專利名稱：使用非隨機(jī)引物的cdna合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性擴(kuò)增靶核酸分子的方法和用于引發(fā)靶核酸分子的擴(kuò)增的寡核 苷酸。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)分析通常涉及起始核酸分子的擴(kuò)增?？梢苑謩e或聯(lián)合應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄(RT)， 體外轉(zhuǎn)錄(IVT)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，進(jìn)行核酸分子的擴(kuò)增。起始核酸分子可以是mRNA 分子，其可以通過首先合成互補(bǔ)cDNA分子，然后合成與第一 cDNA分子互補(bǔ)的第二 cDNA分 子，從而產(chǎn)生雙鏈cDNA分子來擴(kuò)增。通常用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，通常用DNA 聚合酶進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。通過使用RNA聚合酶，雙鏈cDNA分子可用于產(chǎn)生互補(bǔ)的 RNA分子，從而擴(kuò)增最初的起始mRNA分子。RNA聚合酶需要啟動子序列以指導(dǎo)RNA合成的 起始。例如，互補(bǔ)的RNA分子可以用作模板來產(chǎn)生另外的互補(bǔ)DNA分子。可選地，例如雙鏈 cDNA分子可以通過PCR來擴(kuò)增，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可以用作測序模板或者用于微陣列分析。核酸分子的擴(kuò)增需要使用與起始材料中一個或多個靶核酸分子特異性雜交的寡 核苷酸引物。每一寡核苷酸引物可以包括位于寡核苷酸的與靶核酸分子雜交的雜交部分的 5’端的啟動子序列。如果寡核苷酸的雜交部分太短，那么寡核苷酸將不能穩(wěn)定地與靶核酸 分子雜交，由此引發(fā)和隨后的擴(kuò)增將不能進(jìn)行。同樣，如果寡核苷酸的雜交部分太短，那么 寡核苷酸將不能與一個或少數(shù)靶核酸分子特異性雜交，而是與大量的靶核酸分子非特異性 雜交。不同靶核酸分子的復(fù)雜混合物(例如RNA分子)的擴(kuò)增，通常需要使用具有不同 核酸序列的多種寡核苷酸的群體。寡核苷酸的成本隨著寡核苷酸的長度增加。為了控制成 本，優(yōu)選制備不長于確保寡核苷酸與靶序列特異性雜交所需的最小長度的寡核苷酸引物。通常不希望擴(kuò)增高表達(dá)的RNA(例如核糖體RNA)。例如，在分析血細(xì)胞基因表達(dá) 的基因表達(dá)試驗中，對大量拷貝的高豐度球蛋白mRNA或者核糖體RNA的擴(kuò)增，可能會使稀 有mRNA的水平的微小變化不明顯。因此，需要一組寡核苷酸引物，其選擇性地擴(kuò)增核酸分 子群內(nèi)的期望的核酸分子(例如，選擇性擴(kuò)增在細(xì)胞中表達(dá)的、除最高表達(dá)的RNA以外的所 有mRNA的寡核苷酸引物)。為了降低合成寡核苷酸的群體的成本，每個寡核苷酸的雜交部 分應(yīng)該不長于在確定條件下確保與期望的靶序列的特異性雜交所需的長度。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供了在較大的非靶核酸分子群中，選擇性擴(kuò)增靶核酸分子 群(例如，除了最高表達(dá)的RNA種類以外，在細(xì)胞類型中表達(dá)的所有RNA分子)的方法。本 發(fā)明的該方面的方法均包括以下步驟(a)用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群，從分離自 哺乳動物受試者的樣品中的RNA模板分子群合成單鏈引物延伸產(chǎn)物群，其中第一寡核苷酸 引物群中的每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中RNA模 板分子群包括靶核酸分子群和非靶核酸分子群；(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群， 從步驟(a)的單鏈引物延伸產(chǎn)物群合成雙鏈cDNA，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷 酸，包括由6，7或8個核苷酸組成的雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列，其中雜交部分選自具有6，7或8個核苷酸的長度，并且在確定的條件下不與合成的單鏈cDNA中的非 靶核酸分子群雜交的所有可能的寡核苷酸。在一些實施方案中，第一寡核苷酸群中的每一 寡核苷酸包括隨機(jī)雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列。另一方面，本發(fā)明提供了在較大的非靶核酸分子群中，選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群 的方法。這方面，本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群，從 分離自哺乳動物受試者的含總RNA的樣品合成單鏈cDNA，其中第一寡核苷酸引物群中的每 一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中雜交部分為包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成員；以及(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，從步驟 (a)合成的單鏈cDNA合成雙鏈cDNA，其中第二寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸，包括雜 交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中雜交部分為包含SEQ ID NO =750-1498 的寡核苷酸群的成員。另一方面，本發(fā)明提供了用于轉(zhuǎn)錄組特征譜分析的方法。這方面，本發(fā)明的方法包 括(a)用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群，從分離自受試者的樣品中的RNA模板分子群中 的靶核酸分子群合成單鏈引物延伸產(chǎn)物群，其中所述第一寡核苷酸引物群包含雜交部分和 位于雜交部分5’端的第一 PCR引物結(jié)合位點，(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群， 從步驟(a)的單鏈引物延伸產(chǎn)物群合成雙鏈cDNA，其中所述第二寡核苷酸引物群包含雜交 部分和位于雜交部分5’端的第二 PCR引物結(jié)合位點，以及(c)用結(jié)合第一 PCR引物結(jié)合 位點的第一 PCR引物和結(jié)合第二 PCR引物結(jié)合位點的第二 PCR引物，對步驟(b)產(chǎn)生的雙 鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中非靶核酸分子群基本上由與哺乳動物受試者相同物種的核糖體 RNA和線粒體核糖體RNA組成。另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群。例如，這些寡核苷 酸可用于引發(fā)與分離自哺乳動物受試者的RNA分子互補(bǔ)的第一鏈cDNA分子的合成，而不引 發(fā)與核糖體RNA(18SJ8S)或線粒體核糖體RNA (12S，16S)分子互補(bǔ)的第一鏈cDNA分子的 合成。在某些實施方案中，寡核苷酸群中的每一寡核苷酸進(jìn)一步包括位于雜交部分5’端的 確定序列部分。在一個實施方案中，確定序列部分包括轉(zhuǎn)錄啟動子，其在PCR擴(kuò)增中用作引 物結(jié)合位點或用于體外轉(zhuǎn)錄。在另一實施方案中，確定序列部分包括其不是轉(zhuǎn)錄啟動子的 引物結(jié)合位點。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中轉(zhuǎn)錄啟動子例如 T7啟動子(SEQ ID NO :1508)，位于具有SEQ ID NO :1-749中所示的序列的寡核苷酸群的成 員的5'端。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于 具有SEQ ID NO :1-749中所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5'端的T7啟動子(SEQ ID NO 1508)所組成。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中確定序列部分 包括用于引發(fā)PCR合成反應(yīng)但不包含RNA聚合酶啟動子序列的至少一個引物結(jié)合位點。用 于此類實施方案的確定序列部分的代表性實例為5' TCCGATCTCT3' (SEQ ID NO :1499)， 其優(yōu)選位于具有SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的成員的5'端。另一方面，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO :750-1498的寡核苷酸群。例如，這些寡 核苷酸可用于引發(fā)與從分離自哺乳動物受試者的RNA合成的第一鏈cDNA分子互補(bǔ)的第二 鏈cDNA分子的合成，而不引發(fā)與逆轉(zhuǎn)錄自核糖體RNA (18S，28S)或線粒體核糖體RNA (12S， 16S)分子的第一鏈cDNA互補(bǔ)的第二鏈cDNA分子的合成。在一些實施方案中，寡核苷酸群 中的每一寡核苷酸進(jìn)一步包括位于雜交部分5’端的確定序列部分。在一個實施方案中，確定序列部分包括轉(zhuǎn)錄啟動子，其可在PCR擴(kuò)增中用作引物結(jié)合位點或用于體外轉(zhuǎn)錄。在另 一實施方案中，確定序列部分包括其不是轉(zhuǎn)錄啟動子的引物結(jié)合位點。例如，在一些實施方 案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中轉(zhuǎn)錄啟動子例如T7啟動子(SEQ ID N0:1508)，位于 具有SEQ ID NO :750-1498中所示序列的寡核苷酸群的成員的5'端。因此，在一些實施方 案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于具有SEQ ID NO :750-1498中所 示序列的寡核苷酸群的不同成員的5'端的T7啟動子(SEQ ID NO 1508)所組成。在進(jìn)一 步的實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中確定序列部分包括用于引發(fā)PCR合成反 應(yīng)但不包含RNA聚合酶啟動子序列的至少一個引物結(jié)合位點。用于此類實施方案的確定 序列部分的代表性實例為5' TCCGATCTGA3' (SEQ ID NO 1500)，其優(yōu)選位于具有SEQ ID NO =750-1498中所示序列的寡核苷酸群的成員的5'端。另一方面，本發(fā)明提供了在較大的非靶核酸分子群中，選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群 的試劑。在一個實施方案中，該試劑包括包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸的至少10%。 在另一個實施方案中，該試劑包括包含SEQ ID NO =750-1498的寡核苷酸的至少10%。另一方面，本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的試劑盒。這方面，本發(fā)明的試 劑盒包括，包含用于第一鏈cDNA合成的第一寡核苷酸群的試劑，其中第一寡核苷酸群中的 每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中雜交部分為包含 SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成員。在一些實施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括用于第二鏈 cDNA合成的第二寡核苷酸群，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括雜交部分和位于 雜交部分5’端的確定序列部分，其中雜交部分為包含SEQ ID NO :750-1498的寡核苷酸群 的成員。另一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)選擇性擴(kuò)增的核酸分子的群，其包括哺乳動物受試者 的轉(zhuǎn)錄組的代表，所述代表包含5’確定序列，相應(yīng)于哺乳動物受試者中表達(dá)的核酸的經(jīng)擴(kuò) 增的序列群，以及3’確定序列，其中經(jīng)擴(kuò)增的序列群對于特定哺乳動物物種而言特征在于 具有下列性質(zhì)(a)具有大于75%的多聚腺苷酸化和非多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄本，并且具有少 于10%的核糖體RNA。


