專利名稱：共同培養(yǎng)臍帶血衍生細(xì)胞與月經(jīng)血干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請主張2007年10月31日申請的名稱為“Methods for Co-CulturingCord Blood Derived Cells with Menstrual Stem Cells”的美國臨時專利申請第61/001456號 的優(yōu)先權(quán)，該美國臨時專利申請的全文以引用的方式而被并入本文中。本發(fā)明總的來說是關(guān)于人類細(xì)胞培養(yǎng)以及通過共同培養(yǎng)來增強(qiáng)經(jīng)分離的細(xì)胞群 體的方法。更特別的，本發(fā)明涉及關(guān)于共同培養(yǎng)臍帶血衍生細(xì)胞和月經(jīng)血干細(xì)胞以獲得經(jīng) 擴(kuò)增的表達(dá)CD34的臍帶血衍生細(xì)胞的改良細(xì)胞群體。
背景技術(shù)：
臍帶血為具有治療人體多種病癥的能力的干細(xì)胞的公認(rèn)來源。臍帶血為包括含有 CD34細(xì)胞的單核細(xì)胞的造血祖細(xì)胞的豐富來源。家族可決定收集臍帶血，因為在兒童或家 族成員有醫(yī)學(xué)需要的情況之下，具有經(jīng)儲存的干細(xì)胞的豐富來源存在潛在益處。臍帶血(cord blood，也稱為umbilical cord blood)為分娩時保留于臍帶及胎盤 中的血液。此血液為干細(xì)胞的豐富來源，可將其收集、處理且低溫保藏以用于潛在的未來用 途。臍帶血干細(xì)胞為有益的，因為其具有高植入率，較能耐受組織失配，具有較低比率的嚴(yán) 重移植物抗宿主疾病(在干細(xì)胞移植中的主要并發(fā)癥)，且極少被潛伏性病毒污染?？梢阅殠а委煹娜祟惾狈ΠY的數(shù)目在過去十年中已顯著增長。例如，已使用 臍帶血細(xì)胞來治療各種形式的癌癥、與骨髓衰竭(bone marrow failure)相關(guān)的癥候群、 血液病癥、代謝病癥、免疫缺乏病癥及其它疾病病況中的至少70種形式。舉例而言，已使 用臍帶血細(xì)胞來治療以下疾病急性淋巴母細(xì)胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、伯 基特淋巴瘤(Burkitt’ s lymphoma)、慢性骨髓白血病(CML)、青少年骨髓單核細(xì)胞性白 血病(JMML)、噬血細(xì)胞淋巴組織細(xì)胞增生癥(Hemophagocytic lymphohistiocytosis)、 非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin ‘ s lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、郎格罕細(xì)胞 (Langerhan' scell)組織細(xì)胞增生癥、淋巴瘤樣肉芽腫病、骨髓發(fā)育不良癥候群(MDS)、 慢性骨髓單核細(xì)胞性白血病(CMML)、無巨核細(xì)胞小土血小板減少癥(Amegarakyocytic thrombocytopenia)、自體免疫嗜中性球減少癥(嚴(yán)重)、先天性紅細(xì)胞生成不良性貧血、 周期性嗜中性球減少癥、戴布二氏(Diamond-Blackfan)貧血、埃文氏癥候群(Evan' s syndrome)、范可尼貧血(Fanconi anemia)、格蘭茨曼疾病(Glanzman，s disease)、青少 年皮肌炎、科斯特曼癥候群(Kostmarm’ s Syndrome)、紅血球發(fā)育不全、斯沃奇曼癥候群 (Schwachman syndrome)、嚴(yán)重再生不全性貧血、先天性含鐵胚血球貧血、橈骨缺失性血小 板減少癥(TAR癥候群)、先天性角化不全、鐮狀細(xì)胞性貧血(血色素SS)、HbSC疾病、鐮狀
地中海貧血、嚴(yán)重a-地中海貧血(胎兒水腫)、嚴(yán)重地中海貧血(庫利氏貧血 (Cooley’ s anomia))、中間型地中海貧血、地中海貧血、E_0 +地中海貧血、腎上 腺腦白質(zhì)營春不良、高雪氏病(Gaucher、disease)(嬰兒)、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、克拉 貝疾病(Krabbedisease)(球狀細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)、貢特爾疾病(Gunther disease)、哈 布二氏癥候群(Hermansky-Pudlak syndrome)、胡爾勒癥候群(Hurler syndrome)、胡-射
4二氏癥候群(Hurler-Scheie syndrome)、亨特癥候群(Hunter syndrome)、山菲立普癥候 群(Sanfilippo syndrome)、馬拉二氏癥候群(Maroteaux-Lamysyndrome)、II型、III型黏脂 質(zhì)癥(Mucolipidosis)、a甘露糖癥(Alphamannosidosis)、A型及B型紐匹二氏癥候群 (Neumann Pick Syndrome)、山朵夫癥候群(Sandoff Syndrome)、泰薩二 氏疾病(Tay Sachs Disease)、巴滕疾病(Batten disease)(遺傳性神經(jīng)原臘球脂褐質(zhì)化)、雷-納二氏疾病 (Lesch-Nyhan disease)、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Ataxia telangeotasia)、慢性肉 芽腫病、迪喬治癥候群(DiGeorge syndrome), IKK y缺乏癥、免疫調(diào)節(jié)異常多內(nèi)分泌病x 染色體相關(guān)(Immune dysregulation polyendocrineopathyX-linked)、II 型黍占月旨質(zhì)癥、先 天但.骨髓粒細(xì)胞缺乏癥(Myelokathesis^X染色體相關(guān)的免疫缺乏、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺 乏、腺普去膠腌缺乏癥、維_奧二氏癥候群、X染色體相關(guān)的無、球蛋白血癥、X染色體相 關(guān)的淋巴增生性疾病、歐曼癥候群(Omerm’ s syndrome)、網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育異常(Reticular dysplasia)、胸腺發(fā)育異常(Thymic dysplasia)、白血球黏著性缺乏癥及骨石化病。存在關(guān)于臍帶血細(xì)胞收集及在人類病癥治療中的用途的限制。首先，臍帶血細(xì)胞 僅可在出生之后立即收集。此對臍帶血的可收集次數(shù)造成顯著限制。其次，以含有有限量 的干細(xì)胞的小體積收集臍帶血。某些病癥需要輸注或移植大量干細(xì)胞。少量可收集的臍帶 血細(xì)胞使得將此等細(xì)胞用于需要大量細(xì)胞的療法并不可行。正進(jìn)行研究來發(fā)展進(jìn)步以克服臍帶血細(xì)胞的限制。