專利名稱：以dna微陣列為基礎(chǔ)的平衡易位斷點(diǎn)的鑒定和定位的制作方法
以DNA微陣列為基礎(chǔ)的平衡易位斷點(diǎn)的鑒定和定位相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考無有關(guān)聯(lián)邦資助的研究和開發(fā)所形成的發(fā)明的權(quán)利聲明本發(fā)明是在NCI基金號(hào)5P30 CAO15704的政府資助下完成的。政府享有本發(fā)明的 某些權(quán)利。關(guān)于以壓縮磁盤提交的“序列表”、表格、或計(jì)算機(jī)程序表附件的說明無
背景技術(shù)：
大規(guī)模的基因組畸變，其中包括平衡重排(易位和倒位)和基因組不平衡(缺 失、重復(fù)和擴(kuò)增)在癌癥中是很常見的，在腫瘤形成中扮演重要角色。基因組缺失通常與 腫瘤抑制基因功能的喪失相關(guān)，擴(kuò)增與原-癌基因的過量表達(dá)相關(guān)，易位與新型癌基因融 合的形成或癌基因表達(dá)的下調(diào)相關(guān)。從歷史上看，平衡易位和基因融合主要見于血液學(xué) 和間質(zhì)腫瘤，其中包括肉瘤、白血病和淋巴瘤(Rabbits, Nature 372(6502) 143 (1994))， 較少見于上皮腫瘤，如癌。最近的研究發(fā)現(xiàn)，癌基因融合也可見于前列腺癌(Tomlins， Rhodes 等，Science310 (5748) :644_648 (2005))、甲狀腺癌(Bongarzone，Butti 等，Cancer Res. 54(11) :2979_2985 (1994) ；Kroll，Sarraf■等，Science 289(5483) 1357-1360 (2000)) 以及肺癌(Soda, Choi等，Nature 448(7153) :561 (2007))，這說明在癌中比原來預(yù)計(jì)的 更常見，這可能是因?yàn)檫@些腫瘤復(fù)雜的細(xì)胞遺傳學(xué)或者其他技術(shù)原因造成的(Mitelman， Johansson 等，Nat Genet 36(4) 331 (2004)) 通過對(duì)新型原_癌基因、腫瘤抑制基因和癌基因融合的鑒定進(jìn)行大規(guī)模畸變分析 使我們對(duì)腫瘤形成的理解發(fā)生了變化。以微陣列為基礎(chǔ)的比較基因組雜交(陣列-CGH/ aCGH)技術(shù)的進(jìn)展導(dǎo)致有關(guān)癌基因組不平衡的數(shù)據(jù)以指數(shù)速度積累，這些數(shù)據(jù)使繪圖的 分辨率以前所未有的速度提高。通過arryCGH鑒定發(fā)現(xiàn)，少數(shù)易位在一個(gè)或兩個(gè)斷點(diǎn) (breakpoint)處有小的缺失。但是，這種不平衡在一般情況下是檢測(cè)不到的，即使存在也不 表示其他伴侶基因是相同的?，F(xiàn)在結(jié)構(gòu)變異被認(rèn)為是人群之間遺傳變異的重要來源(Bansal,Bashir等，Genome Research 17(2) :219_230 (2007) ；Korbel，Urban 等，Science 318(5849) :420_426 (2007)； Hurles, Dermitzakis φ, Trends in Genetics 24(5) 238-245 (2008) ；Kidd, Cooper φ, Nature 453(7191:56-64(2008))。拷貝數(shù)變異(CNV)如染色體缺失或片段重復(fù)是目前已 報(bào)道的最常見的結(jié)構(gòu)變異，研究表明它與人類疾病或疾病易感性相關(guān)(GonzalehKulkarni 等，Science 30(5714) 1434-1440 (2005) ；Hollox, Huffmeier 等，Nat Genet 40(1) 23(2008))。鑒定平衡染色體重排的方法已滯后于CNV檢測(cè)方法，但是越來越多的人將染 色體倒位和更復(fù)雜的重排視為結(jié)構(gòu)和功能編碼的重要來源，并且也和人類疾病相關(guān)(Feuk， MacDonald 等，PLoS Genetics 1(4) :e56(2005) ；Turner, Shendure 等，Nat Meth 3(6) 439(2006) ；Bansal,Bashir 等，Genome Research 17(2) :219_230(2007) ；Flores,Morales 等，PNAS 104(15) 6099-6106(2007) ；Kidd，Cooper 等，Nature 453(7191 56-64(2008))
當(dāng)前，與可用于檢測(cè)基因組不平衡的方法相比，設(shè)計(jì)出來用于檢測(cè)平衡易位的方 法還是很有限的。傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)分析和多色(或光譜)核型分析是在全基因組內(nèi)鑒定 大規(guī)?；蚪M異常的有效技術(shù)，但是這些方法是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，需要培養(yǎng)細(xì)胞，并且分辨率有 限(約5，000，OOObp)。熒光原位雜交(FISH)可用于以較高的分辨率(一般IOO-IOOOkb) 分析小數(shù)目的基因座，但是FISH不易放大規(guī)模，并且需要事先了解融合伴侶。在陣列繪圖 中，(Fiegler，Gribble 等，J Med Genet 40(9) =664-670(2003))從流式分選的異常染色 體中擴(kuò)增DNA，然后與CGH陣列雜交，這樣就可以高分辨率對(duì)易位斷點(diǎn)進(jìn)行定位(Gribble， Kalaitzopoulos 等，J Med Genet 44(1) :51_58 (2007))。但是這種技術(shù)還未被廣泛應(yīng)用， 只限于能在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的細(xì)胞。鑒定染色體易位并確定其特征的復(fù)雜性還在于這樣的事實(shí)，S卩，越來越多的參與 易位的基因被認(rèn)為是“泛宿主性的”，研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)诓煌囊孜缓筒煌念愋偷哪[瘤中 與多種伴侶基因相融合(Cleary，N Engl J Med 329(13) :958_959 (1993))。明顯的例子包 括混合系白血病(MLL)基因(Meyer，Schneider 等，Leukemia 20(5) :777 (2006))、免疫球蛋 白重鏈(IgH)基因座(Willis 和 Dyer，Blood 96(3) :808_822 (2000)以及 ETV6 (Bohlander， Seminars inCancer Biology 15(3) :162_174(2005))，這些基因中的每一個(gè)都能與不同易 位中的20或更多個(gè)不同基因座形成伴侶。因此，已經(jīng)開發(fā)出了許多分子方法來鑒定平衡 易位中未知的融合伴侶基因，其中一個(gè)伴侶是已知的，或者是可以推測(cè)出來的。這些技術(shù) 包括 cDNA 末端快速擴(kuò)增(RACE) (Frohman, Dush 等，PNAS 85 (23) 8998-9002 (1988))、長(zhǎng)距 離倒位(LDI) PCR(Ochman，Gerber 等，Genetics 120(3) :621_623 (1988) ；Willis, Jadayel 等，Blood 90(6) =2456-2464(1997))以及以陣列為基礎(chǔ)的融合轉(zhuǎn)錄子檢測(cè)(Nasedkina, Domer 等，Haematologica 87(4) 363-72 (2002) ；Maroc, Morel 等，Leukemial8 (9) 1522-30(2004))。但是，這些技術(shù)都是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，其通量有限，不適于臨床樣品的常規(guī)分 析。因此，需要有常規(guī)檢測(cè)染色體異常，特別是平衡易位的改良方法。本發(fā)明可以滿足 這些以及其他需要。發(fā)明概述雖然比較基因組雜交(CGH)已被證明可有效檢測(cè)染色體不平衡，但是以前的CGH 方法通常不能用于檢測(cè)平衡基因組重排，如交互易位，而交互(reciprocal)易位在各種腫 瘤，其中包括淋巴瘤和白血病等，的發(fā)病機(jī)制和診斷中扮演主要角色。以前的CGH方法無法 用于檢測(cè)平衡易位的原因至少部分是因?yàn)檫@些方法依賴于待測(cè)樣品和參照樣品之間相對(duì) 差異的檢測(cè)，而平衡易位不會(huì)產(chǎn)生染色體材料的凈丟失或凈增加，因此其相對(duì)量是維持一 致的。為了克服這些限制并拓展可檢測(cè)的染色體異常的范圍，我們開發(fā)出了易位 CGH(tCGH)，這是一種可以超高分辨率檢測(cè)平衡易位斷點(diǎn)的方法。本發(fā)明的基礎(chǔ)部分在于在 線性擴(kuò)增反應(yīng)中使用已知基因組內(nèi)的序列的特異性引物來制備涵蓋已知基因座和易位伴 侶(partner)的序列的探針。從待測(cè)樣品中制備的探針的雜交模式和雜交強(qiáng)度與參考樣品 中制備的相同探針的雜交模式和雜交強(qiáng)度進(jìn)行比較，從而可以鑒定出已知基因座的易位伴 侶。利用高密度的微陣列如瓦片密度微陣列(tiling density microarray)可對(duì)易位斷點(diǎn) 進(jìn)行高分辨率定位。
如下文將要詳細(xì)描述的，我們證明了 tCGH能夠用于檢測(cè)大多數(shù)常見類型的IgH易 位，其中包括發(fā)生在連接(Jh)片段處和重復(fù)轉(zhuǎn)換重組(Sh)區(qū)內(nèi)發(fā)生的那些易位。我們鑒 定了各個(gè)細(xì)胞系內(nèi)的已知易位斷點(diǎn)，其中包括BCL2、BCL6、細(xì)胞周期蛋白Dl(CCNDl)和MYC 易位以及這些基因座內(nèi)復(fù)雜而隱匿的IgH重排。通過對(duì)5種外套細(xì)胞和小淋巴細(xì)胞性淋巴 瘤內(nèi)的新型CCNDl斷點(diǎn)進(jìn)行定位和克隆進(jìn)一步證明了 tCGH的實(shí)用性，這是迄今為止所報(bào)道 的這種系列中最大的。另外，多重tCGH分析可用于檢測(cè)各種髓性白血病相關(guān)的幾種常見易 位。相應(yīng)的，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了確定待測(cè)樣品中已知基因座內(nèi)的染色 體重排的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞 分離第二基因組DNA，(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記 第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第一可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物；以及利用已知 基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第 二可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物，(c)將擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包 含基因組DNA序列的微陣列雜交，以及(d)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn) 物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度，其中線性擴(kuò)增的待測(cè)樣品DNA產(chǎn)物與不同于已知基因 座的DNA微陣列元件的雜交超過了線性擴(kuò)增的參照樣品DNA產(chǎn)物，則說明已知基因座與細(xì) 胞內(nèi)的第二基因座發(fā)生了重排。在第二個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了鑒定待測(cè)樣品中已知基因座內(nèi)的染色體重排 伴侶的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分 離第二基因組DNA，(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第 一基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第一可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物；以及利用已知基 因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第二 可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物，(c)將標(biāo)記并擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物 和包含基因組DNA序列的微陣列雜交，以及(d)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA 產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度，其中線性擴(kuò)增的待測(cè)樣品DNA產(chǎn)物與不同于已知基 因座的DNA微陣列元件的雜交超過了線性擴(kuò)增的參照樣品DNA產(chǎn)物，則可以將DNA微陣列 的元件鑒定為已知基因座的重排伴侶。在第三個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了同時(shí)確定待測(cè)樣品中已知基因座內(nèi)的染色體 重排以及染色體易位的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參 照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA，(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線 性擴(kuò)增第一基因組DNA以產(chǎn)生待測(cè)基因組DNA和引物特異性的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物的混合 物；以及利用相同的已知基因座樣品內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第二基因組 DNA以產(chǎn)生參照基因組DNA和引物特異性的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物的混合物，(c)通過以寡 核苷酸為引物的聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)增和標(biāo)記待測(cè)樣品和參照樣品的混合物， (d)將標(biāo)記并擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包含基因組DNA序列的微陣列雜交，以 及(e)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度， 其中⑴當(dāng)擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物和參照DNA產(chǎn)物都與DNA微陣列的元件雜交，但是前者的 強(qiáng)度高于后者時(shí)，說明待測(cè)樣品內(nèi)微陣列元件所代表的DNA序列得到了擴(kuò)增，(ii)擴(kuò)增的 參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列元件的雜交強(qiáng)于擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物與DNA微陣列元件的雜交則說明待測(cè)樣品內(nèi)微陣列元件所代表的DNA序列發(fā)生了缺失，以及(iii)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物 與不同于已知基因座的DNA微陣列元件的雜交強(qiáng)于擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列元件 的雜交則說明已知基因座與細(xì)胞內(nèi)的第二基因座發(fā)生了重排。在上述實(shí)施方式的一個(gè)方面，方法還包括確定對(duì)應(yīng)于已知基因座線性序列的一系 列元件中可與擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物雜交的最后一個(gè)元件，從而鑒定出已知基因座重排斷點(diǎn)大概 位置的步驟。在上述實(shí)施方式的另一個(gè)方面，方法還包括確定對(duì)應(yīng)于不同于已知基因座的第二 基因座線性序列的一系列元件中可與擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物雜交的第一元件，從而鑒定出易位伴 侶重排斷點(diǎn)大概位置的步驟。在上述實(shí)施方式的其他方面，待測(cè)樣品和參照樣品包含相同的基因組DNA，待測(cè)樣 品而不是參照樣品用于進(jìn)行(b)部分的線性擴(kuò)增步驟。在上述實(shí)施方式的其他方面，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物是相同的，擴(kuò)增的待測(cè)DNA 產(chǎn)物和參照DNA產(chǎn)物與兩個(gè)相同的微陣列雜交，或者與同一個(gè)微陣列先后雜交。在另一個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括只擴(kuò)增和檢測(cè)第一樣品DNA，然后與 預(yù)先確定的參照讀數(shù)或檢測(cè)值比較。在第四個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了確定待測(cè)樣品中染色體重排的方法，該方法 包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA; (b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生 擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物(T+)；利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo) 記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物(N+)；去除已知基因座內(nèi)的已知DNA序 列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生空白待測(cè)DNA產(chǎn)物(T-)；去除已 知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生空白參 照DNA產(chǎn)物(N-) ； (c)利用隨機(jī)引物通過引物延伸用不同的可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記T+、N+、T-和 N- ； (d) T+和N+與包含基因組DNA序列的第一 DNA微陣列共雜交；(e) T-和N-與包含基因 組DNA序列的第二 DNA微陣列共雜交；(f)將第一 DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式和強(qiáng)度與 第二 DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式和強(qiáng)度進(jìn)行比較，其中第一微陣列上雜交信號(hào)對(duì)染色體 位置的散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)呈直角三角形模式，而第二微陣列上未出現(xiàn)類似模式，則表明染 色體易位，直邊(vertical leg)的染色體位置標(biāo)記了染色體易位斷點(diǎn)；以及其中在第一微 陣列和第二微陣列相同位置上雜交信號(hào)對(duì)染色體位置的散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)都呈現(xiàn)矩形模 式則表明染色體重復(fù)或缺失，直邊的染色體位置標(biāo)記了重復(fù)或缺失的基因組區(qū)域的兩個(gè)端 點(diǎn)，從而可以確定待測(cè)樣品內(nèi)的染色體重排。在第五個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了確定待測(cè)樣品中染色體重排的方法，該方法 包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA; (b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生 擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物(T+)；利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo) 記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物(N+)；去除已知基因座內(nèi)的已知DNA序 列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生空白待測(cè)DNA產(chǎn)物(T-)；去除已 知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生空白參 照DNA產(chǎn)物(N-) ； (c)利用隨機(jī)引物通過引物延伸用不同的可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記T+、N+、T-和N- ； (d)T+和T-與包含基因組DNA序列的第一 DNA微陣列共雜交；(e)N+和N-與包含基因 組DNA序列的第二 DNA微陣列共雜交；(f)將第一 DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式和強(qiáng)度與 第二 DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式和強(qiáng)度進(jìn)行比較，其中第一微陣列上雜交信號(hào)對(duì)染色體 位置的散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)呈直角三角形模式，而第二微陣列上未出現(xiàn)類似模式，則表明染 色體易位，直邊的染色體位置標(biāo)記了染色體易位斷點(diǎn)；以及其中雜交信號(hào)對(duì)染色體位置的 散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)的模式在第一微陣列和第二微陣列上相同則說明是假斷點(diǎn)，從而可以確 定待測(cè)樣品內(nèi)的染色體重排。