專利名稱：通過(guò)極光激酶a的熒光原位雜交非侵入性檢測(cè)膀胱癌的制作方法
通過(guò)極光激酶A的熒光原位雜交非侵入性檢測(cè)膀胱癌
背景技術(shù)：
本發(fā)明在由National Cancer Institute授予的授權(quán)號(hào)UOl CA85078下由美國(guó)政 府支持進(jìn)行。美國(guó)政府具有本發(fā)明中的特定權(quán)利。本發(fā)明一般涉及癌癥檢測(cè)領(lǐng)域。更具體而言，它涉及膀胱癌的檢測(cè)。發(fā)明_既述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿 中分離膀胱細(xì)胞；使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交，其中探針識(shí)別極光激酶Aburora kinase Α)基因的至少部分，以產(chǎn)生與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品；并且計(jì)數(shù)樣 品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、樣品中的每個(gè)膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)、和樣品中具有 極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。附圖簡(jiǎn)述下述附圖構(gòu)成本發(fā)明說(shuō)明書(shū)的部分，并且包括在內(nèi)以進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的特定方 面。本發(fā)明通過(guò)參考與本文呈現(xiàn)的特定實(shí)施方案的詳述組合的這些附圖中的一個(gè)或多個(gè)可 以得到更好地理解。

圖1。極光激酶A在移行細(xì)胞癌(TCC)中的表達(dá)及其與DNA倍數(shù)性的關(guān)聯(lián)。A，通 過(guò)定量RT-PCR揭示的相鄰尿道上皮和TCC的成對(duì)樣品中的極光激酶A水平。B和C，分別 通過(guò)顯示近二倍體(2c)DNA含量和顯著的非整倍體(6c)的腫瘤核的圖像分析產(chǎn)生的DNA 直方圖。D，低級(jí)別(級(jí)別1-2)、淺表(Ta-Tla)和高級(jí)別(級(jí)別3)、侵入性(Tlb和更高的) TCC以及近二倍體和非整倍體TCC中的極光激酶A的平均表達(dá)水平。圖2。在膀胱癌細(xì)胞系中的極光激酶A表達(dá)和染色體拷貝數(shù)。A，通過(guò)定量RT-PCR， 極光激酶A在膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)與經(jīng)培養(yǎng)的尿道上皮細(xì)胞(NU204)相比較。B，使用針 對(duì)染色體3、7和17的著絲粒探針通過(guò)定量FISH揭示的染色體拷貝數(shù)。C，在3組膀胱癌細(xì) 胞系中的極光激酶A的平均表達(dá)水平。D，在C中顯示的3組膀胱癌細(xì)胞系中，用針對(duì)染色 體3、7和17的著絲粒探針通過(guò)FISH揭示的癌細(xì)胞系中的平均染色體拷貝數(shù)。圖3。使用抗GFP抗體用包含野生型極光激酶A插入片段的腺病毒載體轉(zhuǎn)染的 SV40尿道上皮細(xì)胞中的極光激酶A-GFP融合蛋白的異位表達(dá)。A，顯示極光激酶A-GFP融合 蛋白的表達(dá)的Western印跡分析(上圖)。用DAPI作為核復(fù)染劑顯示極光激酶A-GFP融合 蛋白的異位表達(dá)的免疫熒光分析(下圖)。用不含極光激酶A插入片段的腺病毒載體感染 的細(xì)胞的免疫熒光圖像(a，b)。用紅色濾光器獲得的圖像揭示2個(gè)中心體(a)。用綠色濾 光器獲得的圖像揭示沒(méi)有極光激酶A-GFP融合蛋白的異位表達(dá)(b)。用包含極光激酶A插 入片段的腺病毒載體感染的細(xì)胞的免疫熒光圖像(c，d)。用紅色濾光器獲得的圖像顯示用 抗微管蛋白抗體揭示的中心體倍增(紅色)(c)。用綠色濾光器獲得的圖像顯示在中心體中 異位表達(dá)的極光激酶A-GFP蛋白質(zhì)(d)。B，通過(guò)異位表達(dá)的極光激酶A誘導(dǎo)的中心體和染 色體拷貝數(shù)的定量評(píng)估。C，與用PI復(fù)染劑揭示的DNA含量(紅色熒光)相關(guān)的異位表達(dá) 的極光激酶A-GFP蛋白質(zhì)(綠色熒光)的雙重?zé)晒釬ACS分析。在用包含野生型極光激酶 A插入片段的腺病毒載體感染后的雙重?zé)晒夥植紙D(右圖)。用空腺病毒載體感染的細(xì)胞的對(duì)照分布圖(右圖)。與對(duì)照相比較(左圖)，注意到在指定為A和B的分布圖區(qū)域中的 非整倍體(aneuploid)細(xì)胞的增加(右圖)。D，通過(guò)C中顯示的雙重?zé)晒釬ACS分析和軟瓊 脂上的集落形成揭示的非整倍體細(xì)胞的定量評(píng)估。Ad/對(duì)照用不含極光激酶A插入片段 的腺病毒載體感染的細(xì)胞，Ad/極光激酶A GFP 用包含野生型極光激酶A的腺病毒載體轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞，MOI 感染復(fù)數(shù)。圖4。用極光激酶A FISH探針檢測(cè)排泄尿中的癌細(xì)胞。A，雙重?zé)晒釬ISH證實(shí)， 極光激酶A基因拷貝數(shù)(紅色)和染色體特異性探針的短臂(綠色)。正常尿道上皮細(xì)胞 中的極光激酶A的二倍體拷貝數(shù)(a)。在低級(jí)別(級(jí)別1-2) TCC中的低水平極光激酶A基 因擴(kuò)增(3個(gè)拷貝)(b)。在高級(jí)別(級(jí)別3)侵入性TCC中的高水平極光激酶A基因擴(kuò)增 (> 4個(gè)拷貝)(c)。在包含極光激酶A的多個(gè)拷貝和染色體20p探針的高級(jí)別(級(jí)別3) 侵入性TCC中的染色體20的多體性polysomy (d)。B，來(lái)自具有膀胱TCC的23個(gè)患者(訓(xùn) 練組)的排泄尿樣品中的極光激酶A基因拷貝數(shù)的定量FISH分析。顯示了在個(gè)別患者中 顯示極光激酶A的低(3-4個(gè)拷貝)和高(> 4個(gè)拷貝)擴(kuò)增水平的細(xì)胞百分比。C，由來(lái) 自具有膀胱癌的患者的23份尿樣品組成的訓(xùn)練組和來(lái)自7個(gè)健康未受影響對(duì)照的7份尿 樣品中關(guān)于極光激酶AFISH測(cè)試的ROC曲線(η = 30)。