已開發(fā)了組合多個臍帶血單位 或在移植之前在單一臍帶血單位中擴(kuò)增干細(xì)胞的技術(shù)。開發(fā)此等技術(shù)以解決因具有過少干 細(xì)胞群體而無法治療病癥的問題。即使存在發(fā)展，也證明臍帶血干細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)物中難 以擴(kuò)增。豐富但受限的干細(xì)胞來源對病癥治療而言仍具有限制。已開發(fā)活體外檢定系統(tǒng)以對紅血球、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞_巨噬細(xì)胞及巨核細(xì)胞骨 髓細(xì)胞系的多潛能祖細(xì)胞及系受限祖細(xì)胞定量。當(dāng)在合適半固體基質(zhì)中培養(yǎng)時，稱為群落 形成細(xì)胞(CFC)的個別祖細(xì)胞增殖以形成離散細(xì)胞族或群落。藉由將細(xì)胞懸浮液置于半固 體培養(yǎng)基(諸如補(bǔ)充有營養(yǎng)素及細(xì)胞活素的甲基纖維素或膠原蛋白)中、接著培育來進(jìn)行 CFC檢定。接著，基于群落內(nèi)之一或多類造血系細(xì)胞的形態(tài)學(xué)識別來對CFC分類且計數(shù)?？?籍由光顯微術(shù)或藉由采集個別群落且接著使用細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞化學(xué)方法將細(xì)胞染色 來當(dāng)場進(jìn)行群落評估及計數(shù)。已將包括甲基纖維素的各種膠凝劑用于CFC檢定。甲基纖維素為形成具有良好光 學(xué)透明度的穩(wěn)定凝膠的相對惰性的聚合物。其通常用于補(bǔ)充有包括胎牛血清(FBS)、牛血清 白蛋白(BSA)、2-巰基乙醇、胰島素、運鐵蛋白及重組細(xì)胞活素的化合物的培養(yǎng)基中或作為 群落刺激因子來源的改良性培養(yǎng)基(conditioned medium)中。與其它類型的半固體基質(zhì) 相比，基于甲基纖維素的培養(yǎng)基允許紅血球系細(xì)胞的較佳生長，因此允許在相同培養(yǎng)物內(nèi) 檢定紅血球、粒.細(xì)胞、單核細(xì)胞及多潛能CFC。此培養(yǎng)基允許偵測人類群落形成單位-紅 血球(CFU-E)、爆式形成單位-紅血球(BFU-E)、CFU-粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞(CFU-GM)及CFU-粒 細(xì)胞、紅血球、巨噬細(xì)胞、巨核細(xì)胞(CFUGEMM)且對其計數(shù)。盡管已產(chǎn)生進(jìn)步，但仍需要改良臍帶干細(xì)胞擴(kuò)增以制造較多用于治療人類病癥的 干細(xì)胞的方法。本發(fā)明為關(guān)于滿足此需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即來自臍帶血的干細(xì)胞在與月經(jīng)血細(xì)胞群體共同培養(yǎng)時以 足夠大的數(shù)目增殖。該發(fā)現(xiàn)已展示月經(jīng)血干細(xì)胞在具有臍帶血干細(xì)胞的培養(yǎng)物中提供支持 功能以增強(qiáng)臍帶血細(xì)胞增殖。根據(jù)用于收集、低溫保藏(cryopreservation)及儲存的目前 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)來收集臍帶血細(xì)胞。可根據(jù)美國專利公開案第20080241113號的教示來收集用于 與臍帶血干細(xì)胞共同培養(yǎng)的月經(jīng)血干細(xì)胞。臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞的共同培養(yǎng)產(chǎn)生促進(jìn) 表達(dá)⑶34、SSEA4及HLA- II的細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)環(huán)境。美國專利公開案第20080241113號的教示提供多種用于收集適用于本發(fā)明中的 月經(jīng)血干細(xì)胞群體的方法。用于共同培養(yǎng)的月經(jīng)血干細(xì)胞可自新鮮或經(jīng)極冷保藏的月經(jīng)血 干細(xì)胞獲得。月經(jīng)血干細(xì)胞可關(guān)于CD117或其它細(xì)胞表面標(biāo)記經(jīng)分離且亦可經(jīng)由細(xì)胞培養(yǎng) 來擴(kuò)增。月經(jīng)血干細(xì)胞亦可關(guān)于某些細(xì)胞標(biāo)記經(jīng)分離且接著經(jīng)培養(yǎng)以便擴(kuò)增。美國專利公開 案第20080241113號中所述的月經(jīng)血干細(xì)胞的任何群體均可用于本發(fā)明的共同培養(yǎng)方法中。因此，本發(fā)明提供共同培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞以改良臍帶血細(xì)胞的增殖的 方法。在一相關(guān)方面，本發(fā)明提供表達(dá)CD34的人類細(xì)胞的群體，其獲自人類臍帶血細(xì)胞 在具有促進(jìn)人類臍帶血細(xì)胞群體倍增的人類月經(jīng)血細(xì)胞的合適培養(yǎng)條件中的擴(kuò)增。細(xì)胞的 群體表達(dá)SSEA4及HLA- II。本發(fā)明的細(xì)胞的群體可懸浮于冷凍保藏劑、培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基中 的任一中。本發(fā)明的表達(dá)⑶34的人類細(xì)胞的群體是由至少兩次或兩次以上群體倍增而產(chǎn)生 的。本發(fā)明的細(xì)胞的群體能夠產(chǎn)生以下任一者群落形成單位、群落形成單位粒細(xì)胞 (CFU-GM)巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬 細(xì)胞巨核細(xì)胞(CFU-GEMM)血液系前驅(qū)體細(xì)胞。在另一方面中，本發(fā)明還提供藉由以下方法獲得的表達(dá)CD34的人類臍帶血細(xì)胞 的群體，該方法包含在適用于臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的條件下共同培養(yǎng)足量臍帶血干細(xì)胞與足量 月經(jīng)血干細(xì)胞，且接著經(jīng)由至少兩次群體倍增使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖。使足量 臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖的步驟包含使臍帶血細(xì)胞生長以產(chǎn)生以下任一者群落形成單 位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形 成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞(CFU-GEMM)。