專利名稱：有機(jī)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于真核細(xì)胞培養(yǎng)方法以及用于表達(dá)目的重組產(chǎn)物的新選擇系統(tǒng)。該 選擇系統(tǒng)基于將外源性功能膜結(jié)合葉酸化合物(folate)受體基因以及編碼目的產(chǎn)物的多 核苷酸或基因引入到真核細(xì)胞中，其可廣泛用于細(xì)胞生存力依賴于葉酸攝取的真核細(xì)胞。
背景技術(shù)：
選擇標(biāo)記和選擇系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于基因工程、重組DNA技術(shù)以及重組產(chǎn)物例如抗 體、激素和核酸在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中的生產(chǎn)。此類顯性選擇標(biāo)記和選擇系統(tǒng)的首要目的是 引入選擇基因，所述選擇基因在暴露于選擇性生長條件后提供能高水平產(chǎn)生重組目的產(chǎn)物 的細(xì)胞。迄今，有3種可用的主要選擇標(biāo)記系統(tǒng)(a)谷氨酰胺合成酶系統(tǒng)酶谷氨酰胺合成酶(GS)負(fù)責(zé)由谷氨酸和氨生物合成谷 氨酰胺。該生物合成反應(yīng)提供了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中谷氨酰胺形成的唯一途徑。因此，在生長 培養(yǎng)基中缺少谷氨酰胺時(shí)，酶GS對(duì)培養(yǎng)中哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存活是必不可少的。重要的是， 包括小鼠骨髓瘤細(xì)胞在內(nèi)的某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞系缺乏足夠GS的表達(dá)，因此在沒有外源加 入的谷氨酰胺時(shí)不能存活。因此，此類細(xì)胞系是適宜的轉(zhuǎn)染GS基因的受體，在該系統(tǒng)中轉(zhuǎn) 染的GS基因可用作允許細(xì)胞在缺少谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長的選擇標(biāo)記。相比之下，細(xì)胞 系如廣泛使用的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)足夠的GS以支持在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基 中的生長。因此，如果這些CHO細(xì)胞被用作轉(zhuǎn)染GS基因的受體細(xì)胞，則為了抑制內(nèi)源性GS 活性可以應(yīng)用特異且有效的GS抑制劑甲硫氨酸亞砜亞胺(sulfoximine) (MSX)，這樣只有 表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)染的GS基因的轉(zhuǎn)染子可以在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中存活。GS系統(tǒng)的主 要缺點(diǎn)是為了建立穩(wěn)定過表達(dá)目的靶基因的細(xì)胞，選擇性生長的時(shí)間相對(duì)較長(即2-6個(gè) 月)。另一個(gè)缺點(diǎn)是頻繁利用細(xì)胞毒素劑MSX來提升選擇壓力。這種細(xì)胞毒素劑與重組目 的產(chǎn)物(例如多肽如抗體)的一起存在可能需要額外純化步驟來清除該細(xì)胞毒素劑。(b) 二氫葉酸還原酶/MTX選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶(DHFR)催化二氫葉酸至四 氫葉酸(THF)的NADP依賴性還原。然后THF與10-甲?；?THF和5，10-亞甲基-THF (它 們分別用于嘌呤和胸苷酸的從頭生物合成)相與轉(zhuǎn)換。DHF是胸苷酸合酶(TS)的催化活性 的副產(chǎn)物，該胸苷酸合酶在5，10-亞甲基-THF依賴性反應(yīng)中催化dUMP至dTMP的轉(zhuǎn)化。因 此，DHFR對(duì)THF輔因子的再循環(huán)是至關(guān)重要的，而THF輔因子對(duì)DNA復(fù)制所必要的嘌呤和嘧 啶核苷酸的生物合成是必不可少的。因此，缺少DHFR基因(即通過靶向的基因組缺失)的 細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)可用作在不含核苷酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染DHFR基因的受體。轉(zhuǎn)染后，可 使細(xì)胞接觸濃度逐步增長的抗葉酸劑MTX (—種最有效的DHFR抑制劑(Kd = IpM))，由此迫 使細(xì)胞產(chǎn)生增加水平的DHFR。經(jīng)多輪選擇后，選擇標(biāo)記DHFR通常經(jīng)歷顯著的基因擴(kuò)增。此 外，對(duì)MTX具有較大耐藥性的突變型小鼠DHFR也已廣泛用作顯著增加轉(zhuǎn)染子細(xì)胞中高水平 MTX-耐藥性的獲得的顯性選擇標(biāo)記。DHFR/MTX選擇系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是該技術(shù)利用了誘變 性細(xì)胞毒素劑MTX，MTX可容易地改變受體細(xì)胞的基因型。此外，可能必須采取具體的安全 措施來保護(hù)操作該活性劑的人員。這常常導(dǎo)致耐MTX的細(xì)胞群，在該細(xì)胞群中由于還原型葉酸化合物載體(RFC)的功能喪失性突變和/或RFC基因表達(dá)的喪失(兩者均可破壞MTX 攝取)，而不存在目的靶基因的表達(dá)。另一個(gè)缺點(diǎn)是誘變性藥物MTX可容易地污染生長培養(yǎng) 基中所含的分泌的過表達(dá)靶產(chǎn)物(例如多肽，如抗體)，因此需要費(fèi)力、耗時(shí)且昂貴的色譜 方法清除這種誘變性化合物MTX。此外，終產(chǎn)物中MTX的缺乏必須通過相應(yīng)試驗(yàn)來證實(shí)。(c)還原型葉酸化合物載體選擇系統(tǒng)還原型葉酸化合物載體(RFC)是一種泛表 達(dá)的膜糖蛋白，其是攝取還原型葉酸化合物如5-甲基-THF和5-甲?；?THF的主要轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白。然而，RFC對(duì)氧化型葉酸化合物，即葉酸(folic acid)，具有很弱的親和力。因此，缺 少RFC表達(dá)或基因組RFC座位已缺失的細(xì)胞可以用作在如下條件下轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記基因RFC 的受體，在所述條件下逐漸從生長培養(yǎng)基中剝奪還原型葉酸化合物如5-甲酰基-THF，從而 迫使細(xì)胞表達(dá)增加水平的該葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。RFC選擇系統(tǒng)有幾個(gè)缺點(diǎn)a)必須使用 內(nèi)源性RFC基因座已經(jīng)被敲除或者已通過靶向敲除或功能喪失性突變而失活的RFC-無效 受體細(xì)胞。b)RFC對(duì)氧化型葉酸化合物，即葉酸(folic acid)的轉(zhuǎn)運(yùn)親和力極弱，因此這種 氧化型葉酸化合物不能用于選擇。c)與現(xiàn)基于葉酸化合物受體的系統(tǒng)(其為單向葉酸化合 物攝取系統(tǒng)并且在下文詳細(xì)地解釋)相反，RFC是表現(xiàn)出同等有力的葉酸化合物輸入和輸 出的雙向葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這提示，在葉酸化合物剝奪的情況下，RFC過表達(dá)可能對(duì)受 體細(xì)胞是有害的，所述受體細(xì)胞會(huì)經(jīng)由過表達(dá)的RFC而進(jìn)一步輸出葉酸化合物。本發(fā)明的目的是提供比上述的現(xiàn)有技術(shù)選擇系統(tǒng)具有某些優(yōu)勢(shì)的新代謝選擇系 統(tǒng)。該新選擇系統(tǒng)基于在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用葉酸化合物、以及存在經(jīng)由表達(dá)載體引入意欲 產(chǎn)生目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞中的葉酸化合物受體。該新方法不需要內(nèi)源性葉酸化合物受 體(FR)基因的在先缺失。在引入包含F(xiàn)R選擇基因以及編碼目的產(chǎn)物(如多肽)的多核苷 酸的載體后，使細(xì)胞在含有高度限制性濃度的葉酸化合物的選擇培養(yǎng)基中生長。