于蛋白以不溶和毒性聚集體的形式聚集在中樞神 經(jīng)系統(tǒng)或其他組織中的疾病的治療策略的范圍內(nèi)開啟了新的可能。
我們發(fā)明的第一應(yīng)用包括根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備含有人APP的 cDNA的載體(具有Ala673Val)和使用所述載體，以轉(zhuǎn)染可用于發(fā)病機理研究和治療的細(xì)胞 系。
第二應(yīng)用包括根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法使用根據(jù)前述申請的構(gòu)建體作為 載體來制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物(其能夠表達具有Ala673Val突變的人APP)、作為APP的 單一形式(純合子動物)、或者和野生型人APP或含有另一種突變(雙轉(zhuǎn)基因)的組合。這 種動物可用作研究人和/或動物病理(其特征在于β-淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在器官和組 織中的異常形成和沉積)的發(fā)病機理、診斷、預(yù)防和護理的模型。在目前實施方案中，優(yōu)選 的動物是鼠、特別是用于內(nèi)源性APP的敲除的鼠株C57BL6，并且優(yōu)選病理為AD。
考慮到突變的肽潛在可能干擾A β的聚集和原纖維形成，我們發(fā)明的另一種可能 應(yīng)用表示為在體內(nèi)基因治療ONA直接轉(zhuǎn)移到患者的細(xì)胞或組織中)或體外基因治療(DNA 首先轉(zhuǎn)移到從有機體分離的細(xì)胞中，實驗室培養(yǎng)并因此進行修飾，然后其可重新引入患者 中)中產(chǎn)生含有病理的APP (具有Ala673Val突變)的構(gòu)建體，所述病理的特征在于β-淀 粉物質(zhì)在組織和器官中的異常沉積。構(gòu)建體向靶細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移可以借助于病毒型載體來實 現(xiàn)，例如(a)逆轉(zhuǎn)錄病毒，其具有使它們的DNA整合到擴增細(xì)胞染色體中的能力；(b)而慢 病毒，其也允許將基因物質(zhì)轉(zhuǎn)移到?jīng)]有擴增的細(xì)胞中；(c)腺相關(guān)病毒，其不將它們的DNA 整合到細(xì)胞染色體中，而是可以僅用于小尺寸的基因；(d)腺病毒，其可以轉(zhuǎn)運大尺寸的基 因，但是仍然確保它們的有限時間期限的表達；或(e)單純皰疹病毒，其僅傳染數(shù)種類型的 細(xì)胞，特別是神經(jīng)元細(xì)胞?？蛇x擇地，可以使用非病毒載體(如脂質(zhì)體)。受到具有Αβ的 異常積累的病理影響而引入有機體的具有Ala673Val突變的APP可以提供突變的β-蛋白 源，其能夠抑制淀粉物質(zhì)在組織中的積累。
另一種可能的應(yīng)用表示為根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(RNA干擾法，RNAi)， 使用負(fù)感知mRNA (含有本發(fā)明的突變)以抑制信使在用于Ala673Val突變的純合子受試者 中的翻譯。翻譯的抑制具有這樣的目的，所述目的引起突變的肽的生產(chǎn)的中斷，這具有針對 聚集的強的趨勢?；趹?yīng)用于我們的發(fā)明的RNAi技術(shù)的試驗還可以用于疾病(其特征在 于淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在組織和器官中的異常形成和沉積)的發(fā)病機理的研究。
我們發(fā)明的另一種應(yīng)用提供具有Ala673Val突變的人APP和含有這種突變的天然 或合成肽在人和/或動物病理(其特征在于淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在組織和器官中的 異常形成和沉積)的診斷、預(yù)防和護理中的應(yīng)用。
我們優(yōu)選的實施方案提供低分子量肽(如六肽DVEFRH)的應(yīng)用，其合適地配制用 于口腔和/或胃腸外施用，包括鞘內(nèi)施用。優(yōu)選的病理為AD。所述治療提供施用單一肽或 關(guān)聯(lián)的數(shù)種肽，以用作單獨治療或聯(lián)合其他藥物治療。
我們發(fā)明的進一步應(yīng)用提供通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)制備針對根據(jù)前述 應(yīng)用的蛋白和/或肽的抗體，以用于人和/或動物病理(其特征在于β -淀粉和/或淀粉 樣物質(zhì)在組織和器官中的異常形成和沉積)的診斷、預(yù)防和/或護理。
我們優(yōu)選的實施方案提供單克隆抗體，其能夠識別人APP和由其衍生的并含有這種突變的肽中的Ala673Val突變。這種抗體可用于診斷目的以識別具有Ala673Val突變的 APP，或合適地配制以治療特征在于缺少這種突變的APP的淀粉樣變性病。優(yōu)選的淀粉樣變 性病是AD。
上述申請以實施例的形式記錄，并且不以任何方式限制本發(fā)明的進展。 實施例
實施例1 :APP基因新變異的鑒定和這種突變的攜帶患者的臨床顯型的描述