在一實施例中，本發(fā)明的方法可包含使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長以產(chǎn)生以 下任一者之步驟群落形成單位(CFU)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系 爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體 細(xì)胞(CFU-GEMM)。在又一實施例中，本發(fā)明的方法可包含在使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖之后 分離表現(xiàn)CD34的臍帶血細(xì)胞的步驟。在另一實施例中，本發(fā)明的方法可包含在使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖之后 極冷保藏表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的群體的步驟。藉由本發(fā)明的方法獲得的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的群體在使足量臍帶血細(xì)胞在合適培養(yǎng)條件下增殖之后亦可表現(xiàn)⑶34、SSEA4及HLA- II中的至少一者。在又一方面中，本發(fā)明提供獲得經(jīng)擴(kuò)增的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的方法。本 發(fā)明的方法包含以下步驟在適于促進(jìn)臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的共同培養(yǎng)條件下以足量月經(jīng)血細(xì) 胞接種足量臍帶血細(xì)胞，且在支持臍帶血細(xì)胞的至少兩次或兩次以上群體倍增的培養(yǎng)條件 下共同培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞。在一實施例中，共同培養(yǎng)表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞包含擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞以表 現(xiàn)SSEA4及HLA- II中的至少一或多者。在另一實施例中，本發(fā)明的經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞表現(xiàn)高含量的CD34。另外，本發(fā) 明的臍帶血細(xì)胞的共同培養(yǎng)包含擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞以產(chǎn)生以下任一者群落形成單位、粒細(xì) 胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒 細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞(CFU-GEMM)。在替代性實施例中，本發(fā)明的方法可包含以下其它步驟中的至少一者關(guān)于⑶34 免疫選擇經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞，自培養(yǎng)物分離經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞以便輸注于人類 中，極冷保藏經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞或使經(jīng)擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞分化為細(xì)胞系。在又一實施例中，本發(fā)明的方法包含使經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞生長以產(chǎn)生以下任 一者的步驟群落形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生 成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞(CFU-GEMM)血液系前驅(qū) 體細(xì)胞。


圖1展示本發(fā)明的示意性流程圖。圖2a及2b為對于實例1中所述的造血群落形成細(xì)胞而言，在解凍之后經(jīng)涂鋪且 在Methocult 4053半固體甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的臍帶871R細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的相 片。臍帶871R細(xì)胞以每孔50000個細(xì)胞涂鋪于每孔lml培養(yǎng)基中。圖2a為在細(xì)胞培養(yǎng)8 天后的細(xì)胞相片(200X)。圖2b為在細(xì)胞培養(yǎng)9天后的細(xì)胞相片(40X)。圖2a及2b說 明在無群落形成單位(CFU)生長的情況下在半固體培養(yǎng)基中存在游離細(xì)胞。圖3a_31為對于實例2中所述的CFIJ而言，在甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)的 M28100RM月經(jīng)血細(xì)胞的相片。圖3a為展示BFU-E的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(100X)，其說明 在每孔涂鋪10000個細(xì)胞且細(xì)胞培養(yǎng)8天之后由于血色素產(chǎn)生而引起的紅色調(diào)。圖3b為 對于群落形成單位而言，在培養(yǎng)8天之后甲基纖維素培養(yǎng)基中的游離細(xì)胞的相片(100 X)。 圖3c及3d為展示BFU-E的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(200X)，其說明在以每孔21600個細(xì)胞 涂鋪細(xì)胞且在細(xì)胞培養(yǎng)物中8天之后由于血色素產(chǎn)生而引起的紅色調(diào)。圖3e為在以每孔 5000摑細(xì)胞涂鋪細(xì)胞且培養(yǎng)8天之后展示初始BFU-E產(chǎn)生的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(40X)。 圖3f、3g及3h為展示BFU-E的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(分別為100X、100X及40X)，其說 明在每孔涂鋪10000個細(xì)胞且細(xì)胞培養(yǎng)9天之后由于血色素產(chǎn)生而引起的紅色調(diào)。