這樣，只有 顯著過表達(dá)FR的細(xì)胞可攝取足夠的葉酸化合物以維持細(xì)胞生長、DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖，從 而允許過表達(dá)目的靶產(chǎn)物。氧化型葉酸化合物(即葉酸)以及葉酸的還原型衍生物(稱為還原型葉酸化合物 或四氫葉酸化合物(THF))是一組B-9維生素，其是真核細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中 生物合成嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸所必不可少的輔因子和/或輔酶。THF輔因子對(duì)DNA 復(fù)制并由此對(duì)細(xì)胞增殖尤其重要。具體來說，THF輔因子作為一碳單位的供體在一系列相 互關(guān)聯(lián)的代謝途徑中起作用，所述代謝途徑包括嘌呤和胸苷酸的從頭生物合成、氨基酸以 及甲基基團(tuán)的代謝(包括DNA的CpG島甲基化)。具體來說，THF輔因子，包括10-甲酰 基-THF(IO-CHO-THF)，在涉及嘌呤從頭生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵性從頭甲?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)中 貢獻(xiàn)一碳單位。第一個(gè)酶甘氨酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶(GARTF)參與嘌呤的咪唑環(huán)形成，而由 5_氨基咪唑-4-羧酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶(AICARTF)介導(dǎo)的更下游反應(yīng)產(chǎn)生嘌呤中間體肌苷 5'-單磷酸(IMP)。后者是受調(diào)節(jié)的AMP和GMP生物合成的關(guān)鍵前體。此外，5，10-亞甲 基-THF (5,IO-CH2-THF)是另一個(gè)重要的THF輔酶，其作為酶胸苷酸合酶(TS)的關(guān)鍵輔因子 起作用。TS催化由dUM P形成胸苷單磷酸(dTMP)。因此，這些葉酸化合物依賴性酶是DNA 復(fù)制所必需的嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的從頭生物合成的關(guān)鍵介質(zhì)。由此，這些葉酸化合物 依賴性酶被確定為葉酸拮抗劑(稱為抗葉酸劑)活性的靶點(diǎn)。例如，4-氨基葉酸類似物氨 基蝶呤及其同系物4-氨基-10-甲基葉酸氨甲蝶呤(MTX)是第一類抗代謝物，其被引入臨 床用于化療治療兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)?？谷~酸劑目前是當(dāng)前用于治療其它人類惡性腫瘤(包括骨肉瘤、乳腺癌、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)層 細(xì)胞瘤形成)的不同化療方案的關(guān)鍵組分。與合成其自身葉酸化合物的大多數(shù)原核生物、植物、真菌和某些protests相比， 哺乳動(dòng)物和其它真核生物物種缺少THF輔因子生物合成，因此必須從外源性來源獲得它 們。目前已知三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中葉酸化合物和抗葉酸劑的攝取。a)還原型葉酸化合物輔因子的主要細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是還原型葉酸化合物載體 (RFC)。RFC (也稱為溶質(zhì)載體家族19成員1，SLC19A1)是廣泛表達(dá)的 85kDa膜糖蛋白，其 是雙向易化載體，通過交換有機(jī)磷酸(如已知蓄積至非常高細(xì)胞內(nèi)水平的腺嘌呤核苷酸， 以及硫胺素單磷酸和焦磷酸)介導(dǎo)還原型葉酸化合物的向上轉(zhuǎn)運(yùn)。RFC對(duì)THF輔因子(包 括甲酰四氫葉酸(5-甲?；?THF ；Kt = ΙμΜ))顯示高親和力，然而對(duì)葉酸，即氧化型葉酸 化合物，僅具有很弱的轉(zhuǎn)運(yùn)親和力(Kt = 200-400 μ Μ)。b)葉酸化合物攝取的另一路徑是最近已被克隆的質(zhì)子偶聯(lián)葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (PCFT，也稱為SLC46A)。PCFT似乎獨(dú)立于RFC表達(dá)，在酸性pH(5. 5)具有最佳功能并且介 導(dǎo)氧化型葉酸化合物(例如葉酸)和THF輔因子(即還原型葉酸化合物)以及各種親水性 抗葉酸劑(包括MTX)的流入。PCFT在酸性pH(5. 5)而非生理pH(7. 4)顯示最佳的葉酸化 合物和抗葉酸劑轉(zhuǎn)運(yùn)，并在小腸上部的葉酸化合物和抗葉酸劑吸收中起關(guān)鍵作用。c)第三轉(zhuǎn)運(yùn)路徑，即本發(fā)明所基于的路徑，涉及葉酸化合物受體(FR)。FR是由 三種不同基因，F(xiàn)Ra、FRi3和FR γ，編碼的高親和力葉酸化合物結(jié)合糖蛋白。FRa (或 FR alpha)也被稱為成人葉酸化合物結(jié)合蛋白或FDP、葉酸化合物受體1或F0LR(小鼠中 folbpl)，以及卵巢癌相關(guān)抗原或MOvl8。FRi3 (或FR beta)也被稱為F0LR2 (胎兒)和FBP/ PL-I (胎盤)。FR γ (或 FR gamma)也被稱為 F0LR3 和 FR-G (由 M. D. Salazar 和 M. Ratnam 綜述，Cancer Metastasis Rev. 2007 26 (1)，第141-52頁)。成熟FR獲得很好的表征，是 具有 70-80%氨基酸同一性的同源蛋白，包含229至236個(gè)氨基酸以及兩個(gè)至三個(gè)N-糖 基化位點(diǎn)。FRa和FRi3是膜結(jié)合性的、特別地帶糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨的，細(xì)胞表面糖 蛋白，而FRy缺少GPI錨且是分泌蛋白。FRa和FRP對(duì)于葉酸(Kd = 0. 1-lnM)、5，10-二 脫氮雜四氫葉酸(DDATHF ；洛美曲索(Iometrexol) ；Ki = 0. 4-1. 3nM，使用[3H]葉酸作為底 物)和860945(其為僅通過？1^而不通過還原型葉酸化合物載體特異性轉(zhuǎn)運(yùn)的基于環(huán)戊 并[g]喹唑啉的胸苷酸合酶抑制劑)(Kd = InM)顯示高親和力，但對(duì)于MTX (Kd > IOOnM) 則顯示低得多的親和力。葉酸化合物和抗葉酸劑的FR依賴性攝取通過經(jīng)典的受體介導(dǎo)的 內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)行。基因敲除研究已顯示，F(xiàn)Ra (小鼠中也稱為Folbpl)對(duì)早期胚胎發(fā)育以及 母體葉酸化合物補(bǔ)充(挽救子宮內(nèi)胚胎致死以及允許正常發(fā)育)是必不可少的。持續(xù)需要安全、高效和成本有效的、能克服迄今已知的選擇系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)缺 點(diǎn)的選擇系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及真核生物表達(dá)載體，其包括編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一 多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸。本發(fā)明還涉及細(xì)胞生存力依賴于葉酸攝取的真核細(xì)胞，該真核細(xì)胞已穩(wěn)定地引入 了所述表達(dá)載體，由此該細(xì)胞表達(dá)該載體所編碼的功能性葉酸化合物受體。此外，本發(fā)明涉及選擇方法，該方法用于提供能高產(chǎn)率地穩(wěn)定表達(dá)目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞。本發(fā)明可有利地用于高產(chǎn)率地生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法。發(fā)明詳述在本發(fā)明中，現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可基于在細(xì)胞培養(yǎng)基中葉酸化合物的限制可 用量，建立用于提供能夠產(chǎn)生目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞的選擇系統(tǒng)。