D，由來(lái)自具有膀胱癌的患者的51 份尿樣品組成的測(cè)試組和來(lái)自健康未受影響對(duì)照的30份尿樣品中關(guān)于極光激酶A FISH測(cè) 試的ROC曲線(η = 81)。Ε，通過(guò)組織學(xué)級(jí)別的極光激酶A得分。圖5。來(lái)自具有膀胱TCC的74個(gè)患者和37個(gè)健康對(duì)照(組合的訓(xùn)練和測(cè)試組) 的排泄尿樣品中的極光激酶A基因拷貝數(shù)的定量FISH分析。顯示了在個(gè)別患者中顯示極 光激酶A的低(3-4個(gè)拷貝)和高(> 4個(gè)拷貝)擴(kuò)增水平的細(xì)胞百分比。圖 6。AURKA 20ql3 探針的圖。舉例說(shuō)明性實(shí)施方案的描述以非整倍性形式表現(xiàn)染色體不穩(wěn)定性的惡性細(xì)胞經(jīng)常顯示額外的中心體和多極 有絲分裂紡錘體，暗示在細(xì)胞器控制有絲分裂時(shí)的染色體分離的異常在非整倍性的發(fā)展中 起作用。η極光激酶A也稱為STK15或BTAK，是絲氨酸蘇氨酸激酶家族成員，其中包括果蠅 (Drosophilia)極光和釀酒酵母(Saccharomycescervisiae) IPLl激酶。4_6這些激酶已鑒 定為人細(xì)胞中的正常染色體分離和中心體功能(包括中心體分離和突變調(diào)節(jié))的關(guān)鍵調(diào)節(jié) 物。7此外，已顯示位于染色體20ql3上的極光激酶A基因的過(guò)表達(dá)與非整倍性和染色體不 穩(wěn)定性相關(guān)，促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和幾種人腫瘤(包括尿道上皮癌)中的致瘤性轉(zhuǎn)化和進(jìn)展。
4,8有趣的是，經(jīng)誘導(dǎo)以經(jīng)歷體外轉(zhuǎn)化的原代人尿道上皮細(xì)胞表現(xiàn)染色體20ql3. 2的 擴(kuò)增，暗示在這個(gè)染色體上的一種或多種基因的過(guò)表達(dá)可能在膀胱癌的發(fā)展中起顯著作 用。9這些觀察連同在染色體20ql3上的極光激酶A編碼基因也已鑒定為小鼠和人中的腫 瘤易感性基因座1(1以及極光激酶A誘導(dǎo)p53腫瘤抑制基因的功能滅活5的事實(shí)，暗示極光激 酶A的表達(dá)增加可能是人尿道上皮細(xì)胞中的染色體不穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵遺傳決定因素。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測(cè)患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿 中分離膀胱細(xì)胞；使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交，其中探針識(shí)別極光激酶A基因的至 少部分，以產(chǎn)生與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品；并且計(jì)數(shù)樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、樣品中的每個(gè)膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)、和樣品中具有極光激酶A基因的至 少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。從患者的尿中分離膀胱細(xì)胞(最通常地，尿道上皮細(xì)胞)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的 任何技術(shù)來(lái)執(zhí)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離膀胱細(xì)胞可以通過(guò)下述來(lái)完成收集來(lái)自患者的 排泄尿樣品(約100-200ml)，在夠以使尿中的膀胱細(xì)胞形成團(tuán)塊的旋轉(zhuǎn)速度和持續(xù)時(shí)間下 離心，棄去上清液，并且使形成團(tuán)塊的膀胱細(xì)胞重懸浮于合適溶液中用于貯存或使用。在一 個(gè)實(shí)施方案中，離心的持續(xù)時(shí)間和旋轉(zhuǎn)速度是約15分鐘和以約lOOOrpm。在一個(gè)實(shí)施方案 中，使形成團(tuán)塊的膀胱細(xì)胞重懸浮于具有10% DMSO(二甲基亞砜)的2ml DMEM(Dulbecco/ Vogt ModifiedEagle' s Minimal Essential Medium)中并且C存于 _70°C，直至在其在該 方法的后續(xù)步驟中使用前使重懸浮的膀胱細(xì)胞解凍的時(shí)候。在解凍后和在雜交前，膀胱細(xì)胞可以在PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)或適合于洗滌膀胱 細(xì)胞的其它緩沖液中洗滌一次或多次，例如3次，隨后為離心以使經(jīng)洗滌的膀胱細(xì)胞形成 團(tuán)塊。形成團(tuán)塊的經(jīng)洗滌的膀胱細(xì)胞可以在甲醇/乙醇(3 1)中固定，在2x SSC/0.5% NP-40，pH 7中在37°C下預(yù)處理30分鐘，隨后為在乙醇中在90°C下脫水5分鐘。如對(duì)于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)，適合于制備用于與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞的其他 處理技術(shù)可以作為常規(guī)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容執(zhí)行。使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù) 來(lái)執(zhí)行。經(jīng)標(biāo)記的DNA探針可以包括任何DNA序列和任何可檢測(cè)部分，前提是探針識(shí)別極 光激酶A基因的至少部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，可檢測(cè)部分包括熒光團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案 中，可檢測(cè)部分包括放射性同位素。