專利名稱：培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及微生物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。發(fā)明了 一種破囊壺菌 (Thraustochytriales)目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基及破囊壺菌目微生物的培養(yǎng)方法，特別地 用于生產(chǎn)ω-3脂肪酸。此外，發(fā)明了使用酒石酸銨作為氮源來培養(yǎng)破囊壺菌目微生物 (Thraustochytriidea)0
背景技術(shù)：
本發(fā)明披露了通過改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)基提高在破囊壺菌目微生物生物量中的PUFA總 量的方法，特別是提高ω-3 二十二碳六烯酸(DHA)總量的方法。當(dāng)特殊的鹽，尤其是酒石 酸銨，存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中時(shí)，生物量中的DHA量提高。由于不僅提高了 DHA總量，而且提 高了脂質(zhì)總量，簡化了這些產(chǎn)物的生產(chǎn)過程，從而獲得更高的DHA收率。目前，有多種不同的培養(yǎng)破囊壺菌目海洋微生物(尤其是屬于Ulkenia種的微生 物)的細(xì)胞培養(yǎng)基。EP 0935667記載了在含有磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸鈉和不同氯化物的 培養(yǎng)基中培養(yǎng)Ulkenia細(xì)胞。US2007/0141686A1記載了培養(yǎng)破囊壺菌的方法，其中細(xì)胞培 養(yǎng)基是使用碳酸鈣PH穩(wěn)定的。US2007/0054384A1記載了不添加鈉鹽和鹽酸鹽的低鹽培養(yǎng) 基中培養(yǎng)破囊壺菌的方法。US6，410，281B1記載了使用含非含氯鈉鹽(特別是硫酸鈉)的 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)破囊壺菌的方法。已知，屬于破囊壺菌(Thraustochytriidea)目和(尤其是)屬于Ulkenia屬的微 生物用來生產(chǎn)含ω-3 二十二碳六烯酸(亦已知為DHA)和/或ω-3 二十二碳五烯酸(亦 已知為DPA)的脂質(zhì)。不同的多不飽和脂肪酸(PUFA)和(尤其是)ω-3脂肪酸是已知的人體營養(yǎng)和有 益的食品添加劑的主要成分。例如，已知，PUFA能降低血清中甘油三脂濃度，由此作為降脂 劑使用。DHA和DPA均是用做食品添加劑的多不飽和脂肪酸。目前通過培養(yǎng)Ulkenia來生產(chǎn)DHA和/或DPA的方法會(huì)引起令人不滿意的脂質(zhì)產(chǎn) 率，尤其是較低的DHA和/或DPA的產(chǎn)率或包括復(fù)雜的生產(chǎn)步驟。仍存在改善培養(yǎng)破囊壺 菌目微生物的方法需求。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的就是發(fā)明一種新的簡單且經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)破囊壺菌目微生物 的方法，以提高PUFA的產(chǎn)量。本發(fā)明的一個(gè)目的是避免現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是發(fā)明一種不同 的提高PUFA產(chǎn)率的方法，尤其是在破囊壺菌細(xì)胞培養(yǎng)中提高DHA和/或DPA的產(chǎn)率的方法。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是發(fā)明一種不同的生產(chǎn)高純度PUFA (尤其是DHA和/或DPA)的方法。根據(jù)本發(fā)明的主張的主題，將解決上述這些目的和其他的目的(其未予以明確地 敘述，但通過本說明書的上下文也披露給本領(lǐng)域技術(shù)人員)。
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通過提供主張的方法、細(xì)胞培養(yǎng)基、使用硫酸銨和制品，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到 的技術(shù)問題。本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問題，特別是通過提供一種培養(yǎng)破囊壺菌目微生 物的方法解決了技術(shù)問題，該方法包括步驟a)轉(zhuǎn)移微生物至細(xì)胞培養(yǎng)基中；b)在細(xì)胞培 養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中細(xì)胞培養(yǎng)基不包含硫酸銨。在一種優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含至少一種不是硫酸銨的銨 鹽。在一種優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨。在一種優(yōu)選的本發(fā)明 的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨而不包含硫酸銨。此外，通過提供一種培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的方法(該方法包括步驟a)轉(zhuǎn)移微 生物至細(xì)胞培養(yǎng)基中；b)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中細(xì)胞培養(yǎng)基不包含硫酸銨但包 含酒石酸銨)，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問題。此外，通過提供一種培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的方法(該方法包括步驟a)轉(zhuǎn)移微 生物至細(xì)胞培養(yǎng)基中；b)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨)，本 發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問題。