通過參考下列詳細(xì)描述并結(jié)合參考附圖，本發(fā)明的上述方面及許多隨之而來的優(yōu) 點將會更容易并且更好地被理解，其中附圖IA顯示了隨機(jī)6-聚體(N6)寡核苷酸對人RefSeq轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫中的核苷酸 序列的精確匹配的數(shù)量，如實施例1中所描述的；圖IB顯示了不那么隨機(jī)的(Not-So-Random，NSR) 6-聚體寡核苷酸對人RefSeq轉(zhuǎn) 錄本數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列的精確匹配的數(shù)量，如實施例1中所描述的；圖IC顯示了使用用于第一鏈cDNA合成的隨機(jī)引物的混合物和用于第二鏈cDNA 合成的反-NSR 6-聚體寡核苷酸的混合物，合成選擇性擴(kuò)增的cDNA分子的制備物的本發(fā)明 方法的代表性實施方案，如實施例2所描述的；圖ID顯示了使用用于第一鏈cDNA合成的NSR 6_聚體寡核苷酸的混合物和用于 第二鏈cDNA合成的反-NSR 6-聚體寡核苷酸的混合物，然后PCR擴(kuò)增，從而合成選擇性擴(kuò) 增的aDNA分子的制備物的本發(fā)明方法的代表性實施方案，如實施例2和實施例4所描述
圖2為舉例說明受試者的全轉(zhuǎn)錄組分析的方法的流程圖，其包括從分離自受試者 的RNA選擇性擴(kuò)增核酸分子，之后對擴(kuò)增的核酸分子進(jìn)行序列分析或微陣列分析，如實施 例4和實施例5所描述的；圖3A為對數(shù)標(biāo)尺上的柱形圖，其顯示了與使用隨機(jī)引物(N8 = 100% )產(chǎn)生的第 一鏈cDNA相比較，用不同NSR-6庫合成的第一鏈cDNA分子群中18SJ8S，12Sn和16S (相 對于基因和N8進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化)的相對豐度，如實施例3所描述的。圖;3B圖示了，與在第一鏈中使用NSR引物(SEQ ID NO :1-749)然后在第二鏈中 使用隨機(jī)引物(N7)擴(kuò)增的cDNA(NSR > N7 = 3.0% 18S,3.4% 28S)相比較，以及與在第 一鏈中使用NSR引物(SEQ ID NO :1-749)然后在第二鏈中使用反-NSR引物(SEQ ID NO: 750-1498)擴(kuò)增的 cDNA(NSR >反-NSR = 0. 1% 18S，0. 5% 28S)相比較，在第一鏈和第二鏈 合成中均使用隨機(jī)引物(N7)擴(kuò)增的cDNA中胞質(zhì)沙嫩(185或觀幻的相對豐度水平(N7 > N7 = 100% 18S，100% 28S)，如實施例3所描述的；圖3C圖示了，與在第一鏈中使用NSR引物(SEQ ID NO :1-749)然后在第二鏈中 使用隨機(jī)引物(N7)擴(kuò)增的cDNA(NSR > N7 = 27% 12S,20.4% 16S)相比較，以及與在第 一鏈中使用NSR引物(SEQ ID NO :1-749)然后在第二鏈中使用反-NSR引物(SEQ ID NO: 750-1498)擴(kuò)增的。0嫩(賂1 >反-賂1 = 8. 2% 12S，3. 5% 16S)相比較，在第一鏈和第二鏈 合成中均使用隨機(jī)引物(N7)擴(kuò)增的cDNA中線粒體rRNA(12S或16S)的相對豐度水平(N7 > N7 = 100% 12S或16S)，如實施例3所描述的；圖4A為柱形圖，其顯示了在第一鏈合成期間用不同NSR引物合成的cDNA中，代表 性基因轉(zhuǎn)錄本的基因特異性PolyA的含量，如實施例3所描述的；圖4B為柱形圖，其顯示了在第一鏈cDNA合成期間用不同NSR引物，從Jurkat-1 和Jurkat-2總RNA擴(kuò)增的cDNA中，代表性非多聚腺苷酸化RNA的相對豐度水平，如實施例 3所描述的；圖5圖示了，在用NSR-6聚體產(chǎn)生的cDNA中測量的Jurkat/K562 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù) 的對數(shù)比值(χ-軸)對在用隨機(jī)引物(N8)產(chǎn)生的cDNA中測量的Jurkat/K562 mRNA表達(dá) 數(shù)據(jù)的對數(shù)比值，如實施例3所描述的；圖6A圖示了在polyA純化后所通常獲得的總RNA中rRNA與mRNA的比例，其顯示 即使從總RNA中去除95% rRNA，剩余的RNA仍然由約50% rRNA和50% mRNA的混合物組 成，如實施例3所描述的；圖6B圖示了在第一鏈cDNA合成期間用NSR引物且在第二鏈cDNA合成期間用 反-NSR引物而制備的cDNA樣品中rRNA與mRNA的比例。如圖所示，與polyA純化相比， 用NSR引物和反-NSR引物從總RNA產(chǎn)生cDNA可有效去除99. 9% rRNA,從而產(chǎn)生富集超過 95%的mRNA的cDNA群，如實施例3所描述的；圖7A圖示了跨越長轉(zhuǎn)錄本(彡4kb)的NSR引發(fā)的(虛線)或表達(dá)的序列標(biāo)簽 (EST)(實線)cDNA中，polyA+RefSeq mRNA的檢測和位置分布，其舉例說明從5’端開始的 每一堿基位置上顯示的5，790個轉(zhuǎn)錄本的綜合閱讀頻率，如實施例7所描述的；圖7B圖示了跨越長轉(zhuǎn)錄本(彡41Λ)的NSR引發(fā)的(虛線)或表達(dá)的序列標(biāo)簽 (EST)(實線)cDNA中，polyA+RefSeq mRNA的檢測和位置分布，其舉例說明從3’端開始的每一堿基位置上顯示的5，790個轉(zhuǎn)錄本的綜合閱讀頻率，如實施例7所描述的；以及圖8圖示了相對于從分離自通用人類參照(UHR)細(xì)胞系的RNA產(chǎn)生的NSR-引發(fā) 的cDNA，從分離自全腦的RNA產(chǎn)生的NSR-引發(fā)的cDNA中，由第15號染色體I^rader-Willi 神經(jīng)疾病基因座編碼的小核RNA(SnoRNA)的豐富程度，如實施例7所描述的。發(fā)明詳述除非本文明確定義，本文所用的所有術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相 同含義。對于本領(lǐng)域的定義和術(shù)語，請技術(shù)人員特別關(guān)注Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual,2d ed. , Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New YorkjPAusubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons，New York，1999。用于第一鏈cDNA合成的不那么隨機(jī)的(Not-So-Random，〃 NSR“ )6_聚體引物的 使用描述于2006年10月27日提交的共同未決的美國專利申請系列號11/589,322中，其 通過引用并入本文。在特定的實施方案中，共同未決的美國專利申請系列號11/589，322中 描述的NSR-6聚體，包括與血細(xì)胞中表達(dá)的所有mRNA分子雜交，但不與球蛋白mRNA(HBAl， HBA2，HBB, HBD, HBGl和HBG^或細(xì)胞核核糖體RNA(18S和^S rRNA)雜交的寡核苷酸群。 在本申請中，提供了不同的NSR引物群(SEQ ID NO :1-749)，其包括與哺乳動物細(xì)胞中表達(dá) 的所有mRNA分子雜交(包括球蛋白mRNA)，而不與細(xì)胞核核糖體RNA (18S和^S rRNA)和 線粒體核糖體RNA(12S和16S mt-rRNA)雜交的寡核苷酸。本申請進(jìn)一步提供了在第二鏈 cDNA合成期間使用的第二反-NSR寡核苷酸群(SEQ IDNO =750-1498)。反-NSR寡核苷酸 (SEQ ID NO =750-1498)經(jīng)選擇與從哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的RNA模板(包括球蛋白mRNA)逆 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的所有第一鏈cDNA分子雜交，而不與從細(xì)胞核核糖體RNA (18S和^S rRNA)和線 粒體核糖體RNA (12S和16S mt-rRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一鏈cDNA分子雜交。如實施例1_4所 述，在第一鏈合成期間使用NSR引物(SEQ ID NO 1-749)進(jìn)行第一輪選擇性擴(kuò)增接著在第 二鏈合成期間使用反-NSR引物(SEQ ID NO :750-1498)進(jìn)行第二輪選擇性擴(kuò)增，可產(chǎn)生基 本上代表細(xì)胞中表達(dá)的所有polyA RNA和非polyA RNA的雙鏈cDNA群，并且所述cDNA群 具有極低水平(低于10%)的代表不期望的細(xì)胞核核糖體RNA和線粒體核糖體RNA的核酸 分子。如圖2所示，本發(fā)明也提供了分析本發(fā)明擴(kuò)增方法的產(chǎn)物的方法，例如測序和基因表 達(dá)特征譜分析(例如微陣列分析)。如上文所述，一方面，本發(fā)明提供了在較大的非靶核酸分子群中，選擇性擴(kuò)增靶核 酸分子群(例如，除了最高表達(dá)的RNA種類以外，在細(xì)胞類型中表達(dá)的所有RNA分子)的方 法。這方面，本發(fā)明的方法均包括以下步驟(a)用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群，從分 離自哺乳動物受試者的樣品中的RNA合成單鏈cDNA，其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡 核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中所述RNA包括在較大的非 靶核酸分子群中的靶核酸分子群；和(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，從步驟(a) 合成的單鏈cDNA合成雙鏈cDNA，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括由6，7或8 個核苷酸組成的雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列，其中雜交部分選自具有6，7或 8個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸，所述寡核苷酸在確定的條件下不與合成的單鏈 cDNA中的非靶核酸分子群雜交。第二寡核苷酸群還可以包括位于雜交部分5’端的確定序列部分。在一個實施方案中，確定序列部分包括也可用作引物結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄啟動子。因此，在本發(fā)明的這方面的 一些實施方案中，第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸，包括由6個核苷酸或7個核苷酸或8 個核苷酸組成的雜交部分和位于雜交部分5’端的轉(zhuǎn)錄啟動子部分。在另一個實施方案中， 第二寡核苷酸群的確定序列部分包括用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的第二引物結(jié)合位點，其可以任選 地包括轉(zhuǎn)錄啟動子。例如，本發(fā)明提供的反-NSR寡核苷酸群可用于實施本發(fā)明的這方面的 方法。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，鑒定了各具有6個核苷酸的長度的寡核苷酸 群(SEQ ID NO :750-1498)，其可用作引物來引發(fā)所有或基本上所有的從哺乳動物細(xì)胞的 靶RNA分子群合成的第一鏈cDNA分子的第二鏈合成，但不引發(fā)從哺乳動物細(xì)胞的非靶核糖 體RNA(rRNA)或線粒體rRNA(mt_rRNA)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一鏈cDNA的第二鏈合成。所鑒定 的第二寡核苷酸群(SEQ ID NO =750-1498)稱為反-不那么隨機(jī)的(anti-Not-So-Random， 反-NSR)引物。因此，該寡核苷酸群(SEQ ID NO :750-1498)可用于引發(fā)其為從哺乳細(xì)胞分 離的mRNA分子起始群的代表的第一鏈核酸分子群(例如，cDNA)的第二鏈合成，但不引發(fā) 相應(yīng)于rRNA或mt-rRNA的cDNA分子的第二鏈合成。