專利名稱：：合酶抑制劑篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及宿主細胞的選擇，其在特定的生長條件下表達目的活性酶；在這些條件下，不表達活性酶的細胞不能生長。細胞中至少一種必需組分的合成受到向生長培養(yǎng)基加入的一種或多種合成抑制劑抑制，所以如果產(chǎn)生目的活性酶，必需組分只能由宿主細胞從培養(yǎng)基獲得。
背景技術(shù)：
：商業(yè)的酶生廠者的目標是能進行快速而簡單的選擇方法，用于鑒定表達目的活性酶的那些宿主細胞。存在公開各種篩選方法的很多出版物，但是提供用于實際選擇的方法的很少。大多數(shù)基于選擇的方法傳統(tǒng)地使用抗生素抗性標記物。對改進的選擇方法的需要一直存在。發(fā)明概述在第一方面，本發(fā)明涉及用于選擇分泌一種或多種目的活性酶的至少一種宿主細胞的方法，所述方法包括如下步驟a)提供包含一種或多種合酶抑制劑的生長培養(yǎng)基，該抑制劑抑制宿主細胞中至少一種必需化合物的合成，并且進一步包括一種或多種組分，其在存在一種或多種目的活性酶的情況下可轉(zhuǎn)化為至少一種必需化合物，從而允許宿主細胞生長；b)在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或其上培養(yǎng)宿主細胞；和c)選擇能在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或其上生長的至少一種宿主細胞，所述宿主細胞分泌一種或多種目的活性酶。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及用于選擇分泌一種或多種目的活性酶的至少一種宿主細胞的方法，所述方法包括如下步驟a)提供包含一種或多種合酶抑制劑的生長培養(yǎng)基，該抑制劑抑制宿主細胞中至少一種必需化合物的合成，并且進一步包括一種或多種組分，其在存在一種或多種目的活性酶的情況下可轉(zhuǎn)化為至少一種必需化合物，從而允許宿主細胞生長；b)在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或其上培養(yǎng)宿主細胞；和c)選擇能在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或其上生長的至少一種宿主細胞，所述宿主細胞分泌一種或多種目的活性酶。宿主細胞本發(fā)明還涉及重組宿主細胞。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細胞，使載體如前所述作為染色體整合體或自復(fù)制的染色體外載體而保持。術(shù)語“宿主細胞”包括親本細胞的任何后代，其可由于復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細胞。宿主細胞的選擇很大程度上依賴于編碼多肽的基因及其來源。4宿主細胞可以是可用于本發(fā)明的多肽的重組生產(chǎn)的任何細胞，例如，原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括，但不限于，芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)和海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)。革蘭氏陰性細菌包括，但不限于，大腸桿菌(E.coli)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)禾口脲原體屬(Ureaplasma)。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的芽孢桿菌屬細胞包括，但不限于，嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽抱桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽抱桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽抱桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)禾口蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是解淀粉芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是克勞氏芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是地衣芽孢桿菌細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是枯草芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的鏈球菌屬細胞包括，但不限于，似馬鏈球菌(Sti^ptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(Sti^ptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)禾口馬鏈球菌獸癌亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是似馬鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是釀膿鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是乳房鏈球菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。可用于實施本發(fā)明的鏈霉菌屬細胞包括，但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)和淺青紫鏈霉菌(Sti^ptomyceslividans)細胞。在一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是除蟲鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是天藍色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是灰色鏈霉菌細胞。在另一個優(yōu)選的方面，細菌宿主細胞是淺青紫鏈霉菌細胞。宿主細胞也可以是真核細胞，比如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個優(yōu)選的方面，宿主細胞是真菌細胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄗ幽揖T(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi，第8版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢^^^(mitosporiefungi)(Hawksworth等，1995,)。在一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是酵母細胞。“酵母”用在本文包括產(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來可能改變，就本發(fā)明而言，將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner，F(xiàn).A.，Passmore,S.Μ.，禾口Davenport，R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個甚至更優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是念珠菌屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)細胞。