該系統(tǒng)將是廣泛適用 的，即，廣泛地適用于細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞。該新系統(tǒng)可用于加速選擇、篩選和建立在沒有細(xì)胞毒性藥物的情況下穩(wěn)定地過表 達(dá)高水平重組產(chǎn)物的真核細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞)克隆。進(jìn)一步地，并且與其它已知的 選擇系統(tǒng)不同地，對(duì)于，例如通過突變或敲除內(nèi)源性基因，提供修飾的細(xì)胞，并沒有必然的 需要(盡管有時(shí)是可行的)。因?yàn)槔鏔Ra對(duì)FA(Kd = 0. InM)的親和力比例如RFC對(duì)甲 酰四氫葉酸(Kt = ΙμΜ)的親和力更高，且FRa通過單向途徑轉(zhuǎn)運(yùn)葉酸到細(xì)胞中，因此本 發(fā)明提供了 FRa和其它葉酸化合物受體用作顯著改良的顯性代謝選擇標(biāo)記的用途，特別 是通過從生長培養(yǎng)基中逐步剝奪葉酸化合物(例如葉酸)的方式。該新的基于葉酸化合物 的選擇是一個(gè)優(yōu)良的策略，十分適于在不存在細(xì)胞毒性藥物選擇(在多種過表達(dá)系統(tǒng)中常 規(guī)使用)的情況下靶蛋白在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中加速的、穩(wěn)定且高水平的過表達(dá)。此新選擇系統(tǒng)比現(xiàn)有技術(shù)中可用的選擇系統(tǒng)具有幾個(gè)重要的優(yōu)勢(shì)。1.根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)是非?？焖俚倪x擇系統(tǒng)。在葉酸剝奪的四個(gè)星期內(nèi)，可 容易地分離出表達(dá)目的靶基因的細(xì)胞群或克隆細(xì)胞衍生物。這明顯地有別于上述的GS系 統(tǒng)，GS系統(tǒng)可能需要2-6個(gè)月的靶基因選擇和穩(wěn)定化。2.根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染之前不需要內(nèi)源性FRa、β或Y基因的基因組 缺失或衰減，因此可用于任何受體細(xì)胞，即使在存在一些內(nèi)源性FR基因表達(dá)時(shí)。這種關(guān)鍵 的優(yōu)勢(shì)是基于以下事實(shí)在FRa轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞可以暴露于生長培養(yǎng)基中突然且嚴(yán)重的葉酸 化合物(例如葉酸)剝奪。由此，僅表達(dá)顯著量的選擇FR α標(biāo)記的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)運(yùn)足 夠的葉酸化合物以維持DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。這發(fā)生在無內(nèi)源性FRa基因表達(dá)的任何顯 著升高的情況下。這與上述的DHFR/MTX系統(tǒng)不同，DHFR/MTX系統(tǒng)中受體細(xì)胞往往是內(nèi)源 性DHFR基因缺失的(例如CHO DG44細(xì)胞和CHO Dux細(xì)胞)。c)根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)不會(huì)遭遇因葉酸化合物攝取替代路徑的增加表達(dá)(包 括內(nèi)源性RFC的增加表達(dá))引起的選擇壓力緩解而導(dǎo)致的選擇嚴(yán)緊性的喪失。這種重要 的優(yōu)勢(shì)是因?yàn)橐韵率聦?shí)FRa對(duì)于葉酸(Kd = 0. InM)具有突出的親和力，而RFC對(duì)于葉酸 (Km = 0. 2-0. 4mM)顯示極弱的親和力。相比之下，由于在MTX選擇后常常會(huì)導(dǎo)致沒有選擇 標(biāo)記表達(dá)或具有弱選擇標(biāo)記表達(dá)的MTX耐受性細(xì)胞，包括DHFR/MTX系統(tǒng)的多種現(xiàn)有技術(shù)選 擇系統(tǒng)可遭受選擇嚴(yán)緊性的嚴(yán)重喪失。而RFC(主要的MTX轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的功能喪失可能是 MTX耐藥性的常見機(jī)制。已經(jīng)顯示，這可由頻繁出現(xiàn)的RFC基因中失活突變或RFC基因表達(dá) 的嚴(yán)重喪失所致。d)根據(jù)本發(fā)明的選擇系統(tǒng)不使用可以改變受體細(xì)胞的基因型和目的靶基因的細(xì) 胞毒性藥物和/或誘變性化合物，如DHFR系統(tǒng)中的MTX或GS系統(tǒng)中的MSX。相反地，F(xiàn)R選 擇所利用的原理是自生長培養(yǎng)基中剝奪維生素。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及真核生物表達(dá)載體，其包括編碼功能性膜結(jié)合葉酸 化合物受體(即選擇標(biāo)記基因)的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體特別地被定義為能單向輸入或攝取 葉酸化合物到真核細(xì)胞中的功能性膜結(jié)合受體。根據(jù)本發(fā)明的葉酸化合物可以是氧化型葉酸化合物(即葉酸)或還原型葉酸化合 物。一般而言，任何葉酸化合物均可用于本發(fā)明中，只要該葉酸化合物能通過功能性膜結(jié)合 葉酸化合物受體攝取到真核細(xì)胞中。優(yōu)選的氧化型葉酸化合物的實(shí)例是葉酸。優(yōu)選的還原 型葉酸化合物的實(shí)例是5-甲基-四氫葉酸、5-甲?；?四氫葉酸、10-甲?；?四氫葉酸 和5，10-亞甲基-四氫葉酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體能在真核細(xì)胞中表達(dá)功能性膜結(jié)合葉酸 化合物受體和目的產(chǎn)物兩者。由第二多核苷酸編碼的目的產(chǎn)物可以是能通過第二多核苷酸所編碼的遺傳信息 的轉(zhuǎn)錄、翻譯、或任何其他表達(dá)事件產(chǎn)生的任何生物學(xué)產(chǎn)物。在這點(diǎn)上，該產(chǎn)物是表達(dá)產(chǎn)物。 例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該產(chǎn)物選自多肽、RNA和DNA?！岸嚯摹笔侵赴ㄓ呻逆I連在一起 的氨基酸聚合物的分子。術(shù)語“多肽”包括任何長度的多肽，在較大分子(包括例如約50個(gè) 以上氨基酸)的情況下可稱為“蛋白質(zhì)”或者在較小分子(包括例如2-49個(gè)氨基酸)的情 況下可稱為“肽”。產(chǎn)物可以是具有藥學(xué)活性或治療活性的化合物，或者可以是用于分析試 驗(yàn)等的研究工具。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該產(chǎn)物是多肽，優(yōu)選藥學(xué)上或治療上活性的多 肽，或者是用于診斷或其它分析試驗(yàn)等的研究工具。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多肽是免疫 球蛋白分子或抗體，或其片段(特別是功能性片段)，例如嵌合體，或部分或完全人源化的 抗體?？贵w可以是診斷抗體，或藥學(xué)上或治療上活性的抗體。通常，目的產(chǎn)物與用于表達(dá)的 真核宿主細(xì)胞異源，這意味著宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前不會(huì)天然地或內(nèi)源地產(chǎn)生目的產(chǎn)物。相 反地，為了實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的生產(chǎn)或表達(dá)，必須將編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸，特別地通過用根 據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，引入到真核宿主細(xì)胞中。根據(jù)本發(fā)明的載體可以以線性形式、或者優(yōu)選地以環(huán)狀形式例如質(zhì)粒存在。用于表達(dá)目的多核苷酸的載體通常包含適于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制元件，例如啟動(dòng) 子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化信號(hào)、轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)或終止信號(hào)。