圖3i、 3j及3k為展示BFU-E的細(xì)胞培養(yǎng)物的相片(分別為100X、100X及40X)，其說明在每孔 涂鋪21600個細(xì)胞且培養(yǎng)9天之后由于血色素產(chǎn)生而引起的紅色調(diào)。圖31為在此濃度下 無群落形成可能的情況下，培養(yǎng)基中游離細(xì)胞的相片。圖4a-4d為每孔涂鋪5000、10000及21600個細(xì)胞的M28101R月經(jīng)血細(xì)胞的相片。圖4a為在以每孔10000個細(xì)胞涂鋪M28101R月經(jīng)血細(xì)胞且細(xì)胞培養(yǎng)8天之后，展示CFU-GM 的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(40X)。圖4b為在以每孔10000個細(xì)胞涂鋪細(xì)胞且培養(yǎng)9天之后 展示CFU-GM產(chǎn)生的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(40X)。圖4c為在以每孔21600個細(xì)胞涂鋪細(xì)胞 且細(xì)胞培養(yǎng)數(shù)天之后展示BFU-E產(chǎn)生的培養(yǎng)物中細(xì)胞的相片(100X)。圖4d為在以每孔 5000個細(xì)胞涂鋪細(xì)胞且細(xì)胞培養(yǎng)9天之后游離細(xì)胞的相片(40X)。圖5a_5g為實例4中所述的M28100RM月經(jīng)血細(xì)胞與臍帶871R細(xì)胞的共同培養(yǎng)相 片。圖5d為具有以每孔5000個細(xì)胞涂鋪的月經(jīng)血細(xì)胞及以每孔50000個細(xì)胞涂鋪的臍帶 血細(xì)胞的部分CFU-GM在培養(yǎng)9天后的相片(40X)。圖5a、5e及5g展示以每孔10000個 細(xì)胞涂鋪的M28100RM月經(jīng)血細(xì)胞及以每孔50000個細(xì)胞涂鋪的臍帶871R細(xì)胞在培養(yǎng)8天 (圖5a及5e)及培養(yǎng)9天(圖5g)之后的相片(100X)。圖5a及5e說明CFU-GM群落形 成。圖5g說明BFU-E群落形成。圖513、5(及5€為以每孔21600個細(xì)胞涂鋪的1128100冊 月經(jīng)血細(xì)胞及以每孔50000個細(xì)胞涂鋪的臍帶871R細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)8天(圖5b及5c)及 培養(yǎng)9天(圖5f)之后的相片(分別為200X、100X及100X)。圖6a_6c為實例5中所述的M28101R月經(jīng)血細(xì)胞與臍帶871R細(xì)胞的共同培養(yǎng)相 片。圖6a、6b及6c說明甲基纖維素半固體造血培養(yǎng)基中的游離細(xì)胞。單獨培養(yǎng)的M28101R 月經(jīng)血細(xì)胞在以不同濃度涂鋪時能夠產(chǎn)生CFU-GM及BFU-E。
具體實施例方式參考圖1-6，本發(fā)明提供共同培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞以擴(kuò)增表現(xiàn)⑶34的細(xì) 胞的數(shù)目的方法。還提供藉由本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)擴(kuò)增的表現(xiàn)CD34的人類細(xì)胞的組合 物。全臍帶血為包括含有⑶34+細(xì)胞的單核細(xì)胞的造血祖細(xì)胞的豐富來源。臍帶血干 細(xì)胞包含包括CD34+細(xì)胞的單核細(xì)胞。臍帶血干細(xì)胞獲自在分娩嬰兒后但一般在已分娩胎 盤之前自臍帶立即提取的全臍帶血。分娩之時為收集新生兒干細(xì)胞的唯一機(jī)會。且，收集對 于陰道分娩及剖腹分娩均為安全的。為收集臍帶血，將臍帶血自臍帶吸取至血液收集袋中。 將臍帶血封裝于運送材料中且運送至實瞼室中以便在收集的36至48小時內(nèi)加以處理。在嬰兒出生之后，在夾掉臍帶后自臍帶收集全血。全臍帶血的體積可為約110ml。 在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)下將所收集的臍帶血樣品運送至實驗室以進(jìn)行處理。在無菌條件下使用密度梯度分離(Fiooll/Hypaque)來處理臍帶血以分離含有表 現(xiàn)⑶34的細(xì)胞群體的單核細(xì)胞。將臍帶血等分至無菌50ml管中。在470g下將管離心約 15分鐘。在離心之后，壓緊細(xì)胞(packed cell)應(yīng)在每體積1 3比率下?？稍陔x心之后 自管移除血漿，或可將DPBS添加至管中以達(dá)成1 3的壓緊細(xì)胞與體積的比率。各管應(yīng)具 有不大于約35ml的體積，各管下方置放有10ml LSM。將各管在400g下離心約30分鐘。移 除血漿頂層。移除含有單核細(xì)胞及血漿之下一層且將其轉(zhuǎn)移至另一 50ml管中。應(yīng)使用含有L-谷氨酰胺的RPMI01640 IX使50ml管中的細(xì)胞懸浮直至約45ml的 體積，其中RPMI與細(xì)胞混合物的比率為約1 2?？稍?70g下將具有細(xì)胞懸浮液的管離心 約15分鐘。在離心之后，移除上清液。添加少量RPMI以使小球再懸浮。將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn) 移至15ml管中。在15ml管中將細(xì)胞懸浮液在400g下離心約15分鐘。傾析上清液且使用 RPMI使小球再懸浮直至5ml。逐滴添加5ml DMS0/自體血漿(1ml DMS0及4ml自體血漿)。
8在控制速率冷凍器中將DMS0/自體血漿中的細(xì)胞懸浮液的溫度降至約_85°C。將管置于在 約-185°C或_185°C以下的液氮槽中。參考根據(jù)美國專利公開案第20080241113號的任一方法自月經(jīng)收集的細(xì)胞來使 用短語“月經(jīng)血細(xì)胞”。月經(jīng)血細(xì)胞包含表現(xiàn)包括(但不限于)⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、 ⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及I類HLA的細(xì)胞標(biāo)記或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記中的至少一 者，同時以低含量表現(xiàn)或不表現(xiàn)CD3及MHC II的細(xì)胞。盡管將細(xì)胞的上述特征提供為例 示性特征，但在美國專利公開案第20080241113號的整個揭示案中提供月經(jīng)血細(xì)胞的額外 及替代性細(xì)胞表面特征，包括(但不限于)其中任何表及圖中所提供的特征(在極冷保藏 之前及之后、在CD 117選擇之前及之后、在細(xì)胞培養(yǎng)之前及之后)或美國專利公開案第 20080241113號中所揭示的任何組合。另外，美國專利公開案第20080241113號以全文引用 的方式并入本文中，且提供關(guān)于本發(fā)明的月經(jīng)血細(xì)胞的其它揭示內(nèi)容。