來(lái)自人(H. sapiens)的極光激酶A的cDNA序列顯示為SEQ ID NO 1 (GenBank登 記號(hào)BC001280)，并且來(lái)自人的極光激酶A的基因組序列顯示為SEQ ID NO :2。盡管在其他 方面相同，但2個(gè)序列在位置301處不同，并且cDNA包含基因組序列缺乏的16聚體腺苷尾部?！疤结樧R(shí)別極光激酶A基因的至少部分”意指探針包括具有這樣的序列的DNA分 子，所述序列與極光激酶A基因的部分的至少一條DNA鏈基本上完全互補(bǔ)(即，至少約90 % 互補(bǔ)，例如至少約95%互補(bǔ)、至少約96%互補(bǔ)、至少約97%互補(bǔ)、至少約98%互補(bǔ)、至少約 99%互補(bǔ)、至少約99. 5%互補(bǔ)或至少約99. 9%互補(bǔ))，并且進(jìn)一步地，探針的DNA分子足夠 長(zhǎng)并且具有這樣的序列，使得它將基本上僅與極光激酶A基因雜交，并且將基本上不與膀 胱細(xì)胞的任何其他基因或不表達(dá)的基因組元件雜交。進(jìn)一步希望探針的DNA分子不是那么 長(zhǎng)，以需要長(zhǎng)時(shí)間與極光激酶A基因雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記的DNA探針包括AURKA 20ql3(MP Biomedicals/Qbiogene，Illkirch，F(xiàn)rance)。AURKA 20ql3 特異性 DNA 探針進(jìn)行 最佳化，以檢測(cè)在中期/間期散布、血涂片和石蠟包膜組織切片上在區(qū)域20ql3處在染色體 20上的極光激酶A基因拷貝數(shù)?？梢允褂每梢耘c探針的DNA分子結(jié)合的任何熒光團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光團(tuán) 選自若丹明和熒光素。在一個(gè)實(shí)施方案中，AURKA 20ql3探針用若丹明(紅色)直接進(jìn)行 標(biāo)記，并且染色體20 α-衛(wèi)星探針用熒光素(綠色)直接進(jìn)行標(biāo)記。這種雙色極光激酶A FISH探針可以用于檢測(cè)排泄尿樣品的剝落細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜交技術(shù)可以涉及脫水的膀胱細(xì)胞與10 μ IAURKA 20ql3探針在37°C下溫育約16小時(shí)(例如過(guò)夜)。為了去除未雜交的探針，細(xì)胞可以例如在0.5x SSC/0. SDS中在65°C下洗滌5分鐘。在計(jì)數(shù)前細(xì)胞可以用DAPI (4‘，6-二脒基-2-苯 基吲哚)進(jìn)行復(fù)染并且在抗衰退溶液中進(jìn)行固定。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，對(duì)于極光激酶A基因非特異性的第二種經(jīng)標(biāo)記的 DNA探針可以與膀胱細(xì)胞雜交，以允許計(jì)數(shù)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可能感興趣的其他 DNA區(qū)域。雜交步驟產(chǎn)生與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品。計(jì)數(shù)樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、樣品中的每個(gè)膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝 數(shù)、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目，可以通過(guò)流式 細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡檢查或放射性同位素檢測(cè)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的任何合適技術(shù)來(lái) 執(zhí)行。流式細(xì)胞儀或熒光激活細(xì)胞分選器的使用是本領(lǐng)域眾所周知的。當(dāng)可檢測(cè)部分是 熒光團(tuán)時(shí)，可以用任何合適的顯微鏡計(jì)數(shù)并且捕獲熒光信號(hào)，例如Zeiss Axioplan 2 (Carl Zeiss Microimaging GmbH，Jena, Germany) 0計(jì)數(shù)產(chǎn)生樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、樣品中的每個(gè)膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷 貝數(shù)、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。拷貝數(shù)第一 閾值可以選擇為等于在膀胱癌細(xì)胞中通常發(fā)現(xiàn)的極光激酶A基因的最小拷貝數(shù)。在一個(gè)實(shí) 施方案中，極光激酶A基因的拷貝數(shù)第一閾值是3。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，計(jì)數(shù)進(jìn)一步包括計(jì)數(shù)具有極光激酶A基因的至少拷 貝數(shù)第二閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目，其中拷貝數(shù)第二閾值大于拷貝數(shù)第一閾值?？截悢?shù)第二閾 值可以選擇為等于在侵略性膀胱癌細(xì)胞中通常發(fā)現(xiàn)的極光激酶A基因的最小拷貝數(shù)。在一 個(gè)實(shí)施方案中，極光激酶A基因的拷貝數(shù)第二閾值是5。通過(guò)計(jì)數(shù)樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第 一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目，后面一個(gè)數(shù)目可以除以膀胱細(xì)胞數(shù)目，以計(jì)算具有極光激酶A基 因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞百分比。