在其他實施方案中，第一寡核苷酸群中的每一寡核苷酸，包括由6，7或8個核苷酸 組成的雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列，其中雜交部分選自具有6，7或8個核苷 酸的長度的、在確定的條件下不與哺乳動物受試者含RNA的樣品中的非靶核酸分子群雜交 的所有可能的寡核苷酸。第一寡核苷酸群還可以包括位于雜交部分5’端的確定序列部分。在一個實施方案 中，確定序列部分包括也可用作第一引物結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄啟動子。因此，在本發(fā)明這方面的 一些實施方案中，第一寡核苷酸群中的每一寡核苷酸，包括由6個核苷酸或7個核苷酸或8 個核苷酸組成的雜交部分和位于雜交部分5’端的轉(zhuǎn)錄啟動子部分。在另一個實施方案中， 第一寡核苷酸群的確定序列部分包括用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的第一引物結(jié)合位點，其可以任選 地包括轉(zhuǎn)錄啟動子。例如，本發(fā)明提供的NSR寡核苷酸群可用于實施本發(fā)明這方面的方法。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，鑒定了各具有6個核苷酸的長度的第一寡核 苷酸群(SEQ ID NO :1-749)，其可用作引物，以引發(fā)所有或基本上所有的來自哺乳動物細(xì)胞 的mRNA分子的第一鏈合成，但不引發(fā)來自哺乳動物細(xì)胞的非靶核糖體RNA(rRNA)或線粒 體rRNA (mt-rRNA)的擴(kuò)增。鑒定的第一寡核苷酸群(SEQ ID NO 1-749)稱為不那么隨機(jī)的 (Not-So-Random, NSR)引物。因此，該寡核苷酸群(SEQ ID N0 1-749)可用于引發(fā)其為從 哺乳細(xì)胞分離的mRNA分子起始群的代表的核酸分子群(例如，cDNA)的第一鏈合成，但不 引發(fā)相應(yīng)于rRNA或mt-rRNA的cDNA分子的第一鏈合成。本發(fā)明也提供了用于引發(fā)第一鏈cDNA合成的第一寡核苷酸群，其中確定的序列， 例如T7啟動子(SEQ ID NO :1508)或第一引物結(jié)合位點(SEQ ID NO :1499)位于具有SEQ ID NO :1-749中所示的序列的寡核苷酸群的成員的5’端。因此，每一寡核苷酸可以包括與 靶核酸分子(例如mRNA)雜交的雜交部分(選自SEQ IDNO 1_749)，和位于雜交部分5’端 的確定序列，例如啟動子序列或第一引物結(jié)合位點。，可以將確定序列部分整合入使用寡核 苷酸(其包括T7啟動子)作為引物擴(kuò)增的DNA分子，而后其可以促進(jìn)DNA分子的轉(zhuǎn)錄?？蛇x地，確定序列部分，例如轉(zhuǎn)錄啟動子或第一引物結(jié)合位點，可以共價連接至 cDNA分子，例如通過DNA連接酶。
有用的轉(zhuǎn)錄啟動子序列包括T7啟動子(5’ AATTAATACGACTCACTATAGGGAGA 3，(SEQ ID NO :1508)) ,SP6 啟動子(5，ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG3，(SEQ ID NO :1509))，和 T3 啟 動子(5，AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA3，(SEQ ID NO :1510))。靶核酸群例如可以包括，細(xì)胞或組織中表達(dá)的除選擇的非靶mRNA群以外(例如最 高豐度表達(dá)的mRNA)的所有mRNA。高豐度表達(dá)的非靶mRNA，通常構(gòu)成細(xì)胞或組織中表達(dá)的 所有mRNA的至少0. 1 % (例如可以構(gòu)成細(xì)胞或組織中表達(dá)的所有mRNA的50%以上或60% 以上或70%以上)。高豐度表達(dá)的非靶mRNA的實例，為哺乳動物細(xì)胞中的核糖體rRNA或 線粒體rRNA?？梢杂帽景l(fā)明方法選擇性消除的高豐度表達(dá)的非靶RNA的其他實例，包括例 如球蛋白mRNA (來自血細(xì)胞)或葉綠體rRNA (來自植物細(xì)胞)。本發(fā)明的方法可用于分析生物細(xì)胞樣品中總RNA的轉(zhuǎn)錄組特征譜，其中期望減少 擴(kuò)增樣品中的RNA群(其不與NSR和/或反-NSR引物雜交)，例如高表達(dá)的RNA (例如核 糖體RNA)的存在。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可用于在來自RNA樣品的經(jīng)擴(kuò)增的核 酸中減少不與NSR引物和/或反-NSR引物雜交的核酸分子群的量，并且與和NSR和/或 反-NSR引物雜交的經(jīng)擴(kuò)增的核酸分子的量相比，減少至少2倍直至1000倍，例如至少10 倍，50倍，100倍，500倍或更高。用于實施本發(fā)明這方面的方法的寡核苷酸群可以選自更大的寡核苷酸群，其中第 一寡核苷酸群基于其在確定的雜件下與靶RNA群雜交，但在確定的條件下不與非靶RNA群 雜交的能力進(jìn)行選擇，而且該第一寡核苷酸群包括具有6個核苷酸，7個核苷酸或8個核苷 酸的長度的所有可能的寡核苷酸。第二寡核苷酸群基于其在確定的條件下與靶第一鏈cDNA群雜交，但在確定的條 件下不與非靶第一鏈cDNA群雜交的能力進(jìn)行選擇，而且該第二寡核苷酸群包括具有6個核 苷酸，7個核苷酸或8個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸。在一個實施方案中，第二寡 核苷酸群可以通過合成第一寡核苷酸群的序列的反向互補(bǔ)序列來產(chǎn)生。第一寡核苷酸群的組成。在一些實施方案中，第一寡核苷酸群包括具有6個核苷 酸，7個核苷酸或8個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸。第一寡核苷酸群可以只包括具 有6個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸，或者具有7個核苷酸的長度的所有可能的寡 核苷酸，或者具有8個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸。任選地，除了具有6個核苷酸 的長度的所有可能的寡核苷酸，或者具有7個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸，或者 具有8個核苷酸的長度的所有可能的寡核苷酸以外，第一寡核苷酸群還可以包括其他寡核 苷酸。通常，第一寡核苷酸群的每一成員的長度不長于30個核苷酸。第一寡核苷酸群的序列。存在4，096種具有6個核苷酸長度的可能的寡核苷 酸，16，384種具有7個核苷酸長度的可能的寡核苷酸，65，536種具有8個核苷酸的長度 的可能的寡核苷酸。構(gòu)成寡核苷酸群的寡核苷酸的序列，可容易地通過計算機(jī)程序例如 Microsoft Word .產(chǎn)生。第一寡核苷酸子群(Subpopulation)的選擇。第一寡核苷酸子群基于第一寡核苷 酸子群的成員在確定的條件下與靶核酸群雜交，但在相同確定的條件下不與非靶群雜交的 能力選自寡核苷酸群。擴(kuò)增的樣品包括將被擴(kuò)增(例如使用逆轉(zhuǎn)錄)的靶核酸分子(例如 RNA或DNA分子)，也包括將不被擴(kuò)增的非靶核酸分子。第一寡核苷酸子群由這樣的寡核苷 酸組成每一寡核苷酸在確定的條件下與在整個期望擴(kuò)增的核酸分子群中分布的靶序列雜交，但在相同確定的條件下不與非期望擴(kuò)增的大多數(shù)(或任何的)非靶核酸分子雜交。第 一寡核苷酸子群在確定的條件下，與靶核酸序列(除了刻意避免的核酸序列(非靶序列) 之外)雜交。
例如，細(xì)胞樣品可以包括包含許多核糖體RNA分子(例如，5S，18S和28S核糖體 RNA)和線粒體rRNA分子(例如，12S和16S核糖體RNA)在內(nèi)的，哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的所有 mRNA分子的群。通常不期望擴(kuò)增核糖體RNA。例如，在分析細(xì)胞基因表達(dá)的基因表達(dá)試驗 中，對大量拷貝的高豐度核糖體RNA的擴(kuò)增，可能使低豐度mRNA的水平的微小變化不明顯。 因此，在本發(fā)明的實施中，選擇第一寡核苷酸子群，其在確定的條件下不與大多數(shù)(或任何 的)非靶核糖體RNA雜交，但在相同確定的條件下與細(xì)胞表達(dá)的大多數(shù)(優(yōu)選所有的)其 他靶mRNA分子雜交。
為了選擇在確定的條件下與靶核酸群雜交，但在確定的雜件下不與非靶核酸群雜 交的第一寡核苷酸子群，必須知道非靶核酸群的成員的完全或基本上完全的核酸序列。因 此，例如必需知道5S，18S，和28S核糖體RNA (或者每一前述核糖體RNA種類的代表性成員) 的核酸序列，和12S與16S核糖體線粒體RNA的核酸序列。從其獲得細(xì)胞樣品的哺乳動物 物種的核糖體RNA的序列，可見于公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫。例如，表1提供了于2007年9月 5日獲取的人12S，16S, 18S和28S核糖體RNA的NCBI Genbank標(biāo)識符。
然后合適的軟件程序可用于將第一寡核苷酸群中的所有寡核苷酸序列(例如所 有可能的6核酸寡核苷酸群)與核糖體RNA序列進(jìn)行比較，以確定哪些寡核苷酸在確定的 雜交條件下與任何部分的核糖體RNA雜交。只選擇在確定的雜交條件下不與核糖體RNA的 任何部分雜交的寡核苷酸。很容易寫出允許比較核酸序列并且鑒定在確定的雜交條件下彼 此雜交的序列的Perl腳本程序。
因此，例如，如實施例1所更詳細(xì)地描述的，鑒定了與任何核糖體RNA序列的任何 部分不完全互補(bǔ)的所有可能的6核酸寡核苷酸子群。通常，寡核苷酸子群(其在確定的條 件下與靶核酸群雜交但在確定的條件下不與非靶核酸群雜交)必須包含有具有足夠差異 性的寡核苷酸序列，以與RNA樣品中的所有或基本上所有的核酸分子雜交。本文實施例1 顯示，具有SEQ ID NO :1-749中所示核酸序列的寡核苷酸群，可與RefSeq公眾數(shù)據(jù)庫中儲 存的基因轉(zhuǎn)錄本群的所有或基本上所有的核酸序列雜交。
另外的確定核酸序列部分。選擇的第一寡核苷酸子群(例如SEQ ID NO :1-749)， 可用于引發(fā)靶RNA分子群的逆轉(zhuǎn)錄，以產(chǎn)生第一鏈cDNA。可選地，第一寡核苷酸群可用作引 物，其中每一寡核苷酸包括選擇的寡核苷酸子群的一個成員的序列，并且還包括另外的確 定核酸序列。所述另外的確定核酸序列，通常位于選擇的寡核苷酸子群的成員的序列的5’ 端。通常，寡核苷酸群包括選擇的寡核苷酸子群的所有成員的序列(例如，寡核苷酸群可以 包括SEQ ID NO 1-749中所示的所有序列)。
選擇另外的確定核酸序列以使其不影響寡核苷酸與互補(bǔ)靶序列的雜交特異性。 例如，如圖ID所示，每一第一寡核苷酸可以包括轉(zhuǎn)錄啟動子序列或第一引物結(jié)合位點 (PBS#1)，其位于選擇的寡核苷酸子群的成員的序列的5’端?？蓪幼有蛄姓先霐U(kuò)增 的核酸分子，所述核酸分子從而可用作RNA合成的模板。任何RNA聚合酶啟動子序列，可包 括在寡核苷酸群的確定序列部分中。代表性實例包括T7啟動子(SEQ ID N0:1508)，SP6啟 動子(SEQ ID NO :1509)，和 T3 啟動子(SEQ ID NO :1510)。