在第六個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了診斷對(duì)象的疾病的方法，其中疾病是由染色 體重排造成的，該方法包括(a)從對(duì)象獲取生物樣品；(b)從生物樣品的細(xì)胞分離第一基因 組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA ； (c)利用疾病相關(guān)的已知基因座內(nèi)的已知 DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第一可檢測(cè)標(biāo)記物 的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物；以及利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和 標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第二可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物；(d)將擴(kuò) 增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包含基因組DNA序列的微陣列雜交，以及(e)比較擴(kuò) 增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度，其中線性擴(kuò)增 的待測(cè)樣品DNA產(chǎn)物與不同于已知基因座的DNA微陣列元件的雜交超過了線性擴(kuò)增的參照 樣品DNA產(chǎn)物，則可以將DNA微陣列的元件鑒定為已知基因座的重排伴侶，重排伴侶的一致 性為對(duì)象疾病的診斷提供了依據(jù)。在上述實(shí)施方式的某些方面，染色體重排是指易位。在上述實(shí)施方式的某些方面， 染色體重排是指染色體倒位或者是指來源于一個(gè)染色體座的DNA片段插入到第二種不同 的染色體座內(nèi)。在本發(fā)明的其他實(shí)施方式中，方法還包括檢測(cè)選自如下一組的染色體異常 缺失、重復(fù)、擴(kuò)增和倒位。在某些實(shí)施方式中，一種以上類型的染色體異常的檢測(cè)可同時(shí)進(jìn) 行。在其他實(shí)施方式中，一種以上類型的染色體異常的檢測(cè)可先后進(jìn)行。在上述實(shí)施方式的其他方面，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物可在擴(kuò)增期間摻入，或者 在擴(kuò)增后摻入。在上述實(shí)施方式的其他方面，第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，其中包括 Cy3 和 Cy5。在上述實(shí)施方式的其他方面，DNA微陣列是瓦片密度DNA微陣列(tilingdensity DNA microarray)。在上述實(shí)施方式的其他方面，已知基因座對(duì)應(yīng)的是免疫球蛋白基因。在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方式中，已知基因座相對(duì)應(yīng)的是特定疾病或疾病狀態(tài)相 關(guān)的基因座。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，疾病是指腫瘤。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，腫瘤是指白 血病，如髓性白血病。在上述實(shí)施方式的某些方面，待測(cè)樣品的細(xì)胞是指腫瘤細(xì)胞，參照樣品的細(xì)胞是 指正常細(xì)胞，其中腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或白血病細(xì)胞。在上述實(shí)施方式的某些方面，待測(cè)樣品的細(xì)胞是來源于一個(gè)個(gè)體的正?；虍惓＜?xì) 胞，參照樣品的細(xì)胞是來源于第二個(gè)體的正常或異常細(xì)胞，染色體重排是指待測(cè)樣品內(nèi)出 現(xiàn)而參照樣品內(nèi)未出現(xiàn)的，或者參照樣品內(nèi)出現(xiàn)而待測(cè)樣品內(nèi)未出現(xiàn)的，易位、倒位、缺失、 重復(fù)、插入或其他復(fù)雜重排。
附圖簡(jiǎn)述

圖1說明的是(a)顯示Jh和轉(zhuǎn)換重復(fù)區(qū)的IgH基因座；(b)利用Jh引物線性擴(kuò) 增；(c)利用S5(Svqe)引物線性擴(kuò)增；(d)典型易位CGH(tCGH)試驗(yàn)的概要。圖2說明的是包含已知IgH易位斷點(diǎn)的細(xì)胞系的tCGH數(shù)據(jù)，(a)DHL16細(xì)胞系內(nèi) 的Jh_BCL2斷點(diǎn)(微小簇區(qū))；(b)MCl 16細(xì)胞系內(nèi)的Jh-MYC斷點(diǎn)；(c)U266細(xì)胞系內(nèi)的Sa-CCNDl斷點(diǎn)；(d)0CI_Ly8細(xì)胞系內(nèi)的SY_BCL6斷點(diǎn)。
圖3說明的是(a) RL7細(xì)胞系內(nèi)的JH_BCL2斷點(diǎn)和BCL2缺失的分析結(jié)果(i) RL7+JH(Cy3)/ 正常 +JH(Cy5)_ 斷點(diǎn)和缺失；(ii) RL7_JH (Cy3) / 正常-JH(Cy5)_ 只有缺 失；(i i i) RL7+Jh (Cy3) /RL7-Jh (Cy5)-只有斷點(diǎn)。(b)部分說明的是上述所有三個(gè)試 驗(yàn)的RL7/BCL2陣列數(shù)據(jù)的重疊。(c)部分說明的是M02058細(xì)胞系內(nèi)Jh-CCNDI斷點(diǎn) 和CCNDl重復(fù)/缺失的分析結(jié)果⑴M02058+Jh (Cy3) /正常+Jh (Cy5)-斷點(diǎn)和重復(fù)/ 缺失；(ii)M02058-JH(Cy3)/ 正常-Jh (Cy5)-只有重復(fù) / 缺失；(iii)M02058+JH(Cy3) / Granta-J11 (Cy5)_只有斷點(diǎn)。(d)部分說明的是上述所有三個(gè)試驗(yàn)的M02058/CCND1陣列數(shù) 據(jù)的重疊。圖4說明的是0CI_Ly8細(xì)胞系內(nèi)鑒定出的多重IgH斷點(diǎn)(a)JH-BCL2-〃 der(14)〃 斷點(diǎn)；(b)利用SyR鑒定出的Sy3-BCL6-〃 der(3)〃斷點(diǎn)；(c)利用SyR引物鑒定出的 Sy-MYC-" der(8)“斷點(diǎn)；(d)利用 SyF 引物鑒定出的 SY_BCL6_〃 der(14)“斷點(diǎn)。圖5說明的是6分鐘(明線)和10分鐘(暗線)線性擴(kuò)增延伸時(shí)間對(duì)斷點(diǎn)模式 的影響。(a)部分說的是OCI-LyS細(xì)胞系內(nèi)的SY-BCL6斷點(diǎn)；(b)部分說明的是OCI-LyS細(xì) 胞系內(nèi)的SY-BCL6斷點(diǎn)。圖6說明的是具有不同Jh-CCNDI斷點(diǎn)的5種原代外套細(xì)胞淋巴瘤的tCGH分析結(jié)^ ο圖7提供了典型易位CGH(tCGH)試驗(yàn)的概貌。圖8提供了典型IgH易位的概貌，其中包括了各種B細(xì)胞淋巴瘤和漿細(xì)胞骨髓瘤 內(nèi)的伴侶基因座，可作為模型系統(tǒng)用于建立和驗(yàn)證tCGH系統(tǒng)。圖9說明的是利用tCGH檢測(cè)der (14)染色體上帶IgH斷點(diǎn)的VDJ相關(guān)易位以及 多個(gè)Dh片段內(nèi)的交互斷點(diǎn)的示意圖。圖10說明的是交互Jh_BCL2 (a)和BCL2_DH (b)融合的tCGH分析結(jié)果，該融合可定 位到BCL2微小易位簇上；在OCI-LyS淋巴瘤細(xì)胞系內(nèi)可檢測(cè)到兩種交互Sy3_BCL6融合(c 和d)；反向的非-IgH BCL6外顯子1重排(e)；在伯基特淋巴瘤細(xì)胞系MC116內(nèi)可檢測(cè)到 IgH-MYC融合(f)；以及其他幾種MYC重排(g_i)，其中包括反向的非IgH MYC重排⑴。圖11說明的是利用多種不同線性擴(kuò)增方案(a-e)進(jìn)行tCGH分析所檢測(cè)到的BCL2 大內(nèi)含子(190kb)內(nèi)的一個(gè)新型167kb中間缺失中拷貝數(shù)的變化。圖12說明的是通過tCGH分析從5個(gè)含有非-MTC斷點(diǎn)的原發(fā)MCL病例(a_e)中 鑒定出的原發(fā)淋巴瘤內(nèi)的新型cram斷點(diǎn)。圖13說明的是通過tCGH分析在M02058(a_c)和Granta(d-f)細(xì)胞系內(nèi)都鑒定出 了涵蓋CCNDl基因并精確延伸到各自的JH-CCNDl斷點(diǎn)連接處的重復(fù)。圖14說明的是通過CGH分析在OCI-LyS淋巴瘤細(xì)胞系內(nèi)鑒定出了位于IgH_BCL2 斷點(diǎn)處的約6kb的缺失。
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圖15說明的是利用以SYR(a)和SPF(b)為引物的線性擴(kuò)增通過tCGH分析鑒定 出的插入到約IOOkb IgH恒定區(qū)片段的CCNDl基因座內(nèi)的新型隱匿插入片段，該片段從Sα工 延伸到Sy4，其中包含3’ α 增強(qiáng)子。圖中還顯示，當(dāng)以空白擴(kuò)增的腫瘤DNA作為雜交對(duì)照 (c)以及在分析正?；蚪MDNA(d)時(shí)，脫靶擴(kuò)增不含預(yù)測(cè)的易位斷點(diǎn)的序列。圖16說明的是當(dāng)以空白擴(kuò)增的腫瘤DNA作為雜交對(duì)照時(shí)在M02058 (a)和 Granta(b)細(xì)胞內(nèi)脫靶擴(kuò)增不含預(yù)測(cè)的易位斷點(diǎn)的序列。在分析正?；蚪MDNA時(shí)也得到 了同樣的結(jié)果(c-f)。圖17說明的是通過混合等量的DHL16、RL7和Granta 519基因組DNA(被稱為 “33%稀釋”)來確定tCGH分析的敏感性；通過與正?；蚪MDNA混合得到20%和15%稀 釋的樣品。然后利用Jh引物擴(kuò)增樣品12或20個(gè)循環(huán)，并與同樣擴(kuò)增的正?；蚪MDNA共 雜交。圖18說明的是利用髓系引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列多重線性擴(kuò)增三 種慢性髓性白血病細(xì)胞系并通過tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是出現(xiàn)BCR-ABL平衡易位 t(22 ；9)。圖19說明的是利用髓系引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列多重線性擴(kuò)增兩種 急性前髓細(xì)胞白血病(APL)細(xì)胞系(上圖)和兩種急性粒單核細(xì)胞性白血病/嗜酸性粒細(xì) 胞增多癥細(xì)胞系(下圖)并通過tCGH分析得到的結(jié)果，前者的特征是出現(xiàn)PML-RARA平衡 易位t (15 ；21)，后者的特征是出現(xiàn)染色體反轉(zhuǎn)inv(16)導(dǎo)致的MYHlI-CBFB融合。圖20說明的是利用P1/P7引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列多重線性擴(kuò)增MLL 白血病細(xì)胞系并通過tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是出現(xiàn)AF9-MLL平衡易位t (9 ； 11)(上 圖)，以及利用821引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列多重線性擴(kuò)增Kasumi急性髓性白 血病細(xì)胞系并通過tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是出現(xiàn)ET0-AML1平衡易位t (8 ；21)(下 圖)。發(fā)明詳述以陣列為基礎(chǔ)的比較基因組雜交(CGH)為染色體不平衡的研究帶來了革命性的 變化，但是通常不能用于檢測(cè)平衡基因組重排如交互易位，而交互易位在淋巴瘤、白血病和 其他腫瘤的發(fā)病機(jī)制和診斷中扮演主要角色。例如，精確鑒定免疫球蛋白重鏈(IgH)易位 伴侶是B細(xì)胞淋巴瘤分類以及預(yù)測(cè)漿細(xì)胞腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后所必須的。以IgH易位作為平衡基因組重排的模型，我們開發(fā)出了一種陣列CGH方法，我們稱 之為易位-CGH(tCGH)，該方法可用于快速鑒定IgH易位伴侶，并且能夠以前所未有的分辨 率精確定位易位相關(guān)的斷點(diǎn)。如下文將要詳細(xì)描述的，為了使IgH易位能在CGH陣列上被 檢測(cè)到，在陣列雜交前利用單一的IgH結(jié)合區(qū)(Jh)或轉(zhuǎn)換區(qū)(Sy/Sa/SO引物通過酶催 化的線性擴(kuò)增反應(yīng)修飾待測(cè)樣品和參照樣品來源的基因組DNA，這樣就可以特異性地?cái)U(kuò)增 出可能被插入(通過易位或其他重排)到IgH引物下游的任何融合伴侶序列。利用單個(gè)瓦 片_密度寡核苷酸陣列，這種常見的IgH伴侶基因座的例子包括MYC、BCL2和CCNDl (細(xì)胞 周期蛋白Dl)，tCGH成功地鑒定并以約IOObp的分辨率定位了各種細(xì)胞系和原發(fā)淋巴瘤內(nèi) 各種已知的IgH融合斷點(diǎn)，其中包括M02058和Granta 519細(xì)胞系(外套細(xì)胞淋巴瘤)內(nèi) 的Jh-CCNDI斷點(diǎn)，U266 (骨髓瘤)內(nèi)細(xì)胞遺傳學(xué)意義上的隱匿S α -CCNDl融合，MC 116和 Raji (伯基特淋巴瘤)內(nèi)的Jh-MYC和S μ -MYC斷點(diǎn)，以及DHL16 (大細(xì)胞淋巴瘤；微小簇區(qū))
14和濾泡淋巴瘤存檔病例(主要斷點(diǎn)區(qū))內(nèi)的JH_BCL2斷點(diǎn)。然后我們利用tCGH分析了四個(gè)外套細(xì)胞淋巴瘤的存檔病例和一個(gè)B細(xì)胞早幼淋 巴細(xì)胞性白血病t(ll ； 14)陽(yáng)性病例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有病例在CCNDl主要易位簇(MTC)處都缺 乏可通過PCR檢測(cè)的易位斷點(diǎn)。共鑒定并以約IOObp的分辨率定位了 5種新型CCNDl易位 斷點(diǎn)，這樣就可以快速地設(shè)計(jì)出用于擴(kuò)增、測(cè)序和確認(rèn)預(yù)測(cè)斷點(diǎn)的患者特異性的PCR引物。 一個(gè)斷點(diǎn)被定位到MTC的500bp內(nèi)，而其他4個(gè)斷點(diǎn)散在分布于MTC兩次約150kb的區(qū)域 內(nèi)。據(jù)我們了解，這是目前所報(bào)道的最大系列的非MTC外套細(xì)胞淋巴瘤斷點(diǎn)序列。這些結(jié) 果還闡明了 tCGH是如何將散在分布于極大基因組區(qū)域內(nèi)的以前未被鑒定的IgH易位斷點(diǎn) 快速克隆出來的。由于tCGH只需要基因組DNA并且能在同一個(gè)陣列上以超高分辨率同時(shí) 檢測(cè)平衡IgH易位和基因組不平衡，因此它可以作為一種有用的分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法(例 如，F(xiàn)ISH)的替代方法用于臨床檢測(cè)B細(xì)胞和漿細(xì)胞腫瘤。tCGH還有利于開發(fā)出高敏感性 斷點(diǎn)特異性PCR試驗(yàn)用于檢測(cè)微小殘存疾病。最后，由于線性擴(kuò)增反應(yīng)所用的引物是可以 完全定制的，因此tCGH可以很容易地用于鑒定和定位非IgH基因座內(nèi)的其他平衡易位(或 者更復(fù)雜的基因組融合)，如果一個(gè)融合伴侶是已知的話。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)染色體重排的方法，該方法包括 以下步驟(a)擴(kuò)增靶基因座；(b)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸陣列雜交；以及(c)與參照比較 所述雜交模式，其中所述擴(kuò)增是線性擴(kuò)增，以及其中與參照相比擴(kuò)增的基因座的雜交出現(xiàn) 不同則說明存在基因組重排。在某些實(shí)施方式中，基因組重排是指平衡重排，例如平衡易位 或倒置。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)平衡染色體易位的方法。在某些實(shí)施 方式中，本發(fā)明的方法包括以下步驟(a)擴(kuò)增靶基因座；(b)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸陣列 雜交；以及(c)與參照比較所述雜交模式，其中所述擴(kuò)增是線性擴(kuò)增，以及其中存在直角三 角形雜交模式則說明存在平衡染色體重排。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，所述的直角三角 形雜交模式包括不對(duì)稱雜交模式。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè)和/或定位 參與染色體易位的兩個(gè)伴侶基因座內(nèi)的斷點(diǎn)。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括檢測(cè) 平衡易位之外的染色體重排。在上述方法的某些實(shí)施方式中，多重線性擴(kuò)增用于擴(kuò)增一個(gè)以上的擴(kuò)增子。在特 殊實(shí)施方式中，所述的方法包括同時(shí)檢測(cè)一個(gè)以上的基因座。在特殊實(shí)施方式中，一群擴(kuò)增引物用于本發(fā)明的方法。所述擴(kuò)增弓I物群可包含疾 病相關(guān)的平衡易位所涉及的基因座的擴(kuò)增所需的引物。任何與平衡染色體易位相關(guān)的疾病 都可以通過本發(fā)明的方法檢測(cè)。在本發(fā)明的一個(gè)特殊實(shí)施方式中，疾病是腫瘤，例如淋巴瘤 或白血病。在本發(fā)明特殊實(shí)施方式中，選自MPM混合物、821混合物、P1/P7混合物和一群Dh 引物的一群引物可用于本文所提供的方法。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，用于檢測(cè)線性擴(kuò)增產(chǎn)物的陣列包括微陣列或高密度 瓦片陣列。在某些實(shí)施方式中，所述的陣列可包含一群基因座的探針。在某些實(shí)施方式中， 本發(fā)明陣列上的探針相應(yīng)的至少一個(gè)基因座可能與疾病相關(guān)。在特殊實(shí)施方式中，疾病可 以是腫瘤，例如淋巴瘤或白血病。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，所述的陣列包括AML實(shí)驗(yàn)性陣 列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法還可包括選自重復(fù)、擴(kuò)增、缺失、倒置、平衡易位和不平衡易位的第二染色體重排的檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，第一重排和第二重排的檢 測(cè)可先后進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括同時(shí)檢測(cè)平衡重排 和不平衡重排。所述的平衡和不平衡重排可存在于同一個(gè)基因座內(nèi)，或者處于不同的基因 座內(nèi)。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)平衡染色體易位的新型試劑盒。在某 些實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒包含用于線性擴(kuò)增涉及易位的基因座的引物。在其他實(shí)施 方式中，本發(fā)明的試劑盒包含用于檢測(cè)從涉及易位的基因座的線性擴(kuò)增產(chǎn)物的陣列。在本 發(fā)明的某些實(shí)施方式中，試劑盒包含涉及易位的基因組擴(kuò)增所需的一群引物。在其他實(shí)施 方式中，本發(fā)明的試劑盒可用于與染色體易位相關(guān)的疾病的診斷或預(yù)后。在一個(gè)特殊實(shí)施 方式中，疾病可以是腫瘤，例如淋巴瘤或白血病。1.定義術(shù)語(yǔ)“染色體重排”或“染色體異?！蓖ǔＪ侵溉旧w材料的片段以野生型或正常 細(xì)胞未見的方式發(fā)生的異常連接。染色體重排的例子包括缺失、擴(kuò)增、倒置或易位。染色體 重排可能發(fā)生在染色體發(fā)生同時(shí)斷裂之后。如果斷裂導(dǎo)致染色體片段的丟失則會(huì)發(fā)生缺 失。當(dāng)斷裂下來的染色體片段反向插入(倒置插入)或重新插入到其原來的位置時(shí)會(huì)導(dǎo)致 倒置。當(dāng)一個(gè)染色體的一個(gè)片段與另一個(gè)染色體的一個(gè)片段發(fā)生交換時(shí)就產(chǎn)生了易位。擴(kuò) 增可導(dǎo)致染色體的特定區(qū)域出現(xiàn)多個(gè)拷貝。染色體重排還包括上述重排的組合。術(shù)語(yǔ)“易位”或“染色體易位”通常是指相同或不同染色體之間等量或不等量染色 體材料的交換。一般情況下，交換發(fā)生在非同源染色體之間?！捌胶狻币孜煌ǔＪ侵高z傳材料為發(fā)生凈丟失或凈增加的染色體材料的交換?！安黄胶狻币孜煌ǔＪ侵笇?dǎo)致染色體材料增加或丟失的染色體材料的不等量交換?！