在一種上述方法的特別地優(yōu)選的實(shí)施方式中，預(yù)知后續(xù)步驟d)以從培養(yǎng)基或微 生物中收獲，尤其是分離多不飽和脂肪酸，特別是DHA和/或DPA。此外，通過提供一種生產(chǎn)至少一種多不飽和脂肪酸的方法(該方法包括步驟a) 轉(zhuǎn)移破囊壺菌目微生物至細(xì)胞培養(yǎng)基中；b)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物；和c)從微生物和 /或細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲所述的多不飽和脂肪酸，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨)，本發(fā)明解 決了本發(fā)明提到的技術(shù)問題。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，多不飽和脂肪酸是從微生物和/或細(xì)胞培養(yǎng)物中以 包含各種脂質(zhì)的油的形式收獲的。根據(jù)本發(fā)明，脂肪酸是一種脂肪族的一元羧酸。脂質(zhì)是包含連同有關(guān)的磷脂、醇、 乙醇、烴、酮和有關(guān)化合物的脂肪酸甘油酯脂類的脂肪或油。根據(jù)本發(fā)明，多不飽和脂肪酸(PUFA)為鏈長大于C12的包含至少2個(gè)雙鍵的多不 飽和的長鏈脂肪酸?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的PUFA優(yōu)選為n-3脂肪酸和n-6脂肪酸， 更優(yōu)選n-3脂肪酸。從本發(fā)明的意義上說，n-3脂肪酸(ω-3脂肪酸)為鏈長大于C12的包含至少2個(gè) 雙鍵的多不飽和脂肪酸。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在進(jìn)一步步驟d)中從其他脂質(zhì)中分離出至 少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種多不飽和脂肪酸(PUFA)為高純度 的 PUFA。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂肪酸包含ω-3-二十二碳六烯酸 (DHA)和/或ω-3-二十二碳五烯酸(DPA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和 脂肪酸包含ω-3-二十二碳六烯酸(DHA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂 肪酸包含ω-3-二十二碳五烯酸(DPA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂肪 酸包含ω-3-二十二碳六烯酸(DHA)和ω-3-二十二碳五烯酸(DPA)。在本發(fā)明的一種優(yōu) 選的實(shí)施方式中，多不飽和脂肪酸為ω-3-二十二碳六烯酸(DHA)和/或ω-3-二十二碳
4五烯酸(DPA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂肪酸為ω-3-二十二碳六烯 酸(DHA)和ω-3-二十二碳五烯酸(DPA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂 肪酸為ω-3-二十二碳六烯酸(DHA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，多不飽和脂肪酸 為ω-3-二十二碳五烯酸(DPA)。本發(fā)明提供意外的啟示為在培養(yǎng)基中使用酒石酸銨以培養(yǎng)破囊壺菌目海洋生物 來生產(chǎn)PUFA，其出乎意料地顯著增加了 DHA量。使用其他氮源，如氯化銨，能增加如脂質(zhì)含 量的量，但另一方面降低了總生產(chǎn)率，進(jìn)而降低了總生物量的量，這樣沒有經(jīng)濟(jì)上的利益。 鑒于此，意外地獲得高DHA和總脂質(zhì)的量的同時(shí)，總生物量仍在常規(guī)的范圍之內(nèi)。不期望本 發(fā)明的在破囊壺菌目微生物中生產(chǎn)PUFA的方法能增加DHA的總含量。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，破囊壺菌目微生物包含至少28 % (重量)，更 優(yōu)選大于28% (重量)，仍更優(yōu)選大于30% (重量)，最優(yōu)選大于31% (重量)ω-3-二十二 碳六烯酸(DHA)(基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中 破囊壺菌目微生物包含至少28% (重量)ω-3-二十二碳六烯酸(DHA)(基于微生物的總 干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中破囊壺菌目微生物包含大于28% (重量)ω-3-二十二碳六烯酸(DHA)(基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施 方式中，在步驟c)中破囊壺菌目微生物包含大于30% (重量)ω-3-二十二碳六烯酸(DHA) (基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中破囊壺菌目微 生物包含大于31% (重量)ω-3- 二十二碳六烯酸(DHA)(基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，破囊壺菌目微生物包含至少60 % (重量)，更 優(yōu)選大于60% (重量)脂質(zhì)(基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式 中，破囊壺菌目微生物包含大于65% (重量)，更優(yōu)選大于70% (重量)脂質(zhì)(基于微生 物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中破囊壺菌目微生物包含至 少60% (重量)脂質(zhì)(基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步 驟c)中破囊壺菌目微生物包含大于60% (重量)脂質(zhì)(基于微生物的總干重)。在本發(fā) 明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中破囊壺菌目微生物包含大于65% (重量)脂質(zhì) (基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟c)中破囊壺菌目微 生物包含大于70% (重量)脂質(zhì)(基于微生物的總干重)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，破囊壺菌目微生物屬于Ulkenia屬。