在本發(fā)明這方面的一些實施方案中，如圖IC所示，第一寡核苷酸群中的每一寡核 苷酸包括隨機(jī)雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列。如圖IC所示，每一第一寡核苷酸 可以包括位于隨機(jī)雜交部分5’端的包含引物結(jié)合位點的確定序列。將引物結(jié)合位點整合 入擴(kuò)增的核酸，其從而可以作為PCR引物結(jié)合位點用于從cDNA產(chǎn)生雙鏈擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物。 引物結(jié)合位點可以是轉(zhuǎn)錄啟動子序列的部分。第二寡核苷酸群的序列。第二寡核苷酸群的詵擇方法與如上所沭的第一寡核苷酸 群的選擇方法類似，其區(qū)別在于選擇由6個核苷酸，7個核苷酸或8個核苷酸組成的雜交部 分，以在確定的條件下與從靶RNA逆轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA雜交，而在確定的條件下不與從非 靶RNA逆轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA雜交。利用上述方法，例如利用公眾可獲得的核糖體RNA序列， 可選擇第二寡核苷酸群。第二寡核苷酸群也可以作為第一寡核苷酸群的反向互補(bǔ)序列而產(chǎn) 生(反-NSR)。因此例如，如實施例1所更詳細(xì)描述的，基于所有可能的6核酸寡核苷酸選擇第 二群，所述寡核苷酸與鑒定的任何核糖體RNA序列的任何部分都不完全互補(bǔ)。本文實施 例1顯示，具有如SEQ ID NO :1-749所示的核酸序列的寡核苷酸群，可與RefSeq公眾數(shù) 據(jù)庫中儲存的基因轉(zhuǎn)錄本群的所有或基本上所有的核酸序列雜交。第二群SEQ ID NO 750-1498 (反-NSR)由此產(chǎn)生，其是第一寡核苷酸群(SEQ ID NO :1-749，NSR)的反向互補(bǔ) 序列。另外的確定核酸序列部分。選擇的第二寡核苷酸子群(例如SEQ IDNO =750-1498) 可用于引發(fā)第一鏈cDNA分子靶群的第二鏈cDNA合成?？蛇x地，第二寡核苷酸群可以用作引 物，其中每一寡核苷酸包括選擇的寡核苷酸子群的一個成員的序列，并且還包括另外的確 定核酸序列。另外的確定核酸序列，通常位于選擇的寡核苷酸子群的成員的序列的5’端。 通常，寡核苷酸群包括選擇的寡核苷酸子群的所有成員的序列(例如，寡核苷酸群可以包 括SEQ ID NO =750-1498中所示的所有序列)。選擇另外的確定核酸序列以使其不影響寡核苷酸與互補(bǔ)靶序列的雜交特異性。 例如，如圖ID所示，每一第一寡核苷酸可以包括轉(zhuǎn)錄啟動子序列或第二引物結(jié)合位點 (PBS#2)，其位于選擇的寡核苷酸子群的成員的序列的5’端?？蓪幼有蛄姓先霐U(kuò)增 的核酸分子，所述核酸分子從而可用作RNA合成的模板。任何RNA聚合酶啟動子序列，可包 括在寡核苷酸群的確定序列部分。代表性實例包括T7啟動子(SEQ ID N0:1508)，SP6啟動 子(SEQ ID NO :1509)，和 T3 啟動子(SEQ ID NO :1510)。另一方面，本發(fā)明提供了第一寡核苷酸群，其中所述群的每一寡核苷酸包括(a) 其為寡核苷酸子群成員的6核酸寡核苷酸序列(SEQ ID NO :1-749)，其中所述寡核苷酸子 群與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的所有或基本上所有的RNA雜交，但不與核糖體RNA雜交；和(b)位 于6核酸寡核苷酸序列5，端的引物結(jié)合位點(PBS#1)序列(SEQ ID NO :1499)。在一個實 施方案中，第一寡核苷酸群包括如SEQ ID NO :1-749所示的所有6核苷酸序列。在另一實 施方案中，第一寡核苷酸群包括SEQ ID NO :1-749中所示的6核苷酸序列的至少10% (例 如至少 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，或 99% )。任選地，間隔子部分位于第一寡核苷酸群的確定序列部分和雜交部分之間。間隔 子部分的長度，通常為1-12個核苷酸(例如長度為1-6個核苷酸)，并且可以包括任意組 合的隨機(jī)核苷酸(N = A，C，T，或G)。例如，間隔子部分可以由隨機(jī)選擇的核苷酸組成。間隔子部分的全部或部分可以和與雜交部分相同的靶核酸序列雜交或不雜交。如果間隔子部 分的全部或部分和與雜交部分相同的靶核酸序列雜交，那么結(jié)果將增強(qiáng)包括雜交部分和雜 交間隔子部分的寡核苷酸所引發(fā)的cDNA合成的效率。在一些實施方案中，第一寡核苷酸群 進(jìn)一步包括位于引物結(jié)合位點和雜交部分之間的，由1-10個隨機(jī)核苷酸(A，C，T，或G)組 成的間隔子區(qū)。在另一實施方案中，第一寡核苷酸群包括如SEQ ID NO :1-749所示的所有 6核苷酸序列，其中每一核苷酸序列在5’端進(jìn)一步包括至少一個間隔子核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了第二寡核苷酸，其中所述群的每一寡核苷酸包括(a)其 為寡核苷酸子群成員的6核酸寡核苷酸序列(SEQ ID NO :750-1498)，其中所述寡核苷酸子 群與從哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的RNA逆轉(zhuǎn)錄的所有或基本上所有的第一鏈cDNA雜交，但不與從 核糖體RNA逆轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA雜交；和(b)位于6核酸寡核苷酸序列5’端的引物結(jié)合 位點(PBS#2)序列(SEQ ID NO :1500)。在一個實施方案中，第一寡核苷酸群包括如SEQ ID NO =750-1498所示的所有6核苷酸序列。在另一實施方案中，第一寡核苷酸群包括如SEQ ID NO :750-1498所示的6核苷酸序列的至少10% (例如至少20%，30%，40%，50%，60%， 70%，80%，85%，90%，95%，或 99% )。任選地，間隔子部分位于第二寡核苷酸群的確定序列部分和雜交部分之間。間隔 子部分的長度，通常為1-12個核苷酸(例如長度為1-6個核苷酸)，并且可以包括任意組合 的隨機(jī)核苷酸(N = A，C，T，或G)。例如，間隔子部分可以由隨機(jī)選擇的核苷酸組成。間隔 子部分的全部或部分可以和與雜交部分相同的靶核酸序列雜交或不雜交。如果間隔子部分 的全部或部分和與雜交部分相同的靶核酸序列雜交，那么結(jié)果將增強(qiáng)包括雜交部分和雜交 間隔子部分的寡核苷酸所引發(fā)的cDNA合成的效率。在一些實施方案中，第一寡核苷酸群進(jìn) 一步包括位于引物結(jié)合位點和雜交部分之間的，由1-10個隨機(jī)核苷酸(A，C，T，或G)組成 的間隔子區(qū)。在另一實施方案中，第一寡核苷酸群包括如SEQ ID NO :750-1498所示的所有 6核苷酸序列，其中每一核苷酸序列在5’端進(jìn)一步包括至少一個間隔子核苷酸。在一些實施方案中，第一寡核苷酸群的確定序列部分和第二寡核苷酸群的確定序 列部分，各自由范圍在至少10個核苷酸直至30個核苷酸，例如10-12個核苷酸，10-14個 核苷酸，10-16個核苷酸，10-18個核苷酸，和10-20個核苷酸的長度組成。在一些實施方案 中，第一和第二寡核苷酸群的每一寡核苷酸的確定序列部分由10個核苷酸組成，其中確定 序列部分包括PCR引物結(jié)合位點，并且其中第一寡核苷酸群每一成員的PCR結(jié)合位點中的 至少8個連續(xù)核苷酸，與第二寡核苷酸群每一成員的PCR結(jié)合位點中的至少8個核苷酸，具 有相同的序列。在進(jìn)一步的實施方案中，第一和第二寡核苷酸群的每一確定序列部分由10 個核苷酸組成，其中確定序列部分包括PCR引物結(jié)合位點，并且其中第一寡核苷酸群每一 成員的PCR結(jié)合位點中的至少8個連續(xù)核苷酸，與第二寡核苷酸群每一成員的PCR結(jié)合位 點中的至少8個核苷酸，具有相同的序列，并且其中第一寡核苷酸群的確定序列部分的3’ 端剩余的兩個核苷酸(例如C，T)不同于第二寡核苷酸群的確定序列部分3’端的兩個核 苷酸(例如G，A)，從而允許在序列分析之后、在序列閱讀比對之前，鑒定轉(zhuǎn)錄鏈(有義或反 義)。在進(jìn)一步的實施方案中，提供了雜合的RNA/DNA寡核苷酸，其中第一寡核苷酸群 的確定序列部分包括RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5’端。在一個實 施方案中，雜合引物的5' RNA部分由至少11個RNA核苷酸的確定序列部分組成，而雜合引物的3' DNA部分由至少3個DNA核苷酸組成。在特定的實施方案中，雜合RNA/DNA寡 核苷酸包括與NSR引物(SEQ ID NO :1-749)的5，端共價連接的SEQ ID N0:1558。用雜合 RNA/DNA寡核苷酸產(chǎn)生的cDNA可用作模板，通過使用美國專利6，946，251描述的方法來產(chǎn) 生單鏈擴(kuò)增的DNA，該專利通過引用并入本文，如實施例6進(jìn)一步描述的。例如，包括雜合RNA/DNA的確定序列部分(SEQ ID NO :1558)和雜交部分(SEQ ID NO :1-749)的，用于第一鏈cDNA合成的第一寡核苷酸群形成了模板RNA中的靶核酸分子復(fù) 制的基礎(chǔ)。包含雜合RNA/DNA引物部分的第一寡核苷酸群與RNA模板中的靶RNA雜交，并 且雜合RNA/DNA引物可被RNA-依賴性DNA聚合酶延伸以形成第一引物延伸產(chǎn)物(第一鏈 cDNA)。在切割模板RNA之后，在第一引物延伸產(chǎn)物的復(fù)合物中形成第二鏈cDNA。根據(jù)該實 施方案，由于第一引物延伸產(chǎn)物中的雜合引物的存在，第一和第二引物延伸產(chǎn)物的雙鏈復(fù) 合物在一端由RNA/DNA雜合體組成。然后，雙鏈復(fù)合物可與試劑，例如切割RNA/DNA雜合體 中的RNA的酶(例如RNA酶H) —起用于產(chǎn)生單鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，所述酶切割雜交體的RNA 序列，從而保留第二引物延伸產(chǎn)物上的序列以結(jié)合另一雜合引物，所述雜合引物與第一雜 合引物可以相同或不相同。另一第一引物延伸產(chǎn)物由高進(jìn)行性DNA聚合酶例如phU9產(chǎn)生， 所述產(chǎn)物替換了先前被部分切割的第一引物延伸產(chǎn)物，從而產(chǎn)生了替換的切割的第一引物 延伸產(chǎn)物。在可選的實施方案中，通過修飾雙鏈cDNA產(chǎn)物(所有DNA)(用隨機(jī)引物或者NSR 與反-NSR引物或者其組合產(chǎn)生)，產(chǎn)生用于單鏈DNA擴(kuò)增的雙鏈復(fù)合物。將雙鏈cDNA產(chǎn)物 變性，將RNA/DNA雜合引物退火至第二鏈cDNA 3'末端部分上的預(yù)先確定的引物序列。然 后用逆轉(zhuǎn)錄酶延伸雜合引物的DNA部分，以形成具有RNA雜合部分的雙鏈復(fù)合物。通過先 用RNA酶H處理以除去復(fù)合物的RNA部分，再加入RNA/DNA雜合引物和加入高進(jìn)行性DNA 聚合酶例如Phi29，將雙鏈復(fù)合物用作單鏈DNA擴(kuò)增的模板，以產(chǎn)生單鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。雜交條件。在本發(fā)明的實施過程中，第一寡核苷酸群基于寡核苷酸群的成員在確 定的條件下與靶核酸群雜交，但在相同確定的條件下不與非靶核酸群雜交的能力選自寡 核苷酸群。確定的雜交條件允許第一寡核苷酸與存在于樣品中的、除核糖體RNA以外的 所有核酸分子特異性雜交。通常，雜交條件溫度低于天然雙鏈體的解鏈溫度(Tm)不超過 250C -300C (例如10°C )。超過約100個堿基的核酸分子的 ιι，可用公式 ιι = 81. 5+0. 41% (G+C)-log(Na+)進(jìn)行計算，其中(G+C)為核酸分子的鳥苷和胞苷含量。對于長度少于100 個堿基的寡核苷酸分子，示例性雜交條件為低于Tm 5°C-10°C。一般而言，減少短寡核苷 酸雙鏈體的Tm值大約(500/寡核苷酸長度)°C。在本發(fā)明的一些實施方案中，雜交溫度在 400C -50°C的范圍內(nèi)。合適的雜交條件也可以通過經(jīng)驗確定，而無需過多的試驗。在本發(fā)明的一個實施方案中，第一寡核苷酸群在約40°C的溫度下與靶核酸分子群 雜交。在本發(fā)明的一個實施方案中，第二寡核苷酸群在約37°C的溫度下與單鏈引物延伸 產(chǎn)物群中的靶核酸分子群雜交。擴(kuò)增條件。在本發(fā)明的實施中，靶核酸群的第一子群的擴(kuò)增在確定的擴(kuò)增條件下 進(jìn)行。可以如上所述選擇雜交條件。通常，確定的擴(kuò)增條件包括用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行第一鏈cDNA 合成。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在確定濃度的脫氧核苷三磷酸(dNTP)的存在下進(jìn)行。在一些實施方案 中，dNTP濃度在約1000-約2000 μ M的范圍內(nèi)，以富集靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，如在2006年10月27日提交的共同未決美國專利申請系列號11/589,322中所述，其通過引用并入本文。寡核苷酸的組成與合成?？捎糜诒景l(fā)明的實施的寡核苷酸引物可以是DNA。RNA， PNA，嵌合混合物，或它們的衍生物或修飾物，只要它仍能夠引發(fā)期望的反應(yīng)。寡核苷酸引物 可以在堿基部分，糖部分，或磷酸主鏈上進(jìn)行修飾，并可以包括其他的附加基團(tuán)或標(biāo)記，只 要其仍能夠引發(fā)期望的擴(kuò)增反應(yīng)。例如，寡核苷酸引物可以包括至少一個修飾的堿基部分，所述堿基部分選自包括 但不限于以下的組5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌 呤，4-乙?；奏ぃ?-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷，5-羧甲基 氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖基Q苷，肌苷，N6-異戊基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤， 1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞 嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶， β-D-甘露糖基Q苷，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-異戊 基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸，假尿嘧啶，Q苷，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫代尿嘧啶，2-硫 代尿嘧啶，4-硫代尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯，5-甲基-2-硫代尿嘧 啶，3-(3-氨基-3-N-2-羚丙基)尿嘧啶和2，6- 二氨基嘌呤。