如果所需產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，適宜的轉(zhuǎn) 錄控制元件通常包括在載體中，例如5’非翻譯區(qū)(導(dǎo)致適于募集核糖體的5’帽結(jié)構(gòu))和 終止密碼子(以終止翻譯進(jìn)程)。特別地，用作選擇標(biāo)記基因的多核苷酸以及編碼目的產(chǎn)物 的多核苷酸在存在于適宜啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄元件的控制下轉(zhuǎn)錄。所得的選擇標(biāo)記基因和目的 產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄物包含利于實(shí)質(zhì)性水平的蛋白質(zhì)表達(dá)(即翻譯)的功能性翻譯元件。因此，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體，其中第一多核苷酸和第 二多核苷酸在分開的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下。一般地，能引起第一和/或第二多核苷酸在真 核細(xì)胞中表達(dá)(尤其是轉(zhuǎn)錄)的啟動(dòng)子是合適的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分開的轉(zhuǎn) 錄啟動(dòng)子是相同的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分開的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是不同的。優(yōu)選 地，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子選自SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、EFl α啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、BR0AD3啟動(dòng)子、鼠 rosa 26啟動(dòng)子、pCEFL啟動(dòng)子和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。在其一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，控制 第一多核苷酸和/或第二多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子，或最優(yōu)選是SV40啟動(dòng)子。 在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，控制第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子。在本發(fā)明表達(dá)載體的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一多核苷酸和第二多核苷酸在 共同轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下。優(yōu)選地，該轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子選自SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、BR0AD3啟動(dòng)子、鼠rosa 26啟動(dòng)子、pCEFL啟動(dòng)子和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。在其更優(yōu)選 的實(shí)施方案中，該共同轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子。具有共同轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的表達(dá)載體的一個(gè) 更優(yōu)選的實(shí)施方案包括功能性地位于第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的IRES元件。借助于本發(fā)明的表達(dá)載體引入到真核宿主細(xì)胞中的膜結(jié)合葉酸化合物受體可以 來源于任何物種，只要它在本發(fā)明內(nèi)是功能性的，即與所用的真核細(xì)胞相容即可。優(yōu)選地， 使用來源于哺乳動(dòng)物物種的葉酸化合物受體，例如來源于嚙齒類動(dòng)物的葉酸化合物受體， 或最優(yōu)選地人葉酸化合物受體。一般地，引入到真核宿主細(xì)胞中且用作選擇標(biāo)記的該葉酸 化合物受體可以與宿主細(xì)胞的內(nèi)源性葉酸化合物受體同源或異源。如果是同源的，它來源 于與宿主細(xì)胞相同的物種，且可以例如與宿主細(xì)胞的內(nèi)源性葉酸化合物受體相同。如果是 異源的，它來源于與宿主細(xì)胞不同的另一物種，因此可不同于宿主細(xì)胞的內(nèi)源性葉酸化合 物受體。通常，用作選擇標(biāo)記的引入的葉酸化合物受體與宿主細(xì)胞異源。例如人源性葉酸 化合物受體可作為選擇標(biāo)記用于嚙齒類動(dòng)物宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞。優(yōu)選地，由本發(fā)明表達(dá)載體的第一多核苷酸編碼的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體 選自葉酸化合物受體α (FRa )、葉酸化合物受體β (FRi3)及其功能突變體。功能突變體包 括以生理學(xué)方式起作用的(即能被真核細(xì)胞攝取并通過細(xì)胞的葉酸化合物代謝對(duì)細(xì)胞存 活作出貢獻(xiàn)的)葉酸化合物受體衍生物。例如，葉酸化合物受體的突變體形式可以包括一 個(gè)或多個(gè)氨基酸突變，如置換、缺失和/或添加、以及化學(xué)衍生物，其中化學(xué)部分如聚合物 (例如聚乙二醇結(jié)構(gòu)(PEG))連接于葉酸化合物受體。優(yōu)選地，由第一多核苷酸編碼的葉酸 化合物受體是人葉酸化合物受體a (hFR α)、人葉酸化合物受體β (hFRa)或其功能突變 體。最優(yōu)選的是人葉酸化合物受體a (hFRa )，優(yōu)選具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO 1,1 字母代碼，按N-端至C-端的方向顯示)MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQ
QVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQffffEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPffAAffPFLLSLALMLLffLLS另一優(yōu)選的實(shí)施方案涉及具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO 2，1_字母代碼，按 N-端至C-端的方向顯示)的人葉酸化合物受體β (hFRi3)MVWKWMPLLLLLVCVATMCSAQDRTDLLNVCMDAKHHKTKPGPEDKLHDQCSPWKKNACCTASTSQELHKDTSRLYNFNWDHCGKMEPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVNQTWRKERFLDVPLCKEDCQRffffEDCHTSHTCKSNWHRGWDffTSGVNKCPAGALCRTFESYFPTPAALCEGLWSHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDSAQGNPNEEVARFYAAAMHVNAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLffLLG在一個(gè)備選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在其自然環(huán)境中不是膜結(jié)合的葉酸化合物受 體。這種非膜結(jié)合受體可突變成為膜結(jié)合的，例如通過提供該非膜結(jié)合葉酸化合物受體與 另一多肽的跨膜區(qū)之間的融合蛋白。同樣地，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說容易可得的其它突 變形式也是可以的。在這點(diǎn)上，優(yōu)選的例子基于可溶性葉酸化合物受體Y (FRY)，優(yōu)選人 可溶性葉酸化合物受體Y (FRY)。在其最優(yōu)選的實(shí)施方案中，人可溶性葉酸化合物受體 Y (FRy)具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO 3，1-字母代碼，按N-端至C-端的方向顯示)