在本 發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，破囊壺菌目微生物屬于Thraustochytrium屬，特別是 Thraustochytrium aureum種或Schizochytrium屬或2者的混合物。在另一種優(yōu)選的實(shí)施 方式中，本發(fā)明方法中使用的微生物為甲藻，如Crypthecodinium，特別是Crypthecodinium cohnii。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，破囊壺菌目微生物屬于Ulkenia sp. SAM 2179 或 Ulkenia sp. SAM 2180。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含硫酸銨。在本發(fā)明的一種 優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含至少0. 6g/升且不大于4. Og/升的硫酸根離子。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基不包含氯化銨。在本發(fā)明的一種 優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含氯化銨。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含氮源。在本發(fā)明的一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含除酒石酸銨外的氮源。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含氮源，氮源選自蛋白胨、酵母 提取液、麥芽浸膏、肉浸出物、絡(luò)蛋白氨基酸、玉米漿、豆餅、谷氨酸鈉、乙酸銨、氯化銨、硝酸 銨及其混合物。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的酒石酸銨用作氮源。在本發(fā) 明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中酒石酸銨為唯一的氮源。在本發(fā)明的一種優(yōu) 選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含的氮源有酒石酸銨和選自乙酸銨、氯化銨、硝酸銨及其混 合物的另一種鹽。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含或不包含天然的或人造的海 水。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基碳源。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí) 施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含碳源，碳源選自葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶淀粉、海 藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、油酸、脂肪，優(yōu)選如大豆脂肪、油、谷氨酸、糖蜜、甘油、甘露醇、乙酸 鈉及其混合物。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基，更優(yōu)選如微量營養(yǎng)素、選自磷酸 氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鎂、氯化鈣、維生素及其混合 物的物質(zhì)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含葡萄糖、玉米漿、磷酸二氫 鉀、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鈉和酒石酸銨。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中碳源的濃度可以為15_250g 每升細(xì)胞培養(yǎng)基。氮源，包括酒石酸銨，的濃度可以為0. 5-13g/升，更優(yōu)選7g每升細(xì)胞培 養(yǎng)基。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基中的酒石酸銨在0. 5-10g每升，優(yōu)選0. 5-7每 升，最優(yōu)選2-7g每升細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu)選情況下，氮源量的增加隨著碳源量的增加而相應(yīng)地 增加。優(yōu)選情況下，氮源的量，尤其是銨鹽，最優(yōu)選酒石酸銨，根據(jù)碳源的量調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含DHA和/或DPA的前體。在 本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含選自十四烷、十六烷、十八烷、油酸、亞油 酸、α-亞油酸及其混合物。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，碳源、氮源、前體等等在培養(yǎng)之前或培養(yǎng)期間 加入至細(xì)胞培養(yǎng)基中。這些成分的加入可以是一次性、重復(fù)地或連續(xù)地。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在微生物培養(yǎng)之前，細(xì)胞培養(yǎng)基的ρΗ值在 3. 0到8. 0之間，更優(yōu)選4. 0到7. 0之間。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物之前，細(xì)胞培養(yǎng) 基是滅菌的，更優(yōu)選高壓滅菌。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間為1-12天， 更優(yōu)選2-10天。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物的溫度為 IO0C -40°c，更優(yōu)選18°C -32°c，仍更優(yōu)選22°C -30°C，最優(yōu)選27°C -29°C。在本發(fā)明的一種 優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物于28°C下在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方 式中，微生物使用通氣攪拌培養(yǎng)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物使用振搖法培 養(yǎng)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，微生物在穩(wěn)定期培養(yǎng)。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選的 實(shí)施方式中，微生物在攪拌釜反應(yīng)器中培養(yǎng)。