通過下列方式進行突變的鑒定從患者淋巴細(xì)胞中提取基因組DNA，經(jīng)過聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PC 、使用引物 5，-GTTTTGGGTAGCCTTTG-3 和 5，-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3， 對基因APP的外顯子16和17進行擴增，然后根據(jù)已經(jīng)描述的技術(shù)(Wakutani et al. Novel amyloid precursor protein gene missense mutation(D678N)in probably familial Alzheimer' s. JNeurol Neurosurg Psychiatry75 :1039-42,2004) ^ X^t ψ ±| 產(chǎn)物進行測序(圖5)。由于突變消除了限制性內(nèi)切酶HpYCH4V在外顯子16內(nèi)部的特 定酶切位點，因此Ala673Val的存在還通過下列方面示出外顯子16通過PCR(引物 5，-GGCAAGACAAAACAGTAGTGG-3，和 5，-TACTTTAATTATGATGTAATA-3，)擴增，PCR 產(chǎn)物被 HpYCH4V消化，以及片段在2. 5%瓊脂糖凝膠上的分離。在野生型等位基因中，HpYCH4消化 產(chǎn)生91和78個堿基對(bp)的兩種片段，而突變的等位基因產(chǎn)生169個bp的單一片段(圖 6)。
Ala673Val突變在沒有家族癡呆癥的純合性患者中進行鑒定，其受到進化的心 理-有機綜合癥(evolutive psycho-organicsyndrome)的影響，該綜合癥在36歲發(fā)病， 并且具有逐漸嚴(yán)重的記憶不足、計劃困難和行為紊亂(圖4，III 18)。針對嚴(yán)重的多部分 (multi-sector)認(rèn)知衰退，臨床描述發(fā)展為不自主運動和肌陣攣類型、帕金森癥以及痙攣 性四肢輕癱有關(guān)。
家族基因?qū)W研究允許鑒定第二純合子受試者的Ala673Val突變(圖4，III 20)和 不同雜合子受試者(圖4，II 10、III 1、1112、III 8、III 12、IV 1)。純合子(即患者的 妹妹，年輕5歲)目前具有和疾病發(fā)作一致的認(rèn)知劣化的初始信號；另一方面，沒有雜合子 受試者表現(xiàn)出神經(jīng)病學(xué)病理，即使在年齡增加的情況下也是如此。這種觀察表明Ala673Val 突變是常染色體隱性的，從而使得在以純合性的形式存在時，目前為止上述中只有一種和 表達病理顯型的AD有關(guān)聯(lián)。
應(yīng)該強調(diào)，APP基因的相同密碼子容納Ala673Thr多態(tài)性。這種多態(tài)性在雜合 性受試者中遇到，而沒有AD的臨床信號或神經(jīng)病理學(xué)改變的暗示(Peacock et al. Novel polymorphismin the A4region of the amyloid precursor protein gene in a patientwithout Alzheimer' s disease. Neurology 43:1254-56,1993)。
對患者進行的實驗室和裝置研究表明
廣泛的腦萎縮，普遍涉及腦髓的前部區(qū)域、RM處；
和由未受到癡呆癥影響的受試者所表示的對照組相比(Αβ 1-40 = 109士 12pg/ ml, ρ = 0. 003 ；Aβ 1-42 = 20士6pg/ml，p = 0. 004)，肽 Αβ 1-40 和 Αβ 1-42 在血漿中明顯 增多(分別為似6士93pg/ml和46士7pg/ml)(圖7)；
相對于陰性對照(Αβ 1-40 = 34. 4士3. 8pg/ml ；A β 1-42 = 4. 4士0. 6pg/ml)，Αβ在通過皮膚活組織檢查從患者中取出的纖維原細(xì)胞的培養(yǎng)基中增加(Αβ1-40 = 87. 3 士9. 5pg/ml ；A β 1-42 = 8. 8 士0. 2pg/ml)(圖 8)；
·Αβ 1-42士43pg/ml 對 392士 115pg/ml (對照組，ρ = 0.0004)降低(圖 9)，以及 在腦脊液中，τ蛋白(420pg/ml ；正常范圍90_150pg/ml)和磷_ τ (63. 3pg/ml ；對照中的平 均濃度19. lpg/ml)增加(圖10)，所述改變完全類似于阿爾茨海默氏病中觀察到的那些。
實施例2 含有Ala673Val突變的A β肽的化學(xué)-物理特性的分析
為了確定Ala673Val突變的效果并證實其在AD發(fā)病機理中的作用，我們合成了兩 種 A β -40 肽，一種具有野生型(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)序列，另一 種在2位的丙氨酸>纈氨酸(DVEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV)。所述肽通過 固相合成法經(jīng)過利用合成器433A(AppliedBiOSyStemS)來制備。然后根據(jù)Ball et al. (Int JPept Prot Res40 :370-9,1992)由 Bonetto et al. (J Biol Chem 277 :31327-34,2002) 所介紹的修飾方法，使用親脂性探針(4-十二烷基氨基羰基芴-9-基甲基琥珀酰亞氨基碳 酸酯)將和樹脂結(jié)合的肽在N-末端衍生化。在從樹脂分離后，所述肽通過HPLC法、經(jīng)過 使用反相柱C4 (Waters)來純化，獲得純度> 95 %。肽鑒定通過MALDI-T0F光譜法來確定 (Reflex III Brucker Model)。