在一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，酵母宿主細胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細胞。在另一個更優(yōu)選的方面，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(Eumycota)和卵菌門(OOmycota)亞門(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養(yǎng)生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養(yǎng)生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬賭菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、Filibasidium、鍵抱屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、_包M(Magnaporthe)、^；βM(Mucor)>^βM(Myceliophthora)、f考瑪月旨霉屬(Neocallimastix)、脈孢菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、栓菌屬6(Trametes)或木霉屬(Trichoderma)細胞。在一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、漂曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是桿孢狀,廉抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫威德抱(Fusariumcrookwellense)、大刀德抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖,廉抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱,廉抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色德抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱德抱(Fusariumtrichothecioides)或鑲片鐮孢(Fusariumvenenatum)細胞。在另一個最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細胞是黑剌煙管菌(Bjerkanderaadusta)、干擬錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、干擬錯菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲擬錯菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角質(zhì)金抱子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)、米漂毛霉(Mucormiehei)、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、福身寸身寸脈菌(Phlebiaradiata)、朿Ij序側(cè)耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、長絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningji)、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)細胞。目的活件酶本發(fā)明的活性酶可以是獲得自任何屬的微生物的多肽酶。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來源相關(guān)的術(shù)語“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來源產(chǎn)生，或由其中插入了來自所述來源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在另一個優(yōu)選的實施方案中，獲得自給定來源的多肽是胞外分泌的。在一個優(yōu)選的實施方案中，目的活性酶是異源或同源的。本發(fā)明具有酶活性的多肽可以是細菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽性細菌多肽如芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬或海洋芽孢桿菌屬多肽，所述多肽具有酶活性；或革蘭氏陰性細菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬或脲原體屬多肽，其具有酶活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌或馬鏈球菌獸瘟亞種多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍色鏈霉菌、灰色鏈霉菌或淺青紫鏈霉菌多肽。本發(fā)明具有酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如念珠菌屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬多肽，其具有酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬、傘草屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬、短梗霉屬、Botryospaeria、擬賭菌屬、毛_殼屬(Chaetomidium)、金孢子菌屬、麥角菌屬(Claviceps)、方寵抱腔菌屬(Cochliobolus)、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)>HlAlifM(Cryphonectria)、β急球菌屬、色二包屬(Diplodia)>瓣菌屬(Exidia)、Filibasidium,鐮孢屬、赤霉菌屬(Gibberella)、全鞭毛蟲屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霄屬、奉巴齒菌屬(Irpex)、香屬(Lentinula)>Leptospaeria>梨孢菌屬、Melanocarpus、多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、瘤胃壺菌屬、Poitrasia、假黑盤菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、牛艮毛霉屬(Rhizomucor)、裂裙菌屬、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬、嗜熱霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、木霉屬、長毛盤菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、草菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，其具有酶活性。