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破囊壺菌目微生物優(yōu)選通過接種一種本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基使用預(yù)培養(yǎng)微生物培養(yǎng)。培養(yǎng)可以優(yōu)選地以補(bǔ)料分批模式或連續(xù)地進(jìn)行分批發(fā)酵。合適培養(yǎng)方法對本領(lǐng)域 技術(shù)人員是已知的。通過本發(fā)明描述的培養(yǎng)方法，在破囊壺菌目微生物的細(xì)胞中生產(chǎn)和蓄積了含PUFA 脂質(zhì)，尤其是DHA和/或DPA。如使用的是脂質(zhì)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)期間從培養(yǎng)物或滅菌培養(yǎng)物， 在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)從培養(yǎng)物或滅菌培養(yǎng)物，或者從上述任一種培養(yǎng)物收集的培養(yǎng)細(xì)胞，或干細(xì) 胞中，可以回收含PUFA脂質(zhì)。在此，術(shù)語“培養(yǎng)物”指的是破囊壺菌目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物， 且其包含培養(yǎng)細(xì)胞、干培養(yǎng)細(xì)胞和已處理的培養(yǎng)細(xì)胞以及包含細(xì)胞和培養(yǎng)上清液的培養(yǎng)肉 湯。DHA和/或DPA可以優(yōu)選地從培養(yǎng)細(xì)胞中回收的含有DHA和/或DPA的脂質(zhì)中分 離出來，如下文所述。優(yōu)選情況下，培養(yǎng)后，通過常規(guī)的固體/液體分離手段如離心法和過 濾法從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞。優(yōu)選情況下，細(xì)胞經(jīng)充分水洗，且優(yōu)選情況下，然后予以干燥。優(yōu) 選地通過冷凍干燥、風(fēng)干等等方法干燥細(xì)胞。優(yōu)選情況下，然后破壞干的細(xì)胞，例如，通過球 磨機(jī)或超聲粉碎，然后優(yōu)選地使用有機(jī)溶劑從細(xì)胞中提取脂質(zhì)，更優(yōu)選在氮流下。有機(jī)溶劑 如乙醚、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷或石油醚都是優(yōu)選使用的。使用甲醇和石油醚交 替提取或使用氯仿/甲醇/水的混合溶劑系統(tǒng)提取也是優(yōu)選使用的。減壓條件下通過從提 取物中蒸發(fā)有機(jī)溶劑的方法，可以獲得高濃度的含有DHA和/或DPA的脂質(zhì)。在本發(fā)明的 另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，含DHA和/或DPA的脂質(zhì)可以通過直接的壓榨干或濕細(xì)胞生物 量的方法獲得?；蛘撸崛】梢詢?yōu)選地使用濕細(xì)胞進(jìn)行。該情況下，與水相容的溶劑如甲醇或乙 醇，或者與水相容的由乙醇和水組成的混合溶劑和/或其他溶劑是優(yōu)選使用的。其他的操 作步驟優(yōu)選同上所述。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，PUFA高產(chǎn)率的獲得。在本發(fā)明的一種優(yōu)選 的實(shí)施方式中，PUFA高純度地獲得。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，從微生物中獲得 PUFA。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，從培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得。在本發(fā)明的一 種優(yōu)選的實(shí)施方式中，PUFA從微生物和從培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得。生產(chǎn)的PUFA優(yōu)選是通?？梢灾行灾镜男问将@得和收獲，例如，甘三脂，或極性 脂質(zhì)如卵磷脂、腦磷脂或磷脂酰肌醇。 在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)的PUFA，尤其是DHA和/或DPA，是以中 性脂質(zhì)組分的形式收獲。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，PUFA，尤其是DHA和/或DPA，是以 極性脂質(zhì)組分的形式收獲。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，生產(chǎn)的PUFA，尤其是DHA和/或 DPA，是以總脂質(zhì)組分的形式收獲。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明收獲的油，尤其是含 PUFA的油或其組分，如含有本發(fā)明的PUFA的極性脂質(zhì)組分，總脂質(zhì)組分或中性脂質(zhì)組分， 尤其是DHA或DPA。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語PUFA、n_3脂肪酸或n_3活性物質(zhì)可以理解成所有可能的 形式，其中可以存在相應(yīng)的脂肪酸，例如游離脂肪酸和脂、甘油三脂、磷脂或其他衍生物。所 有這些物質(zhì)都概述于本說明中，且術(shù)語可以同義地使用。此外，PUFA可以優(yōu)選通過化學(xué)或