對于下面記錄的物理-化學(xué)研究(除非另有說明)，將肽野生型A β 1-40、突變的 A β 1-40和含有等摩爾的兩種肽的混合物的樣品溶解于IOmM NaOH中，隨后在50mM Tris HCl (pH7. 0)中稀釋，直到最終濃度為0. 25和0. 125mM。然后將上述樣品在37°C下溫育1、 4、8、對小時以及3、5、10、15和20天。每次都分析等份的樣品以確定二級結(jié)構(gòu)、聚集、以及 聚集體的超微結(jié)構(gòu)和光學(xué)-染色性能。
二級結(jié)構(gòu)
由Αβ的二級結(jié)構(gòu)突變導(dǎo)致的變化根據(jù)由Clippingdale etal. (J Pept Sci 5 227-49,2001)所描述的技術(shù)、借助于圓二色光譜法來進行研究。將肽稀釋在150mM磷酸鹽 緩沖液(PH 7.4)中至最終濃度為ΙΟΟμΜ，使用Jasco-810分光偏振儀在37°C的恒溫下進 行測定。通過使用Imm的測試管和20nm/min的掃描速度來獲得光譜。在獲得緩沖溶液的 光譜后，如果需要，通過使用加權(quán)移動平均法除去噪音。
分析證實，突變的肽強烈地傾向于在β-片層呈現(xiàn)出大量的二級構(gòu)象。在所有檢 查的次數(shù)中，不僅相對于野生型肽，而且相對于由突變肽和野生型肽構(gòu)成的等摩爾混合物， 其β-片層含量都較高(圖11)。
這表明Aβ折疊的Ala673Val突變條件引起二級β -片層結(jié)構(gòu)的顯著增加。
聚集
野生型A β 1-40、突變的A β 1-40和它們等摩爾混合物的聚集通過下列方式來評 價確定可以用離心過濾法沉淀的肽的量。在不同的溫育時間，30μ 1的等份樣品在4°C下 以15，000g/15分鐘來離心過濾。將小球溶解于25 μ 1的純甲酸中，然后將溶液注射到設(shè)置 有 PRLP-SΙΟΟΑ柱(4.6x150mm)(Labservice Analytica,Polymer Laboratories)的 HPLC 中。通過下列方式進行洗脫使用洗脫液A (由在水中的0. 1% TFA構(gòu)成)和洗脫液B (由 在乙腈中的0. 08% TFA構(gòu)成)作為流動相，流速為0. 7ml/min，在20分鐘內(nèi)施加15-60%線 性梯度的洗脫液B。通過測定洗脫液在214nm處的吸收度來改善對應(yīng)于肽的峰。
可以被沉淀的肽的量被計算為初始溶液中存在的肽的總量的百分?jǐn)?shù)。
這些試驗證實與野生型肽相比，突變的肽聚集更多更快，并且吃驚的是，由兩種肽 形成的混合物沉淀少于突變的肽和野生型肽(圖12)。
聚集體的超微結(jié)構(gòu)和和染色性能
聚集體的超微結(jié)構(gòu)特性和光學(xué)-染色性能分別在用剛果紅著色后借助于電子顯 微鏡和偏振光顯微鏡來研究。
對于超微結(jié)構(gòu)研究，將5 μ 1的野生型A β 1-40、突變的A β 1-40和它們等摩爾混合 物的混懸液在1小時-20天的溫育時間吃取出，沉積在包覆i^ormvar-Carbon的鎳網(wǎng)上5分 鐘，用鈾酰的過飽和溶液陰性著色，然后在電子顯微鏡(EM109Zeiss)下觀察。在溫育的第 二十天，將等份樣品以15，000g/15分鐘離心過濾。將這樣獲得的小球固定于在磷酸鹽緩沖 液(pH 7.4)中的2. 5%的戊二醛，并且后固定在四氧化鋨中，在丙酮中脫水，并包含在 環(huán)氧樹脂(Spurr，Electron Microscopy Sciences)中。在銅網(wǎng)上收集超小部分(500 A), 用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，然后在電子顯微鏡下觀察。
為了證實是否以及以何種測量方式聚集體由淀粉質(zhì)構(gòu)成，在不同溫育時間，在聚 賴氨酸化(polylysinated)載玻片(Bio-Optical)上收集5 μ 1各樣品的溶液，用剛果紅染 色，然后用偏振光顯微鏡(Nikon Eclipse E-800)檢測。
超微結(jié)構(gòu)分析表明在第一個2天的溫育中，野生型A β 1-40肽形成無定形聚集體、 低聚物和很少的細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)。在48小時后，短原纖維材料出現(xiàn)，沒有分支并且不規(guī)定(前 原纖維)，僅在72小時溫育后，觀察到長的分支原纖維，直徑約8nm并且插入有無定形和前 原纖維材料。隨后，原纖維密度增加，并且無定形和前原纖維材料的量成比例增加。僅在15 天溫育后，大部分材料由致密原纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成。
另一方面，突變的肽Aβ 1-40的聚集動力學(xué)非?？?。事實上，從溫育M小時開始， 存在缺少各種衍生物的長的、規(guī)則原纖維(圖13)，在5天后，樣品由致密原纖維網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成而 沒有前原纖維和無定形材料。
吃驚的是，不僅相對于突變的肽、而且相對于野生型肽，兩種肽的等摩爾混合物都 形成較少原纖維，在20天溫育后，大多數(shù)聚集體由無定形材料構(gòu)成(圖14)。
用剛果紅染色的制劑的偏振光觀察表明突變的肽A β 1-40比野生型A β 1-40更具 淀粉樣化性，兩種肽的混合物具有低的形成淀粉質(zhì)的傾向。事實上，在突變的A β 1-40樣品 中在M小時溫育后存在雙折射材料的少量聚集體(圖13)，在野生型A β 1-40樣品中在72 小時后以及在兩種肽的混合物在5天后才出現(xiàn)這種情況。在稍后時間，在突變的Αβ 1-40 和野生型Αβ 1-40樣品中觀察到雙折射材料顯著增加，而在兩種肽的混合物中觀察到非常 少量的增加，即使在20天溫育后也是如此(圖14)。
