專利名稱：干酪乳桿菌副干酪亞種作為抗真菌劑的用途的制作方法
干酪乳桿菌副干酪亞種作為抗真菌劑的用途本發(fā)明涉及干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)用于保護(hù)乳制品免于產(chǎn)生霉菌的 用途。幾千年來就知道選擇微生物用于改善食品貯存。在這些微生物中，可提及的是乳 酸菌，其廣泛用于保存旨在用作人類食物或動物飼料的乳制品、肉制品或植物來源的產(chǎn)品。 利用乳酸菌改善食品貯存在很大程度上是基于它們在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸及其它有機(jī)酸 的能力，乳酸及所述其它有機(jī)酸通過降低介質(zhì)的PH、使其不利于不期望之微生物(細(xì)菌和 霉菌)的生長和/或其對這些微生物具有直接毒性作用而抑制這些微生物的生長。除了這 些有機(jī)酸之外，某些乳酸菌還產(chǎn)生抗真菌和/或抗菌物質(zhì)，比如過氧化氫、雙乙?；蛉樗徭?球菌肽(nisine)。申請EP 0221499描述了干酪乳桿菌鼠李糖亞種(Lactobacillus casei ssp. Rhamnosus)NRRL-B-15972的抗真菌性質(zhì)。當(dāng)在補(bǔ)充有黃瓜汁的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)該細(xì)菌 時(shí)，其能夠完全抑制橄欖色毛殼霉(Chaetomiumolivacium)的生長，以及部分抑制土曲霉 (Aspergillus terreus)和輪枝孢霉屬物種(Verticillium sp.)的生長。另一方面，在這 些條件下，其對草酸青霉(Penicillium oxalicum)的生長沒有影響；然而，在pH約為3. 7 的黃瓜汁中培養(yǎng)該細(xì)菌時(shí)，觀察到其對該微生物的抑制作用。申請EP 0576780描述了干酪乳桿菌鼠李糖亞種LC-705的抗真菌作用。利用 補(bǔ)充有酪蛋白水解產(chǎn)物和酵母提取物的基于乳清(lactoserum)的培養(yǎng)基獲得的該細(xì)菌 的培養(yǎng)物可以抑制青霉菌屬(Penicillium)、分支孢子菌屬(Cladosporium)、鐮刀菌屬 (Fusarium)和念珠菌屬(Candida)的生長。PCT 申請 WO 97/36603 描述了干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacilluscasei ssp. Casei)N94/49432的抗真菌作用。利用補(bǔ)充有酵母提取物的合成培養(yǎng)基獲得的該細(xì)菌的培 養(yǎng)物對鏈格孢屬(Alternaria)、Chaetomtum、分支孢子菌屬、刺盤孢屬(Colletotrichum)、 小克銀漢霉屬(Cunninghamella)、Dothiorella、地絲菌屬(Geotrichum)、蓮點(diǎn)霉屬 (Phoma)和Phomopsis有抗真菌作用。申請EP 1308506 描述了詹氏丙酸桿菌(Propionibacterium jensenii)與某些干 酪乳桿菌副干酪亞種(Lactobacillus casei ssp. paracasei)菌株之組合的抗真菌和抗細(xì) 菌作用?，F(xiàn)在，本發(fā)明人注意到當(dāng)單獨(dú)使用干酪乳桿菌副干酪亞種細(xì)菌時(shí)，即不與其它抗 真菌細(xì)菌特別是詹氏丙酸桿菌組合時(shí)，其具有抗真菌活性(特別是對于青霉菌屬的霉菌)。該抗真菌活性顯示出下述特征當(dāng)利用合成培養(yǎng)基培養(yǎng)干酪乳桿菌時(shí)，不產(chǎn)生抗真菌活性，但是當(dāng)利用乳培養(yǎng)基 或基于乳的培養(yǎng)基(milieu abase de lait)上培養(yǎng)時(shí)，顯示出從培養(yǎng)5小時(shí)開始產(chǎn)生抗真 菌活性。在發(fā)酵24至48小時(shí)后達(dá)到其最大值。其對PH敏感。其在PH低于4時(shí)消失，但是如果PH重新上升到高于4，則其再次產(chǎn)生。其還對熱敏感。在60°C熱處理1小時(shí)后，其消失。