昂怂彡嚵小被颉昂怂嵛㈥嚵小笔侵敢蝗汉怂嵩渲忻恳粋€(gè)元件包含一個(gè)或多個(gè) 固定到固相表面上的靶核酸分子，核酸探針可與這些靶核酸分子雜交?？晒潭ǖ竭@種固相 支持物上的核酸分子包括而不限于寡核苷酸、cDNA和基因組DNA。在本發(fā)明的上下中，使用 的是包含基因組核酸不同片段相應(yīng)的序列的微陣列。微陣列的基因組元件代表了有機(jī)體的 整個(gè)基因組，或者代表了基因組的特定區(qū)，例如，特定染色體或其連續(xù)片段?；蚪M瓦片微陣列包含重疊的寡核苷酸，這些寡核苷酸可完整或幾乎完整代表目 的整個(gè)目的基因組區(qū)。比較基因組雜交(CGH)通常是指用于分析給定對(duì)象DNA的DNA內(nèi)容物內(nèi)拷貝數(shù) 變化(增加/丟失)的分子_細(xì)胞遺傳學(xué)方法，通常是指腫瘤細(xì)胞內(nèi)的DNA內(nèi)容物。對(duì)于 腫瘤來說，該方法的基礎(chǔ)在于標(biāo)記的腫瘤DNA (通常用熒光標(biāo)記物)和正常DNA (通常用第 二種不同的熒光標(biāo)記物)與正常人中期制備物的雜交。通過表面熒光顯微鏡和定量圖像 分析可以檢測(cè)增加/丟失對(duì)對(duì)照DNA的熒光比例的區(qū)域差異，用于鑒定基因組內(nèi)的異常 區(qū)。CGH通常只能用于檢測(cè)不平衡的染色體變化。無法檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常如平衡交互易 位或倒置，因?yàn)樗鼈兾磳?dǎo)致拷貝數(shù)發(fā)生變化。參見，例如，Kallioniemi等，Science 258 818-821(1992)。在一個(gè)被稱為“染色體微陣列分析(CMA) ”或“陣列CGH”的CGH變體中，來源于對(duì) 象組織和正常對(duì)照組織(參照)的DNA用不同的標(biāo)記物標(biāo)記(例如，用不同的熒光標(biāo)記物)。 對(duì)象的DNA和參照DNA與未標(biāo)記的用于抑制重復(fù)DNA序列的人cot 1 DNA混合以后，混合物與包含一群特定DNA探針的玻片雜交，這些特定DNA探針通常來源于正常參照細(xì)胞。參見， 例如，美國(guó)專利號(hào)5，830，645 ；6, 562，565，當(dāng)用寡核苷酸作為微陣列上的元件時(shí)，通常可以 獲得20-80堿基對(duì)的分辨率，而使用BAC陣列只能得到IOOkb的分辨率。隨陣列的元件形 成的(熒光素)顏色比例用于評(píng)價(jià)對(duì)象樣品內(nèi)DNA增加或丟失的區(qū)。術(shù)語(yǔ)“雜交的直角三角形模式”或“直角三角形雜交模式”通常是指雜交信號(hào)(或 雜交信號(hào)比例或其對(duì)數(shù))對(duì)染色體位置的圖形上的不對(duì)稱模式，其中包括任何不對(duì)稱的雜 交信號(hào)模式，其特征是(i)單一不連續(xù)邊界，代表重排斷點(diǎn)，以及(ii)雜交信號(hào)(或其比例 或?qū)?shù)比例)在著絲?；蚨肆７较蛳蚧€逐漸回歸，形成不連續(xù)的第二邊界。“擴(kuò)增”或“擴(kuò)增反應(yīng)”是指任何化學(xué)反應(yīng)，其中包括酶催化反應(yīng)，該反應(yīng)可導(dǎo) 致模板核酸序列的拷貝數(shù)增加。擴(kuò)增反應(yīng)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和連接酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)(LCR)(參見美國(guó)專利4，683，195和4，683，202 ； ((PCR方法方法和應(yīng)用指南》(PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications) (Innis 等編輯，1990))，鏈置換擴(kuò)增 技術(shù)(SDA) (Walker 等，Nucleic Acids Res. 20(7) 1691(1992)；《沃克 PCR 方法》(Walker PCR Methods)增干丨J 3(1) 1 (1993))，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(Phyffer 等，J. Clin. Microbiol. 34 834(1996) ； Vuorinen 等，J. Clin. Microbiol. 33 1856 (1995)),以核酸序列為基礎(chǔ)的 擴(kuò)增(NASBA) (Compton, Nature 350(6313) 91(1991),滾環(huán)擴(kuò)增(RCA) (Lisby，MoI. Biotechnol. 12(1) 75(1999)) ；Hatch 等，Genet. Anal. 15(2) 35(1999))以及分支 DNA 信 號(hào)擴(kuò)增(bDNA)(參見，例如，Iqbal 等，Mol Cell Probes 13(4) :315(1999))。線性擴(kuò)增是指不會(huì)導(dǎo)致DNA呈指數(shù)擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)。DNA線性擴(kuò)增的例子包 括只使用單個(gè)引物時(shí)通過PCR方法進(jìn)行的DNA擴(kuò)增，如本文所述。也可參見Liu，C.L.， S. L. Schreiber 等，BMC Genomics, 4 :Art. No. 19,2003 年 5 月 9 日。其他例子包括恒溫?cái)U(kuò)增 反應(yīng)如鏈置換擴(kuò)增(SDA) (Walker 等，NucleicAcids Res. 20(7) =1691(1992)；《沃克 PCR 方 法》(Walker PCR Methods)Appl 3(1) 1(1993)等。擴(kuò)增反應(yīng)所用的試劑包括，例如，寡核苷酸引物；硼酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、巴比妥、 Tris等緩沖液(參見美國(guó)專利號(hào)5，508，178)；鹽如氯化鉀或氯化鈉；鎂離子；三磷酸脫氧 核苷(dNTP)；核酸聚合酶如Taq DNA聚合酶；以及DMSO ；和穩(wěn)定劑如明膠，牛血清白蛋白和 非離子去污劑(例如，吐溫-20)?！疤结槨蓖ǔＪ侵概c特異性目的核酸序列互補(bǔ)的核酸。術(shù)語(yǔ)“引物”是指可在擴(kuò)增反應(yīng)內(nèi)啟動(dòng)聚核苷酸合成的核酸序列。一般來說，引物 包含的核苷酸數(shù)目在約100個(gè)以內(nèi)，優(yōu)選少于約30個(gè)核苷酸。典型的引物長(zhǎng)度約為5到25 個(gè)核苷酸?！鞍小被颉鞍行蛄小笔侵笖U(kuò)增反應(yīng)中要被擴(kuò)增的單鏈或雙鏈聚核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“核酸”或“聚核苷酸”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸 及其聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括包含已知核苷酸類似物或經(jīng)過修飾的骨架殘基或連接子的核酸， 這些核酸可以是合成的、天然的或非天然的，具有與參照核酸相同的結(jié)合特性，可以參照核 酸同樣的方式固定。這種類似物的例子包括而不限于磷硫酰、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手 性甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。如果兩個(gè)序列內(nèi)的核苷酸或氨基酸殘基的序列在按照下文所述的方法以最大的 對(duì)應(yīng)性進(jìn)行排列時(shí)是相同的，那么可以說兩個(gè)核酸序列或多肽是“一致的”。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”在本文中是指第一序列的全部與參照聚核苷酸序列的至少一部分是互補(bǔ)的。術(shù)語(yǔ)“選擇性的(或特異性的)雜交”是指在嚴(yán)格雜交條件下一個(gè)分子只與特定 核苷酸序列結(jié)合、形成雙螺旋或雜交，當(dāng)復(fù)合混合物中存在該序列時(shí)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格雜交條件”是指在該條件下探針與其靶亞序列，通常在核酸復(fù)合混合 物中，雜交，但是不與其他序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的，在不同的環(huán)境下 是不同的。較長(zhǎng)的序列在較高的溫度下特異性雜交。核酸雜交的詳細(xì)指南見于Tijssen， 《生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)-與核酸探針雜交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Probes)，“雜交原理概述和核酸試驗(yàn)策 略，，(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays) (1993) 0 一般來說，嚴(yán)格條件選擇比特定離子強(qiáng)度pH下特定序列的解鏈溫度(Tm) 低約5-10°C。Tm是指50%的靶序列互補(bǔ)探針與靶序列雜交達(dá)到平衡(如果靶序列過量存 在，在Tm下，50%的探針在平衡狀態(tài)下被占據(jù))時(shí)的溫度(在特定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度 下)。嚴(yán)格條件包括鹽濃度低于約1. OM鈉離子，一般為約0. 01-1. OM鈉離子濃度(或其他 鹽)，pH為7. 0-8. 3，對(duì)于短探針(例如10-50核苷酸)來說溫度至少約30°C，對(duì)于長(zhǎng)探針 (例如，超過50個(gè)核苷酸)來說至少約60°C。嚴(yán)格條件還可以通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺 來達(dá)到。對(duì)于高嚴(yán)格雜交來說，陽(yáng)性信號(hào)至少是背景的兩倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地認(rèn)識(shí)到其他雜交和洗滌條件也可用于提供相同嚴(yán)格程度的 條件。對(duì)于PCR來說，低嚴(yán)格擴(kuò)增通常使用約36°C的溫度，但是根據(jù)引物的長(zhǎng)度退火溫 度可在約32°C到48°C之間。對(duì)于高嚴(yán)格PCR擴(kuò)增來說，通常使用的溫度為約62°C，但是根 據(jù)引物的長(zhǎng)度和特異性，退火溫度的范圍可以為約50°C到約65°C。高嚴(yán)格和低嚴(yán)格擴(kuò)增的 典型循環(huán)條件包括變性相90°C -95°C持續(xù)30秒-2分鐘，退火相持續(xù)30秒-2分鐘，延伸相 約72°C持續(xù)1-2分鐘。2.易位 CGH(tCGH)概述本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)和定位染色體一床，特別是染色體易位。在一個(gè)實(shí)施方 式中，本發(fā)明的方法利用了得自待測(cè)樣品如患者樣品的第一群基因組核酸和得自參照樣品 的第二群基因組核酸。參照樣品可以是得自個(gè)體或任何細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物的如本文 所提供的任何細(xì)胞、組織或液體，其中不包含任何遺傳異常，即，包含全部染色體的正常遺 傳互補(bǔ)。本發(fā)明利用特定基因座的特異性引物線性擴(kuò)增基因座所包含的并且延伸到易位伴 侶序列內(nèi)的序列，以產(chǎn)生包含易位對(duì)兩個(gè)成員的探針分子。同時(shí)，還通過以待測(cè)樣品所述的 方式從參照細(xì)胞中線性擴(kuò)增基因組DNA來制備參照探針。待測(cè)探針和參照探針用不同的標(biāo) 記物標(biāo)記，例如用Cy3和Cy5，但是本領(lǐng)域熟知的許多熒光標(biāo)記對(duì)都適用。不同標(biāo)記的探針 與包含基因組DNA的微陣列雜交。一般來說，微陣列的基因組DNA序列來源于參照源，如特 定有機(jī)體的數(shù)據(jù)庫(kù)序列，例如，人、小鼠或大鼠基因組的完整數(shù)據(jù)庫(kù)。待測(cè)樣品探針的雜交 模式和強(qiáng)度與來源于參照樣品的相同探針的雜交相比較就可以鑒定出已知基因座的易位 伴侶。利用高密度微陣列，如瓦片密度微陣列，可以高分辨率定位易位的斷點(diǎn)。相應(yīng)的，如果目的基因座中存在易位，那么待測(cè)探針與包含參照細(xì)胞基因組DNA 序列的微陣列雜交就會(huì)產(chǎn)生與已知基因座相應(yīng)的元件相關(guān)的信號(hào)以及與另一個(gè)基因座相 關(guān)的微陣列元件相關(guān)的信號(hào)。與其他基因座相關(guān)的信號(hào)出現(xiàn)說明該基因座是已知基因座的易位伴侶。相反，微陣列與參照探針雜交所產(chǎn)生的信號(hào)無一例外地都與已知基因座相應(yīng)的 微陣列元件相關(guān)，不會(huì)像待測(cè)探針那樣出現(xiàn)與另一基因座相關(guān)的雜交信號(hào)。如果使用高密度瓦片微陣列，可以通過確定在一系列代表基因組DNA連續(xù)片段的 微陣列元件上雜交開始和終止的位置來確定易位的斷點(diǎn)。因此，如果待測(cè)探針與對(duì)應(yīng)于已 知基因座的一系列元件的雜交終止在一個(gè)特殊的點(diǎn)，而參照探針與該系列元件的雜交卻可 以延該系列繼續(xù)下去，則可以將雜交終止的點(diǎn)鑒定為已知基因座的易位斷點(diǎn)。同樣，待測(cè)探 針在對(duì)應(yīng)于該基因座的一系列元件上開始雜交的點(diǎn)與已知基因座不同，并且參照探針的雜 交沒有出現(xiàn)這樣的點(diǎn)，則說明雜交發(fā)生處的第一元件是已知基因座的易位伴侶的斷點(diǎn)。具體地說，本發(fā)明方法的兩個(gè)通用實(shí)施方式將在下文描述。每一個(gè)實(shí)施方式包括 四個(gè)線性擴(kuò)增(LA)反應(yīng)的表現(xiàn)(1)“Τ+”:利用LA引物(目的基因座內(nèi)已知序列的引物)擴(kuò)增待測(cè)(例如，腫瘤) DNA ；(2) “N+” 利用LA引物擴(kuò)增正常DNA ；(3) “Τ-”空白擴(kuò)增待測(cè)(例如，腫瘤)DNA(S卩，沒有引物存在)；(4) “N-”空白擴(kuò)增正常DNA (S卩，沒有引物存在)。在每一個(gè)實(shí)施方式中(下文所述的標(biāo)記的A型和B性試驗(yàn))，相同的4個(gè)反應(yīng)以不 同的配對(duì)組合方式(標(biāo)記后)與兩個(gè)獨(dú)立的2-色陣列共雜交。如下文所述，通過比較兩個(gè) (2-色)陣列可以得到染色體重排信息，但是不同類型的試驗(yàn)所獲得的信息是不同的A型 和B型都顯示了易位斷點(diǎn)，但是A型試驗(yàn)還顯示了基因組不平衡。A型試驗(yàn)步驟1 :T+和N+樣品與一個(gè)陣列共雜交(“Τ+/Ν+陣列”)。這個(gè)陣列用于檢測(cè)易 位斷點(diǎn)和基因組不平衡。步驟2 =T-和N-樣品與第二個(gè)陣列共雜交(“Τ-/Ν-陣列”)。這個(gè)陣列用于檢測(cè) 基因組不平衡，但是不能檢測(cè)易位斷點(diǎn)。步驟3 按如下方式分析和比較Τ+/Ν+和Τ-/Ν-陣列的結(jié)果a)T+/N+陣列上出現(xiàn)易位斷點(diǎn)，但是T-/N-陣列上未出現(xiàn)。一般來說，易位斷點(diǎn)看 起來像直角三角形，直邊表示斷點(diǎn)的位置，水平邊遠(yuǎn)離斷點(diǎn)。b)T+/N+和T-/N-陣列上都出現(xiàn)基因組不平衡。一般來說，不平衡看起來像三角， 其中直邊代表重復(fù)或缺失的基因組區(qū)的兩個(gè)末端。B型試驗(yàn)步驟1 :T+和T-樣品與一個(gè)陣列共雜交(“Τ+/Τ-陣列”)。Τ+/Τ-陣列用于檢測(cè) 真正的易位斷點(diǎn)和“偽斷點(diǎn)”(pseudo-breakpoint)，但是不能檢測(cè)基因組不平衡。偽斷點(diǎn) 的產(chǎn)生是因?yàn)樵谡麄€(gè)基因組的多個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生的“非特異性”啟動(dòng)，可能是由它們與引物序 列的同源性造成的。偽斷點(diǎn)也呈直角三角形形狀。步驟2 :N+和N-樣品與第二陣列共雜交(“N+/N-陣列”)。N+/N-陣列只能檢測(cè) “偽斷點(diǎn)”，但是不能檢測(cè)真正的易位斷點(diǎn)和基因組不平衡，因?yàn)镹+和N-樣品都是用正?；?因組開始的。步驟3 按如下方式分析和比較T+/T-和N+/N-陣列的結(jié)果a)T+/T-陣列上出現(xiàn) 易位斷點(diǎn)，而N+/N-陣列上未出現(xiàn)，b)T+/T-和N+/N-陣列上都出現(xiàn)偽斷點(diǎn)，但是是可以忽略的。3.生物樣品在一個(gè)方面，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)待測(cè)樣品內(nèi)的染色體異常。一般而言，待測(cè) 樣品來源于患者。待測(cè)樣品包括來源于患者的細(xì)胞、組織或液體，該患者被懷疑可能患有與 染色體或遺傳異常相關(guān)的病狀或狀態(tài)。為了診斷或預(yù)測(cè)預(yù)后，病狀或狀態(tài)通常與遺傳缺陷 有關(guān)，例如，基因組堿基的取代、擴(kuò)增、缺失和/或易位。待測(cè)樣品可以是疑似包含癌細(xì)胞或 這種細(xì)胞的細(xì)胞核的樣品。樣品包括而不限于羊水、活檢組織、血液、血細(xì)胞、骨髓、腦脊髓 液、糞便樣品、細(xì)針活檢組織樣品、腹膜液、血漿、胸水、唾液、精液、血清、唾液、眼淚、組織或 組織勻漿物、組織培養(yǎng)基、尿液等。樣品可以是經(jīng)過處理的，例如組織切片、分離、純化或細(xì) 胞器分離。分離細(xì)胞、組織或液體樣品的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，其中包括而不限 于抽吸、組織切片、血液或其他體液采集、手術(shù)或針刺活檢等。來源于患者的樣品包括用于 組織學(xué)檢測(cè)的冷凍切片或石蠟切片。樣品可來源于上清(細(xì)胞培養(yǎng)物的)、細(xì)胞裂解物、組 織培養(yǎng)物的細(xì)胞，比較理想的是檢測(cè)其中的鑲嵌性水平，其中包括染色體異常和拷貝數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方式中，疑似包含癌細(xì)胞的樣品來自于人類患者?？衫檬熘募夹g(shù) 從患者獲取樣品，例如，靜脈穿刺、腰椎穿刺、體液樣品如唾液或尿液、組織或針刺活檢等。 在疑似患有包含癌細(xì)胞的腫瘤的患者中，樣品可包括腫瘤活檢組織或手術(shù)標(biāo)本，其中包括， 例如，腫瘤活檢組織、細(xì)針抽吸樣品或切除腫瘤的切片。灌洗標(biāo)本可通過鹽水灌洗從任何目 的區(qū)域獲取，例如，宮頸、支氣管、膀胱等。患者的樣品還可包括呼出的氣體樣品，如利用體 內(nèi)酒精測(cè)量器收集或來自于咳嗽或噴嚏。生物樣品也可來自于儲(chǔ)存組織和/或血液的細(xì)胞 或血液庫(kù)，或者來源于體外，如細(xì)胞培養(yǎng)物。建立用作樣品的細(xì)胞培養(yǎng)物的方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的。已知參與各種疾病的易位的例子包括而不限于t(2 ；5) (p23 ；q35)_退行性大細(xì) 胞淋巴瘤；t(8 ； 14)-伯基特淋巴瘤(c-myc) ；t(9 ；22) (q34 ；qll)_費(fèi)城染色體，CML, ALL ； t(ll ；14)-外套細(xì)胞淋巴瘤(BcI-I) ；t(ll ；22) (q24 ；qll. 2-12)-尤因氏肉瘤；t(14 ； 18) (q32 ；q21)_濾泡淋巴瘤(Bcl-2) ；t(17 ；22)-隆凸性皮膚纖維肉瘤；t(15 ；17)-急性 早幼粒細(xì)胞性白血?。籺(l ；12) (q21 ；pl3)_急性髓性白血病；t(9 ；12) (p24 ；pl3)_CML， ALL(TEL-JAK2) ；t(X ； 18) (pll. 2 ;qll. 2)-滑膜肉瘤；t(l ；11) (q42. 1 ；ql4. 3)-精神分裂 癥；t(12 ；15) (pl3 ；q25)-(TEL-TrkC)；急性髓性白血病，先天性纖維肉瘤，分泌性乳腺癌。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供了通過檢測(cè)染色體易位的存在并確定易位伴侶的特征來預(yù) 測(cè)、診斷染色體重排特別是染色體易位所引起的疾病的方法或者預(yù)測(cè)該疾病預(yù)后的方法。 例如，如果希望診斷伯基特淋巴瘤，可利用線性擴(kuò)增合適免疫球蛋白調(diào)節(jié)基因座所用的引 物來制備用于和人微陣列雜交的探針。利用本發(fā)明的方法，如果免疫球蛋白基因座的易位 伴侶被鑒定為MYC的基因，那么可以診斷為伯基特淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方 法特別適用于與平衡染色體易位相關(guān)的腫瘤的診斷或預(yù)后預(yù)測(cè)。術(shù)語(yǔ)“腫瘤”是指人類癌癥和癌、白血病、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、實(shí)體和淋巴癌等。不 同類型的腫瘤的例子包括而不限于單核細(xì)胞性白血病、髓性白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血 病、以及急性粒細(xì)胞白血病、慢性粒細(xì)胞白血病、早幼粒細(xì)胞白血病、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、 卵巢癌、甲狀腺癌、肺癌、前列腺癌、子宮癌、睪丸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭部、頸部、宮頸和陰道