該數(shù)據(jù)證實聚集研究的結(jié)果，并且證明(i)突變的肽Αβ 1-40比野生型Αβ 1-40 更具淀粉樣化性，和(ii)兩種肽的混合物具有低的形成淀粉質(zhì)原纖維的傾向。
實施例3.通過合成肽(含有Ala673Val突變的A β的N-末端區(qū)域的同源物)抑 制淀粉樣化
由于突變的A β 1-40和野生型A β 1-40肽的混合物的物理化學(xué)研究表明 八1動73￥31突變對于々0聚集可具有抑制作用，因此我們通過使用對應(yīng)于Αβ的第一六個 氨基酸的兩種合成肽來驗證該假設(shè)，一種具有野生型序列(DAEFRH)，另一種在2位含有取 代丙氨酸的纈氨酸(DVEFRH)。將兩種六肽和野生型Αβ 1-40以等摩爾濃度或過量(六肽Αβ1_40 = 5 1)濃度共溫育。如實施例2所述制備混合物以用于超微結(jié)構(gòu)和組織 化學(xué)研究。該研究表明兩種六肽(突變的和野生型的)都抑制A β 1-40的原纖維形成，這 說明Αβ的N-末端區(qū)域的突變位點在聚集中發(fā)揮重要作用(圖15)。然而，突變的六肽產(chǎn) 生較對應(yīng)的野生型更高的活性，這強調(diào)了 Ala673Val突變的重要性(由于對原纖維形成的 抑制作用)。
實施例4 用野生型人APP或在A β的2位含有Ala > Val突變的那種進行細(xì)胞 系的轉(zhuǎn)染
通過基因工程方法(Tesco et al. APP substitutions V715Fand L720P alter PS !conformation and differentially affect Aβ andAICD generation. JNeurochem 95 :446-56,2005 ；Sudhir et al. Release of Amino-Amino terminal Fragments from AmyloidPrecursor Protein Reporter and Mutated Derivatives in CulturedCell . J Biol Chem 267 :25602-08,1992)，產(chǎn)生兩種載體，所述載體分別含有野生型人APP751的 cDNA和在A β的2位具有Ala > Val突變的人ΑΡΡ751的cDNA。使用這些載體轉(zhuǎn)染兩種細(xì) 胞系(C0S7和CH0)，其中使用ELISA法在培養(yǎng)基中進行A β計量。
通過定點突變法(Quik Change XL Site-DirectedMutagenesis Kit, Mratagene)、使用寡核苷酸
5 ’ -GATCTCTGAAGTGAAGATGGATGTAGAATTCC-3 '和 5 ‘ -GTCATGTCGGAATTCTACATCCATC TTCACTT 3，將在A β的2位的Ala > Val突變插入人ΑΡΡ751的cDNA。然后，野生型和突 變形式的APP通過PCT、經(jīng)過使用下列引物來擴增
5’ -CCCGGATATCGCCACCATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3，和 5’ -ACCGAAGCTTTGTGGCGGGG GTCTAGTTC-3’(第一個含有限制性內(nèi)切酶EcoRV識別的位點，第二個具有用于酶HindIII 的位點)，在載體pcDNA 3. 1的限制性位點EcoRV和HindIII處克隆。這樣制得的構(gòu)建體 通過 iTop Ten One Shot(Invitrogen)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化進行擴增，通過 kit Endofree Plasmid Maxi Kit^liagen)進行純化，并通過電穿孔用于轉(zhuǎn)染C0S7和CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染效率通過 Western blot法、使用定向于蛋白N-末端區(qū)域(殘基61-88)的抗體22C11 (Chemicon International Inc.)、經(jīng)過細(xì)胞裂解液中的APP的量來評價。APP表達水平用于比較通過 使用兩種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染細(xì)胞而產(chǎn)生的A β的水平。在表達野生型和突變的人APP的C0S7和 CHO 的培養(yǎng)基上，然后用 ELISA(Immuno-BiologicalLaboratories Gunma)計量肽Αβ 1-40, A β 1-42和在N-末端的截短形式。
研究證實
相對于用野生型APP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞9士8. 6pg/ml和4士0. 8pg/ml)，在用突變 的APP轉(zhuǎn)染的C0S7細(xì)胞的培養(yǎng)基中Aβ 1-40和Αβ 1_42顯著增加(分別為116. 8士90. 5pg/ ml 和 20 士 12. 3pg/ml)(圖 16)；
相對于用野生型APP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞8士 11. 8pg/ml和4. 2士0. 8pg/ml)，在用突 變的APP轉(zhuǎn)染的CHO的培養(yǎng)基中Aβ 1-40和Αβ 1-42顯著增加(分別為84. 6士9pg/ml和 9. 6 士 3. 4pg/ml)(圖 17)；