根據(jù)美國專利公開 案第20080241113號的教示，用于與臍帶血干細(xì)胞共同培養(yǎng)的月經(jīng)血細(xì)胞可自月經(jīng)收集， 濃縮且極冷保藏，且稍后根據(jù)本發(fā)明的方法來解凍。或者，美國專利公開案第20080241113 號的教示提供獲得適用于本發(fā)明中的月經(jīng)血細(xì)胞的多種方法。盡管術(shù)語“細(xì)胞”在本申請案中可以單數(shù)含義使用，但術(shù)語“細(xì)胞”亦可用以指用 于本發(fā)明的一個以上細(xì)胞。認(rèn)識到由于某些細(xì)胞分化為多種獨特細(xì)胞類型之能力，該等細(xì)胞在本質(zhì)上為多能 的。多能細(xì)胞具有分化為多種不同哺乳動物細(xì)胞類型的能力。舉例而言，用于本發(fā)明中的 月經(jīng)血細(xì)胞展示分化為各種細(xì)胞系的潛力，該等細(xì)胞系諸如神經(jīng)系、心臟生成系、軟骨生成 系、脂肪生成系及成骨系。本發(fā)明的方法及組合物出于多種原因，將經(jīng)擴(kuò)增⑶34細(xì)胞用于治療用途可為有益的。詳言之，經(jīng)擴(kuò)增 CD34細(xì)胞(a)與其它臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增方法相比需要使用較少臍帶血細(xì)胞來增殖，(b)在與 月經(jīng)血細(xì)胞的共同培養(yǎng)中增殖，(c)能夠自體應(yīng)用，(d)能夠同種異體應(yīng)用，及(e)可用作定 制的再生保健溶液的來源。本發(fā)明提供表現(xiàn)CD34的人類細(xì)胞的群體，其獲自人類臍帶血細(xì)胞在具有促進(jìn)人 類臍帶血細(xì)胞群體倍增的人類月經(jīng)血細(xì)胞的合適培養(yǎng)條件中的擴(kuò)增。細(xì)胞的群體亦表現(xiàn) SSEA4 及 HLA- II。本發(fā)明的細(xì)胞的群體可懸浮于冷凍保藏劑、培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基的 任一者中。本發(fā)明的表現(xiàn)CD34的人類細(xì)胞的群體是由于至少兩次或兩次以上群體倍增而產(chǎn) 生的。本發(fā)明的細(xì)胞的群體能夠產(chǎn)生以下任一者群落形成單位、群落形成單位粒細(xì)胞 (CFU-GM)巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬 細(xì)胞巨核細(xì)胞(CFU-GEMM)血液系前驅(qū)體細(xì)胞。本發(fā)明還提供藉由以下方法獲得的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的群體，該方法 包含在適用于臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的條件下共同培養(yǎng)足量臍帶血干細(xì)胞與足量月經(jīng)血細(xì)胞，且 接著經(jīng)由至少兩次群體倍增使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖。使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng) 物中增殖的步驟包含使臍帶血細(xì)胞生長以產(chǎn)生以下任一者群落形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BHU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血 球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞(CFU-GEMM)。本發(fā)明的方法可包含使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中生長以產(chǎn)生以下任一者的 步驟群落形成單位(CFU)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣 生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞 (CFU-GEMM)。本發(fā)明的方法可包含在使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖之后分離表現(xiàn)CD34的 臍帶血細(xì)胞的步驟。本發(fā)明的方法可包含在使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖之后極冷保藏表現(xiàn) CD34的人類臍帶血細(xì)胞的群體的步驟。藉由本發(fā)明的方法獲得的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的群體在足量臍帶血細(xì)胞 在合適培養(yǎng)條件下增殖之后也可表現(xiàn)⑶34、SSEA4及HLA- II中的至少一者。本發(fā)明提供獲得經(jīng)擴(kuò)增的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方法包 含以下步驟在適于促進(jìn)臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的共同培養(yǎng)條件下以足量月經(jīng)血細(xì)胞接種足量臍 帶血細(xì)胞，且在支持臍帶血細(xì)胞的至少兩次或兩次以上群體倍增的培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)臍 帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞。共同培養(yǎng)表現(xiàn)⑶34的人類臍帶血細(xì)胞包含擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞以表現(xiàn)SSEA4及 HLA- II中的至少一或多者。本發(fā)明的經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞表現(xiàn)高含量的⑶34。本發(fā)明的臍帶血細(xì)胞的共同培養(yǎng)包含擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞以產(chǎn)生以下任一者群落形 成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群 落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞(CFU-GEMM)。本發(fā)明的方法可包含以下其它步驟中的至少一個關(guān)于⑶34免疫選擇經(jīng)擴(kuò)增人 類臍帶血細(xì)胞，自培養(yǎng)物分離經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞以輸注于人類中，極冷保藏經(jīng)擴(kuò)增人 類臍帶血細(xì)胞，或使經(jīng)擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞分化為細(xì)胞系。