而且，其既不與有機(jī)酸(例如山梨酸、丙酸或苯甲酸(已知它們具有抗真菌活性)) 的產(chǎn)生相關(guān)，也不與過氧化氫的產(chǎn)生相關(guān)，在具有抗真菌性質(zhì)的干酪乳桿菌副干酪亞種的 培養(yǎng)物中檢測不到這些物質(zhì)。本發(fā)明的目的是干酪乳桿菌副干酪亞種細(xì)菌賦予發(fā)酵乳制品以抗真菌性質(zhì)的用 途。特別地，本發(fā)明的目的是用于抑制發(fā)酵乳制品中子囊菌類的霉菌(特別是青霉 菌屬的霉菌)的方法，其特征在于其包括在干酪乳桿菌副干酪亞種細(xì)菌存在下，將乳基質(zhì) (substrat laitier)發(fā)酵足以在該基質(zhì)中出現(xiàn)抗真菌活性的一段時(shí)間。在發(fā)酵后所述制品 被所述霉菌污染情況下，該抗真菌活性具有抑制所述霉菌生長的作用。有利地，對于所述發(fā)酵而言，接種所述乳基質(zhì)的所述干酪乳桿菌副干酪亞種之細(xì) 菌的量為至少IO6Cfu/克乳基質(zhì)，優(yōu)選為至少IO7Cfu/克乳基質(zhì)，有利地為IO7至IO8Cfu/克 乳基質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述乳基質(zhì)的發(fā)酵進(jìn)行至少5小時(shí)，優(yōu) 選至少15小時(shí)，更優(yōu)選地24至48小時(shí)。為了使用短的發(fā)酵時(shí)間獲得抗真菌活性，優(yōu)選使 用相對大量的干酪乳桿菌副干酪亞種；例如，為了觀察所述乳基質(zhì)發(fā)酵5小時(shí)后的抗真菌 活性，按照至少IO7Cfu/克乳基質(zhì)的比例進(jìn)行接種。根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，如果需要，其包括調(diào)節(jié)發(fā)酵基質(zhì)的pH 至高于4、優(yōu)選4至6. 5之間的值。有利地，所述干酪乳桿菌副干酪亞種細(xì)菌為CNCM 1-1518菌株的細(xì)菌。該菌株特 別描述于申請EP0794707中；根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，其于1994年12月30日保藏于巴 黎Docteur Roux大街25號的CNCM(國家微生物培養(yǎng)物保藏中心，Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes)。根據(jù)下述闡述干酪乳桿菌副干酪亞種菌株抗真菌活性之實(shí)施例的進(jìn)一步說明，本 發(fā)明將得到更好地理解。實(shí)施例1 在干酪乳桿菌副干酪亞種存在下證實(shí)發(fā)酵乳制品的抗真菌活性用 下述6種真菌，按照IO2個(gè)孢子的比例接種包含干酪乳桿菌副干酪亞種的發(fā)酵乳制品 (Actimel ,包含CNCM 1-1518菌株與嗜熱鏈球菌(S. thermophilus)和保加利亞乳桿菌 (L. bulgaricus)的組合)以及包含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的發(fā)酵乳制品(對照) 卷枝毛霉菌(Mucorcircinelloides)(測試2個(gè)菌株)；白霉菌(Mucor plumbeus)；擴(kuò)展 青霉菌(Penicillium expansum)；婁地青霉菌(Penicillium roqueforti)；短密青霉菌 (Penicillium brevicompactum)。這些物種是鮮奶制品中通常遇到的代表性污染物。然后，在10°C孵育該制品，每7天檢查真菌生長菌體的外觀。對于Aetimel 而言，從第14天開始，以及對于對照制品而言從第7天開始，在這 兩種制品上都觀察到毛霉菌屬物種的大量產(chǎn)生。另一方面，對Aetimel 而言，在孵育40天 后觀察到青霉菌極低地生長(聚集體)或缺少可見的生長，而僅在14天中就觀察到了對對 照產(chǎn)品表面的侵入(envahissement)。