相對于用野生型APP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(1. 1 士0. 3pg/ml)，在用突變的APP轉(zhuǎn) 染的C0S7細(xì)胞的培養(yǎng)基中，Αβ、特別是Αβ 3-42的N-末端處的截短形式明顯增加 (2. 5 士0. 3pg/ml)。13
該數(shù)據(jù)表明在A β的2位的Ala > Val突變改變了 APP的加工，從而支持淀粉樣 化途徑，同時A β 1-40、A β 1-42和N末端的截短形式的產(chǎn)量增加。
實施例5 轉(zhuǎn)基因鼠(在A β的2位具有Ala > Val突變的攜帶者)的產(chǎn)生
我們制備了這樣的構(gòu)建體，其攜帶在A β的2位具有Ala > Val突變的人ΑΡΡ，以 用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因鼠，對所述轉(zhuǎn)基因鼠進行行為學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)影像學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)、生 物化學(xué)和分子學(xué)測試，以限定和該基因缺陷有關(guān)的疾病的顯型特性，并進行發(fā)病機理和治 療研究。
將野生型ΑΡΡ751的cDNA克隆到載體pTSC21中，其含有啟動子鼠Thy 1. 2(限制 性位點HindIII和EcoRV)(圖18)。然后使該構(gòu)建體進行定點突變，并且通過報道用于細(xì)胞 轉(zhuǎn)染的相同方案(參見實施例4)插入在A β的2位的Ala > Val突變(Mratagene)，其用 于產(chǎn)生始于株C57B1/6的轉(zhuǎn)基因鼠。
獲得轉(zhuǎn)基因陽性的6個奠基者(3雄和3雌)，它們生下了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)過表達 在Αβ的2位具有Ala > Val突變的人APP的三個品系。兩個最優(yōu)品系交雜用于內(nèi)源性 APP的C5781/6敲除鼠的品系(已經(jīng)可得到的品系)，以獲得在缺乏鼠APP的情況下表達突 變的人APP的動物(huAPPmut/m0APPQAl，圖19)。最后，這些將交雜用于野生型人APP的轉(zhuǎn)基 因鼠，以獲得雜合子動物(huAPP_/huAPPwt)。
在純合性和雜合性的情況下表達具有A β的2位突變的人APP的鼠用于阿爾茨海 默氏病的發(fā)病機理研究、診斷、預(yù)防和護理，更通常用于特征在于淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在 器官和組織中異常沉積的人和/或動物疾病。
術(shù)語
AD=阿爾茨海默氏病
AI⑶=C-末端片段，其衍生自通過Y -分泌酶酶切APP
APP = β -淀粉質(zhì)蛋白前體
APP070 =用于內(nèi)源性APP的敲除動物
APP673a = APP 野生型
APP673v =在密碼子673處具有Ala > Val突變的APP
A β = β -淀粉質(zhì)，衍生自APP代謝的肽
BACE = β -分泌酶
bp =堿基對
COS細(xì)胞=用SV40病毒的缺陷突變株轉(zhuǎn)染的成年雄性非洲綠猴的腎臟細(xì)胞
Cellule CHO =衍生自中華倉鼠卵巢細(xì)胞的細(xì)胞
DHPLC =變性高效液相色譜法
DNA =脫氧核糖核酸
FAD =家族形式的阿爾茨海默氏病
HPLC=高效液相色譜法
huAPP =正常人 APP
huAPPmut =表達人APP的轉(zhuǎn)基因鼠，其中A β的2位Ala > Val突變
huAPPwt =表達野生型人APP的轉(zhuǎn)基因鼠
MAPT =編碼τ蛋白的基因
moAPP =鼠 APP
moAPP+/+ =具有正常APP表達的鼠
moAPP070 =用于內(nèi)源性APP的敲除鼠
mRNA=信使 RNA
Mut =突變的
Pqw =巨細(xì)胞病毒的啟動子
PCR=聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
PSENl =早老素 1
PSEN2=早老素 2
RM=核磁共振
RNA =核糖核酸
RNAi = RNA 干擾
sAPP β =衍生自通過β -分泌酶酶切APP的可溶性片段
SSCP =單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法
Wt =野生型
權(quán)利要求
1.一種基于以純合子或雜合子形式、在編碼人APP基因￠8767 的序列的密碼子673 處胞嘧啶被胸腺嘧啶置換的研究，對人生物材料進行篩選以確定病理的方法，所述病理的 特征在于由Αβ的任何異形體形成的淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)的異常沉積，所述研究對 應(yīng)于ΑΡΡ770異形體(ΝΜ_000484. 2)的核苷酸2212 (c. 2212C > T轉(zhuǎn)變)，所述突變導(dǎo)致在 APP770的殘基673處或在對應(yīng)于A β的2位的APP的其他異形體的類似殘基處丙氨酸被纈 氨酸置換。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，基于信使RNA(mRNA)被這樣的基因轉(zhuǎn)錄的研究，所 述基因編碼根據(jù)點1具有所述突變的人APP的各種異形體，或在APP770的密碼子673處具 有其他突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，基于含有所述Ala673Val突變的蛋白APP和/或 其異形體的研究，所述突變對應(yīng)于A β的2位或在ΑΡΡ770的密碼子673處具有其他突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的篩選方法，其特征在于，其包含從任何生物材料分離所述 基因組DNA和/或RNA和對它們進行測序。