例如，寡核苷酸引物可包括至少一個修飾的糖部分，所述糖部分選自包括但不限 于以下的組阿拉伯糖，2-氟阿位伯糖，木酮糖，和己糖。例如，寡核苷酸引物可以包括至少一個修飾的磷酸主鏈，所述磷酸主鏈選自硫代 磷酸酯，二硫代磷酸酯，硫代氨基磷酸酯，氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，甲基膦酸酯，烷基磷 酸三酯，和甲酰乙縮醛(formacetal)，或它們的類似物。用于本發(fā)明的方法的寡核苷酸引物，可以通過使用非特異性核酸切割化學(xué)劑或酶 或者位點特異性限制性核酸內(nèi)切酶切割較大的核酸片段獲得，或者可以通過用本領(lǐng)域已知 的標(biāo)準(zhǔn)方法合成而獲得，例如通過使用自動化DNA合成儀(例如其可商購自Biosearch， Applied Biosystems等)和標(biāo)準(zhǔn)亞磷酰胺化學(xué)法。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸可以使 用Stein等人的方法來合成(Nuc 1. Acids Res. 16 =3209-3221,1988)，甲基膦酸酯寡核苷 酸可以使用受控的孔度玻璃聚合物支持物來制備(Sarin et al. , Proc. Natl. Acad. Sci U. S. Α. 85 :7448-7451,1988)。一旦合成期望的寡核苷酸，其將從固體支持物(寡核苷酸在其上合成)上切割下 來，并且用本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行處理，以除去存在的任何保護(hù)基團(tuán)。然后寡核苷酸用本領(lǐng) 域已知的任何方法進(jìn)行純化，包括萃取和凝膠純化。寡核苷酸的濃度和純度，可通過對在丙 烯酰胺凝膠上分離的寡核苷酸進(jìn)行檢測而確定，或者通過使用分光光度計在260nm處測量 光密度而確定。例如，本發(fā)明這方面的方法可用于選擇性地擴(kuò)增mRNA的編碼區(qū)，內(nèi)含子，基因的 可變剪接形式，以及調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA。另一方面，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO :1-749所示核酸序列的至少10% (例如 至少 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，或99%)的寡核苷酸群。例 如，這些寡核苷酸(SEQ ID NO 1-749)可用于引發(fā)與從哺乳動物受試者分離的RNA分子互 補(bǔ)的cDNA分子的第一鏈合成，但不引發(fā)與核糖體RNA分子互補(bǔ)的cDNA分子的第一鏈合成。 事實上，例如，這些寡核苷酸(SEQ ID NO 1-749)可用于引發(fā)以任何RNA分子群作為模板的cDNA合成，但不擴(kuò)增顯著量的核糖體RNA或線粒體核糖體RNA。例如，本發(fā)明提供了寡核苷 酸群，其中確定序列部分，例如轉(zhuǎn)錄啟動子如T7啟動子(SEQ ID NO :1508)，或引物結(jié)合位 點(PBS#1) (SEQ ID NO :1499)位于具有如SEQ ID NO :1-749所示的序列的寡核苷酸群的成 員的5’端。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于 具有如SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5，端的T7啟動子(SEQ ID NO 1508)組成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于 具有如SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5’端的引物結(jié)合位點SEQ ID NO :1499和隨機(jī)間隔子核苷酸(A，C，T，或G)組成。在一些實施方案中，寡核苷酸群包 括SEQ ID NO :1-749所示的6核苷酸序列的至少10% (例如20%，30%，40%，50%，60%， 70%，80%，90%，95%，或 99% )。另一方面，本發(fā)明提供了包括SEQ ID NO :750-1498所示的核酸序列的至少10% (例如至少 20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，或 99% )的寡核苷 酸群。例如，這些寡核苷酸(SEQ ID NO =750-1498)可用于引發(fā)與從哺乳動物受試者分離的 RNA分子互補(bǔ)的單鏈引物延伸產(chǎn)物的第二鏈合成，但不引發(fā)與核糖體RNA分子互補(bǔ)的cDNA 分子的第二鏈合成。事實上，例如，這些寡核苷酸(SEQ ID NO =750-1498)可用于引發(fā)以任 何單鏈引物延伸分子群作為模板的第二鏈cDNA合成，但不擴(kuò)增顯著量的與核糖體RNA或 線粒體核糖體RNA互補(bǔ)的單鏈引物延伸分子。例如，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中確定 序列部分，例如轉(zhuǎn)錄啟動子如T7啟動子(SEQ ID NO :1508)，或引物結(jié)合位點(PBS#2) (SEQ IDNO 1500)位于具有如SEQ ID NO =750-1498所示序列的寡核苷酸群的成員的5，端。因 此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于具有如SEQ ID NO =750-1498所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5，端的T7啟動子(SEQ ID NO :1508) 組成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸由位于具有如SEQ ID NO :750-1498所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5，端的引物結(jié)合位點(PBS#2) SEQ ID NO :1500和隨機(jī)間隔子核苷酸(A，C，T，或G)組成。在一些實施方案中，寡核苷酸群包括 SEQ IDNO =750-1498 所示的 6 核苷酸序列的至少 10% (例如 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%，80%，90%，95%，或 99% )。另一方面，本發(fā)明提供了從RNA模板分子群選擇性合成單鏈引物延伸產(chǎn)物(第一 鏈cDNA)的試劑。例如，該試劑可用于引發(fā)與從哺乳動物受試者分離的樣品中的靶RNA模 板分子互補(bǔ)的第一鏈cDNA分子的合成，但不引發(fā)與核糖體RNA分子互補(bǔ)的第一鏈cDNA分 子的合成。本發(fā)明的試劑包括，包含SEQ ID NO :1-749所示的核酸序列的至少10%的寡核 苷酸群。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，所述寡核苷酸群包括SEQ ID NO :1-749所示的6核苷酸序列的至少10% (例如20 %，30%，40 %，50 %，60%，70 %， 80 %，85 %，90 %，95 %，或99 % )。在一些實施方案中，選擇寡核苷酸群以與樣品中存在的、 除核糖體RNA和線粒體rRNA以外的基本上所有的核酸分子雜交。在其他實施方案中，選 擇寡核苷酸群以與樣品中存在的核酸分子的子集雜交，其中核酸分子的子集不包括核糖體 RNA。另一方面，本發(fā)明提供了從單鏈引物延伸產(chǎn)物群(第一鏈cDNA)選擇性合成雙鏈 cDNA的試劑。例如，該試劑可用于引發(fā)與從哺乳動物受試者分離的樣品中的靶RNA模板分 子互補(bǔ)的第二鏈cDNA分子的合成，但不引發(fā)與核糖體RNA分子互補(bǔ)的第二鏈cDNA分子的合成。本發(fā)明這方面的試劑，可用于引發(fā)使用隨機(jī)引物產(chǎn)生的第一鏈cDNA的合成，或者可 用于引發(fā)使用NSR引物(例如SEQ ID NO 1-749)產(chǎn)生的第一鏈cDNA的合成，以提供另外 的選擇靶分子的步驟。本發(fā)明這方面的試劑包括，包含SEQ ID NO :750-1498所示的核酸序 列的至少10%的寡核苷酸群。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，所述 寡核苷酸群包括SEQ ID NO :750-1498所示的6核苷酸序列的至少10% (例如20%，30%， 40%，50%，60%，70%，80%，85%，90%，95%，或99% )。在一些實施方案中，選擇寡核苷 酸群以與樣品中存在的、除從核糖體RNA和線粒體rRNA合成的第一鏈cDNA以外的基本上 所有的第一鏈cDNA分子雜交。在其他實施方案中，選擇寡核苷酸群以與樣品中存在的第一 鏈cDNA分子的子集雜交，其中第一鏈cDNA分子的子集不包括從核糖體RNA合成的cDNA分 子。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其中含轉(zhuǎn)錄啟動子例如 T7啟動子的確定序列部分位于具有如SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的成員的 5’端。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其中每一寡核苷酸由 位于具有如SEQ ID N0:l-749所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5，端的T7啟動子(SEQ ID NO 1508)組成。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其中含引物結(jié) 合位點(例如PBS#1)的確定序列部分，位于具有如SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸 群的成員的5’端。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其中每一 寡核苷酸由位于具有如SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5’端的引 物結(jié)合位點(例如PBS#1) (SEQ ID NO :1499)組成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了進(jìn)一 步包含至少一個隨機(jī)核苷酸的間隔子區(qū)的試劑，所述間隔子區(qū)位于引物結(jié)合位點和具有如 SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的不同成員之間。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其中含轉(zhuǎn)錄啟動子例如 T7啟動子的確定序列部分，位于具有如SEQ ID NO :750-1498所示序列的寡核苷酸群的成 員的5’端。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其中每一寡核苷 酸由位于具有如SEQ ID NO =750-1498所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5，端的T7啟 動子(SEQ ID NO 1508)組成。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群的試劑，其 中含引物結(jié)合位點(例如PBS#2)的確定序列部分，位于具有如SEQ ID NO :750-1498所示 序列的寡核苷酸群的成員的5’端。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了含寡核苷酸群 的試劑，其中每一寡核苷酸由位于具有如SEQ ID NO :750-1498所示序列的寡核苷酸群的不 同成員的5，端的引物結(jié)合位點(PBS#2) (SEQ ID NO 1500)組成。在一些實施方案中，本發(fā) 明提供了進(jìn)一步包含至少一個隨機(jī)核苷酸的間隔子區(qū)的試劑，所述間隔子區(qū)位于引物結(jié)合 位點和具有如SEQ ID NO :750-1498所示序列的寡核苷酸群的不同成員之間。本發(fā)明的試劑可以以水性溶液，或去除了水的水性溶液，或凍干固體的形式提供。