本發(fā)明的方法包含使經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞生長以產(chǎn)生以下任一者的步驟群落 形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及 群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞(CFU-GEMM)血液系前驅(qū)體細(xì)胞。制備用于培養(yǎng)的細(xì)胞臍帶血細(xì)胞樣品及月經(jīng)血細(xì)胞樣品可在儲存中經(jīng)極冷保藏。或者，臍帶血細(xì)胞樣 品及月經(jīng)血細(xì)胞樣品中任一者或兩者在自所收集的原始血液樣品處理之后可為新鮮的。在 極冷保藏臍帶血細(xì)胞樣品及月經(jīng)血細(xì)胞樣品中任一者或兩者的情況下，必須使經(jīng)極冷保藏 的臍帶血細(xì)胞和/或月經(jīng)血細(xì)胞解凍以為培養(yǎng)作準(zhǔn)備。在臍帶血細(xì)胞樣品及月經(jīng)血細(xì)胞樣 品中任一者或兩者新鮮的情況下，可制備細(xì)胞以進(jìn)行培養(yǎng)。使經(jīng)極冷保藏的細(xì)胞解凍的方法包含使經(jīng)極冷保藏的細(xì)胞解凍且接著經(jīng)由離心 來洗滌該等細(xì)胞的步驟。自極冷保藏移除一小瓶細(xì)胞且在約37-40°C水浴中攪拌該小瓶直 至剩余幾片冷凍樣品，藉此使經(jīng)極冷保藏的細(xì)胞解凍。經(jīng)極冷保藏的細(xì)胞不應(yīng)完全解凍。 將部分解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至具有DNase (每lOOmllO滴)的冷凍Chang氏完全培養(yǎng)基中且通 過倒置使其輕微混合。Chang氏完全培養(yǎng)基應(yīng)以5 1的比率與部分解凍細(xì)胞混合。舉例 而言，使25ml Chang氏完全培養(yǎng)基與5ml解凍細(xì)胞混合。此時，可移除約100-200 u 1的Chong氏完全培養(yǎng)基及解凍細(xì)胞樣品以用于下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的流式細(xì)胞儀分析。懸浮解凍細(xì)胞的Chang氏完全培養(yǎng)基溶液可接著經(jīng)受在約環(huán)境溫度下在約120g 下離心約5分鐘的第一步。一旦離心完成，即移除上清液且通過溫和倒置使細(xì)胞小球及可 能存在的其它碎片再懸浮于無DNase的Chang氏完全培養(yǎng)基中。懸浮于Chang氏完全培養(yǎng) 基中的細(xì)胞可接著經(jīng)受在約環(huán)境溫度下在約120g下離心約5分鐘的第二步。一旦第二離心 步驟完成，即移除上清液且使細(xì)胞小球再懸浮于7ml的15% FBS Chang氏生長培養(yǎng)基中。Chang氏完全培養(yǎng)基包含MEM a培養(yǎng)基、Chang B、Chang C、盤尼西林/鏈霉素 (Penicillin/Streptomycin)、L_ 谷氨酰胺及 ES-FBS。藉由組合 650mlMEM a 培養(yǎng)基、180ml Chang B(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(18% v/v)、20ml Chang C(2% v/v)、10ml 盤尼西林/鏈霉素(10000 單位/ml盤尼西林G鈉及10000 ii g/ml鏈霉素硫酸鹽)、10ml L-谷氨酰胺200mM(100X) 及150ml ES-FBS(19% v/v)來制備Chang氏完全培養(yǎng)塞?？墒褂媒鈨黾跋礈旖?jīng)極冷保藏的細(xì)胞的方法來制備經(jīng)極冷保藏的臍帶血細(xì)胞及 月經(jīng)血細(xì)胞以進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)由在燒瓶中培養(yǎng)來擴(kuò)增細(xì)胞將經(jīng)解凍或新鮮月經(jīng)血細(xì)胞涂鋪于經(jīng)解凍或新鮮臍帶血細(xì)胞上以在燒瓶中共同 培養(yǎng)細(xì)胞?？稍赥-25非經(jīng)組織培養(yǎng)物處理的燒瓶中共同培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞。細(xì) 胞不應(yīng)超過每個燒瓶約10000000個細(xì)胞。將足夠數(shù)目化臍帶血細(xì)胞與足夠數(shù)目的月經(jīng)血 細(xì)胞在燒瓶中共同培養(yǎng)。在一實施例中，臍帶血細(xì)胞可介于約1000個細(xì)胞至約10000個細(xì) 胞的范圍內(nèi)，而月經(jīng)血細(xì)胞可介于約10000個細(xì)胞至約50000個細(xì)胞的范圍內(nèi)。其它量的 臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞亦可為足夠的，只要月經(jīng)血細(xì)胞提供促進(jìn)臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的支持 功能即可。先前培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞可以約2000個/cm2經(jīng)涂鋪，具有約48小時 的繼代時間。若涂鋪更多細(xì)胞，則細(xì)胞可在約24小時內(nèi)經(jīng)歷繼代。臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì) 胞可涂鋪于分別具有約7ml、約15ml及約30ml Chang氏完全培養(yǎng)基的T_25、T_75及T-175 非經(jīng)組織培養(yǎng)物處理的燒瓶中。臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞的共同培養(yǎng)可在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培 育，直至細(xì)胞以約70-80%融合?？山逵梢鹊鞍酌富?trypsinizing)步驟使臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞的共同培養(yǎng) 物與燒瓶分離。當(dāng)顯而易見共同培養(yǎng)的臍帶血與月經(jīng)血細(xì)胞準(zhǔn)備分離時，應(yīng)吸出燒瓶中的 培養(yǎng)基且接著以對于T-25燒瓶而言體積為約5ml、對于T-75燒瓶而言體積為約10ml或?qū)?于T-157燒瓶而言體積為約25ml的無鈣或鎂的DPBS洗滌非組織培養(yǎng)燒瓶。在洗滌之后， 可以TrypLE酶在約36°C至約38°C下對于T-25燒瓶而言以約1. 