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果大于或等于第一閾值百分比的膀胱細(xì)胞具有極光激酶A 基因的至少拷貝數(shù)第一閾值，那么該方法進(jìn)一步包括假定患者具有膀胱癌的步驟。具有極 光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞的百分比任何值可以用作第一閾值百分 比。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一閾值百分比是15%。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如果大于或等于第二閾值百分比的膀胱細(xì)胞具有極 光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值，其中第二閾值百分比大于第一閾值百分比，那么該 方法進(jìn)一步包括假定患者具有侵略性膀胱癌的步驟?！扒致孕?aggressive)”膀胱癌指具 有特征在于呈現(xiàn)侵入性腫瘤、非乳頭狀腫瘤、或具有組織學(xué)級(jí)別3的腫瘤中的一種或多種 的膀胱癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一閾值百分比是15%，并且第二閾值百分比是20%。通過(guò)執(zhí)行該方法，在假定患者是否具有膀胱癌以及如果具有膀胱癌，那么侵略性 是如何中有用的因素可以由醫(yī)生通過(guò)非侵入性技術(shù)進(jìn)行定量。通過(guò)對(duì)因素定量，醫(yī)生可以 決定是否應(yīng)執(zhí)行或考慮執(zhí)行其他診斷或治療方法，例如膀胱鏡檢查、手術(shù)切除、BCG滴注到 膀胱內(nèi)、其他化學(xué)治療分子滴注到膀胱內(nèi)、輻照處理或膽囊切除術(shù)。通過(guò)在目前對(duì)膀胱癌進(jìn) 行治療(例如通過(guò)化學(xué)治療或輻射)的患者的復(fù)發(fā)基礎(chǔ)上執(zhí)行該方法，可以監(jiān)控治療的功 效。通過(guò)在先前對(duì)膀胱癌進(jìn)行治療的患者的復(fù)發(fā)基礎(chǔ)上執(zhí)行該方法，可以監(jiān)控可能存在的復(fù)發(fā)的程度。我們已發(fā)現(xiàn)該方法具有高特異性(在下文實(shí)施例中，當(dāng)η = 81時(shí)，特異性是1. 0， 意指假陽(yáng)性率是0%)和高靈敏度(在下文實(shí)施例中，靈敏度是0.86，意指假陰性率是 14% )。就我們所知，沒(méi)有其他同事報(bào)告了在至少80名個(gè)體的樣本大小上測(cè)試的非侵入性 膀胱癌篩選方法，具有超過(guò)0. 85的特異性和超過(guò)0. 85的靈敏度，更不必說(shuō)1. 0的特異性和 至少0. 86的靈敏度。包括下述實(shí)施例以證實(shí)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在下述 實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)踐中工作良好的技術(shù)，并且因此可 以被視為構(gòu)成用于其實(shí)踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可 以在所公開(kāi)的具體實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變，并且仍獲得相同或相似結(jié)果，而不背離本發(fā) 明的精神和范圍。實(shí)施例1概括背景導(dǎo)致非整倍性的染色體錯(cuò)誤分離是瘤形成中的常見(jiàn)體細(xì)胞遺傳改變，并且 調(diào)節(jié)染色體分離的基因可能是潛在的癌癥檢測(cè)標(biāo)記。有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物——極光激酶 A的擴(kuò)增/過(guò)表達(dá)已在人癌癥(包括膀胱癌)中頻繁檢測(cè)出，并且擴(kuò)增程度與非整倍性程度 相關(guān)。方法我們測(cè)量了在膀胱癌細(xì)胞中的極光激酶A表達(dá)的水平，并且使之與3種所選 擇的染色體的拷貝數(shù)和核DNA總含量相關(guān)聯(lián)。極光激酶A對(duì)中心體倍增和染色體拷貝數(shù)的 影響在體外使用腺病毒表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)量。為了評(píng)估該基因作為關(guān)于膀胱癌的生物標(biāo)記 的適用性，還在來(lái)自膀胱癌患者的排泄尿的脫落細(xì)胞上使用熒光原位雜交(FISH)測(cè)量了 極光激酶A基因拷貝數(shù)。發(fā)現(xiàn)極光激酶A在人尿道上皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)中心體的擴(kuò)增、染色體錯(cuò)誤 分離和非整倍性。此外，極光激酶A基因的過(guò)表達(dá)在腫瘤發(fā)生的早期發(fā)生，并且可以在原位 損傷中以及在具有膀胱癌的患者的排泄尿中檢測(cè)出。在由來(lái)自具有膀胱癌的患者的51份 排泄尿樣品和30份未受影響的健康對(duì)照中組成的不知情驗(yàn)證測(cè)試上執(zhí)行的關(guān)于極光激酶 A基因拷貝數(shù)的FI SH測(cè)試，以特異性1. 0和靈敏度0. 86檢測(cè)出膀胱癌。解釋我們的發(fā)現(xiàn)指出過(guò)表達(dá)的極光激酶A可以引起尿道上皮細(xì)胞的非整倍性， 并且是用于檢測(cè)膀胱癌的有希望的生物標(biāo)記。前言人膀胱癌是研究染色體不穩(wěn)定性機(jī)制的理想系統(tǒng)，因?yàn)樗?jīng)由乳頭狀和非乳頭狀 途徑從原位腫瘤前狀態(tài)發(fā)展，這顯示侵略性和非整倍性程度之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)?！霸从谀虻郎?皮增生的大多數(shù)低級(jí)別、淺表乳頭狀腫瘤是近二倍體。盡管它們經(jīng)常復(fù)發(fā)，但它們不太可能 侵入膀胱壁且轉(zhuǎn)移。相比之下，通過(guò)由嚴(yán)重發(fā)育異常癌原位進(jìn)展而發(fā)展的基本上所有高級(jí) 別、非乳頭狀腫瘤顯示顯著的非整倍性，并且具有侵入膀胱壁且轉(zhuǎn)移的高傾向。在本文研究中，評(píng)估了極光激酶A在來(lái)自原位尿道上皮增生的膀胱癌發(fā)展中的作 用。我們研究了在人膀胱腫瘤樣品和膀胱癌細(xì)胞系中的極光激酶A擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)水平，并 且使之與非整倍性程度相關(guān)聯(lián)。極光激酶A過(guò)表達(dá)的功能牽涉通過(guò)體外轉(zhuǎn)染研究進(jìn)行驗(yàn) 證。最后，鑒定極光激酶A作為用于在尿中進(jìn)行膀胱癌的非侵入性檢測(cè)的潛在生物標(biāo)記。