在又一系列試驗(yàn)中，利用源自抗菌譜技術(shù)的技術(shù)評價(jià)了 CNCM 1-1518菌株的抗真 菌活性。其包括將測試制品混入瓊脂(80%的產(chǎn)品+20%的瓊脂溶液(15g/l))中，并將該混合物倒入培養(yǎng)皿中。將3個(gè)無菌紙盤放置在固化培養(yǎng)基上，并將100個(gè)測試霉菌的孢子(擴(kuò)展青霉菌 LMSA 00 083)置于該盤上。在25°C和10°C孵育該培養(yǎng)皿。定期測量真菌菌體的直徑。所測試制品如下Actimel ; Actimel 與嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的 乳混合物，不含CNCM 1-1518菌株；不含嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的Actimel 的乳 混合物，在CNCM 1-1518菌株存在下發(fā)酵24小時(shí)。將每個(gè)測試條件下兩次測試的結(jié)果列在下表I中。表 I
孵育后的菌體直徑(mm)在10。，17天后的菌 體直徑(mm)在10。，24天后的菌 體直徑測試1 在25T下8天測試2 在25C下7天測試1測試2測試1測試2標(biāo)準(zhǔn) Actimel (市售)17.6 ± 4.419.2 ±4.89.6 土 0.510 ± 0.910.9 ± 0.812.9 士 1.8Actimel ,不 含干酪乳桿菌>65>65>65>65>65>65
Actimel 的乳混合物，在不存在嗜熱W菌和保加利亞9.4 ±18.8 ±111.4 ± 115.1 ± 1.214.1 ± 0.917.2 ± 1.2乳桿菌下，其與干酪乳桿菌發(fā)酵24小時(shí)與不含有CNCM 1-1518菌株的制品(不含有干酪乳桿菌的Actimel 的乳混合
物)不同，包含CNCM 1-1518菌株的兩種制品(Actimel ;以及Actimel 的乳混合物，
其在不存在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌下與干酪乳桿菌發(fā)酵24小時(shí))顯示出抗真菌活 性。實(shí)施例2 用干酪乳桿菌副干酪亞種發(fā)酵期間抗真菌活性的表觀動力學(xué)對由脫脂乳組成的混合物進(jìn)行抗真菌活性測試，所述脫脂乳補(bǔ)充有2%的葡萄糖
5和6%的乳蛋白(常規(guī)脫脂乳蛋白)，用107CfU/ml的冷凍干燥形式的CNCM 1-1518菌株接 種。在用CNCM 1-1518接種之前和之后收集混合物樣品，然后在發(fā)酵15小時(shí)、24小時(shí)、48 小時(shí)和72小時(shí)后收集混合物樣品。在測試抗真菌活性之前，以IOkG照射所收集并冷凍的 樣品以阻止細(xì)菌產(chǎn)生，從而防止其在測試期間生長和代謝。預(yù)先解凍該測試樣品，將樣品的 PH調(diào)節(jié)至6. 2 (起始混合物的pH)。如上述實(shí)施例1所述進(jìn)行測試。這些測試的結(jié)果(菌體直徑的測量值)顯示在下表II中。術(shù)語“盤上有菌體”和 “聚集體”是指僅在盤上觀察到的真菌生長的痕跡。表 II在25 °C下測試7天
未接種的混合物混合物+干路孔桿菌TOT15hT24hT48hT72 h
36.8mm 士 10.222.5mm 土 3.119.3mm 士 2.7聚集休聚集體聚集體在10°C下測試19天
未接種的混綠混合物+干酪乳桿菌TOT15hT24hT48hT72h48.5mm ±1.913.8mm 士 3.3盤上有菌體聚集體聚集體聚集體這些測試顯示了抗真菌活性的早期表現(xiàn)，其有時(shí)在接種早期似乎就微弱地存在， 但是僅從發(fā)酵后15小時(shí)開始就很明顯，并且在24小時(shí)至48小時(shí)之間達(dá)到最大值。在48 小時(shí)、甚至在72小時(shí)后，只要pH高于4，該活性就仍存在。實(shí)施例3 抗真菌活性的pH敏感性在與上述實(shí)施例2相同的條件下進(jìn)行抗真菌活性測試，但是在測試前未調(diào)節(jié)pH。