20的鱗狀細(xì)胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、軟組織和骨肉瘤、大腸癌、肝癌(即肝癌)、腎癌(即腎細(xì)胞 癌)、胸膜癌、胰腺癌、宮頸癌、肛門癌、膽管癌、胃腸道類癌腫瘤、食管癌、膽囊膀胱癌、小腸 癌、中央神經(jīng)系統(tǒng)癌、皮膚癌、絨毛膜癌、骨肉瘤、纖維肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、B細(xì)胞淋 巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、小細(xì)胞淋巴瘤、大細(xì)胞淋巴瘤等。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)胎兒的染色體或遺傳異常。例如，產(chǎn) 前檢查顯示孕婦的胎兒染色體或遺傳異常的風(fēng)險(xiǎn)升高。危險(xiǎn)因素是本領(lǐng)域熟知的，其中包 括，例如，高齡產(chǎn)婦、產(chǎn)前篩查時(shí)出現(xiàn)的異常產(chǎn)婦血清標(biāo)記物、早產(chǎn)兒生理異常以及未知的 染色體狀況、父母染色體異常和反復(fù)自然流產(chǎn)。本發(fā)明的方法可用于利用任何類型的胚胎或胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷。胎兒細(xì)胞可 來自于孕婦或胚胎樣品。因此，胎兒細(xì)胞存在于羊水中，可通過羊膜穿刺、注射器抽取絨毛 膜絨毛、經(jīng)皮抽取臍血、胎兒皮膚活檢、四細(xì)胞到八細(xì)胞階段胚胎的卵裂球(預(yù)植入)或胚 泡的滋養(yǎng)外胚層樣品(預(yù)植入或通過子宮灌洗)獲取。也可以使用包含足量基因組核酸的 體液。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的tCGH方法包括檢測(cè)和定位參與染色體易位的兩個(gè) 伴侶基因內(nèi)的斷點(diǎn)(參見，例如，圖7中的基因A和B)。在檢測(cè)易位的兩個(gè)伴侶基因時(shí)，基 因A線性擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子，例如，引物靶向的基因，可產(chǎn)生“倒置”的直角三角形模式的雜 交(參見，例如，圖IOe和IOi顯示的BCL6和MYC擴(kuò)增子分別產(chǎn)生的倒置雜交模式)。在第二個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 tCGH分析方法，其中包括多重線性擴(kuò)增以同 時(shí)檢測(cè)一個(gè)以上基因座上的染色體重排，多重?cái)U(kuò)增利用線性擴(kuò)增引物的混合物進(jìn)行。在一 個(gè)實(shí)施例中，7種011引物的混合物(參見，表3)用于覆蓋多個(gè)Dh重排(van Dongen,Langerak 等，Leukemia 17(12) :2257_317 (2003))。在另一實(shí)施方式中，用于線性擴(kuò)增髓性白血病相 關(guān)基因座的5種引物的混合物(MPM，參見，表5)被用于擴(kuò)增三種不同的髓性白血病易位 (I)BCR-ABL融合=CML(慢性髓細(xì)胞性白血病)中的t (9 ；22)，⑵PML-RARA融合=急性早 幼粒細(xì)胞性白血病中的t(15 ；17)，以及(3)帶有inV(16)/t(16 ； 16)的急性髓性白血病。在 另一實(shí)施方式中，821引物混合或P1/P7引物混合(表5)用與多重線性擴(kuò)增，并結(jié)合tCGH 進(jìn)行平衡易位的分析。在第三個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明所提供的方法包括檢測(cè)平衡以外的染色體重排。在 某些實(shí)施方式中，這種染色體重排包括缺失、重復(fù)、擴(kuò)增、倒置或不平衡易位。例如，圖lie 顯示的是通過tCGH分析檢測(cè)到了的內(nèi)含子間質(zhì)BCL2缺失，擴(kuò)增跨過缺失斷點(diǎn)。同樣，圖19 顯示的是通過tCGH分析檢測(cè)到的MYHll和CBFB基因inv(16)(下圖)融合形成的染色體倒置。在第四個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明包含同時(shí)檢測(cè)平衡重排和不平衡染色體異常。在某 些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法可用于同時(shí)檢測(cè)不平衡的斷點(diǎn)是否和平衡重排的斷點(diǎn)相一 致。例如，圖13顯示的是同時(shí)檢測(cè)M02058和Granta 519細(xì)胞系內(nèi)IgH-CCNDl易位斷點(diǎn)上 的平衡易位和染色體重復(fù)。在第五個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過檢測(cè)染色體重排對(duì)個(gè)體的疾病進(jìn)行診斷 或預(yù)后的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了診斷個(gè)體淋巴瘤的方法，該方法包括檢測(cè) 所述個(gè)體來源的樣品內(nèi)是否存在如表2所述的那些新型斷點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，該方法 包括檢測(cè)選自如下的疾病B細(xì)胞淋巴瘤、外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、骨髓瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、B細(xì)胞淋巴瘤和濾泡中心淋巴瘤(FCL)。在某些實(shí)施方式 中，檢測(cè)包括PCR分析、測(cè)序、質(zhì)譜、雜交或tCGH分析。用于表2所列的新型易位的PCR分 析或測(cè)序的合適引物包括而不限于SEQ ID NOS :27、28、30、31、33、34、36、37、39、40、42、43、 45、46、48、49、51、52、54、55、57、58、60、61、63、64 及其功能等價(jià)物。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過檢測(cè)來源于個(gè)體的生物樣品內(nèi)的 IgH-CCNDl易位來診斷或預(yù)后個(gè)體的B細(xì)胞淋巴瘤或外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)的方法，其中 CCNDl 斷點(diǎn)選自如下一組:chrll :69，055，996，chrll :69，100，509，chr21 :69，131，130， chrl 1 :69，056，460，68，989，831，chrll :69，082，854，chrll :69，059，199 以及 chrl8 58，944，421。在第二個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了檢測(cè)來源于個(gè)體的生物樣品內(nèi) 的IgH-CCNDl易位來診斷或預(yù)后個(gè)體的骨髓瘤的方法，其中CCNDl斷點(diǎn)選自chrll 69，153，045或chrll :69，153,019。在第三個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了檢測(cè)來源于個(gè) 體的生物樣品內(nèi)的IgH-BCL2易位來診斷或預(yù)后個(gè)體的DLBCL的方法，其中BCL2斷點(diǎn)選自 chr 18 :58，944，489，chrl8 :58，914，890，chrl8 :58，944，475 和 chrl8 :58，938，252。在第 四個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了檢測(cè)來源于個(gè)體的生物樣品內(nèi)的IgH-BCL6易位來診斷 或預(yù)后個(gè)體的DLBCL的方法，其中BCL2斷點(diǎn)是chr3 :188，945，670或chr3 :188，945，699。 在第五個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了檢測(cè)來源于個(gè)體的生物樣品內(nèi)的IgH-MYC易位 來診斷或預(yù)后個(gè)體的B細(xì)胞淋巴瘤的方法，其中MYC斷點(diǎn)是chr8 :128，818，596，chr8 128，817，581 或 chr8 :128，816，104。4.用于檢測(cè)平衡易位的探針的制備為了檢測(cè)易位，可以使用任何方法，只要該方法能夠線性擴(kuò)增包含潛在易位位點(diǎn) 的DNA?？捎糜趯?shí)現(xiàn)本發(fā)明的線性擴(kuò)增方法的例子包括使用單個(gè)引物的PCR擴(kuò)增。參見 Liu, C. L.，S. L. Schreiber 等，BMC Genomics, 4 :Art. No. 19，2003/5/9。線性擴(kuò)增所用的一組典型條件包括50 μ 1體積的反應(yīng)，其中含有1 μ g基因組DNA， 200mM dNTP和150nM線性擴(kuò)增引物。擴(kuò)增可按如下方法利用克隆技術(shù)有限公司(Clontech) 的PCR酶系統(tǒng)(Advantage 2PCR Enzyme System)完成95°C變性5分鐘，然后進(jìn)行12個(gè)循 環(huán)(95°C /15 秒，60°C /15 秒和 68°C /6 分鐘)。探針可在線性擴(kuò)增期間或擴(kuò)增完成后標(biāo)記。在下文的特殊例子中，標(biāo)記物通過一 個(gè)單獨(dú)的步驟摻入，在用DNA聚合酶通過寡核苷酸(隨機(jī)六聚體)介導(dǎo)的引物延伸反應(yīng)完 成線性擴(kuò)增后進(jìn)行。通過這種方法，原始的基因組DNA樣品和線性擴(kuò)增產(chǎn)物都能形成產(chǎn)生 信號(hào)的標(biāo)記探針。雜交以后，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)所產(chǎn)生的信息判斷，如果所檢測(cè)到的基因組 DNA信號(hào)與正常aCGH所檢測(cè)到的信號(hào)不同則說明有染色體異常，但是根據(jù)產(chǎn)生自線性擴(kuò)增 產(chǎn)物的不同信號(hào)也能揭示染色體重排。如果只需要將標(biāo)記物簡(jiǎn)單地?fù)饺氲骄€性擴(kuò)增產(chǎn)物 中，那么在線性擴(kuò)增步驟中加入標(biāo)記的dNTP就可以實(shí)現(xiàn)，這時(shí)就只能顯示易位，而無法顯 示染色體異常如擴(kuò)增和缺失?？捎玫臉?biāo)記物包括，例如，熒光素染料(例如，Cy5，Cy3，F(xiàn)ITC， 羅丹明，熒光體(lanthamide phosphor)，德克薩斯紅)，32P, 35S, 3H, 14C, 125I，131I，電子致密試 劑(例如，金)、酶如ELISA常用的酶(例如，辣根過氧化物酶，β半乳糖苷酶，熒光素酶，堿 性磷酸酶)，生色標(biāo)記物(例如，膠體金)，磁性標(biāo)記物(例如，免疫磁珠)，生物素，地高辛或 已有其抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質(zhì)。標(biāo)記物可直接摻入到待測(cè)核酸內(nèi)，或者連 接到能與待測(cè)核酸雜交或結(jié)合的探針(例如，寡核苷酸)或抗體上?？蓹z測(cè)標(biāo)記物可摻入
22到、連接到或結(jié)合到核酸上。核酸與可檢測(cè)標(biāo)記物之間的連接可以是共價(jià)的，也可以是非共 價(jià)的。標(biāo)記物可通過各種長(zhǎng)度間隔臂連接以降低可能的空間位阻或者對(duì)其他有用的或理想 的特性的影響。5.微陣列任何已知的微陣列和/或制備和使用微陣列的方法都可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例 如，美國(guó)專利號(hào) 6，277，628 ；6，277，489 ；6，261，776 ；6，258，606 ；6，054，270 ；6，048，695 ； 6，045，996 ；6，022，963 ；6，013，440 ；5，965，452 ；5，959，098 ；5，856，174 ；5，830，645 ； 5，770，456 ；5，632，957 ；5，556，752 ；5，143，854 ；5，807，522 ；5，800，992 ；5，744，305 ； 5，700，637 ；5，556，752 ；5，434，049 所描述的那些；也可參見，例如，WO 99/51773 ； WO 99/09217 ；WO 97/46313 ；WO 96/17958 ；也可參見，例如，Johnston, Curr. Biol. 8 R171-R174,1998 ；Schummer, Biotechniques 23 1087-1092, 1997 ；Kern, Biotechniques 23 :120-124，1997 ；Solinas-Toldo, Genes, Chromosomes& Cancer 20 :399_407，1997 ； Bowtel 1, Nature Genetics Supp. 21 :25_32，1999。也可參見公開的美國(guó)專利申請(qǐng)系列 號(hào) 20010018642 ；20010019827 ；20010016322 ；20010014449 ；20010014448 ；20010012537 ； 20010008765。本發(fā)明的tCGH方法可用各種商品化的CGH陣列以及可商業(yè)定制的陣列執(zhí)行。商 品化的高密度陣列和試劑盒包括Agilent Technologies的用于人、小鼠和大鼠基因組分 析的那些陣列(例如，G4411B和G4412A)，Nimblegen(Roche)生產(chǎn)的定制瓦片陣列以及 Affymetrix生產(chǎn)的全基因組瓦片陣列。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)與白血病有關(guān)的平衡易位的新型 高密度陣列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的高密度陣列可用于白血病如髓性白血病或淋巴 瘤的診斷、預(yù)后或者分型。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)表1、表2和/或 表4所列的基因座的陣列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的陣列可用于檢測(cè)表2所列的新型 斷點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的陣列可用于檢測(cè)易位的兩個(gè)伴侶基因，用于tCGH分析。 在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了表4所述的AML高密度陣列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了可用于檢測(cè)與疾病如癌癥相關(guān)的平衡易位的引 物混合物。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，癌癥是白血病和髓性白血病。在某些實(shí)施方式中，本發(fā) 明所提供的引物混合物可用于基因座的線性擴(kuò)增，對(duì)于患病的個(gè)體來說，該基因座通常參 與平衡易位。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的引物混合可用于多重線性擴(kuò)增和多重tCGH分 析。在本發(fā)明的特殊實(shí)施方式中，引物混合物選自髓性引物混合物(MPM)、821混合物和Pl/ P7混合物。以陣列為基礎(chǔ)的CGH的分辨率主要取決于陣列內(nèi)核酸元件的數(shù)量、大小和位置， 這些元件可涵蓋整個(gè)基因組。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，寡核苷酸元件用于 以瓦片密度形成微陣列。參見，例如，Mockler，T. C.和J. R. Ecker，Genomics 85 1(2005)； Bertone, P. , Μ. Gerstein 等，Chromosome Research, 13 259 (2005)。6.微陣列的雜交以前所描述的用于比較基因組雜交的很多方法都可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，例如美 國(guó)專利號(hào) 6，197，501 ；6，159，685 ；5，976，790 ；5，965，362 ；5，856，097 ；5，830，645 ；5，721，098 ； 5,665, 549 ；5,635, 351 ；Diago, Am.J. Pathol. 158 1623-1631,2001 ；Theillet,
23Bul1.Cancer 88 :261_268,2001 ；Werner, Pharmacogenomics 2 :25_36,2001 ；Jain, Pharmacogenomics 1 :289_307，2000 所描述的那些方法。在某些例子中，需要在特異性目的探針雜交前封閉重復(fù)序列。許多用于去除和/ 或封閉與重復(fù)序列的雜交的方法都是大家熟知的(參見，例如，W093/18186)。例如，希望封 閉與高重復(fù)序列如Alu序列的雜交。一種達(dá)到此目的的方法利用了互補(bǔ)序列的雜交率隨其 濃度的增加而升高這樣一個(gè)事實(shí)。因此，通常以高濃度存在的重復(fù)序列在變性并在雜交條 件下孵育后比其他序列更快地形成雙鏈。然后去除雙鏈核酸，剩余的用于雜交。從雙鏈序 列中分離出單鏈核酸的方法包括利用羥磷灰石或連接到固相支持物上的固定互補(bǔ)核酸等。 另外，可以使用部分雜交的混合物，這樣雙鏈序列將不能與靶序列雜交。另外，可在雜交混合物中加入與需要被封閉的序列互補(bǔ)的未標(biāo)記序列。這種方法 可用于抑制重復(fù)序列以及其他序列的雜交。例如，Cot-IDNA可用于特異性地抑制樣品內(nèi)重 復(fù)序列的雜交。為了制備Cot-IDNA，可提取DNA，剪切后進(jìn)行變性和復(fù)性。由于高度重復(fù)序 列可以更快地復(fù)性，因此得到的雜合子富含這些序列。剩余的單鏈DNA( S卩，單拷貝序列)用 Sl核酸酶消化，純化出雙鏈Cot-IDNA用于封閉樣品內(nèi)的重復(fù)序列的雜交。盡管Cot-IDNA 可按上述方法制備，但是也有商品化的產(chǎn)品(BRL)。在本發(fā)明的方法中，核酸的雜交條件是本領(lǐng)域熟知的。雜交條件可以是高、中等或 低嚴(yán)格條件。比較理想的是，核酸只與互補(bǔ)核酸雜交而不與樣品內(nèi)的其他非互補(bǔ)核酸雜交。 可調(diào)整雜交條件以改變雜交的嚴(yán)格程度并降低背景信號(hào)，這是本領(lǐng)域熟知的。例如，如果雜 交條件是高嚴(yán)格條件，核酸將以很高的互補(bǔ)程度只與核酸靶序列結(jié)合。低嚴(yán)格雜交條件將 允許序列雜交有某種程度的不一致。雜交條件將根據(jù)生物樣品以及核酸的類型和序列而 定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何優(yōu)化雜交條件以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。典型的雜交條件如下。高嚴(yán)格條件是指在0.018M NaCl、65°C下能形成穩(wěn)定雜合 子的那些核酸序列的雜交條件。例如，高嚴(yán)格條件可通過如下方式提供在50%甲酰胺、5x 登哈特液、5x SSC(檸檬酸鈉鹽)0.2% SDS(十二烷基硫酸鈉)、42°C下雜交，然后在0. Ix SSC、0. 1% SDS、65°C下洗滌。中等嚴(yán)格條件是指如下條件在50%甲酰胺、5x登哈特液、5x SSC、0. 2% SDS、42°C下雜交，然后在0. 2x SSC、0. 2% SDS、65°C下洗滌。低嚴(yán)格條件是指如 下條件在10%甲酰胺、5x登哈特液、6xSSC、0. 2% SDS、42°C下雜交，然后在Ix SSC.0. 2% SDS、50°C下洗滌。tCGH試驗(yàn)數(shù)據(jù)的讀取和解釋已知基因座易位伴侶的鑒定和易位斷點(diǎn)的確定依據(jù)的是標(biāo)記探針與微陣列的一 個(gè)或多個(gè)核酸元件雜交的模式和強(qiáng)度的確定。一般而言，檢測(cè)的是與樣品或待測(cè)探針和參 照探針相連的可檢測(cè)標(biāo)記物所產(chǎn)生的陣列上的雜交信號(hào)的位置、雜交信號(hào)的強(qiáng)度和強(qiáng)度比 例。通過確定可與樣品或待測(cè)探針雜交而不與參照探針雜交的元件可以將元件內(nèi)所包含的 序列鑒定為已知基因座的易位伴侶。待測(cè)探針和參照探針具有相同的雜交模式說明待測(cè)樣 品在已知基因座上不含易位。在使用瓦片密度微陣列時(shí)，可通過確定在一系列代表連續(xù)基 因組片段的微陣列元件上雜交開始或終止的位置來確定易位斷點(diǎn)。因此，如果是平衡易位， 雜交將起始于與已知基因組不同的基因內(nèi)的特定DNA序列。不同基因的連續(xù)序列內(nèi)第一元 件所包含的序列將被鑒定為代表第二基因內(nèi)的斷點(diǎn)的序列。相反，對(duì)于已知基因座來說，連 續(xù)序列內(nèi)的元件如果是雜交終止的位置，那么就標(biāo)志著該元件代表了已知基因座內(nèi)的易位