MDMAffQMMQL LLLALVTAAG SAQPRSARAR TDLLNVCMNA KHHKTQPSPEDELYGQCSPff KKNACCTAST SQELHKDTSR LYNFNWDHCG KMEPTCKRHFIQDSCLYECS PNLGPffIRQV NQSffRKERIL NVPLCKEDCE RffffEDCRTSYTCKSNWHKGff NWTSGINECP AGALCSTFES YFPTPAALCE GLffSHSFKVSNYSRGSGRCI QMWFDSAQGN PNEEVAKFYA AAMNAGAPSR GIIDS然后其可以被突變或者被遺傳改變或衍生化以形成能在本發(fā)明中實(shí)現(xiàn)葉酸化合 物攝取的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。在另一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)載體還可包括編碼一個(gè)或多個(gè)另外的選擇標(biāo)記 的一個(gè)或多個(gè)其它的多核苷酸。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以通過利用本發(fā)明的葉 酸化合物系統(tǒng)以及一種或多種不同的選擇系統(tǒng)(例如neoAMIS)的共選擇，提供最佳的性 能。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，其中 該真核細(xì)胞中已穩(wěn)定地引入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第 一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和 所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。在其優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體和所述目的產(chǎn)物被所述真核細(xì)胞表達(dá)。除通過表達(dá)載體引入到細(xì)胞系中的功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體之外，根據(jù)本發(fā) 明的真核細(xì)胞還可以包括至少一種內(nèi)源功能性單向葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，特別是一種或多 種內(nèi)源功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，即使存在該內(nèi)源功能性單 向葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(即在保持該內(nèi)源系統(tǒng)的情況下)，也可以利用下文所描述的選擇 方法。因此，一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及本發(fā)明的真核細(xì)胞，其包括至少一種內(nèi)源性單向功 能性葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其中該內(nèi)源性單向功能性葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)優(yōu)選包括至少一 種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。在其優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)源性功能性膜結(jié) 合葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體α (FRa)和葉酸化合物受體β (FRi3)。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞，其中所述內(nèi)源性單向功能性 葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(例如，包括至少例如一種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體)缺 乏完全活性，即是衰減的?？梢岳缤ㄟ^目的內(nèi)源性葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(例如內(nèi)源性功 能性膜結(jié)合葉酸化合物受體)的任何類型誘變，例如點(diǎn)突變、基因中斷等，提供這種衰減。 衰減可以是部分的或完全的。在后一情況下，根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞不包括內(nèi)源性功能性 單向葉酸化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，例如內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體。因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu) 選的實(shí)施方案涉及已穩(wěn)定地引入了本發(fā)明的表達(dá)載體的真核細(xì)胞，所述細(xì)胞缺乏至少一種 內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的完全活性。就引入到所述宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體而言，可以利用如本文所述的任何本發(fā)明表 達(dá)載體(包括其優(yōu)選的實(shí)施方案)。在本發(fā)明真核細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼功能性 膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸位于同一表達(dá)載 體上。優(yōu)選地，該表達(dá)載體是根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所述)的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞優(yōu)選選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞。 就真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞而言，其對(duì)于葉酸化合物通常是原養(yǎng)型的(即，這種細(xì)胞可自主地 合成對(duì)其細(xì)胞生存力，即細(xì)胞生長和增殖，所必需的自身葉酸化合物)。本發(fā)明特別包括可以變成葉酸化合物營養(yǎng)缺陷型的此類真菌和植物細(xì)胞。這可以例如通過基因操作實(shí)現(xiàn)，即， 細(xì)胞目前不能合成對(duì)其細(xì)胞生存所必需的足量葉酸化合物。例如，可以通過諸如適當(dāng)靶基 因的基因破壞或基因沉默、或者關(guān)鍵酶的抑制等，失活該真菌或植物細(xì)胞(例如通過適當(dāng) 的代謝途徑)內(nèi)源性地生物合成葉酸化合物的能力。在其優(yōu)選的實(shí)施方案中，該真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，該哺乳動(dòng)物細(xì)胞選 自嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞和猴細(xì)胞。特別優(yōu)選的是嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選選自CHO細(xì)胞、 BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、小鼠3T3成纖維細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。最特別優(yōu)選的嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是 CHO細(xì)胞。還優(yōu)選的是人細(xì)胞，優(yōu)選選自HEK293細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、PerC6細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。 