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明的試劑可以包括用于產(chǎn)生雙鏈cDNA的一種或多 種下列成分逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶，DNA連接酶，RNA酶H，Tris緩沖液，鉀鹽，鎂鹽，銨鹽，還 原劑，脫氧核苷三磷酸(dNTP)，[β]_煙酰胺腺嘌呤二核苷酸([i3]_NAD+)，和核糖核酸酶 抑制劑。例如，試劑可以包括經(jīng)優(yōu)化用于第一鏈cDNA合成的成分，例如具有減少的RNA酶 H活性和增加的熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶(例如Superscript III Reverse Transcriptase, hvitrogen)，和終濃度范圍在50 5000 μ M的dNTP，或者更優(yōu)選地，終濃度范圍在10002000 μ M ^ dNTPo另一方面，本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增獲自哺乳動物受試者的樣品中的RNA模板分 子群中的靶核酸分子群的試劑盒。在一些實施方案中，試劑盒包括(a)含第一寡核苷酸引 物群的第一試劑，其中確定序列部分例如引物結(jié)合位點(PBS#1)位于由6個核苷酸組成的 雜交部分的5’端，所述雜交部分選自具有6個核苷酸的長度的、在確定的條件下不與RNA 模板分子群中的非靶核酸分子群雜交的所有可能的寡核苷酸，其中所述非靶核酸分子群基 本上由RNA模板分子群中的最高豐度的核酸分子組成，(b)含第二寡核苷酸引物群的第二 試劑，其中確定序列部分例如引物結(jié)合位點(PBSi^)位于由6個核苷酸組成的雜交部分的 5’端，其中所述雜交部分選自第一寡核苷酸引物群的雜交部分的核苷酸序列的反向互補(bǔ)序 列，和(c)與第一寡核苷酸群的第一確定序列部分結(jié)合的第一 PCR引物以及與第二寡核苷 酸群的第二確定序列部分結(jié)合的第二 PCR引物。在一些實施方案中，第一試劑包括具有SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群 的成員。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含含有第一寡核苷酸群的第一試劑的 試劑盒，其中每一寡核苷酸由位于具有如SEQ ID NO :1-749所示序列的寡核苷酸群的不同 成員的5，端的第一引物結(jié)合位點(PBS#1) (SEQ IDNO :1499)組成。在一些實施方案中，本 發(fā)明提供了包含含有第二寡核苷酸群的第二試劑的試劑盒，其中每一寡核苷酸由位于具有 如SEQ ID NO :750-1498所示序列的寡核苷酸群的不同成員的5’端的第二引物結(jié)合位點 (PBS#2) (SEQ IDNO 1500)組成。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含第一 PCR引物和第 二 PCR引物的試劑盒，其中所述第一 PCR引物包含與第一寡核苷酸群的確定序列部分雜交 的至少10個連續(xù)核苷酸，且任選地包括不與第一寡核苷酸群雜交的另外的序列尾部，所述 第二 PCR引物包含與第二寡核苷酸群的確定序列部分雜交的至少10個連續(xù)核苷酸，且任選 地包括不與第二寡核苷酸群雜交的另外的序列尾部。在一個實施方案中，第一 PCR引物由 SEQ ID NO 1501組成，第二 PCR引物由SEQ ID NO :1502組成。該實施方案的試劑盒可用 于，從用本發(fā)明的NSR引物(SEQID NO 1-749)和反-NSR引物(SEQ ID NO :750-1498)產(chǎn)生 的cDNA產(chǎn)生擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。根據(jù)本文描述的方法，本發(fā)明的試劑盒可設(shè)計用于檢測任何靶核酸群，例如細(xì)胞 或組織中表達(dá)的、除最高豐度表達(dá)的RNA以外的所有RNA。示例性寡核苷酸引物的非限制性 實例，包括SEQ ID NO 1-749ο引物結(jié)合區(qū)的非限制性實例示于SEQ ID NO :1499和1500中。間隔子部分可以包括核苷酸的任意組合，包括與靶RNA雜交的核苷酸。在一些實施方案中，試劑盒包括包含具有6，7，或8個核苷酸的雜交部分的寡核苷 酸引物的試劑。在一些實施方案中，試劑盒包括包含可用于檢測多個哺乳動物mRNA靶的寡核苷 酸引物群的試劑。在一些實施方案中，試劑盒包括在40°C -50°C的溫度范圍內(nèi)雜交的寡核苷酸。在另一實施方案中，試劑盒包括不檢測rRNA或線粒體rRNA的寡核苷酸子群。用于 本實施方案的試劑盒的示例性寡核苷酸，提供于SEQ ID NO :1-749和SEQ ID NO :750_1498。在一些實施方案中，試劑盒包括含寡核苷酸群的試劑，所述寡核苷酸群包含SEQ ID NO :1-749所示的6核苷酸序列的至少10% (例如至少20 %，30 %，40 %，50 %，60 %，70%，80%，85%，90%，95%，或 99% )。在一些實施方案中，試劑盒包括含寡核苷酸群的試劑，所述寡核苷酸群包含SEQ ID NO :750-1498所示的6核苷酸序列的至少10% (例如至少20%，30%，40%，50%，60%， 70%，80%，85%，90%，95%，或 99% )。在一些實施方案中，試劑盒包含寡核苷酸，其中轉(zhuǎn)錄啟動子包括T7啟動子(SEQ ID NO :1508)，SP6 啟動子(SEQ ID NO 1509)，或 T3 啟動子(SEQ ID NO :1510)。在另一實施方案中，試劑盒可以包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有含有核苷酸的 任意組合的1-12個核苷酸的間隔子部分。在本發(fā)明的一些實施方案中，試劑盒可進(jìn)一步包括用于產(chǎn)生cDNA的一種或多種 下列組分逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶，DNA連接酶，RNA酶H，Tris緩沖液，鉀鹽(例如氯化鉀)， 鎂鹽(例如氯化鎂)，銨鹽(例如硫酸銨)，還原劑(例如二硫代蘇糖醇)，脫氧核苷三磷酸 (dNTP)，[β]_煙酰胺腺嘌呤二核苷酸([i3]_NAD+)，和核糖核酸酶抑制劑。例如，試劑盒可 以包括經(jīng)優(yōu)化用于第一鏈cDNA合成的組分，例如具有減少的RNA酶H活性和增加的熱穩(wěn)定 性的逆轉(zhuǎn)錄醇(例如 Superscript III Reverse Transcriptase， Invitrogen)，禾口 dNTP 儲備液以提供終濃度范圍在50 5000 μ Μ,或者更優(yōu)選地，終濃度范圍在1000 2000 μ M 的 dNTP。在各種實施方案中，試劑盒可以包括檢測劑，例如STOR綠色染料或BEBO染料，其 在PCR擴(kuò)增步驟期間優(yōu)先或?qū)Ｓ械亟Y(jié)合雙鏈DNA。在其他的實施方案中，試劑盒可以包括正 向和/或反向引物，所述引物含熒光團(tuán)和淬滅劑以檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的量。本發(fā)明的試劑盒還可提供用于擴(kuò)增的cDNA的體外轉(zhuǎn)錄的試劑。例如，在一些實施 方案中，試劑盒可以進(jìn)一步包括一種或多種下列組分RNA聚合酶，IPPase (磷酸肌醇1_磷 酯酶)酶，轉(zhuǎn)錄緩沖液，Tris緩沖液，鈉鹽(例如氯化鈉)，鎂鹽(例如氯化鎂)，亞精胺，還 原劑(例如二硫代蘇糖醇)，核苷三磷酸(ATP，CTP, CTP, UTP)，和氨基-烯丙基-UTP。在另一實施方案中，試劑盒可以包括使用Cy3或Cy5染料標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的試 劑，其用于將標(biāo)記的cDNA樣品與微陣列雜交。在另一實施方案中，試劑盒可以包括用于標(biāo)記雙鏈PCR產(chǎn)物的試劑。例如，試劑盒 可以包括用于在PCR期間摻入修飾堿基例如氨基-烯丙基dUTP的試劑，其隨后可與胺反應(yīng) 性Cy染料化學(xué)偶聯(lián)。在另一實例中，試劑盒可以包括用于將Cy染料與鳥嘌呤殘基直接化 學(xué)連接以標(biāo)記PCR產(chǎn)物的試劑。在另一實施方案中，試劑盒可以包括用于測序雙鏈PCR產(chǎn)物的一種或多種下列試 劑Taq DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶，核酸外切酶I (大腸桿菌(E. coli))，測序引物，dNTP, 終止(脫氮)混合物(混合物G，混合物A，混合物T，混合物C)，DTT溶液，和測序緩沖液。試劑盒任選地包括在選擇性擴(kuò)增mRNA靶中使用試劑盒的說明書。試劑盒還可任 選地提供對擴(kuò)增的cDNA分子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄的說明書，和標(biāo)記體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物且將體外轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物與微陣列雜交的說明書。試劑盒還可以提供標(biāo)記和/或測序的說明書。試劑盒還可以 提供，將PCR產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體以產(chǎn)生代表取樣時樣品的轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)文庫的說明書。另一方面，本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群以產(chǎn)生選擇性擴(kuò)增的cDNA分 子的方法。本發(fā)明這方面的方法包括(a)提供第一寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸包括雜 交部分和位于雜交部分5’端的第一 PCR引物結(jié)合位點，(b)將第一寡核苷酸群與分離自哺乳動物受試者的包含RNA模板的樣品退火，(c)用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成cDNA，(d)用DNA 聚合酶和第二寡核苷酸群合成雙鏈cDNA，其中每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分 5，端的第二 PCR結(jié)合位點，其中雜交部分為含SEQ ID NO :750-1498的寡核苷酸群的成員， 和(e)純化雙鏈cDNA分子。在一些實施方案中，該方法進(jìn)一步包括PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA分 子。圖IC顯示了本發(fā)明這方面的方法的代表性實施方案。如圖IC所示，在該方法的一個 實施方案中，第一引物混合物包括位于雜交部分5'端的第一 PCR引物結(jié)合位點(PBS#1)， 其中雜交部分包括隨機(jī)9聚體群。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群以產(chǎn)生選擇性擴(kuò)增的 aDNA分子的方法。圖ID顯示了本發(fā)明這方面的方法的代表性實施方案。如圖ID所示，第 一引物混合物包括位于雜交部分5'端的第一 PCR引物結(jié)合位點(PBS#1)，其中雜交部分為 含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成員。該方法進(jìn)一步包括用熱穩(wěn)定DNA聚合酶、與第 一 PCR引物結(jié)合位點結(jié)合的第一 PCR引物、以及與第二 PCR引物結(jié)合位點結(jié)合的第二 PCR 引物，PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA，以產(chǎn)生擴(kuò)增的雙鏈DNA(aDNA)。如圖ID所示，在一些實施方案中， 該方法進(jìn)一步包括對至少一部分aDNA進(jìn)行測序的步驟。本文描述的方法和試劑可用于實施本發(fā)明的這方面。根據(jù)本發(fā)明的這方面，任何 DNA-依賴性DNA聚合酶都可用于從第一鏈cDNA合成第二鏈DNA分子。例如，可以使用DNA 聚合酶I的Klenow片段合成第二鏈DNA分子?？梢允褂冒?-9個核苷酸組成的雜交部 分且進(jìn)一步包含位于雜交部分5’端的確定序列部分的第二寡核苷酸群，來引發(fā)第二鏈DNA 分子的合成。確定序列部分可以包括任何合適的序列，只要該序列與第一寡核苷酸群所包含的 確定序列不相同。取決于選擇的引物序列，這些確定序列部分例如可用于選擇性指導(dǎo)第二 DNA分子的DNA依賴性RNA合成，和/或通過DNA依賴性DNA合成來擴(kuò)增雙鏈cDNA模板。雙鏈DNA分子的純化。第二 DNA分子的合成產(chǎn)生了雙鏈DNA分子群，其中第一 DNA 分子與第二 DNA分子雜交，如圖ID所示。