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或多項所述的篩選方法，其特征在于，其包括通過所述 DNA的非同位素分析來研究所述突變。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或多項所述的篩選方法，其中所述突變的研究通過使用 限制性內(nèi)切酶和/或DHPLC (去活高效液相色譜法)和/或SSCP (單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法) 和/或原位雜交法來進行。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的一項或多項所述的篩選方法，其特征在于，所述DNA得自從 患者血液中分離的白細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7所述的篩選方法，其特征在于一種所述病理是典型形式或以非典 型顯型表達的AD。
9.構(gòu)建體，其特征在于，其在任何非內(nèi)源性啟動子控制下攜帶人APP或它們片段的不 同異形體，所述人APP或它們片段在ΑΡΡ770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突 變或其他突變。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的構(gòu)建體，其特征在于其在啟動子Thyl.1或Thyl. 2控制 下攜帶人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有 Ala673Val突變或其他突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體，其特征在于其在巨細(xì)胞病毒(P。mv)的啟動子控制 下攜帶人APP或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有 Ala673Val突變或其他突變。
12.任意細(xì)胞系，其特征在于，其以穩(wěn)定或瞬間方式用根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的構(gòu)建 體轉(zhuǎn)染。
13.轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其以雜合子或純合子形式攜帶所述DNA序列或 其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片段的不同異形體，所述人APP或它們片 段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變或其他突變。
14.提供敲除用于內(nèi)源性APP的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其攜帶所述DNA序 列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片段的不同異形體，所述人APP或它 們片段以純合子形式(基因型APP673v/APP673v)、或半合子形式(基因型APPQ/APP673v)、或雜合子(基因型APP673A/APP673v)在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val (APP673v) 突變或其他突變。
15.根據(jù)權(quán)利要求13和14所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變(或在APP770或它們片段的密碼子673處的其 他突變)和其他突變相關(guān)聯(lián)。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和在編碼早老素1 (PSEm)的基因中的突變相關(guān)聯(lián)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和在編碼早老素2(PSEN2)的基因中的突變相關(guān)聯(lián)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和在編碼τ蛋白(MAPT)的基因中的突變相關(guān)聯(lián)。
19.根據(jù)權(quán)利要求13-15所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其以純合子、半合 子或雜合子形式攜帶所述DNA序列或其片段，所述DNA序列或其片段編碼人APP或它們片 段的不同異形體，其中所述Ala673Val突變、(或在APP770或它們片段的密碼子673處的 其他突變)和基因PSEm和/或PSEN2和/或MAPT中的突變組合相關(guān)聯(lián)。
20.根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物，其特征在于，其是敲除物，其中所述 內(nèi)源性APP在內(nèi)源性啟動子控制下通過非同源重組經(jīng)過人APP或其片段而置換，所述人APP 或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變或其他突變。