再優(yōu)選為猴細(xì)胞，優(yōu)選選自COS-I、C0S-7細(xì)胞和Vero細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及制備根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞的方法，所述方法 包括提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，和引入位于表達(dá)載體上且編碼功 能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多 核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表 達(dá)載體上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載 體上，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該表達(dá)載體是根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所述)的表達(dá)載體。本發(fā)明的再其它方面涉及用于選擇真核細(xì)胞的方法，其中該真核細(xì)胞能穩(wěn)定地表 達(dá)由已引入到該細(xì)胞中的表達(dá)載體編碼的目的產(chǎn)物，所述方法包括(i)提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的多個(gè)真核細(xì)胞，其中在所述細(xì)胞中 已經(jīng)引入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于 表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸 位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上，(ii)在具有限制性濃度的葉酸化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多個(gè)真核細(xì)胞，由 此獲得穩(wěn)定表達(dá)目的產(chǎn)物的真核細(xì)胞。原則上，該葉酸化合物可以是氧化型葉酸化合物或 還原型葉酸化合物。優(yōu)選的是氧化型葉酸化合物，特別是葉酸。就限制量的葉酸化合物而言，培養(yǎng)基中的適宜濃度可依照宿主細(xì)胞的要求以及 待用的選擇條件的嚴(yán)緊性，由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在葉酸用作該葉酸化合物的情況 下，例如對(duì)于CHO宿主細(xì)胞，用于嚴(yán)緊性選擇方法的細(xì)胞培養(yǎng)基中適宜的葉酸濃度約為 IOOnM或更低，優(yōu)選約30nM或更低，或者約IOnM或更低。例如，適宜的葉酸濃度可以是在 0. OOlnM-IOOnM的范圍、優(yōu)選在0. OlnM-IOOnM的范圍、更優(yōu)選在0. InM-IOOnM的范圍或在 InM-IOOnM的范圍內(nèi)的任何值。同樣地，優(yōu)選0. 001nM_30nM的范圍、0. 01nM_30nM的范圍、 0. 1ηΜ-30ηΜ的范圍、1ηΜ-30ηΜ的范圍或3nM-10nM的范圍。例如，適于選擇的細(xì)胞培養(yǎng)基中 的葉酸濃度可以是1ηΜ、3ηΜ、10ηΜ或30nM。在還原型葉酸化合物如甲酰四氫葉酸用于選擇方法時(shí)，其濃度也可依照宿主細(xì)胞 的要求以及待用的選擇條件的嚴(yán)緊性，由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。對(duì)于嚴(yán)緊性選擇方法，細(xì)胞 培養(yǎng)基中的甲酰四氫葉酸濃度可以為例如0. 2nM-2nM。在其進(jìn)一步的實(shí)施方案中，選擇方法還包括鑒定和分離實(shí)現(xiàn)了目的產(chǎn)物的穩(wěn)定表 達(dá)的真核細(xì)胞。在選擇方法的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該多個(gè)真核細(xì)胞由根據(jù)本發(fā)明(S卩，如 本文所公開)的真核細(xì)胞組成。
本發(fā)明此方面的其它優(yōu)選實(shí)施方案如本文所述，特別是就真核細(xì)胞和表達(dá)載體所 描述的。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法，其包括(i)實(shí)施根據(jù)本發(fā)明(即，如本文所公開)的選擇方法，(ii)從所述細(xì)胞培養(yǎng)基或所述細(xì)胞分離目的產(chǎn)物。本發(fā)明此方面的優(yōu)選實(shí)施方案也如本文所述，特別是就真核細(xì)胞和表達(dá)載體所描 述的。依照本發(fā)明產(chǎn)生的目的產(chǎn)物例如多肽可以通過本領(lǐng)域已知方法回收、進(jìn)一步純化 和分離。例如，多肽可通過常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離 心。過濾、超濾、提取或沉淀。純化可通過多種本領(lǐng)域已知的方法來進(jìn)行，所述方法包括但 不限于色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、色譜聚焦和大小排阻色譜 法)、電泳方法(例如制備型等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)或提取。本發(fā)明的其它方面涉及功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體作為選擇標(biāo)記用于選擇真 核細(xì)胞的用途，其中該真核細(xì)胞的細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取且該真核細(xì)胞能穩(wěn) 定地表達(dá)目的產(chǎn)物。在該用途的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葉酸化合物受體選自葉酸 化合物受體α (FRa)、葉酸化合物受體β (FRi3)及其功能突變體。優(yōu)選地，在本發(fā)明的 這個(gè)方面中利用的葉酸化合物受體是相應(yīng)的人葉酸化合物受體，優(yōu)選人葉酸化合物受體 α (FRa)0本發(fā)明的這個(gè)方面的其它優(yōu)選的實(shí)施方案如本文所述，特別是就真核細(xì)胞和表 達(dá)載體所描述的。本文所提及的科教書和文件的全部內(nèi)容通過弓I用并入本文。下述實(shí)施例用來舉例說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。具體來說， 這些實(shí)施例涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
實(shí)施例一般地，此處提及的材料如試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，市售可得，并且可依照 制造商的說明書來使用。實(shí)施例1 利用基于葉酸化合物_受體的選擇系統(tǒng)來高水平表達(dá)重組抗體實(shí)施例1. 1 表達(dá)載體適于在真核細(xì)胞(特別是CHO細(xì)胞)中表達(dá)的質(zhì)粒載體(即試驗(yàn)載體)包含(i) 包括編碼IgGl型分泌重組人抗體的重鏈和輕鏈的多核苷酸的表達(dá)盒；和(ii)包括作為選 擇標(biāo)記基因的編碼人葉酸受體a (hFRa)的多核苷酸的不同表達(dá)盒，所述質(zhì)粒載體被構(gòu)建 以研究在培養(yǎng)基中限制性濃度的葉酸化合物(即葉酸)下選擇hFRa-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的效率。 人葉酸受體a (hFRa)的表達(dá)在SV40啟動(dòng)子和標(biāo)準(zhǔn)(SV40)多腺苷酸化信號(hào)的控制下。重 組抗體的表達(dá)在CMV啟動(dòng)子和標(biāo)準(zhǔn)(SV40)多腺苷酸化信號(hào)的控制下。作為對(duì)照(即對(duì)照 載體)，使用類似的表達(dá)載體，其編碼相同的抗體，缺乏hFRa表達(dá)盒，但含有新霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶基因作為選擇標(biāo)記。實(shí)施例1. 2 細(xì)胞和生長條件在含有2.3yM(micr0M)葉酸的適宜的化學(xué)成分確知生長培養(yǎng)基中、在懸浮培養(yǎng) 條件下維持源自菌株CHO-Kl的中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