通常，純化雙鏈DNA分子，以除去基本上所有短于 50個堿基對的核酸分子，包括所有或基本上所有(例如通常超過99%)的第二引物。優(yōu)選 地，純化方法選擇性地純化基本上為雙鏈的DNA分子，而除去基本上所有未配對的單鏈核 酸分子，例如單鏈引物?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的方法，例如通過經(jīng)由大小分級分離柱的 洗脫來實現(xiàn)純化。例如，然后可沉淀純化的第二 DNA分子，并將其溶解于合適的緩沖液，以 用于本發(fā)明這方面的方法的下一步。雙鏈DNA分子的擴(kuò)增。在本發(fā)明這方面的方法的實施中，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將 雙鏈DNA分子用作酶擴(kuò)增的模板。任何合適的引物可用于引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。通常，使 用兩種引物一 一種引物與第一引物序列的確定部分(或其互補(bǔ)序列)雜交，和另一種引物 與第二引物序列的確定部分(或其互補(bǔ)序列)雜交。PCR擴(kuò)增條件。通常，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)期間，擴(kuò)增循環(huán)的數(shù)目越大，所獲得的擴(kuò)增 的DNA的數(shù)量就越多。另一方面，過多的擴(kuò)增循環(huán)將導(dǎo)致雙鏈DNA的隨機(jī)偏倚擴(kuò)增。因此， 在一些實施方案中，期望的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為5-40個擴(kuò)增循環(huán)，例如5-35個，例如10-30個擴(kuò) 增循環(huán)。關(guān)于溫度條件，通常，循環(huán)包括解鏈溫度例如95°C，退火溫度(其在約40°C "70°C 之間)，延伸溫度(通常約72°C )。關(guān)于退火溫度，在一些實施方案中，退火溫度為約550C -65°C，更優(yōu)選約 60°C。在一個實施方案中，用于本發(fā)明該方面的擴(kuò)增條件包括，10個循環(huán)的(95°C，30 秒；60°C，30 秒；72°C，60 秒)，接著 20 個循環(huán)的(95°C，30 秒；60°C，30 秒，72°C，60 秒(每 循環(huán)的延伸步驟+10秒))。關(guān)于用于本發(fā)明這方面的方法的PCR反應(yīng)組分，dNTP通常在反應(yīng)中以 50 μ Μ-2000 μ M 的 dNTP，更優(yōu)選地 800-1000 μ M 存在。MgCl2 通常在反應(yīng)中以 0. 25mM-10mM, 更優(yōu)選地約4mM存在。正向和反向PCR引物通常在反應(yīng)中以約50nM-2000nM存在，更優(yōu)選 地以約IOOOnM的濃度存在。DNA標(biāo)記。任選地，擴(kuò)增的DNA分子可用染料分子進(jìn)行標(biāo)記，以易于在雜交試驗中 用作探針，例如用于篩選DNA芯片的探針?？梢允褂萌魏魏线m的染料分子，例如熒光團(tuán)和化 學(xué)發(fā)光劑。實施例5提供了將染料分子與擴(kuò)增的DNA分子連接的示例性方法。例如，本發(fā)明這方面的方法可用于分析含總RNA的生物學(xué)樣品的轉(zhuǎn)錄組特征譜。 在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明這方面的方法產(chǎn)生的、通過用NSR引發(fā)第一鏈cDNA并用 反-NSR引發(fā)第二鏈合成從cDNA產(chǎn)生的擴(kuò)增的aDNA，可被標(biāo)記以用于基因表達(dá)試驗中，從而 提供了基于雜交的試劑，其與從NSR-引發(fā)的cDNA產(chǎn)生的擴(kuò)增的RNA相比，通常產(chǎn)生較低水 平的背景。在本發(fā)明這方面的一些實施方案中，第一和/或第二引物結(jié)合區(qū)的確定序列部分 進(jìn)一步包括一個或多個限制性酶切位點，從而產(chǎn)生具有一個或多個位于擴(kuò)增部分側(cè)翼的限 制性酶切位點的擴(kuò)增的雙鏈DNA產(chǎn)物群。這些擴(kuò)增產(chǎn)物可直接用于序列分析，或者可通過 用限制性酶消化而釋放并亞克隆入任何期望的載體，例如表達(dá)載體以用于進(jìn)一步的分析。 PCR產(chǎn)物的測序分析可用任何DNA測序方法進(jìn)行，例如Sanger雙脫氧鏈終止法，染料終止子 測序法，或美國專利7，232，656中記載的高通量測序方法(Solexa)，其通過引用并入本文。另一方面，本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增的核酸分子群，其包括從哺乳動物受試者分 離的樣品中的RNA模板分子群中的靶核酸分子群的代表，其中每一擴(kuò)增的核酸分子包括 位于擴(kuò)增的核酸序列群的成員的側(cè)翼的5’確定序列部分，以及3’確定序列，其中選擇性 擴(kuò)增的序列群包括與哺乳動物受試者表達(dá)的靶RNA分子相對應(yīng)的擴(kuò)增的核酸序列，并且 就特定的哺乳動物物種而言，其特征在于具有下列性質(zhì)(a)具有超過75%的多聚腺苷酸 化和非多聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄本，和具有少于10%的核糖體RNA (例如rRNA(18S或^S)和 mt-RNA)。本發(fā)明這方面的選擇性擴(kuò)增的核酸分子群，可用本文記載的本發(fā)明的方法產(chǎn)生。 可將選擇性擴(kuò)增的核酸分子群克隆入表達(dá)載體以構(gòu)建文庫。可選地，可將選擇性擴(kuò)增的核 酸分子群固定于基質(zhì)上以制備擴(kuò)增產(chǎn)物的微陣列。微陣列可以包括固定于固體或半固體 基質(zhì)上的至少一個擴(kuò)增產(chǎn)物，所述基質(zhì)由選自下列的材料制成紙，玻璃，陶瓷，塑料，聚苯 乙烯，聚丙烯，尼龍，聚丙烯酰胺，硝化纖維，硅，金屬，和光學(xué)纖維。擴(kuò)增產(chǎn)物可以固定于二 維構(gòu)型或三維構(gòu)型的固體或半固體基質(zhì)上，所述二維構(gòu)型或三維構(gòu)型包括針形，棒形，纖維 形，帶形，線形，珠形，顆粒形，微滴定孔形，毛細(xì)管形和圓柱體形。下列實施例僅用于舉例說明目前預(yù)期實施本發(fā)明的最佳方式，而不應(yīng)解釋為對本 發(fā)明的限制。實施例1
本實施例描述了 749個6-聚體寡核苷酸(SEQ ID NO 1-749)的第一群(不那 么隨機(jī)的，“NSR")的選擇，所述寡核苷酸與哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的所有或基本上所有的 RNA分子雜交，但不與細(xì)胞核核糖體RNA (18S和^S rRNA)或線粒體核糖體RNA (12S和16S mt-rRNA)雜交。還產(chǎn)生了與NSR寡核苷酸反向互補(bǔ)的第二反-NSR寡核苷酸群(SEQ ID NO 750-1498)。NSR寡核苷酸群可用于引發(fā)第一鏈cDNA合成，反-NSR寡核苷酸群可用于引發(fā) 第二鏈cDNA合成?；驹黼S機(jī)6-聚體(N6)可在RefSeq數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)錄本序列(稱為“核苷酸序列”)的每 一核苷酸位置上退火，如圖IA所示。在除去其反向互補(bǔ)序列與細(xì)胞核核糖體RNA(18S和 28S rRNA)和線粒體核糖體RNA (12S和16S mt-rRNA)完美匹配的6-聚體之后，剩余的NSR 寡核苷酸(SEQ ID NO :1-749)與RefSeq數(shù)據(jù)庫的核酸序列(稱為“核苷酸序列”)上的每 4-5個核苷酸完美匹配，如圖IB所示。方法對所有可能的4，096種6-聚體寡核苷酸進(jìn)行計算，其中每一核苷酸為A，T (或U)， C，或G。將每一 6-聚體寡核苷酸的反向互補(bǔ)序列，與18S和^S rRNA的核苷酸序列及12S 和16S線粒體rRNA的核苷酸序列進(jìn)行比較，如下文表1所示。表1:核糖體RNA
權(quán)利要求
其中要求專有所有權(quán)或特權(quán)的本發(fā)明的實施方案定義如下
1.在RNA模板分子群中選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群從分離自哺乳動物受試者的樣品中的RNA 模板分子群合成的單鏈引物延伸產(chǎn)物群，其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括 雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中RNA模板分子群包括靶核酸分子群和 非靶核酸分子群；和(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，從步驟(a)的單鏈引物延伸產(chǎn)物群合成雙鏈 cDNA，其中第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸，包括由6，7或8個核苷酸組成的雜交部分和 位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中雜交部分選自具有6，7或8個核苷酸的長度，并 且在確定的條件下與靶核酸分子群雜交，而在確定的條件下不與單鏈引物延伸產(chǎn)物群中的 非靶核酸分子群雜交的所有可能的寡核苷酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中第二寡核苷酸引物群的雜交部分經(jīng)選擇包括，在確定的條 件下不與單鏈引物延伸產(chǎn)物群中的非靶核酸群雜交的、長度為6個核苷酸的所有可能的寡 核苷酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中非靶核酸分子群基本上由RNA模板分子群中最高豐度的核 酸分子組成。
4.權(quán)利要求3的方法，其中最高豐度的核酸分子選自核糖體RNA，線粒體核糖體RNA，及 其組合。
5.權(quán)利要求1的方法，其中第一寡核苷酸群的雜交部分由6，7，8，或9個隨機(jī)核苷酸中 的一種組成，并且所述確定序列部分包括用于PCR擴(kuò)增的第一引物結(jié)合位點。
6.權(quán)利要求1的方法，其中第一寡核苷酸引物群的雜交部分群選自，在確定的條件下 不與RNA模板分子群中的非靶核酸分子雜交的、長度為6個核苷酸的所有可能的寡核苷酸。
7.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包括總RNA。
8.權(quán)利要求1的方法，其中第一和第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸的確定序列部 分，由長度范圍在10個核苷酸至20個核苷酸的、用于PCR擴(kuò)增的引物結(jié)合位點所組成。
9.權(quán)利要求8的方法，其中第一或第二引物結(jié)合位點中的至少一個，包括轉(zhuǎn)錄啟動子。
10.權(quán)利要求1的方法，其中第二寡核苷酸群的每一寡核苷酸進(jìn)一步包括，由1-10個 隨機(jī)核苷酸組成的間隔子序列部分，其中所述間隔子部分位于確定序列部分和雜交部分之 間。
11.權(quán)利要求1的方法，其中第二寡核苷酸群中的雜交部分群選自，包括SEQID NO 750-1498的寡核苷酸。
12.權(quán)利要求6的方法，其中第一寡核苷酸群中的雜交部分群選自，包括SEQID NO 1-749的寡核苷酸。
13.權(quán)利要求8的方法，進(jìn)一步包括擴(kuò)增雙鏈cDNA的至少一個鏈。
14.權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括對PCR擴(kuò)增的DNA進(jìn)行測序。
15.權(quán)利要求8的方法，其中第一群中每一寡核苷酸的確定序列部分包括至少8個連續(xù) 核苷酸的區(qū)域，所述區(qū)域與第二群中每一寡核苷酸的確定序列部分中的至少8個連續(xù)核苷 酸的區(qū)域相同。
16.權(quán)利要求8的方法，其中第一或第二寡核苷酸群的至少一個的確定序列部分，包括RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5 ‘端。
17.分析轉(zhuǎn)錄組特征譜的方法，包括(a)用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群，從分離自哺乳動物受試者的樣品中的RNA模 板分子群中的靶核酸分子群合成單鏈引物延伸產(chǎn)物群，所述第一寡核苷酸引物群包括雜交 部分和位于雜交部分5’端的第一 PCR引物結(jié)合位點，(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，從步驟(a)生成的單鏈引物延伸產(chǎn)物群合成 雙鏈cDNA，所述第二寡核苷酸引物群包括雜交部分和位于雜交部分5’端的第二 PCR引物結(jié) 合位點，其中雜交部分選自具有6個核苷酸的長度的，在確定的條件下與靶核酸分子群雜 交，而在確定的條件下不與單鏈引物延伸產(chǎn)物群中的非靶核酸分子群雜交的所有可能的寡 核苷酸，其中非靶核酸分子群基本上由與所述哺乳動物受試者相同物種的核糖體RNA和線 粒體核糖體RNA所組成，和(c)使用與第一PCR引物結(jié)合位點結(jié)合的第一 PCR引物和與第二 PCR引物結(jié)合位點結(jié) 合的第二 PCR引物，PCR擴(kuò)增步驟(b)合成的雙鏈cDNA。