結(jié)果顯示在下表III中。表 III未接種的混 合物混合物+干酪乳桿菌TOT15hT24hT48hT72hpH6.326.015.634.83.943.7533.2 ± 2.512.8 ± 1.3聚集體聚集體34.3 ± 11.425.2 士 2.1這些結(jié)果表明當(dāng)pH低于4時(shí)抗真菌能力削弱了。然而，這種削弱似乎是可逆的，因?yàn)槿绻鹥H回到高于4的值時(shí)，抗真菌能力即得以恢復(fù)。實(shí)施例4 發(fā)酵培養(yǎng)基對抗真菌活性的影響為了確定抗真菌活性是否與培養(yǎng)基有關(guān)系，使用下述物質(zhì)作為培養(yǎng)基進(jìn)行測試 首先是在實(shí)施例2中描述的乳混合物，其次是具有下述組成的合成培養(yǎng)基10g/L蛋白胨， 10g/L肉提取物；5g/L酵母提取物；2g/L磷酸二鉀；2g/L檸檬酸銨；0. lg/L硫酸鎂；0. 05g/ L硫酸錳；20g/L葡萄糖；吐溫80 =Iml ；加至IL的適量去離子水。用冷凍干燥形式的IO7Cfu/ ml的CNCM 1-1518菌株接種這些培養(yǎng)基。在培養(yǎng)24和48小時(shí)后，如實(shí)施例2所述測試抗 真菌活性，在25°C下測試7天后的抗真菌活性，在10°C下測試20天的抗真菌活性。當(dāng)利用所述乳混合物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，觀察到真菌生長完全被抑制，其與測試溫度無 關(guān)。另一方面，當(dāng)在合成培養(yǎng)基上進(jìn)行等同細(xì)菌群落的培養(yǎng)時(shí)，未觀察到抑制。
權(quán)利要求
干酪乳桿菌副干酪亞種(Lactobacillus casei ssp.paracasei)細(xì)菌用于賦予發(fā)酵乳制品以抗真菌性質(zhì)的用途。
2.抑制發(fā)酵乳制品中產(chǎn)生子囊菌類霉菌的方法，其特征在于，其包括在干酪乳桿菌副 干酪亞種細(xì)菌的存在下，使乳基質(zhì)發(fā)酵足以在該基質(zhì)中出現(xiàn)抗真菌活性的一段時(shí)間。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，對于所述發(fā)酵，接種所述乳基質(zhì)的所述干酪 乳桿菌副干酪亞種細(xì)菌的量為至少IO6Cfu/克乳基質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，對于所述發(fā)酵，接種所述乳基質(zhì)的所述干酪 乳桿菌副干酪亞種細(xì)菌的量為至少IO7Cfu/克乳基質(zhì)。
5.如權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述乳基質(zhì)的發(fā)酵進(jìn)行至少5 小時(shí)。
6.如權(quán)利要求2至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，如果需要，其包括調(diào)節(jié)所述發(fā) 酵基質(zhì)的PH至高于4的值。
7.如權(quán)利要求2至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述干酪乳桿菌副干酪亞種細(xì) 菌為CNCM 1-1518菌株的細(xì)菌。
8.如權(quán)利要求2至7中任一項(xiàng)所述的方法，特征在于所述子囊菌類的霉菌屬于青霉菌jM ο
全文摘要
本發(fā)明涉及干酪乳桿菌副干酪亞種用于賦予發(fā)酵乳產(chǎn)品以抗真菌性質(zhì)的用途，特別是用于抑制所述產(chǎn)品中子囊菌類霉菌生長的用途。
文檔編號A23C9/123GK101917861SQ200880123913
公開日2010年12月15日 申請日期2008年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者伊夫·蒂里利, 凱瑟琳·洛伊桑斯-帕魯, 貝諾伊特·富爾曼, 路易斯·佩里爾 申請人:達(dá)能日爾維公司