為了分析細(xì)胞存活對(duì)葉酸的依賴性，使用2300nM至0. InM的葉酸濃度進(jìn)行葉酸饑 餓實(shí)驗(yàn)。在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，分析細(xì)胞生存力以定量存活細(xì)胞的百分比。表1總結(jié)了 用上述的CHO-Kl細(xì)胞系所獲得的結(jié)果。表1 在不同葉酸濃度下CHO細(xì)胞的存活 這些結(jié)果顯示，對(duì)于這種特定的宿主細(xì)胞系，就基于葉酸受體選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì) 胞而言，低于ΙΟΟηΜ、優(yōu)選低于30nM的葉酸濃度應(yīng)適于產(chǎn)生顯著的選擇壓力。實(shí)施例1. 3 轉(zhuǎn)染和詵擇用含有hFRa表達(dá)盒的試驗(yàn)載體或缺少hFR α的對(duì)照載體，通過電穿孔轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 隨后在125ml搖瓶中、在補(bǔ)充有適宜濃度的谷氨酰胺和2. 3yM(micr0M)葉酸的培養(yǎng)基中、 在懸浮培養(yǎng)條件下生長轉(zhuǎn)染子細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，對(duì)于試驗(yàn)載體轉(zhuǎn)染的樣品，將細(xì)胞轉(zhuǎn) 移至含有限制量的葉酸，即IOnM或InM葉酸的培養(yǎng)基中，在24孔板中起始根據(jù)本發(fā)明的選 擇方法。此外，用對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過向含有2.3yM(micr0M)葉酸(即對(duì)照1)的培 養(yǎng)基中加入選擇劑，即0.8mg/mL G418，來選擇，或者在缺少任何選擇(即對(duì)照2)的情況下 培養(yǎng)該細(xì)胞。將從該選擇方案成功回收的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至6孔板，并在搖瓶中進(jìn)一步擴(kuò)增以用 于分析抗體生產(chǎn)水平。實(shí)施例1. 4 分析抗體的牛產(chǎn)從轉(zhuǎn)染子和葉酸剝奪的細(xì)胞群，制備在搖瓶中過度匯合的(overconfluent)分批 培養(yǎng)物，以分析抗體表達(dá)水平。將細(xì)胞以2xl05細(xì)胞/mL接種在含有2.3yM(micr0M)葉酸 的培養(yǎng)基中，并在懸浮培養(yǎng)(即搖床)條件下孵育。在第14天，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液， 并使用蛋白A HPLC法(即親合純化)分析抗體水平。IgG分子主要通過其Fc-部特異地與 柱子結(jié)合，而其它蛋白通過柱子與基質(zhì)無相互作用。在低PH條件下，從柱子中洗脫捕獲的IgG蛋白，通過UV吸收測(cè)量來定量，并在需要時(shí)，進(jìn)一步純化和分離。實(shí)施例1.5 結(jié)果本方法的目的在于提供下述觀點(diǎn)的證據(jù)葉酸化合物基因，特別是hFRa基因，可 在葉酸化合物剝奪的條件下用作選擇標(biāo)記，由此選擇共_過表達(dá)目的產(chǎn)物例如單克隆抗體 的細(xì)胞。作為對(duì)照，也使用含有新霉素耐藥性基因作為選擇標(biāo)記的載體。轉(zhuǎn)染后，通過使培 養(yǎng)基中的葉酸濃度從2. 3 yM(microM)突然降至IOnM或InM，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行嚴(yán)緊性選擇。用包 含葉酸受體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在葉酸化合物剝奪的條件下容易恢復(fù)，并可在選擇培養(yǎng)基中 進(jìn)一步擴(kuò)增。相對(duì)地，在對(duì)照載體的情況下，葉酸濃度保持不變，但是施加使用G418的選擇 壓力或根本未施加選擇壓力。然后使用在含有2.3yM(micr0M)葉酸的培養(yǎng)基中過度生長 (即過度匯合)的懸浮(即搖瓶)培養(yǎng)物來分析所選擇的細(xì)胞群的抗體生產(chǎn)。然后在第14 天測(cè)定培養(yǎng)基中的抗體濃度。如下表2所示，轉(zhuǎn)染了含有葉酸受體的質(zhì)粒且通過減少的葉 酸可用量選擇的細(xì)胞過表達(dá)重組抗體。與用對(duì)照載體轉(zhuǎn)染且用G418選擇的細(xì)胞相比，由這 些轉(zhuǎn)染子細(xì)胞群產(chǎn)生的抗體的量更高。作為另一對(duì)照，當(dāng)未應(yīng)用選擇壓力時(shí)，獲得不產(chǎn)生抗 體的細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)為下述觀點(diǎn)提供了證據(jù)目前的葉酸受體基因方法可容易地作為獨(dú)立 運(yùn)作的顯性代謝選擇標(biāo)記使用以快速建立過表達(dá)重組目的產(chǎn)物的細(xì)胞。(C^ig 選擇期間培養(yǎng)基中葉酸的濃度；Ce418 選擇期間培養(yǎng)基中G418的濃 度；CmAb 過度生長培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中分泌抗體的濃度) 實(shí)施例2 重組抗體生產(chǎn)水平隨著生長培養(yǎng)基中葉酸濃度的下降而增加實(shí)施例2. 1 表達(dá)載體提供如上文實(shí)施例1. 1中所述的質(zhì)粒載體(即試驗(yàn)載體)。實(shí)施例2. 2 細(xì)胞和生長條件在含有2. SyMOiiicroM)葉酸的化學(xué)成分確知生長培養(yǎng)基RPMI-1640中、在單層 培養(yǎng)條件下維持源自菌株CHO-Kl的中國倉鼠卵巢細(xì)胞。如在其它地方(Assaraf，Y. G.和 Schimke, R. T. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84, 7154-7158 ；Rothem, L.等人，Mol. Pharmacol. 68 =616-624)公開，該細(xì)胞缺乏RFC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。該RFC缺陷型細(xì)胞在本實(shí) 施例中使用，以避免因此另外的載體系統(tǒng)而導(dǎo)致的對(duì)該葉酸饑餓的潛在規(guī)避。實(shí)施例2. 3 轉(zhuǎn)染和選擇通過電穿孔用試驗(yàn)載體轉(zhuǎn)染RFC缺陷型C15細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，細(xì)胞在補(bǔ)充有 30nM葉酸的無葉酸培養(yǎng)基中增殖以便促進(jìn)選擇標(biāo)記以及重組抗體的表達(dá)，隨后進(jìn)行稀釋克隆。將細(xì)胞稀釋至5細(xì)胞/ml的最終密度，并以100 μ 1/孔接種在96孔板中(即0. 5細(xì)胞 /孔)。然后將克隆維持在含有0. 25ηΜ葉酸和500 μ g/ml G418的培養(yǎng)基中。通過利用本 發(fā)明葉酸化合物系統(tǒng)以及額外的選擇系統(tǒng)(即neo/G418)的共選擇，導(dǎo)致最佳性能的選擇 方法。然后在低葉酸濃度(即1200pM、600pM和60pM)下生長具有最高抗體生產(chǎn)水平的克 隆，以進(jìn)一步支持和建立抗體過表達(dá)。這通過進(jìn)一步分析多個(gè)克隆中的抗體表達(dá)來確證。實(shí)施例2. 4 分析抗體的牛產(chǎn)根據(jù)如上文實(shí)施例1. 4中所述的原理進(jìn)行抗體生產(chǎn)的分析。如下使用ELISA試驗(yàn) 來監(jiān)控分泌抗體的濃度=Maxis0rp微量板用抗-人IgG包被。用含有牛血清白蛋白(BSA)的 緩沖液封閉并進(jìn)行數(shù)次洗滌后，加入分泌抗體樣品的多個(gè)稀釋物。然后，加入由山羊抗-人 IgG-過氧化物酶組成的過氧化物酶綴合的第二抗體。最后，加入比色的過氧化物酶底物，接 著用分光光度法測(cè)定每孔中所得的染料濃度，然后與已知IgG濃度的標(biāo)準(zhǔn)濃度相比較。2. 5 結(jié)果如下表3所示，重組抗體的生產(chǎn)水平與葉酸剝奪的嚴(yán)緊性相關(guān)。因此，當(dāng)培養(yǎng)基中 的葉酸濃度下降時(shí)，抗體生產(chǎn)水平增加。這些結(jié)果進(jìn)一步鞏固了下述觀點(diǎn)的證據(jù)hFRa基 因是有效的選擇標(biāo)記，其可用于在葉酸化合物剝奪的條件下過表達(dá)重組蛋白。 (C_ 培養(yǎng)基中葉酸的濃度；培養(yǎng)基中分泌抗體的濃度)