21.根據(jù)權(quán)利要求13-20所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其特征在于，其為嚙齒動物。
22.根據(jù)權(quán)利要求13-20所述的轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其特征在于，其是任何株的鼠。
23.轉(zhuǎn)基因動物，其特征在于，其是任何動物有機體，所述動物有機體表達人APP或其 片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變或 其他突變，所述基因型的特征在權(quán)利要求13-20中有所描述(例如線蟲、黑腹果蠅、斑馬魚寸J ο
24.轉(zhuǎn)基因有機體，其特征在于，其是任何真核或原核微生物，所述微生物表達人APP 或其片段，所述人APP或其片段在APP770或它們片段的密碼子673處具有Ala673Val突變 或其他突變，所述基因型的特征在權(quán)利要求13-20中有所描述(例如細(xì)菌，如大腸桿菌、酵 母菌、霉菌等)。
25.信使RNA(mRNA)或其片段，其含有核苷酸序列，所述核苷酸序列對應(yīng)于(“正感 知”mRNA)或互補于(“負(fù)感知”mRNA)DNA，所述DNA編碼人APP，所述人APP在APP770的密 碼子673處具有Ala673Val突變或其他突變。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求的RNA或其片段的應(yīng)用，它們用于已知為RNA干擾(RNAi)的技術(shù)范圍和所有其可能的應(yīng)用。
27.根據(jù)權(quán)利要求25和沈的RNA或其片段在人和/或動物病理的診斷、預(yù)防和治療中 的應(yīng)用，所述病理表示由Αβ的任何異形體形成的β-淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或 動物器官和組織中的異常沉積。
28.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的物質(zhì)的應(yīng)用，其中一種所述病理表示為具有典型或非典 型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
29.人APP的異形體，其特征在于，其在ΑΡΡ770的密碼子673處具有Ala673Val突變或 其他突變。
30.人APP的片段，包括所有Aβ的異形體，所述A β包括在N-末端處截短和/或在 C-末端處延伸的那些，其特征在于，其在ΑΡΡ770的密碼子673處具有Ala673Val突變或其 他突變。
31.如前述權(quán)利要求所述的人APP的片段，其表示為Aβ 1-40、A β 1_42、在A β 1-40和 Aβ 1-42的N-末端處截短形式、以及在Aβ 1-40和Αβ 1-42的C-末端處延伸形式、或它們 的部分序列。
32.合成肽，其特征在于，它們類似于根據(jù)權(quán)利要求30和31所述的人APP的片段。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32所述的肽，其特征在于，它們含有至少一種右旋形式的氨基酸殘基。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-33所述的肽，其特征在于，它們含有一種或多種氨基酸殘基，所 述氨基酸殘基通過使用任何類型的化學(xué)基團結(jié)合來修飾。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-34所述的模擬化學(xué)結(jié)構(gòu)、非蛋白或只有部分蛋白用于藥物制劑， 所述藥物制劑被設(shè)計用于人和/或動物病理的診斷和/或預(yù)防和/或護理，所述病理的特 征在于β-淀粉物質(zhì)和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物組織和器官中的異常沉積。
36.根據(jù)權(quán)利要求30-35所述的物質(zhì)，其特征在于，它們偶合分子，所述分子起到載體 的作用，所述載體能夠攜帶這些物質(zhì)至特定位點，在所述位點中所述物質(zhì)具有用于人和/ 或動物病理的診斷和/或預(yù)防和/或護理的功能，所述病理的特征在于β -淀粉物質(zhì)和/ 或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
37.根據(jù)權(quán)利要求30-36所述的物質(zhì)在藥物制劑中的應(yīng)用，所述藥物制劑被設(shè)計用于 人和/或動物病理的診斷和/或預(yù)防和/或護理，所述病理的特征在于β -淀粉物質(zhì)和/ 或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的物質(zhì)的應(yīng)用，其中一種所述病理表示為具有典型或非典 型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
39.根據(jù)權(quán)利要求30-36所述的物質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，它們?yōu)檩d體，所述載體能夠 攜帶任何類型的化合物至特定位點，在所述位點中所述物質(zhì)具有用于人和/或動物病理的 診斷和/或預(yù)防和/或護理的功能，所述病理的特征在于β -淀粉物質(zhì)和/或淀粉樣物質(zhì) 在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