24斷點(diǎn)。另外，在一般情況下，靶核酸片段上信號(hào)強(qiáng)度的比例越高則說明兩個(gè)樣品內(nèi)與該 元件結(jié)合的序列的拷貝數(shù)比例約大。因此，通過比較靶核酸片段之間的信號(hào)強(qiáng)度比例可以 比較兩個(gè)樣品的基因組核酸內(nèi)不同序列的拷貝數(shù)比例?？傊?，可用于檢測(cè)與陣列上固定的核酸片段結(jié)合的核酸相連接的可檢測(cè)標(biāo)記物的 任何裝置或方法都可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。用于檢測(cè)多重?zé)晒饣鶊F(tuán)的裝置和方法是本領(lǐng)域熟知 的，參見，例如，美國(guó)專利號(hào) 5，539，517 ；6, 049, 380 ；6, 054, 279 ；6, 055, 325 和 6，294，331。 任何已知的裝置或方法或其變體都可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法，其中包括陣列閱讀或“掃 描”裝置，例如掃描和分析多色熒光圖像；參見，例如，美國(guó)專利號(hào)6，294，331 ；6, 261，776 ； 6，252，664 ；6，191，425 ；6，143，495 ；6，140，044 ；6，066，459 ；5，943，129 ；5，922，617 ； 5，880，473 ；5，846，708 ；5，790，727 ；以及在本文陣列討論部分所引用的專利。還可參考 已公開的美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)20010018514 ；20010007747 ；以及已公開的國(guó)際專利申 請(qǐng)?zhí)?W00146467A ；W09960163A ；W00009650A ；W00026412A ；W00042222A ；W00047600A 和 W00101144A。7.本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明還提供了使本文所提供的tCGH方法容易實(shí)現(xiàn)和/或標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒。用 于執(zhí)行本發(fā)明的各種方法的材料和試劑都可以試劑盒的方式提供以便于執(zhí)行這些方法。在 本文中，術(shù)語(yǔ)“試劑盒”是指有利于過程、試驗(yàn)、分析、診斷、預(yù)后或操作完成的材料的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的試劑盒包含線性擴(kuò)增含平衡易位的基因座所用 的核酸引物。在某些實(shí)施方式中，試劑盒包含用于多重線性擴(kuò)增多個(gè)基因座的引物混合物。 在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒包含用于tCGH分析平衡染色體易位的高密度瓦片陣 列。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于診斷或預(yù)后以平衡易位為特征的疾病的試劑盒。 在特殊實(shí)施方式中，疾病是癌癥，如淋巴瘤或白血病。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含用于檢測(cè)髓性白血病相關(guān)平衡易位的 高密度瓦片陣列的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒還可包含用于多重線性擴(kuò)增參與髓性白血病相 關(guān)平衡易位的基因座的引物混合物。在一個(gè)特殊實(shí)施方式中，瓦片陣列可以是AML實(shí)驗(yàn)性 陣列，引物混合物可選自MPM混合物、821混合物或P1/P7混合物。下面所提供的實(shí)施例用于說明而不是限制本發(fā)明的權(quán)利要求。
實(shí)施例實(shí)施例1 Jh相關(guān)的易位斷點(diǎn)的鑒定陣列CGH被設(shè)計(jì)成可用于檢測(cè)基因組不平衡而不能檢測(cè)平衡基因組重排。因此我 們探索一種方式使合成的基因組不平衡可代表標(biāo)準(zhǔn)CGH陣列上的平衡易位位點(diǎn)。以淋巴瘤 細(xì)胞系內(nèi)的平衡免疫球蛋白易位為模型，我們開發(fā)了一種酶催化線性擴(kuò)增反應(yīng)，該反應(yīng)可 使平衡易位也能用陣列CGH檢測(cè)，該方法包括在靶向性線性擴(kuò)增步驟中修飾基因組DNA，然 后進(jìn)行熒光素標(biāo)記和微陣列雜交。如圖1所示，Jh-相關(guān)的易位斷點(diǎn)可利用Jh共有引物通 過酶催化擴(kuò)增(van Dongen，2003)，結(jié)果線性擴(kuò)增可跨越斷點(diǎn)連接處進(jìn)入到易位伴侶基因 座。利用單個(gè)引物就能夠擴(kuò)增Jh-相關(guān)的易位，無論是否鑒定出IgH伴侶基因。在一個(gè)典型的tCGH試驗(yàn)中，來源于淋巴瘤和正常對(duì)照的基因組DNA經(jīng)過線性擴(kuò)增以及用熒光染料Cy3(淋巴瘤)或Cy5(對(duì)照)標(biāo)記以后混合在一起，然后以瓦片密度與代 表常見IgH融合伴侶基因座的定制寡核苷酸陣列雜交(圖1)。圖2a和圖2b描述了 BCL2 和MYC基因座所包含的Jh-相關(guān)的易位。根據(jù)其在tCGH陣列上呈現(xiàn)的帶直邊的特征性直 角三角形形狀可以將其鑒定為斷點(diǎn)，其中直邊代表非IgH基因座內(nèi)斷點(diǎn)的基因組位置。直 邊的高度代表了 Jh相關(guān)線性擴(kuò)增的范圍。這個(gè)三角形狀與線性擴(kuò)增步驟相符，因?yàn)檫@種線 性擴(kuò)增可產(chǎn)生不同大小的DNA片段，并且距離Jh引物越遠(yuǎn)擴(kuò)增強(qiáng)度越弱。這種斷點(diǎn)模式的 形狀依賴于擴(kuò)增條件，延伸時(shí)間延長(zhǎng)可導(dǎo)致tCGH陣列上的斷點(diǎn)模式變寬(圖6)。使用正?；蚪MDNA作為雜交對(duì)照可以在一個(gè)陣列上同時(shí)檢測(cè)平衡易位和染色 體不平衡。例如，研究表明，RL7(Lipford，1987)(圖 3a，上圖)和 0CI_Ly8 (Tweeddale， 1987)細(xì)胞系都包含JH_BCL2易位，并且BCL2內(nèi)含子2含有大片段缺失。在OCI-LyS內(nèi)臨近 JH-BCL2斷點(diǎn)的小片段缺失很可能是因?yàn)樵撘孜灰鸬?。在M02058外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL) 細(xì)胞系(Meeker，1991)(圖3c)中，有一個(gè)位于Jh斷點(diǎn)末端著絲粒側(cè)的CCNDl基因座重復(fù)， 在CCND13’UTR內(nèi)有一個(gè)小片段缺失。一般來說，在tCGH陣列上，與平衡易位相關(guān)的陣列模 式具有不對(duì)稱形狀，這使它很容易與基因組不平衡區(qū)別開來。在經(jīng)典arryCGH中，通過與空 白擴(kuò)增試驗(yàn)比較tCGH結(jié)果就可以證明這一點(diǎn)，其中空白擴(kuò)增試驗(yàn)只能鑒定基因組不平衡 (圖3a和3c，中圖)。通過用空白擴(kuò)增的待則DNA代替線性擴(kuò)增的正常DNA作為對(duì)照樣品， tCGH還可用于單獨(dú)鑒定平衡易位(不檢測(cè)基因組不平衡)(圖3a和3c，下圖)。以這種方 式進(jìn)行的tCGH試驗(yàn)在多個(gè)位置產(chǎn)生了“偽斷點(diǎn)”(補(bǔ)充數(shù)據(jù)，未顯示)，這是一種偽像，通過 在經(jīng)典tCGH試驗(yàn)中使用擴(kuò)增的正常DNA可以使其最小化。實(shí)施例2 IgH轉(zhuǎn)換(SH)相關(guān)的易位斷點(diǎn)的鑒定然后設(shè)計(jì)出線性擴(kuò)增引物用于鑒定包含IgH轉(zhuǎn)換(Sh)區(qū)的易位。人包含特 征性重復(fù)序列單位的多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列在S” Sa和SeE區(qū)，重復(fù)單位是退化的五聚體序 列 G(A/G)GCT，其中在 Sy 區(qū)其長(zhǎng)度為 80-90，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜(Max, 1982 ；Mills, 1990 ；Mills, 1995)。Sh相關(guān)的易位斷點(diǎn)分別在這些重復(fù)區(qū)內(nèi)。為了便于檢測(cè)這些分散分布的斷點(diǎn)，將線 性擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)成可以識(shí)別這些重復(fù)單位并能夠在31^/5八5￡區(qū)(S5引物)或\重復(fù)區(qū) (Sy引物)的多個(gè)位置啟動(dòng)合成。使用Jh處的S5引物進(jìn)行的tCGH用于鑒定伯基特淋巴瘤 細(xì)胞系Raji內(nèi)的Sli-MYC易位(Dyson，1985)(未顯示)和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系U-266內(nèi)的 隱匿 Sa-CCNDl 融合(Gabrea，1999)(圖 2c)。已知大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系0CI_Ly8 (Tweeddale，Lim 等，Blood 69(5) 1307-1314(1987))包含 MYC 重排以及 JH_BCL2 和 Sy3"BCL6 融合(Farrugia，Duan 等， Blood 83(1) 191-198(1994) ；Chang，Blondal 等，Leuk Lymphomal9 (1-2) :165_71 (1995)； Ye，Chaganti等，EMBO 14(24) :6209_17 (1995))。分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明存在染色 體 3、8、14 禾口 18 的復(fù)雜的重 W (Changanti，Rao 等，Genes, Chromosomes and Cancer 23(4) :328_336 (1998) ；Mehra, Messner 等，Genes, Chromosomes and Cancer 33(3) 225-234(2002) ；Sanchez-Izquierdo, Buchonnet 等，Blood 101(11) :4539_4546(2003))， 但是MYC重排的詳細(xì)情況還未完全清楚。通過用Jh引物進(jìn)行tCGH，我們證實(shí)了存在Jh_BCL2 融合。令人感興趣的是，我們意外地在BCL2內(nèi)含子內(nèi)鑒定出了與RL7細(xì)胞系一樣的大片段 缺失以及一個(gè)與斷點(diǎn)相關(guān)的小片段缺失。然后我們?cè)O(shè)計(jì)了可識(shí)別所有Sy重復(fù)序列的共有 線性擴(kuò)增引物，將其命名為SYR，其中R表示“反”向，說明引物的3’末端指向14q中心粒(圖9)。我們利用SYR引物進(jìn)行tCGH分析，成功地鑒定出了 SY3-BCL6融合(圖4b)，并且 意外地檢測(cè)到以前未鑒定出的包含MYC基因5’末端的Sy-MYC融合(圖4c)。利用SYF線 性擴(kuò)增引物(F代表“正”向，表示3’末端指向14q端粒)通過tCGH成功地鑒定出了交互 S￥-BCL6融合(圖4d)。但是利用SyF、SPF、SPR、JH或DH線性擴(kuò)增引物進(jìn)行的tCGH未鑒定 出交互SY-MYC融合。實(shí)施例3 未知易位斷點(diǎn)的鑒定為了證明tCGH能夠鑒定原發(fā)腫瘤內(nèi)的新型斷點(diǎn)，我們研究了懷疑包含Jh_CCND1 易位的一系列淋巴瘤。外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL，綜述見Jares，2007)是一種成熟的B細(xì)胞淋 巴瘤，其特征是包含易位t(ll ； 14) (ql3 ；q32)，這將導(dǎo)致丄_0冊(cè)1基因融合和CCND1蛋白過 量表達(dá)。雖然約40-50%的MCL病例，其中包括M02058細(xì)胞系(圖3c)，包含聚集于主要易 位簇(MTC)上的斷點(diǎn)，但是大多數(shù)MCL斷點(diǎn)散在分布于CCND1和MYE0V基因之間的整個(gè)大基 因間隔區(qū)，位于著絲粒到CCND1約400kb處。為了證明tCGH能夠檢測(cè)還未鑒定清楚的易位 斷點(diǎn)，我們利用它來鑒定和定位不包含MTC相關(guān)斷點(diǎn)的MCL病例內(nèi)的Jh_CCND1易位。圖6 顯示了利用JH引物進(jìn)行tCGH分析的結(jié)果，該試驗(yàn)共研究了 4個(gè)這種MCL病例和一個(gè)t (11 ； 14)陽(yáng)性B細(xì)胞早幼淋巴細(xì)胞性白血病(B-PLL)。在每一個(gè)病例中，在高分辨率下推測(cè)出的 獨(dú)特?cái)帱c(diǎn)使我們能夠立刻設(shè)計(jì)出PCR引物用于擴(kuò)增和測(cè)序獨(dú)特的Jh_CCND1融合。斷點(diǎn)散 在分布于CCND1斷點(diǎn)區(qū)的約140kb的片段內(nèi)(Vaandrager，1996)，其中一個(gè)病例(B-PLL)所 包含的一個(gè)斷點(diǎn)剛剛處于MTC外。實(shí)施例4:材料和方法基因組0嫩制備和雜交利用一個(gè)或多個(gè)靶向到化11基因座的1、011或511引物，這 些位點(diǎn)上的重排特異性的MYC、BCL2或BCL6引物，或者包含BCR、MYH11、MLL、PML或AML/ RUNX1基因座的重排特異性的一個(gè)或多個(gè)引物(參見表3和5)線性擴(kuò)增待測(cè)DNA和參照 DNA。擴(kuò)增出的DNA通過超聲進(jìn)行片段化，然后按照W125]描述的方法分別用酞菁-3_dUTP 和酞菁-5-dUTP (安捷倫基因組DNA標(biāo)記試劑盒)。標(biāo)記的待測(cè)DNA樣品和參照DNA樣品與 定制的安捷倫HD-CGH 8xl5K微陣列(產(chǎn)品編號(hào)G4427A)共雜交，基本按照廠家推薦的說明 書進(jìn)行(安捷倫出版物NO.G4410-90010和G4427-90010)。陣列數(shù)據(jù)用安捷倫特征提取軟 件(第9版)和安捷倫CGH分析軟件(3. 4或3. 5版)進(jìn)行分析。線性擴(kuò)增利用克隆技術(shù)有限公司(Clontech)的PCR酶系統(tǒng)(AdvantagdPCR Enzyme System)進(jìn)行線性擴(kuò)增，反應(yīng)混合物(50 u 1)包含0. 5 y g到2 y g基因組DNA、200mM dNTP和150nM線性擴(kuò)增引物。多重反應(yīng)中每一種線性擴(kuò)增引物的濃度都為75nM。典型反應(yīng) 條件如下95°C變性5分鐘，然后進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，其中包括變性95°C /15秒、復(fù)性60°C /15 秒和延伸68°C /6分鐘，但是延伸時(shí)間從2分鐘到18分鐘都是可以的，在篩選試驗(yàn)中循環(huán) 次數(shù)可高達(dá)20個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(例如，參見圖17)。線性擴(kuò)增以后，得到的DNA混合物溶于 400 ill pH8. 0的TE中，用配有Misonix 431A角杯(cup horn)的費(fèi)氏550型超聲細(xì)胞研磨 器(Fisher Model 550Sonic Dismembrator)超聲 3 分鐘使其片段化，然后濃縮(Microcon Y30)到終體積32 ill。熒光標(biāo)記和雜交用安捷倫公司的基因組DNA標(biāo)記試劑盒(Agilent Genomic DNA labeling kit PLUS)(目錄號(hào)5188-5309)完成，基本按照廠家推薦的方法進(jìn) 行，但是既不進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，也不進(jìn)行全基因組擴(kuò)增?？傊?，在有標(biāo)記的dNTP存在 的條件下，利用DNA聚合酶通過隨機(jī)引物介導(dǎo)的延伸反應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記。這樣既可以標(biāo)記線性擴(kuò)增的產(chǎn)物，又可以標(biāo)記樣品內(nèi)的基因組DNA。但是，在擴(kuò)增反應(yīng)中，線性擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物 只通過摻入標(biāo)記的dNTP進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)照人基因組DNA購(gòu)自普利馬公司(PromegaM目錄號(hào) G1471(男性)和 G1521(女性))。陣列設(shè)計(jì)通過定制經(jīng)過篩選的寡核苷酸探針，所謂篩選是指利用算法進(jìn)行設(shè)計(jì) 以使參數(shù)如探針長(zhǎng)度、預(yù)期解鏈溫度以及探針間距和密度達(dá)到最優(yōu)化，在安捷倫DNA微陣 列(G4427A)上以瓦片密度排列IgH或髓性白血病(AML)斷點(diǎn)相關(guān)的基因組區(qū)。由定制的 探針以高密度代表的基因組區(qū)首先用R印eatMasker(http://r印eatmasker. org/cgi-bin/ AnnotationRequest)過濾以屏蔽高度保守的重復(fù)序列元件。為了使基因組的覆蓋范圍達(dá)到 最大化，不屏蔽高度分散的重復(fù)區(qū)(> 15%的分散性)，因?yàn)樵谶@些區(qū)內(nèi)也可以鑒定出獨(dú)特 的寡核苷酸探針。利用程序Tile (見下文)使探針在重復(fù)區(qū)被屏蔽的每一個(gè)基因組片段內(nèi) 都有統(tǒng)一的空間分布。IgH易位陣列共包含11，852個(gè)探針，代表了 IgH易位中最常見的5個(gè) 基因座BCL2、BCL6、CCND1、MLT1和MYC(見下表1)。另外，以較低的密度代表其他23個(gè)基 因座的2410個(gè)探針選自安捷倫探針文庫(kù)(http://earray. chem. agilent. com/earray/)。 AML陣列(見下表4)總共包含14，262個(gè)探針，代表如下基因座:BCR、ABL、ETO (RUNX1T1)、 AML1、RARA、PML、CBFB、MYH11、MLL、AF9、IKZF1 (Ikaros)。Tile(N. Hoffman和H. Greisman，未發(fā)表)利用了簡(jiǎn)單的算法使寡核苷酸具有統(tǒng)一 的空間分布，并且使其解鏈溫度(Tm)、GC含量和核苷酸長(zhǎng)度盡可能接近特定參數(shù)。輸入的 是寡核苷酸序列表，每一個(gè)序列都與目的基因組片段的起始和終止位置以及解鏈有關(guān)。對(duì) 于這些試驗(yàn)中所使用的陣列來說，候選寡核苷酸包括涵蓋目的區(qū)的所有可能的N聚合物， 其中N的范圍為25到60 (對(duì)IgH陣列來說)或35到60 (對(duì)AML陣列來說)。寡核苷酸篩 選標(biāo)準(zhǔn)所用的參數(shù)如下D_，Dfflin, D。pt_離起始位置的最大、最小和最佳距離Tmmax，Tmmin，Tm。pt_ 最大、最小和最近 TmTmmax，Tmmin，Tm。pt_ 最大、最小和最近 Tm寡核苷酸篩選算法按如下方式反復(fù)進(jìn)行，起始于序列區(qū)的&核苷酸位置1. P0+Dfflin到PfD.核苷酸位置之間的一組寡核苷酸被認(rèn)為是一組。2.剔除Tm處于[Tm_，Tmfflin]范圍之外的寡核苷酸。3.處于Pi位置的每一個(gè)寡核苷酸i，計(jì)算如下數(shù)值a. D, = VD^-Pj因此，較小的數(shù)值對(duì)應(yīng)于靠近序列區(qū)最佳距離的位置。隊(duì)可圍繞在最近的Dbin核 苷酸周圍(一般使用數(shù)值5)。b. dTnii = | 徹廠！^郵因此較小數(shù)值的dTmJf應(yīng)于接近最佳Tm的解鏈溫度。(！！^可圍繞在最近的 dTmromd度數(shù)周圍(一般使用1度的數(shù)值)。c. = -1* (寡核苷酸長(zhǎng)度)因此較小的數(shù)字對(duì)應(yīng)于與較長(zhǎng)的寡核苷酸。d. GCj = 100* (G+C) / 長(zhǎng)度因此較小的數(shù)字對(duì)應(yīng)于較低的G+C含量。GQ可在最近的百分比周圍。4.對(duì)于每一個(gè)寡核苷酸i來說，制備一列由DpdTmp-Li和GQ中的一些或全部組成的元組。5.這個(gè)數(shù)值表按升序分類。每一個(gè)在元組中的相對(duì)位置決定 了該參數(shù)的相對(duì)權(quán)重(即，如果01超過了 GC”那么賦予寡核苷酸長(zhǎng)度比GC含量更大的權(quán)重)。6.篩選分類表中位于第一元組相應(yīng)的位置X上的寡核苷酸。7. PQ重新設(shè)定為Px，重復(fù)上述過程。算法還確定了候選寡核苷酸在目的序列上的覆蓋區(qū)內(nèi)的不連續(xù)區(qū)?？紤]覆蓋范圍 [P0+Dfflin,P0+Dfflax]的序列區(qū)和覆蓋范圍[Pgapstart，Pgapst。p]的“間隙”(也就是說，不包含候選寡 核苷酸的序列區(qū))。如果Pgapstot<Po+D_，那么在這個(gè)重復(fù)中寡核苷酸將從范圍[Po+D— Pgapstart]中選擇。在下一個(gè)重復(fù)時(shí)，寡核苷酸篩選將從間隙開始，Po設(shè)定為(Pgapst。p-D。pt)以 強(qiáng)迫所考慮的寡核苷酸接近候選寡核苷酸重新覆蓋的點(diǎn)。最佳探針長(zhǎng)度為60個(gè)堿基，探針之間的最佳距離為50-100個(gè)堿基，可接受的GC 含量為20 %到80 %，最佳Tm為74. 5 V，利用EMBOSS軟件包的Dan程序計(jì)算(http // emboss, sourceforge. net)。表 1
基因座帶區(qū)間距區(qū)長(zhǎng)度探針tt間隔CCND1llql3. 3chrll :68808198-69188422380，2255，59768BCL218q21. 33chrl8 :58880000-59157593277，5944，21366MYC8q24.21chr8 :128782854-12883285350，00072869BCL63q27.3chr3 :188921902-18897518153，28084763MLT118q21.31chrl8 54468326-5450152833，20346771 新型斷點(diǎn)的確認(rèn)新型易位和缺失斷點(diǎn)都是通過PCR擴(kuò)增和桑格測(cè)序確定的，其中包括所有5個(gè)MCL 病例的Jh-CCND1融合、一個(gè)濾泡淋巴瘤(FCL)病例的Jh_BCL2融合以及0CI_Ly8內(nèi)的所有 四個(gè)新型IgH融合(Jh_BCL2，Dh-BCL2, Sy2_MYC和Sy3_BCL6)。伴侶斷點(diǎn)列在表2中，下面 提供的是其序列。另外，RL7內(nèi)的新型內(nèi)含子BCL2缺失(chrl8 :58，954，729-59，122，208) 和0CI-Ly8內(nèi)的新型內(nèi)含子BCL2缺失(chrl8 :58，998，604-59，133，954)都用缺失兩側(cè)的 特異性BCL2引物進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，見下文。表2