在一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母多肽。在另一個優(yōu)選的方面，所述多肽是具有酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、嗜角質(zhì)金孢子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、粗金抱子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、桿包狀包、禾谷包、庫成包、大刀包、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、白耙齒菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌、Thielaviaachromatica>Thielaviaalbomyces>Thielaviaalbopilosa>yjfl^(Thielaviaaustraleinsis)>Thielaviafimeti、小抱梭抱殼(Thielaviamicrospora)、卵抱梭抱^(Thielaviaovispora)>Thielaviaperuviana^Thielaviaspededoriium、€■f包冑(Thielaviasetosa)>Thielaviasubthermophila、_zht—胃、Ρ^^β/^^Κβ、"^!^木霉、里氏木霉或綠色木霉多肽?？衫斫獾氖菍τ谇笆龅姆N，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學的等同物(equivalent)，例如無性型(anamorph)，而無論它們已知的種名。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將容易地識別適合的等同物的身份(identity)。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏中心對于公眾能夠容易地得到，所述保藏中心諸如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。此外，可以使用上述的探針從其它來源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫來獲得所述多核苷酸。一旦用探針檢測到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過將編碼另一個多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們符合讀框(inframe)，并且使融合多肽的表達處于相同啟動子和終止子的控制下。融合多肽可以進一步包括切割位點。一旦分泌了融合蛋白質(zhì)，就切割所述位點，從融合蛋白質(zhì)釋放具有酶活性的多肽。切割位點的實例包括，但不限于，編碼二肽Lys-Arg的Kex2位點(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568_76；Svetina，2000，J.Biotechnol.76245-251；Rasmussen-Wilson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488_3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498_503；和Contreras等，1991，Biotechnology9:378_381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點，其在精氨酸殘基后通過FactorXa蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505_512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點，其在賴氨酸后通過腸激酶切割(Collins-Racie等，1995，Biotechnology13:982_987)；His-Tyr-Glu位點或His-Tyr-Asp位點，其通過GenenaseI切割(Carter等，1989,ProteinsStructure,Function,andGenetics6:240_248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點，其在Arg后通過凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld435-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點，其在Gln后通過TEV蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點，其在Gln后通過基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見上文)。此外，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，目的活性酶是裂合酶、連接酶、水解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或異構(gòu)酶，并且更優(yōu)選地，酶是淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶或植物細胞壁降解酶，并且更優(yōu)選地，具有活性的酶選自下組氨肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡糖苷酶、商素過氧化氫酶、半纖維素酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、脂肪酶、裂合酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠酶、過氧化物酶、肌醇六磷酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷酰胺酶或木聚糖酶。9脂肪酶的詵擇可以使用任何脂肪酸合酶抑制劑選擇可分泌活性脂肪分解酶的轉(zhuǎn)化體，所述抑制劑如，三氯生(triclosan)、淺藍菌素(cerulenin)、硫乳霉素(thiolactomycin)或diazaborin。脂肪分解酶可以是對于底物(如三甘油酯脂質(zhì)、磷脂、半乳糖酯)中的酯鍵有活性的任何羧基-酯酶。蛋白酶的詵擇可以使用任何氨基酸合酶抑制劑選擇可分泌活性蛋白水解酶的轉(zhuǎn)化體，所述抑制劑如，5-硝基-2-苯并咪唑啉酮(5-nitro-2-benzimidazolinone)、草甘膦(glyphosate)、羧基甲氧基胺(carboxymethosylamin)、0-烯丙基羥胺(0_allylhydroxylamine)、吲哚丙烯酸(imidazolinones)、0-(羧甲基)羥胺半鹽酸鹽(0-(carboxymethyl)hydroxylaminehemihydrochloride)、咪唑啉酮(imidazolinones)或磺酉先脲(sulfonylurea)。通過力口入氨基酸也可以抑制氨基酸合成。例如由于氨基酸合成途徑的反饋抑制，大腸桿菌能通過加入酪氨酸和苯丙氨酸而對于色氨酸產(chǎn)生饑餓，這對于三種氨基酸很常見。蛋白水解酶可以是對于任何類型的肽鍵都有活性的任何蛋白酶。糖酶的詵擇可以使用任何抑制劑選擇可分泌活性糖酶的轉(zhuǎn)化體，所述抑制劑如，針對葡萄糖-6-磷酸酶的木白斯他汀(Mumbaistatin)、根皮素(phloretin)、磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate)、theilavinA或2-羥基-5-硝基苯甲醛(2-hydroxy-5-nitrobenzaldehyde)；或針對果糖1，6二磷酸酶的2，3-二氫-IH-環(huán)戊[b]喹啉(2，3-dihydro-lH-cyclopenta[b]quinoline)；或針對葡糖胺_6P_合酶的氨基連三唑(amitrole)或aptamine。