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材料與方法腫瘤樣品和細(xì)胞系。如先前所述從21份人膽囊切除術(shù)樣品中獲得膀胱和相鄰尿 道上皮的移行細(xì)胞癌(TCC)的成對(duì)樣品的細(xì)胞懸浮液。12簡(jiǎn)言之，刮下與腫瘤相鄰的粘膜 表面，并且將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包含磷酸鹽緩沖溶液(PBS)的錐形管內(nèi)。腫瘤從冷凍塊中切開(kāi)，以 使由非腫瘤細(xì)胞的污染降到最低，并且類似地轉(zhuǎn)移至包含PBS的錐形管。通過(guò)機(jī)械攪動(dòng)組 織片段將腫瘤細(xì)胞釋放到PBS溶液內(nèi)。僅產(chǎn)生超過(guò)90%顯微鏡可識(shí)別腫瘤細(xì)胞或完整尿 道上皮的那些樣品用于這個(gè)研究。在腫瘤的經(jīng)尿道切除前收集來(lái)自具有膀胱鏡檢查明顯的 膀胱癌的74個(gè)患者的排泄尿樣品(約100-200ml)，并且在1000RPI下離心15分鐘。使尿 樣品重懸浮于具有10% DMSO的2ml DMEM中并且貯存于_70°C。將尿道上皮內(nèi)癌前病變 分類為輕度、中度和重度發(fā)育異常或原位癌。腫瘤根據(jù)三層世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)組織學(xué)分級(jí)系統(tǒng)和生長(zhǎng)模式(乳頭狀與非乳頭狀)進(jìn)行分類。侵入深度根據(jù) TNM(腫瘤_結(jié)節(jié)-轉(zhuǎn)移)分期系統(tǒng)進(jìn)行記錄。來(lái)自37個(gè)無(wú)膀胱癌證據(jù)的未受影響的健康個(gè) 體的排泄尿樣品作為對(duì)照。人膀胱癌細(xì)胞系UM-UC-1、UM-UC-2、UM-UC3、UM-UC-6、UM-UC-9、 UM-UC-10, UM-UC-12, UM-UC-13, UM-UC-15, UM-UC-16 和 UM-UC-17，以及正常人尿道上皮細(xì) 胞由我們建立，并且SV40永生化人尿道上皮細(xì)胞系SVHUC得自Dr. C. A. Reznikoff,并且如 先前所述進(jìn)行培養(yǎng)。13用于極光激酶A的表達(dá)測(cè)定法。如先前所述定量RT-PCR用于分析相鄰尿道上皮 /膀胱腫瘤和細(xì)胞系的成對(duì)樣品中的極光激酶A的表達(dá)水平。12簡(jiǎn)言之，對(duì)于RT-PCR，使用 TaqMan RT 試劑根據(jù)制造商的方案(Applied Biosystems, Foster City, CA)從 2 μ g 總 RNA 巾gj^cDNA。 ffligi Applied BiosystemsAssays-by-Design Service i^if
每種基因的引物和熒光探針。在PerkinElmer/AppliedBiosystems 7700Prism儀器上執(zhí)行 RT-PCR分析，使用持家基因18S作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)。由不含尿道上皮瘤形成的來(lái)自腎切 除術(shù)樣品的輸尿管制備的尿道上皮懸浮液用作標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其計(jì)算來(lái)自相鄰尿道上皮和膀胱 腫瘤的極光激酶A的相對(duì)表達(dá)。NU204人尿道上皮細(xì)胞如先前所述在體外生長(zhǎng)14，并且用作 參考以計(jì)算在體外生長(zhǎng)的膀胱癌細(xì)胞系中的極光激酶A的相對(duì)表達(dá)水平。極光激酶A基因拷貝數(shù)分析。購(gòu)自MP Biomedicals/Qbiogene(Illkirch,France) 的雙色極光激酶A FISH探針(AURKA 20gl3/a_衛(wèi)星20DNA探針)用于檢測(cè)排泄尿樣品的脫 落細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)。AURKA 20813探針用若丹明(紅色)直接進(jìn)行標(biāo)記，并 且染色體20 α-衛(wèi)星探針用熒光素(綠色)直接進(jìn)行標(biāo)記。雜交條件根據(jù)制造商的建議。 15簡(jiǎn)言之，使排泄尿樣品解凍，并且在PBS中洗滌3次，隨后離心。使細(xì)胞離心(cystospin) 制備物在甲醇/乙醇(3 1)中固定，并且在2x SSC/0. 5%NP-40, pH 7中在37°C下預(yù)處 理30分鐘，隨后在梯度增加的乙醇中脫水。在90°C下變性5分鐘后，使細(xì)胞與10 μ 1 AURKA 20ql3探針在37°C下雜交過(guò)夜。在0. 5x SSC/0. 1 % SDS中在65°C下洗滌5分鐘后，細(xì)胞用 DAPI進(jìn)行復(fù)染并且在抗衰退溶液中進(jìn)行固定。用Zeiss Axioplan 2顯微鏡計(jì)數(shù)并且捕獲 熒光信號(hào)。DNA倍數(shù)性分析。如先前所述用關(guān)于染色體3、7和17的著絲粒FISH探針(Vysis Abbott ；Park, IL)并且通過(guò)用 SAMBA 4000 系統(tǒng)(Ampersand Medical ；Chicago, IL)的圖像 分析通過(guò)測(cè)量核總DNA來(lái)分析間期核的倍數(shù)性。6來(lái)自切除的腎切除術(shù)樣品的正常人尿道 上皮細(xì)胞都用于測(cè)試正常人二倍體組織中的FISH探針的表現(xiàn)和充當(dāng)陰性對(duì)照。