29 MCL1JH-CCND1融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-GACCCAGCACCCTTATTTCC-3，(IgH)(SEQ ID NO 27)5，-GATCACAGTCTTTGCTGCCTGT-3，(CCND1)(SEQ ID NO 28)CAGTTTTAGAGTTGTTTGTGGCAGGAAAGTTACTTTTGGCCAGAATTGGAAGTTGGAAGGTGTGCAGCT ATTGCTATAGCAAATGTGTTCTCCATCCTGATCAGTAAAGAGGATAAAAAGCAATTTATCATTAGATAGGAAGGATATTCACAATCTCACTCCAGATCTATGTTATAATAACTCCTGTTCTCCAAAGAATATAGGTTGACTACTGGGGCCAGGG AACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTAAG(SEQ ID NO 29)MCL2Jh-CCND1融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CCAGGCTCAGTTACTCCATCAG-3，(IgH)(SEQ ID NO 30)5，-CACTCTGGAACATTCTTGCATTG-3，(CCND1)(SEQ ID NO 31)TGTAATCCCCAGCACTTTGGGAGGCTGATACGGGAGAATCACTTAGCCCCAGAGAAGTTCCAAGAACAG CCTGGGCATCATACATAGCGAGACTCGTTCTCTAAAAAATACAAAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCACGTGCCTGT AGTCACAGCTACTTGGGAGGCTGTGATGGGAGGATCACTGGAGCCCAGGAACTCCAGGCTGTAGTGAACTATGATCA TGCCACTGCTCCAGCCTGGGTGACAGTGTGAGACCCTGTCTCTGATAATAATCATAATATTTTATTAGTAGAGTCGT TTTTTCTTTTTCATTTCTTTTTAATTTAATGTTTTGTACGGACAAGTTTTCGCTATTTTGCCCAGGCTAGTCTTGAA CTCCTGGCCTCAACCGATCCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAAGCACTGGGATTACAGGCAAGAACCACCGCACCCGGCC CAAACATTTTCATTTTTTATATTTCAAGTACTTTGATTAATTATTGTGCAAGTTTCTTGTGCAAAGCTTAGAAGAAG AGGTCTTACAGAATTTTTTGCGGTTTTTAAGCAATTACACCATATAAAACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGG GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTC(SEQ ID NO 32)MCL3Jh-CCND1融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-AGAGGCTCCCAGATCCTCAAG-3，(IgH)(SEQ ID NO 33)5，-AACACAGTGCCATGAAACCA-S' (CCND1)(SEQ ID NO 34)AACACTAGATCTGGAAAATAGGGTTTCATGGCCCAGAGTTTGGGGAACCGGGCACGAGAGCTGAGTCAG CATCTTTGGCTGTGAAAAATCTCTGCTTAATGTTGGCTGCCACGGGCTCCACAGCCTCTTTGCCATGGCATATCTTC TGGCGTGCCACTGACTCACACCATCATGAAATGAGCGCCATGCAGAACACAATCTTGGGGAAAAGCTTATCTAAGGA ATAAAATTACAGGTCCAGATCACTTATATAACTGGCGCTTAGAAGAAGAGCCCACCCACATTATTTTTTGAGGACCC CCATGGCTGATGGTGAACCCCTGCTCTGAGGTGGGTGGCTTCCCTTCAGCCCCACGGCTTGTTGGGGGGCACCCTCC ACCCAGCTGTCGCCTTGGGGTAAGGCTCCCCACGGAGCCACCCGAAATGAATCTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGA ACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTCACCACCCCCTCTCTGAGTCCACTTAGGGAGACTCAGCTTGCCAGG GTCTCAGGGTCAGAGTCTTGGAGGCATTTTGGAGGTCAGGAAAGAAA(SEQ ID NO 35)MCL4Jh-CCND1融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CCAGGCTCAGTTACTCCATCAG-3，(IgH)(SEQ ID NO 36)5，-CTGTGACCACTTCCTGACCA-3，(CCND1)(SEQ ID NO. 37)CTTTAGGTACACGGATGGAGGTCTGCTGGCCGAGGCTGGCATTTGCACACTTCATTGCAGCACTGGAGA ACTGAGTCTTCTTTTACTCAATTTTTCATAGAAATAGGCACATTCCCCATCCCTTCCCCTCGCCCCCACAACCCCTG ACGCTCAGCATCCAGGGCTGATCTGAGAGGGACCCGGGAGGCAGAGAAACCCCAGAGCCGTCATTTCCCAGATGTGG CATTATGTGTGAGCCTAGGTTTGTGTTCTTTTAACGGCACCACATAAACCCCAGTCCTCCAAACTGGTTCGACCCCT GGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTCACCACCCCCTCTCTGAGTCCACTTAGGGAGACTC AGCTTGCCAGGGTCTCAGGGTCAGAGTCTTGGAGGCATTTTGGAGGTCAGGAAAGAAAGCCGGGGAGAGGGACCCTT CGAATGGGAACCCAGCCTGTCCTCCCCAAGTCCGGCCACAGATGTCGGCAGCTGGGGGGCTCCTTCGGCTGGTCTGG GGTGACCTCTCTCCGCTTCACCTGGAGCATTCTCAGGGGCTGTCGTGATGATTGCGTGGTGGGACTCTGTCCCGCTC CAAGGCACCCGCTCTCTG(SEQ ID NO 38)MCL5JH-CCND1融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-GACCCAGCACCCTTATTTCC-3，(IgH)(SEQ ID NO 39)
31
5，-ACCACACCTGGCCTTCTATTGTA-3，(CCND1)(SEQ ID NO 40) TGTCTAATGCCCTGTATCCCCATTTTAACATCATACAAAGAGTTTCACTGCCCTAAAAATCTGTCTCC
ACCTGTTCACCCCTCTCTCCAAATTCCTGGCAACCACTGATTGTTTTACTTTCTCTGTAGTTTTGTCCTTTCTAGA
ATGTCAAAGAGTTGGACTCATACGGTAACGGAGAGACCAGCATACATGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA
CCGTCTCCTCAGGTGAGTCCTCACAACCTCTCTCCTGCTTTAACTCTGAAGGGTTTTGCTGCATTTTTGGGGGGA
AATAAGGGGCTGGGTC(SEQ ID NO 41)FCL JH-BCL2融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CTTACCTGAGGAGACGGTGACC-3，(IgH)(SEQ ID NO 42)5，-CGGGAATTCTTTGACCTTTAGAGAGTTGCTT-3，(BCL2)(SEQ ID NO 43)TTTTCCAAGGCATCGGAAATCCACAGAGGCTCCCAGATCCTCAAGGCACCCCAGTGCCCGTCCCCTCCT GGCCAGTCCGCCCAGGTCCCCTCGGAACATGCCCCGAGGACCAACCTGCAATGCTCAGGAAACCCCACAGGCAGTAG CAGAAAACAAAGGCCCTAGAGTGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGACGTCCAT CACCGGGCCCCGCCGGGGAGGTCTGGCTTCATACCACAGGTTTCCTGCTTTCTTGGTGGAGCGTAAGCACCACTGCA TTTCAGGAAGACCCTGAAGGACAGCCATGAGAAAGCCCCCGCGGAAGGAGGGCAGGAGGGCTCTGGGTGGGTCTGTG TTGAAACAGGCCACGTAAAGCAACTCTCTAAAGGTCAAA(SEQ ID NO 44)DHL16 JH-BCL2融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CCAGGCTCAGTTACTCCATCAG-3，(IgH)(SEQ ID NO 45)5，-CGGGAATTCTCAGTCTCTGGGGAGGAGTGG-3，(BCL2)(SEQ ID NO 46)ACAGGCAGTAGCAGAAAACAAAGGCCCTAGAGTGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC CCTTGGCCCCAGACGTCCATATTAATATTTGGCGAGACAGAGAATACCACAAAGAAGTGGATAGATGGCAGATGAC ACATGCGAGACCCAAAGTGCTAATTTCCTGAATATACAAAGAGCTCTTACAAGTTAATCAAAAGACAAATAACTC AATGAAGTAATGGGCTCTTGCCTATGTTATGAATATTTTCATCTGGTATGACATTTACTCTTTGATTTCATTATT TTTGTGATTTTCATAGGCTTGTATTTTATGTAGTCAAATCTCTATGTCTTTCTATCACTTTTGTGTTTAGAAGGA CGTTCCTCCTTCTGAAGTACACATATTTGATTTTGGATTTGAGATGGCATTCATTTCTGATCCATCTATAAAGTT TTTGGTGTGTGGTTAAAGGTAAAAATAGACTCACATTTTCCTAAATAATAGCCAGTTGTTCCAGCTCCATTTATT GAGTGGTCCTTCCTTTCCCAACTGATGCGCGGTGTAACCTTTATCATATATTAAATACTCATGTGTGCTAAAAAT AAAAAGTCATTTCAGTTGAGTGCTG(SEQ ID NO 47)0CI-Ly8JH-BCL2融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CCAGGCTCAGTTACTCCATCAG-3，(IgH)(SEQ ID NO 48)5，-CGGGAATTCTTTGACCTTTAGAGAGTTGCTT-3，(BCL2)(SEQ ID NO 49)TTTTCCAAGGCATCGGAAATCCACAGAGGCTCCCAGATCCTCAAGGCACCCCAGTGCCCGTCCCCTCCT GGCCAGTCCGCCCAGGTCCCCTCGGAACATGCCCCGAGGACCAACCTGCAATGCTCAGGAAACCCCACAGGCAGTAG CAGAAAACAAAGGCCCTAGAGTGGCCATTCTTACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGACGTCCAT ACCGTATTTTCATCCCATTCGCACACAGGGGGTAACGGGGCGCCGGGTAAGCACCACTGCATTTCAGGAAGACCCTG AAGGACAGCCATGAGAAAGCCCCCGCGGAAGGAGGGCAGGAGGGCTCTGGGTGGGTCTGTGTTGAAACAGGCCACGT AAAGCAACTCTCTAAAGGTCAAAGAATTCCCGA(SEQ ID NO 50)0CI-Ly8DH-BCL2融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CTGGAGCACTTCAACAGCAG-3，(BCL2)(SEQ ID NO 51)5，-GTGGCCCTGGGAATATAAAA-3，(IgH)(SEQ ID NO 52)
ATTTGTGGGCACTTATGAACCCGAAAGGACATGGCCATGGGGTGGGTAGGGACATAGGGACAGATGCCA GCCTGAGGTGGAGCCTCAGGACACAGGTGGGCACGGACACTATCCACATAAGCGAGGGATAGACCCGAGTGTCCCCA CAGCAGACCTGAGAGCGCTGGGCCCACAGCCTCCCCTCAGAGCCCTGCTGCCTCCTCCGGTCAGCCCTGGACATCCC AGGTTTCCCCAGGCCTGGCGGTAGGTTTAGAATGAGGTCTGTGTCACTGTGGTATTACGATATTTTGACTGGTTATT ATAACCACAGTGTCACAGAGTCCATCAAAAACCCATGCCTGGAAGCTTCCCGCCACAGCCCTCCCCATGGGGCCCTG CTGCCTCCTCAGGTCAGCCCCGGACATCCCGGGTTTCCCCAGGCTGGGCGGTAGGTTTGGGGTGAGGTCTGTGTCAC TGTGGTATTACTATGGTTCGGGGAGTTGTACGGCCCTGATACTTAGCTTCCATTGTATACATTTTTAAAGTGATATA AAACAAATCTGGTTGTGATTCCTATCAACATAGGCATGAGCCACTGCGCTCAGCCCTCTTTGTTTTTGTGCTGGTTC CTTTGTGAAAGTTCTGCTGTTGA(SEQ ID NO-. 53)0CI-Ly8 S y 2_MYC融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-GGTCGGACATTCCTGCTTTA-3，(MYC) (SEQ ID NO 54)5，-CCCAGAAGGAGCAAGATGG-3，(IgH)(SEQ ID NO 55)GGGTTTGGGGGGCTGGGGGTTGCTTTGCGGTGGGCAGAAAGCCCCTTGCATCCTGAGCTCCTTGGAGTA GGGACCGCATATCGCCTGTGTGAGCCAGATTGCTCCGCAGCCGCTGACTTGTCCCCGTCTCCGGGAGGGCATTTAAA TTTCGGCTCACCGCATTTCTGACAGCCGGAGACGGACACTGCGGCGCGTCCCGCCCGCCTGTCCCCGCGGCAAGGTC CCTGTTGGGCTCAACCCAGGCCCCCCAGCATATGTAGGAGCCTTGTATGGCCCTCCCCACCCTGCGTGGTGCCAGGA CCCCCAGGCCACAGGGAGGCCCCATTTCTCTCTGCCGCTGGCCCAGTGGCCCTGGAGTCCCACTCCACGTGGGGTGT GCCCCTGACTTCTGAGGAACCTAAGTGCCCTGCCCTCAGCCAGGCCATCCCCTCTGCTCAGAGGGCCCCGCTCACCA CCCCTTCCCCTCACCTGCAGCACAGACTCTGGCTGATTCTGCCCAGGCCCTGAATGGGCCCCTCTGGCAGCCGTCTG TTGCTACACTGCCC(SEQ ID NO 56)0CI-Ly8 S y 2-BCL6 (S y F)融合所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CCTGCCTCCCAGTGTCCTGCATTACTTCTG-3，(IgH)(SEQ ID NO 57)5，-GCAGTGGTAAAGTCCGAAGC-3，(BCL6)(SEQ ID NO 58)ACTGGGGTTCTTAAAGTGGTGATGCAAGAAGTTTCTAGGAAAGGCCGGACACCAGGTGATTATTGCTGT TGCTGCCGCCGCTGCTGCTGCTACTGCCGCCGCCGCCGCTGTTGCCGCTGGTGCCGCTGCCGCCGCCGCTGCTCATG ATCATTATTTTACCTTTTAATTCTTTTTTTTTCCGCTCTTGCCGAGTGCTTTGGCTCCAAGTTTTCTATGTGTATCT ATTGATATAAATGTATATATTTATTTATTCTAGGTGGAGCTCARAGAGCCGGGGAARATCATCGGTAGGTGAGCAGG GGCTGGTGGAAAGCAGGAGGAGCAAGGGGCAGCTCATGGAGCTCAGAGGACCAGGGAAGAGCAGCCACAGGTGAACA GGGGCAGGTGGGCGGCAGAATGAGCAGGGGCAACTCCTGGAGCTCAGGGGACAAGGGCAGAGCAGCCATAGGCAAAC AGGAGCAGGGTCAGGGGACAGGAGGAGCAGGGGGCAGTTCTTGGAGTTTAGGGGACCAGGGCAGAGCCGCTGCAGGT GAGCAGGGGCAGGTGGGGGGCAGGAGGAGCAGGGGGCATCTCCTGGAGCTCAGAGCACCAGGGCAGAGCAGCCACAG GTGAGCAGGGACGGTGGGAGGCAGCACGCAGCTCCTAGACTTTGGCAGGAGCTGGGTAGTTGCCGGCACCAGACAGC TGAGGGCTGGTGAAAGTGC AGTGCAGCCTCCTGGTG(SEQ ID NO. 59)0CI-Ly8內(nèi)含子BCL2缺失所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-TCAGACACCAGCTCCCTAGC-3，(SEQ ID NO 60)5，-GAAGCACAGATGGTTGATGG-3，(SEQ ID NO 61)AGGAAGTCTTGCTCTTCAGCAAAAACTGCAGCAGGAATCCCTAAATGCCTAAAATGACTTTTAGATTAA TAATGCACATTTGAAATGATAGGCAAATCATTCATCATTCTCAAACACTACCACTTTTATTCCAAAGTGTCCTATGA GTGCATTTCCTGGTATATATATATATTTTTTCTCTAAATTCCTTTGTTTTCCTATATGTCACCATCTATGCATTGTTCTGAAAGCTATTACATATTTTACCATCAACC(SEQ ID NO 62)RL7內(nèi)含子BCL2缺失所使用的PCR/測(cè)序引物和斷點(diǎn)序列5，-CTCATGCCCCATATTCATTCAA-3，(SEQ ID NO 63)5，-AGGGCATGTTACTGCAAGTTCA-3，(SEQ ID NO 64)ATTTGTTTACTGTAAAGAGCCTACTCTGGGCCAATCATTGTTCTAGGGGCTGGAGCTGTAACAGAAAAC ATGACAGGTTAAGAACTCTCCCATCTCTTGTGAATCCCACATTGTGAGGAAGTCAGAAAAGTAAACAACTTAAAAAT TAACAATATAACATAAGGGCCACAAAGTAATGAAAACAGGGCAATGCAGTGCAAGGGTGCTGATGGGACAATATTAA CTTCTTCCTTGGTCTTTGAGATTTTTCAAGCAGTACTACAAGTTTACACAGAGGAGATTTAATGGGTTTTTCTTCAT TAATAGTTGAAAACTATTTATAAGACAAATAATAATTTGTCTTAGGGTCTGTTTCTAAGGGAGTCTAACCTATGGCC ATGGGATTTACTGTTGAATGAATATGGGGCATGAG(SEQ ID NO 65)實(shí)施例5 免疫球蛋白重鏈(IgH)易位的鑒定為了能在寡核苷酸陣列上檢測(cè)平衡易位，在DNA標(biāo)記和陣列雜交前通過酶催化擴(kuò) 增斷點(diǎn)相關(guān)的基因組DNA序列。這種線性擴(kuò)增步驟使用單個(gè)寡核苷酸引物不對(duì)稱啟動(dòng)雜合 DNA片段的合成，合成起始于一個(gè)基因座，并且延伸跨過易位斷點(diǎn)進(jìn)入伴侶基因座(圖7)。 擴(kuò)增的和標(biāo)記的基因組DNA與瓦片密度寡核苷酸陣列的雜交可使易位伴侶被鑒定出來，并 且以高分辨率定位基因組斷點(diǎn)，其中寡核苷酸陣列被設(shè)計(jì)成可以代表伴侶基因座(圖7)。 由于擴(kuò)增不需要靶向到伴侶基因座的第二引物，因此利用單個(gè)陣列通過tCGH分析就可以 檢測(cè)散在分布于大基因組區(qū)以及多個(gè)伴侶基因座內(nèi)的易位斷點(diǎn)。由于擴(kuò)增的正?；蚪M DNA可作為陣列雜交的參照樣品，因此tCGH還可在同一個(gè)陣列上檢測(cè)基因組不平衡和平衡 易位。在本實(shí)施例中研究了免疫球蛋白重鏈(IgH)易位，其中包括各種B細(xì)胞淋巴瘤和 漿細(xì)胞骨髓瘤內(nèi)的各種伴侶基因座，這種易位被用作開發(fā)和驗(yàn)證tCGH的模型系統(tǒng)。鑒定特 定淋巴瘤或骨髓瘤內(nèi)的特殊IgH伴侶基因座是準(zhǔn)確診斷和分類所必須的，也是預(yù)測(cè)臨床后 果及預(yù)后所必須的。由于IgH易位被認(rèn)為是異常VDJ或種類轉(zhuǎn)換重組(CSR)所引起的，并 且癌基因的整個(gè)編碼區(qū)通常融合到保守的IgH調(diào)節(jié)區(qū)上，因此IgH基因座內(nèi)的斷點(diǎn)通常位 于保守的連接片段(JH)、差異片段(Dh)或轉(zhuǎn)換片段(SH)內(nèi)(圖8)，而各種IgH伴侶基因座 內(nèi)的斷點(diǎn)可能散在分布于基因組序列的數(shù)百個(gè)Kb的區(qū)域內(nèi)。IgH易位的這些特征可被用 于設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)保守IgH斷點(diǎn)區(qū)所有斷點(diǎn)的一小組線性擴(kuò)增引物，也可用于設(shè)計(jì)以瓦片密 度代表多個(gè)IgH伴侶基因座的定制的高分辨率寡核苷酸陣列。本文所描述的實(shí)驗(yàn)性陣列代 表了包括CCND1和BCL2斷點(diǎn)區(qū)以及部分MYC和BCL6斷點(diǎn)區(qū)的總長(zhǎng)度約為1Mb的基因組序 列。