糖酶可以是切割糖中的鍵釋放例如葡糖胺_6P、葡萄糖或6_磷酸果糖的任何酶。DNA導(dǎo)入可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111_115)，使用感受態(tài)細胞(參見，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823_829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209_221)，電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742_751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5771—5278)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166557-580)或電穿孔(參見，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見，例如，Gong等，2004，F(xiàn)oliaMicrobiol.(Praha)49:399_405)，接合(參見，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583_3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98=6289-6294)?？赏ㄟ^如下方法實現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細胞例如電穿孔(參見，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51_57)。可通過如下方法實現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見，例如，Perry和Kuramitsu，1981，Infect.Immun.321295-1297)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68189-207)，電穿孔(參見，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.653800-3804)或接合(參見，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45409-436)。然而，可以使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入宿主細胞的任何方法?？梢詫⒄婢毎ㄟ^涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA811470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147_156和WO96/00787描述。可以使用由如下文獻描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182—187,AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o因此，在一個優(yōu)選的實施方案中，將宿主細胞轉(zhuǎn)化；優(yōu)選用包含至少一個編碼一個或多個目的酶的多核苷酸的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細胞。多核苷酸構(gòu)津體術(shù)語“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛聿淮嬖谟?nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段，或者所述核酸分子是合成的。當所述核酸構(gòu)建體含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時，術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語“表達盒”同義。術(shù)語“調(diào)控序列”在本文定義為包括對編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達是必需的或有利的所有組分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點的接頭一起提供，所述特異性限制位點促進調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接。術(shù)語“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對于多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達。術(shù)語“表達”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。術(shù)語“表達載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達的額外核苷酸可操作地連接。如本文中所使用的術(shù)語“宿主細胞”包括任何細胞類型，所述細胞類型對于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)0術(shù)語“修飾”在本文的意思是，對活性酶多肽或其同源序列的任何化學修飾，以及對編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個或多個(幾個)氨基酸側(cè)鏈的置換。優(yōu)選地，氨基酸改變對性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如11氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變凈電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)0保守取代的實例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。除了20個基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上能夠獲得的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3_和4_甲基脯氨酸，和3，3_二甲基脯氨酸。可供選擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變法(Cunningham和Wells，1989，Science2441081-1085)來鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個殘基，并且測試所得突變分子的生物活性(即，酶活性)以鑒定對于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見Hilton等，1996，J.Biol.Chem.2714699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過結(jié)構(gòu)的物理分析而測定，如通過以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學、電子衍射或光親和標記，連同推定的接觸位點氨基酸的突變來測定。