在用Feulgen反應(yīng)染色的相鄰尿道上皮/膀胱腫瘤和膀胱癌細(xì)胞系的成對(duì)樣品的 細(xì)胞離心制備物上執(zhí)行DNA倍數(shù)性測(cè)量。DNA指數(shù)計(jì)算為腫瘤細(xì)胞的平均核DNA含量與二 倍體標(biāo)準(zhǔn)(人外周血淋巴細(xì)胞)的平均核DNA含量的比。具有DNA指數(shù)為0.9-1. 2的腫瘤 分類為二倍體/近二倍體，而其中在直方圖上具有獨(dú)特峰的超過(guò)20%細(xì)胞的DNA指數(shù)超過(guò) 1. 2的腫瘤分類為非整倍體。體外轉(zhuǎn)染測(cè)定法。如先前所述使用pcDNA3野生型極光激酶A和猿猴病毒40 (SV40) 永生化人尿道上皮細(xì)胞來(lái)執(zhí)行體外轉(zhuǎn)染研究。4簡(jiǎn)言之，用不含極光激酶A的腺病毒GFP載 體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞充當(dāng)對(duì)照。僅接受顯示大于或等于80%轉(zhuǎn)染率的那些實(shí)驗(yàn)用于分析。通過(guò) western印跡分析使用抗GFP抗體且通過(guò)RT-PCR使用靶向極光激酶A-GFP融合序列的引 物，驗(yàn)證極光激酶A-GFP異位表達(dá)的程度。隨后在轉(zhuǎn)染后第1-4天時(shí)收獲細(xì)胞并且用于分 析中心體拷貝數(shù)的分析、DNA總含量和極光激酶A表達(dá)水平的同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量、用關(guān)于 染色體3、7和17的著絲粒FISH探針的染色體拷貝數(shù)、和軟瓊脂集落形成測(cè)定法。如先前所述對(duì)于中心體拷貝數(shù)，使甲醇固定的細(xì)胞暴露于抗-y_微管蛋白小鼠 抗體(1 2000 稀釋，Sigma Chemical Corp.，St. Louis, MO)共 1 小時(shí)。4 簡(jiǎn)言之，使用 DAPI作為復(fù)染劑用Texas Red綴合的抗小鼠抗體(1 500稀釋，Vector Labora tories, Burlingame, CA)檢測(cè)結(jié)合的一抗。使用熒光激活細(xì)胞分選器(EPICSXL-MCL, Beckman Coulter，Inc，Miami，F(xiàn)L.)執(zhí) 行DNA含量(碘化丙啶的紅色熒光；PI)和極光激酶A(GFP的綠色熒光)的表達(dá)水平的同時(shí) 流式細(xì)胞術(shù)分析。具有異常DNA含量的細(xì)胞群體計(jì)算為具有DNA指數(shù)< 2c和> 4c的GFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。對(duì)于軟瓊脂集落形成測(cè)定法，用包含用GFP標(biāo)記的野生型極光激酶A的腺病毒載 體或僅包含GFP的對(duì)照腺病毒感染SV40永生化尿道上皮細(xì)胞。在病毒感染后1天，將細(xì)胞 以10，000細(xì)胞/平板的濃度鋪平板在包含UM-UC-3條件培養(yǎng)基的軟瓊脂上。在鋪平板后 2周記錄集落數(shù)目/平板。統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于FISH的定量分析，在來(lái)自每個(gè)尿樣品的至少20個(gè)細(xì)胞中計(jì)數(shù)綠 色和紅色信號(hào)，并且記錄關(guān)于每個(gè)細(xì)胞的綠色和紅色信號(hào)數(shù)目。將包含異常極光激酶A信 號(hào)的細(xì)胞分成2個(gè)亞組，由具有低(3-4個(gè)拷貝)和高(> 4個(gè)拷貝)水平的極光激酶A基 因擴(kuò)增的細(xì)胞組成。對(duì)于每個(gè)樣品，通過(guò)將具有升高水平(3個(gè)或更多拷貝)的細(xì)胞數(shù)目除 以檢查的總細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算極光激酶A得分。極光激酶A得分> 0. 15被視為是升高的，并 且與一組20個(gè)中具有至少3個(gè)紅色FISH信號(hào)的> 3個(gè)細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。這個(gè)得分用于產(chǎn)生關(guān) 于7份對(duì)照和23份膀胱癌尿樣品的訓(xùn)練組的ROG曲線(η = 30)。極光激酶A FISH測(cè)試的 表現(xiàn)在30份對(duì)照和51份膀胱癌尿樣品的測(cè)試組上進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證(η = 81)。曲線下面 積(AUC)用于評(píng)估標(biāo)記的表現(xiàn)。AUC等價(jià)于使案例和對(duì)照組相比較的Wilcoxon-Marm-Whi tney秩和檢驗(yàn)，16并且后面一種檢驗(yàn)用于衍生ρ值。對(duì)來(lái)自癌癥樣品的數(shù)據(jù)使用卡方檢驗(yàn)， 以評(píng)估極光激酶A得分和腫瘤的病理學(xué)特征(例如組織學(xué)級(jí)別、生長(zhǎng)模式和分期之間的關(guān) 系。在其中列聯(lián)表計(jì)數(shù)很小的情況下，P值通過(guò)用固定的邊緣計(jì)數(shù)模擬進(jìn)行評(píng)估(P < -0. 05 被視為顯著的)。結(jié)果我們首先研究了膀胱的TCC樣品及其相鄰原位腫瘤發(fā)生前尿道上皮中的極光激酶A的表達(dá)水平。通過(guò)定量RT-PCR揭示的極光激酶AmRNA水平在相鄰尿道上皮和TCC中都 是升高的(圖1A)。極光激酶A的表達(dá)水平與腫瘤級(jí)別、分期和非整倍性相關(guān)(圖1B-D)。 與正常尿道上皮相比較，顯示與其核DNA總含量的正常二倍體的最低限度偏差并且分類為 近二倍體的低級(jí)別、淺表TCC顯示極光激酶A表達(dá)的輕微升高(約2倍)。相比之下，具有 顯著的非整倍性的高級(jí)別、侵入性TCC顯示極光激酶A表達(dá)的顯著升高(約7倍)。為了測(cè)定染色體不穩(wěn)定性的程度是否與極光激酶A的過(guò)表達(dá)程度相關(guān)，我們分析 了膀胱癌細(xì)胞系中的極光激酶A表達(dá)水平和染色體拷貝數(shù)(圖2A，B)。使用極光激酶A的 表達(dá)水平，將膀胱癌細(xì)胞系分成3個(gè)組(圖2C)。第一組由不具有極光激酶A表達(dá)升高的6 個(gè)細(xì)胞系組成。第二組由具有輕微極光激酶A升高(2至5倍)的4個(gè)細(xì)胞系組成。其余 3個(gè)細(xì)胞系顯示明顯升高水平的極光激酶A(6至14倍)。使用關(guān)于所選擇的染色體(3、7、 17)的著絲粒FISH探針的染色體拷貝數(shù)分析顯示在具有明顯升高水平的極光激酶A的細(xì)胞 系中明顯增加的染色體數(shù)目(圖2D)。