IgH基因座包含遺傳重復(fù)是最近才發(fā)現(xiàn)的(Ravetch，Siebenlist等，Cell 27(3, Part 2) 583-591 ；Matsuda, Ishii 等，J. Exp. Med. 188 (11) 2151-2162 (1998))，因此未呈現(xiàn)在這 個(gè)實(shí)驗(yàn)性陣列上。包含特征已確定的IgH易位的一組8個(gè)淋巴瘤和骨髓瘤細(xì)胞系用于檢測(cè)和驗(yàn)證 tCGH，其中IgH易位涉及BCL2、BCL6、MYC和CCND1基因座。所有9種已知IgH易位都已 經(jīng)過鑒定并且以高分辨率進(jìn)行了定位，這些在以前是IgH伴侶基因座上未知的IgH-MYC重 排和多拷貝數(shù)異常。在VDJ相關(guān)的易位中，der(14)染色體上的IgH易位通常定位在6個(gè) JH片段中的一個(gè)片段上，而交互染色體上的斷點(diǎn)定位在27 片段中的一個(gè)片段上(van Dongen，Langerak 等，Leukemia 17(12) :2257_317 (2003))。JH 斷點(diǎn)及其交互 DH 伴侶利用單個(gè)共有JH引物或7種共有DH引物的等摩爾混合物通過線性擴(kuò)增分別鑒定(圖9)。例如，通 過tCGH分析淋巴瘤細(xì)胞系DHL16內(nèi)的典型平衡IgH-BCL2易位(Hecht，Epstein等，Cancer Genetics and Cytogenetics 14(3-4) :205 (1985))，結(jié)果顯示 JH_BCL2 和 BCL2_DH 交互融 合(分別顯示在圖10a和10b中)定位在BCL2微小易位簇上(van Dongen，Langerak等， Leukemia 17(12) :2257_317 (2003))。在對(duì)數(shù)熒光強(qiáng)度-比例散點(diǎn)圖上，JH和DH融合表現(xiàn) 為不對(duì)稱偽-擴(kuò)增子，包含單個(gè)區(qū)分邊界，以高分辨率清楚地顯示出了易位斷點(diǎn)。離斷點(diǎn)的 基因組距離越遠(yuǎn)，這個(gè)擴(kuò)增子的振幅越大，跨越數(shù)個(gè)Kb后回到基線水平。每一個(gè)擴(kuò)增子的 方向依賴于擴(kuò)增的方向利用JH引物則朝向端粒(圖10b)，利用Dh引物則朝向中心粒(圖 10b)。與此相反的是，每個(gè)擴(kuò)增子的振幅、寬度和形狀隨外部參數(shù)的變化而變化，其中包括 線性擴(kuò)增引物、擴(kuò)增條件以及可能的局部基因組序列。JjnDH引物也可用于定位伯基特淋巴瘤細(xì)胞系MC116內(nèi)的IgH_MYC融合(圖10f) 和外套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系M02058和Granta 519內(nèi)的IgH-CCNDl融合(圖13a，13d)。通過 混合等量的DHL16、RL7和Granta 519基因組DNA(被稱為“33%稀釋”)來確定tCGH的分 析敏感性，通過與正常基因組DNA混合制備20%和15%稀釋樣品。這些稀釋度的樣品用JH 引物擴(kuò)增12或20個(gè)循環(huán)，然后與同樣擴(kuò)增的正?；蚪MDNA共雜交。如圖17所示，每個(gè) 樣品中都可檢測(cè)到所有三種斷點(diǎn)，盡管擴(kuò)增12個(gè)循環(huán)時(shí)15%稀釋度所產(chǎn)生的信號(hào)弱于20 個(gè)循環(huán)。為了鑒相關(guān)的易位，設(shè)計(jì)出靶向到Sw、Sa 重復(fù)序列的交互SPF和SPR 擴(kuò)增引物，這些重復(fù)序列都包含五聚體序列(GRGCT)n(Mills，Brooker等，NucleicAcid Res. 18(24) 7305-16(1990))以及靶向到四種密切相關(guān)的SY重復(fù)序列的交互SYF和SYR 引物(Mills,Mitchell 等，J. Immunol. 155(6) :3021_3036 (1995))(表 3)。以 SYF 或 SYR 為 引物線性擴(kuò)增 0CI-Ly8 淋巴瘤細(xì)胞系(Tweeddale，Lim等，Blood 69(5) 1307-1314 (1987)， 結(jié)果鑒定出兩種Sy3-BCL6交互融合(圖1°C和10d)，其中只有一種是以前已經(jīng)鑒定和克隆 的(Ye，Chaganti 等，EMB0 J. 14 (24) 6207-17 (1995))。同樣，以 SPF 和 SYR 為引物線性擴(kuò)增 淋巴瘤細(xì)胞系U266(圖15)，結(jié)果鑒定出在一個(gè)約lOOKblgH恒定區(qū)片段的CCND1內(nèi)有一個(gè) 隱匿的插入片段，該片段從Sal延伸到SY4，其中包含3’ a 1增強(qiáng)子(Gabre^Bergsagel等， Molecular Cell 2⑴119(1999))。和以JH為引物的擴(kuò)增子一樣，利用SPF或SYF引物擴(kuò) 增出的那些擴(kuò)增子朝向端粒，對(duì)應(yīng)于如1~(14)-編碼的融合，而以5氺、5汴或011為引物的線 性擴(kuò)增可產(chǎn)生朝向中心粒的擴(kuò)增子，對(duì)應(yīng)于交互衍生染色體上的融合(圖9)。表3 令人意外的是，除了在0CI-Ly8內(nèi)鑒定出了已知的S Y3_BCL6易位之外，以S YR為引 物的擴(kuò)增還意外地檢測(cè)出了以前未被鑒定的Sy2-MYC融合(圖lie)。以前對(duì)0CI-Ly8進(jìn)行 的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子研究表明，在3、8、14和18號(hào)染色體上有涉及BCL6、MYC、IgH和BCL2 基因座的復(fù)雜重排(Farrugia，Duan 等，Blood 83(1) :191_198 (1994) ；Chang，Blondal 等， Leuk Lymphomal9(l-2) 165-71 (1995) ；Ye, Chaganti 等，EMBOJ. 14(24)6207-17 (1995)； Changanti, Rao 等，Genes Chromosomes and Cancer 23(4) :328_336 (1998)； 以 及 Sanchez-Izquierdo, Siebert 等，Leukemia 15(9) : 1475-84 (2001))，但是這 6 種潛在 IgH 融合產(chǎn)物中只有一種已被克隆和測(cè)序(Ye, Chaganti等，EMB0J. 14(24)6207-17(1995))。 通過tCGH分析在0CI-Ly8中總共鑒定出了 5種IgH融合，其中包含平衡Sy3_BCL6易位 (圖10)和Jh/Dh-BCL2易位(見下文和圖10)的交互融合產(chǎn)物以及明顯的平衡Sy2-MYC 重排(圖lie)。令人感興趣的是，0CI-Ly8內(nèi)的易位斷點(diǎn)序列具有幾種不常見的特征，其 中包括IgH-BCL2斷點(diǎn)上罕見的約6kb的大片段缺失(圖14)，IgH-MYC斷點(diǎn)位于SY3轉(zhuǎn) 換重復(fù)區(qū)之外，具有結(jié)合微同源性，這些都說明這些重排包含非常規(guī)機(jī)制(Jager，Bocskor 等，Blood 95(11) 3520-3529(2000) ； Shou, Martelli 等，PNAS 97(1) 228-233 (2000)； Corneo, Wendland 等，Nature 449(7161) :483_486 (2007)；以及 Yan，Boboila 等，Nature 449(7161)478-482(2007))。確實(shí)，隨后我們?cè)噲D利用JH、DH或SH線性擴(kuò)增引物鑒定交互 IgH-MYC融合，但是沒有成功，說明這些非常規(guī)IgH斷點(diǎn)或更復(fù)雜的重排涉及非IgH伴侶基 因座(Changanti, Rao 等，Genes Chromosomes and Cancer 23(4) :328_336 (1998))。一組MYC或BCL6基因重排不涉及IgH，但是涉及免疫球蛋白k和入輕鏈基因座 或者其他多種非 IgH 基因座(Akasaka，Akasaka 等，Cancer Res. 60(9) 2335-2341 (2000)； Shou, Martelli 等，PNAS 97(1) :228_233 (2000))。為 了證明 tCGH 能夠檢測(cè)這些基因座內(nèi) 的非IgH重排，我們使用了靶向到位于MYC和BCL6外顯子1附近的易位斷點(diǎn)熱區(qū)的線性 擴(kuò)增引物(Akasaka，Akasaka 等，Cancer Res. 60(9) :2335_2341 (2000) ；Busch，Keller 等， Leukemia 21 (8) =1739(2007) 0在對(duì)數(shù)-比例散點(diǎn)圖中，這些重排(圖10e，10i)的表現(xiàn)與 上述IgH重排一致，只是其方式是“倒置的”，這是利用線性擴(kuò)增引物在同一個(gè)基因座內(nèi)通 過tCGH進(jìn)行鑒定可以預(yù)料到的特征(圖7中的“基因A”)。這些試驗(yàn)說明tCGH可用于檢 測(cè)MYC和BCL6重排以及鑒定這些基因座內(nèi)的斷點(diǎn)，即使其重排伴侶是未知的或者是陣列上 所沒有的。實(shí)施例6 新型染色體重復(fù)和缺失的鑒定由于腫瘤和正?；蚪MDNA在線性擴(kuò)增和標(biāo)記后與同一個(gè)陣列共雜交(圖7)，因 此預(yù)計(jì)tCGH除了能檢測(cè)平衡重排以外還能檢測(cè)拷貝數(shù)的變化。確實(shí)，在BCL2和CCND1基因 座內(nèi)鑒定出了幾種以前未被認(rèn)識(shí)的與同一基因座上的IgH易位相關(guān)的缺失和重復(fù)。例如， 在RL7淋巴瘤細(xì)胞系內(nèi)，該細(xì)胞系包含已知的JH-BCL2易位，鑒定出了位于BCL2大內(nèi)含子 (190kb)內(nèi)的一個(gè)167kb的新型中間缺失(圖11a)。在0CI-Ly8內(nèi)也鑒定出了一個(gè)相似的 135kb的內(nèi)含子BCL2缺失，該缺失與Jh_BCL2斷點(diǎn)連接處的6. 2kb的缺失不同(圖13)。這 些異常都通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序進(jìn)行了確認(rèn)。在M02058和Granta 519內(nèi)鑒定出了一個(gè)涵蓋 CCND1基因并且精確延伸到各自Jh-CCND1斷點(diǎn)連接處的重復(fù)，說明所有重復(fù)事件都發(fā)生在 der(14)t(ll ； 14)染色體上(圖13)。在M02058內(nèi)還鑒定出了一個(gè)已知的位于CCND13，非翻
37譯區(qū)內(nèi)的 1852nt 的缺失(Withers，Harvey 等，Mol. Cell. Biol. 11(10) 4846-4853 (1991)) (圖13a)。最后，在CCND1基因上游約55kb處檢測(cè)到一個(gè)562nt的新型缺失多態(tài)性并對(duì)其 特征進(jìn)行了鑒定(圖12b)。tCGH對(duì)拷貝數(shù)變化的檢測(cè)不依賴于所使用的特定線性擴(kuò)增(圖 lla-c和圖14)。中間缺失的斷點(diǎn)也能通過跨越缺失斷點(diǎn)的線性擴(kuò)增進(jìn)行定位(圖11中的 圖 a、d、e)。在上述tCGH試驗(yàn)中，線性擴(kuò)增的腫瘤DNA與同樣擴(kuò)增的正?；蚪MDNA共雜交 (圖7)。當(dāng)以空白擴(kuò)增的腫瘤DNA而不是擴(kuò)增的正常DNA作為雜交對(duì)照時(shí)，預(yù)計(jì)tCGH只能 檢測(cè)到平衡重排而檢測(cè)不到拷貝數(shù)的變化(圖lid和圖16a和16b)。然而在這些條件下， 還可以觀察到遠(yuǎn)離預(yù)期易位斷點(diǎn)的“脫靶”擴(kuò)增，即使是正?；蚪MDNA。脫靶擴(kuò)增信號(hào)的 數(shù)目和模式依賴于線性擴(kuò)增引物，其表現(xiàn)比靶向到重復(fù)轉(zhuǎn)換序列的SH引物更復(fù)雜，但是脫 靶信號(hào)的模式對(duì)于任何給定的引物來說都是明顯可重現(xiàn)的(圖15和16)。當(dāng)腫瘤和正常 DNA使用相同引物進(jìn)行擴(kuò)增并與常規(guī)tCGH共雜交時(shí)(圖7)，兩個(gè)樣品的脫靶信號(hào)是完全匹 配的，因而可有效地互相遮蔽，只顯示靶向的易位斷點(diǎn)。t(ll ； 14)及相關(guān)的Jh_CCND1融合是外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)的特殊病癥。在約 40%的MCL病例中，CCND1斷點(diǎn)位于約lOOnt的主要易位簇(MTC)內(nèi)(van Dongen, Langerak 等，Leukemia 17(12) :2257_317 (2003))，而另外約60%的MCL病例包含非MTC斷點(diǎn)，這些 斷點(diǎn)散在分布于MTC兩側(cè)約400kb的區(qū)域內(nèi)(Vaandrager，Schuuring等，Blood 88(4) 1177-1182(1996))。與易于克隆和分析的 MTC 斷點(diǎn)不同(Wetzel，Le 等，Cancer Res. 61(4) 1629-1636 (2001))，研究顯示非MTC斷點(diǎn)比較難以克隆，只有極少幾個(gè)例子已被測(cè)序 (Meeker, Grimaldi 等，Blood 74(5) 1801-1806(1989) ；Meeker, Sellers 等，Leukemia 5(9) 733-7(1991) ；Willis，Jadayel 等，Blood 90(6) :2456_2464(1997)。為了確定 tCGH 是否能夠鑒定原發(fā)淋巴瘤樣品內(nèi)的新型斷點(diǎn)，我們分析了 5例包含非MTC斷點(diǎn)的原發(fā)MCL 病例。新型CCND1斷點(diǎn)都以lOOnt的分辨率進(jìn)行了定位(圖12)，能夠快速地確定和測(cè)序斷 點(diǎn)連接。斷點(diǎn)散在分布于CCND1基因中心粒一側(cè)的約150kb的區(qū)域內(nèi)，其中一個(gè)距離MTC 約 100bp。實(shí)施例6 用于檢測(cè)髓性白血病內(nèi)平衡易位的tCGH陣列的建立和驗(yàn)證本實(shí)施例說明了可用于檢測(cè)髓性白血病內(nèi)常見的染色體異常如平衡易位、染色體 缺失、染色體重復(fù)和染色體倒置的tCGH陣列的建立方法。我們構(gòu)建了包含14，262個(gè)探針 序列的微陣列，這些序列涵蓋了常被染色體異常如易位和大片段缺失打斷的11個(gè)基因，長(zhǎng) 度超過1. IMbp，平均間隔83nt (表4)。然后利用引物混合物(表5)線性擴(kuò)增分離自各種 髓性白血病細(xì)胞系的染色體DNA。擴(kuò)增的染色體序列與AML實(shí)驗(yàn)性陣列雜交來進(jìn)行tCGH分 析，如表4所示。表4 :AML實(shí)驗(yàn)性陣列內(nèi)的雜交探針?biāo)w的基因座和基因組區(qū)的鑒定
38 表5 髓性白血病的tCGH分析中多重線性擴(kuò)增染色體DNA所用的引物混合物 圖18顯示的是利用AML實(shí)驗(yàn)性陣列以MPM引物組合對(duì)三種慢性髓性白血病細(xì)胞 系CML1、CML2和K562進(jìn)行多重tCGH分析得到的結(jié)果。易位斷點(diǎn)在分析中清晰可見。該分 析還顯示在CML1白血病細(xì)胞系內(nèi)有一個(gè)大片段染色體缺失。這個(gè)實(shí)施例證明多重tCGH分 析可同時(shí)確定慢性髓性白血病相關(guān)的平衡BCR-ABL易位的基因型以及相關(guān)的染色體缺失 和擴(kuò)增。圖19顯示的是利用AML實(shí)驗(yàn)性陣列對(duì)兩個(gè)急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系 (APL1和APL2)進(jìn)行多重tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是在RARA基因內(nèi)有不同易位斷點(diǎn) 的PML-RARA平衡易位t (15 ；21)，以及利用髓性引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列對(duì)兩 個(gè)急性粒細(xì)胞單核細(xì)胞性白血病/嗜酸性粒細(xì)胞增多癥細(xì)胞系(M4Eol和M4Eo2)進(jìn)行多重 tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是由染色體倒置inv(16)/t(16 16)引起的MYH11-CBFB融 合。如本實(shí)施例中所見，多重tCGH分析可同時(shí)確定各種染色體異常的基因型，如平衡易位 和染色體倒位。圖20顯示的是利用P1/P7引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列對(duì)MLL白血病細(xì) 胞系進(jìn)行多重tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是AF9-MLL平衡易位t(9;ll)，以及利用821 引物混合物(MPM)和AML實(shí)驗(yàn)性陣列對(duì)卡蘇米(Kasumi)急性髓性白血病細(xì)胞系進(jìn)行多重 tCGH分析得到的結(jié)果，其特征是ET0-AML1平衡易位t (8 ；21)。本實(shí)施例證明多重tCGH可 用于分析多種染色體異常的基因型，其中包括平衡易位、染色體缺失、染色體重復(fù)和染色體 倒置。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所描述的實(shí)施例和實(shí)施方式只是為了說明的目的，本領(lǐng)域的 技術(shù)人員可對(duì)其進(jìn)行各種修改或改變，這些修改或改變也包括在本申請(qǐng)書的精神和范圍以 及附屬權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文所引用的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)都已完整納入本文 作為參考。
權(quán)利要求
一種確定待測(cè)樣品中已知基因座內(nèi)的染色體重排的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA；(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第一可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物；以及利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第二可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物；(c)將擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包含基因組DNA序列的微陣列雜交；以及(d)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度；其中，線性擴(kuò)增的待測(cè)樣品DNA產(chǎn)物與不同于已知基因座的DNA微陣列元件的雜交超過了線性擴(kuò)增的參照樣品DNA產(chǎn)物，則說明已知基因座與細(xì)胞內(nèi)的第二基因座發(fā)生了重排。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重排是染色體易位。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物在擴(kuò)增期間 摻入。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物在擴(kuò)增后摻入。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記物是Cy3和Cy5。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA微陣列是瓦片密度DNA微陣列。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述已知基因座對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白基因。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，參照細(xì)胞 是正常細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
11.一種鑒定待測(cè)樣品中已知基因座內(nèi)的染色體重排伴侶的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA；(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第一基因組DNA 樣品以產(chǎn)生包含第一可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物；以及利用已知基因座內(nèi)的已知 DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第二可檢測(cè)標(biāo)記物 的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物；(c)將標(biāo)記并擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包含基因組DNA序列的微陣列雜 交·’以及(d)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度； 其中，線性擴(kuò)增的待測(cè)樣品DNA產(chǎn)物與不同于已知基因座的DNA微陣列元件的雜交超過了線性擴(kuò)增的參照樣品DNA產(chǎn)物，則可以將DNA微陣列的元件鑒定為已知基因座的重排 伴侶。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述重排是染色體易位。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，所述方法還包括確定對(duì)應(yīng)于已知基因座線性序列的一系列元件中可與擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物雜交的最后一個(gè)元件，從而鑒定出已知基因座重排斷點(diǎn)大 概位置的步驟。