參見例如deVos等，1992，Science255:306_312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必需氨基酸的身份也能夠從與多肽的同一性分析來推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾口Sauer，1988，Science24153-57；Bowie禾口Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862152-2156；W095/17413；或WO95/22625公開的那些方法來進行并測試單個或多個氨基酸取代、缺失和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.3010832-10837；美國專利號5，223，409；W092/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46145；Ner等，1988，DNA7127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動化的篩選方法組合以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893_896)。能夠從宿主細胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標準方法快速測序。這些方法允許快速測定感興趣的多肽中單個氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。本發(fā)明還涉及包含編碼本發(fā)明活性酶的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個或多個(幾個)調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以提供多肽的表達。依賴于表達載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對其進行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^例如使用熟知的聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)或表達文庫的抗體篩選來檢測具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆DNA片段，從而實現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U增方法，如連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(ligatedactivatedtranscription；LAT)和基于核苷酸序列的擴增(NASBA)?？梢詮纳鲜鼍曛?，或其它或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。調(diào)控序列可以是適當?shù)膯幼有蛄?，其是由用于表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細胞識別的核苷酸序列。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽的表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動子可以是在所選的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動子，并且可以從編碼與宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下述獲得的啟動子大腸桿菌Iac操縱子、天藍色鏈霉菌(Str印tomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727_3731)，以及tac啟動子(DeBoer等，1983，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21-25)。另外的啟動子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"于ScientificAmerican,1980,242:74_94中；禾口在Sambrook等，1989，見上文中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動子的實例是從下列酶的基因獲得的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動子(來自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對于酵母宿主細胞其它有用的啟動子由Romanos等，1992，Yeast8:423_48描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，是由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對于酵母宿主細胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對于酵母宿主細胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對于宿主細胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對于酵母宿主細胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時，宿主細胞將其識別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號。可以將在所選宿主細胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對于絲狀真菌宿主細胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，1995，MolecularCellularBiology15:5983_5990描述。調(diào)控序列還可以是信號肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進入細胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號肽編碼序列，其與編碼分泌多肽的編碼序列的區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中?？晒┻x擇的是，編碼序列5’端可含有對于所述編碼序列外源的信號肽編碼序列。外源信號肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號肽編碼序列時可為必需的?