40.根據(jù)權(quán)利要求25和30-36所述的物質(zhì)在研究人和/或動物疾病的發(fā)病機理中的應(yīng) 用，所述疾病的特征在于β-淀粉物質(zhì)和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物組織和器官中異 常沉積。
41.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的物質(zhì)的應(yīng)用，其特征在于，一種所述病理表示為具有典型或非典型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
42.根據(jù)權(quán)利要求四-34所述的蛋白和/或肽的多克隆抗體。
43.單克隆抗體或它們的片段(單鏈抗體，納米體)，其針對根據(jù)權(quán)利要求四-34所述 的蛋白和/或肽。
44.根據(jù)權(quán)利要求42和43所述的抗體在藥物制劑中的應(yīng)用，所述藥物制劑瞄準(zhǔn)人和/ 或動物病理的診斷和/或預(yù)防和/或護理，所述病理的特征在于β -淀粉物質(zhì)和/或淀粉 樣物質(zhì)在人和/或動物組織和器官中異常沉積。
45.抗體針對根據(jù)前述權(quán)利要求所述的蛋白和/或肽的應(yīng)用，其中一種所述病理表示 為具有典型或非典型顯型的AD的偶然或遺傳形式。
46.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的構(gòu)建體在人和/或動物病理的體細(xì)胞基因治療中的應(yīng) 用，所述病理的特征在于β-淀粉物質(zhì)和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物組織和器官中異 常沉積。
47.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的構(gòu)建體的應(yīng)用，其中根據(jù)權(quán)利要求46所述的體細(xì)胞治療 通過使用天然或合成的脂質(zhì)或聚合物作為攜帶載體而獲得。
48.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的構(gòu)建體的應(yīng)用，其中根據(jù)權(quán)利要求46所述的體細(xì)胞基因 治療通過使用生物劑作為載體而獲得。
49.前述權(quán)利要求所述的構(gòu)建體的應(yīng)用，其中根據(jù)權(quán)利要求46所述的體細(xì)胞基因治療 通過使用病毒劑作為載體(腺病毒、腺相關(guān)病毒、SV40、逆轉(zhuǎn)錄病毒等)而獲得。
50.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的構(gòu)建體在人自身細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用，所述應(yīng)用用在所 述病理的細(xì)胞治療，所述人自身細(xì)胞受到根據(jù)權(quán)利要求37和38所述的病理的影響。
51.根據(jù)權(quán)利要求9-11所述的構(gòu)建體在異源或異種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染中的應(yīng)用，所述應(yīng)用用 在根據(jù)權(quán)利要求37和38所述的病理的細(xì)胞治療。
52.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞和根據(jù)權(quán)利要求13-Μ所述的基因改造的有機體作為 模型用于根據(jù)權(quán)利要求37和38所述的病理的發(fā)病機理以及診斷、預(yù)防和護理研究中的應(yīng) 用。
53.根據(jù)權(quán)利要求12所述的細(xì)胞和根據(jù)權(quán)利要求1314所述的基因改造的有機體用于 根據(jù)權(quán)利要求四-31所述的蛋白和/或肽的制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于在純合性或雜合性的情況下對β-蛋白的2位的點狀突變Ala＞Val(對應(yīng)于含有770個氨基酸的β-蛋白的Ala673Val突變前體)的研究，對從人和/或動物有機體分離的生物材料進行篩選以確定表現(xiàn)為β-淀粉和/或淀粉樣物質(zhì)在人和/或動物器官和組織中異常沉積的人和/或動物病理的風(fēng)險的方法。本專利提供下列可行性(1)產(chǎn)生表達Ala673Val突變的單細(xì)胞或多細(xì)胞轉(zhuǎn)基因有機體；(2)合成或制備具有這種突變的肽和/或它們的衍生物、和/或含有相同突變的核酸；(3)使用這些產(chǎn)物研究特征為β-淀粉和/或淀粉物質(zhì)的異常沉積的病理的發(fā)病機理以及這些疾病的預(yù)防、診斷和護理。
文檔編號C12N15/11GK102037136SQ200880121317
公開日2011年4月27日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月12日
發(fā)明者A·馬蒂尼, F·塔格利維尼, G·迪費德, M·莫斌 申請人:卡羅貝斯塔神經(jīng)學(xué)會I.R.C.C.S.基金會