5ml的體積、對于T-75燒 瓶而言以約3ml的體積且對于175燒瓶而言以約6ml的體積來涂布細(xì)胞。TrypLE酶可與細(xì) 胞一起在C02培育箱中在約36°C至約38°C下培育約5分鐘。在培育之后，可移出細(xì)胞且可 以相同體積的首先用于涂布細(xì)胞的TrypLE酶來稀釋燒瓶的內(nèi)容物。接著，可將含有懸浮細(xì) 胞內(nèi)容物的TrypLE酶的溶液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。可使用無鈣或鎂的DPBS來洗滌燒瓶 的內(nèi)容物，對于T-25燒瓶而言以約5ml的體積、對于T-75燒瓶而言以約10ml的體積且對 于T-175燒瓶而言以約25ml的體積進(jìn)行洗滌。用于本發(fā)明實踐中的燒瓶可為非經(jīng)組織培 養(yǎng)物處理的燒瓶。可將約50ml DPBS添加至含有TryPLE酶及懸浮細(xì)胞內(nèi)容物的50ml離心管中?？蓪?0ml離心管在環(huán)境溫度下在約120g下離心約5分鐘?？梢瞥∏虻纳倭康?分試樣(諸如20iU)以用血球計手動地或用自動化裝置進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。在離心之后，移除 且丟棄上清液，且使剩余小球懸浮于約7ml Chang氏完全培養(yǎng)基中。懸浮于Chang氏完全培養(yǎng)基中的經(jīng)共同培養(yǎng)且經(jīng)擴(kuò)增的細(xì)胞可為極冷保藏而作 準(zhǔn)備，經(jīng)受關(guān)于CD34細(xì)胞的免疫選擇，為輸注于人類中而作準(zhǔn)備或為沿任何數(shù)目的細(xì)胞路 徑進(jìn)行細(xì)胞分化而作準(zhǔn)備。在細(xì)胞培養(yǎng)的過程期間，可獲得共同培養(yǎng)信息。每隔約3天或3天以上可更換培 養(yǎng)基。若共同培養(yǎng)物含有10000000個以上細(xì)胞，則可移除共同培養(yǎng)物中的細(xì)胞以在相同培 養(yǎng)條件下繼代培養(yǎng)或者根據(jù)本申請案中所述的極冷保藏方法進(jìn)行極冷保藏。經(jīng)由在培養(yǎng)盤上培養(yǎng)來擴(kuò)增細(xì)胞可在無菌條件下使用涂鋪技術(shù)來共同培養(yǎng)細(xì)胞。用于本發(fā)明的方法中的培養(yǎng)基 可為含有 hSCF、hGM-CSF、hIL_3、hG-CSF、hEPO 的 Methocult 4034 以偵測 CB 中的 BFU-E、 CFU-GM、CFU-GEMM。在約2_8°C下或在室溫下，使儲存在_80°C下的培養(yǎng)基(MethoCult #4034)解凍。在涂鋪之前將用于共同培養(yǎng)的經(jīng)解凍培養(yǎng)基及細(xì)胞置于冰上歷時約15分鐘。 將約0. 3ml細(xì)胞懸浮液添加至含有培養(yǎng)基的管中，渦動且使其在冰上培育約30分鐘。使用 注射器將培養(yǎng)基均勻分布于四孔培養(yǎng)盤的三個孔中，每孔約lml。將約lml DPBS添加至培 養(yǎng)盤的第四孔中。應(yīng)在無菌條件下在約37°C下將培養(yǎng)盤培育約14至約21天。流式細(xì)胞儀分析可分析經(jīng)共同培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞的任何樣品(無論是否經(jīng)擴(kuò)增)的 總細(xì)胞計數(shù)、細(xì)胞生存力(藉由錐蟲藍(lán)，經(jīng)由染料排除)及細(xì)胞表面標(biāo)記的表現(xiàn)。經(jīng)擴(kuò)增的共同培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞的總細(xì)胞計數(shù)及細(xì)胞生存力可 藉由用血球計進(jìn)行的手動計數(shù)、流式細(xì)胞儀或其它適用于獲得細(xì)胞計數(shù)的構(gòu)件(諸如 ViCell(Beckman Coulter)或適于計數(shù)顯示于顯微影像上的細(xì)胞的軟件)來定量。經(jīng)擴(kuò)增的共同培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞可籍由流式細(xì)胞儀來進(jìn)行分析?？?根據(jù)StomKit藉由將約36ml蒸餾水及4ml 10X溶解溶液添加至50ml管中來制備IX NH4CL 溶解溶液?？蓪⒓s50 yl細(xì)胞樣品添加至兩個管中以進(jìn)行分析。一個管用于CD34+/生 存力分析且第二個管用于等純系對照(isocloniccontrol)?？蓪⒓s10 yl 7-AAD生存力 染料添加至各管中?？蓪⒓slOiil⑶45-FITC/⑶34-PE添加至第一個管中?？蓪⒓s10 yl CD45-FITC/CTRL-PE添加至第二個管中。可將混合物渦動且接著在約15°C至約30°C下培 育至少20分鐘，同時使其避光。接著，可將約lml lx NH4CL溶解溶液添加至各管中且渦 動。可將混合物在約15°C至約30°C下培育約20分鐘。可將約100 ill的干細(xì)胞計數(shù)熒光 球(stem-Count Fluorosphere)添加至各管中且渦動。接著，應(yīng)使樣品在流式細(xì)胞儀上運 行以進(jìn)行分析。經(jīng)擴(kuò)增的共同培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞亦可藉由流式細(xì)胞儀來進(jìn)行分析 以分析細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞生存力及其它細(xì)胞特征。在細(xì)胞溶解之后亦可根據(jù)以下方案來 分析細(xì)胞的新鮮樣品。可在約2000rPm下將經(jīng)擴(kuò)增的共同培養(yǎng)的臍帶血細(xì)胞及月經(jīng)血細(xì)胞的樣品離心 約7分鐘。可移除上清液且使細(xì)胞再懸浮于約100 yl洗滌培養(yǎng)基(25% HSA、DNAse、肝素及HBSS w/Ca+及Mg+)中。接著，可在Blood Bank Serofuge中將再懸浮細(xì)胞離心約1分 鐘?？蓛A析上清液且使細(xì)胞再懸浮于約1. 2ml鞘液(Sheath fluid)中且渦動?？煞治銮室褐械募?xì)胞的任何數(shù)目的細(xì)胞表面標(biāo)記。舉例而言，且并非為限制，可將 鞘液中的細(xì)胞的約100 iil樣品添加至含有以下試劑(在各管中每個試劑的體積為10 iil 或20iU)的各管中且接著將管渦動以混合如表A中所述的試劑與樣品。表A 流式細(xì)胞儀負(fù)載概略
權(quán)利要求
一種表現(xiàn)CD34的人類細(xì)胞的群體，其獲自人類臍帶血細(xì)胞在用以促進(jìn)人類臍帶血細(xì)胞群體倍增的具有人類月經(jīng)血細(xì)胞的合適培養(yǎng)條件下的擴(kuò)增。
2.如權(quán)利要求1所述的人類細(xì)胞的群體，其中該人類細(xì)胞的群體還表現(xiàn)SSEA4。
3.