；蛘撸庠葱盘栯木幋a序列可以簡單地取代天然信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達的多肽進入所選宿主細胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶14(nprT,nprS,nprM)、克勞氏芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprH)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號肽由Simonen和Palva,1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對于酵母宿主細胞有用的信號肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號肽編碼序列由Romanos等，1992，見上文描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前多肽通常是無活性的并且能夠通過前肽的催化或自催化切割從前多肽轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當信號肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時，將前肽序列置于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且將信號肽序列置于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對于宿主細胞的生長來調(diào)節(jié)多肽的表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實例是引起基因表達響應(yīng)化學或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實例是那些允許基因擴增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列將與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達載體本發(fā)明還涉及重組表達載體，所述重組表達載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達載體，所述表達載體可以包括一個或多個(幾個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來表達本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達載體的過程中，將編碼序列置于載體中，使該編碼序列與適當?shù)谋磉_調(diào)控序列可操作地連接。重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?，其能夠方便地進行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當被引入宿主細胞中時，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨的載體或質(zhì)?；騼蓚€或更多個載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。15本發(fā)明的載體優(yōu)選地含有一個或多個(幾個)選擇性標記，其允許簡單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細胞。選擇性標記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細菌選擇性標記的實例是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標記，所述抗生素抗性例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對于酵母宿主細胞合適的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞的選擇性標記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細胞基因組或載體在細胞中獨立于基因組的自主復(fù)制。為了整合入宿主細胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過同源重組整合入宿主細胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對，優(yōu)選400至10，000堿基對，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對，其與相應(yīng)的目標序列具有高度同一性以增強同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細胞基因組中的目標序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過非同源重組整合到宿主細胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所述的宿主細胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細胞中發(fā)揮功能。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細菌復(fù)制起點的實例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點。用于酵母宿主細胞中的復(fù)制起點的實例是2微米復(fù)制起點，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細胞中有用的復(fù)制起點的實例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch159163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)?；蜉d體能夠根據(jù)公開于WO00/24883中的方法完成。可以將多于一個拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過如下方法獲得將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組，或?qū)⒖蓴U增的選擇性標記基因包括于多核苷酸，其中可通過在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇性標記基因的擴增拷貝并由此含有多核苷酸的額外拷貝的細胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等，1989，見上文)。合酶抑制劑在本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案中，一個或多個合酶抑制劑包括可抑制至少一種氨基酸和/或至少一種脂肪酸合成的抑制劑；優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括5-硝基-2苯并咪唑啉酮，草甘膦，羧基甲氧基羥胺，羧基甲氧基胺，0-烯丙基羥胺，吲哚丙烯酸，0_(羧甲基)羥胺半鹽酸鹽，咪唑啉酮或磺酰脲；更優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括可抑制甲硫氨酸合成的抑制劑，優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括羧基甲氧基羥胺；并且更優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括三氯生，淺藍菌素，硫乳霉素或diazaborin。在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選的實施方案中，一個或多個合酶抑制劑包括可抑制葡萄糖-6-磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括根皮素，磷酸吡哆醛，theilavinA,2_羥基5-硝基苯甲醛或木白斯他汀。在本發(fā)明第一方面的另一個優(yōu)選的實施方案中，一個或多個合酶抑制劑包括可抑制葡糖胺-6P合酶的抑制劑；優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括氨基連三唑或Aptamine。