這些相關(guān)研究暗示通過(guò)擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)獲得的極光激酶A的功能產(chǎn)生在膀胱癌發(fā) 展期間的非整倍體細(xì)胞表型。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染研究，使用SV40永生化尿道上皮細(xì)胞和包含野 生型極光激酶A-GFP插入片段的腺病毒構(gòu)建體驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的尿道上皮細(xì)胞顯示 與中心體的擴(kuò)增和非整倍性的發(fā)展相關(guān)的明顯升高的異位表達(dá)的極光激酶A，以及通過(guò)存 在中心體信號(hào)、染色體拷貝數(shù)、DNA總含量和在軟瓊脂上的集落形成能力的獲得的數(shù)目增加 而揭示的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞表型(圖3A-D)。為了測(cè)定極光激酶A是否可以用作用于膀胱癌檢測(cè)的標(biāo)記，我們使用FISH技術(shù)就 極光激酶A的擴(kuò)增分析具有膀胱癌的患者的排泄尿樣品(圖4A)。分析以不知情方式進(jìn)行； 即，對(duì)FISH結(jié)果評(píng)分的觀察者不知道樣品得自具有膀胱癌的患者還是未受影響的對(duì)照。初 始測(cè)試在來(lái)自具有膀胱癌的23個(gè)患者和7個(gè)健康對(duì)照的排泄尿樣品的訓(xùn)練組上執(zhí)行。它揭 示在具有膀胱癌的所有23個(gè)患者中至少低水平的基因擴(kuò)增(3-4個(gè)拷貝)。來(lái)自具有低級(jí) 別TCC的患者的排泄尿樣品包含具有極光激酶A的3-4個(gè)拷貝的原代細(xì)胞，而來(lái)自具有高 級(jí)別TCC的患者的基本比例的細(xì)胞(> 20% )具有> 4個(gè)拷貝的極光激酶A(圖4B)。在一 個(gè)對(duì)照中檢測(cè)出具有極光激酶A信號(hào)的3個(gè)拷貝的2個(gè)細(xì)胞。在其余6個(gè)對(duì)照的尿樣品中 未檢測(cè)出極光激酶A的異?？截悢?shù)。來(lái)自使用> 15%細(xì)胞具有極光激酶A的至少3個(gè)拷貝 作為關(guān)于測(cè)試陽(yáng)性的截止的訓(xùn)練組的數(shù)據(jù)分析得到1. 0的特異性、0. 91的靈敏度和0. 997 的 ROCAUC (P = IxliT4)。在由來(lái)自51個(gè)膀胱癌患者和30個(gè)健康對(duì)照的排泄尿樣品組成的其他不知情的測(cè) 試組上驗(yàn)證用于膀胱癌的極光激酶A FISH測(cè)試的表現(xiàn)。使用用于測(cè)試的陽(yáng)性的相同截止 點(diǎn)分析數(shù)據(jù)，即> 15%細(xì)胞具有極光激酶A的至少3個(gè)拷貝。測(cè)試在具有膀胱癌的患者的 44份樣品中是陽(yáng)性的。在具有膀胱癌的7個(gè)患者中未鑒定出異常極光激酶A基因拷貝數(shù)。 在30份對(duì)照樣品中的5份中，鑒定出具有極光激酶A基因的3個(gè)拷貝的1-3個(gè)細(xì)胞。測(cè)試 組的分析得到1. 0的特異性、0. 84的靈敏度和0. 925的ROC AUC(ρ = 6. 79x10-")。在關(guān)于 具有膀胱癌的74個(gè)患者和37個(gè)健康對(duì)照的排泄尿中的細(xì)胞的定量FISH分析結(jié)果概括于 圖5中。如通過(guò)極光得分測(cè)量的極光激酶A擴(kuò)增的程度與腫瘤的組織學(xué)級(jí)別強(qiáng)相關(guān)。高組 織學(xué)級(jí)別(級(jí)另U 3)的膀胱癌具有比低級(jí)別(級(jí)另Ij 1-2)腫瘤(0. 13 + 0. 15)明顯更高的極 光激酶A得分(0.60 士0.29)。在得分和腫瘤生長(zhǎng)模式(乳頭狀與非乳頭狀)、或分期(淺表與侵入)之間不存在顯著關(guān)聯(lián)(數(shù)據(jù)未顯示)。討論根據(jù)早期公開(kāi)的那些的目前發(fā)現(xiàn)提供了支持極光激酶A擴(kuò)增過(guò)表達(dá)是膀胱癌發(fā) 生中的早期事件的強(qiáng)烈證據(jù)，這與中心體擴(kuò)增和非整倍體基因組含量的發(fā)展相關(guān)。這些觀 察假定就我們較早報(bào)告的發(fā)現(xiàn)而言的重要生物學(xué)意義極光激酶A促進(jìn)腫瘤抑制蛋白質(zhì) P53的降解，并且具有極光激酶A的升高表達(dá)的人膀胱腫瘤樣品揭示極低的細(xì)胞p53含量， 模擬關(guān)鍵的腫瘤抑制途徑的喪失。17在本文背景中相關(guān)提及特定腫瘤抑制蛋白質(zhì)(最顯著地是P53)的喪失或滅活突 變引起中心體擴(kuò)增18，并且P53突變和細(xì)胞周期蛋白E過(guò)表達(dá)的伴隨發(fā)生與膀胱癌中的染 色體不穩(wěn)定性和中心體擴(kuò)增強(qiáng)相關(guān)。19極光激酶A和粘著斑支架蛋白質(zhì)HEFl之間的相互 作用和反饋調(diào)節(jié)的近期發(fā)現(xiàn)指出，極光激酶A的升高表達(dá)可能協(xié)同地干擾控制細(xì)胞附著、 遷移和細(xì)胞存活的整聯(lián)蛋白依賴性信號(hào)過(guò)程，連同表現(xiàn)為非整倍性的染色體不穩(wěn)定性的誘 導(dǎo)。2°這些觀察不僅提供關(guān)于極光激酶A在尿道上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用的強(qiáng)烈 證據(jù)，還暗示它可能是用于膀胱癌的新生物標(biāo)記?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的數(shù)據(jù)指出極光激酶A在尿道上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，引起中心體 擴(kuò)增和染色體的錯(cuò)誤分離，導(dǎo)致非整倍性和經(jīng)轉(zhuǎn)化的表型。在具有膀胱癌的患者的排泄尿 樣品上的目前FISH研究連同先前公開(kāi)的數(shù)據(jù)指出，極光激酶A的過(guò)表達(dá)和擴(kuò)增在膀胱癌 中是頻繁的，并且可以在來(lái)自排泄尿樣品的脫落尿道上皮細(xì)胞中檢測(cè)出。