4.如權(quán)利要求1所述的人類細(xì)胞的群體，其中該人類細(xì)胞的群體還表現(xiàn)HLA-II。
5.如權(quán)利要求1所述的人類細(xì)胞的群體，其中該表現(xiàn)CD34的人類細(xì)胞的群體懸浮于冷 凍保藏劑、培養(yǎng)基、生長培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基中的任一中。
6.如權(quán)利要求1所述的人類細(xì)胞的群體，其中該表現(xiàn)CD34的人類細(xì)胞的群體為至少兩 次或兩次以上群體倍增的結(jié)果。
7.如權(quán)利要求1所述的人類細(xì)胞的群體，其中該人類細(xì)胞的群體能夠產(chǎn)生以下任一 者群落形成單位、群落形成單位粒細(xì)胞(CFU-GM)巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位、和 粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞群落形成單位(CFU-GEMM)。
8.一種表現(xiàn)⑶34的人類臍帶血細(xì)胞的群體，其通過包含以下的方法而獲得在適于臍帶血干細(xì)胞擴(kuò)增的條件下共同培養(yǎng)足量的臍帶血干細(xì)胞與足量月經(jīng)血干細(xì)胞；及經(jīng)由至少兩次群體倍增使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包含使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物 中生長以產(chǎn)生以下任一者的步驟群落形成單位(CFU)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位 (CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核 細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞(CFU-GEMM)。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包含在使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物 中增殖之后，分離表現(xiàn)CD34的臍帶血細(xì)胞的步驟。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包含在使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物 中增殖之后，冷凍保藏該表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的群體的步驟。
12.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，在使足量臍帶血細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下增殖之 后，該表現(xiàn)⑶34的人類臍帶血細(xì)胞的群體還表現(xiàn)HLA-II。
13.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，在使足量臍帶血細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下增殖之 后，該表現(xiàn)⑶34的人類臍帶血細(xì)胞的群體還表現(xiàn)SSEA4。
14.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該使足量臍帶血細(xì)胞在培養(yǎng)物中增殖包含使臍帶 血細(xì)胞生長以產(chǎn)生以下任一者群落形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、 紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液 系前驅(qū)體細(xì)胞(CFU-GEMM)。
15.一種獲得經(jīng)擴(kuò)增的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的方法，該方法包含在適于促進(jìn)臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的共同培養(yǎng)條件下以足量月經(jīng)血細(xì)胞接種足量的臍帶血 細(xì)胞；及在支持臍帶血細(xì)胞的至少兩次或兩次以上群體倍增的培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)臍帶血細(xì) 胞與月經(jīng)血細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的共同培養(yǎng)包含擴(kuò) 增臍帶血細(xì)胞以表現(xiàn)SSEA-4及HLA-II中的至少一種或多種。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中，經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞表現(xiàn)高含量的CD34。
18.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，臍帶血細(xì)胞的共同培養(yǎng)包含擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞以 產(chǎn)生以下任一者群落形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂 樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì)胞 (CFU-GEMM)。
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其中，該方法進(jìn)一步包含以下步驟中的至少一種免疫 選擇關(guān)于CD34的經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞；自培養(yǎng)物分離經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞以用于輸 注于人類中；極冷保藏經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞；或?qū)⒔?jīng)擴(kuò)增臍帶血細(xì)胞分化為細(xì)胞系。
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其中該方法包含使經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞生長以產(chǎn)生 以下任一者的步驟群落形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆 裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞血液系前驅(qū)體細(xì) 胞(CFU"GEMM)。
全文摘要
本發(fā)明提供獲得經(jīng)擴(kuò)增的表現(xiàn)CD34的人類臍帶血細(xì)胞的方法。該方法包括在適于促進(jìn)臍帶血細(xì)胞擴(kuò)增的共同培養(yǎng)條件下以足量月經(jīng)血細(xì)胞接種足量臍帶血細(xì)胞，且在支持臍帶血細(xì)胞的至少兩次或兩次以上群體倍增的培養(yǎng)條件下共同培養(yǎng)臍帶血細(xì)胞與月經(jīng)血細(xì)胞。還提供使經(jīng)擴(kuò)增人類臍帶血細(xì)胞生長以產(chǎn)生以下任一的方法群落形成單位、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞群落形成單位(CFU-GM)、紅細(xì)胞系爆裂樣生成單位(BFU-E)及群落形成單位粒細(xì)胞紅血球巨噬細(xì)胞巨核細(xì)胞(CFU-GEMM)血液系前驅(qū)體細(xì)胞。該經(jīng)擴(kuò)增細(xì)胞可表現(xiàn)CD34、SSEA-4及HLA-Ⅱ。還提供經(jīng)擴(kuò)增細(xì)胞的組合物。
文檔編號C12N5/0789GK101952416SQ200880122741
公開日2011年1月19日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者朱莉·G·阿利克遜, 默西迪絲·A·沃爾頓 申請人:干細(xì)胞國際公司