另一個優(yōu)選的實施方案涉及本發(fā)明第一方面的方法，其中一個或多個合酶抑制劑包括可抑制果糖1，6二磷酸酶的抑制劑；優(yōu)選地，一個或多個合酶抑制劑包括2，3_二氫-IH-環(huán)己[b]喹啉。實施例實施例1轉(zhuǎn)化體的選擇這個實施例的目的是證明轉(zhuǎn)化體的選擇，其在特定的生長條件下表達目的活性酶；在這些條件下不表達活性酶的轉(zhuǎn)化體不能生長。細胞中至少一個必需組分的合成受到向生長培養(yǎng)基中加入的一個或多個合成抑制劑的抑制，因此如果產(chǎn)生目的活性酶，必需組分只能由宿主細胞從培養(yǎng)基獲得。質(zhì)粒PENI3659的構(gòu)建質(zhì)粒pENI3659是pENI3420的進一步發(fā)展。質(zhì)粒pENI3420包含來自曲霉屬的中性淀粉酶2啟動子，其在酵母中產(chǎn)生基因表達。質(zhì)粒為pYES2.O的衍生物，其可以在酵母中復(fù)制并能通過ura3篩選而進行選擇。使用PENI3420作為模板，寡核苷酸180804L1(10微摩爾)、180804L2(0.1微摩爾)和180804L3(10微摩爾)，使用PWO聚合酶，按照生產(chǎn)商(Roche)的推薦，進行PCR。180804L1:aagggatcctcgaggtaccacgcgtgaattcactagtgcatgcaagctt(SEQIDNO1)180804L2:gtcaccctctagatctcgacttaattaagcttgcatgcactagtgaat(SEQIDNO2)180804L3:gttccggttacctttgcggataag(SEQIDNO3)用限制性酶BamHI和BstEII切割質(zhì)粒pENI3420和產(chǎn)生的PCR片段。從瓊脂糖凝膠純化切割的載體pENI3420和切割的PCR片段，連接并轉(zhuǎn)化進入大(Sambrook禾口尺ussell:Molecularcloning-alaboratorymanual2001ColdspringHarborlaboratorypressNY)。制備質(zhì)粒制備物并測序。正確的克隆在啟動子之前包含多個連接頭位點，從而使其適合于克隆理想的基因。質(zhì)粒dENI2419的構(gòu)建使用WO92/05249Al(NovozymesA/S)中公開的質(zhì)粒pAHL為模板，并使用寡聚物01igo21350，如WO97/04079Al(NovozymesA/S)中所示構(gòu)建質(zhì)粒pENI2419。01igo21350:gaacccttgtccccgtccggcgacgagacatcgtgaagatagaaggc(SEQIDNO4)質(zhì)粒DENI3791的構(gòu)建用BamHI/XhoI切割質(zhì)粒pENI2419，并將包含脂肪酶基因的片段克隆入用BamHI/XhoI切割的質(zhì)粒pENI3659，從而產(chǎn)生pENI3791。質(zhì)粒DENI4158的構(gòu)建使用PWO聚合酶進行兩個PCR反應(yīng)模板pENI2419。寡聚物Oligo170904L1和Oligo190804L1模板pENI3420。寡聚物Oligo190804L2和0603002jl從瓊脂糖凝膠分離并純化兩個PCR片段，并使用PWO聚合酶用于第三個PCR反應(yīng)中模板來自PCR反應(yīng)a)和b)的PCR片段，連同寡聚物Oligo170904L1和060302jl。170904L1:ccatttcactactattatgc(SEQIDNO5)190804L1:ctcggggaggtctcgcaggatctgtt(SEQIDNO6)190804L2:gcgagacctccccgagggccagcttcccca(SEQIDNO7)060302j1:agagcttaaagtatgtcccttg(SEQIDNO8)用BamHI和MfeI切割第三個反應(yīng)中產(chǎn)生的PCR片段和質(zhì)粒pENI3791，從瓊脂糖凝膠分離并純化，連接，從而產(chǎn)生PENI4158。實施例2酵母中脂肪酸合成的淺藍菌素(cerulinine)抑制本實施例的目的是表明淺藍菌素可通過抑制脂肪酸合成而抑制酵母生長，并且表明在甘油三酸酯存在的情況下脂肪酶的表達和分泌能在淺藍菌素存在的情況下恢復(fù)酵母生長，這是由于脂肪酶在水解甘油三酸酯時產(chǎn)生了游離脂肪酸。將質(zhì)粒pENI3659(對照)和pENI4158(具有脂肪酶基因)轉(zhuǎn)化入酵母菌株釀酒酵母JG169(MAT-alpha；ura3-52；Ieu2-3,112；his3-D200；pep4-113；prcl::HIS3；prbl::LEU2)。將轉(zhuǎn)化酵母在包含淺藍菌素和橄欖油的平板上劃線。只有用pENI4158轉(zhuǎn)化的酵母細胞，其表達活性脂肪酶，能在存在淺藍菌素的情況下在甘油三酸酯平板上生長。甘油三酸酯平板向450mlSC-ura-基本瓊脂加入50ml20%葡萄糖和IOml橄欖油。使用UltraTurax超聲發(fā)生器(IKALabortechnik，德國)分散橄欖油。加入溶于Iml乙醇中的5mg淺藍菌素和500微升氨芐青霉素(100mg/ml)。將混合物注入四個9cm培養(yǎng)皿中。SC-ura-基本瓊脂7.5g不合氨基酸的酵母氮基，11.3gBernstein,6.8gNa0H,5.6g酪蛋白水解物，0.IgL-色氨酸，20g瓊脂，于總共900ml水。實施例3重排的脂肪酶的選擇將編碼分泌并具有活性的脂肪酶的四種不同的野生型基因重排，所述脂肪酶的總體氨基酸序列同一性為32%(比較全部四種脂肪酶基因)編碼來自PENI2419的一種脂肪酶的基因(疏棉狀腐質(zhì)霉；實施例1)示于SEQIDNO:9中，并且編碼的氨基酸序列示于SEQIDNO10中。編碼第二種脂肪酶的基因(ND002444叢赤殼屬菌種(Nectriasp))示于SEQIDNO11，并且氨基酸序列示于SEQIDNO:12中。編碼第三種脂肪酶的基因(ND002119鐮孢屬菌種)示于SEQIDNO:13，并且氨基酸序列示于SEQIDNO14中。編碼第四種脂肪酶的基因(ND002652玉米赤霉(Gibberellazeae))示于SEQIDNO15，并且氨基酸序列示于SEQIDN0:16中。按照生產(chǎn)商(Roche)的推薦，使用PWO聚合酶進行下述PCR，引物序列示于序列表中表1包括模板和引物的PCR設(shè)置按照生產(chǎn)商(Roche)的推薦，使用PWO聚合酶在100微升的總體積中進行下述PCR10微升PCR片段編號:1、7、8、14、15、21、22、281微升PCR片段編號2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27。用KpnI和SpeI切割PCR片段并克隆入用相同的酶切割的pENI3659。獲得約30,000個大腸桿菌克隆。從這些克隆制得DNA制備物，并轉(zhuǎn)化入酵母(選擇的在5-F0A平板上為Ura陰性的ATCC26787(MATa,SUC2,mal,gal2,CUPl))中，獲得約120，000個酵母轉(zhuǎn)化體。將文庫涂布在甘油三酸酯平板(參見實施例2)上。很多酵母轉(zhuǎn)化體在這些平板上生長。使用BiolOl-系統(tǒng)(FastDNAspinkit目錄號6560-200)，按照生產(chǎn)商的推薦，從酵母轉(zhuǎn)化體分離質(zhì)粒DNA。將DNA制備物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，并且從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備DNA。通過對質(zhì)粒測序而鑒定所選擇的重排的脂肪酶。實施例4分泌蛋白酶的芽孢桿菌屬的平板選擇在這個實施例中選擇轉(zhuǎn)化體，其能在給定的生長條件下表達活性蛋白酶。選擇機制是基于轉(zhuǎn)化體細胞中一種或多種必需組分的合成受到生長培養(yǎng)基中存在的合成抑制劑的抑制。