14.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法還包括確定對(duì)應(yīng)于不同于已知 基因座的第二基因座線性序列的一系列元件中可與擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物雜交的第一元件，從而 鑒定出重排伴侶重排斷點(diǎn)大概位置的步驟。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物在擴(kuò)增期 間摻入。
16.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物在擴(kuò)增后 摻入。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo) 記物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記物是Cy3和Cy5。
19.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述DNA微陣列是瓦片密度DNA微陣列。
20.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述已知基因座對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白基因。
21.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，參照細(xì) 胞是正常細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
23.—種同時(shí)確定待測(cè)樣品中已知基因座內(nèi)的染色體重排，其中包括染色體易位，的方 法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA；(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第一基因組DNA以產(chǎn)生 待測(cè)基因組DNA和引物特異性的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物的混合物；以及利用相同的已知基因 座樣品內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第二基因組DNA以產(chǎn)生參照基因組DNA和 引物特異性的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物的混合物；(c)通過以寡核苷酸為引物的聚合酶介導(dǎo)的延伸反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)增和標(biāo)記待測(cè)樣品和參 照樣品的混合物；(d)將標(biāo)記并擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包含基因組DNA序列的微陣列雜 交；以及(e)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度；其中(i)當(dāng)擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物和參照DNA產(chǎn)物都與DNA微陣列的元件雜交，但是前者的強(qiáng) 度高于后者時(shí)，說明待測(cè)樣品內(nèi)微陣列元件所代表的DNA序列得到了擴(kuò)增；(ii)擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列元件的雜交強(qiáng)于擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物與DNA微 陣列元件的雜交則說明待測(cè)樣品內(nèi)微陣列元件所代表的DNA序列發(fā)生了缺失；以及(iii)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物與不同于已知基因座的DNA微陣列元件的雜交強(qiáng)于擴(kuò)增的參照 DNA產(chǎn)物與DNA微陣列元件的雜交則說明已知基因座與細(xì)胞內(nèi)的第二基因座發(fā)生了易位。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物在擴(kuò)增期 間摻入。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物在擴(kuò)增后摻入。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo) 記物。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述熒光標(biāo)記物是Cy3和Cy5。
28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述DNA微陣列是瓦片密度DNA微陣列。
29.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述已知基因座對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白基因。
30.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，參照細(xì) 胞是正常細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
32.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品和參照樣品包含相同的基 因組DNA，待測(cè)樣品而不是參照樣品用于進(jìn)行(b)部分的線性擴(kuò)增步驟。
33.如權(quán)利要求1、11或23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一和第二可檢測(cè) 標(biāo)記物是相同的，擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物和參照DNA產(chǎn)物與兩個(gè)相同的微陣列雜交，或者與同 一個(gè)微陣列先后雜交。
34.一種確定待測(cè)樣品中染色體重排的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA；(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以 產(chǎn)生擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物(T+)；利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò) 增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物(N+)；去除已知基因座內(nèi)的已知 DNA序列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生空白待測(cè)DNA產(chǎn)物(T-)； 去除已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生 空白參照DNA產(chǎn)物(N-)；(c)利用隨機(jī)引物通過引物延伸用不同的可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記T+、N+、T-和N-；(d)T+和N+與包含基因組DNA序列的第一 DNA微陣列共雜交；(e)T-和N-與包含基因組DNA序列的第二 DNA微陣列共雜交；(f)將第一DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式和強(qiáng)度與第二 DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式 和強(qiáng)度進(jìn)行比較，其中第一微陣列上雜交信號(hào)對(duì)染色體位置的散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)呈直角三角形模式，而 第二微陣列上未出現(xiàn)類似模式，則表明染色體易位，直邊的染色體位置標(biāo)記了染色體易位 斷點(diǎn)；以及其中在第一微陣列和第二微陣列相同位置上雜交信號(hào)對(duì)染色體位置的散點(diǎn)圖上雜交 信號(hào)都呈現(xiàn)矩形模式則表明染色體重復(fù)或缺失，直邊的染色體位置標(biāo)記了重復(fù)或缺失的基 因組區(qū)域的兩個(gè)端點(diǎn)，從而可以確定待測(cè)樣品內(nèi)的染色體重排。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生T-和N-的空白擴(kuò)增不包含擴(kuò)增。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述染色體重排是染色體易位。
37.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
38.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述DNA微陣列是瓦片密度DNA微陣列。
39.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述已知基因座對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白基因。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，參照細(xì) 胞是正常細(xì)胞。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
42.一種確定待測(cè)樣品中染色體重排的方法，該方法包括(a)從待測(cè)樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA；(b)利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以 產(chǎn)生擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物(T+)；利用已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò) 增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物(N+)；去除已知基因座內(nèi)的已知 DNA序列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第一基因組DNA樣品以產(chǎn)生空白待測(cè)DNA產(chǎn)物(T-)； 去除已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物空白線性擴(kuò)增第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生 空白參照DNA產(chǎn)物(N-)；(c)利用隨機(jī)引物通過引物延伸用不同的可檢測(cè)標(biāo)記物標(biāo)記T+、N+、T-和N-；(d)T+和T-與包含基因組DNA序列的第一 DNA微陣列共雜交；(e)N+和N-與包含基因組DNA序列的第二DNA微陣列共雜交；(f)將第一DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式和強(qiáng)度與第二 DNA微陣列上雜交信號(hào)的模式 和強(qiáng)度進(jìn)行比較，其中第一微陣列上雜交信號(hào)對(duì)染色體位置的散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)呈直角三角形模式，而 第二微陣列上未出現(xiàn)類似模式，則表明染色體易位，直邊的染色體位置標(biāo)記了染色體易位 斷點(diǎn)；以及其中雜交信號(hào)對(duì)染色體位置的散點(diǎn)圖上雜交信號(hào)的模式在第一微陣列和第二微陣列 上相同則說明是假斷點(diǎn)，從而可以確定待測(cè)樣品內(nèi)的染色體重排。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述重排是易位。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
45.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述DNA微陣列是瓦片密度DNA微陣列。
46.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述已知基因座對(duì)應(yīng)于免疫球蛋白基因。
47.如權(quán)利要求42所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品的細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞，參照細(xì) 胞是正常細(xì)胞。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞是淋巴瘤或白血病。
49.一種診斷對(duì)象的疾病的方法，所述疾病是由染色體重排造成的，該方法包括以下步驟(a)從對(duì)象獲取生物樣品；(b)從生物樣品的細(xì)胞分離第一基因組DNA，從參照樣品的細(xì)胞分離第二基因組DNA；(c)利用疾病相關(guān)的已知基因座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第一 基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第一可檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物；以及利用已知基因 座內(nèi)的已知DNA序列的特異性引物線性擴(kuò)增和標(biāo)記第二基因組DNA樣品以產(chǎn)生包含第二可 檢測(cè)標(biāo)記物的擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物；(d)將擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及參照DNA產(chǎn)物和包含基因組DNA序列的微陣列雜交；以及(e)比較擴(kuò)增的待測(cè)DNA產(chǎn)物及擴(kuò)增的參照DNA產(chǎn)物與DNA微陣列雜交的模式和強(qiáng)度； 其中線性擴(kuò)增的待測(cè)樣品DNA產(chǎn)物與不同于已知基因座的DNA微陣列元件的雜交超過 了線性擴(kuò)增的參照樣品DNA產(chǎn)物，則可以將DNA微陣列的元件鑒定為已知基因座的重排伴 侶，重排伴侶的一致性為對(duì)象疾病的診斷提供了依據(jù)。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述重排是易位。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌癥。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述癌癥是淋巴瘤或白血病。
53.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述已知基因座是免疫球蛋白。
54.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述重排伴侶是MYC。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述淋巴瘤是伯基特淋巴瘤。
56.一種用于檢測(cè)染色體重排的方法，該方法包括以下步驟(a)擴(kuò)增靶基因座；(b)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸陣列雜交；以及(c)與參照比較所述雜交模式，其中所述擴(kuò)增是線性擴(kuò)增，以及其中與參照相比擴(kuò)增的基因座的雜交出現(xiàn)不同則說明存在基因組重排。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述染色體重排是平衡染色體重排
58.一種檢測(cè)平衡染色體易位的方法，該方法包括以下步驟(a)擴(kuò)增靶基因座；(b)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物與核酸陣列雜交；以及(c)與參照比較所述雜交模式，其中所述擴(kuò)增是線性擴(kuò)增，以及其中存在直角三角形雜交模式則說明存在平衡染色體重排。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述方法包括多重線性擴(kuò)增。
60.如權(quán)利要求56或59中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在單個(gè)試驗(yàn)中檢測(cè)多個(gè)基因組基因座。
61.如權(quán)利要求56-60中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用了一群線性擴(kuò)增引物。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述引物群包含擴(kuò)增基因座所用的引物， 該基因座參與疾病相關(guān)的平衡易位。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌癥。
64.如權(quán)利要求62所述的方法，其特征在于，所述癌癥是淋巴瘤或白血病。
65.如權(quán)利要求61所述的方法，其特征在于，所述引物群選自MPM混合物、821混合物、 P1/P7混合物以及011引物群。
66.如權(quán)利要求56-65中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述核酸陣列是包含與一組 基因座雜交的探針的高密度瓦片陣列。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述一組基因座中至少有一個(gè)是與疾病 相關(guān)的基因座。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述疾病是癌癥。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其特征在于，所述癌癥是淋巴瘤或白血病。
70.如權(quán)利要求56-69中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述陣列是AML實(shí)驗(yàn)性陣列。
71.如權(quán)利要求56-70中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括檢測(cè)第二染 色體重排。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其特征在于，所述第二染色體重排選自如下一組重 復(fù)、擴(kuò)增、缺失、倒置、平衡易位和不平衡易位。
73.如權(quán)利要求56-72中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)易位的兩 個(gè)伴侶基因座。
74.—種診斷或預(yù)后個(gè)體的淋巴瘤的方法，該方法包括檢測(cè)所述個(gè)體的生物樣品內(nèi)的 IgH易位，其中所述IgH伴侶染色體斷點(diǎn)是選自表2所列的那些。
75.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述易位是平衡易位。
76.如權(quán)利要求74或75所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)是通過PCR、測(cè)序、質(zhì)譜、雜 交或tCGH分析進(jìn)行的。
77.一種用于檢測(cè)平衡染色體易位的試劑盒，該試劑盒包含(a)線性擴(kuò)增參與易位的基因座所用的引物；以及(b)用于檢測(cè)所述引物擴(kuò)增的產(chǎn)物的陣列。
78.如權(quán)利要求77所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含一群用于線性擴(kuò)增參 與易位的基因座的引物。
79.如權(quán)利要求77或78所述的試劑盒，其特征在于，所述基因座與疾病相關(guān)。
80.如權(quán)利要求79所述的試劑盒，其特征在于，所述疾病是癌癥。
81.如權(quán)利要求80所述的試劑盒，其特征在于，所述癌癥是淋巴瘤或白血病。
82.一種用于通過tCGH分析與疾病相關(guān)的染色體重排的陣列。
83.如權(quán)利要求82所述的陣列，其特征在于，所述陣列包含一群特異于至少兩個(gè)基因 座的探針，其中所述基因座參與疾病相關(guān)的染色體重排。
84.如權(quán)利要求82或83所述的陣列，其特征在于，所述至少一個(gè)與疾病相關(guān)的重排是 平衡易位。
85.如權(quán)利要求82-84中任一項(xiàng)所述的陣列，其特征在于，所述疾病是淋巴瘤或白血病。
86.如權(quán)利要求82-85中任一項(xiàng)所述的陣列，其特征在于，所述陣列所檢測(cè)的至少一個(gè) 基因座選自表2和表4所列的那些基因座。
87.如權(quán)利要求86所述的陣列，其特征在于，所述陣列包含與表2所列的基因座雜交的 探針。
88.如權(quán)利要求86所述的陣列，其特征在于，所述陣列包含與表4所列的基因座雜交的 探針。
89.一種用于計(jì)算機(jī)程序Tile的寡核苷酸篩選算法。
全文摘要
本說明書公開了利用比較基因組雜交對(duì)各種疾病相關(guān)的染色體重排進(jìn)行檢測(cè)和定位的方法。方法包括鑒定已知基因座的易位伴侶和確定易位斷點(diǎn)。這些方法可用于有染色體重排參與的疾病的預(yù)后、診斷以及易感性的確定。
文檔編號(hào)C12P19/34GK101918831SQ200880124084
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月8日
發(fā)明者H·A·格賴斯曼 申請(qǐng)人:華盛頓大學(xué)