權(quán)利要求
一種真核生物表達(dá)載體，其包括編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的真核生物表達(dá)載體，其中所述目的產(chǎn)物選自多肽、RNA和DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的真核生物表達(dá)載體，其中所述目的產(chǎn)物是多肽。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷 酸是在分開的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是相同的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的表達(dá)載體，其中所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是不同的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中控制第一多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子是 SV40啟動(dòng)子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核 苷酸是在共同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的表達(dá)載體，其中所述共同轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中所述載體包括功能性地位于所述第 一多核苷酸和所述第二多核苷酸之間的IRES元件。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，其中所述由第一多核苷酸編碼的功能性 膜結(jié)合葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體α (FRa)、葉酸化合物受體β (FRβ)及其功 能突變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其中所述由第一多核苷酸編碼的功能性膜結(jié)合葉酸 化合物受體是人葉酸化合物受體α (hFRa)。
13.細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，其中該真核細(xì)胞中已經(jīng)穩(wěn)定地引 入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載 體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同 一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞缺乏至少一種內(nèi)源性功能性膜結(jié)合葉 酸化合物受體的完全活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的真核細(xì)胞，其中所述編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的 第一多核苷酸和所述編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體如權(quán)利要求1至 12中任一項(xiàng)所定義。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的真核細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的真核細(xì)胞，其中所述嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
20.制備根據(jù)權(quán)利要求13至19中任一項(xiàng)的真核細(xì)胞的方法，所述方法包括提供細(xì)胞生 存力依賴于葉酸化合物攝取的真核細(xì)胞，和引入位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸 化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述 第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同一表 達(dá)載體上。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述表達(dá)載體如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所定義。
23.用于選擇真核細(xì)胞的方法，其中所述真核細(xì)胞能夠穩(wěn)定地表達(dá)由已經(jīng)引入到該細(xì) 胞中的表達(dá)載體編碼的目的產(chǎn)物，所述方法包括(i)提供細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取的多個(gè)真核細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中已經(jīng)引 入了位于表達(dá)載體上且編碼功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體的第一多核苷酸和位于表達(dá)載 體上且編碼目的產(chǎn)物的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸位于同 一表達(dá)載體上或位于分開的表達(dá)載體上，( )在具有限制性濃度的葉酸化合物的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多個(gè)真核細(xì)胞，由此獲 得實(shí)現(xiàn)所述目的產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)的真核細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，還包括鑒定和分離實(shí)現(xiàn)所述目的產(chǎn)物的穩(wěn)定表達(dá)的真核 細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的方法，其中所述多個(gè)真核細(xì)胞由如權(quán)利要求13至19中任 一項(xiàng)所定義的真核細(xì)胞組成。
26.生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法，其包括(i)實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)的選擇方法，( )從所述細(xì)胞培養(yǎng)基或從所述細(xì)胞分離所述目的產(chǎn)物。
27.功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體作為選擇標(biāo)記用于選擇真核細(xì)胞的用途，其中所述 真核細(xì)胞的細(xì)胞生存力依賴于葉酸化合物攝取且該真核細(xì)胞能穩(wěn)定地表達(dá)目的產(chǎn)物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用途，其中所述葉酸化合物受體選自葉酸化合物受體 α (FRα)、葉酸化合物受體β (FRβ)及其功能突變體。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中所述葉酸化合物受體是人葉酸化合物受體 α (hFR α )。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于真核細(xì)胞培養(yǎng)方法和用于表達(dá)重組目的產(chǎn)物的新選擇系統(tǒng)。該選擇系統(tǒng)基于引入外源性功能性膜結(jié)合葉酸化合物受體基因以及編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸或基因到真核細(xì)胞中，并且該選擇系統(tǒng)可廣泛用于細(xì)胞生存力依賴于葉酸攝取的真核細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/85GK101903526SQ200880122105
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者H-P·科諾普夫, T·約斯多克, Y·G·阿薩拉弗 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司