關(guān)于極光激酶A 基因和α-衛(wèi)星著絲粒染色體20DNA的雙色FISH探針以高特異性和靈敏度檢測(cè)膀胱癌。 此外，極光激酶A擴(kuò)增的程度與高級(jí)別臨床侵略性的膀胱癌相關(guān)。這暗示關(guān)于在尿中通過(guò) FISH技術(shù)的這種極光激酶A拷貝數(shù)的測(cè)試是用于膀胱癌的有希望的非侵入性測(cè)試。此外，就我們所知，我們的工作是首先超越相關(guān)研究的，暗示通過(guò)擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)獲 得的極光激酶A的功能產(chǎn)生在膀胱癌發(fā)展期間的非整倍體細(xì)胞表型，以顯示極光激酶A在 尿道上皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)引起中心體擴(kuò)增和染色體的錯(cuò)誤分離，導(dǎo)致非整倍性和經(jīng)轉(zhuǎn)化的 表型。本文公開(kāi)且請(qǐng)求保護(hù)的所有方法可以根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)而進(jìn)行且完 成。盡管本發(fā)明的組合物和方法已就優(yōu)選實(shí)施方案而言進(jìn)行描述，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員 顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)本文描述的方法和方法的步驟或步驟的順序應(yīng)用變化，而不背離本 發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體而言，顯而易見(jiàn)的是化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的特定試劑可以取 代本文描述的試劑，同時(shí)仍達(dá)到相同或相似結(jié)果。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的所有此 類相似取代物和修飾被認(rèn)為在如由附加權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神、概念和范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)下述參考文獻(xiàn)特別通過(guò)引用合并入本文，至它們提供本文描述的那些的補(bǔ)充的示 例性操作或其他細(xì)節(jié)的程度。1.Perkins AS， Stern DF.Molecular biology of cancer !oncogenes.In Cancer Principles and practices of oncology. 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權(quán)利要求
檢測(cè)患者中的膀胱癌的方法，其包括從所述患者的尿中分離膀胱細(xì)胞；使所述膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交，其中所述探針識(shí)別極光激酶A基因的至少部分，以產(chǎn)生與所述經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品；和計(jì)數(shù)所述樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、所述樣品中的每個(gè)膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)、和所述樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。
2.權(quán)利要求1的方法，其中極光激酶A基因的拷貝數(shù)第一閾值是3。
3.權(quán)利要求1的方法，其中計(jì)數(shù)進(jìn)一步包括計(jì)數(shù)具有極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第 二閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目，其中所述拷貝數(shù)第二閾值大于所述拷貝數(shù)第一閾值。
4.權(quán)利要求3的方法，其中極光激酶A基因的拷貝數(shù)第二閾值是5。
5.權(quán)利要求1的方法，如果大于或等于第一閾值百分比的膀胱細(xì)胞具有極光激酶A基 因的至少拷貝數(shù)第一閾值，那么所述方法進(jìn)一步包括假定所述患者具有膀胱癌。
6.權(quán)利要求5的方法，其中第一閾值百分比是15%。
7.權(quán)利要求5的方法，如果大于或等于第二閾值百分比的膀胱細(xì)胞具有極光激酶A基 因的至少拷貝數(shù)第一閾值，其中第二閾值百分比大于第一閾值百分比，那么所述方法進(jìn)一 步包括假定所述患者具有侵略性膀胱癌。
8.權(quán)利要求7的方法，其中第一閾值百分比是15%，并且第二閾值百分比是20%。
9.權(quán)利要求1的方法，其中經(jīng)標(biāo)記的DNA探針包括AURKA20ql3。
10.權(quán)利要求1的方法，其中極光激酶A基因包括選自SEQID NO :1和SEQ ID NO 2 的DNA序列。
全文摘要
公開(kāi)了檢測(cè)患者中的膀胱癌的方法，其包括從患者的尿中分離膀胱細(xì)胞；使膀胱細(xì)胞與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交，其中探針識(shí)別極光激酶A基因的至少部分，以產(chǎn)生與經(jīng)標(biāo)記的DNA探針雜交的膀胱細(xì)胞樣品；并且計(jì)數(shù)樣品中的膀胱細(xì)胞數(shù)目、樣品中的每個(gè)膀胱細(xì)胞中的極光激酶A基因拷貝數(shù)、和樣品中具有極光激酶A基因的至少拷貝數(shù)第一閾值的膀胱細(xì)胞數(shù)目。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101932727SQ200880123846
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月3日
發(fā)明者B·切爾尼亞克, H·B·格羅斯曼, S·薩伯拉塔 申請(qǐng)人:得克薩斯大學(xué)體系董事會(huì)