7生物催化轉(zhuǎn)酯基作用的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)換和濃縮，例如，在合適的酶(優(yōu)選脂肪酶)的幫助下， 在從培養(yǎng)物中分離之前或之后進(jìn)行轉(zhuǎn)換。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常用步驟，從發(fā)酵的微生物或培養(yǎng)基或油中分離PUFA 和分析脂肪酸譜。此外，通過提供一種培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基，本發(fā)明解決了本發(fā)明 提到的技術(shù)問題，其中細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨作為氮源。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基是上述方法的描述的培養(yǎng)基。此外，通過提供酒石酸銨在一種培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基中作為氮源 的用途，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問題。此外，在通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌目微生物生產(chǎn)至少一種多不飽和脂肪 酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中，通過提供酒石酸銨作為氮源的用途，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù) 問題。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，至少一種多不飽和脂肪酸是ω-3- 二十二碳 六烯酸(DHA)和/或ω-3- 二十二碳五烯酸(DPA)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，酒石酸銨用于上述方法中。在本發(fā)明的一種 優(yōu)選的實(shí)施方式中，酒石酸銨用于上述的細(xì)胞培養(yǎng)基中。此外，通過提供含有至少10% (重量)DHA，優(yōu)選至少20% (重量)DHA和最優(yōu)選 至少30% (重量)DHA的使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的油，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問題。 優(yōu)選情況下，油隨后從通過本發(fā)明的方法可獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。此外，通過提供使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的DHA，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問 題。優(yōu)選情況下，DHA隨后從通過本發(fā)明的方法可獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。此外，通過提供使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的DPA，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技術(shù)問 題。優(yōu)選情況下，DPA隨后從通過本發(fā)明的方法可獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)基中分離。此外，通過提供使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的生物量，本發(fā)明解決了本發(fā)明提到的技 術(shù)問題。本發(fā)明的另一些優(yōu)選實(shí)施方式是次要主張的主題。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 含酒石酸銨的細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)葡萄糖(g/L)150. 0玉米漿(g/L)3. 75KH2PO4 (g/L) 3. 0NaCI (g/L)0. 8CaCl2X 2H20 (g/L) 0.3MgSO4X 7H20 (g/L) 1.5(NH4)2C4H4O6 (g/L) 6. 95實(shí)施例2 含氯化銨的細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基B)葡萄糖(g/L)150. 0玉米漿(g/L)3. 750077]KH2PO4 (g/L)3. 0
0078]NaCl (g/L)0. 8
0079]CaCl2X 2H20 (g/L)0.3
0080]MgSO4X 7H20 (g/L)1.5
0081]NH4Cl(g/L)4. 03實(shí)施例3 培養(yǎng)破囊壺菌目微生物使用本發(fā)明的2種不同的細(xì)胞培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A和B)培養(yǎng)破囊壺菌目微生物與 現(xiàn)有技術(shù)(培養(yǎng)基C)比較，在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)同類微生物。在培養(yǎng)基A和B中使用的銨 鹽(酒石酸銨和氯化銨)的量可獲得培養(yǎng)基C中相同的銨離子的量。微生物細(xì)胞使用的是Ulkenia sp. SAM 2179。為生產(chǎn)PUFA，微生物根據(jù)如下方法培養(yǎng)1.預(yù)備培養(yǎng)如下的預(yù)備培養(yǎng)物用于所有的3中培養(yǎng)基中葡萄糖(g/L) 30，0酵母浸出物(g/L)10，O(Sensient)Tropic Marin (g/L) 16，65(Dr. B ienert GmbH, ffartenberg)使用HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 0。微生物在2升的不帶擋板的錐形瓶中培養(yǎng)，其包含350ml的預(yù)備培養(yǎng)基，25°C下轉(zhuǎn) 速為160rpm培養(yǎng)48h。2.