18.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括將PCR產(chǎn)物克隆入載體，以產(chǎn)生樣品分離時哺乳動 物受試者的轉(zhuǎn)錄組的代表性文庫。
19.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括對至少一部分PCR產(chǎn)物測序。
20.權(quán)利要求17的方法，其中PCR擴(kuò)增使用退火溫度在40-50度的至少2個擴(kuò)增循環(huán)， 之后用退火溫度大于50度的額外的擴(kuò)增循環(huán)來進(jìn)行。
21.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括標(biāo)記至少一部分?jǐn)U增的PCR產(chǎn)物。
22.權(quán)利要求17的方法，其中第一群中每一寡核苷酸的第一PCR引物結(jié)合位點，包括至 少8個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，所述區(qū)域與第二寡核苷酸群中每一寡核苷酸的第二 PCR引物結(jié) 合位點中的至少8個連續(xù)核苷酸的區(qū)域相同。
23.權(quán)利要求17的方法，其中第一或第二寡核苷酸群的至少一個的PCR引物結(jié)合位點， 包括RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5‘端。
24.用權(quán)利要求17的方法所產(chǎn)生的經(jīng)擴(kuò)增的核酸分子群。
25.在較大的非靶核酸分子群中選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的方法，所述方法包括以下 步驟(a)用逆轉(zhuǎn)錄酶和第一寡核苷酸引物群，從分離自哺乳動物受試者的含總RNA的樣品 合成單鏈cDNA，其中第一寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分 5’端的確定序列部分，其中雜交部分為包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成員；和(b)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸引物群，從步驟(a)合成的單鏈cDNA合成雙鏈cDNA， 其中第二寡核苷酸引物群中的每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序 列部分，其中雜交部分為包含SEQ ID NO :750-1498的寡核苷酸群的成員。
26.權(quán)利要求25的方法，其中第一寡核苷酸引物群的雜交部分群，包括包含SEQID NO 1-749的寡核苷酸的至少10%。
27.權(quán)利要求25的方法，其中第二寡核苷酸引物群的雜交部分群，包括包含SEQID NO =750-1498的寡核苷酸的至少10%。
28.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括對至少一部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。
29.權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括標(biāo)記至少一部分PCR產(chǎn)物。
30.用于第一鏈cDNA的合成的包含SEQID NO 1-749的寡核苷酸群。
31.用于第二鏈cDNA的合成的包含SEQID NO =750-1498的寡核苷酸群。
32.用于選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的試劑，所述試劑包括包含SEQID NO :1-749的寡 核苷酸的至少10%。
33.用于選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的試劑，所述試劑包括包含SEQID NO :750-1498的 寡核苷酸的至少10%。
34.用于選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的試劑，所述試劑包括引發(fā)靶核酸分子群的擴(kuò)增的 寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中 雜交部分為包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成員。
35.用于選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的試劑，所述試劑包括引發(fā)靶核酸分子群的擴(kuò)增的 寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其中 雜交部分為包含SEQ ID NO =750-1498的寡核苷酸群的成員。
36.用于選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群的試劑盒，所述試劑盒包括包含用于第一鏈cDNA合 成的第一寡核苷酸群的試劑，其中第一寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括雜交部分和位于 雜交部分5’端的確定序列部分，其中雜交部分為包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成 員O
37.權(quán)利要求36的試劑盒，其中第一寡核苷酸群中的雜交部分群包括包含SEQID NO 1-749的寡核苷酸的至少10%。
38.權(quán)利要求36的試劑盒，進(jìn)一步包括用于第二鏈cDNA合成的第二寡核苷酸群，其中 第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5’端的確定序列部分，其 中雜交部分為包含SEQ ID NO =750-1498的寡核苷酸群的成員。
39.權(quán)利要求38的試劑盒，其中第二寡核苷酸群中的雜交部分群包括包含SEQID NO 750-1498的寡核苷酸的至少10%。
40.權(quán)利要求38的試劑盒，其中第一寡核苷酸群中的雜交部分群包括由SEQIDNO 1-749所組成的寡核苷酸，并且其中第二寡核苷酸群中的雜交部分群包括由SEQ ID NO 750-1498所組成的寡核苷酸。
41.權(quán)利要求38的試劑盒，進(jìn)一步包括至少一種下列成分逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、DNA 連接酶、RNA酶H、Tris緩沖液、鉀鹽、鎂鹽、銨鹽、還原劑、脫氧核苷三磷酸或核糖核酸酶抑 制劑。
42.用于在獲自哺乳動物受試者的樣品的RNA模板分子群中選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群 的試劑盒，所述試劑盒包括(a)包含由6個核苷酸組成的雜交部分和位于雜交部分5'端的確定序列部分的第一 寡核苷酸引物群，所述雜交部分選自長度為6個核苷酸的，在確定的條件下不與RNA模板分 子群中的非靶核酸分子群雜交的所有可能的寡核苷酸，其中所述非靶核酸分子群基本上由 RNA模板分子群中的最高豐度的核酸分子所組成；(b)包含由6個核苷酸組成的雜交部分和位于雜交部分5'端的確定序列部分的第二 寡核苷酸引物群，所述雜交部分選自第一寡核苷酸引物群的雜交部分的核苷酸序列的反向 互補(bǔ)序列；(c)與第一寡核苷酸群的第一確定序列部分結(jié)合的第一PCR引物，和與第二寡核苷酸群的第二確定序列部分結(jié)合的第二 PCR引物。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中非靶核酸分子群基本上由與哺乳動物受試者相同物種 的核糖體RNA和線粒體核糖體RNA所組成。
44.權(quán)利要求42的試劑盒，其中第一和第二寡核苷酸群中的每一寡核苷酸的確定序列 部分，由用于PCR擴(kuò)增的、長度范圍在10個核苷酸至20個核苷酸的引物結(jié)合位點所組成。
45.權(quán)利要求42的試劑盒，其中第一群中的每一寡核苷酸的確定序列部分包括至少8 個連續(xù)核苷酸的區(qū)域，所述區(qū)域與第二群中的每一寡核苷酸的確定序列部分中的至少8個 連續(xù)核苷酸的區(qū)域相同。
46.權(quán)利要求42的試劑盒，其中第一或第二寡核苷酸群的至少一個的確定序列部分， 包括RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5‘端。
47.選擇性擴(kuò)增靶核酸分子群以產(chǎn)生擴(kuò)增的DNA分子的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供第一寡核苷酸群，其中每一寡核苷酸包括雜交部分和位于雜交部分5'端的 第一 PCR引物結(jié)合位點，其中雜交部分為包含SEQ ID NO :1-749的寡核苷酸群的成員；(b)將第一寡核苷酸群與包含分離自哺乳動物受試者的RNA的樣品退火；(c)用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA合成cDNA；(d)用DNA聚合酶和第二寡核苷酸群合成雙鏈cDNA，其中每一寡核苷酸包括雜交部分 和位于雜交部分5'端的第二 PCR結(jié)合位點，其中雜交部分為包含SEQID NO :750-1498的 寡核苷酸群的成員；(e)用熱穩(wěn)定DNA聚合酶，與第一PCR引物結(jié)合位點相結(jié)合的第一 PCR引物，以及與第 二 PCR引物結(jié)合位點相結(jié)合的第二 PCR引物來PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA以產(chǎn)生擴(kuò)增的雙鏈DNA， 和(f)對擴(kuò)增的雙鏈PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。
48.選擇性擴(kuò)增的核酸分子的群，其由分離自哺乳動物受試者的細(xì)胞樣品中的RNA模 板分子群中的靶核酸分子群的代表所組成，其中每一擴(kuò)增的核酸分子包括位于擴(kuò)增的核酸序列的群的成員的側(cè)翼的5’確定序列部分，和3’確定序列部分，其中 選擇性擴(kuò)增的序列的群包括與哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的靶RNA分子相對應(yīng)的擴(kuò)增的核酸序 列，并且就特定的哺乳動物物種而言，其特征在于具有下列性質(zhì)(a)具有超過75%的多聚腺苷酸化和非多聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄本，且具有少于10%的核 糖體RNA。
49.插入至克隆載體的權(quán)利要求48的群。
50.權(quán)利要求48的群，其中所述群中的每一核酸分子被標(biāo)記。
51.與底物連接的權(quán)利要求48的群。
52.權(quán)利要求48的群，其中第一或第二寡核苷酸群的至少一個的確定序列部分，包括 RNA部分和DNA部分，其中RNA部分位于DNA部分的5‘端。
全文摘要
本發(fā)明提供了選擇性擴(kuò)增RNA模板分子群中的靶核酸分子群的方法(例如，除了最高表達(dá)的mRNA種類以外，細(xì)胞類型中表達(dá)的所有mRNA分子)。本發(fā)明還提供了包括SEQ ID NO1-749中所示的核酸序列的第一寡核苷酸群，和包括SEQID NO750-1498中所示的核酸序列的第二寡核苷酸群。例如，第一寡核苷酸群可用于引發(fā)與從哺乳動物細(xì)胞分離的mRNA分子互補(bǔ)的第一鏈cDNA分子的合成，但不引發(fā)與核糖體RNA分子互補(bǔ)的cDNA分子的合成。第二寡核苷酸群可用于例如引發(fā)，與從哺乳動物細(xì)胞分離的mRNA分子互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物(第一鏈cDNA)的第二鏈合成，但不引發(fā)從核糖體RNA分子合成的引物延伸產(chǎn)物的第二鏈合成。
文檔編號C12Q1/68GK102124126SQ200880122833
公開日2011年7月13日 申請日期2008年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月26日
發(fā)明者C·K·雷蒙德, C·阿穆爾, J·卡斯?fàn)?申請人:生命技術(shù)公司