只有在轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，使其能在抑制劑存在的條件下生長時才能獲得必需組分。我們想要找到只允許分泌蛋白酶的芽孢桿菌屬菌落在小肽met-gly-met-met(MGMM)存在的條件下生長的羧基甲氧基羥胺(CMA)的濃度。CMA抑制芽孢桿菌屬細胞中甲硫氨酸的合成，嚴重影響它們的生長。然而，在存在MGMM時，分泌蛋白酶的芽孢桿菌屬細胞能在包含CMA的培養(yǎng)基上生長。分泌的蛋白酶降解MGMM肽，從而釋放游離的甲硫氨酸殘基，后者由分泌蛋白酶的芽孢桿菌屬細胞攝取并用于蛋白質(zhì)合成。實驗描沭融化500mlLB瓊脂并放在培養(yǎng)箱中，直至瓊脂到達60°C。向瓊脂加入5mlmet-gly-met-met(MGMM,SigmaM4786-250MG)(5mg/ml)和300微升氯霉素(溶于70%乙醇)。用25mlStripette將4X25ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至干凈的25mlNunc容器中。如下述方案中所示向培養(yǎng)基加入不同量的CMA(AldrichC13408_lg)。將全部25ml培養(yǎng)基注入9cm培養(yǎng)皿中，并在潔凈工作臺上干燥；“平板上涂布6XCMA”時除外，此時將25ml培養(yǎng)基注入9cm培養(yǎng)皿上并干燥，之后將600微升CMA(0.56mg/ml)涂布在平板上。表2.將分泌標注為“10R”的野生型蛋白酶(W02004/111220)的芽孢桿菌屬菌株和分泌失活的IOR蛋白酶(在IOR氨基酸序列中包含取代S143A)的芽孢桿菌屬菌株兩者接種于來自冷凍儲液的200微升LB-液體培養(yǎng)基(bouillon)中。將這兩種微生物在6種不同類型的平板上劃線。在37°C倒置過夜培養(yǎng)所有平板。結(jié)果示于下面的表3中。表3.由表3可以清楚得知，在平板中具有11.2mg/LCMA以及MGMM的LB瓊脂能用于只選擇芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體細胞，其分泌活性IOR蛋白酶，因為只有它們能在給定條件下在平板上生長。權(quán)利要求用于選擇至少一種分泌一種或多種目的活性酶的宿主細胞的方法，所述方法包括如下步驟a)提供包含一種或多種合酶抑制劑的生長培養(yǎng)基，該抑制劑抑制所述宿主細胞中至少一種必需化合物的合成，并且進一步包括一種或多種組分，其在存在所述一種或多種目的活性酶的情況下可轉(zhuǎn)化為至少一種必需化合物，從而允許所述宿主細胞生長；b)在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或其上培養(yǎng)所述宿主細胞；和c)選擇能在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或其上生長的至少一種宿主細胞，所述宿主細胞分泌一種或多種目的活性酶。2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述宿主細胞轉(zhuǎn)化；優(yōu)選用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述宿主細胞，所述構(gòu)建體包含編碼一種或多種目的酶的至少一個多核苷酸。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述宿主細胞是微生物的宿主細胞。4.權(quán)利要求3的方法，其中所述宿主細胞是原核的，優(yōu)選所述宿主細胞是革蘭氏陽性的，更優(yōu)選所述宿主細胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)細胞，并且最優(yōu)選所述宿主細胞是嗜堿^ifelflif(Bacillusalkalophilus)>I^jv^ifelflii(Bacillusamyloliquefaciens)>短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細胞。5.權(quán)利要求3的方法，其中所述宿主細胞是真核的，優(yōu)選所述宿主細胞是酵母細胞，更優(yōu)選所述宿主細胞是酵母屬(Saccharomyces)細胞，并且最優(yōu)選所述宿主細胞是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)細胞。6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中所述一種或多種目的活性酶為異源的或同源的。7.權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其中所述一種或多種目的活性酶包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和/或連接酶；優(yōu)選所述一種或多種目的活性酶包括脂肪酶和/或蛋白酶。8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括可抑制至少一種氨基酸和/或至少一種脂肪酸的合成的抑制劑。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括5-硝基-2-苯并咪唑啉酮、草甘膦、羧基甲氧基羥胺、羧基甲氧基胺、0-烯丙基羥胺、吲哚丙烯酸、0-(羧基甲基)羥胺半鹽酸鹽、咪唑啉酮或磺酰脲。10.權(quán)利要求8的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括可抑制甲硫氨酸合成的抑制劑，優(yōu)選所述一種或多種合酶抑制劑包括羧基甲氧基羥胺。11.權(quán)利要求8的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括三氯生、淺藍菌素、硫乳diazaborin。12.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括可抑制葡萄糖-6-磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選所述一種或多種合酶抑制劑包括根皮素、磷酸吡哆醛、theilavinA、2_羥基_5_硝基苯甲醛或木白斯他汀(Mumbaistatin)。13.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括可抑制葡糖胺-6P合酶的抑制劑，優(yōu)選所述一種或多種合酶抑制劑包括氨基連三唑或aptamine。14.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述一種或多種合酶抑制劑包括可抑制果糖1，6二磷酸酶的抑制劑，優(yōu)選所述一種或多種合酶抑制劑包括2，3_二氫-IH-環(huán)戊[b]喹啉。全文摘要本發(fā)明涉及用于選擇至少一種宿主細胞的方法，所述細胞分泌一種或多種目的活性酶的，方法包括步驟a)提供包含一種或多種合酶抑制劑的生長培養(yǎng)基，所述抑制劑抑制宿主細胞中至少一種必需化合物的合成，并且進一步包括一種或多種組分，其在存在一種或多種目的活性酶的情況下轉(zhuǎn)化成至少一種必需化合物，從而允許宿主細胞生長；b)在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或培養(yǎng)基上培養(yǎng)宿主細胞；和c)選擇能在步驟(a)的生長培養(yǎng)基中或培養(yǎng)基上生長的至少一種宿主細胞，所述宿主細胞分泌一種或多種目的活性酶。文檔編號C12Q1/02GK101918580SQ200880124673公開日2010年12月15日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日發(fā)明者杰斯珀·文德申請人:諾維信公司