主要培養(yǎng)基培養(yǎng)預(yù)備培養(yǎng)基后，培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)基A (本發(fā)明的)、培養(yǎng)基B(本發(fā)明 的)或C (現(xiàn)有技術(shù))中細(xì)胞培養(yǎng)基A 參見實(shí)施例1。細(xì)胞培養(yǎng)基B 參見實(shí)施例2。細(xì)胞培養(yǎng)基C 葡萄糖(g/L)150. 0玉米漿r (g/L) 3. 75KH2PO4 (g/L)3.0NaCI (g/L)0.8CaCI2X 2H20 (g/L) 0.3MgSO4X 7H20 (g/L) 1.5(NH4J2SO4 (g/L)5.0所有的3種細(xì)胞培養(yǎng)基含有1. 36g/L的銨離子。pH 值> 4，通過 NaOH (20% (重量)(w/v))或 KOH (20% (重量)(w/v))調(diào)節(jié)。微生物在IOL的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為28°C，通氣為0. 75vvm.直至培養(yǎng)基中無葡萄糖，停止培養(yǎng)微生物。表1顯示了不同培養(yǎng)基的結(jié)果。表1:培養(yǎng)的結(jié)果 DBM:干生物重12個(gè)單獨(dú)培養(yǎng)的均值**最低值26.0% (重量)；最高值28. 7% (重量)培養(yǎng)基A和B使用了不同的銨源，但絕對的銨量在培養(yǎng)基A、B和C中是相等。培養(yǎng)基A使用酒石酸銨，培養(yǎng)基B是使用氯化銨，培養(yǎng)基C使用硫酸銨，結(jié)果培養(yǎng) 基A、B顯著增加了 DHA質(zhì)量(重量)，增加至少15% (重量)(DHA占干生物量的比例)， 而脂肪酸譜的特性無影響(相似的DHA面積％ (重量)值)。使用酒石酸銨增加了在細(xì)胞培養(yǎng)基中的DHA總量。該結(jié)果特別出現(xiàn)于與使用培養(yǎng) 基C培養(yǎng)的相比總干生物量相近時(shí)，因?yàn)楫?dāng)DHA含量提高時(shí)，這導(dǎo)致了總DNA量的增加。使用酒石酸銨替代硫酸銨，干生物量中的總油含量也提高。
權(quán)利要求
一種培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的方法，其包括步驟a)轉(zhuǎn)移微生物至細(xì)胞培養(yǎng)基中，和b)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，其中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨。
2.—種生產(chǎn)至少一種多不飽和脂肪酸的方法，其包括步驟a)轉(zhuǎn)移破囊壺菌目微生物至細(xì)胞培養(yǎng)基中，b)在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，c)從微生物和/或細(xì)胞培養(yǎng)物中收獲所述的多不飽和脂肪酸，其中，該細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨。
3.權(quán)利要求2的方法，其中該至少一種多不飽和脂肪酸是在進(jìn)一步的步驟d)中從其他 脂質(zhì)中分離的。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中該多不飽和脂肪酸包含《-3-二十二碳六烯酸(DHA) 和/或《 -3- 二十二碳五烯酸(DPA)。
5.權(quán)利要求2或3的方法，其中該多不飽和脂肪酸是co-3-二十二碳六烯酸(DHA)和 /或(0-3- 二十二碳五烯酸(DPA)。
6.權(quán)利要求2或3的方法，其中該多不飽和脂肪酸是co-3-二十二碳六烯酸(DHA)。
7.權(quán)利要求2-6的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟c)中基于總的微生物干重，該破囊壺 菌目微生物包含至少28% (重量)的《-3-二十二碳六烯酸(DHA)。
8.權(quán)利要求2-7的任意一項(xiàng)的方法，其中在步驟c)中基于總的微生物干重，該破囊壺 菌目微生物包含至少60% (重量)的脂質(zhì)。
9.上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)的方法，其中該破囊壺菌目微生物屬于Ulkenia屬。
10.上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)的方法，其中細(xì)胞培養(yǎng)基中的酒石酸銨作為氮源使用。
11.上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)的方法，其中酒石酸銨是細(xì)胞培養(yǎng)基中的唯一氮源。
12.上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)基包含0.6g/升-4. 0g/升的硫 酸根離子。
13.培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中該細(xì)胞培養(yǎng)基包含酒石酸銨作為氮源。
14.酒石酸銨在培養(yǎng)破囊壺菌目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基中作為氮源的用途。
15.酒石酸銨在用于培養(yǎng)破囊壺菌目微生物生產(chǎn)至少一種多不飽和脂肪酸的細(xì)胞培養(yǎng) 基中作為氮源的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中至少一種多不飽和脂肪酸是co-3-二十二碳六烯酸 (DHA)和/或(0-3- 二十二碳五烯酸(DPA)。
17.權(quán)利要求14-16的任意一項(xiàng)的用途，其中破囊壺菌目微生物屬于Ulkenia屬。
全文摘要
本發(fā)明大體上涉及微生物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。發(fā)明了一種破囊壺菌目微生物的細(xì)胞培養(yǎng)基及破囊壺菌目微生物的培養(yǎng)方法，特別地用于生產(chǎn)ω-3脂肪酸。此外，發(fā)明了使用酒石酸銨作為氮源來培養(yǎng)破囊壺菌目微生物。
文檔編號C12N1/14GK101932696SQ200880122177
公開日2010年12月29日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月15日
發(fā)明者馬庫斯·盧伊 申請人:隆薩股份公司